-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
optisch aktiven Dinucleotids. Das gemäß dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung erhaltene Dinucleotid kann bei der Herstellung eines Oligonucleotids,
das bei der Identifizierung, Extraktion und Expressionskontrolle
eines Ziel-Gens in Gebieten wie z. B. Gentechnik, klinischer Diagnose
und medizinischer Behandlung nützlich
ist, als Vorläufer
verwendet werden.
-
Beim
Nachweis und der Mengenbestimmung einer Ziel-Nucleinsäure wird
die Fähigkeit
der Ziel-Nucleinsäure,
mit einer Nucleinsäure-Sonde,
die eine zu einer speziellen Nucleotidsequenz in der Ziel-Nucleinsäure komplementäre Basensequenz
aufweist, zu hybridisieren, verwendet.
-
Andererseits
ist von Interkalationsfarbstoffen wie Oxazolgelb, Thiazolorange
und Ethidiumbromid bekannt, dass ihre Fluoreszenz beim Binden an
eine doppelsträngige
Nucleinsäure
außergewöhnlich zunimmt.
-
Unter
Verwendung dieser Eigenschaft haben die Erfinder ein Verfahren zum
Untersuchen einer Nucleinsäure,
die eine spezielle Nucleinsäuresequenz
enthält
(eine Ziel-Nucleinsäure),
durch Nachweisen der speziellen Nucleinsäuresequenz erfunden, wobei
das Verfahren einen Schritt des Zugebens eines einzelsträngigen Oliogonucleotids,
das eine zu der speziellen Nucleinsäuresequenz in der Ziel-Nucleinsäure komplementäre Nucleinsäuresequenz
enthält,
als Sonde zu einer Probe, und Hybridbildung der Sonde mit der Ziel-Nucleinsäure umfasst;
wobei es sich bei der Sonde um ein einzelsträngiges Oligonucleotid handelt,
das mit einem fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff, der in das
Hybrid der Ziel-Nucleinsäure
und dem einzelsträngigen
Oligonucleotid interkaliert, markiert ist (JP-A-8-211050, USP 5,814,447
und
EP 714986 ).
-
Die
vorstehend erwähnte
Erfindung stellte eine markierte Nucleinsäure-Sonde zum homogenen und einfachen
Einstufen-Nachweis einer Nucleinsäure, die eine spezielle Nucleinsäuresequenz
enthält,
bereit, die den Nachweis von Hybridbildung oder Mengenbestimmung
des entstehenden Hybrids ohne die Notwendigkeit eines Schritts des
Abtrennen des unhybridisierten Sondenüberschusses beim Nachweis einer
Ziel-Nucleinsäure
ermöglichte.
-
Als
eine interkalierende Markierung in der Mitte einer Nucleinsäure-Sonde über einen
Aminoalkylphosphonat-Linker, der keinen Einfluss auf die Hybridbildung
mit der Ziel-Nucleinsäure hat,
befestigt wurde, war es möglich,
bereits die Substitution nur einer Base in einer Ziel-Nucleinsäure nachzuweisen,
wenn auch das Verfahren des Markierens der Nucleinsäure-Sonde
nicht darauf beschränkt
ist.
-
Eine
phosphonische Diesterkopplung als Internucleotidkopplung weist ein
chirales Zentrum an ihrem Phosphoratom auf. Daher weist eine DNS-Sonde,
die durch Einführen
von Phosphonsäure
in die Mitte eines Oligonucleotids erhalten wird, zwei Stereoisomere
mit absoluter R- bzw. S-Konfiguration
auf.
-
Von
Methylphosphorsäure-enthaltender
Gegensinn-DNS, die als genetisches Arzneimittel ausführlich erforscht
wird, ist bekannt, dass sie in der Stabilität ihrer Hybridbildung mit einem
Komplementärstrang
(Tm), in der Konformation und in der Reaktivität mit Nucleasen in Abhängigkeit
der absoluten Konfiguration der Methylphosphonsäure variiert.
-
WO
97/09340 offenbart ein Zweistufen-Verfahren zur Synthese von optisch
reinen Organophosphor-Dinucleotiden aus optisch aufgelösten Nucleotidmonomeren.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines
optisch aktiven Dinucleotids der Formel (1) bereit,
wobei das Verfahren Umsetzen
eines phosphonischen Nucleotids der Formel (2)
mit einem Nucleosid der Formel
(3)
um ein Dinucleotid der Formel
(4)
zu ergeben, und optisches
Trennen des Dinucleotids umfasst,
wobei P* ein optisch aktives
Phosphoratom ist, B eine beliebige Base ist, R
1 eine
Trifluoracetylgruppe ist, R
2 eine Hydroxyl-Schutzgruppe
ist und R
3 eine t-Butyldimethylsilylgruppe
ist.
-
Das
optisch aktive phosphonische Dinucleotid ist als Vorläufer bei
der Herstellung einer optisch aktiven DNS-Sonde nützlich.
Die Erfinder haben gefunden, dass ein phosphonisches Dinucleotid,
das in Form eines Racemats erhalten wird, einen Unterschied im Rf-Wert
seiner Stereoisomere in Abhängigkeit
der Art der getragenen Schutzgruppe aufweisen kann. Auf der Grundlage
dieser Entdeckung haben sie die Stereoisomere unschwer aufgetrennt
und ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven phosphonischen
Dinucleotids geschaffen.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun im Detail beschrieben. Es wird auf
die begleitenden Zeichnungen verwiesen:
-
1 veranschaulicht
das Verfahren von Beispiel 1.
