JPH04330093A - オリゴリボヌクレオチドの製造法 - Google Patents
オリゴリボヌクレオチドの製造法Info
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- JPH04330093A JPH04330093A JP3136086A JP13608691A JPH04330093A JP H04330093 A JPH04330093 A JP H04330093A JP 3136086 A JP3136086 A JP 3136086A JP 13608691 A JP13608691 A JP 13608691A JP H04330093 A JPH04330093 A JP H04330093A
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】オリゴリボヌクレオチドの化学合
成、特に２０量体以上の高縮合度のオリゴリボヌクレオ
チドの製造法に関する。
成、特に２０量体以上の高縮合度のオリゴリボヌクレオ
チドの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】オリゴリボヌクレオチドの合成に当って
は、３’位−５’位結合を形成するために、リボヌクレ
オチドの２’位、５’位の水酸基を保護した上で、該５
’位の保護基のみを離脱させ、縮合反応を行って鎖伸長
させ、その後全ての保護基を外してオリゴリボヌクレオ
チドを製造することが通常行なわれている。この保護基
、保護基離脱剤の組合せが色々用いられており、その例
としてリボヌクレオチドの２’位の水酸基の保護基とし
てテトラヒドロピラニル基、５’位の保護基としてジメ
トキシトリチル基を用いて、この５’位の保護基を脱離
させるために、１％ジクロロ酢酸塩化メチレン処理をお
こない、リン酸トリエステル法を利用して１１量体の合
成を行うもの〔Ｉ．Ｈｉｒａｏ ら、ケミストリー・レ
ターズ（Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．），１９２９（１９８６
）〕、１９量体を得るもの〔Ｉ．Ｈｉｒａｏ ら、ブレ
チン・オブ・ケミカル・ソサイエティ・オブ・ジャパン
（Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊａｐ．），
６２，１９９５（１９８９）〕、同様に５’位の保護基
としてジメトキシトリチル基を用い、またその脱離法と
して、０．３％ジクロロ酢酸塩化メチレンを用いて、ホ
スホロアミダイト法により、８量体の合成を行うもの〔
Ｒ． Ｋｉｒｅｚｅｋ ら、バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）， ２５，７８４０（１９８６
）〕が報告されている。又、最近、５’位の保護基とし
て、アデノシン、グアノシンについては９−フェニルキ
サンテニル基を、シチジン、ウリジンについては９−（
４−メトキシ）フェニルキサンテニル基を用いて、その
脱離反応のために、０．５％トリフルオロ酢酸塩化メチ
レンを使用し、ホスホロアミダイト法を利用して、２１
量体の合成を行った例〔Ｈ． Ｔａｎｉｍｕｒａら、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） １７，８１３５（１９８９）〕
も知られている。
は、３’位−５’位結合を形成するために、リボヌクレ
オチドの２’位、５’位の水酸基を保護した上で、該５
’位の保護基のみを離脱させ、縮合反応を行って鎖伸長
させ、その後全ての保護基を外してオリゴリボヌクレオ
チドを製造することが通常行なわれている。この保護基
、保護基離脱剤の組合せが色々用いられており、その例
としてリボヌクレオチドの２’位の水酸基の保護基とし
てテトラヒドロピラニル基、５’位の保護基としてジメ
トキシトリチル基を用いて、この５’位の保護基を脱離
させるために、１％ジクロロ酢酸塩化メチレン処理をお
こない、リン酸トリエステル法を利用して１１量体の合
成を行うもの〔Ｉ．Ｈｉｒａｏ ら、ケミストリー・レ
ターズ（Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．），１９２９（１９８６
）〕、１９量体を得るもの〔Ｉ．Ｈｉｒａｏ ら、ブレ
チン・オブ・ケミカル・ソサイエティ・オブ・ジャパン
（Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊａｐ．），
６２，１９９５（１９８９）〕、同様に５’位の保護基
としてジメトキシトリチル基を用い、またその脱離法と
して、０．３％ジクロロ酢酸塩化メチレンを用いて、ホ
スホロアミダイト法により、８量体の合成を行うもの〔
Ｒ． Ｋｉｒｅｚｅｋ ら、バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）， ２５，７８４０（１９８６
）〕が報告されている。又、最近、５’位の保護基とし
て、アデノシン、グアノシンについては９−フェニルキ
サンテニル基を、シチジン、ウリジンについては９−（
４−メトキシ）フェニルキサンテニル基を用いて、その
脱離反応のために、０．５％トリフルオロ酢酸塩化メチ
レンを使用し、ホスホロアミダイト法を利用して、２１
量体の合成を行った例〔Ｈ． Ｔａｎｉｍｕｒａら、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） １７，８１３５（１９８９）〕
も知られている。
【０００３】
【本発明が解決すべき課題】オリゴリボヌクレオチドの
化学合成は、現在でもたいへん困難であるが、その理由
の一つに保護基の選択と、その脱離法の問題がある。特
に２’位水酸基の保護基については、５’位水酸基の保
護基を外してヌクレオチド鎖伸長反応を行う工程中に、
同時に外れてしまうことが多く、希望するような縮合度
のオリゴリボヌクレオチドが得られないことが多く、ど
のような条件で、脱離反応をおこなうかということと関
連して、いろいろな保護基が開発されている。中でもア
セタール型の保護基であるテトラヒドロピラニル基は、
原料が安価で入手し易く、また導入反応も容易であるた
めに、一般によく使用されているが、上記の従来の報告
例にもある通り、現時点ではこれらの合成法では１１量
体、或いは１２量体であり、多量体としてはせいぜい２
０量体位までの長さのオリゴリボヌクレオチドの合成し
か報告されていないのが現状である。
化学合成は、現在でもたいへん困難であるが、その理由
の一つに保護基の選択と、その脱離法の問題がある。特
に２’位水酸基の保護基については、５’位水酸基の保
護基を外してヌクレオチド鎖伸長反応を行う工程中に、
同時に外れてしまうことが多く、希望するような縮合度
のオリゴリボヌクレオチドが得られないことが多く、ど
のような条件で、脱離反応をおこなうかということと関
連して、いろいろな保護基が開発されている。中でもア
セタール型の保護基であるテトラヒドロピラニル基は、
原料が安価で入手し易く、また導入反応も容易であるた
めに、一般によく使用されているが、上記の従来の報告
例にもある通り、現時点ではこれらの合成法では１１量
体、或いは１２量体であり、多量体としてはせいぜい２
０量体位までの長さのオリゴリボヌクレオチドの合成し
か報告されていないのが現状である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、２０量体
以上のオリゴリボヌクレオチドを得るべく研究を重ねた
結果、２’位にテトラヒドロピラニル基を導入した原料
を使って、２０量体以上のオリゴリボヌクレオチドを合
