KR20040015758A - 올리고뉴클레오티드 합성의 활성화제 - Google Patents
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Abstract
포스포라미다이트를 이용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 바람직하게는 유기 염기의 존재 하에서, 활성화제로서 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 이용한다. 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온은 화학식 1로 표현되며, 화학식 1에서 p는 0 또는 1 내지 4의 정수이고; X7은 O 또는 S이고; R은 각각의 경우에 치환기이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 할로, 치환 또는 비치환된 지방족기, -NR11R12, OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, 또는 시아노이거나; 두 개의 인접한 R기는 그들이 부착된 탄소원자와 함께 포화 또는 불포화의 6원환을 형성하고; 여기에서, R11및 R12는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이고; R13은 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기이다. 바람직한 유기 염기는 피리딘, 3-메틸피리딘, 또는 N-메틸이미다졸이다.
Description
포스포라미다이트(phosphoramidite) 합성법을 이용한 올리고뉴클레오티드의 제조는 뉴클레오시드 포스포라미다이트와 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드(nascent oligonucleotide)의 축합을 연루한다. 상기 축합 반응(여기서는 결합반응이라고도 한다)은 반응을 촉진시키는 활성화제(또는 결합 시약이라고도 알려져 있다)를 필요로 한다. 가장 널리 사용되는 활성화제는 친핵성 활성화제인 1H-테트라졸이다. 그러나, 1H-테트라졸은 폭발성이 있으며, 그리하여 대규모의 합성에 사용하기는 위험할 수 있다.
1H-테트라졸은 활성화의 제 1 단계동안 포스포라미다이트의 3가 인을 프로톤화시키는 약산이다. 그런 다음, 테트라졸라이드 음이온이 더 느린 제 2 단계동안 포스포라미다이트의 디알킬아민기(예: N,N-디이소프로필 아민)를 치환하여, 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드의 5'-일차알콜기와 신속하게 반응하는 테트라졸릴 중간체를 형성한다. t-부틸-디메틸실릴로 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미다이트 또는 2'-O-메틸뉴클레오시드 포스포라미다이트와 같은 공간적 장애를 갖는(sterically hindered) 포스포라미다이트를 올리고뉴클레오티드 합성에 사용할 때, 결합반응의 속도를 증가시키기 위해서 종종 또 다른 활성화제가 필요하다. 5-에틸티오-1H-테트라졸, 5-(p-니트로페닐)-1H-테트라졸, 및 벤지미다졸리움 트리플레이트와 같은 또 다른 활성화제는 종종 테트라졸보다 산성이 커서 3가 인의 프로톤화 속도를 가속화시키고, 그럼으로써 축합반응의 속도를 증가시킨다.
그러나, 테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸, 5-(p-니트로페닐)-1H-테트라졸, 및 벤지미다졸리움 트리플레이트가 산성이기 때문에, 그것들은 전형적으로 산성으로 변하기 쉬운 기인 포스포라미다이트의 5'-히드록시 보호기의 너무 이른 탈보호를 유발할 수 있다. 너무 이른 탈보호는 원하는 산물보다 하나의 염기가 더 긴 올리고뉴클레오티드 불순물("N+1 불순물"이라고 한다)을 생성시킬 수 있으며 원하는 생성물에서 분리하기 어렵다. RNA 합성에는 일반적으로 더 오랫동안의 결합반응 시간과 대량의 합성이 필요하며, 그 결과 포스포라미다이트의 때 이른 탈보호도 더 증가하게 된다.
그러므로, 올리고뉴클레오티드가 진단 및 치료에 보다 용이하게 사용될 수있도록 뉴클레오시드 포스포라미다이트의 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드와의 축합을 촉진하고 부산물을 증가시키지 않는 비폭발성 활성화제가 필요하다.
합성 올리고뉴클레오티드는 유전병 및 바이러스 질환의 진단을 위한 중요한 진단 수단이다. 또한, 올리고뉴클레오티드 및 변형 올리고뉴클레오티드는 유전자 발현 또는 단백질 작용을 억제하는 치료 후보물질로서 관심의 대상이다. 치료 후보물질로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드의 대량 합성은 FDA가 올리고뉴클레오티드 유사체를 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 치료에 사용하는 것을 승인한 이후로 그 중요성이 증가되어 왔으며, 그 이외의 여러 올리고뉴클레오티드 유사체가 현재 임상실험에 사용되고 있다.
발명의 요약
1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온이 뉴클레오시드 포스포라미다이트와 뉴클레오시드 모노머 또는 신생 올리고뉴클레오티드의 축합을 촉진시킬 것이라는 것을 발견하였다. 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온은 하기 화학식 1로 표현될 수 있다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
p는 0 또는 1 내지 4의 정수이다. 각각의 경우에 R은 치환기이며, 바람직하게는 각각 독립적으로 할로, 치환 또는 비치환된 지방족기, -NR11R12, OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, 시아노, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴, -CHO, -COR13, -NHCOR13, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 할로겐화 알킬(예: 트리플루오로메틸 및 트리클로로메틸), 또는 -SR13이다. 바람직하게는, R은 할로, 치환 또는 비치환된 지방족기, -NR11R12, OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, 또는 시아노이다. 또는, 두 개의 인접한 R기는 그들이 부착된 탄소원자와 함께 포화 또는 불포화의 6원환을 형성한다. 바람직하게는, 상기 6원환은 방향족 고리이다. R11및 R12는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이거나; 그들이 부착된 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성한다. R13은 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기이다. X7은 O 또는 S이다. 바람직하게는 X7은 O이다. X7은 O이고, p는 0인 것이 특히 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 유기 염기의 염복합체는 뉴클레오시드 포스포라미다이트의 뉴클레오시드 모노머 또는 신생 올리고뉴클레오티드와의 축합을 효과적으로 촉진시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예는 화학식 1의 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 유기 염기의 염복합체이다.
유기 염기의 존재 하에서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온은 특히 올리고뉴클레오티드 합성에 전형적으로 사용되는 유기 용매에서 용해도가 좋다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 구현예는 유기용매, 유기 염기, 및 화학식 1로 표시되는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 포함하는 활성화제 용액이다. 상기 활성화제 용액에서 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 유기 염기의 농도는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온의 용해도 이하로 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 유기 염기는 약 0.01 M 내지 약 2 M, 예를 들어 0.05 M 내지 0.5 M의 농도 범위로 존재할 수 있다. 일반적으로, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 유기 염기는 약 0.1 M 내지 약 0.25 M과 같이 0.25 M 이하의 농도로 존재한다. 보다 바람직한 구현예에서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 유기 염기는 동일한 몰농도로 존재한다. 바람직한 구현예에서, 유기용매는 아세토니트릴을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 유기용매는 디메틸포름아미드, 1-메틸-2-피롤리디논, 또는 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논과 같은 유기 아미드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포라미다이트 화학을 이용하여 합성할 수 있으며, 여기에서 결합시약(coupling agent)은 화학식 1의 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온이다. 결합시약은 유리 히드록시 또는 티올기를 갖는 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드 및 포스포라미다이트 간의 축합을 촉진시킨다. 바람직한 구현예에서, 유기 염기는 결합반응동안 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온과 함께 존재한다. 보다 바람직한 구현예에서, 유기 염기는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온과 동일한 몰농도로 존재한다.
뉴클레오시드 포스포라미다이트는 모노머 또는 다이머나 트라이머와 같은 올리고머일 수 있다. 뉴클레오시드 포스포라미다이트가 모노머일 경우, 그것은 하기 화학식 2a로 표현될 수 있다:
상기 화학식 2a에서,
각각의 X1은 독립적으로 -O- 또는 -S-이다. 바람직하게는, X1은 모든 경우에 -O- 이다. 각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, 또는 -NR-이다. 바람직하게는,X2는 모든 경우에 -O-이다. 각각의 X3는 독립적으로 -O-, -S-, -CH2-, 또는 -(CH2)2- 이다. 바람직하게는, X3는 모든 경우에 -O- 이다. 보다 바람직한 경우에, X1, X2, 및 X3는 모두 모든 경우에 -O- 이다. R1은 알콜 보호기 또는 티오 보호기이다. 바람직하게는, R1은 산으로의 변환이 용이한 보호기이다. R2는 각각 독립적으로 -H, -F, -OR6, -NR7R8, -SR9, 또는 메틸 또는 알릴과 같은 치환되거나 비치환된 지방족기이다. R3는 각각 독립적으로 -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환 또는 비치환된 지방족기, -OR10, -SR10, -O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, -O-CH2CH2-C6H4-NO2, -S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -S-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, 또는 -S-CH2CH2-C6H4-NO2이다. R4및 R5는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이다. 또는, R4및 R5는 그들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성한다. R6는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기(예: 메틸, 에틸, 메톡시에틸, 또는 알릴), 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 알콜 보호기, 또는 -(CH2)q-NR18R19이다. R7및 R8은 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 또는 아민 보호기이다. 또는, R7및 R8은 그들이 부착되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성한다. R9은 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 또는 티오 보호기이다. R10은 각각의 경우에 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기이다. R18및 R19는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 치환 또는 비치환된 헤테로아랄킬기, 또는 아민 보호기이다. 또한, R18및 R19는 그들이 결합된 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성한다. q는 1 내지 6의 정수이다. B는 -H, 천연 또는 비천연의 핵염기, 보호된 핵염기, 보호된 천연 또는 비천연의 핵염기, 헤테로고리, 또는 보호된 헤테로고리이다.