-
2 veranschaulicht
das Verfahren von Beispiel 2.
-
3 ist
das NMR-Diagramm von Verbindung 5.
-
4 sind
die NMR-Diagramme von Verbindungen 5S und 5R.
-
5 sind
die NMR-Diagramme von Verbindungen 5S und 5R.
-
6 veranschaulicht
die Einzelheiten von Verbindungen 5S/5R (B1 =
T, B2 = CBZ, R31 = MZ, R32 = Ac) und
5S/R(B1 = T, B2 =
CBZ, R31 = TFA,
R32 = TBDMS).
-
7 veranschaulicht
das Verfahren von Beispiel 3.
-
8 veranschaulicht
das Verfahren von Beispiel 3.
-
9 veranschaulicht
das Verfahren von Beispiel 4.
-
10 veranschaulicht
das Verfahren von Beispiel 5.
-
11 veranschaulicht
die in Beispiel 8 erhaltene DNS-Sonde.
-
12 ist
das HPLC-Diagramm der in Beispiel 8 erhaltenen DNS-Sonde.
-
13 veranschaulicht
die in Beispiel 9 erhaltene DNS-Sonde.
-
14 ist
das HPLC-Diagamm der in Beispiel 9 erhaltenen DNS-Sonde.
-
15 veranschaulicht
das Verfahren von Beispielen 10 und 11.
-
16 veranschaulicht
die in Beispiel 14 erhaltene DNS-Sonde.
-
17 ist
das HPLC-Diagamm der in Beispiel 14 erhaltenen DNS-Sonde.
-
18 veranschaulicht
die in Beispiel 15 erhaltene DNS-Sonde.
-
19 ist
das HPLC-Diagamm der in Beispiel 15 erhaltenen DNS-Sonde.
-
20(A) zeigt das Fluoreszenzspektrum einer
wässrigen
Lösung,
die die in Beispiel 8 erhaltene DNS-Sonde YO-A13S und das Ziel-Nucleotid
Oligo-dT (30-mer) enthält,
gemessen unter hybridbildungsfähigen
Bedingungen (I), das Fluoreszenzspektrum einer wässrigen Lösung, die die in Beispiel 9
erhaltene DNS-Sonde YO-A13R und das Ziel-Nucleotid Oligo-dT (30-mer)
enthält,
gemessen unter hybridbildungsfähigen
Bedingungen (II), das Fluoreszenzspektrum von YO-A13R in einer wässrigen
Lösung
(III) und das Fluoreszenzspektrum von YO-A13S in einer wässrigen
Lösung
(IV).
-
20(B) zeigt die Fluoreszenzspektren von
wässrigen
Lösungen,
die die in Beispielen 8 oder 9 erhaltenen DNS-Sonden YO-A13S bzw.
YO-A13R und Oligo-dA (30-mer) enthalten.
-
20(C) zeigt die Fluoreszenzspektren von
wässrigen
Lösungen,
die die in Beispielen 8 oder 9 erhaltenen DNS-Sonden YO-A13S bzw.
YO-A13R und eine rekombinante HCV-RNS enthalten.
-
21(A) zeigt das Fluoreszenzspektrum einer
wässrigen
Lösung,
die die in Beispiel 14 erhaltene DNS-Sonde YO-271S und die Ziel-Nucleinsäure Temp271
enthält,
gemessen unter hybridbildungsfähigen
Bedingungen (Temp271), und das Fluoreszenzspektrum von YO-271S in
wässriger
Lösung
(keines).
-
21(B) zeigt das Fluoreszenzspektrum einer
wässrigen
Lösung,
die die in Beispiel 15 erhaltene DNS-Sonde YO-271R und die Ziel-Nucleinsäure Temp271
enthält,
gemessen unter hybridbildungsfähigen
Bedingungen (Temp271), und das Fluoreszenzspektrum von YO-271R in
wässriger
Lösung
(keines).
-
22 ist
das NMR-Diagramm von Verbindung 5S.
-
23 ist
das NMR-Diagramm von Verbindung 5R.
-
24 veranschaulicht
die Substrate und die Reaktionsprodukte der Umsetzungen in Beispielen
20 bis 22.
-
Ein
Nucleosid der Formel (5) kann in der vorliegenden Erfindung als
Ausgangsmaterial verwendet werden, und diejenigen, bei denen R2 eine DMTr-Gruppe (4,4'-Dimethoxytrityl) bedeutet, können mit
dem in der Literatur offenbarten Verfahren (J. Am. Chem. Soc., Vol.
84, 430 (1962)) erhalten werden. Andere solche Verbindungen, die
auf dem Markt sind, können
ebenfalls verwendet werden.
-
-
Ferner
kann eine Verbindung der Formel (6), die durch Schützen von
im Handel erhältlicher
2-Aminoethylphosphonsäure
mit einer geeigneten Aminoschutzgruppe erhalten werden kann, verwendet
werden. Bei der Aminoschutzgruppe handelt es sich um TFA (Trifluoracetyl).
