DE19611376A1

DE19611376A1 - Nukleinsäureverbindungen und deren Syntheseverfahren

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Publication number: DE19611376A1
Application number: DE19611376A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Sugiyama; Ken Hatano; Isao Saito; Takayoshi Uchida; Yoko Matsuda; Kiyoshi Uchida
Original assignee: Toagosei Co Ltd
Current assignee: Toagosei Co Ltd
Priority date: 1995-03-22
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 1996-12-12
Also published as: US5770715A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäurever bindungen, welche die Bildung von intramolekularen Basen paarstrukturen fördern, die aus zwei Nukleotidketten ent stehen, deren Sequenzen im wesentlichen komplementär zuein ander sind, Verbindungen, die eine verbesserte Permeabilität besitzen, Verbindungen, die eine Dreifachstrangbildung mit der dritten Nukleotidkette fördern, ihre Syntheseverfahren und Verbindungen, welche die Nukleinsäureverbindungen erge ben.

Als Nukleinsäureverbindungen sind verschiedene Ver bindungen bekannt, z. B. Nukleinsäureverbindungen, die eine erhöhte Hyodrophobizität oder Nukleaseresistenz durch Modi fizierung einer Base, eines Zuckers oder eines Phosphodie sterteiles der Nukleinsäuren besitzen, Nukleinsäureverbin dungen, welche funktionelle Gruppen, wie hydrophobe Gruppen, fluoreszierende Gruppen oder ladungsneutralisierende Gruppen am 5′- oder 3′-Ende oder an anderen Stellen der Nukleinsäu ren besitzen, und Nukleinsäureverbindungen, die interkalie rende Gruppen besitzen (E. Uhlmann und A. Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990); F. Eckstein ed., Oligonucleoti des and Analogues - A Practical Approach, IRL press (1991); J.F. Milligan et al., Medicinal Chemistry, 38: 1923-1937 (1993)).

Jedoch fördert keine der oben beschriebenen Verbindun gen die Bildung einer intramolekularen Basenpaarstruktur, die von zwei Nukleotidketten, deren Sequenzen im wesentli chen komplementär zueinander sind, gebildet wird.

Außerdem sind weder Verbindungen bekannt, die funktio nelle Gruppen zur Bildung von Dreifachsträngen mit der drit ten Nukleotidkette besitzen, noch Verbindungen mit derarti gen Nukleotidketten, die hydrophobe funktionelle Gruppen zwischen den zwei Nukleotidketten aufweisen.

Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäureverbin dungen zur Verfügung, die die aus komplementären Basense quenzen gebildete intramolekulare Basenpaarstruktur fördert, Verbindungen, die eine Dreifachstrangbildung mit der dritten Nukleotidkette fördern, Verbindungen, die eine verbesserte Permeabilität besitzen, ihre Syntheseverfahren und Verbin dungen, welche die Nukleinsäureverbindungen ergeben.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäureverbindungen, welche die Bildung von intramolekularen Basenpaarstrukturen för dern, die aus zwei Nukleotidketten, deren Sequenzen im we sentlichen komplementär zueinander sind, gebildet werden, verwenden Nichtnukleinsäureverbindungen mit einer bestimmten Struktur.

Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäureverbin dungen zur Verfügung, welche eine ringartige Struktur, zwei funktionelle Gruppen und ein Paar Nukleotidketten besitzen. Diese funktionellen Gruppen sind an das ringartige Skelett mit einer fixierten Struktur gebunden und können im wesent lichen in die gleiche Richtung zeigen. Die Nukleotidketten sind durch solche funktionelle Gruppen verbunden und bilden die intramolekulare Basenpaarstruktur.

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfah ren zur Synthese der Nukleinsäureverbindungen mit Ring skelett, die durch ein Paar komplementäre Nukleotidketten charakterisiert sind, welche an den Ringen durch die funk tionellen Gruppen verbunden sind, zur Verfügung.

Die vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem triter penoide Verbindungen mit einer Nichtnukleinsäurestruktur und einem Ringskelett, welches in den folgenden chemischen For meln (1) bzw. (2) dargestellt ist:

Die erfindungsgemäßen triterpenoiden Verbindungen sind in den folgenden chemischen Formeln (3) bzw. (4) darge stellt,

wobei R und R′ ein Wasserstoffatom oder eine Schutz gruppe darstellen.

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem neue Phos phoramiditester der triterpenoiden Verbindungen zur Verfü gung, welche in den folgenden chemischen Formeln (5) und (6) dargestellt sind,

wobei R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe darstellt.

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Triphosphi tester der triterpenoiden Verbindungen zur Verfügung, welche in den folgenden chemischen Formeln (7) und (8) dargestellt sind,

wobei R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe darstellt.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden detail liert beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäureverbindungen besit zen eine Nichtnukleinsäurestruktur mit zwei funktionellen Gruppen und zwei Nukleotidketten, die durch die funktionel len Gruppen zu dieser Struktur verbunden sind. Es können Nukleotidketten mit jeder DNA-Sequenz verwendet werden, bevorzugt sind jedoch Ketten, die Doppelstränge ausbilden oder solche, die Dreifachstränge ausbilden, in denen eine der an die Struktur gebundenen Ketten einen Doppelstrang mit der dritten Kette ausbildet und eine andere daran gebundene Kette an den gebildeten Doppelstrang gebunden wird.

Die dritte Kette ist als Nukleotidkette definiert, die sich von den Nukleotidketten, die durch die funktionellen Gruppen an das Skelett gebunden sind, unterscheidet; die dritte Kette ist nicht an die Struktur gebunden und ihre Enden sind im allgemeinen frei.

Da die Struktur ein ringartiges Skelett besitzt, wird die Struktur als Nichtnukleinsäureringskelett bezeichnet. Zwei funktionelle Gruppen sind durch zwei funktionelle Grup pen an das Nichtnukleinsäureringskelett gebunden und so fi xiert, daß sie im wesentlichen in die gleiche Richtung zei gen. Da der Abstand zwischen den Nukleotidketten, welche komplementäre Basenpaare oder Dreifachstränge bilden, im allgemeinen 0,8-1,2 nm beträgt, ist in der vorliegenden Erfindung eine solche Distanz zwischen den funktionellen Gruppen von 0,6-1,4 nm, insbesondere 0,8-1,2 nm, bevor zugt.

Bei einem solchen Nichtnukleinsäureringskelett handelt es sich um ein tripernoides Skelett, ein Steroidskelett, ein kondensiertes polyzyklisches Skelett, ein Adamantanskelett, ein polyalizyklisches Kohlenwasserstoffskelett, ein Skelett mit Heteroring(en), ein Skelett mit Metallkomplex(en) oder ein Skelett mit natürlichem Ursprung. Bei dem tripernoiden Skelett handelt es sich z. B. um die in den folgenden chemi schen Formeln (1′) und (2′) dargestellten Verbindungen.

