DE3326366A1

DE3326366A1 - Festphase-synthese von oligonucleotiden

Info

Publication number: DE3326366A1
Application number: DE19833326366
Authority: DE
Inventors: Krishnamurthy Columbia Maryland Jayaraman
Original assignee: Genex Corp
Current assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-08-20
Filing date: 1983-07-21
Publication date: 1984-02-23
Also published as: FR2531963A1; IT8367877A0; BE897562A; NL8302921A; GB2125798A; AU1694583A; GB8322519D0; JPS5953500A; IT1162935B; IL69196A0

Description

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

PATENT- UND RECHTSANWÄLTE

PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-1NQ. W. LEHN

DIPL.-INQ. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS · DIPL.-ING. K. GDRG

DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE

38 957 ra/fg

Genex Corporation, Rockville / USA

Festphase-Synthese von Oligonucleotiden

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden an einem festen Träger, insbesondere zur Synthese von Desoxyribooligonucleotiden und Ribooligonucleotiden.

In letzter Zeit haben Wissenschaftler Methoden zur Synthese von Oligonucleotiden mit definierten Sequenzen entwickelt, die angewendet werden können, um DNA und RNA zu manipulieren. So können z.B. synthetische DNA-Stücke in der Grosse von 10 bis Einheiten durch spezifische enzymatische Methoden miteinander verbunden werden, um ganze Gene zu bilden, oder sie können als Sonden dienen, um zur Identifizierung einer gewünschten DNA-Sequenz mitzuhelfen·. . Ketten synthetischer Oligonucleotide können als Linker beim Splicing verschiedener DNA-Stücke oder bei der Bildung rekombinanter DNA-Moleküle dienen.

Oligonucleotide wurden zuerst von Khorana et al mit Hilfe einer Diester-Synthese (J.Molec. Biol. 72:251 (1972)) synthetischhergestellt. Narang et al, J. Biological Chemistry 250:4592 (1975). erweiterte dieses Verfahren mit der Entwicklung einer Triester-Synthese. Diese frühen Methoden waren schwierig durchzuführen und ausserordentlich zeitintensiv. Es war ein grosser Zeitaufwand erforderlich, um mit Erfolg Nucleotide zu verbinden, um Reagentien zur Kondensation herzustellen, und um die Produkte eines jeden Kondensationsschrittes zu reinigen und die endgültige» Nulceotidscquci.z zu isolieren und zu reinigen.

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Letsinger et al, J. Am. Chem. Society 97:3278-79 (1975) verbesserte die Verfahren der Oligonucleotid-Synthese mit der Entwicklung des "Phosphit-Triester"-Verfahrens. Dieser Phosphit-Triester;—Approach wurde später zu einer Festphase-Synthese von Oligonucleotiden ausgebaut. Das Festphase-Syntheseverfahren oder das "Polymerträger"-Syntheseverfahren bringen Vorteile, indem sie die Trenn- und Reinigungsschritte erleichtern. Silicagel, ein hartes, nicht quellbares Kolloid wird häufig als Träger bzw. Unterlage (support) verwendet. Beim Festphase-Verfahren wird ein geschütztes Nucleosid mit einem phosphitylierenden Agens, wie z.B. Methoxydichlorophosphin, umgesetzt. Das sich bildende Nucleosid-phosphomonochloridit wird dann mit einem zweiten geschützten Nucleosid, das an einen Träger gebunden ist, umgesetzt.

Durch nachfolgende milde Oxidation unter Verwendung von Jod in Tetrahydrofuran, Lutidin und Wasser wird das Phosphit zu einem Phosphat umgewandelt. Obwohl dieses Verfahren viel schneller als das vorausgehende abläuft, wird eine merkliche Menge des 3'-3'-Isomers gebildet, selbst wenn die Reaktion bei -78⁰C ausgeführt und das Verhältnis von Nucleosid zu phosphitylierendem Agens sorgfältig kontrolliert wird. Einen weiteren Nachteil stellt die Instabilität der reaktionsfreudigen Zwischenprodukte gegen Hydrolyse und Luftoxidation dar.