-
-
Dehydratisierungskondensation
einer Verbindung der Formel (5) mit einer Verbindung der Formel
(6) ergibt eine Verbindung der Formel (2). Obwohl das für die Kondensation
verwendete Kondensationsmittel nicht beschränkt ist, ist es üblicherweise
ein Mittel, das zum Bilden eines Phosphoresters fähig ist,
wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, Alkylbenzolsulfonsäurederivate
und Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid. Als Lösungsmittel
kann ein polares Lösungsmittel,
das das Reaktionsprodukt löst,
wie z. B. Acetonitril und Pyridin verwendet werden. Die Reaktionstemperatur
ist ebenfalls nicht besonders beschränkt, sie liegt aber zwischen dem
Schmelzpunkt und dem Siedepunkt des Lösungsmittels, vorzugsweise
von –10°C bis 60°C.
-
-
Die
entstehende Verbindung der Strukturformel (2) wird mit einem Nucleosid
der Formel (3), das eine ungeschützte
Hydroxylgruppe an der 5'-Position
aufweist, kondensiert, um ein phosphonisches Dinucleotid der Formel
(4) zu ergeben. Als Schutzgruppe an der 3'-Position der Verbindung der Strukturformel
(3) wird TBDMS (tert-Butyldimethylsilyl) verwendet.
-
-
-
Obwohl
das für
die Kondensation verwendete Kondensationsmittel nicht beschränkt ist,
ist es üblicherweise
ein Mittel, das zum Bilden eines Phosphoresters fähig ist,
wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, Alkylbenzolsulfonsäurederivate
und Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid.
Als Lösungsmittel
kann ein polares Lösungsmittel,
das das Reaktionsprodukt löst,
wie z. B. Acetonitril und Pyridin verwendet werden. Die Reaktionstemperatur
ist ebenfalls nicht besonders beschränkt, sie liegt aber zwischen
dem Schmelzpunkt und dem Siedepunkt des Lösungsmittels, vorzugsweise
von –10°C bis 60°C.
-
Diese
Verbindung weist ein chirales Zentrum am Phosphoratom auf und wird
als Mischung der beiden Stereoisomere, die R- bzw. S-Konfiguration
aufweisen, erhalten. Die Stereoisomere können mit gebräuchlichen
Verfahren zur reinigenden Trennung von Verbindungen, wie z. B. Silicagel-Säulenchromatographie
und Umkehrphasen-Säulenchromatographie,
optisch aufgetrennt werden.
-
In
einem Versuch, die Stereoisomere zu trennen, haben die Erfinder
gefunden, dass es einen Unterschied der Rf-Werte der beiden Stereoisomere
gibt, der von der Art der Schutzgruppen an der 3'-Position des phosphonischen Dinucleotids
abhängt.
Wenn die Aminoschutzgruppe eine MZ-Gruppe ist und die Schutzgruppe
an der 3'-Position
Ac ist, haben die beiden Stereoisomere den gleichen Rf-Wert und
sind schwer zu trennen. Wenn jedoch die Aminoschutzgruppe eine TFA-Gruppe
ist und die Schutzgruppe an der 3'-Position eine TBDMS-Gruppe ist, ist
der Unterschied der Rf-Werte der beiden Stereoisomere groß genug,
um ihre Trennung zu ermöglichen.
Die absoluten Konfigurationen der aufgetrennten Stereoisomere werden
durch analytische Verfahren wie z. B. 1H-NMR
und 31P-NMR bestimmt.
-
Dann
kann das aufgetrennte optisch aktive Phosphonat-Dinucleotid einer
Schutzgruppenentfernung an der 3'-Position
unterworfen werden. Die Schutzgruppenentfernung wird vorzugsweise
unter Bedingungen durchgeführt,
bei denen keine anderen Schutzgruppen der Verbindung entfernt werden.
Eine TBDMS-Gruppe, die, wie vorstehend beschrieben, die Schutzgruppe
an der 3'-Position
ist, ist als Schutzgruppe einer alkoholischen Hydroxylgruppe ausgezeichnet,
und ihr größter Vorteil
ist, dass sie unter Verwendung von Fluoridanionen (Tetrabutylammoniumfluorid,
n-Bu4NF) unter neutralen Bedingungen entfernt
werden kann. Wenn das Substrat eine funktionelle Gruppe, die gegen
Basizität
empfindlich ist, aufweist, kann sich das Substrat unter solchen
Bedingungen zersetzen. In solch einem Fall ergibt, wie bekannt ist,
Zugabe von Essigsäure
zum Reaktionssystem durch Mäßigen der
Basizität
von Tetrabutylammoniumfluorid eine selektivere Entfernung des Silylethers
(K. K. Ogilvie und S. L. Beaucage, Tetrahedron Lett. (1976) 1255-1256).
Dieses herkömmliche
Verfahren kann in der vorliegenden Erfindung zur Schutzgruppenentfernung
an der 3'-Position
eingesetzt werden. Wenn jedoch das Substrat eine funktionelle Gruppe,
die sowohl gegen Acidität
als auch gegen Basizität
instabil ist, aufweist, wird bevorzugt, wie nachstehend beschrieben
vorzugehen, um die TBDMS-Gruppe ohne Säure oder Base genauer und selektiver
zu entfernen.
-
Wenn
ein Trialkylsilylether als Schutzgruppe in einer Verbindung mit
einer funktionellen Gruppe, die sowohl gegen Acidität als auch
gegen Basizität
instabil ist, unter Verwendung von Tetrabutylammoniumfluorid entfernt
wird, kann nämlich
Zugabe von sowohl Essigsäure
als auch einem Amin sowohl die Acidität als auch die Basizität mäßigen. Das
zuzugebende Amin ist nicht besonders beschränkt, aber es ist vorzugsweise
ein Amin, das nach der Umsetzung durch Destillation oder dergleichen
entfernt werden kann, wie z. B. Triethylamin. Mit Bezug auf das
Verfahren ihrer Zugabe können
Essigsäure
und ein Amin als solche zugegeben werden, oder als eine wässrige Lösung wie
z. B. als ein Triethylamin-Acetat-Puffer. In beiden Fällen unterbricht das
Zugeben von Essigsäure
und einem Amin die Umsetzung zum Entfernen der Trialkylsilylether-Kopplung nicht.