成することができることを見出した。すなわち、本発明
は（１）２’位がテトラヒドロピラニル基で保護され、
５’位が９−フェニルキサンテニル基類で保護されたリ
ボヌクレオチドを１．５容量％から２．５容量％のジク
ロロ酢酸含有有機溶媒溶液で処理して５’位の保護基を
脱離させた後、２’位がテトラヒドロピラニル基で保護
され、５’位が９−フェニルキサンテニル基誘導体で保
護されたリボヌクレオチドユニットとの縮合反応に付す
ことを特徴とする、オリゴリボヌクレオチドの製造法、
及び（２）２’位がテトラヒドロピラニル基で保護され
、５’位が９−フェニルキサンテニル基類で保護された
リボヌクレオチドを１．５容量％から２．５容量％のジ
クロロ酢酸含有有機溶媒溶液で処理して５’位の保護基
を脱離させ、２’位がテトラヒドロピラニル基で保護さ
れ、５’位が９−フェニルキサンテニル基誘導体で保護
されたリボヌクレオチド誘導体との縮合反応に付し、縮
合反応後、すべての保護基を除去することを特徴とする
、オリゴリボヌクレオチドの製造法、に関する。
以上のオリゴリボヌクレオチドを得るべく研究を重ねた
結果、２’位にテトラヒドロピラニル基を導入した原料
を使って、２０量体以上のオリゴリボヌクレオチドを合
成することができることを見出した。すなわち、本発明
は（１）２’位がテトラヒドロピラニル基で保護され、
５’位が９−フェニルキサンテニル基類で保護されたリ
ボヌクレオチドを１．５容量％から２．５容量％のジク
ロロ酢酸含有有機溶媒溶液で処理して５’位の保護基を
脱離させた後、２’位がテトラヒドロピラニル基で保護
され、５’位が９−フェニルキサンテニル基誘導体で保
護されたリボヌクレオチドユニットとの縮合反応に付す
ことを特徴とする、オリゴリボヌクレオチドの製造法、
及び（２）２’位がテトラヒドロピラニル基で保護され
、５’位が９−フェニルキサンテニル基類で保護された
リボヌクレオチドを１．５容量％から２．５容量％のジ
クロロ酢酸含有有機溶媒溶液で処理して５’位の保護基
を脱離させ、２’位がテトラヒドロピラニル基で保護さ
れ、５’位が９−フェニルキサンテニル基誘導体で保護
されたリボヌクレオチド誘導体との縮合反応に付し、縮
合反応後、すべての保護基を除去することを特徴とする
、オリゴリボヌクレオチドの製造法、に関する。
【０００５】本発明における５’位の保護基である９−
フェニルキサンテニル基類としては、９−フェニルキサ
ンテニル基、あるいは９−（４−メトキシ）フェニルキ
サンテニル基等の９−〔４−（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）
〕フェニルキサンテニル基等が挙げられる。特に、塩基
がアデノシン、グアノシンの場合には９−フェニルキサ
ンテニル基を、シチジン、ウリジンの場合には９−（４
−メトキシ）フェニルキサンテニル基を用いるのが好ま
しい。２’位がテトラヒドロピラニル基で保護され、５
’位が９−フェニルキサンテニル基類で保護されたリボ
ヌクレオチドの５’位の保護基の脱離は、通常該ヌクレ
オチドを１５〜３０℃で０．５〜３分間１．５〜２．５
容量％（以下％と略す）のジクロロ酢酸含有有機溶媒溶
液で処理することにより行われる。ジクロロ酢酸を溶解
させるための有機溶媒としては通常、ジクロロメタンや
１，２−ジクロロエタンなどの非極性有機溶媒が用いら
れる。５’位の保護基が除去されたリボヌクレオチドと
２’位および５’位が保護されたリボヌクレオチド誘導
体との縮合反応としては、ホスホロアミダイト法〔Ｍ．
Ｄ． Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ら、ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサィエティ（Ｊ． Ａｍ． Ｃ
ｈｅｍ． Ｓｏｃ．），１０３，３１８５（１９８１）
〕、Ｈ−ホスホネート法〔Ｐ． Ｊ． Ｇａｒｅｇｇ，
ケミカ・シュークロース（Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒ．）
２５，２８０（１９８５）〕、リン酸トリエステル法〔
Ｒ． Ｌ． Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒｅｔ ら、ジャーナル
・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサィエティ（Ｊ．
Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．）， ８７，３５２６（
１９６５）〕が挙げられるが、望ましくはホスホロアミ
ダイト法が挙げられる。
フェニルキサンテニル基類としては、９−フェニルキサ
ンテニル基、あるいは９−（４−メトキシ）フェニルキ
サンテニル基等の９−〔４−（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）
〕フェニルキサンテニル基等が挙げられる。特に、塩基
がアデノシン、グアノシンの場合には９−フェニルキサ
ンテニル基を、シチジン、ウリジンの場合には９−（４
−メトキシ）フェニルキサンテニル基を用いるのが好ま
しい。２’位がテトラヒドロピラニル基で保護され、５
’位が９−フェニルキサンテニル基類で保護されたリボ
ヌクレオチドの５’位の保護基の脱離は、通常該ヌクレ
オチドを１５〜３０℃で０．５〜３分間１．５〜２．５
容量％（以下％と略す）のジクロロ酢酸含有有機溶媒溶
液で処理することにより行われる。ジクロロ酢酸を溶解
させるための有機溶媒としては通常、ジクロロメタンや
１，２−ジクロロエタンなどの非極性有機溶媒が用いら
れる。５’位の保護基が除去されたリボヌクレオチドと
２’位および５’位が保護されたリボヌクレオチド誘導
体との縮合反応としては、ホスホロアミダイト法〔Ｍ．
Ｄ． Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ら、ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサィエティ（Ｊ． Ａｍ． Ｃ
ｈｅｍ． Ｓｏｃ．），１０３，３１８５（１９８１）
〕、Ｈ−ホスホネート法〔Ｐ． Ｊ． Ｇａｒｅｇｇ，
ケミカ・シュークロース（Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒ．）
２５，２８０（１９８５）〕、リン酸トリエステル法〔
Ｒ． Ｌ． Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒｅｔ ら、ジャーナル
・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサィエティ（Ｊ．
Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．）， ８７，３５２６（
１９６５）〕が挙げられるが、望ましくはホスホロアミ
ダイト法が挙げられる。
【０００６】ホスホロアミダイト法が望ましい理由は、
まず第１点として、縮合反応がほぼ定量的に行なえると
いうこと、第２点として、縮合反応時間が、現在知られ
ている反応の中で、最も短いこと、第３点として、塩基
部位の修飾反応などの副反応がほとんど起こらないこと
であり、特に、今回開発された、アミダイトユニットで
は、塩基部分も完全に保護しているため、アミダイト法
由来の副反応は、全く起こらないという利点がある。ホ
スホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、リン酸トリ
エステル法について、図１の模式図に示すと共に、それ