Andere Beispiele für ein solches Skelett sind die in den folgenden chemischen Formeln (9) bzw. (10) dargestellten Verbindungen. Beide der in den Formeln (9) und (10) darge stellten Verbindungen besitzen eine entgegengesetzte Stereo struktur der Wasserstoffatome der D- und E-Ringe zu den in den Formeln (1′) bzw. (2′) dargestellten Verbindungen.

Die Nukleinsäureverbindungen mit triterpenoidem Skelett und zwei Nukleotidketten, im besonderen jene, in denen die Sequenzen im wesentlichen komplementär zueinander sind oder solche, die einen Dreifachstrang mit der dritten Kette aus bilden, werden gemäß der folgenden Stufen synthetisiert:

a) eine kommerziell erhältliche Verbindung, Glycyr rhetinsäure, dargestellt in folgender Formel (11),

wird unter Verwendung von Methanol verestert. Dabei wird Glycyrrhetinsäure zur Veresterung in einer ausreichenden Menge Methanol gelöst und mit einer ausreichenden Menge konzentrierter Schwefelsäure rückflußgekühlt. Bevorzugt wird dieses Veresterungsverfahren mindestens zweimal wiederholt. Danach wird das Methanol durch Verdampfen entfernt und der Rückstand auf eine Kieselgelsäule getragen, um die in fol gender Formel dargestellte Verbindung (12) zu erhalten.

b) Die erhaltene Verbindung (12) wird mit Diisobutyl alminum (DIBAL) reagiert. Dabei wird die Verbindung (12) in einer ausreichenden Menge Lösungsmittel, wie Methylenchlo rid, in Stickstoffatmosphäre gelöst und die Mischung auf -60 bis -78°C abgekühlt und DIBAL (1,5 M DIBAL in Toluol) zu gegeben; dann wird die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von Wasser gestoppt, dessen Volumen ungefähr 1/3 des Methylenchlorids, das zum Lösen der Verbindung (12) benutzt worden ist, ausmacht. Das Lösungsmittel in der Reak tionsmischung wird dann durch Verdampfen entfernt. Bevorzugt wird Methylenchlorid zu dem nach Verdampfen erhaltenen Rück stand gegeben und der Rückstand zerkleinert und gut gerührt; dann wird der feste Stoff, also der zerkleinerte Rest, fil triert und Methylenchlorid durch Verdampfen entfernt, um einen rohen Alkohol zu erhalten.

Im nächsten Schritt wird der erhaltene rohe Alkohol oxydiert. Dabei wird der erhaltene Alkohol in einem Lösungs mittel, wie Methylenchlorid, gelöst, eine geeignete Menge MnO₂ zugegeben und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der erhaltene Feststoff wird filtriert und das Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt; dann wird der Rück stand unter Verwendung von präparativem TLC aufgereinigt usw. Auf diese Weise wird die als Verbindung (13) bezeich nete Verbindung erhalten, die in folgender Formel darge stellt ist.

Die sekundäre OH-Gruppe am A-Ring an der Position 3 und die primäre OH-Gruppe am E-Ring an der Position 30 kön nen im wesentlichen dieselbe Orientierung haben.

Da der Abstand zwischen diesen OH-Gruppen ungefähr 1,25 nm beträgt, können die komplementären Nukleotidketten ohne irgendwelche strukturellen Schwierigkeiten eine kom plementäre Basenpaarstruktur bilden oder zwei Nukleotidket ten verbinden, die intramolekular einen Dreifachstrang mit der dritten Nukleotidkette bilden können.

Die oben erwähnte Verbindung wird außerdem unter Ver wendung folgenden Verfahrens synthetisiert.

a′) Eine kommerziell erhältliche Verbindung, Glycyr rhetinsäure, die in folgender Formel (11) dargestellt ist,

wird unter Verwendung von Aluminiumlithiumhydrid reduziert. Dabei wird Glycyrrhetinsäure in wasserfreiem Tetrahydrofuran unter Verwendung von Aluminiumlithiumhydrid, bevorzugt über Nacht und unter Rühren, reduziert. Das überschüssige Alumi niumlithiumhydrid wird unter Verwendung von Wasser und NaOH abgebaut und die Lösung konzentriert, um ein weißes Kristall zu erhalten. Da das Kristall roh ist, wird es in Methanol umkristallisiert, um die in folgender chemischer Formel (14) dargestellte Verbindung zu erhalten. Die Verbindung wird als Verbindung (14) bezeichnet.

b′) Die erhaltene Verbindung (14) wird oxydiert. Dabei wird die Verbindung (14) in einer ausreichenden Menge Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, gelöst, eine ausreichen de Menge MnO₂ zugegeben und die Mischung über Nacht bei Raum temperatur gerührt. Der erhaltene Feststoff wird filtriert und das Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt; dann wird der Rückstand unter Verwendung von präparativem TLC aufge reinigt usw. Auf diese Weise wird die in der folgenden For mel dargestellte Verbindung (13) erhalten und als Verbindung (13) bezeichnet.

In dieser Stufe (b′), kann die Verbindung (14) dehy dratisiert werden, wobei der Dehydratisierungsschritt als Schritt (b′′) bezeichnet wird. Dabei wird die Verbindung (14) in einer Mischung aus Methanol und HCl gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird die Lösung bis zur Trockenheit eingedampft, um ein weißes Kristall zu er halten. Das Kristall wird in Methanol umkristallisiert, um die in folgender chemischer Formel dargestellte Verbindung (15) zu erhalten.

c) In die OH-Gruppe an der Position 30 auf dem E-Ring der erhaltenen Verbindungen (13) und (15) wird zum Schutz der OH-Gruppe eine Schutzgruppe eingeführt. Es können ver schiedene bekannte Schutzgruppen, wie die Tritylgruppe, Me thoxytritylgruppe, Dimethoxytritylgruppe, Acetylgruppe, Benzoylgruppe, p-Anisoylgruppe und Tributyrylgruppe verwen det werden. Als Beispiel wird eine Reaktion mit der Dime thoxytritylgruppe gezeigt.

Die Verbindung (13) oder (15) wird mit 4,4′-Dimeth oxytritylchlorid (DMTrCl) reagiert. Dabei wird die Verbin dung (13) bzw. (15) in getrocknetem Pyridin gelöst und dann zur Trockenheit eingedampft. Bevorzugt wird das Verfahren zur Trocknung der Verbindung (13) oder (15) drei- oder vier mal wiederholt. Die getrocknete Verbindung (13) bzw. (15) wird wieder in getrocknetem Pyridin gelöst und zu der Lösung 4,4′-Dimethoxytritylchlorid, Dimethylaminopyridin und Triet hylamin gegeben. Danach wird die Mischung über Nacht in Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur gerührt. Alternativ wird DMTrCl zu dem getrocknetem Pyridin, welches die Verbin dung (13) bzw. (15) enthält, gegeben und die Lösung ungefähr 6 Stunden in Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur ge rührt. In beiden oben beschriebenen Fällen wird Dimeth oxytritylchlorid vorzugsweise mit etwa 2 Äquivalenten im Verhältnis zu der Verbindung (13) bzw. (15) zugegeben. Dime thylaminopyridin wird vorzugsweise mit ungefähr 0,01 Äquiva lenten und Tritethylamin mit ungefähr 1,5 Äquivalenten zu gegeben. Die erhaltene Verbindung wird mit Hilfe von Ethyl acetatwasser getrennt und die organische Ethylacetat enthal tende Schicht auf Natriumsulfatanhydrid getrocknet. Danach wird das Ethylacetat durch Verdampfen entfernt, um die er haltene Verbindung aufzureinigen. Die Verbindung kann mit Hilfe von Kieselgelsäulen aufgereinigt werden. Die erhaltene Verbindung ist in den folgenden chemischen Formeln (3′) bzw. (4′) dargestellt,

wobei R DMTr und R′ ein Wasserstoffatom darstellen. Die erhaltene Verbindung wird als Verbindung (3′) bzw. (4′) bezeichnet.