Caruthers et al, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191 (1981) modifizierten dieses Verfahren durch Einführen eines "Tetrazolid"-Derivates von Nucleosidphosphit. Diese Zwischenverbindung ist jedoch nicht sehr stabil und die Herstellung des Derivates fordert einen zusätzlichen, bei -78°C auszuführenden Schritt.

Caruthers et al, Tetrahedron Letters 22, 1859-62 (1981) modifizierten auch das Grundverfahren so, dass Methoxydichlorophosphin, das PhosphityJLierungsagens, in ein Ν,Ν'-Dialkylamino-Derivat umgewandelt wird, das bei Behandlung mit einem

_ 7 —

Nucleosid ein ziemlich stabiles "Nucleosidphosphit" ergibt. Das Produkt wird dann mit Silicagel, welches ein Nucleosid· trägt, in Gegenwart von Tetrazol behandelt. Obwohl dieses Verfahren ein Zwischenprodukt mit grösserer Stabilität als zuvor ergibt, wird der Vorteil durch das langwierige Verfahren zur Herstellung des Startmaterials aufgehoben.

Somit besteht ein fortgesetzter Bedarf nach einem Verfahren zur Synthese eines Oligonucleotids auf einem festen Träger, das relativ einfach und leicht auszuführen ist, und mit welchem die vorstehenden Probleme vermieden werden. Es ist somit Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Festphase-Synthese von Oligonucleotiden zur Verfügung zu stellen, das einfach und ökonomisch durchgeführt werden kann und ein stabiles Produkt liefert.

Es wurde gefunden, dass Oligonucleotide an einem festen Träger auf einfache Weise nach einem Verfahren synthetisiert werden können, das die Behandlung des festen Trägers mit einem Phosphitylierungsagens und nachfolgender Behandlung mit dem Nucleosid umfasst. Dies steht im Gegensatz zu den vorherrschenden Methoden, die die Behandlung des Nucleosids mit dem Phosphitylierungsagens und nachfolgende Behandlung mit dem Träger vorsehen.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden an einem Festphase-Träger, in der Hauptsache Silicagel. Ein Nucleosid wird an den Festphase-Träger mit seiner 3'-Hydroxylgruppe gekoppelt. Die 5'-Hydroxylgruppe des Nucleosids ist mit einer Schutzgruppe geschützt. Die Schutzgruppe wird entfernt und das freie 5'-Hydroxyl reagiert mit einem bi funktionell en Phosphitylierungsiigcns. Der Triiyor wird dann mit einem geschützten Nucleosid behande.lt. Die Phosphitgruppen werden zu Phosphatgruppen oxidiert, und die 5'-Hydroxy1-Schutzgruppe wird von dem zweiten Nucleosid

BAD ORIGINAL

entfernt. Die Kettenverlängerung erfolgt dann nach demselben Zyklus von Reaktionen: Behandlung mit Phosphitylierungsagens, Behandlung mit einem anderen Nucleosid und Oxidation. Am Ende der Synthese wird das Oligonucleotid von dem Träger abgespalten, entblockt (deblocked) und gereinigt .

Mit Hilfe dieses Verfahrens können Oligonucleotide bei gemässigten Temperaturen synthetisiert werden. Die Synthese '"Kann in einem einzigen Gefä'ss^durchgeführt und leicht für die Automatisierung adaptiert werden. Ausserdem kann ein grosser Überschuss an umgesetzten Materialien verwendet und diese können leicht nach der Umsetzung rückgewonnen werden..

Gemäss der vorliegenden Erfindung können Oligonucleotide an einem Festphase-Träger synthetisiert werden. In der Beschreibung soll die Bezeichnung Oligonucleotide sowohl Ribccligonucleotide als auch Desoxyribooligonucleotide umfassen.