Es wird bevorzugt, eine Mischung von Essigsäure und Triethylamin mit einer
Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung
zu der Substratlösung
zuzugeben, anstatt eine Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung zu
einer Mischung von Essigsäure
und Triethylamin mit der Substratlösung zuzugeben. Das liegt daran,
dass die Acidität und
Basizität
von Tetrabutylammoniumfluorid wirksamer gemäßigt werden kann.
-
Obwohl
es keine Beschränkung
der zuzugebenden Mengen von Tetrabutylammoniumfluorid, Essigsäure und
Triethylamin gibt, ist die zu verwendende Menge von Tetrabutylammoniumfluorid
beispielsweise von 1 bis 10-mal, vorzugsweise von 1,5 bis 3-mal
größer als
die des Substrats. Bei der TBDMS-entfernenden Umsetzung von Tetrabutylammoniumfluorid
verzögert
die Zugabe von Essigsäure
und Triethylamin das Verschwinden des Ausgangsmaterials, aber die
Umsetzung ist in etwa einer oder zwei Stunden beendet, wenn das
molare Verhältnis
von Tetrabutylammoniumfluorid : Essigsäure : Triethylamin 2:1:1 beträgt.
-
Das
vorstehend erwähnte
Verfahren zum Entfernen eines Trialkylsilylethers als Schutzgruppe
ist zum Entfernen der TBDMS-Gruppe, die als Schutzgruppe an der
3'-Position der
vorstehend erwähnten
Verbindung verwendet wird, besonders wirksam. Gemäß einem
Bericht dieser Erfinder ergab herkömmliche Behandlung einer Verbindung
der nachstehenden Strukturformel (7) mit Tetrabutylammoniumfluorid
allein in THF das beabsichtigte Produkt der nachstehenden Strukturformel
(8) in einer Ausbeute von etwa 37% nach Isolation. Eine TLC-Analyse
der Reaktionslösung
zeigte Verschwinden des Ausgangsmaterials, wies aber auch Zersetzungsprodukte
wie z. B. DMTr-Gruppen zusätzlich
zum beabsichtigten Produkt nach. Als andererseits Essigsäure und
Triethylamin als ein Triethylamin-Acetat-Puffer zu einer THF-Lösung des Ausgangsmaterials
zugegeben wurden, erhöhte
sich wegen der Abnahme von Zersetzungsprodukten die Ausbeute des
beabsichtigten Produkts nach Isolation. Die Ergebnisse wurden unabhängig von
den Basenarten der Nucleinsäuren
bestätigt.
-
-
-
Die
so gebildete 3'-Hydroxylgruppe
kann einer Phosphorylierung oder einer Phosphoramidierung unterworfen
werden, und dann an das 5'-Ende
eines getrennt hergestellten DNS-Oligiomers angefügt werden. Ferner
kann das DNS-Oligomer mit dem am 5'-Ende angefügten Phosphonsäure-Dinucleotid
verlängert
werden, um ein Oligomer mit einer beabsichtigten Sequenz zu ergeben.
Das DNS-Oligomer kann mit herkömmlichen
Verfahren zur Herstellung von DNS-Oligomeren, wie z. B. einem Flüssigphasen-Verfahren
oder einem Verfahren in fester Phase, erhalten werden. Phosphoramidierung
eines phosphonischen Dinucleotids ermöglicht es, das phosphonische
Dinucleotid in der gleichen Weise wie im Handel erhältliche
Reagenzien für DNS-Synthetisiergeräte handzuhaben.
DNS-Synthese mit einem DNS-Synthesegerät unter Verwendung eines phosphoramidierten
phosphonischen Dinucleotids liefert ein DNS-Oligomer mit einem phosphonischen Diester
an einer beliebigen Stelle der DNS-Sequenz.
-
Schließlich wird
das so erhaltene phosphonische Oligomer der Schutzgruppenentfernung
unterworfen und ein interkalierender Farbstoff wird an die ungeschützte Aminogruppe
des Aminoethylphosphonats gebunden, um eine optisch aktive DNS-Sonde
zu ergeben.
-
Die
Verwendung eines Interkalationsfarbstoffs mit einer funktionellen
Gruppe, die direkt an eine Aminogruppe binden kann, erleichtert
das Anbinden eines Interkalationsfarbstoffs an die Aminogruppe.
Wenn ein bifunktionelles Reagens mit funktionellen Gruppen an beiden
Enden, wie z. B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)
und N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat
(EMCS) an die Aminogruppe des Aminoethylphosphonats gebunden wird,
und ein Interkalationsfarbstoff über
das bifunktionale Reagens angebunden wird, ist es möglich, die
funktionelle Gruppe des Interkalationsfarbstoffs beliebig zu wählen.
-
Jede
Verbindung, von der bekannt ist, dass sie bei Interkalation in eine
doppelsträngige
Nucleinsäure die
Fluoreszenz bemerkenswert ändert,
kann als der Interkalationsfarbstoff verwendet werden, wie z. B.