또 다른 구현예에서, 포스포라미다이트는 다이머 또는 트라이머와 같은 올리고머일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 포스포라미다이트 합성에 있어서 뉴클레오시드 포스포라미다이트 다이머 및 트라이머를 제조하고 이용하는 방법은, 전체가 참고로 여기에 통합되어 있는 국제특허출원 PCT/GB01/03973에 개시되어 있다.
포스포라미다이트의 당 모이어티는 자연적으로 생성되는 DNA 및 RNA 그리고 화학식 2a에서와 같이 D 배위이거나, L 배위일 수 있다. 화학식 2b는 L-뉴클레오시드 포스포라미다이트를 나타낸다:
상기 화학식 2b에서, X1, X2, X3, R1, R2, R3, R4, R5, 및 B는 상기 정의한 바와 같다.
또 다른 구현예에서, 뉴클레오시드 포스포라미다이트의 포스포라미다이트기는 당 고리의 5'-위치에 부착될 수 있다. 이러한 구현예에서, 뉴클레오시드 포스포라미다이트는 화학식 3a 및 3b로 표현될 수 있다:
상기 화학식 3a 및 3b에서, X1, X2, X3, R1, R2, R3, R4, R5, 및 B는 상기 정의한 바와 같다.
또 다른 구현예에서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온은 신생 n-mer 올리고뉴클레오티드와 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 축합시켜 (n+1)-mer 올리고뉴클레오티드를 형성하는 반응을 촉진시키기 위해서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오시드 포스포라미다이트는 화학식 2a로 표현될 수 있다. 신생 올리고뉴클레오티드는 화학식 4로 표현될 수 있다:
상기 화학식 4에서, X1, X2, X3, R2, R3, 및 B는 상기 정의한 바와 같다. 각각의 X4는 독립적으로 -O-, 또는 -S-이다. X5는 각각 독립적으로 -OH, 또는 -SH 이다. 바람직하게는, X5는 -OH 이다. R16은 히드록시 보호기, 티오 보호기, 아미노 보호기, -(CH2)q-NR18R19, 고체 기판, 또는 화학식 -Y2-L-Y2-R15와 같은 고체 기판에 부착된 분리 가능한 링커이다. Y2는 각각 독립적으로 단일 결합, -(C)O-, -C(O)NR17-, -C(O)O-, -NR17-, 또는 -O-이다. L은 바람직하게는 치환 또는 비치환된 지방족기 또는 치환 또는 비치환된 방향족기인 링커이다. 보다 바람직하게는, L은 에틸렌기이다. R17은 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 또는 치환 또는 비치환된 방향족기이다. R15는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 고체상 올리고뉴클레오티드 합성에 적절한 임의의 고체 기판이다. 적절한 고체 기판의 예로는 제어된-다공성 유리(controlled-pore glass), 폴리스티렌, 폴리(디메틸아크릴아미드)와 같은 미세 다공성 폴리아미드, 및 폴리에틸렌으로 코팅된 폴리스티렌이 있다. 많은 구현예에서, R16은 고체 기판에 부착된, 숙시닐 또는 옥살로일 링커와 같은 분리 가능한 링커이다. n은 0 또는 양의 정수이다.
신생 올리고뉴클레오티드를 포스포라미다이트 및 화학식 1의 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온과 접촉시킨다. 바람직한 구현예에서,신생 올리고뉴클레오티드가 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온과 접촉할 때, 유기 염기 또한 존재한다. 보다 바람직하게는, 유기 염기는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온와 동일한 농도로 존재한다. 신생 올리고뉴클레오티드는 포스포라미다이트와 반응하여, 5'-말단에 3가의 인을 갖는 화학식 5의 (n+1) 올리고뉴클레오티드를 형성한다:
상기 화학식 5에서, X1, X2, X3, X4, R1, R2, R3, R16, B, 및 n은 상기 정의한 바와 같다.
그런 다음, 화학식 5의 올리고뉴클레오티드를 산화제 또는 황화제와 접촉시켜 5가의 인 백본(back bone)을 갖는 하기 화학식 6의 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있다:
[화학식 6]
상기 화학식 6에서, X1, X2, X3, X4, R1, R2, R3, R16, B, 및 n은 상기 정의한 바와 같다.
(n+1) 올리고뉴클레오티드를 산화 또는 황화 한 후에, 포스포라미다이트와 반응하지 않은 X5기를 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 종래의 캡핑 기술로 캡핑할 수 있다. 예를 들어, 미반응의 X5기를 염기의 존재 하에서 산 클로라이드 또는 무수물과 반응시킬 수 있다. 전형적으로, X5를 아세틸 클로라이드 또는 아세틱 안하이드라이드로 캡핑한다.
산화 또는 황화 단계 후에, 또는 캡핑 단계 후에, (n+1)올리고뉴클레오티드를 시약과 반응시켜 R1을 제거함으로써 탈보호할 수 있다. R1이 산으로의 변환이 용이한 보호기라면, (n+1) 올리고뉴클레오티드를 산으로 처리하여 R1을 제거한다. R1이 t-부틸메틸실릴기 또는 트리이소프로필실릴기와 같은 트리알킬실릴기라면, (n+1) 올리고뉴클레오티드는 플루오라이드 이온으로 처리하여 R1을 제거할 수 있다. 전형적으로 t-부틸디메틸실릴 및 트리이소프로필실릴은 THF 중의 테트라부틸암모늄 플루오라이드 용액 또는 불화수소와 (C2H5)3N.3HF와 같은 짝염기로 처리함으로써 제거한다. t-부틸디메틸실릴을 제거하는 방법은 전체가 참고로 여기에 통합되어 있는 Greene 등, Protective Groups in Organic Synthesis(1991), John Wiley & Sons, Inc., 77-83쪽에서 찾아볼 수 있다. 상기 반응 단계, 또는 반응 주기를 1 회 이상 반복하여 원하는 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 5'-말단기가 보호된 올리고뉴클레오티드 생성물을 획득하고자 한다면, 캡핑 단계가 이루어진다면 상기 반응 주기의 최종 단계를 캡핑 단계로 하거나, 캡핑 단계가 이루어지지 않는다면 상기 반응의 최종 단계를 산화 또는 황화 단계로 할 수 있다. 산화 단계나 황화 단계, 또는 캡핑 단계가 최종 단계라면, 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 7로 나타낼 수 있다:
[화학식 7]
상기 화학식 7에서, X1, X2, X3, X4, R1, R2, R3, R16, 및 B 는 상기 정의한 바와 같다. m 은 정수이다.
또는, 상기 반응주기의 최종 단계는, 생성물이 5'-보호기를 갖지 않기를 원한다면, R1을 제거하는 단계일 수 있다. R1의 제거가 최종 단계일 경우, 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 8로 표현될 수 있다:
[화학식 8]
상기 화학식 8에서, X1, X2, X3, X4, X5, R1, R2, R3, R16, B, 및 m 은 상기 정의한 바와 같다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드는 탈보호될 수 있으며, 주어진 보호기 및/또는 고체 기판에 대해서 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있는 방법을 이용해서 고체 기판으로부터 분리할 수 있다.
유기 염기의 존재 하에서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온은 테트라졸과 적어도 동일한 효율을 갖도록 포스포라미다이트 축합반응을 촉진시킬 수 있다. 그러나, 테트라졸 대신 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 사용할 경우에는 바람직하지 않은 부산물이 보다 적게 생성된다. 또한, 본 발명의 복합체는 비폭발성이며, 그러므로 특히 올리고뉴클레오티드를 대량 합성할 경우 테트라졸보다 더 안전하다.
발명의 상세한 설명
여기에 사용된 지방족기는 완전히 포화되거나 하나 이상의 비공액의(unconjugated) 이중결합을 함유하는 선형 또는 분지형의 C1-C18탄화수소, 또는 완전히 포화되거나 하나 이상의 비공액의 이중결합을 함유하는 시클릭 C1-C18탄화수소를 포함한다. 알킬기는 완전히 포화된, 선형 또는 분지형의 C1-C8탄화수소 또는 C3-C8시클릭 탄화수소이다.
아릴기는 카보시클릭 방향족 고리 시스템(예: 페닐)과, 하나 이상의 카보시클릭 방향족에 융합된 카보시클릭 방향족 고리 시스템(예: 나프틸 및 안트라세닐) 또는 하나 이상의 비방향족 고리에 융합된 방향족 고리 시스템(예: 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸)을 포함한다.