に従って簡単に説明する。図中、Ｒは９−フェニルキサ
ンテニル基類、Ｒ’はテトラヒドロピラニル基、Ｒ’’
はシアノエチル基又はメチル基（ホスホロアミダイト法
）、オルトクロロフェノキシ基、パラクロロフェノキシ
基、又はフェニルチオ基（リン酸トリエステル法）、Ｒ
’’’はアセチル基又はベンゾイル基を示す。ホスホロ
アミダイト法は、３価の状態にある、ヌクレオチドホス
ホロアミダイト誘導体の、Ｐ−Ｎ結合をテトラゾールな
どにより活性化させて、ヌクレオチドの５’水酸基と縮
合反応を行ない、その後、ヨウ素により酸化反応を行な
って安定な５価のリン酸トリエステルを形成する反応を
行なう方法である。Ｈ−ホスホネート法はＰ−Ｈ結合を
もつ、ヌクレオチドＨ−ホスホネート誘導体を、塩化ピ
バロイルなどにより活性化させた後、ヌクレオチドの５
’水酸基と縮合反応を行ない、最終的にヨウ素により酸
化反応を行なって、リン酸ジエステルを形成する反応を
行なう方法である。リン酸トリエステル法はヌクレオチ
ドリン酸ジエステル誘導体を、メシチレンスルホニルニ
トロトリアゾリドなどとの縮合剤により活性化させた後
、５’水酸基と縮合反応を行なって、リン酸トリエステ
ルを形成する反応を行なう方法である。
まず第１点として、縮合反応がほぼ定量的に行なえると
いうこと、第２点として、縮合反応時間が、現在知られ
ている反応の中で、最も短いこと、第３点として、塩基
部位の修飾反応などの副反応がほとんど起こらないこと
であり、特に、今回開発された、アミダイトユニットで
は、塩基部分も完全に保護しているため、アミダイト法
由来の副反応は、全く起こらないという利点がある。ホ
スホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、リン酸トリ
エステル法について、図１の模式図に示すと共に、それ
に従って簡単に説明する。図中、Ｒは９−フェニルキサ
ンテニル基類、Ｒ’はテトラヒドロピラニル基、Ｒ’’
はシアノエチル基又はメチル基（ホスホロアミダイト法
）、オルトクロロフェノキシ基、パラクロロフェノキシ
基、又はフェニルチオ基（リン酸トリエステル法）、Ｒ
’’’はアセチル基又はベンゾイル基を示す。ホスホロ
アミダイト法は、３価の状態にある、ヌクレオチドホス
ホロアミダイト誘導体の、Ｐ−Ｎ結合をテトラゾールな
どにより活性化させて、ヌクレオチドの５’水酸基と縮
合反応を行ない、その後、ヨウ素により酸化反応を行な
って安定な５価のリン酸トリエステルを形成する反応を
行なう方法である。Ｈ−ホスホネート法はＰ−Ｈ結合を
もつ、ヌクレオチドＨ−ホスホネート誘導体を、塩化ピ
バロイルなどにより活性化させた後、ヌクレオチドの５
’水酸基と縮合反応を行ない、最終的にヨウ素により酸
化反応を行なって、リン酸ジエステルを形成する反応を
行なう方法である。リン酸トリエステル法はヌクレオチ
ドリン酸ジエステル誘導体を、メシチレンスルホニルニ
トロトリアゾリドなどとの縮合剤により活性化させた後
、５’水酸基と縮合反応を行なって、リン酸トリエステ
ルを形成する反応を行なう方法である。
【０００７】本発明で用いるヌクレオチドユニットは上
記縮合反応に依り異なるが、ホスホロアミダイト法で用
いられるリボヌクレオチドアミダイトユニットは、すで
に公知の方法により調製される。すなわち、Ｈ． Ｔａ
ｎｉｍｕｒａ ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） １７，８
１３５（１９８９）に記載された方法に従い、アデノシ
ン、グアノシン、シチジン、ウリジンの各アミダイトユ
ニットを調製できる。一連のヌクレオチド鎖伸長反応は
、マニュアル法、自動合成機を用いる方法の、いずれに
よっても可能であるが、自動合成機により行うことによ
り、操作法の簡便化、合成の正確性の点から自動合成機
を用いる方法が望ましい。このようにして得られた、保
護されたオリゴリボヌクレオチドはそのまま利用されて
もよく、又全保護基を除去してもよい。これらの全保護
基の除去および、精製は公知の方法、例えば、まずアン
モニア／ピリジン（５：１）溶液を室温で１２時間、そ
の後５５℃で３時間反応させることにより、固相担体か
らのヌクレオチド鎖の切り出しと、塩基部分の保護基の
除去を行ない、溶媒を留去した後、ｐＨ２．０に調整し
た希塩酸と２０時間反応させることにより、２’位の保
護基と５’位の保護基を除去し、こうして全ての保護基
を除いた後、逆相ＨＰＬＣにより精製する方法〔Ｈ．
Ｔａｎｉｍｕｒａ ら、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１７，
８１３５（１９８９）〕で行なうことができる。
記縮合反応に依り異なるが、ホスホロアミダイト法で用
いられるリボヌクレオチドアミダイトユニットは、すで
に公知の方法により調製される。すなわち、Ｈ． Ｔａ
ｎｉｍｕｒａ ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） １７，８
１３５（１９８９）に記載された方法に従い、アデノシ
ン、グアノシン、シチジン、ウリジンの各アミダイトユ
ニットを調製できる。一連のヌクレオチド鎖伸長反応は
、マニュアル法、自動合成機を用いる方法の、いずれに
よっても可能であるが、自動合成機により行うことによ
り、操作法の簡便化、合成の正確性の点から自動合成機
を用いる方法が望ましい。このようにして得られた、保
護されたオリゴリボヌクレオチドはそのまま利用されて
もよく、又全保護基を除去してもよい。これらの全保護
基の除去および、精製は公知の方法、例えば、まずアン
モニア／ピリジン（５：１）溶液を室温で１２時間、そ
の後５５℃で３時間反応させることにより、固相担体か
らのヌクレオチド鎖の切り出しと、塩基部分の保護基の
除去を行ない、溶媒を留去した後、ｐＨ２．０に調整し
た希塩酸と２０時間反応させることにより、２’位の保
護基と５’位の保護基を除去し、こうして全ての保護基
を除いた後、逆相ＨＰＬＣにより精製する方法〔Ｈ．
Ｔａｎｉｍｕｒａ ら、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１７，
８１３５（１９８９）〕で行なうことができる。
【０００８】
【作用】本発明では、リボヌクレオチドの２’位をテト
ラヒドロピラニル基で保護し、５’位を９−フェニルキ
サンテニル基類で保護したリボヌクレオチドの該５’位
の保護基の脱離反応に、１．５容量％から２．５容量％
のジクロロ酢酸含有有機溶媒溶液を用い、２’位と５’
位が同様に保護されたリボヌクレオチド誘導体との縮合
反応を順次行うことにより、５’位の保護基離脱の際に
２’位の保護基が同時に外れてしまうことが防止でき、
縮合度の大きい、例えば３０量体のオリゴリボヌクレオ
チドが得られる。
ラヒドロピラニル基で保護し、５’位を９−フェニルキ
サンテニル基類で保護したリボヌクレオチドの該５’位
の保護基の脱離反応に、１．５容量％から２．５容量％
のジクロロ酢酸含有有機溶媒溶液を用い、２’位と５’
位が同様に保護されたリボヌクレオチド誘導体との縮合
反応を順次行うことにより、５’位の保護基離脱の際に
２’位の保護基が同時に外れてしまうことが防止でき、
縮合度の大きい、例えば３０量体のオリゴリボヌクレオ
チドが得られる。
【０００９】
【実施例】本発明を実施例をあげて、さらに詳しく説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。なおリボヌクレオチドに関しては、次の略称を用
いる。 Ａ：アデノシン；Ｇ：グアノシン；Ｃ：シチジン；Ｕ：
ウリジン