d) Die erhaltene Verbindung (3′) bzw. (4′) wird mit einem Phosphoramidit, z. B. 2-Cyanethyl-N,N,N′,N′-tetraiso propylphophoramidit, reagiert, welches die folgende chemi sche Formel (16) besitzt.

Dabei wird die Verbindung (3′) bzw. (4′) in trockenem Acetonitril gelöst und bis zur Trockenheit eingedampft. Vorzugsweise wird dieser Trocknungsprozeß ein paarmal wie derholt. Die getrocknete Verbindung (3′) bzw. (4′) wird in Acetonitril gelöst. Dann werden 2-Cyanethyl-N,N,N′,N′-te traisopropylphosphoramidit und Tetrazol zu der Lösung gege ben und etwa eine Nacht reagiert. Bevorzugt wird 2-Cyan ethyl-N,N,N′,N′-tetraisopropylphosphoramidit mit ungefähr 1,1 Äquivalenten und Tetrazol mit ungefähr 1,1 Äquivalenten im Verhältnis zu der Verbindung (3′) bzw. (4′) gegeben.

Die erhaltene Verbindung wird mit Hilfe von Natriumhy drogencarbonat gesättigtem Ethylacetat getrennt und die Ethylacetatschicht auf Natriumsulfatanhydrid getrocknet; dann wird die Schicht durch Verdampfung konzentriert. Die erhaltene Verbindung besitzt folgende chemische Formel (5′) bzw. (6′),

wobei R DMTr darstellt. Die erhaltenen Verbindungen werden als Verbindung (5′) bzw. (6′) bezeichnet.

e) Schließlich wird die erhaltene Verbindung (5′) oder (6′) in einem Lösungsmittel, z. B. Acetonitrilmethylen chlorid gelöst. Dann wird die Verbindung (5′) bzw. (6′) unter Verwendung einer DNA- oder RNA-Syntheseapparatur an Nukleotidketten gebunden. Die Nukleotidkette kann an die Verbindung (5′) bzw. (6′) in einem beliebigen Stadium gebun den werden, z. B. in dem Stadium, in dem die Synthese der er sten der zwei Nukleotidketten beendet ist und wonach die anderen Nukleotide daran gebunden werden.

In einem alternativen Verfahren wird die Synthese gemäß der in (a) und (b) beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei (b′) oder (b′′) anstelle von (b) angewendet werden können, um die Verbindung (13) oder (15) zu erhalten. Die Verbindung (13) bzw. (15) wird in Chloroform gelöst. Dann wird 2-Chlorphenoxy-2,5-dimethylthiochlorphosphin mit der folgenden chemischen Formel (17)

zu der Lösung gegeben, um die Verbindung mit folgender che mischer Formel (7′) bzw. (8′) zu erhalten,

wobei R DMTr darstellt. Die erhaltene Verbindung wird als Verbindung (7′) bzw. (8′) bezeichnet. Nachdem die Ver bindung (7′) bzw. (8′) erhalten worden ist, werden die Nu kleotidketten wie oben beschrieben an die Verbindung (7′) bzw. (8′) gebunden.

Die funktionellen Gruppen in den erhaltenen DNA- und RNA-Ketten oder Nukleinsäureverbindungen werden während ihrer Synthese geschützt, um unerwünschte Reaktionen zu verhindern. Die derart erhaltenen Nukleinsäureverbindungen werden unter Verwendung eines bekannten Verfahrens entblockt und durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit Packmaterialien für die Umkehrphasentrennung oder Ionenaus tauschtrennung, z. B. einer Säule wie Sep Pack, oder durch ein anderes Verfahren zur Analyse von Verbindungen, aufge reinigt.

Die Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigung wird z. B. mit Hilfe einer C18 Säule (WAKO PURE CHEMICAL) mit 0,05 M Triethylam moniumacetatpuffer (pH 7,0) oder 0,05 M Ammoniumformiatpuf fer mit ansteigendem Gehalt an Acetonitril als Elutionspuf fer durchgeführt.

In den Beispielen der vorliegenden Erfindung kann das Phosphoramiditverfahren verwendet werden, da Phosphoramidit für die Synthese der Verbindung verwendet wird. Das Phos phoramiditverfahren ist ein Syntheseverfahren für nuklein säureverwandte Verbindungen, wie Oligodesoxyribonukleotide oder Oligoribonukleotide; in diesem Verfahren werden Phos phoroamiditreagenzien mit Cyanethylschutzgruppen an den 3′- Enden der modifizierten Desoxyribonukleotide oder modifi zierten Ribonukleotide an die 5′-Enden anderer Nukleotide, wie modifizierte Desoxyribonukleotide, modifizierte Ribonu kleotide, Oligomere modifizierter Desoxyribonukleotide, Oli gomere modifizierter Ribonukleotide usw., gebunden.

Das Phosphoramiditverfahren kann unter Verwendung einer 381A DNA-Syntheseapparatur oder einer 394 DNA/RNA-Syntheseapparatur (beide von APPLIED BIOSYSTEMS) nach den Protokollen von APPLIED BIOSYSTEMS oder F. Eckstein ed. Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach, IRL Press (1991) durchgeführt werden.

Die Nukleinsäureverbindungen mit derselben Stereo struktur der OH-Gruppen wie die oben beschriebenen Verbin dungen werden ebenso durch Anwendung des Thiophophitverfah rens unter Verwendung von Thiophosphit erhalten.

Die auf diese Weise erhaltenen Verbindungen sind in den folgenden chemischen Strukturen (18a) und (18b) darge stellt und als Verbindung (18a) bzw. (18b) bezeichnet,

wobei X und Y komplementäre Nukleotidketten darstel len, welche DNA-Ketten, RNA-Ketten oder Nukleotidketten, die einen Dreifachstrang mit dem dritten Nukleotid ausbilden, umfassen. Es kann jede Art von DNA, RNA oder Nukleotidketten verwendet werden, wenn sie komplementär zueinander sind oder einen Dreifachstrang mit der dritten Nukleotidkette ausbil den können. Ihre Sequenzen sind nicht eingeschränkt.