여기에 사용된 헤테로시클릭기는 헤테로아릴기와 헤테로알리시클릴기를 포함한다. 여기에 사용된 헤테로아릴기는 방향족 고리에 황, 질소, 또는 산소로부터선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 갖는 방향족 고리 시스템을 포함한다. 바람직하게는, 헤테로아릴기는 1 개 내지 4 개의 헤테로 원자를 갖는 5원환 또는 6원환이다. 여기에 사용된 헤테로알리시클릴기는 바람직하게는 5 개 내지 6개의 원자를 가지며 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 비방향족 고리 시스템이다. 헤테로시클릴기의 예로는 몰폴리닐, 페페리디닐, 피페라지닐, 티오몰폴리닐, 피롤리디닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로티에닐, 아제티디닐, 테트라하이드로퓨릴, 디옥사닐 및 디옥세파닐 티에닐, 피리딜, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 인다졸릴, 퓨란, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 트리아졸, 피리미딘, 피라진, 티아졸, 이속사졸, 이소티아졸, 테트라졸, 옥사디아졸, 벤조(b)티에닐, 벤즈이미다졸, 인돌, 테트라하이드로인돌, 아자인돌, 인다졸, 퀴놀린,이미다조피리딘, 퓨린, 피롤로[2,3-d]피리미딘, 및 피라졸로[3,4-d]피리미딘이 있다.
여기에 사용되는 아자헤테로시클릴 화합물은 방향족 고리에 하나 이상의 질소 원자를 갖는 헤테로아릴기와 비방향족 고리 시스템에 하나 이상의 질소 원자를 갖는 헤테로알리시클릴을 포함한다. 바람직하게는, 아자헤테로아릴 화합물은 방향족 고리에 1 개 내지 3 개의 질소를 갖는 5원환 또는 6원환의 방향족 고리를 갖는다. 바람직하게는, 아자헤테로알리시클릴 화합물은 고리에 하나 또는 두 개의 질소를 포함하는 5원환 또는 6원환이다. 바람직한 아자헤테로시클릴 화합물은 유기 염기이다. 유기 염기인 아자헤테로시클릴 화합물의 예로는 피리미딘, 1-알킬피라졸, 특히 1-(C1-4알킬)피라졸, 1-아릴피라졸, 1-벤질피라졸, 피라진, N-알킬퓨린,특히 1-(C1-4알킬)퓨린, N-아릴퓨린, N-벤질퓨린, N-알킬피롤, 특히 N-(C1-4알킬)피롤, N-아릴피롤, N-벤질피롤, 피리딘, N-알킬이미다졸, 특히 N-(C1-4알킬)이미다졸, N-아릴이미다졸, 특히 N-페닐이미다졸, N-벤질이미다졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴녹살린, 퀴나졸린, N-알킬인돌, 특히 N-(C1-4알킬)인돌, N-아릴인돌, N-벤질인돌, N-알킬벤즈이미다졸, 특히 N-(C1-4알킬)벤즈이미다졸, N-아릴벤즈이미다졸, N-벤질벤즈이미다졸, 트리아진, 티아졸, 1-알킬-7-아자인돌, 특히 1-(C1-4알킬)-7-아자인돌, 1-아릴-7-아자인돌, 1-벤질-7-아자인돌, 피롤리딘, 몰폴린, 피페리딘, 및 피페라진이 있다. 특히 바람직한 아자헤테로시클릴 화합물은 피리딘 및 3-메틸피리딘과 같은 피리딘과 N-메틸이미다졸과 같은 N-(C1-4알킬)이미다졸 이다.
여기에 사용된 아랄킬기는 알킬기에 의해 모이어티에 결합된 방향족 치환체이다. 바람직한 아랄킬기로는 벤질기가 있다.
여기에 사용된 헤테로아랄킬기는 알킬기에 의해 모이어티에 결합된 헤테로아릴 치환체이다.
유기 염기는 pH 7에서 프로톤을 수용하는 경향이 있는 유기 화합물이다. 바람직한 유기 염기는 2급 아민, 3급 아민, 또는 아자헤테로시클릴 화합물이며, 각각은 하나 이상의 치환체에 의해 치환되거나 비치환될 수 있다. 비양성자성 유기 염기는 프로톤을 수용하기 이전에 그 화학 구조에 수소결합 프로톤을 갖고 있지 않는 유기 염기이다. 3급 아민 및 비양성자성 아자헤테로시클릴 화합물과 같은 비양성자성 유기 염기는 바람직하게는 축합반응을 촉진시키기 위해서 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온과 함께 사용된다.
3급 아민은 3개의 탄소 원자, 종종 3개의 아릴, 통상적으로는 페닐, 및/또는 알킬기, 통상적으로는 예를 들어 트리메틸아민, 트리에틸아민, 및 디이소프로필에틸아민과 같은 트리알킬아민을 포함한 3개의 알킬기에 결합된 질소 원자를 갖는 유기 염기이다. 또한, 3급 아민은 질소 원자가 비양성자성인 아자헤테로시클릴기일 수 있다. 아자헤테로시클릴기인 3급 아민이 바람직하다. 아자헤테로시클릴 3급 아민의 예로는 N-알킬피롤리딘, N-아릴피롤리딘, N-알킬피롤, N-아릴피롤, N-알킬몰폴린, N-아릴몰폴린, N-알킬피페리딘, N-아릴피페리딘, N,N-디알킬피페라진, N,N-디아릴피페라진, N-알킬-N-아릴-피페라진, 퀴누클리딘, 및 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔이 있다. 3급 아민은 또한 아자헤테로아릴 또는 아자헤테로알리시클릴 화합물일 수 있다.
2급 아민은 하나의 수소와 두 개의 탄소 원자에 결합된 질소를 포함하는 유기 염기이다. 통상적으로, 질소 원자는 두 개가 알킬기 또는 두 개의 아릴기에 결합하거나 아자헤테로시클릭기의 일부를 형성한다. 2급 아민 화합물의 예로는 디에틸아민과 디이소프로필아민이 있다.
지방족기, 아릴기, 아랄킬기, 헤테로아릴기, 아자헤테로아릴기, 및 헤테로알리시클릴의 적절한 치환체로는 아릴기, 할로겐화 아릴기, 알킬기, 할로겐환 알킬기(예: 트리플루오로메틸 및 트리클로로메틸), 지방족 에테르, 방향족 에테르,벤질, 치환된 벤질, 할로겐, 특히 클로로 및 플루오로기, 시아노, 니트로, -S-(지방족 또는 치환된 지방족기), 및 -S-(방향족 또는 치환된 방향족)이 있다.
아민, 히드록시, 및 티올 보호기는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있다. 아민 보호기의 예는, 전체가 참고로 여기에 통합되어 있는 Greene 등, Protectve Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, inc., 309-405쪽을 참조하면 된다. 바람직하게는, 아민은 아미드 또는 카바메이트로서 보호된다. 히드록시 보호기의 예는 Greene 등, Protectve Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, inc., 10-402쪽을 참조하면 된다. 바람직한 히드록시 보호기는 t-부틸디메틸실릴기이다. 티올 보호기의 예는 Greene 등, Protectve Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, inc., 277-308쪽을 참조하면 된다.
산으로의 변환이 용이한 보호기는 브론스테드산 또는 루이스산과 접촉시 제거될 수 있는 보호기이다. 산으로의 변환이 용이한 보호기는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있다. 통상적인 산으로의 변환이 용이한 보호기로는 치환 또는 비치환된 트리틸기(상기 참고문헌 60-62쪽), 치환 또는 비치환된 테트라하이드로피라닐기(상기 참고문헌 31-34쪽), 치환 또는 비치환된 테트라하이드로퓨라닐기(상기 참고문헌 36-37쪽) 또는 픽실기(상기 참고문헌 65쪽)가 있다. 트리틸기는 통상적으로 알콕시와 같은 전자 공여 치환체에 의해 치환된다. 바람직한 산으로의 변환이 용이한 보호기는 치환 또는 비치환된 트리틸, 예를 들어 4,4'-디메톡시트리틸(이하 "DMT"이라고 한다)이다.
뉴클레오시드 염기로는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 및 우라실과 같은 자연적으로 생성되는 염기와 7-데아자구아니딘, 7-데아자-8-아자구아니딘, 5-프로피닐시토신, 5-프로피닐우라실, 7-데아자아데닌, 7-데아자-8-아자아데닌, 7-데아자-6-옥소퓨린, 6-옥소퓨린, 3-데아자아데노신, 2-옥소-5-메틸피리미딘, 4-옥소-5-메틸피리미딘, 2-아미노-퓨린, 5-플루오로우라실, 2,6-디아미노퓨린, 8-아미노퓨린, 4-트리아졸로-5-메틸티민, 및 4-트리아졸로-5-메틸우라실과 같은 변형된 염기가 있다.