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。なおリボヌクレオチドに関しては、次の略称を用
いる。 Ａ：アデノシン；Ｇ：グアノシン；Ｃ：シチジン；Ｕ：
ウリジン
【００１０】
【実施例１】 ＣＵＣＧＵＣＣＵＣＧＣＣＧＧＣ
ＵＡＧＵＡ（配列番号１）の製造 ５’位は９−フェニルキサンテニル（Ｐｉｘ）基で、２
’位はテトラヒドロピラニル（Ｔｈｐ）基で保護された
アデノシン誘導体が、１ｇあたり２０μｍｏｌの割合で
誘導されたコントロールポアグラス（ＣＰＧ）１０ｍｇ
（０．２μｍｏｌ）を、自動合成機（ＡＢＩ社製のＤＮ
Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３８１ Ａ
）にすえつけてある反応カラムにつめる。そして、５’
位は９−（４−メトキシ）フェニルキサンテニル（Ｍｏ
ｘ）基で、２’位はテトラヒドロピラニル（Ｔｈｐ）基
で保護されたホスホロアミダイト法用ウリジンホスホロ
アミダイトユニットを、０．２Ｍの濃度になるように無
水アセトニトリルに溶解して、ユニット保存用のボトル
につめて自動合成機に取り付ける。それから、以下に記
す操作を自動合成機によって、反応カラム中で行う。
ＵＡＧＵＡ（配列番号１）の製造 ５’位は９−フェニルキサンテニル（Ｐｉｘ）基で、２
’位はテトラヒドロピラニル（Ｔｈｐ）基で保護された
アデノシン誘導体が、１ｇあたり２０μｍｏｌの割合で
誘導されたコントロールポアグラス（ＣＰＧ）１０ｍｇ
（０．２μｍｏｌ）を、自動合成機（ＡＢＩ社製のＤＮ
Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３８１ Ａ
）にすえつけてある反応カラムにつめる。そして、５’
位は９−（４−メトキシ）フェニルキサンテニル（Ｍｏ
ｘ）基で、２’位はテトラヒドロピラニル（Ｔｈｐ）基
で保護されたホスホロアミダイト法用ウリジンホスホロ
アミダイトユニットを、０．２Ｍの濃度になるように無
水アセトニトリルに溶解して、ユニット保存用のボトル
につめて自動合成機に取り付ける。それから、以下に記
す操作を自動合成機によって、反応カラム中で行う。
【００１１】１）２．０％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）／Ｃ
Ｈ２Ｃｌ２処理を６０秒間行い、アデノシンの５’位の
９−フェニルキサンテニル（Ｐｉｘ）基を除去する。こ
の溶液は、縮合収率を算定するために、保存しておく。 ２）アセトニトリルによりＣＰＧを洗浄する。 ３）アルゴンガスによりＣＰＧを乾燥させる。 ４）保護された０．２Ｍウリジンホスホロアミダイトユ
ニットと０．４Ｍテトラゾールにより、縮合反応を５分
間行う。 ５）０．２５Ｍ無水酢酸／１−メチルイミダゾール／ル
チジン／テトラヒドロフラン溶液を３０秒間反応させる
ことにより、未反応の５’−水酸基をブロックする。 ６）０．１Ｍヨウ素／テトラヒドロフラン／ピリジン／
水により、酸化反応を３０秒間行う。 ７）アセトニトリルによる洗浄、アルゴンガスによる乾
燥を行う。
Ｈ２Ｃｌ２処理を６０秒間行い、アデノシンの５’位の
９−フェニルキサンテニル（Ｐｉｘ）基を除去する。こ
の溶液は、縮合収率を算定するために、保存しておく。 ２）アセトニトリルによりＣＰＧを洗浄する。 ３）アルゴンガスによりＣＰＧを乾燥させる。 ４）保護された０．２Ｍウリジンホスホロアミダイトユ
ニットと０．４Ｍテトラゾールにより、縮合反応を５分
間行う。 ５）０．２５Ｍ無水酢酸／１−メチルイミダゾール／ル
チジン／テトラヒドロフラン溶液を３０秒間反応させる
ことにより、未反応の５’−水酸基をブロックする。 ６）０．１Ｍヨウ素／テトラヒドロフラン／ピリジン／
水により、酸化反応を３０秒間行う。 ７）アセトニトリルによる洗浄、アルゴンガスによる乾
燥を行う。
【００１２】以上の操作で、ＣＰＧ上に導入されたアデ
ノシン誘導体に、保護されたウリジン誘導体を結合させ
ることができる。次の塩基配列の、保護されたグアニン
誘導体を結合させるためには、同様に０．２Ｍの濃度に
溶解して自動合成機に取り付けた後、１）及び４）につ
いては下記のとおりにする以外は、上記の操作１）〜７
）を繰り返して行なう。 １）２．０％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２処理を６０秒間行な
い、保護されたウリジン誘導体の５’−（Ｍｏｘ）基を
除去する。この溶液は、縮合収率を算定するために保存
しておく。 ４）保護された０．２Ｍグアノシンホスホロアミダイト
ユニットと０．４Ｍテトラゾールにより縮合反応を５分
間行なう。
ノシン誘導体に、保護されたウリジン誘導体を結合させ
ることができる。次の塩基配列の、保護されたグアニン
誘導体を結合させるためには、同様に０．２Ｍの濃度に
溶解して自動合成機に取り付けた後、１）及び４）につ
いては下記のとおりにする以外は、上記の操作１）〜７
）を繰り返して行なう。 １）２．０％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２処理を６０秒間行な
い、保護されたウリジン誘導体の５’−（Ｍｏｘ）基を
除去する。この溶液は、縮合収率を算定するために保存
しておく。 ４）保護された０．２Ｍグアノシンホスホロアミダイト
ユニットと０．４Ｍテトラゾールにより縮合反応を５分
間行なう。
【００１３】以上の操作を繰り返すことにより、ヌクレ
オチド鎖を順次のばしていく。１）の操作で遊離してき
た、ＰｉｘあるいはＭｏｘを、比色定量した結果算出し
た各縮合反応の平均収率は、９９％であった。合成反応
が終了した後の、脱保護操作は、常法〔Ｈ． Ｔａｎｉ
ｍｕｒａ ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．） １７，８１３５
（１９８９）〕に従って行なった。反応カラム中のＣＰ
Ｇを取り出してから、これをまずアンモニア／ピリジン
（５：１）溶液で室温で１２時間、その後５５℃で３時
間反応させることにより、固相担体からのヌクレオチド
鎖の切り出しと、塩基部分の保護基の除去を行ない、溶
媒を留去した後、ｐＨ２．０に調整した希塩酸と２０時
間反応させることにより、２’位のテトラヒドロピラニ
ル（Ｔｈｐ）基と５’−末端のシチジンの５’−Ｍｏｘ
基を除去し、こうして全ての保護基を除いた後、逆相Ｈ
ＰＬＣ（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８）を用いて
、精製を行なう。 以上の操作により、目的物のＲＮＡフラグメントＣＵＣ
ＧＵＣＣＵＣＧＣＣＧＧＣＵＡＧＵＡを合成した。合成
物の構造は次の方法により確認した。Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼを用いて、合成オリゴリボヌクレオチドの
５’−末端を、３２Ｐでラベル化し、ドニス−ケラー（
Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌａｒ）法〔Ｈ． Ｄｏｎｉｓ−Ｋ
ｅｌｌａｒ ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）４，２５２７
（１９７７）〕により、その構造を確認した。
オチド鎖を順次のばしていく。１）の操作で遊離してき
た、ＰｉｘあるいはＭｏｘを、比色定量した結果算出し
た各縮合反応の平均収率は、９９％であった。合成反応
が終了した後の、脱保護操作は、常法〔Ｈ． Ｔａｎｉ
ｍｕｒａ ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．） １７，８１３５