In den ersten Schritten des erfindungsgemässen Verfahrens wird ein Nucleosid an einen festen Träger gekoppelt. Als allgemeine Regel gilt, dass ein fester Träger als Träger bei dem erf indungsgemässen Verfahren verwendet v/erden kann, der gewährleistet, dass Moleküle frei in denselben hineindiffundieren, und welcher nicht irreversibel Reagentien absorbiert. Einen bevorzugten Träger- stellt Silicagel dar. Die. Kopplung erfolgt zwischen der 3'-Hydroxylgruppe des Nuclec^ids und dem Träger; die 5'-Hydroxylgruppe wird nit einer Schutzgruppe geschützt, wie z.B. einer Monomethoxytrityl- oder Diir.ethoxytrity!gruppe, wobei die Dimethoxytrityl-Gruppe bevorzugt ist. Diese Schutzgruppe wird entfernt und das Nucleosid mit einem bifunktionellen Phosphitylierungsmittel unter Bildung eines Nucleosid-phosphomonochloridits, das an den Träger gebunden ist, behandelt. Jedes beliebige Alkyl- oder Arylphospho-

BAD ORiGIMAL ^C0PY

dichloridit kann als Phosphitylierungsagens verwendet werden/ wobei Methoxydichlorophosphin bevorzugt ist.

Dieses bifunktionelle Phosphitylierungsagens kann zu dem N.ucleosid direkt zugegeben werden, oder es kann zunächst durch Umwandlung desselben in ein Tetrazolderivat modifiziert werden. Durch Modifizierung des Phosphitylierungsagens in der genannten Weise kann die mögliche Bildung eines 5'"5'-Crosslinking zwischen zwei benachbarten Oligonucleotidketten verhindert werden. Dieses Crosslinking wird nicht als ernsthaftes Problem angesehen, wenn die Inkocporierung von Nucleotiden auf dem festen Träger verhältnismässig klein ist (ca.30ouMol/g); sie kann jedoch dann bedeutend werden, wenn die Inkorporierung an Nucleosiden grosser wird. Die Umwandlung des Phosphitylierungsagens kann erreicht werden, entweder durcji Umsetzung desselben direkt mit Tetrazol, bevor es zu dem. NucXepsid zugegeben wird, oder durch Zugabe des Tetrazols zu dem Nucleosid vor der· Behandlung des Nucleosids mit dem Phosphitylierungsagens.

Das molare Verhältnis von Nucleosid zu Phosphitylierungagens ist im allgemeinen ca. 1:10 bis ca. 1 : 20, vorzugsweise ca. 1 : 15. Das Reaktionsgemisch kann schnell geschüttelt und. zentrifugiert und das überschüssige Phosphodichloridit entfernt werden. Die gesamte Reaktionszeit liegt im allgemeinen im Bereich von ca. 2 bis ca. 10 Minuten.

W.enn das Phosphitylierungsagens mit Tetrazol modifiziert wird, 'beträgt das molare Verhältnis von Phosphitylierungsagens zu Tetrazol im allgemeinen von ca. 1 : 2 bis ca. 1 : 10, vorzugsweise ca. :1:3 . Die Reaktionsbedingungen für diese Ausführungsform gemäss der Erfindung umfassen im allgemeinen eine Gesamt reaktionszeit, von ca. .15 Minuten bei einer Temperatur von ca. O⁰C.

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ο 3 ,£ ο j 6 6 - ίο -

Nach der Behandlung mit dem Phosphitylierungsagens wird der Träger mit einem überschuss" eines zweiten Nucleosids umgesetzt. Für die Reaktion gewährt man im allgemeinen ca. 10 bis ca. 15 Minuten bei ca. 27⁰C. Auf die Reaktion mit dem zweiten Nucleosid erfolgt Oxidation der Internucleotidphosphit-Bindungen zu Phosphaten entsprechend den konventionellen Verfahren, wie z.B. mit Jod in einer wässrigen Lösung von Tetrahydrofuran und Lutidin. Ein bevorzugtes Verhältnis von Tetrahydrofuran zu Lutidin zu Wasser beträgt ca. 2 : 1 :

Die Schutzgruppe des zweiten Nucleosids wird dann entfernt. Das Dimere kann von dem Träger abgespalten, entblockt und gewünschtenfalls gereinigt werden. Die Ausbeute dieser Reaktion beträgt typischerweise ca. 95 %.

Kettenverlängerung erfolgt unter Durchführung des gleichen Zyklus an Reaktionen, wie vorstehend angegeben ist: Behandlung des Nucleosids mit Phosphitylierungsagens, Behandlung mit einem weiteren Nucleosid und Oxidation der Phosphitgruppen. Am Ende der Synthese wird das Oligonucleotid vorteilhafterweise vom Träger abgespalten, entblockt und gereinigt.