보호된 뉴클레오시드 염기는 염기의 반응성 작용기가 보호되는 뉴클레오시드 염기이다. 유사하게, 보호된 헤테로고리는 헤테로 고리의 반응성 치환기가 보호된 헤테로고리이다. 전형적으로, 뉴클레오시드 염기 또는 헤테로사이클은 아미드 또는 카바메이트와 같이 아민 보호기로 보호될 수 있는 아민기를 갖는다. 예를 들어, 아데닌과 시토신의 아민기는 전형적으로 벤조일 보호기로 보호하며, 구아닌의 아민기는 전형적으로 이소부티릴기, 아세틸기, 또는 t-부틸페녹시아세틸기로 보호한다. 그러나, 그 이외의 보호 전략을 이용할 수도 있다. 예를 들어, 신속한 탈보호를 위해서, 아데닌 및 구아닌의 아민기는 페녹시아세틸기로 보호하며, 시토신의 아민기는 이소부티릴기 또는 아세틸기로 보호한다. 핵염기 또는 헤테로고리 보호기 제거를 위한 조건은 사용되는 보호기에 의존할 것이다. 아미드 보호기를 사용할 경우, 올리고뉴클레오티드를 농축 암모늄 히드록시드 용액, n-메틸아민 용액, 또는 암모늄 히드록시드 중의 t-부틸아민 용액과 같은 염기 용액으로 처리함으로써 제거될 수 있다.
여기에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 예를 들어 2'-데옥시리보핵산(이하 "DNA")과 같은 자연적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드와 리보핵산(이하 "RNA"), 및 변형된 당 모이어티, 변형된 인산 모이어티, 또는 변형된 핵염기 모이어티를 함유하는 핵산을 포함한다. 당 모이어티의 변형은 리보오스 고리를 헥소오스, 시클로펜틸 고리, 또는 시클로헥실 고리로 치환하는 것을 포함한다. 또는, 자연적으로 생성되는 핵산의 D-리보오스 고리를 L-리보오스로 치환하거나, 자연적으로 생성되는 핵산의 b-아노머를 a-아노머로 치환할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 비염기성 모이어티를 포함할 수 있다. 변형된 인산 모이어티로는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트, 메틸 포스페이트, 및 포스포라미데이트가 있다. 그러한 핵산 유사체는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 중 두 개 이상의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 제조될 수 있으며, 예를 들어 데옥시리보- 및 리보뉴클레오시드의 혼합물, 특히 데옥시리보뉴클레오시드 및 2'-O-메틸이나 2'-O-메톡시에틸 리보뉴클레오시드와 같은 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 있다. 뉴클레오시드의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 예로는 리보자임이 있다.
키메릭 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 연결(linkage)을 모두 갖는 올리고뉴클레오티드이다.
합성 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 2 내지 100 개의 핵염기를 갖는다. 보다 바람직하게는, 합성 올리고뉴클레오티드는 2 내지 약 75 개의 핵염기를 갖는다. 현재 치료학적으로 관심이 있는 많은 합성 올리고뉴클레오티드는 8 내지 40 개의 핵염기를 포함한다.
올리고뉴클레오티드의 합성은 용액 또는 고체 기판 상에서 이루어 질 수 있다. 상기 합성이 용액에서 이루어 질 때, R16은 알콜, 아민, 또는 티올 보호기이다. 올리고뉴클레오티드를 합성한 후에, 알콜, 아민, 또는 티올 보호기를 제거할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 고체 기판 상에서 합성하는 경우에는, R16은 고체 기판을 나타내거나, 바람직하게는 화학식 -Y2-L-Y2-R15기와 같은 고체 기판에 부착된 분리 가능한 링커를 나타낸다. 일반적으로, 신생 올리고뉴클레오티드와 포스포라미다이트 모노머의 축합을 촉진시키기 위해 테트라졸 대신 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 화합물을 이용한 올리고뉴클레오티드의 용액상 합성 또는 고체상 합성은 활성화제로서 테트라졸을 이용하여 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 개발되었던 방법과 유사하게 수행한다. 축합 반응을 촉진시키기 위해 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 이용하는 올리고뉴클레오티드의 용액상 합성 또는 고체상 합성의 전형적인 조건의 예를 아래에 나타내었다.
올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 제 1 단계는 화학식 2a의 포스포라미다이트와 같은 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 화학식 4의 5-보호된 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드와 같은, 유리 히드록시기 또는 티올기를 갖는 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드와 결합시키는 것을 포함한다. 상기 결합 반응 동안, 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드의 히드록시기 또는 티올기는 -NR4R5기를 치환함으로써 뉴클레오시드 포스포라미다이트와 반응한다. 합성이 용액에서 이루어질 때, 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드는 종종 약 0.001 M 내지 1.0 M의 농도로 존재하며, 바람직하게는 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드는 약 0.025 M 내지 약 0.5 M로 존재한다. 뉴클레오시드 포스포라미다이트는 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드에 대하여 바람직하게는 약 1.1 eq 내지 약 2 eq의 농도로 존재한다. 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드에 대하여 약 0.5 eq, 종종 약 2.5 eq 내지 약 5.0 eq만큼 축합 반응을 촉진시키기 위해 부가한다. 바람직하게는, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 피리디늄염, 3-피콜리늄염, 또는 N-메틸이미다졸륨염과 같은 유기 염기와의 염복합체로서 부가한다. 상기 반응시간은 통상적으로 약 20 분 내지 약 60 분이고, 화학식 5의 구조를 갖는 신생 올리고뉴클레오티드와 같은 말단 3급 인 연결을 갖는 (n+1) 신생 올리고뉴클레오티드가 형성된다.
올리고뉴클레오티드를 제조하는 제 2 단계는 신생 올리고뉴클레오티드의 말단 3가 인 그룹을 산화하거나 황화하는 것을 포함한다. 용액상 합성에서, 산화 반응은 종종 올리고뉴클레오티드를 물의 존재 하에서 I2와 같은 산화제, 또는 유기 용매 중에서 t-부틸 과산화수소와 같은 과산화물로 처리함으로써 수행한다. I2및 물을 사용할 경우, 산화 용액은 전형적으로 염기의 존재 하에서 1.1 내지 1.8 eq의 I2와 미량의 물을 함유한다. 상기 반응은 3급 알킬아민과 같은 염기 및 약 1 %의 물과 함께 혼합된, THF와 같은 비양성자성 극성 용매에서 수행한다. 비양성자성 용매:염기의 비율은 약 4:1(부피/부피) 내지 약 1:4(부피/부피)이다. 약 5분 내지 약 20분 후에, 상기 반응 혼합물을 소듐 바이설파이트 수성 용액에 부어, 과량의 요오드를 급냉시킨 다음, 유기용매로 추출한다.
또는, 말단 3가 인 그룹을 올리고뉴클레오티드 합성의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 임의의 황 전이 시약을 사용하여 황화시킬 수 있다. 황 전이 시약의 예로는 3H-벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드(또한, 보케이지 시약(beaucage reagent)이라고도 함), 디벤조일 테트라술파이드, 페닐아세틸 디술파이드, N,N,N',N'-테트라에틸티우람 디술파이드, 황 원소, 및 3-아미노-[1,2,4]디티아졸-5-디티온이 있다(전체가 참고로 여기에 통합되어 있는 미국특허 6,096,881 참조). 상기 시약을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 황화하기 위한 반응 조건을 전체가 참고로 여기에 통합되어 있는 Beaucage 등, Tetrahedron(1993), 49:6123에서 찾아볼 수 있다. 3-아미노-[1,2,4]디티아졸-5-티온은 바람직한 황 전이 시약이다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드를 피리딘/아세토니트릴(1:9) 혼합물 또는 피리딘과 같은 유기 용매 중에서 약 0.05 M 내지 약 0.2 M의 농도를 갖는 3-아미노-[1,2,4]디티아졸-5-티온 용액과 접촉시킨다. 상기 황화 반응은 통상적으로 약 30 초 내지 약 2 분 후에 완전히 종결된다.
올리고뉴클레오티드의 산화 또는 황화 후에, 임의의 미반응의 유리 히드록시기 또는 티올기는 이후의 결합 단계에서 반응할 수 없도록 캡핑될 수 있다. 캡핑이 일어나지 않은 서열은 보다 용이하게 전장 올리고뉴클레오티드 생성물로부터 분리될 수 있다. 히드록시기 또는 티올기와 반응하여 포스포라미다이트와의 반응을 차단하는 임의의 시약을 캡핑 시약으로서 사용할 수 있다. 전형적으로, 아세틱 안하이드라이드나 이소부티릭 안하이드라이드와 같은 무수물, 또는 아세틸 클로라이드나 이소부티릴 클로라이드와 같은 산 클로라이드를 염기의 존재 하에서 캡핑 시약으로서 사용한다.