（１９８９）〕に従って行なった。反応カラム中のＣＰ
Ｇを取り出してから、これをまずアンモニア／ピリジン
（５：１）溶液で室温で１２時間、その後５５℃で３時
間反応させることにより、固相担体からのヌクレオチド
鎖の切り出しと、塩基部分の保護基の除去を行ない、溶
媒を留去した後、ｐＨ２．０に調整した希塩酸と２０時
間反応させることにより、２’位のテトラヒドロピラニ
ル（Ｔｈｐ）基と５’−末端のシチジンの５’−Ｍｏｘ
基を除去し、こうして全ての保護基を除いた後、逆相Ｈ
ＰＬＣ（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８）を用いて
、精製を行なう。 以上の操作により、目的物のＲＮＡフラグメントＣＵＣ
ＧＵＣＣＵＣＧＣＣＧＧＣＵＡＧＵＡを合成した。合成
物の構造は次の方法により確認した。Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼを用いて、合成オリゴリボヌクレオチドの
５’−末端を、３２Ｐでラベル化し、ドニス−ケラー（
Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌａｒ）法〔Ｈ． Ｄｏｎｉｓ−Ｋ
ｅｌｌａｒ ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）４，２５２７
（１９７７）〕により、その構造を確認した。
【００１４】
【実施例２】 ウリジル酸３０量体（配列番号２
）の製造 ５’位をＭｏｘ基で、２’位はＴｈｐ基で保護されたウ
リジン誘導体を、１ｇあたり２０μｍｏｌの割合で導入
されたＣＰＧ １０ｍｇ（０．２μｍｏｌ）を、自動合
成機にすえつけてある、反応カラムにつめる。そして、
ホスホロアミダイト法用のウリジンホスホロアミダイト
ユニットを、０．２Ｍの濃度になるように、無水アセト
ニトリルに溶解して、ユニット保存用のボトルにつめて
、自動合成機に取り付ける。その後、以下に記す操作を
自動合成機によって、反応カラム中で行なう。
）の製造 ５’位をＭｏｘ基で、２’位はＴｈｐ基で保護されたウ
リジン誘導体を、１ｇあたり２０μｍｏｌの割合で導入
されたＣＰＧ １０ｍｇ（０．２μｍｏｌ）を、自動合
成機にすえつけてある、反応カラムにつめる。そして、
ホスホロアミダイト法用のウリジンホスホロアミダイト
ユニットを、０．２Ｍの濃度になるように、無水アセト
ニトリルに溶解して、ユニット保存用のボトルにつめて
、自動合成機に取り付ける。その後、以下に記す操作を
自動合成機によって、反応カラム中で行なう。
【００１５】１）２．０％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２処理を
６０秒間行い、５’−Ｍｏｘ基を除去する。この溶液は
、縮合収率を算定するために、保存しておく。 ２）アセトニトリルによりＣＰＧを洗浄する。 ３）アルゴンガスによりＣＰＧを乾燥させる。 ４）０．２Ｍウリジンホスホロアミダイトユニットと０
．４Ｍテトラゾールにより、縮合反応を５分間行う。 ５）０．２５Ｍ無水酢酸／１−メチルイミダゾール／ル
チジン／テトラヒドロフラン溶液を３０秒間反応させる
ことにより、未反応の５’−水酸基をブロックする。 ６）０．１Ｍヨウ素／テトラヒドロフラン／ピリジン／
水により、酸化反応を３０秒間行う。 ７）アセトニトリルによる洗浄、アルゴンガスによる乾
燥を行う。
６０秒間行い、５’−Ｍｏｘ基を除去する。この溶液は
、縮合収率を算定するために、保存しておく。 ２）アセトニトリルによりＣＰＧを洗浄する。 ３）アルゴンガスによりＣＰＧを乾燥させる。 ４）０．２Ｍウリジンホスホロアミダイトユニットと０
．４Ｍテトラゾールにより、縮合反応を５分間行う。 ５）０．２５Ｍ無水酢酸／１−メチルイミダゾール／ル
チジン／テトラヒドロフラン溶液を３０秒間反応させる
ことにより、未反応の５’−水酸基をブロックする。 ６）０．１Ｍヨウ素／テトラヒドロフラン／ピリジン／
水により、酸化反応を３０秒間行う。 ７）アセトニトリルによる洗浄、アルゴンガスによる乾
燥を行う。
【００１６】以上の操作で、ＣＰＧ上に導入されたウリ
ジン誘導体に、保護されたウリジン誘導体を結合させる
ことができる。この操作を繰り返すことにより、ヌクレ
オチド鎖を順次のばしていく。１）の操作で遊離してき
た、Ｍｏｘを比色定量した結果算出した、各縮合反応の
平均収率は、９９％であった。合成反応が終了した後の
、脱保護操作は、常法〔Ｈ． Ｔａｎｉｍｕｒａ ら、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） １７，８１３５（１９８９）
〕に従って行なった。反応カラム中のＣＰＧを取り出し
てから、これをまずアンモニア／ピリジン（５：１）溶
液で、室温で１２時間、その後５５℃で３時間反応させ
ることにより、固相担体からのヌクレオチド鎖の切り出
しと、塩基部分の保護基の除去を行ない、溶媒を留去し
た後、ｐＨ２．０に調整した希塩酸と２０時間反応させ
ることにより、２’−Ｔｈｐ基と５’−末端の５’−Ｍ
ｏｘ基を除去し、こうして全ての保護基を除いた後、逆
相ＨＰＬＣ（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８）を用
いて、精製を行なう。以上の操作により、目的物のＲＮ
Ａフラグメントのウリジル酸の３０量体を合成すること
ができた。合成物の構造は次の方法により確認した。Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、合成オリゴリボ
ヌクレオチドの５’−末端を、３２Ｐでラベル化し、ド
ニス−ケラー（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌａｒ）法（前出）
により、その構造を確認した。
ジン誘導体に、保護されたウリジン誘導体を結合させる
ことができる。この操作を繰り返すことにより、ヌクレ
オチド鎖を順次のばしていく。１）の操作で遊離してき
た、Ｍｏｘを比色定量した結果算出した、各縮合反応の
平均収率は、９９％であった。合成反応が終了した後の
、脱保護操作は、常法〔Ｈ． Ｔａｎｉｍｕｒａ ら、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） １７，８１３５（１９８９）
〕に従って行なった。反応カラム中のＣＰＧを取り出し
てから、これをまずアンモニア／ピリジン（５：１）溶
液で、室温で１２時間、その後５５℃で３時間反応させ
ることにより、固相担体からのヌクレオチド鎖の切り出
しと、塩基部分の保護基の除去を行ない、溶媒を留去し
た後、ｐＨ２．０に調整した希塩酸と２０時間反応させ
ることにより、２’−Ｔｈｐ基と５’−末端の５’−Ｍ
ｏｘ基を除去し、こうして全ての保護基を除いた後、逆
相ＨＰＬＣ（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８）を用
いて、精製を行なう。以上の操作により、目的物のＲＮ
Ａフラグメントのウリジル酸の３０量体を合成すること
ができた。合成物の構造は次の方法により確認した。Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、合成オリゴリボ
ヌクレオチドの５’−末端を、３２Ｐでラベル化し、ド
ニス−ケラー（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌａｒ）法（前出）
により、その構造を確認した。
【００１７】
【実施例３】 ３８量体、ＵＵＡＡＵＡＡＵＧＣＵＣ
ＵＵＣＵＣＵＣＵＣＧＵＣＣＵＣＧＣＣＧＧＣＵＡＧＵ