In der Nukleinsäureverbindung sind X und Y DNA-Ketten, RNA-Ketten, DNA und RNA enthaltende Nukleotidketten oder Modifizierungen davon, die z. B. mit Phosphorthionat modifi ziert sind. Sie können Doppel- oder Dreifachstränge ausbil den und besitzen eine bestimmte räumliche Festlegung. Die räumliche Lokalisierung solcher Nukleotidketten wird durch die Verbindung mit dem Skelett (1) bzw. (2), welches an beide Enden von X und Y gebunden ist, festgelegt. Die Ver bindung mit dem Skelett (1) bzw. (2) entspricht dem Schlei fenteil in einer sogenannten Haarnadelstruktur, die in RNA ausgebildet wird. Die Nukleinsäureverbindungen mit einem solchen Skelett (1) bzw. (2) besitzen eine ausgezeichnete Permeabilität.

Syntheseverfahren für Nukleinsäureverbindungen mit derartigem Skelett, welche in den chemischen Formeln (1) bzw. (2) dargestellt sind, werden beispielhaft erklärt. Jedoch beschränken sich die Syntheseverfahren für die er findungsgemäßen Verbindungen nicht auf die unten beschrie benen. Entsprechend können verschiedene Verbindungen unter Verwendung anderer Verfahren zur Synthese der erfindungs gemäßen Verbindungen, welche die Bildung intramolekularer komplementärer Basenpaarstrukturen fördern, die Bildung eines Dreifachstranges mit der dritten Oligonukleotidkette fördern und eine ausgezeichnete Permeabilität besitzen, verwendet werden.

Da die obigen erfindungsgemäßen Verbindungen aufgrund ihrer verbesserten Permeabilität leicht in Zellen einge bracht werden können, ergeben sie eine ausgezeichnete "Anti sense"-Nukleinsäurewirkung und können als Pharmazeutika oder Diagnostika verwendet werden. Sie stehen im besonderen für Pharmazeutika oder Diagnostika zur Verfügung, welche eine hohe Nukleaseresistenz erfordern, wenn sie modifizierte Phosphodiester zwischen den Basen besitzen. Außerdem kann die vorliegende Erfindung zur Inhibierung der Expression von Genen, die Krankheiten verursachen, als Modifikation der "Antisense"-Methode angewendet werden, wenn die Verbindungen zwei Nukleotidketten besitzen, die mit der dritten Nukleo tidkette einen Dreifachstrang bilden können.

Fig. 1 zeigt das ¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz)-Spektrum der Glycyrrhetinsäure.

Fig. 2 zeigt das ¹H NMR(CDCl₃, 200 MHz)-Spektrum der Verbindung mit der chemischen Formel (12).

Fig. 3 zeigt das ¹H NMR(CDCl₃, 200 MHz)-Spektrum der Verbindung mit der chemischen Formel (13).

Fig. 4 zeigt ein Schnellschußmassenspektrum (FAB, positiv) der Verbindung mit der chemischen Formel (13).

Fig. 5 zeigt das ¹H NMR(CDCl₃, 200 MHz)-Spektrum der Verbindung mit der chemischen Formel (19).

Fig. 6 zeigt das Ergebnis der HPLC-Analyse der von der Verbindung mit der chemischen Formel (21) abgespalteten Verbindungen.

Fig. 7 zeigt das ¹H NMR(D₂O, 500 MHz) Spektrum der Verbindung mit der chemischen Formel (22).

Fig. 8 zeigt das FAB (positiv) -Spektrum der Verbin dung mit der chemischen Formel (22).

Fig. 9 zeigt das Profil des Absorptionsintensitäts verhältnisses (ΔA/A) im UV-Bereich in Abhängigkeit von der Temperatur.

Fig. 10 zeigt die Zirkulardichroismusspektren ver schiedener Verbindungen. Die obere Spalte zeigt das Spektrum der Mischung von der Nukleinverbindung (23) mit der Nukleo tidkette (24). Die mittlere Spalte zeigt das Spektrum der Mischung von der Verbindung (24) mit der Nukleotidkette (25). Die untere Spalte zeigt das Spektrum der drei Nukleo tidketten (24), (25), (26) wobei die Y-Achse die molare Elliptizität in deg × cm²/dmol darstellt.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen detailliert beschrieben, ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

a) 5 g 18 β-Glycyrrhetinsäure (Gl, 010-5, 10,6 mmol, ALDRICH CHEMICAL) werden in 200 ml Methanol gelöst. Zu der Lösung werden 4 ml konzentrierter Schwefelsäure gegeben und die Mischung 3 Stunden rückflußgekühlt. Dann werden weitere 4 ml konzentrierter Schwefelsäure zu der Mischung gegeben und für weitere 3 Stunden rückflußgekühlt. Das Methanol wird durch Verdampfen entfernt und der Rückstand auf eine Kiesel gelsäule (100 g Kieselgel (Wako-Gel 200), Hexan/Ethylacetat = 1/4 (v/v)) aufgetragen. Dadurch wird das Rohprodukt eines Methylesters mit folgender chemischer Struktur (12) erhal ten.

Das Gewicht der erhaltenen Verbindung (12) beträgt 4,0 g und die Ausbeute 77,7%. Das ¹H NMR-Spektrum (CDCl₃, 200 MHz) der Glycyrrhetinsäure ist in Fig. 1 und das der erhaltenen Verbindung in Fig. 2 gezeigt.

b) 1,89 g (3,9 mmol) der Verbindung mit der chemi schen Formel (12) werden in 30 ml Methylenchlorid in Stick stoffatmosphäre gelöst. Dann wird die Mischung auf -78°C abgekühlt und bei dieser Temperatur 7,9 ml 1,5 M DIBAL in Toluol (11,8 mmol) zugegeben. Dann wird die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 ml Wasser beendet und das Lösungs mittel durch Verdampfen entfernt. Zu dem Rückstand wird Methylenchlorid gegeben und die feste Verbindung gut zer kleinert. Die Lösung wird gerührt und die verbleibende feste Verbindung durch Filtration entfernt. Dann wird Methylen chlorid durch Verdampfen entfernt und ein roher Alkohol erhalten. Der rohe Alkohol wird in 40 ml Methylenchlorid gelöst. Zu der Lösung werden 2 g MnO₂ gegeben und die Mi schung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um den Alkohol zu oxydieren. Die in der Mischung gebildeten Feststoffe werden durch Filtration entfernt und dann das Methylenchlo rid durch Verdampfen entfernt; der Rückstand wird zur Auf reinigung auf präparatives TLC (MERK) aufgetragen (Tren nungsbedingung: Hexan/Ethylacetat = 1/4 (v/v)). Diese Auf reinigung ergibt eine neue Komponente mit folgender chemi scher Formel (13) und einem Rf-Wert von 0,7.