캡핑 반응이 완결된 후에, R1보호기를 제거한다. R1이 산으로의 변환이 용이한 보호기일 경우, 올리고뉴클레오티드를 산으로 처리함으로써 R1을 제거한다. 바람직하게는, R1은 4,4'-디메톡시트리틸과 같은 트리틸기이다. R1이 트리틸기일 경우, 올리고뉴클레오티드를 디클로로메탄 또는 톨루엔과 같은 유기 용매 중의 디클로로아세트산 또는 트리클로로아세트산 용액으로 처리함으로써 제거할 수 있다. 일단 R1보호기를 제거하면, 반응 주기(즉, 결합단계, 산화 또는 황화 단계, 캡핑 단계(선택적), 및 탈보호 단계)를 선택적으로 1 회 이상 반복하여 원하는 길이의 올리고뉴클레오티드를 획득할 수 있다.
키메릭 올리고뉴클레오티드는 1 회 이상의 반응 주기에서 말단의 3가 인 그룹을 산화하고 그 이외의 1 회 이상의 반응 주기에서 3가 인 그룹을 황화함으로써 제조할 수 있다. 또는, 키메릭 올리고뉴클레오티드는 R3기 중 일부가 -OCH2CH2CN과 같은 보호된 히드록시기이고 R3기 중 일부가 -SCH2CH2CN과 같은 보호된 티올기인 포스포라미다이트 모노머를 선택함으로써 제조할 수 있다. 이러한 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 각각의 반응 주기에서 결합 단계 후에 산화시킨다.
R1기가 남아 있는 올리고뉴클레오티드를 얻고자 할 경우에는, 캡핑 단계가 이루어진다면 반응 주기의 최종 단계는 캡핑 단계이거나, 캡핑 단계가 이루어지지 않는다면 반응 주기의 최종 단계는 산화 또는 황화 단계일 수 있다. R1이 탈보호된 올리고뉴클레오티드를 원할 경우, 반응 주기는 탈보호 단계에서 종결된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드가 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 정제될 경우, R1이 보호된 올리고뉴클레오티드가 원하는 생성물이다. 올리고뉴클레오티드가 이온교환크로마토그래피 또는 전기영동에 의해 정제될 경우, R1이 탈보호된 올리고뉴클레오티드가 원하는 생성물이다.
뉴클레오시드 포스포라미다이트를 유리 히드록시기 또는 티올기를 갖는 지지체에 결합된 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드와 축합반응하는 것을 촉진시키기 위하여, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온과 바람직하게는 유기 염기를 이용하여 올리고뉴클레오티드를 고체상 합성하는 것은 일반적으로 용액상 합성에서와 동일한 반응주기 및 시약을 이용한다. 일반적으로, 우선 사용하는 특정 레진에 적절한 최대의 크기로 뉴클레오시드를 고체 지지체에 로딩한다. 예를 들어, 로딩은 지지체 1 g 당 약 50μmole 내지 약 700 μmole이 될 수 있다. 축합 단계에서, 아세토니트릴과 같은 유기 용매 중에서 전형적으로 약 0.01 M 내지 약 1 M, 바람직하게는 0.1 M의 농도를 갖는 뉴클레오시드 포스포라미다이트 용액을 고체 지지체에 결합된 뉴클레오시드와 반응시켜 말단에 3가의 인 결합을 갖는 신생 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 화학식 2a 또는 2b의 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 사용할 경우, 상기 신생 올리고뉴클레오티드는 결합 반응을 완결한 후 5'-말단에 3가의 인 연결을 가질 것이다. 화학식 3a 또는 3b의 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 사용할 경우, 상기 신생 올리고뉴클레오티드는 결합 반응을 완결한 후 5'-말단에 3가의 인 연결을 가질 것이다. 바람직하게는, 화학식 2a의 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 사용한다. 약 0.015 M 내지 약 1.5 M의 농도를 가지며, 종종 약 0.05 M내지 약 0.5 M의 농도, 바람직하게는 0.1 내지 0.25 M의 농도를 갖는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 용액을 일반적으로 축합반응 전 또는 축합반응 동안에 포스포라미다이트 모노머를 함유하는 용액과 혼합한다. 바람직하게는, 유기 염기 또한 약 0.015 M 내지 약 1.5 M, 종종 약 0.05 M 내지 약 0.5 M, 바람직하게는 0.1 M 내지 0.25 M의 농도로 용액에 존재한다. 바람직하게는, 유기 염기는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온과 동일한 몰농도로 존재한다. 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온은 뉴클레오시드 포스포라미다이트에 대한 몰비로, 즉 화학양론적 양보다 적게, 또는 화학양론적인 몰비이거나 화학양론적 몰비보다 더 큰 몰비로 이용될 수 있다. 많은 구현예에서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 : 뉴클레오시드 포스포라미다이트의 몰비는 약 0.2:1 내지 5:1, 종종 0.25:1 내지 4:1, 바람직하게는 약 0.3:1 내지 2:1의 범위이며, 예를 들어 약 1:1이다. 그런 다음, 지지체에 결합된 5'-탈보호된 뉴클레오시드를 약 2 분 내지 약 10 분간, 바람직하게는 약 5 분간 혼합물과 접촉시킨다.
결합반응이 완결된 후에 말단의 3가 인 연결을 산화시키고자 한다면, 신생 올리고뉴클레오티드를 함유하는 고체 지지체를 아세토니트릴 또는 톨루엔과 같은 유기용매에서 I2와 물의 혼합물 또는 t-부틸 하이드로퍼옥사이드와 같은 과산화물과 같은 산화제와 접촉시킨다. I2와 H2O의 혼합물이 바람직한 산화제이다. I2와 물의 혼합물을 사용할 경우, 그 이외의 수용성 유기 용매 또한 존재할 수 있다. 전형적으로, 3가 인의 뉴클레오티드간 결합을 함유하는 고체 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드를 물, 비양성자성 수용성 용매, 및 염기의 용매 혼합물 중의 I2용액과 접촉시킬 수 있다. 전형적인 산화 용액의 예는 (2:80:20) 물/테트라하이드로퓨란/루티딘(부피/부피/부피) 용액 중 I2가약 0.05 M 내지 약 1.5 M인 용액이다. 고체 지지체는 전형적으로 약 30 초 내지 1.5 분동안 I2용액으로 처리한다.
또는, 고체 지지체에 결합된 신생 올리고뉴클레오티드를 유기 용매중의 황 전이 시약 용액과 접촉시켜 3가 인 그룹을 황화시킬 수 있다. 예를 들어, 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드를 약 30 초 내지 약 2 분 동안 아세토니트릴 또는 피리딘과 같은 유기 용매에서 3-아미노-[1,2,4]-디티아졸-5-티온 용액(약 0.05 M - 0.2 M)과 접촉시킬 수 있다.
고체상 올리고뉴클레오티드 합성에서, 고체 지지체에 결합된 신생 올리고뉴클레오티드는 필요에 따라 약 30 초 내지 약 1 분 동안 캡핑 시약과 접촉시킬 수 있다. 캡핑 단계 후에, 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드를 산 용액과 약 1 분 내지 3 분간 접촉시킴으로써 탈보호 단계를 수행한다. 상기 반응 주기는 원하는 길이의 올리고뉴클레오티드를 합성할 때까지 선택적으로 1 회 이상 반복할 수 있다. 용액상 합성에서와 같이, 반응 주기가 캡핑 단계 또는 산화나 황화 단계로 종결될 때는 R1이 보호된 올리고뉴클레오티드를 획득하게 된다. 반응 주기가 탈보호 단계에서 종결될 때는, R1이 탈보호된 올리고뉴클레오티드가 얻어진다.
고체상 합성이 종결될 때, 고체 기판으로부터 올리고뉴클레오티드를 표준방법으로 제거할 수 있다. 일반적으로, 고체 지지체를 농축된 수산화암모늄 용액으로 25℃-60℃에서 뉴클레오티드 서열에 따라 그리고 이 단계 동안 핵염기 보호기를 제거하고자 하는 지 여부에 따라 약 0.5 시간 내지 약 16 시간 또는 더 오랫동안 처리한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드를 이온교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 적절한 용매 중에서의 침전 중 하나 이상의 방법과 같이 당해기술분야의 공지의 방법으로 정제한다. 예를 들어 한외 여과에 의한 생성물의 추가적인 처리를 또한 적용할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 측면은 뉴클레오시드 포스포라미다이트, 바람직하게는 뉴클레오시드 3'-포스포라미다이트를, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 N-알킬이미다졸, 바람직하게는 N-메틸이미디졸의 혼합물을 포함하는 활성화제의 존재 하에서, 유리 히드록시기, 바람직하게는 유리 5'-히드록시기를 포함하는 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레티드와 결합시키는 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성방법을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 포스포라미다이트는 통상적으로 화학식 -P(OCH2CH2CN)N(CH(CH3)2)2모이어티를 포함한다. 통상적으로, 이러한 구현예에서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 N-알킬이미다졸 각각의 농도는 0.1 내지 0.25 M이며, 바람직하게는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 : N-알킬이미다졸의 몰비는 약 1:1 내지 약 1.5:1, 가장 바람직하게는 1:1 이다. 특히 바람직한 구현예에서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 : 포스포라미다이트의 몰비는 0.5:1 내지 2:1 이다.