Der intermediäre Zentrifugationsschritt zur Entfernung von überschüssigem Phosphitylierungsagens kann möglicherweise Feuchtigkeit in das Reaktionsgemisch einbringen. Ss wurde gefunden, dass die Zentrifugation des Reaktionsgemisches, das das Silciumdioxid und das Phosphitylierungsagens enthält j nicht erforderlich ist, um hohe Ausbeuten an dem gewünschten Endoligonucleotid zu gewährleisten. Dieses Verfahren kann wie vorstehend angegeben, ausgeführt werden, wobei, der Zentrifugationsschritt v/eggelassen wird« Wenn dann das Oligonucleotid nach einer konventionellen

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Oxidationsmethode oxidiert worden ist, kann der Träger mehrere Male gründlich mit organischen Lösungsmitteln gewaschen werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird der Träger mit 50 % wässrigem Tetrahydrofuran, anschliessend mit Tetrahydrofuran und schliesslich mit Ether gewaschen. Wie vorstehend angegeben beträgt die Ausbeute des gewünschten Dimer ca. 90 bis 100 %. Diese hohen Ausbeuten indizieren, das selbst bei Anwesenheit eines Überschusses an Phosphitylierungsagens die gewünschte 5'-3'-Kopplung erreicht werden kann, indem man einen Überschuss an Nucleosid verwendet. Ausserdem gibt die dünnschichtchromatografische (TLC) Analyse des überStandes dec Reaktionsgemische, einen Hinweis dafür, dass mindestens ca. 80 % des zugegebenen Nucleosids in Takt bleibt und somit zurückgewonnen und - falls gewünscht - wieder verwendet werden kann.

Wie vorstehend angegeben, besitzt das Verfahren gemäss der Erfindung eine Reihe von Vorteilen gegenüber den herkömmliehen Verfahren. Das erfindungsgemässe Verfahren erfordert keine z-uvor hergestellten Ausgangsmaterialien, kann bei Temperaturen durchgeführt werden, die gegenüber den bisher angewendeten Temperaturen wesentlich weniger extrem sind und kann in einem einzigen Behälter ausgeführt werden. Es ist leicht für die Automatisierung adaptierbar. Sowohl Ribooligonucleoti.de und Desoxyribooligonucleotide können nach dem erfindungsgemässen Verfahren synthetisiert werden. Schliesslich ist es möglich, überschüssiges Nucleosid nach Durchführung der Reaktion zurückzugewinnen, wodurch dieses Verfahren sehr ökonomisch wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung im einzelnen, sollen dieselbe jedoch nicht beschränken.

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- 12 Beispiel I

Herstellung eines Dimers durch, direkte Behandlung mit Phosphitylierungsagens
5

Siliciumdioxid (Vydac TP, 100 mg), welches Desoxythymidin (4 μΜοΙ) trug, wurde mit Methoxydichlorophosphin (60 jiMol) in wasserfreiem Pyridin (0,2 ml) bei Raumtemperatur behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde schnell geschüttelt und zentrifugiert (die Gesamtreaktionszeit einschliesslich der --■>· Zentrifugation betrug 2 Minuten bei Raumtemperatur) . Der Überstand wurde entfernt und ein 10-facher Überschuss an 5'-Dimethoxytritylcytidin in Pyridin (0,2 ml) zu dem Siliciumdioxid zugegeben. Nach 10' bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit Jod in Tetrahydrofuran/Lutidin/Wasser (2; 1 :1.) -Gemisch oxidiert. Die Ausbeute der Reaktion betrug entsprechend der Entfernung von Tritylgruppen und der HPLC nach dem Entblocken 95 %.