Das Gewicht der neuen erhaltenen Verbindung beträgt 806 mg und die Ausbeute 45%. Das ¹H NMR-Spektrum (CDCl₃, 200 MHz) der neuen Verbindung (13) ist in Fig. 3 und das FAB (posi tiv)-Spektrum ist in Fig. 4 dargestellt. Die in Fig. 4 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß M + 1 = 458 ist.

c) 806 mg (1,77 mmol) der in Formel (13) dargestell ten Verbindung werden zur Trocknung mit getrocknetem Pyridin verdampft (20 ml Pyridin, 3 mal). Dann wir die getrocknete Verbindung in 30 ml getrocknetem Pyridin gelöst. Zu der Lö sung werden 960 mg (283 mmol) 4,4′-Dimethoxytrltylchlorid, 20 mg Dimethylaminopyridin (0,16 mmol) und 380 ml Triethyla min (2,8 mmol) zugegeben. Die Lösung wird über Nacht in Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur gerührt. Die erhal tenen Verbindungen werden unter Verwendung von Ethylacetat wasser getrennt. Die Ethylacetatschicht wird auf Natriumsul fatanhydrid getrocknet. Danach wird die Ethylacetatschicht verdampft und auf eine Kieselgelsäure aufgetragen (Elutions puffer: Methanol/Methylenchlorid = 5/95(v/v)), um die in folgender chemischer Formel (19) dargestellte Verbindung zu erhalten.

Das Gewicht der erhaltenen Verbindung (19) beträgt 730 mg und die Ausbeute 54%. Das ¹H NMR-Spektrum der neuen Ver bindung (CDCl₃, 200 MHz) ist in Fig. 5 dargestellt.

d) Die gesamte Menge der in Formel (19) wiedergegebe nen Verbindung, 730 mg (0,96 mmol) wird zur Trocknung mit getrocknetem Acetonitril verdampft (5 ml, 3 mal). Die ge trocknete Verbindung (19) wird in 2 ml Acetonitril in Stickstoffatmosphäre gelöst, nachdem 285 mg 2-Cyanethyl- N,N,N′,N′-tetraisopropylphosphoramidit (30,599-5, ALDRICH CHEMICAL) und 2 ml 1H-Tetrazol (0,5 M) zugegeben worden sind. Die Mischung wird dann über Nacht bei Raumtemperatur reagiert. Danach wird die Mischung mit Hilfe von mit Natri umhydrogencarbonat gesättigtem Ethylacetat getrennt. Die Ethylacetatschicht wird auf Natriumsulfatanhydrid getrock net. Die Schicht wird zur Konzentration eingedampft und die neue Verbindung mit folgender chemischer Formel (20) erhalten.

Das Gewicht der erhaltenen Verbindung beträgt 746 mg und die Ausbeute 81%.

e) Die gesamte Menge der in Formel (20) dargestellten Verbindung wird in Acetonitril/Methylenchlorid (1/1(v/v)) gelöst, um eine 0,1 M Lösung herzustellen. Die Lösung wird in eine DNA-Syntheseapparatur (381 A, ABI) eingebracht, um DNA gemäß des bekannten Synthesezyklus herzustellen, welcher 30 Sekunden Kopplung, 20 Sekunden Jodoxydation, 15 Sekunden "Capping" und 100 Sekunden Entblocken der DMTr-Gruppe um faßt. Es werden 2 DNA-Ketten, 5′-d(CTAGGC) und 3′-d(GATCCG), welche komplementär zu 5′-d(CTAGGC) ist, synthetisiert. Da die DNA′s während ihrer Synthese geschützt werden, sollten sie unter Verwendung bekannter Methoden entblockt und durch Umkehrphasen HPLC aufgereinigt werden. Von der neuen Nu kleinsäureverbindung wird angenommen, daß sie folgende For mel (21) besitzt:

Um zu bestätigen, daß die neue Verbindung die obige Formel (21) besitzt, wird die neue Verbindung unter Verwendung von Schlangengiftphosphatase und alkalischer Phosphatase hydro lysiert. Dabei wird die Lösung, welche 0,1 mM der neuen Verbindung (Basenkonzentration), 50 mM Natriumkakodylat (pH 7), 0,03 Einheiten (unit) Schlangengiftphosphatase, und 10 Einheiten (unit) alkalische Phosphatase enthält, über Nacht bei 370 C inkubiert.

Die hydrolysierte Verbindung wird durch HPLC analy siert. Die HPLC Bedingungen sind folgendermaßen.

Säule: C₁₈
Elutionspuffer: Gradientpuffer, 50 mM Ammoniumformiat/Aceto nitril (0-50%/30 Minuten)
Fließgeschwindigkeit: 1, 5 ml/Minute.
Wellenlänge: UV 254 nm.

Nach der Analyse werden Nukleotide mit der Sequenz CTAGGC (GATCCG) und die in folgender chemischer Formel (22) dargestellte Verbindung erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 wiedergegeben. Die erhaltene Verbindung wird als Verbindung (22) bezeichnet.

Als Standardpräparationen werden Desoxycytidin (dC), Desoxyguanosin (dG), Desoxythimidin (dT) und Desoxyadenosin (dA) (YAMASA) verwendet.

Das ¹H NMR-Spektrum (D₂O, 500 MHz) der Verbindung (22) ist in Fig. 7 und das FAB (positiv)-Spektrum in Fig. 8 wiedergegeben. Der Fig. 8 ist zu entnehmen, daß M + 1 = 787 und M + Na = 807 sind. Diese Ergebnisse zeigen, daß die erhaltene Nukleinsäureverbindung die chemische Formel (21) besitzt; diese Verbindung wird als Verbindung (21) bezeich net.

Im weiteren wird die Schmelztemperatur der Nukleinsäu reverbindung (21) unter folgenden Bedingungen gemessen:
Puffer: 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0).
Nukleinsäurekonzentration: 0,05 mM (berechnet anhand der Basenkonzentration)
Erhitzungsverhältnis: 20 C/Min.

Die Schmelztemperatur der äquimolaren Mischung von 2 Hexameren, die .der an die Nukleinsäureverbindung (21) gebun denen Nukleotidketten entspricht, beträgt 20,6°C. Die Nu kleinsäureverbindung (21) besitzt dagegen einen Schmelzpunkt von 71,3°C. Die Ergebnisse zeigen also, daß die Nu kleinsäureverbindung (21) die Ausbildung intramolekularer Basenpaarstruktur fördert.

Beispiel 2

Zur Herstellung der Verbindung (13) werden die Stufen (a′) und (b′) anstelle der beiden Stufen (a) und (b) von Beispiel 1 durchgeführt.

a′) 3 g Aluminiumlithiumhydrid werden in 100 ml was serfreiem Tetrahydrofuran suspendiert. Zu der Lösung wird eine geeignete Menge wasserfreies Tetrahydrofuran, welches 2 g 18 β-Glycerinretinsäure (G1,010-5, ALDRICH CHEMICAL) ent hält, gegeben. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nacheinander werden zu der Lösung 3 ml Wasser, 3 ml 15%ige wäßrige NaOH Lösung und 9 ml Wasser gegeben, um überschüssiges Aluminiumlithiumhydrid und überschüssige Metallkomplexe abzubauen. Dann wird die Lösung bis zur Troc kenheit konzentriert. Die getrocknete Verbindung wird in Methanol kristallisiert, um die in folgender Formel (14) dargestellte Verbindung zu erhalten. Die Verbindung wird als Verbindung (14) bezeichnet.