Ａ（配列番号３）の合成 ５’位は９−フェニルキサンテニル（Ｐｉｘ）基で、２
’位はテトラヒドロピラニル（Ｔｈｐ）基で保護された
アデノシン誘導体が、１ｇ当り２０μｍｏｌ、導入され
たＣＰＧ １０ｍｇ（０．２μｍｏｌ）を、自動合成機
（ＡＢＩ社製のＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏ
ｄｅｌ ３８１ Ａ）にすえつけてある、反応カラムに
つめる。そして、ウリジンホスホロアミダイトユニット
を、０．２Ｍの濃度になるように、無水アセトニトリル
に溶解して、ユニット保存用のボトルにつめて、自動合
成機に取り付ける。それから以下の操作を自動合成機に
よって、反応カラム中で行なう。
ＵＵＣＵＣＵＣＵＣＧＵＣＣＵＣＧＣＣＧＧＣＵＡＧＵ
Ａ（配列番号３）の合成 ５’位は９−フェニルキサンテニル（Ｐｉｘ）基で、２
’位はテトラヒドロピラニル（Ｔｈｐ）基で保護された
アデノシン誘導体が、１ｇ当り２０μｍｏｌ、導入され
たＣＰＧ １０ｍｇ（０．２μｍｏｌ）を、自動合成機
（ＡＢＩ社製のＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏ
ｄｅｌ ３８１ Ａ）にすえつけてある、反応カラムに
つめる。そして、ウリジンホスホロアミダイトユニット
を、０．２Ｍの濃度になるように、無水アセトニトリル
に溶解して、ユニット保存用のボトルにつめて、自動合
成機に取り付ける。それから以下の操作を自動合成機に
よって、反応カラム中で行なう。
【００１８】１）２．０％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２処理を
６０秒間行ない、５’−Ｐｉｘ基を除去する。この溶液
は縮合収率を算定するために、保存しておく。 ２）アセトニトリルによりＣＰＧを洗浄する。 ３）アルゴンガスによりＣＰＧを乾燥させる。 ４）０．２Ｍウリジンホスホロアミダイトユニットと０
．４Ｍテトラゾールにより、縮合反応を５分間行なう。 ５）０．２５Ｍ無水酢酸／１−メチルイミダゾール／ル
チジン／テトラヒドロフラン溶液を３０秒間反応させる
ことにより、未反応の５’−水酸基をブロックする。 ６）０．１Ｍヨウ素／テトラヒドロフラン／ピリジン／
水により、酸化反応を３０秒間行なう。 ７）アセトニトリルによる洗浄、アルゴンガスによる乾
燥を行なう。
６０秒間行ない、５’−Ｐｉｘ基を除去する。この溶液
は縮合収率を算定するために、保存しておく。 ２）アセトニトリルによりＣＰＧを洗浄する。 ３）アルゴンガスによりＣＰＧを乾燥させる。 ４）０．２Ｍウリジンホスホロアミダイトユニットと０
．４Ｍテトラゾールにより、縮合反応を５分間行なう。 ５）０．２５Ｍ無水酢酸／１−メチルイミダゾール／ル
チジン／テトラヒドロフラン溶液を３０秒間反応させる
ことにより、未反応の５’−水酸基をブロックする。 ６）０．１Ｍヨウ素／テトラヒドロフラン／ピリジン／
水により、酸化反応を３０秒間行なう。 ７）アセトニトリルによる洗浄、アルゴンガスによる乾
燥を行なう。
【００１９】以上の操作で、ＣＰＧ上に導入されたアデ
ノシン誘導体に、保護されたウリジン誘導体を縮合させ
ることができる、次の塩基配列の保護されたグアノシン
誘導体を結合させるためには、同様に０．２Ｍの濃度に
溶解して自動合成機に取付けた後、１）及び４）につい
ては下記の通りにする以外は、上記の操作１）から７）
を繰り返して行なう。 １）２．０％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２処理を６０秒間行な
い、保護されたウリジン誘導体の５’−（Ｍｏｘ）基を
除去する。この溶液は、縮合収率を算定するために、保
存しておく。 ４）保護された０．２Ｍグアノシンホスホロアミダイト
ユニットと０．４Ｍテトラゾールにより縮合反応を５分
間行なう。
ノシン誘導体に、保護されたウリジン誘導体を縮合させ
ることができる、次の塩基配列の保護されたグアノシン
誘導体を結合させるためには、同様に０．２Ｍの濃度に
溶解して自動合成機に取付けた後、１）及び４）につい
ては下記の通りにする以外は、上記の操作１）から７）
を繰り返して行なう。 １）２．０％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２処理を６０秒間行な
い、保護されたウリジン誘導体の５’−（Ｍｏｘ）基を
除去する。この溶液は、縮合収率を算定するために、保
存しておく。 ４）保護された０．２Ｍグアノシンホスホロアミダイト
ユニットと０．４Ｍテトラゾールにより縮合反応を５分
間行なう。
【００２０】以上の操作を繰り返すことにより、ヌクレ
オチド鎖を、順次伸ばしていく。１）の操作で遊離して
きた、ＰｉｘあるいはＭｏｘを比色定量した結果算出し
た、各縮合反応の平均収率は、９９％以上であった。合
成反応が終了した後の、脱保護操作は、常法（Ｈ． Ｔ
ａｎｉｍｕｒａ ら、ヌクレイック アシッズ リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）， １７
， ８１３５（１９８９））に従って行なった。反応カ
ラム中のＣＰＧを取り出してから、これを、まず、アン
モニア／ピリジン（５：１）溶液で、室温で１２時間、
その後５５℃で３時間反応させることにより、固相担体
からのヌクレオチド鎖の切り出しと、塩基部分の保護基
の除去を行なう。溶媒を留去した後、ｐＨ２．０に調整
した希塩酸と、２０時間反応させることにより、２’−
Ｔｈｐ基と５’−末端のウリジンの５’−Ｍｏｘ基とを
除去する。こうしてすべての保護基を除いた後、逆相Ｈ
ＰＬＣ（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８）を用いて
、精製を行なう。以上の操作により、目的物のＲＮＡフ
ラグメントの３８量体 ＵＵＡＡＵＡＡＵＧＣＵＣＵＵ
ＣＵＣＵＣＵＣＧＵＣＣＵＣＧＣＣＧＧＣＵＡＧＵＡを
合成した。合成物の構造はつぎの方法により確認した。 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、合成オリゴリ
ボヌクレオチドの５’−末端を、３２Ｐでラベル化し、
Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌａｒ 法（Ｈ． Ｄｏｎｉｓ−Ｋ
ｅｌｌａｒ ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）， ４，
２５２７（１９７７））により、その構造を確認した。
オチド鎖を、順次伸ばしていく。１）の操作で遊離して
きた、ＰｉｘあるいはＭｏｘを比色定量した結果算出し
た、各縮合反応の平均収率は、９９％以上であった。合
成反応が終了した後の、脱保護操作は、常法（Ｈ． Ｔ
ａｎｉｍｕｒａ ら、ヌクレイック アシッズ リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）， １７
， ８１３５（１９８９））に従って行なった。反応カ
ラム中のＣＰＧを取り出してから、これを、まず、アン
モニア／ピリジン（５：１）溶液で、室温で１２時間、
その後５５℃で３時間反応させることにより、固相担体
からのヌクレオチド鎖の切り出しと、塩基部分の保護基
の除去を行なう。溶媒を留去した後、ｐＨ２．０に調整
した希塩酸と、２０時間反応させることにより、２’−
Ｔｈｐ基と５’−末端のウリジンの５’−Ｍｏｘ基とを
除去する。こうしてすべての保護基を除いた後、逆相Ｈ
ＰＬＣ（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８）を用いて