본 발명을 하기 비제한적 실시예를 통해 설명하고자 한다.
실시예 1: 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ
6
-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 피리딘의 염복합체 제조
1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 아세토니트릴에 현탁하고 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온에 대하여 1.1eq의 피리딘을 상기 현탁액에 적가하였다. 상기 용액은 피리딘 적가가 끝날 무렵에 맑아졌으며, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 피리딘의 염복합체를 미세한 결정 물질로서 용액으로부터분리하였다. 상기 결정을 에테르 또는 헥산 중 어느 하나로 세척하여 미량의 피리딘 및 아세토니트릴을 제거하였다.1H NMR(DMSO) 화학적 쉬프트(ppm): 8.8(2H,s), 8.2(1H, q), 8.0(1H, q), 및 7.6-7.9(6H, m).
실시예 2: 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ
6
-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 3-피콜린의 염복합체 제조
1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 3-피콜린의 염복합체를 실시예 1에 기재한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.1H NMR(DMSO) 화학적 쉬프트(ppm): 8.8(1H, s), 8.72(1H, d), 8.27(1H, d), 8.0(2H, d), 7.77-7.93(6H, m), 및 2.45(3H, s).
실시예 3: 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ
6
-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 N-메틸이미다졸의 염복합체 제조
1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 아세토니트릴에 현탁하고, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온에 대하여 1.1eq의 N-메틸이미다졸을 상기 현탁액에 적가하였다. 상기 용액 혼합물을 감압 하에 농축하여 결정성 염을 형성시킨 다음, 그 결정성 염을 에테르 또는 헥산 중 어느 하나로 세척하여 미량의 N-메틸이미다졸 및 아세토니트릴을 제거하였다.1H NMR(DMSO) 화학적 쉬프트(ppm): 13.9(1H,s), 9.03(1H, s), 7.59-7.75(6H, m), 및 3.88(3H, s).
실시예 4: 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ
6
-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 유기 염기를 이용한 데옥시리보-올리고뉴클레오티드의 합성
올리고뉴클레오티드의 합성을 DNA 합성기 Oligo Pilot Ⅱ(Amersham Pharmacia Biotech) 상에서 수행하였다. 표준 포스포라미다이트 화학 프로토콜을 약간 변형하여 합성하였다. 포스포라미다이트 모노머의 농도는 아세토니트릴에서 0.1 M 하였다. 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 피리딘, 3-피콜린, 또는 N-메틸이미다졸의 염복합체를 축합 단계 동안 활성화제로서 테트라졸 대신 사용하였다. 염복합체의 농도는 아세토니트릴 중에서 0.25 M 이었다. 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 염복합체를 이용하여 체인을 신장시키기 위해 소요되는 결합 시간은 테트라졸이 활성화제로 사용될 때 소요되는 결합 시간과 유사하다. 상기 축합 단계 후에, 포스파이트 트리에스테르 연결을 요오드 용액으로 또는 보케이지 시약 또는 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온으로 안정한 포스포로티오에이트 트리에스테르로 변환시켰다. 합성이 끝날 때, 올리고뉴클레오티드를 분리하고 β-시아노에틸 보호기와 핵염기 보호기를 제거하기 위해, 충분히 보호된 올리고뉴클레오티드가 연결된 고체 지지체를 농축 수산화암모늄 중의 10% t-부틸아민으로 16-20 시간 동안 50℃에서 처리하였다. 조올리고뉴클레오티드(crude oligonucleotide)를 이온교환 HPLC, 모세관 전기영동, 및 MALDI-TOF 질량 분광분석법으로 분석하고 활성화제로서 테트라졸을 사용하여 제조한 올리고뉴클레오티드와 비교하였다. 표 1은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 서열 5' TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT 3'(SEQ ID NO 1)을 합성하기 위해 사용한 조건을 나타내며, 표 2는 다양한 합성으로부터 획득된 결과를 나타낸다. 표 1 및 2에 나타낸 염복합체는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 N-메틸이미다졸 및 N-메틸이미다졸이다.
[표 1]
SEQ ID NO 1의 합성을 위한 합성 파라미터
| 고체 지지체 | 합성 규모 | 활성화제 | 아미다이트 몰당량 | 활성화제:아미다이트 | 황화제의 당량 |
| CPG-비즈(beads) | 746μmol | 테트라졸 | 2.0 equ. | 4.3 | 3.2 |
| CPG-비즈 | 737μmol | 염-복합체 | 2.0 equ. | 4.0 | 3.3 |
| CPG-비즈 | 737μmol | 염-복합체 | 1.5 equ. | 3.3 | 3.3 |
| 경질 PS | 626μmol | 염-복합체 | 2.0 equ. | 4.0 | 3.8 |
| 경질 PS | 600μmol | 테트라졸 | 2.0 equ. | 4.3 | 4.0 |
[표 2]
SEQ ID NO 1의 분석 및 결과
| 고체지지체 | 규모 | 활성화제 | 아미다이트몰당량 | 총 OD유닛 | CGE에 의한 FLP | HPLC에 의한 FLP | 분자량 |
| CPG비즈 | 746μmol | 테트라졸 | 2.0 equ | 84504 | 74 % | 77 % | 5688 |
| CPG비즈 | 737μmol | 염복합체 | 2.0 equ | 82134 | 77 % | 79 % | 5687 |
| CPG비즈 | 737μmol | 염복합체 | 1.5 equ | 82320 | 77 % | 79 % | 5689 |
| 경질 PS | 626μmol | 염복합체 | 2.0 equ | 80712 | 76 % | 76 % | 5686 |
| 경질 PS | 600μmol | 테트라졸 | 2.0 equ | 75006 | 73 % | 71 % | 5687 |
| FLP = 전장 생성물, CGE = 모세관 겔 전기영동, HPLC =이온교환 HPLC |
본 발명을 특히 그 바람직한 구현예를 참조하여 나타내고 설명하였지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 정해지는 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 실시 형태 및 세부 사항에 있어 다양한 변화를 가할 수 있다는 것을 알아야 한다.
Claims (64)
- 유기 염기 및 하기 화학식 1로 표현되는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 포함하는 염 복합체:[화학식 1]상기 화학식 1에서,p는 0 또는 1 내지 4의 정수이고,X7은 O 또는 S이며;R는 각각의 경우에 치환기이다.
- 제 1 항에 있어서, 각각의 R은 독립적으로 할로, 치환 또는 비치환된 지방족기, -NR11R12, OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, 시아노, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴, -CHO, -COR13, -NHCOR13, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 -SR13이거나; 두 개의 인접한 R기는 그들이 부착된 탄소원자와 함께 포화 또는불포화의 6원환을 형성하고; 여기에서,R11및 R12는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이거나; 그들이 부착된 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하며;R13은 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기인 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 유기 염기는 아민인 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제 3 항에 있어서, 상기 아민은 3급 아민인 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제 4 항에 있어서, 상기 3급 아민은 트리알킬아민, 치환 또는 비치환된 N-알킬피롤리딘, 치환 또는 비치환된 N-아릴피롤리딘, 치환 또는 비치환된 N-알킬피롤, 치환 또는 비치환된 N-아릴피롤, 치환 또는 비치환된 N-알킬몰폴린, 치환 또는 비치환된 N-아릴몰폴린, 치환 또는 비치환된 N-알킬피페리딘, 치환 또는 비치환된 N-아릴피페리딘, 치환 또는 비치환된 N,N-디알킬피페라진, 치환 또는 비치환된 N,N-디아릴피페라진, 치환 또는 비치환된 N-알킬-N-아릴피페라진, 치환 또는 비치환된 퀴누클리딘, 및 치환 또는 비치환된 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7엔으로구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제 3 항에 있어서, 상기 아민은 치환 또는 비치환된 아자헤테로시클릴 화합물인 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제 6 항에 있어서, 상기 아자헤테로시클릴 화합물은 치환 또는 비치환된 피리미딘, 치환 또는 비치환된 1-알킬피라졸, 치환 또는 비치환된 1-아릴피라졸, 치환 또는 비치환된 피라진, 치환 또는 비치환된 N-알킬퓨린, 치환 또는 비치환된 N-아릴퓨린, 치환 또는 비치환된 N-알킬피롤, 치환 또는 비치환된 N-아릴피롤, 치환 또는 비치환된 피리딘, 치환 또는 비치환된 N-알킬이미다졸, 치환 또는 비치환된 N-아릴이미다졸, 치환 또는 비치환된 퀴놀린, 치환 또는 비치환된 이소퀴놀린, 치환 또는 비치환된 퀴녹살린, 치환 또는 비치환된 퀴나졸린, 치환 또는 비치환된 N-알킬인돌, 치환 또는 비치환된 N-아릴인돌, 치환 또는 비치환된 N-알킬벤즈이미다졸, 치환 또는 비치환된 N-아릴벤즈이미다졸, 치환 또는 비치환된 트리아진, 치환 또는 비치환된 트리아졸, 치환 또는 비치환된 1-알킬-7-아자인돌, 치환 또는 비치환된 1-아릴-7-아자인돌, 치환 또는 비치환된 피롤리딘, 치환 또는 비치환된 몰폴린, 치환 또는 비치환된 피페리딘, 및 치환 또는 비치환된 피페라진으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제 7 항에 있어서, 상기 아자헤테로시클릴 화합물은 피리딘, 3-메틸피리딘,또는 N-메틸이미다졸인 것을 특징으로 하는 복합체.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X7은 O이고 p는 0인 것을 특징으로 하는 복합체.