Es werden 1,1 g der weißen kristallinen Verbindung (14) erhalten, wobei die Ausbeute 55% beträgt. Die Analysedaten der Verbindung (14) sind im folgenden wiedergegeben.

¹H NMR-Spektrum (CDCl₃, 200 MHz) : δ 0,81 (s, 3H), 0,84 (s, 3H), 0,88 (s, 3H), 0,98 (s, 3H), 1,09 (s, 3H), 1,21 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 0,80-2,05 (m, 21H), 3,22 (dd, 1H, J = 9,6, 5,7 Hz), 3,47 (d, 1H, J = 10,8 Hz), 3,54 (d, 1H, J = 10,8 Hz) , 4,28 (brs, 1 H), 5,29 (d, 1H, J = 4,2 Hz)
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) : δ 15,71, 18,10, 18,70, 19,37, 25,26, 26,38, 27,04, 27,12, 27,37, 28,35, 28,45, 29,55, 32,27, 33,21, 35,55, 36,34, 38,29, 38,68, 38,75, 39,50, 41,86, 42,52, 46,49, 52,48, 55,75, 66,63, 66,74, 79,06, 126,04, 147,97.

HR FABMS (Positivion) : m/z 459,3838 (M + H, 459,3838, berechnet für C₃₀H₅₁O₃).

b′) 1,1 g der in Stufe (a) erhaltenen Verbindung (14) werden in 200 ml Methylenchlorid gelöst. Zu der Lösung werden 7 g MnO₂ gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird die Lösung zur Abtrennung des MnO₂ fil triert. Das Filtrat wird zur Trockenheit konzentriert. Da nach wird die getrocknete Verbindung in Methanol kristalli siert, um die in folgender Formel (13) dargestellte Verbin dung zu erhalten.

Es werden 543 mg der weißen kristallinen Verbindung (13) erhalten, und die Ausbeute beträgt 51%. Im folgenden sind die Analysedaten der Verbindung (13) wiedergegeben.

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz) : δ 0,78 (s, 3H), 0,83 (s, 3H), 0,89 (s, 3H), 0,97 (s, 3H), 1,09 (s, 3H), 1,10 (s, 3H), 1,35 (s, 3H), 0,62-2,10 (m, 19H), 2,30 (s, 1H), 2,75 (m, 1H), 3,20 (dd, 1H, J = 9,8, 5,7 Hz), 3,44 (d, 1H, J = 11,2 Hz), 3,59 (d, 1H, J = 11,2 Hz) , 5,56 (s, 1H).

¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) : δ 15,56, 16,35, 17,46, 18,69, 23,39, 26,37, 26,70, 27,27, 27,32, 28,07, 28,56, 29,38, 32,28, 32,74, 35,41, 35,92, 37,07, 39,11, 40,29, 43,39, 45,37, 46,98, 50,80, 54,92, 61,76, 66,21, 79,04, 128,31, 169,87, 200,25.

HR FABMS (Positivion) : m/z 457,3681 (M + H, 457,3681, berechnet für C₃₀H₄₉O₃).

Beispiel 3

Um die Verbindung (15) zu erhalten, wird die Stufe (b′′) anstelle der in Beispiel 2 beschriebenen Stufe (b′) verwendet.

b′′) 1,1 g der Verbindung (14) werden in einer Mi schung aus 20 ml Methanol und 1 ml 1 N HCl gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Lösung wird zur Trockenheit konzentriert. Die entstehende Verbindung wird in Methanol kristallisiert, um die in folgender Formel (15) dargestellte Verbindung zu erhalten.

Es werden 237 mg der weißen kristallinen Verbindung (15) erhalten, und die Ausbeute beträgt 22%. Im folgenden sind die Analysedaten der Verbindung (15) wiedergegeben.

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz) : δ 0,81 (s, 3H), 0,87 (s, 3H), 0,98 (s, 3H), 1,03 (s, 3H), 1,13 (s, 3H), 1,16 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 0,6-2,1 (m, 19H), 3,17-3,27 (m, 2H), 3,44 - 3,53 (m, 2H), 5,49 (d, 1H, J = 5,5 Hz), 5,56 (d, 1H, J = 5,5 Hz).

FABMS (Positivion) : m/z 441 (M + H, 441, berechnet für C₃₀H₄₉O₂).

Beispiel 4

Um die Möglichkeit der Dreifachstrangbildung der in folgender Formel (23) dargestellten Verbindung zu untersu chen,

wird die Verbindung (23) mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen Methode synthetisiert, mit dem Unterschied, daß verschiedene DNA-Ketten benutzt werden. Die unten wie dergegebenen Verbindungen und Nukleotidketten werden syn thetisiert und aufgereinigt, um die Möglichkeit der Drei strangbildung zu untersuchen.

Dabei werden die Verbindungen und Nukleotidketten kombiniert und ihre Interaktionen untersucht.

Kombination 1: Die Nukleinsäureverbindung (23) und die Nukleotidkette (24) mit folgender DNA-Sequenz:

5′-d(AAAGAAAGA) (24)

Kombination 2: Die Nukleotidketten (24) und (25) mit folgenden DNA-Sequenzen:

5′-d(TCTTTCTTT) (25)

Kombination 3: Die Nukleotidketten (24), (25) und (26) mit folgender DNA-Sequenz:

5′-d(TTTCTTTCT) (26)

Die Nukleotidkette (24) ist dabei in ihrer Sequenz komplementär zu dem 3′-Bereich der Verbindung (23). Die Verbindung (25) besitzt die gleiche DNA-Sequenz wie die Verbindung (23) in ihrem 3′-Bereich. Die Nukleotidkette (26) besitzt die gleiche DNA-Sequenz wie die Verbindung (23) in ihrem 5′-Bereich. Die Nukleotidkette (26) kann durch Bindung an einen Doppelstrang, welcher aus der Nukleotidkette (24) und dem 3′-Bereich der Verbindung (23) besteht, oder an den Doppelstrang, der aus den Nukleinsäuren (24) und (25) be steht, einen Dreifachstrang ausbilden.

Derartige Interaktionen zwischen Nukleinsäureverbin dungen und der Nukleotidkette oder zwischen Nukleotidketten werden durch UV- und Zirkulardichroismus-Spektroskopie un tersucht. Die UV- und Zirkulardichroismus-Spektren werden unter folgenden Bedingungen erhalten:
Puffer: 10 mM Phosphatpuffer mit 100 mM NaCl (pH 7,0). Nukleinsäurekonzentration: 4 µM (bezogen auf die Kon zentration der Verbindung oder Nukleotidkette).

Temperatur: eingestellt auf eine bestimmte Temperatur.

Zur Bestimmung der Schmelztemperaturen der Doppel- oder Dreifachstränge durch UV-Spektroskopie wird die Temperatur der Probenlösung mit 0,5°C/Minute erhöht oder erniedrigt.