、精製を行なう。以上の操作により、目的物のＲＮＡフ
ラグメントの３８量体 ＵＵＡＡＵＡＡＵＧＣＵＣＵＵ
ＣＵＣＵＣＵＣＧＵＣＣＵＣＧＣＣＧＧＣＵＡＧＵＡを
合成した。合成物の構造はつぎの方法により確認した。 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、合成オリゴリ
ボヌクレオチドの５’−末端を、３２Ｐでラベル化し、
Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌａｒ 法（Ｈ． Ｄｏｎｉｓ−Ｋ
ｅｌｌａｒ ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）， ４，
２５２７（１９７７））により、その構造を確認した。
【００２１】
【実施例４】 ３９量体、ＵＧＵＧＵＣＵＡＣＵＵＣ
ＵＧＣＣＡＣＣＵＧＧＡＣＡＵＣＡＵＵＵＧＧＵＡＡＵ
ＡＧ（配列番号４）の合成 ５’位は９−フェニルキサンテニル（Ｐｉｘ）基で、２
’位はテトラヒドロピラニル（Ｔｈｐ）基で保護された
グアノシン誘導体が、１ｇ当り２０μｍｏｌ、導入され
たＣＰＧ １０ｍｇ（０．２μｍｏｌ）を、自動合成機
（ＡＢＩ社製のＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏ
ｄｅｌ ３８１ Ａ）にすえつけてある、反応カラムに
つめる。そして、アデノシンホスホロアミダイトユニッ
トを、０．２Ｍの濃度になるように、無水アセトニトリ
ルに溶解して、ユニット保存用のボトルにつめて、自動
合成機に取り付ける。それから以下の操作を自動合成機
によって、反応カラム中で行なう。 １）２．０％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２処理を６０秒間行な
い、５’−Ｐｉｘ基を除去する。この溶液は縮合収率を
算定するために、保存しておく。 ２）アセトニトリルによりＣＰＧを洗浄する。 ３）アルゴンガスによりＣＰＧを乾燥させる。 ４）０．２Ｍアデノシンホスホロアミダイトユニットと
０．４Ｍテトラゾールにより、縮合反応を５分間行なう
。 ５）０．２５Ｍ無水酢酸／１−メチルイミダゾール／ル
チジン／テトラヒドロフラン溶液を３０秒間反応させる
ことにより、未反応の５’−水酸基をブロックする。 ６）０．１Ｍヨウ素／テトラヒドロフラン／ピリジン／
水により、酸化反応を３０秒間行なう。 ７）アセトニトリルによる洗浄、アルゴンガスによる乾
燥を行なう。
ＵＧＣＣＡＣＣＵＧＧＡＣＡＵＣＡＵＵＵＧＧＵＡＡＵ
ＡＧ（配列番号４）の合成 ５’位は９−フェニルキサンテニル（Ｐｉｘ）基で、２
’位はテトラヒドロピラニル（Ｔｈｐ）基で保護された
グアノシン誘導体が、１ｇ当り２０μｍｏｌ、導入され
たＣＰＧ １０ｍｇ（０．２μｍｏｌ）を、自動合成機
（ＡＢＩ社製のＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏ
ｄｅｌ ３８１ Ａ）にすえつけてある、反応カラムに
つめる。そして、アデノシンホスホロアミダイトユニッ
トを、０．２Ｍの濃度になるように、無水アセトニトリ
ルに溶解して、ユニット保存用のボトルにつめて、自動
合成機に取り付ける。それから以下の操作を自動合成機
によって、反応カラム中で行なう。 １）２．０％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２処理を６０秒間行な
い、５’−Ｐｉｘ基を除去する。この溶液は縮合収率を
算定するために、保存しておく。 ２）アセトニトリルによりＣＰＧを洗浄する。 ３）アルゴンガスによりＣＰＧを乾燥させる。 ４）０．２Ｍアデノシンホスホロアミダイトユニットと
０．４Ｍテトラゾールにより、縮合反応を５分間行なう
。 ５）０．２５Ｍ無水酢酸／１−メチルイミダゾール／ル
チジン／テトラヒドロフラン溶液を３０秒間反応させる
ことにより、未反応の５’−水酸基をブロックする。 ６）０．１Ｍヨウ素／テトラヒドロフラン／ピリジン／
水により、酸化反応を３０秒間行なう。 ７）アセトニトリルによる洗浄、アルゴンガスによる乾
燥を行なう。
【００２２】以上の操作で、ＣＰＧ上に導入されたグア
ノシン誘導体に、保護されたアデノシン誘導体を縮合さ
せることができる。次の塩基配列の保護されたウリジン
誘導体を結合させるためには、同様に０．２Ｍの濃度に
溶解して自動合成機に取付けた後、１）及び４）につい
ては下記の通りにする以外は、上記の操作１）から７）
を繰り返して行なう。 １）２．０％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２処理を６０秒間行な
い、保護されたアデノシン誘導体の５’−（Ｐｉｘ）基
を除去する。この溶液は、縮合収率を算定するために、
保存しておく。 ４）保護された０．２Ｍウリジンホスホロアミダイトユ
ニットと０．４Ｍテトラゾールにより縮合反応を５分間
行なう。
ノシン誘導体に、保護されたアデノシン誘導体を縮合さ
せることができる。次の塩基配列の保護されたウリジン
誘導体を結合させるためには、同様に０．２Ｍの濃度に
溶解して自動合成機に取付けた後、１）及び４）につい
ては下記の通りにする以外は、上記の操作１）から７）
を繰り返して行なう。 １）２．０％ＤＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２処理を６０秒間行な
い、保護されたアデノシン誘導体の５’−（Ｐｉｘ）基
を除去する。この溶液は、縮合収率を算定するために、
保存しておく。 ４）保護された０．２Ｍウリジンホスホロアミダイトユ
ニットと０．４Ｍテトラゾールにより縮合反応を５分間
行なう。
【００２３】以上の操作を繰り返すことにより、ヌクレ
オチド鎖を、順次伸ばしていく。１）の操作で遊離して
きた、ＰｉｘあるいはＭｏｘを比色定量した結果算出し
た、各縮合反応の平均収率は、９９％以上であった。合
成反応が終了した後の、脱保護操作は、常法（Ｈ． Ｔ
ａｎｉｍｕｒａ ら、ヌクレイック アシッズ リサー
チ（ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）， １
７， ８１３５（１９８９））に従って行なった。反応
カラム中のＣＰＧを取り出してから、これを、まず、ア
ンモニア／ピリジン（５：１）溶液で、室温で１２時間
、その後５５℃で３時間反応させることにより、固相担
体からのヌクレオチド鎖の切り出しと、塩基部分の保護
基の除去を行なう。溶媒を留去した後、ｐＨ２．０に調
整した希塩酸と、２０時間反応させることにより、２’
−Ｔｈｐ基と５’−末端のウリジンの５’−Ｍｏｘ基を
除去する。 こうしてすべての保護基を除いた後、逆相ＨＰＬＣ（μ
Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８）を用いて、精製を行
なう。以上の操作により、目的物のＲＮＡフラグメント
の３９量体 ＵＧＵＧＵＣＵＡＣＵＵＣＵＧＣＣＡＣＣ
ＵＧＧＡＣＡＵＣＡＵＵＵＧＧＵＡＡＵＡＧ を合成し
た。合成物の構造はつぎの方法により確認した。Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて、合成オリゴリボヌク
レオチドの５’−末端を、３２Ｐでラベル化し、Ｄｏｎ
ｉｓ−Ｋｅｌｌａｒ 法（Ｈ． Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌ
ａｒ ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ（ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）， ４， ２５２