- 비양성자성 용매, 유기 염기, 및 하기 화학식 1로 표현되는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 포함하는 활성화제 용액:[화학식 1]상기 화학식 1에서,p는 0 또는 1 내지 4의 정수이고,X7은 O 또는 S이며;R는 각각의 경우에 치환기이다.
- 제 10 항에 있어서, 각각의 R은 독립적으로 할로, 치환 또는 비치환된 지방족기, -NR11R12, OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, 시아노, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환또는 비치환된 헤테로시클릴, -CHO, -COR13, -NHCOR13, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 -SR13이거나; 두 개의 인접한 R기는 그들이 부착된 탄소원자와 함께 포화 또는 불포화의 6원환을 형성하고; 여기에서,R11및 R12는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이거나; 그들이 부착된 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하며;R13은 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기인 것을 특징으로 하는 활성화제 용액.
- 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 유기 용매는 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 활성화제 용액.
- 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 유기 용매는 유기 아미드인 것을 특징으로 하는 활성화제 용액.
- 제 13 항에 있어서, 상기 유기 아미드는 디메틸포름아미드, 1-메틸-2-피롤리디논, 및 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 활성화제 용액.
- 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온은 약 0.01 M 내지 약 2.0 M의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 활성화제 용액.
- 제 15 항에 있어서, 상기 유기 염기는 약 0.01 M 내지 약 2.0 M의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 활성화제 용액.
- 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 염기는 피리딘, 3-메틸피리딘, 또는 N-메틸이미다졸인 것을 특징으로 하는 활성화제 용액.
- 제 10 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 염기는 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온의 농도와 동일한 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 활성화제 용액.
- 제 10 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, X7은 O이고, p는 0인 것을 특징으로 하는 활성화제 용액.
- 결합 시약(coupling agent)인 하기 화학식 1의 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온의 존재 하에서 유리 히드록시기 또는 티올기를 갖는 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드와 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 결합(coupling)하는 것을 포함하는 포스포라미다이트 화학반응을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법:[화학식 1]상기 화학식 1에서,p는 0 또는 1 내지 4의 정수이고,X7은 O 또는 S이며;R는 각각의 경우에 치환기이다.
- 제 20 항에 있어서, 각각의 R은 독립적으로 할로, 치환 또는 비치환된 지방족기, -NR11R12, -OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, 시아노, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴, -CHO, -COR13, -NHCOR13, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 -SR13이거나; 두 개의 인접한 R기는 그들이 부착된 탄소원자와 함께 포화또는 불포화의 6원환을 형성하고; 여기에서,R11및 R12는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이거나; 그들이 부착된 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하며;R13은 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 유기 염기는 결합반응동안 결합시약과 함께 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22 항에 있어서, 상기 유기 염기는 아민인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 아민은 3급 아민인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 24 항에 있어서, 상기 3급 아민은 상기 3급 아민은 트리알킬아민, 치환 또는 비치환된 N-알킬피롤리딘, 치환 또는 비치환된 N-아릴피롤리딘, 치환 또는 비치환된 N-알킬피롤, 치환 또는 비치환된 N-아릴피롤, 치환 또는 비치환된 N-알킬몰폴린, 치환 또는 비치환된 N-아릴몰폴린, 치환 또는 비치환된 N-알킬피페리딘, 치환 또는 비치환된 N-아릴피페리딘, 치환 또는 비치환된 N,N-디알킬피페라진, 치환또는 비치환된 N,N-디아릴피페라진, 치환 또는 비치환된 N-알킬-N-아릴피페라진, 치환 또는 비치환된 퀴누클리딘, 및 치환 또는 비치환된 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7엔으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 아민은 치환 또는 비치환된 아자헤테로시클릴 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항에 있어서, 상기 아자헤테로시클릴 화합물은 치환 또는 비치환된 피리미딘, 치환 또는 비치환된 1-알킬피라졸, 치환 또는 비치환된 1-아릴피라졸, 치환 또는 비치환된 피라진, 치환 또는 비치환된 N-알킬퓨린, 치환 또는 비치환된 N-아릴퓨린, 치환 또는 비치환된 N-알킬피롤, 치환 또는 비치환된 N-아릴피롤, 치환 또는 비치환된 피리딘, 치환 또는 비치환된 N-알킬이미다졸, 치환 또는 비치환된 N-아릴이미다졸, 치환 또는 비치환된 퀴놀린, 치환 또는 비치환된 이소퀴놀린, 치환 또는 비치환된 퀴녹살린, 치환 또는 비치환된 퀴나졸린, 치환 또는 비치환된 N-알킬인돌, 치환 또는 비치환된 N-아릴인돌, 치환 또는 비치환된 N-알킬벤즈이미다졸, 치환 또는 비치환된 N-아릴벤즈이미다졸, 치환 또는 비치환된 트리아진, 치환 또는 비치환된 트리아졸, 치환 또는 비치환된 1-알킬-7-아자인돌, 치환 또는 비치환된 1-아릴-7-아자인돌, 치환 또는 비치환된 피롤리딘, 치환 또는 비치환된 몰폴린, 치환 또는 비치환된 피페리딘, 및 치환 또는 비치환된 피페라진으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 27 항에 있어서, 상기 아자헤테로시클릴 화합물은 피리딘, 3-메틸피리딘, 또는 N-메틸이미다졸인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 포스포라미다이트는 모노머인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 포스포라미다이트는 다이머인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스포라미다이트는 하기 화학식 2a 또는 화학식 2b의 3'-포스포라미다이트인 것을 특징으로 하는 방법:[화학식 2a][화학식 2b]상기 화학식에서,각각의 X1은 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, 또는 -NR14-이고;각각의 X3는 독립적으로 -O-, -S-, -CH2-, 또는 -(CH2)2-;R1은 알콜 보호기 또는 티오 보호기이고;R2는 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, -F, -OR6, -NR7R8, 또는 -SR9이고;R3는 -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환 또는 비치환된 지방족기, -OR10, -SR10, -O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, -O-CH2CH2-C6H4-NO2, -S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -S-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, 또는 -S-CH2CH2-C6H4-NO2이고;R4및 R5는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이거나;R4및 R5는 그들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하고;R6는 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 히드록시 보호기 또는 -(CH2)q-NR18R19이고;R7및 R8은 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 또는 아민 보호기이거나;R7및 R8은 그들이 부착되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하고;R9은 H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 또는 티오 보호기이고;R10은 각각의 경우에 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기이고;R14는 -H, 알킬기, 아릴기, 또는 아랄킬기이고;R18및 R19는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 치환 또는 비치환된 헤테로아랄킬기, 또는 아민 보호기이거나;R18및 R19는 그들이 결합된 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하고;q는 1 내지 6의 정수이며;각각의 B는 독립적으로 -H, 천연 또는 비천연의 핵염기, 보호된 천연 또는 비천연의 핵염기, 헤테로고리, 또는 보호된 헤테로고리이다.
- 제 20 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스포라미다이트는 하기 화학식 3a 또는 화학식 3b의 5'-포스포라미다이트인 것을 특징으로 하는 방법:[화학식 3a][화학식 3b]상기 화학식에서,각각의 X1은 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, 또는 -NR14-이고;각각의 X3는 독립적으로 -O-, -S-, -CH2-, 또는 -(CH2)2-;R1은 알콜 보호기 또는 티오 보호기이고;R2는 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, -F, -OR6, -NR7R8, 또는 -SR9이고;R3는 -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환 또는 비치환된 지방족기, -OR10, -SR10, -O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, -O-CH2CH2-C6H4-NO2, -S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -S-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, 또는 -S-CH2CH2-C6H4-NO2이고;R4및 R5는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이거나;R4및 R5는 그들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하고;R6는 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 히드록시 보호기 또는 -(CH2)q-NR18R19이고;R7및 R8은 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 또는 아민 보호기이거나;R7및 R8은 그들이 부착되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하고;R9은 H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 또는 티오 보호기이고;R10은 각각의 경우에 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기이고;R14는 -H, 알킬기, 아릴기, 또는 아랄킬기이고;R18및 R19는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 치환 또는 비치환된 헤테로아랄킬기, 또는 아민 보호기이거나;R18및 R19는 그들이 결합된 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하고;q는 1 내지 6의 정수이며;각각의 B는 독립적으로 -H, 천연 또는 비천연의 핵염기, 보호된 천연 또는 비천연의 핵염기, 헤테로고리, 또는 보호된 헤테로고리이다.