Bei.spi.el ΣΙ

Herstellung γόη Dimer durch direkte Behandlung mit Phosphitylierungsagens

Siliciumdioxid ( Vydac TP₇ 100 mg), welches Dasoxythymidin (4 μΜοΙ) trug,' wurde mit Methoxydichlorophosphin (60 μΜο!) in. Pyridin (0,2 ml) 10' bei. 0⁰C oder 1 bis 2 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. 5'-Dimethoxytritylcytidin (200 μΜοΙ) in Pyridin (0,2 bis 0,25 ml) wurde dann zu dem Rsakticnsgemisch ohne Zentrifugation zugegeben. Nach 10' bei Raumtemperatur wurde eine Oxidation mit Jod in Tetrahydrofuran/ Lutidin/Wasser (2:1:1) ausgeführt. Das Siliciumdioxid wurde dann, mit 50%igem wässrigen Tetrahydrofuran, mit Tetrahydrofuran, und schliesslich mit Ether gründlich gewaschen. Die

Ausbeute wurde zu 95 % mittels Absorption.;des Tritylkations bei 498 nm bestimmt. Die Ausbeute wurde ebenfalls durch Umkehrphase-HPLC-Analyse nach Entblocken bestätigt.(12 bis 16h bei 50⁰C mit konzentriertem Ammoniumhydroxid, gefolgt durch 80 %ige Essigsäurebehandlung.) Während der HPLC-Analyse wurde der Dimer-Peak gesammelt; es wurde festgestellt/ dass das UV-Spektrum sehr gut mit dem mittels Computer produzierten Spektrum übereinstimmte.

Beispiel III

Weitere Dimere wurden nach dem Verfahren von Beispiel II hergestellt. Die Ausbeute nach Isolierung eines jeden Dimers ist in der folgenden Tabelle wiedergegeben. 1.5

Tabelle 1

Verbindung ■ Ausbeute nach Isolierung (%)

d-CpC 96

d-GpT . 87

d-CPT 95 I

d-GpG 98 ί

d-CpG 84

d-GpA . 81

Beispiel IV

Synthese des C-T-Dimers unter Anwendung eines modifizierten I bifunktionellen Phosphitylierungsagens

Siliciumdioxid (Vydac TP₇ 100 mg), welches N-Benzoyldesoxycytitin (4,2 μΜοΙ) trug, und Tetrazol (630 μΜοΙ) wurden mit Pyridiii azeotrop behandelt. Das Siliciumdioxid und das Tetrazol 35

wurden mit Methoxydichlorophosphin (53 μΜοΙ) in Pyridin (0,3 ml) 10 Minuten lang bei 0°C behandelt. Dann wurde 5'-Dimethoxytrityl-thymidin (210 μΜοΙ) zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit Jod in Tetrahydrofuran/Lutidin/Wasser (2:1:1) oxidiert. Das Siliciumdioxid wurde mit 50 %igem wässrigen Tetrahydrofuran, Tetrahydrofuran und schliesslich mit Ether gründlich gewaschen. Die Ausbeute wurde mittels Absorption des Tritylkations bei 498 nm als 98 %ig abgeschlitzt.

Beispiel V

Synthese eines Pentamers unter Anwendung eines modifizierten Phosphitylierungsagens

Siliciumdioxid (Vydac TP, 100 mg), welches N-Benzoyl-desoxycytidin (4,2 μΜοΙ) trug, und Tetrazol (630 μΜοΙ) wurden mit Pyridin azeotrop behandelt (azeotroped). Das Siliciumdioxid und das Tetrazol wurden dann mit der 15-fachen Menge an Methoxydichlorophosphin (63 μΜοΙ) in Pyridin (0,3 ml) 10 Minuten lang bei O⁰C behandelt. Die 50-fache Menge an 5'-Dimethoxytritylthymidin in Pyridin (0,3 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur erfolgte Oxidation mit Jod in Tetrahydrofuran/Lutidin/Wasser (2:1:1). Das Siliciumdioxid wurde dann wie in Beispiel IV gewaschen. Die TrItyIgruppe wurde durch Behandlung mit 5 %iger Trichloressigsäur.e in Chloroform entfernt. Das Siliciumdioxid wurde gründlich mit Chloroform gewaschen.

Dieser Zyklus wurde wiederholt, um die Kette bis zur. Pentamerr· Sequenz. T-T-T-T-C auszudehnen. Das Verhältnis für die Reagentien wurde während der gesamten Synthese konstant belassen; das Pyridinvolumen wurde wie erforderlich angepasst.

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Die Gesamtausbeute für die Synthese des T-T-T-T-C-Pentamers betrug 53 %.