Oxazolgelb, Thiazolorange und Ethidiumbromid. Insbesondere sind
jene, die die Fluoreszenzintensität bemerkenswert verstärken, bevorzugt.
Als Beispiele solcher Interkalationsfarbstoffe können Thiazolorange und Oxazolgelb
erwähnt
werden.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf Beispiele detaillierter
beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch in keiner Weise
auf diese speziellen Beispiele beschränkt.
-
Die
nachfolgenden Abkürzungen
werden in den Beispielen verwendet.
- T:
- Thymin
- ABz:
- N-Benzoyladenin
- CBz:
- N-Benzoylcytosin
- GiBu:
- N-Isobutyrylguanin
- MZ:
- 4-Methoxybenzyloxycarbonyl
- TFA:
- Trifluoracetyl
- Ac:
- Acetyl
- TBDMS:
- tert-Butyldimethylsilyl
-
Beispiel 1
-
Wie
in 1 gezeigt, wurden Verbindung 1 und Verbindung
2 in den in Tabelle 1 gezeigten Verhältnissen gemischt und in Pyridin
gelöst,
und Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (TPS-Cl) und Tetrazol in Pyridin
wurden tropfenweise zugegeben. Die Reaktionslösung wurde 4 Stunden bei 40°C gerührt. Dann
wurde 50 %-iges wässriges
Pyridin zugegeben und der pH-Wert wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat auf
etwa 7,0 eingestellt. Die Reaktionslösung wurde zwischen Ethylacetat
und gesättigtem
wässrigem
Natriumchlorid aufgetrennt und die organische Schicht wurde getrocknet
und im Vakuum konzentriert. Reinigung des Konzentrats durch Silicagel-Säulenchromatographie
ergab Verbindung 3 in den in Tabelle 1 gezeigten Mengen und Ausbeuten.
-
-
Beispiel 2
-
Wie
in 2 gezeigt, wurden Verbindung 3 und Verbindung
4 in den in Tabelle 2 gezeigten Verhältnissen gemischt und in Pyridin
gelöst.
Ein Kondensationsmittel (Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (TPS-Cl),
Triisopropylbenzolsulfonyl-3-nitrotriazol (TPS-NTriazol) oder Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid
(BOP-Cl)) wurde zugegeben und die Umsetzung wurde bei 40°C durchgeführt. Nach
den in Tabelle 2 gezeigten Reaktionszeiten wurde 50%-iges wässriges
Pyridin zugegeben und der pH-Wert wurde auf etwa 7,0 eingestellt.
Die Reaktionslösung
wurde zwischen Ethylacetat und gesättigtem wässrigem Natriumchlorid aufgetrennt
und die organische Schicht wurde getrocknet und im Vakuum konzentriert.
Reinigung des Konzentrats durch Silicagel-Säulenchromatographie ergab Verbindung
5S und Verbindung 5R in den in Tabelle 2 gezeigten Mengen und Ausbeuten.
-
-
Beim
Vergleich der Protonen-NMR Spektren der beiden Stereosiomere wurde
dasjenige, in dem das P-CH2-Signal (P-1-Position)
zu höherer
magnetischer Feldstärke
verschoben war, als 5S gekennzeichnet, und dasjenige, in dem das
entsprechende Signal zu einer niedrigeren magnetischen Feldstärke verschoben
war, wurde als 5R gekennzeichnet.
-
Das
NMR (CDCl3)-Diagramm von Verbindung 5(R
+ S)(B1 = T, B2 =
CBz, R31 = MZ, R32 = Ac) bei 500 MHz ist in 3 gezeigt.
-
Die
NMR (CDCl3)-Diagramme von Verbindung 5S
(B1 = T, B2 = CBz, R31 = TFA, R32 = TBDMS) und Verbindung 5R (B1 =
T, B2 = CBz, R31 = TFA, R32 = TBDMS)
bei 500 MHz sind in 4 gezeigt.
-
Die
NMR (CDCl3)-Diagramme von Verbindung 5S
(B1 = ABz, B2 = ABz, R31 = TFA, R32 = TBDMS)
und Verbindung 5R (B1 = ABz,
B2 = ABz, R31 = TFA, R32 = TBDMS)
bei 500 MHz sind in 5 gezeigt.
-
Das
NMR (CDCl3)-Diagramm von Verbindung 5S (B1 = CBz, B2 = GiBu, R31 = TFA, R32 = TBDMS)
bei 500 MHz ist in 22 gezeigt.
-
Das
NMR (CDCl3)-Diagramm von Verbindung 5R (B1 = CBz, B2 = GiBu, R31 = TFA, R32 = TBDMS)
bei 500 MHz ist in 23 gezeigt.
-
Detaillierte
Strukturen von Verbindungen 5S/5R (B1 =
T, B2 = CBz, R31 = MZ, R32 = Ac)
und 5S/5R (B1 = T, B2 =
CBz, R31 = TFA,
R32 = TBDMS) sind in 6 gezeigt.
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, hängt der Unterschied der Wanderungsgeschwindigkeit
(Rf) in der Dünnschichtchromatographie
(TLC) zwischen den R- und S-Stereoisomeren von Verbindung 5 von
der Art der Hydroxyl- und Aminoschutzgruppen (R31 und
R32) ab, und wenn R31 gleich
TFA und R32 gleich TBDMS ist, ist die Trennung
der beiden Stereoisomere leicht. Für die TLC wurden ein handelsübliches
Gerät (Merck
Silicagel 60 F254 HPTLC-Platte) und eine
95:5 Mischung von Chloroform und Methanol als Entwicklungslösung verwendet.