- 제 20 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X7은 O이고 p는 0인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온:뉴클레오시드 포스포라미다이트의 몰비는 약 0.2:1 내지 5:1의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
- 하기 화학식 4의 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 하기 화학식 2a의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 및 하기 화학식 1의 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온과 접촉시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 4의 N-mer 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 하기 화학식 2a의 뉴클레오시드 포스포라미다이트와 축합시켜 5'-말단이 3가의 인 결합을 갖는 하기 화학식 5의 (n+1) 올리고뉴클레오티드를 형성하는 방법:[화학식 4]상기 화학식 4에서,각각의 X1은 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, 또는 -NR14-이고;각각의 X3는 독립적으로 -O-, -S-, -CH2-, 또는 -(CH2)2-이고;각각의 X4는 독립적으로 -O-, 또는 -S-이고;X5는 -OH, 또는 -SH 이고;각각의 R2는 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, -F, -OR6, -NR7R8, 또는 -SR9이고;각각의 R3는 독립적으로 -OCH2CH2CN, -SCH2CH2CN, 치환 또는 비치환된 지방족기, -OR10, -SR10, -O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, -O-CH2CH2-C6H4-NO2, -S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5, -S-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3, 또는 -S-CH2CH2-C6H4-NO2이고;각각의 R6는 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 히드록시 보호기 또는 -(CH2)q-NR18R19이고;R7및 R8은 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 또는 아민 보호기이거나;R7및 R8은 그들이 부착되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하고;R9은 H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 또는 티오 보호기이고;R10은 각각의 경우에 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기이고;각각의 R14는 독립적으로 -H, 알킬기, 아릴기, 또는 아랄킬기이고;R16은 히드록시 보호기, 티오 보호기, 아미노 보호기, -(CH2)q-NR18R19, 고체 기판, 또는 고체 기판에 부착되어 있는 분리 가능한 링커이고;R18및 R19는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기, 치환 또는 비치환된 헤테로아랄킬기, 또는 아민 보호기이거나;R18및 R19는 그들이 결합된 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하고;q는 1 내지 6의 정수이고;각각의 B는 독립적으로 -H, 천연 또는 비천연의 핵염기, 보호된 천연 또는 비천연의 핵염기, 헤테로고리, 또는 보호된 헤테로고리이며;n은 0 또는 양의 정수이다;[화학식 2a]상기 화학식 2a에서,R2, R3, X1, X2, X3, 및 B는 상기에서 이미 정의한 바와 같고;R1은 알콜 보호기 또는 티오 보호기이고;R4및 R5는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이거나;R4및 R5는 그들이 결합되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성한다;[화학식 1]상기 화학식 1에서,p는 0 또는 1 내지 4의 정수이고,X7은 O 또는 S이며;R는 각각의 경우에 치환기이다.[화학식 5]
- 제 35 항에 있어서, 각각의 R은 독립적으로 할로, 치환 또는 비치환된 지방족기, -NR11R12, -OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, 시아노, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴, -CHO, -COR13, -NHCOR13, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 -SR13이거나; 두 개의 인접한 R기는 그들이 부착된 탄소원자와 함께 포화 또는 불포화의 6원환을 형성하고; 여기에서,R11및 R12는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이거나; 그들이 부착된 질소와 함께헤테로시클릴기를 형성하며;R13은 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 유기 염기는 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포스포라미다이트 및 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온과 접촉시킬 때 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37 항에 있어서, 상기 유기 염기 및 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온은 동일한 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 상기 유기 염기 및 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온의 농도는 약 0.01 M 내지 약 2 M인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 35 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온:뉴클레오시드 포스포라미다이트의 몰비는 약 0.2:1 내지 5:1의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 35 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,a) 5'-말단이 3가의 인 결합을 갖는 하기 화학식 5의 (n+1) 올리고뉴클레오티드를 산화제 또는 황화제(sulfurizing agent)와 접촉시켜, 5가의 인 백본(back bone)을 갖는 하기 화학식 6의 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계;[화학식 6]b) 선택적으로, X5기를 산 클로라이드 또는 무수물과 반응시킴으로써, 포스포라미다이트와 반응하지 않는 X5기를 캡핑(capping)시키는 단계;c) 5가의 인 백본을 갖는 (n+1) 올리고뉴클레오티드를 시약과 반응시켜 R1을 제거함으로써 탈보호하는 단계;d) 선택적으로, 결합단계, 산화 또는 황화 단계, 캡핑 단계, 및 탈보호 단계를 1 회 이상 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 산화 또는 황화 단계가 최종 단계이며 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:[화학식 7]상기 화학식 7에서, m은 n보다 큰 정수이다.
- 제 41 항에 있어서, 상기 탈보호 단계가 최종 단계이며 상기 제조된 올리고뉴클레오티드가 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:[화학식 8]상기 화학식 8에서, m은 n보다 큰 정수이다.
- 제 35 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R2는 또는 -OR6이고, 제조된 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 35 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R2는 H이고, 제조된 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 35 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, R2중 적어도 어느 하나는 H이고, R2중 적어도 어느 하나는 -OR6인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 35 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, R16은 고체 기판에 부착된 분리 가능한 링커인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 41 항에 있어서,a) 상기 올리고뉴클레오티드는 각각의 결합 단계 후에 산화되어, 제조된 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드이고;b) 상기 올리고뉴클레오티드는 각각의 결합 단계 후에 황화되어, 제조된 올리고뉴클레오티드는 포스포티오에이트 올리고뉴클레오티드이거나;c) 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 결합 단계 후에 산화되고 하나 이상의 결합 단계 후에 황화되어, 제조된 올리고뉴클레오티드는 키메릭 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 35 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X7은 O이고 p는 0인 것을 특징으로 하는 방법.
- 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온을 유기 염기와 접촉시켜 염 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1의 구조를 갖는, 유기 염기 및 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온의 염복합체를 제조하는 방법:[화학식 1]상기 화학식 1에서,p는 0 또는 1 내지 4의 정수이고,X7은 O 또는 S이며;R는 각각의 경우에 치환기이다.
- 제 50 항에 있어서, 각각의 R은 독립적으로 할로, 치환 또는 비치환된 지방족기, -NR11R12, OR13, -OC(O)R13, -C(O)OR13, 시아노, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴, -CHO, -COR13, -NHCOR13, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 -SR13이거나; 두 개의 인접한 R기는 그들이 부착된 탄소원자와 함께 포화 또는 불포화의 6원환을 형성하고; 여기에서,R11및 R12는 각각 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아랄킬기이거나; 그들이 부착된 질소와 함께 헤테로시클릴기를 형성하며;R13은 치환 또는 비치환된 지방족기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 아랄킬기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 50 항 또는 제 51 항에 있어서, 상기 염 복합체는 결정구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 50 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 유기 용매의 존재 하에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 53 항에 있어서, 상기 염 복합체는 유기 용매로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 53 항에 있어서, 유기 염기를 부가한 후에 유기 용매 일부를 증발시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 54 항에 있어서, 염 복합체를 유기 용매로부터 분리한 후에 에테르 또는 헥산으로 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 53 항에 있어서, 상기 유기 용매는 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 50 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 염기는 피리딘, 3-메틸피리딘, 또는 N-메틸이미다졸인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 50 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, X7은 O이고 p는 0인 것을 특징으로 하는 방법.
- 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온과 N-알킬이미다졸, 바람직하게는 N-메틸이미다졸의 혼합물을 포함하는 활성화제의 존재 하에서, 뉴클레오시드 포스포라미다이트, 바람직하게는 뉴클레오시드 3'-포스포라미다이트를 유리 히드록시기, 바람직하게는 유리 5'-히드록시기를 포함하는 뉴클레오시드 또는 신생 올리고뉴클레오티드와 결합시키는 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성방법.
- 제 60 항에 있어서, 상기 포스포라미다이트는 화학식 -P(OCH2CH2CN)N(CH(CH3)2)2모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 60 항 또는 제 61 항에 있어서, 상기 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 및 N-알킬이미다졸 각각의 농도는 0.1 내지 0.25M인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 60 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 : N-알킬이미다졸의 몰비는 약 1:1 내지 약 1:1.5:1인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 60 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1,1-디옥소-1,2-디하이드로-1λ6-벤조[d]이소티아졸-3-온 : 포스포라미다이트의 몰비는 0.5:1 내지 2:1인 것을 특징으로 하는 방법.
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