Die Schmelztemperatur der Mischung aus der Nukleinsäu reverbindung (23) und der Nukleotidkette (24), welche als Mischung (a) bezeichnet wird, beträgt 27,4°C. Im Gegensatz dazu beträgt die Schmelztemperatur der Mischung aus den Nukleotidketten (24) und (25), die als Mischung (b) bezeich net wird, 18,0°C. Die Schmelztemperatur der Mischung aus den Nukleotidketten (24), (25) und (26), die als Mischung (c) bezeichnet wird, beträgt 16,8°C. Demgemäß ist die Schmelztemperatur der Mischung (a) bedeutend höher als die der anderen Mischungen. Die Ergebnisse zeigen, daß in der Mischung (a) die Interaktion zwischen der Nukleinsäurever bindung und der Nukleotidkette stärker als in Mischung (b) oder (c) ist.

Die Ultraviolettabsorptionsspektren der Mischungen (a), (b) und (c) ändern sich entsprechend der Temperatur der Lösung. Wenn doppelsträngige oder dreifachsträngige DNA in einzelsträngige DNA dissoziiert, wird der Absorptionswert erhöht. Um festzustellen, ob es sich bei den Strängen in der Mischung um Doppel- oder Dreifachstränge handelt, wird das folgende Verfahren verwendet. Zunächst werden die UV-Spek tren der Mischung bei kontrollierter Temperatur gemessen. Da die Ergebnisse eine in Fig. 9 dargestellte sigmoide Kurve ergeben, werden die Werte A und B mit Hilfe der Kurve fol gendermaßen bestimmt. Die sigmoide Kurve enthält zwei linea re Bereiche, die durch eine Steigung verbunden sind (siehe Fig. 9). Der höhere lineare Bereich, welcher sich bei höhe ren Temperaturen als der Schmelztemperatur des Stranges ergibt, zeigt, daß ausschließlich einzelsträngige DNA in der Mischung enthalten ist. Der untere lineare Bereich, welcher sich bei Temperaturen unter der Schmelztemperatur des Stran ges ergibt, zeigt, daß ausschließlich doppel- oder dreifach strängige DNA in der Mischung enthalten ist. Da diese zwei linearen Bereiche zwei Linien ergeben, werden sie zur Schmelztemperatur extrapoliert und die Absorptionswerte A und B bestimmt. (Die obere Linie wird als Linie U und die untere Linie als Linie L bezeichnet. Die Linie U entspricht dem einzelsträngigen Stadium mit Zufallswindungen. Im Gegen satz dazu entspricht die Linie L dem doppel- oder dreifach strängigen Stadium.) ΔA wird als Differenz von A und B er halten und durch A geteilt, um das Verhältnis ΔA/A zu erhal ten. Aufgrund der physikalischen Bedeutung des Verhältnisses wird angenommen, daß das Verhältnis den Gehalt an Doppel- oder Dreifachstrang in der Lösung bei einer Temperatur unter der Schmelztemperatur widerspiegelt.

Das erhaltene Verhältnis ΔA/A beträgt 0,188 in der Mischung (a), 0,101 in der Mischung (b) und 0,097 in der Mischung (c). Im Ergebnis ist das aus der Mischung (a) er haltene Verhältnis bedeutend höher als das aus der Mischung (b) erhaltene, während die Verhältnisse, die aus der Mi schung (b) und (c) erhalten werden, jedoch keine signifikan ten Unterschiede zeigen und im wesentlichen gleich sind. Dieses Ergebnis zeigt, daß sich die Nukleotidketten in den Mischungen (a) und (b) in unterschiedlichen Stadien befin den. Es wird angenommen, daß die Nukleotidketten in der Mischung (b) bei einer Temperatur unter der Schmelztempera tur im doppelsträngigen Stadium vorliegen. Im Gegensatz dazu könnten die Nukleotidketten auch in einer anderen Struktur als im doppelsträngigen Zustand vorliegen, welche sich durch ein erhöhtes Basen-"Stacking" auszeichnet.

Die Zirkulardichroismusspektren der Mischungen (a), (b) und (c) bei 10°C sind in Fig. 10 wiedergegeben. Bei Mischung (a) erscheint eine negative Kurve bei 211 nm. Bei den beiden Mischungen (b) und (c) existiert jedoch kein negativer Bereich bei 211 nm (Fig. 10). Bekanntermaßen tritt ein negativer Bereich um 210 nm auf, wenn ein Drei fachstrang gebildet wird (D.M. Gray et al., Methods in Enzy mology, 246: 19-34 (1995)). Die auf diesen experimentellen Ergebnissen beruhenden Analysen der Zirkulardichroismusspek tren führen zum Schluß, daß der negative Bereich, welcher bei der Mischung (a) auftritt, durch Dreifachstrangbildung verursacht wird.

Gemäß der obigen experimentellen Ergebnisse können die Nukleinsäureverbindungen mit dem triterpenoiden Skelett und den zwei Oligonukleotidketten Dreifachstränge mit der drit ten Nukleotidkette ausbilden. Es hat sich gezeigt, daß in dem Dreifachstrang eine der Nukleotidketten der Nukleinsäu reverbindung (23) Watson-Crick-Basenpaare mit seiner kom plementären Nukleotidkette ausbildet und eine andere Kette der Verbindung (23) mit dem Doppelstrang unter Ausbildung von Hoogsten-Basenpaaren interagiert, um einen Dreifach strang zu ergeben.

Beispiel 5 1) Synthese der Nukleotidketten und Nukleinverbindun gen zur Untersuchung ihres Einbringens in Zellen

Die in folgender Formel (27) dargestellte Verbindung wird unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Metho de synthetisiert, mit der Ausnahme, daß unterschiedliche DNA Ketten verwendet werden, aufgereinigt und als Verbindung (27) bezeichnet.

Bei der Synthese von (27) wird Beaucage-Reagenz ([3H]- 1,2-Benzodithiol-3-one-1,1-dioxyd) verwendet, um die Ver bindung mit Phosphorthioatbindung (mit * in (27) bezeichnet) anstelle einer üblichen Phosphodiesterbindung zu erhalten.

Außerdem wird die in folgender Formel (28) darge stellte Verbindung synthetisiert und mit (27) hinsichtlich ihres Einbringens in Zellen verglichen.

5′-d(T*G*G*T*G*A*G*G*T*T*T*G*A*T*C*C*G*C*A*T) (28)

*: Phosphorthioatbindung.

Die oben beschriebene Nukleotidsequenz besitzt nur Phosphor thioatbindungen anstelle von Phosphodiesterbindungen.

Die erhaltenen Nukleinsäureverbindungen (27) und die Nukleotidkette (28) werden an ihren 5′-Enden unter Verwen dung von T4-Polynukleotidkinase und [γ-³²p]ATP(10mCi/ml) mar kiert, um das Einbringen in Zellen zu untersuchen.