-
Beispiel 3
-
Wie
in 7 und 8 gezeigt, wurde 0,1 M Tetrabutylammoniumfluorid
in THF tropfenweise zu Verbindung 5R oder 5S in THF zugegeben. Nach
2 Stunden Rühren
wurde die entstandene Reaktionslösung
im Vakuum zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wurde zwischen Chloroform
und gesättigtem
wässrigem
Natriumchlorid aufgetrennt, und die organische Schicht wurde getrocknet
und zur Trockne konzentriert. Reinigung des Rückstands mit Silicagel-Säulenchromatographie
ergab Verbindung 6S oder Verbindung 6R.
-
-
Beispiel 4
-
Wie
in 9 gezeigt, wurde Verbindung 7 gemäß dem in
Nucleic Acid Research, Vol. 14, 7391 offenbarten Verfahren phosphoramidiert,
um Verbindung 8 zu ergeben, die nachfolgend ohne Isolierung zur
Synthese eines DNS-Oligomers mit einem DNS-Synthesegerät verwendet
wurde.
-
Beispiel 5
-
Wie
in 10 gezeigt, wurde Verbindung 9 in der gleichen
Weise wie in Beispiel 4 phosphoramidiert, um Verbindung 10 zu ergeben,
die nachfolgend ohne Isolierung zur Synthese eines DNS-Oligomers
mit einem DNS-Synthesegerät
verwendet wurde.
-
Beispiel 6
-
Ein
DNS-Oligomer A-13S mit der folgenden Basensequenz wurde unter Verwendung
von Verbindung 8 und Adenosin-3'-phosphoramidit
als Ausgangsmaterialien mit einem DNS-Synthesegerät (Applied Biosystems Model
380B DNA Synthesizer, hergestellt von Perkin-Elmer) synthetisiert.
A-13S: (5')AAAAA*AAAAAAAA(3')
wobei "*" die Lage des der Verbindung 8 eigenen
zugeschriebenen Diesters anzeigt.
-
Beispiel 7
-
Ein
DNS-Oligomer A-13R mit der nachstehenden Basensequenz wurde unter
Verwendung von Verbindung 10 und Adenosin-3'-phosphoramidit als Ausgangsmaterialien
mit einem DNS-Synthesegerät (Applied Biosystems
Model 380B DNA Synthesizer, hergestellt von Perkin-Elmer) synthetisiert.
A-13R:
(5')AAAAA*AAAAAAAA(3')
wobei "*" die Lage des der Verbindung 10 zugeschriebenen
phosphonischen Diesters anzeigt.
-
Beispiel 8
-
Eine
DNS-Sonde YOA-13S, die in
11 gezeigt
ist, wurde unter Verwendung von DNS-Oligomer A-13S als Ausgangsmaterial
gemäß dem in
der USP 5,814,447 oder in der
EP
714986 offenbarten Verfahren erhalten.
-
Das
HPLC-Diagramm von gereinigtem YOA-13S ist in 12 gezeigt.
-
Beispiel 9
-
Eine
DNS-Sonde YOA-13R, die in
13 gezeigt
ist, wurde unter Verwendung von DNS-Oligomer A-13R als Ausgangsmaterial
gemäß dem in
der USP 5,814,447 oder in der
EP
714986 offenbarten Verfahren erhalten.
-
Das
HPLC-Diagramm von gereinigtem YOA-13R ist in 14 gezeigt.
-
Beispiel 10
-
Wie
in 15 gezeigt, wurde die in Beispiel 3 hergestellte
Verbindung 6S (in der B1 = CBz,
B2 = GiBu) in der
gleichen Weise wie in Beispiel 4 behandelt, um Verbindung 11 S zu
ergeben, die nachfolgend ohne Isolierung zur Synthese eines DNS-Oligomers
verwendet wurde.
-
Beispiel 11
-
Wie
in 15 gezeigt, wurde die in Beispiel 3 hergestellte
Verbindung 6R (in der B1 = CBz,
B2 = GiBu) in der
gleichen Weise wie in Beispiel 4 behandelt, um Verbindung 11R zu
ergeben, die nachfolgend ohne Isolierung zur Synthese eines DNS-Oligomers
verwendet wurde.
-
Beispiel 12
-
Ein
DNS-Oligomer 271 S mit der folgenden Basensequenz (wobei "*" die Lage des der Verbindung 11 S zugeschriebenen
phosphonischen Diesters anzeigt) wurde unter Verwendung der in Beispiel
10 hergestellten Verbindung 11 S und G-, C- und T-Phosphoramiditen
als Ausgangsmaterialien in der gleichen Weise wie in Beispiel 6
synthetisiert.
271S: (5')CTCGC*GGGGGCTG(3')
-
Beispiel 13
-
Ein
DNS-Oligomer 271 R mit der folgenden Basensequenz (wobei "*" die Lage des der Verbindung 11R zugeschriebenen
phosphonischen Diesters anzeigt) wurde unter Verwendung der in Beispiel
11 hergestellten Verbindung 11R und G-, C- und T-Thosphoramiditen
als Ausgangsmaterialien in der gleichen Weise wie in Beispiel 6
synthetisiert.
271R: (5')CTCGC*GGGGGCTG(3')
-
Beispiel 14
-
Eine
DNS-Sonde YO-271 S, die in 16 gezeigt
ist, wurde unter Verwendung von DNS-Oligomer 271 S als Ausgangsmaterial
in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten. Das HPLC-Diagramm
von gereinigtem YO271S ist in 17 gezeigt.