７（１９７７））により、その構造を確認した。
オチド鎖を、順次伸ばしていく。１）の操作で遊離して
きた、ＰｉｘあるいはＭｏｘを比色定量した結果算出し
た、各縮合反応の平均収率は、９９％以上であった。合
成反応が終了した後の、脱保護操作は、常法（Ｈ． Ｔ
ａｎｉｍｕｒａ ら、ヌクレイック アシッズ リサー
チ（ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）， １
７， ８１３５（１９８９））に従って行なった。反応
カラム中のＣＰＧを取り出してから、これを、まず、ア
ンモニア／ピリジン（５：１）溶液で、室温で１２時間
、その後５５℃で３時間反応させることにより、固相担
体からのヌクレオチド鎖の切り出しと、塩基部分の保護
基の除去を行なう。溶媒を留去した後、ｐＨ２．０に調
整した希塩酸と、２０時間反応させることにより、２’
−Ｔｈｐ基と５’−末端のウリジンの５’−Ｍｏｘ基を
除去する。 こうしてすべての保護基を除いた後、逆相ＨＰＬＣ（μ
Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８）を用いて、精製を行
なう。以上の操作により、目的物のＲＮＡフラグメント
の３９量体 ＵＧＵＧＵＣＵＡＣＵＵＣＵＧＣＣＡＣＣ
ＵＧＧＡＣＡＵＣＡＵＵＵＧＧＵＡＡＵＡＧ を合成し
た。合成物の構造はつぎの方法により確認した。Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて、合成オリゴリボヌク
レオチドの５’−末端を、３２Ｐでラベル化し、Ｄｏｎ
ｉｓ−Ｋｅｌｌａｒ 法（Ｈ． Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌ
ａｒ ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ（ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）， ４， ２５２
７（１９７７））により、その構造を確認した。
【００２４】
【発明の効果】本発明によってこれまで問題の多かった
２０量体以上のオリゴリボヌクレオチドの合成について
、自動合成機を利用して、簡便に、また迅速に製造でき
るようになった。こうして得られる合成ＲＮＡフラグメ
ントを用いることにより、色々な分子生物学的研究や、
構造化学的な研究の発展に寄与することができる。
２０量体以上のオリゴリボヌクレオチドの合成について
、自動合成機を利用して、簡便に、また迅速に製造でき
るようになった。こうして得られる合成ＲＮＡフラグメ
ントを用いることにより、色々な分子生物学的研究や、
構造化学的な研究の発展に寄与することができる。
【００２５】
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＣＵＣＧＵＣＣＵＣＧ ＣＣＧＧＣＵＡＧＵＡ
２０。
２０。
【００２６】配列番号：２
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ ＵＵ
ＵＵＵＵＵＵＵＵ
３０。
ＵＵＵＵＵＵＵＵ
３０。
【００２７】配列番号：３
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＵＵＡＡＵＡＡＵＧＣ ＵＣＵＵＣＵＣＵＣＵ Ｃ
ＧＵＣＣＵＣＧＣＣ ＧＧＣＵＡＧＵＡ
３
８。
ＧＵＣＣＵＣＧＣＣ ＧＧＣＵＡＧＵＡ
３
８。
【００２８】配列番号：４
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＵＧＵＧＵＣＵＡＣＵ ＵＣＵＧＣＣＡＣＣＵ ＧＧＡ
ＣＡＵＣＡＵＵ ＵＧＧＵＡＡＵＡＧ
３９。
ＣＡＵＣＡＵＵ ＵＧＧＵＡＡＵＡＧ
３９。
【００２９】
【図１】本発明で用いられる縮合反応を模式的に示した
図である。
図である。
Claims (2)
- 【請求項１】２’位がテトラヒドロピラニル基で保護さ
れ、５’位が９−フェニルキサンテニル基類で保護され
たリボヌクレオチドを１．５容量％から２．５容量％の
ジクロロ酢酸含有有機溶媒溶液で処理して５’位の保護
基を脱離させた後、２’位がテトラヒドロピラニル基で
保護され、５’位が９−フェニルキサンテニル基誘導体
で保護されたリボヌクレオチドユニットとの縮合反応に
付すことを特徴とする、オリゴリボヌクレオチドの製造
法。 - 【請求項２】２’位がテトラヒドロピラニル基で保護さ
れ、５’位が９−フェニルキサンテニル基類で保護され
たリボヌクレオチドを１．５容量％から２．５容量％の
ジクロロ酢酸含有有機溶媒溶液で処理して５’位の保護
基を脱離させ、２’位がテトラヒドロピラニル基で保護
され、５’位が９−フェニルキサンテニル基誘導体で保
護されたリボヌクレオチド誘導体との縮合反応に付し、
縮合反応後、すべての保護基を除去することを特徴とす
る、オリゴリボヌクレオチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3136086A JPH04330093A (ja) | 1990-07-20 | 1991-06-07 | オリゴリボヌクレオチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19076290 | 1990-07-20 | ||
| JP2-190762 | 1990-07-20 | ||
| JP3136086A JPH04330093A (ja) | 1990-07-20 | 1991-06-07 | オリゴリボヌクレオチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04330093A true JPH04330093A (ja) | 1992-11-18 |
Family
ID=26469763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3136086A Withdrawn JPH04330093A (ja) | 1990-07-20 | 1991-06-07 | オリゴリボヌクレオチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04330093A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004533488A (ja) * | 2001-07-03 | 2004-11-04 | アベシア・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド | オリゴヌクレオチド合成用のアクチベーター |
-
1991
- 1991-06-07 JP JP3136086A patent/JPH04330093A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004533488A (ja) * | 2001-07-03 | 2004-11-04 | アベシア・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド | オリゴヌクレオチド合成用のアクチベーター |
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| Date | Code | Title | Description |
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