Beispiel VI
5

Das Octamer C-A-A-G-C-T-A-G wurde nach dem Verfahren von Beispiel V mit einer Gesamtausbeute von 24 % synthetisiert.

•^Beispiel VII

Siliciumdioxid (Vydac TP₇' 100 mg), welches N-Isobutyldesoxyguanosin (2,9 μΜοΙ) trug^und die 45-fache Menge Tetrazol (130 μΜοΙ), wurden mit Pyridin azeotropisiert. Wasserfreies Pyridin (0,1 ml) wurde zu dem Siliciumdioxid-Tetrazol-Gemisch zugegeben, bevor das Siliciumdioxid mit der 15-fachen Menge an Methoxydichlorophosphin (43 μΜοΙ) 10' lang bei O⁰C behandelt wurde. Daraufhin wurde 5 '-Dimethoxytrityl-N-benzoyldesoxyaden.Qsin in 0,2 ml Pyridin zugegeben. Nach 15' bei Raumtemperatur erfolgte Oxidation mit Jod in Tetrahydrofuran/ Lutidin/Wasser (2:1:1). Das Siliciumdioxid wurde dann mit 50 %i.gem wässrigen Tetrahydrofuran, Tetrahydrofuran und Ether gewaschen. Die Ausbeute wurde als ca. 100 %ig abgeschätzt auf der Basis der Tritylabsorption des Tritylkations bei 498 nm

Beispiel VIII

Siliciumdioxid (Vydac TP, 100 mg), welches N-IsobutyryldesQXyguanosin (2,9 μΜοΙ) trug, wurde mit 0,2 ml Pyridin, welches Methoxydichlorophosphin (43,5 μΜοΙ) enthielt und Tetrazol (130 μΜοΙ), 15' bei O⁰C behandelt. 5'-Dimethoxytrityl-N-benzoyladenosin in 0,2 ml Pyridin wurde zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Nach 15' bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch oxidiert und entsprechend den vorstehenden Beispielen gewaschen. Die Ausbeute wurde als ca. 100 %ig ermittelt.

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Beispiel IX

Synthese von A-T-G-C-A-C-A-C-A-A-G-A-G

Siliciumdioxid (Vydac TP, 500 mg), welches N-Isobutyryldesoxyguanosin (14,5 μΜοΙ) trug, wurde durch Waschen mit wasserfreiem Pyridin (2 χ 10 ml) und wasserfreiem Diethylether (10 ml) getrocknet. Das Siliciumdioxid wurde ausserdem in einem Vakuumexsikkator bis zu dessen Verwendung getrocknet.

Ein 45-facher Überschuss an Tetrazol (652 μΜοΙ) wurde in 1 ml Pyridin bei O⁰C aufgelöst. Ein 15-facher Überschuss an Methoxydichlorophosphin (217 μΜοΙ) wurde zu der Tetrazol-Pyridin-Lösung zugegeben, dann wurde die Lösung zu dem Siliciumdioxid zugegeben. Nach 15 Minuten bei 0⁰C wurde ein 50-facher Überschuss an 5'-O-(Dimethoxytrityl)-N-benzoyldesoxyadenosin in 1,0 ml Pyridin zugegeben. Die Reaktion wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur fortgesetzt, dann wurde das Reaktionsgemisch oxidiert und entsprechend der Methode der vorstehenden Beispiele gewaschen. Das Siliciumdioxid wurde mit 5%iger Tetrachloressigsäure in Chloroform behandelt, um die Dimethoxytritylgruppe zu entfernen. Nach Waschen mit Chloroform, wasserfreiem Pyridin und wasserfreiem Ether war die Lösung für die Zugabe des nächsten Nucleosids bereit.

Die restlichen 11 Nucleoside wurden genau wie vorstehend angegeben zugegeben. Die Menge und die Konzentration der Reagentien blieb während der gesamten Synthese die gleiche.

Eine qualitative Bestimmung der Ausbeute wurde auf der Basis der bei der 5% Trichloressigsäure-Behandlung erhaltenen orangen Farbe nach jeder Zugabe erhalten. In allen Fällen 35

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schien die Ausbeute ausgezeichnet zu sein.