-
Beispiel 15
-
Eine
DNS-Sonde YO-271R, die in 18 gezeigt
ist, wurde unter Verwendung von DNS-Oligomer 271R als Ausgangsmaterial in
der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten. Das HPLC-Diagramm
von gereinigtem YO271S ist in 19 gezeigt.
-
Beispiel 16
-
Eine
Ziel-Nucleinsäure
wurde mit den in Beispielen 8 und 9 hergestellten DNS-Sonden (YO-A13R bzw.
YO-A13S) wie folgt nachgewiesen.
-
Verfahren
-
- ➀ Zu einem Hybridbildungspuffer (1 × SSC, 1
mM EDTA), der eine Sonde enthielt (YO-A13R oder YO-A13S; Endkonzentration
10 nM), wurde Ziel-DNS (Oligo-dT (30-mer), Oligo-dA (30-mer) oder
eine rekombinante HCV-RNS; Endkonzentration jeweils 10 nM) zugegeben
und die entstandene Reaktionslösung wurde
in eine Fluorimeterküvette
pipettiert.
- ➁ Das Fluoreszenzspektrum der Reaktionslösung wurde
mit einem Fluoreszenzspektrometer FP-777 (JASCO Corporation) (Anregungswellenlänge 490
nm/HW 5 nm) gemessen.
-
Ergebnisse
-
Die
so erhaltenen Fluoreszenzspektren sind in 20 gezeigt.
- (A) I YO-A13S (10 nM) und Oligo-dT (30-mer)
(10 nM)
II YO-A13R (10 nM) und Oligo-dT (30-mer) (10 nM)
III
YO-A13R (10 nM) allein
IV YO-A13S (10 nM) alllein
- (B) (––––– ) YO-A13S
(10 nM) und Oligo-dA (30-mer) (10 nM)
(-----) YO-A13R (10 nM)
und Oligo-dA (30-mer) (10 nM)
- (C) (––––– ) YO-A13S
(10 nM) und rekombinante HCV-RNS (10 nM)
(-----) YO-A13R (10
nM) und rekombinante HCV-RNS (10 nM).
-
Sowohl
YO-A13R als auch YO-A13S wiesen in Gegenwart des komplementären Oligo-dT
(30-mer) außergewöhnliche
Fluoreszenzverstärkung
auf (20(A)). Im Gegensatz dazu war
die Fluoreszentintensität in
Gegenwart von nichtkomplementären
Nucleinsäuren,
Oligo-dA (30-mer) und rHCV-RNS, mit jener im Fall der Sonde allein
vergleichbar.
-
Beispiel 17
-
Die
Schmelzpunkte der in Beispielen 8 und 9 hergestellten DNS-Sonden
(YO-A13R bzw. YO-A13S) wurden wie folgt gemessen.
-
Verfahren
-
- ➀ Eine DNS-Sonde (YO-A13R oder YO-A13S)
oder dA (13-mer) (Endkonzentration jeweils 1,5 μM) wurde zu einem Hybridbildungspuffer
(1 × SSC,
1mM EDTA), der eine Ziel-Nucleinsäure, dT (30-mer), enthielt, zugegeben.
- ➁ Die Reaktionslösung
wurde allmählich
von 90°C
auf 25°C
abgekühlt,
wobei die Temperatur aufgezeichnet wurde, während die UV-Absorption bei
260 nm gemessen wurde.
-
Ergebnisse
-
- Schmelzpunkte (engl: Tm-values)
- YO-A13R: 47°C
- YO-A13S: 47°C
- Oligo-dA (13-mer): 37°C
-
Die
Schmelzpunkte der beiden Sonden waren um 10°C höher als der von Oligo-dA (13-mer),
das nicht mit YO modifiziert war, was Stabilisierung von doppelsträngiger DNS,
die von den Sonden bei der Interkalation des YO-Moleküls gebildet
wird, anzeigt. Die in Beispiel 16 beobachtete Fluoreszenzverstärkung kann
vermutlich der Interkalation zugeordnet werden.
-
Beispiel 18
-
Eine
Ziel-Nucleinsäure
wurde mit den in Beispielen 14 und 15 hergestellten DNS-Sonden (YO-271 R bzw. YO-271
S) wie folgt nachgewiesen.
-
Verfahren
-
- ➀ Zu einem Hybridbildungspuffer (1 × SSC, 1
mM EDTA), der eine Sonde enthielt (YO-271R oder YO-271S; Endkonzentration
25 nM), wurde eine Ziel-DNS, Temp271 (Endkonzentration 25 nM), zugegeben
und die entstandene Reaktionslösung
wurde in eine Fluorimeterküvette
pipettiert.
- ➁ Das Fluoreszenzspektrum der Reaktionslösung wurde
mit einem Fluoreszenzspektrometer FP-777 (JASCO Corporation) (Anregungswellenlänge 490
nm/HW 5 nm, Temperatur: 37°C)
gemessen.
-
Ergebnisse
-
Die
so erhaltenen Fluoreszenzspektren sind in 21 gezeigt.
- (A) Temp271: YO-271 S (25 nM) und Temp271 (25
nM) keines: YO-271 S allein
- (B) Temp271: YO-271R (25 nM) und Temp271 (25 nM) keines: YO-271R
allein
-
YO-271
S zeigte in Gegenwart von komplementärem Temp271 außergewöhnliche
Fluoreszenzverstärkung,
während
die Fluoreszenzintensität
von YO-271 R in Gegenwart von komplementärem Temp271 mit jener im Fall
der Sonde allein vergleichbar war.