2) Einbringen der Nukleotidkette und der Nukleinsäu reverbindung in A549-Zellen

Es wird die humane Karzinomzellinie A549 verwendet. Die Zellen werden in 96-Loch-Mikrotiterplatten in mit 10% FCS supplementiertem DMEM, bei 37°C und 5% CO₂ 3 Tage kul tiviert. Nach 3 Tagen sind die Zellen konfluent (ungefähr 1 × 10⁵ Zellen/Loch) und werden mit serumfreiem Medium, OPTI-MEM, gewaschen.

Zur Herstellung des Inkorporationsmediums wird mar kierte und nicht markierte Nukleinsäureverbindung (27) ge mischt und zu OPTI-MEM gegeben, so daß ihre Gesamtkonzen tration 1 µM beträgt. Ebenso wird markierte und nicht mar kierte Nukleotidkette (28) gemischt und zu OPTI-MEM gegeben, so daß ihre Gesamtkonzentration 1 µM beträgt, um Inkorpora tionsmedium herzustellen. Die Konzentration 1 µM entspricht 5,5×10⁴ cpm/Loch. Dann wird die Platte bei 37°C und 5% CO₂ 4 Stunden inkubiert.

Danach wird das Medium entfernt und die Zellen mit PBS (phosphate buffered saline) gewaschen. Dann werden die Zel len mit 0,05% Trypsin/0,53 mM EDTA behandelt. Durch diese Behandlung lösen sich die Zellen von der 96 Lochplatte ab, wobei die auf der Zelloberfläche gebundenen Nukleinsäurever bindungen ebenso entfernt werden. Die zellenthaltende Lösung wird in Mikroreaktionsgefäße überführt und bei 1.500 rpm 10 Minuten zentrifugiert. Ihre Überstände werden entfernt. Die auf dem Boden der Reaktionsgefäße gesammelten Zellen werden in 1%iger SDS-Lösung gelöst. 200 µl der SDS-Lösung werden in Röhrchen überführt und die Menge der obigen Verbindungen, die in die Zellen eingebracht werden, unter Verwendung von Flüssigscintillation bestimmt.

Die Mengen der eingebrachten Verbindungen (27) und (28) sind als Verhältnis, bei dem die Menge an eingebrachter Nukleotidkette (28) gleich 1 gesetzt wird, wiedergegeben. Im Ergebnis beträgt das Inkorporationsverhältnis der Verbindung (28) 2,1 ± 0,6, was zeigt, daß die Inkorporation der Ver bindung (27) bedeutend höher als bei dem Vergleich ist.

Zusammengefaßt zeigt das Ergebnis, daß die erfindungs gemäßen Nukleinsäureverbindungen mit triterpenoidem Skelett (27) leicht in derartige Zellen eingebracht werden können. Das Ergebnis zeigt weiter, daß die erfindungsgemäße Verbin dung eine verbesserte Zellmembranpermeabilität besitzt.

Claims

1. Nukleinsäureverbindung, welche eine Nichtnuklein säurestruktur mit Ringskelett, an das zwei funktionelle Gruppen in fixiertem Zustand gebunden sind, die im wesentli chen in die gleiche Richtung zeigen können, und ein Paar Nukleotidketten, die an die funktionellen Gruppen gebunden sind, beinhaltet.

2. Nukleinsäureverbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Ketten des Nukleotidkettenpaares komplementär zueinander ist.

3. Nukleinsäureverbindung gemäß Anspruch 1, wobei der Abstand zwischen den funktionellen Gruppen in der Nichtnu kleinsäureverbindung 0,6-1,4 nm beträgt.

4. Nukleinsäureverbindung gemäß Anspruch 1, wobei eine der Nukleotidketten des Nukleotidkettenpaares komplementär zu der dritten Nukleotidkette unter Ausbildung eines Dop pelstranges ist, und eine andere Kette des Nukleotidketten paares mit dem Doppelstrang einen Dreifachstrang ausbildet.

5. Nukleinsäureverbindung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Nichtnukleinsäureskelett um ein triterpenoides Skelett handelt.

6. Nukleinsäureverbindung gemäß Anspruch 1, wobei das Nichtnukleinsäureskelett in folgender chemischer Formel (1) wiedergegeben ist:

7. Nukleinsäureverbindung gemäß Anspruch 1, wobei das Nichtnukleinsäureskelett durch folgende chemische Formel (2) dargestellt ist:

8. Syntheseverfahren für eine Nukleinsäureverbindung, dadurch charakterisiert, daß ein Paar Nukleotidketten je weils zu zwei funktionellen Gruppen gegeben wird, die auf einer Nichtnukleinsäurestruktur mit Ringskelett im wesentli chen in der gleichen Richtung fixiert sind.

9. Syntheseverfahren für eine Nukleinsäureverbindung gemäß Anspruch 8, wobei die Nukleotidketten komplementär zueinander sind.

10. Syntheseverfahren für eine Nukleinsäureverbindung gemäß Anspruch 8, wobei eine der zugegebenen Nukleotidketten komplementär zu der dritten Nukleotidkette ist, um einen Doppelstrang auszubilden, und eine andere Nukleotidkette einen Dreifachstrang mit dem Doppelstrang ausbilden kann.

11. Syntheseverfahren für besagte Nukleinsäureverbin dung gemäß Anspruch 8, wobei der Abstand zwischen den funk tionellen Gruppen der Nichtnukleinsäureverbindung 0,6-1,4 nm beträgt.

12. Syntheseverfahren für besagte Nukleinsäureverbin dung gemäß Anspruch 8, wobei die Nukleotidketten an die funktionellen Gruppen der Nichtnukleinsäureverbindung durch eine Phosphoramidit- oder Thiophosphitbindung gebunden sind.

13. Syntheseverfahren für besagte Nukleinsäureverbin dung gemäß Anspruch 8, wobei es sich bei der Nichtnuklein säureverbindung um eine triterpenoide Verbindung handelt.

14. Syntheseverfahren für besagte Nukleinsäureverbin dung gemäß Anspruch 8, wobei es sich bei der Nichtnuklein säureverbindung um eine Verbindung mit einem in folgender chemischer Formel (1) dargestellten Skelett handelt.

15. Syntheseverfahren für besagte Nukleinsäureverbin dung gemäß Anspruch 8, wobei es sich bei der Nichtnuklein säureverbindung um eine Verbindung mit einem in folgender chemischer Formel (2) dargestellten Skelett handelt.

16. Triterpenoide Verbindung, dargestellt in folgender chemischer Formel (3), worin R und R′ jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe sind.

17. Triterpenoide Verbindung, dargestellt in folgender chemischer Formel (4), worin R und R′ jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Schutz gruppe sind.

18. Phosphoramiditverbindung, dargestellt in folgender chemischer Formel (5), worin R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe ist.

19. Phosphoramiditverbindung, dargestellt in folgender chemischer Formel (6), worin R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe ist.

20. Thiophosphitverbindung, dargestellt in folgender chemischer Formel (7), worin R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe ist.

21. Thiophosphitverbindung, dargestellt in folgender chemischen Formel (8), worin R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe ist.