Quantitative Bestimmungaider Ausbeute wurden durch Behandlung einer genau abgewogenen Menge an Siliciumdioxid mit 2% Benzolsulfonsäure in Acetonitril und Bestimmung der Absorption des Tritylkations bei 498 nm erhalten. Die Gesamtausbeute der verschiedenen Schritte ist nachfolgend angegeben.

Länge des Oligonucleotids	Ausbeute %
2	100
5	90
9	78-83
13	60-70

Claims

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

PATENT- UND RECHTSANWÄLTE

PATENTANWÄLTE DIPL.-INQ. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL₁-INa. K. FOCHSLE ■ DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS · D1PL.-ING. K. QORG

DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE

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Festphase-Synthese von Oligonucleotiden

Patentansprüche

M.!Verfahren zur Synthese eines Olxgonucleotids an einem festen Träger, ' gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

(a) Binden eines ersten Nucleosids, dessen 5'-Hydroxylgruppe mit einer Schutzgruppe geschützt ist, an einen Festphase-Träger über die 3·-Hydroxylgruppe des genannten ersten Nucleosids,

(b) Entfernen der genannten Schutzgruppe am 5'-Hydroxyl des ersten Nucleosids,

(c) Umsetzen der 5'-Hydroxylgruppe⁷mit einer bifunktionellen phosphitylierenden Gruppe,

(d) Binden eines folgenden Nucleosids, dessen 5'-Hydroxyl mit einer Schutzgruppe geschützt ist, an den genannten Träger durch Kopplung des 3' -Ilydroxyls des genannten folgenden Nucleosids an die 5'-Hydroxylgruppe des ersten Nucleosids,

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(e) Oxidieren der zwischen den genannten Nucleosiden gebildeten Phosphitbindung,

(f) Wiederholung der Schritte (b) bis einschliesslich (e) bis die gewünschte Nucleosidzahl zu dem genannten Träger zugegeben worden ist,

(g) Abspalten des Oligonucleotids vom Träger, und

im

(h) Entblocken und Reinigen des genannten Oligonucleotids.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das bifunktionelle phosphitylierende Agens von Schritt (c) vor Umsetzung mit dem genannten 5'-Hydroxyl des Nucleosids in ein Tetrazolderivat umgewandelt wird.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Nucleosid vor dessen Behandlung mit dem bifunktionellen phosphitylierenden Agens mit Tetrazol vermischt wird.
4. Verfahren gemäss Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass der feste Träger Silicium- dioxid (Silica) darstellt.
5. Verfahren gemäss Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass die genannte Schutzgruppe eine Monomethoxytrityl-Gruppe ist.
6. Verfahren gemäss Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass die genannte Schutzgruppe Diraethoxytrityl darstellt.

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7. Verfahren gemäss Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass das genannte bifunktionelle phosphitylierende Agens ein Alkyl- oder Aryl-phosphodichloridit darstellt.
5
8. Verfahren gemäss Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass das genannte bifunktionelle fihosphitylierende Agens Methoxydichlorophosphin darstellt.
9. Verfahren gemäss Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass das molare Verhältnis von Nucleosid zu phosphitylierendem Agens im Bereich von ca. 1 : 10 bis ca. 1 : 20 liegt.
10. Verfahren gemäss Ansprüchen 1, 2 odär 3, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis von Nucleosid zu phosphitylierendem Agens ca. 1:15 beträgt.
11. Verfahren gemäss Ansprüchen'2 oder 3, dadurch g e -

kennzeichnet, dass das molare Verhältnis von phosphitylierendem Agens zu Tetrazol im Bereich von ca. 1 : 2 bis ca. 1 : 10 liegt.
12. Verfahren gemäss Ansprüchen 2 oder 3, dadurch g e -

kennzeichnet, dass das molare Verhältnis von phosphitylierendem Agens zu Tetrazol ca. 1 : 3 beträgt.
13. Verfahren gemäss Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass die Umsetzungen bei ca. 0⁰C bis ca. 27⁰C ausgeführt werden.
14. Verfahren gemäss Ansprüchen 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass die Umsetzungen bei ca. 0⁰C ausgeführt werden.
15. Verfahren gemäss Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass überschüssiges Nucleosid durch Extraktionsverfahren rückgewonnen und wiederverwendet wird.

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