-
Beispiel 19
-
Die
Schmelzpunkte der in Beispielen 14 und 15 hergestellten DNS-Sonden
(YO-271R bzw. YO-271 S) wurden wie folgt gemessen.
-
Verfahren
-
- DNA271: (5')CTCGCGGGGGCTG(3')
Temp271: (5')GTGCCCCCGCGAG(3')
-
- ➀ Eine DNS-Sonde (YO-271R oder YO-271S)
oder ein synthetisches Oligomer DNA271 (Endkonzentration jeweils
1,0 μM)
wurde zu einem Hybridbildungspuffer (1 × SSC, 1mM EDTA), der eine
Ziel-Nucleinsäure, Temp271,
enthielt, zugegeben.
- ➁ Die Reaktionslösung
wurde allmählich
von 90°C
auf 25°C
abgekühlt,
wobei die Temperatur aufgezeichnet wurde, während die UV-Absorption bei
260 nm gemessen wurde.
-
Ergebnisse
-
- Schmelzpunkte
- YO-271R: 62°C
- YO-271 S: 66°C
- DNA271: 59°C
-
Der
Schmelzpunkt der Sonde YO-271S, die in Beispiel 18 Fluoreszenzverstärkung zeigte,
war höher als
der von DNA271, die nicht mit YO modifiziert war. Andererseits war
der Schmelzpunkt von YO-271R, das keine Fluoreszenzverstärkung zeigte,
nicht sehr von dem von DNA271 verschieden. Diese Ergebnisse zeigen Stabilisierung
von doppelsträngiger
DNS, die von der Sonde YO-271S bei der Interkalation des YO-Moleküls gebildet
wird. Die nur für YO-271
S beobachtete außergewöhnliche
Fluoreszenzverstärkung
kann vermutlich der Interkalation zugeordnet werden.
-
Beispiel 20
-
Zu
Verbindung 12 von 24 (15 mg, 12,8 μmol) in 2,3
ml THF wurde 2M Triethylamin-Acetat-Puffer (6,4 μl, pH 7,0)
tropfenweise zugegeben, und dann wurde 0,1 M Bu4NF
in THF (0,255 ml) tropfenweise zugegeben. Nach 2 Stunden wurde die
Reaktionslösung
mit gesättigtem
wässrigem
Natriumchlorid verdünnt
und mit 10 ml Chloroform dreimal extrahiert. Die organischen Schichten
wurden zusammengenommen und über Magnesiumsulfat
getrocknet, und das Lösungsmittel
wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Reinigung des Rückstands
durch Silicagel-Säulenchromatographie
ergab 7 mg der Verbindung 14 von 24 in
einer Ausbeute von 52%. Zum Vergleich wurde zu Verbindung 12 von 24 (9
mg, 7,7 μmol)
in 1,0 ml THF, 0,1 M Bu4NF in THF (23 μl) tropfenweise
zugegeben. Nach 6 Stunden wurde die Reaktionslösung mit gesättigtem wässrigem
Natriumchlorid verdünnt
und mit 10 ml Chloroform dreimal extrahiert. Die organischen Schichten wurden
zusammengenommen und über
Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen
im Vakuum entfernt. Reinigung des Rückstands durch Silicagel-Säulenchromatographie
ergab 3 mg der Verbindung 14 von 24 in
einer Ausbeute von 37%. Für
einen weiteren Vergleich wurde zu Verbindung 12 von 24 (3
mg, 2,6 μmol)
in 0,05 ml THF, 0,1 M Bu4NF in THF (50 μl) tropfenweise
zugegeben. Nach 3,5 Stunden wurde die Reaktionslösung mit gesättigtem
wässrigem
Natriumchlorid verdünnt
und mit 10 ml Chloroform dreimal extrahiert. Die organischen Schichten
wurden zusammengenommen und über
Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen
im Vakuum entfernt. Reinigung des Rückstands durch Silicagel-Säulenchromatographie
ergab 1 mg der Verbindung 14 von 24 in
einer Ausbeute von 37%.
-
Beispiel 21
-
Zu
Verbindung 13 von 24 (73 mg, 55,6 μmol) in 4,5
ml THF wurde 2M Triethylamin-Acetat-Puffer (27,8 μl, pH 7,0)
tropfenweise zugegeben, und dann wurde 0,1 M Bu4NF
in THF (1,11 ml) tropfenweise zugegeben. Nach 1 Stunde wurde die
Reaktionslösung
mit gesättigtem wässrigem
Natriumchlorid verdünnt
und mit 10 ml Chloroform dreimal extrahiert. Die organischen Schichten
wurden zusammengenommen und über
Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen
im Vakuum entfernt. Reinigung des Rückstands durch Silicagel-Säulenchromatographie
ergab 32 mg der Verbindung 15 von 24 in
einer Ausbeute von 48%.
-
Beispiel 22
-
Zu
Verbindung 13 von 24 (68 mg, 51,8 μmol) in 4,1
ml THF wurde THF (1,08 ml), das 0,1 M Bu4NF und
0,05 M Triethylamin-Acetat-Puffer enthielt, tropfenweise zugegeben.
Nach 2 Stunden Rühren
wurde die Reaktionslösung
mit gesättigtem
wässrigem
Natriumchlorid verdünnt
und mit 10 ml Chloroform dreimal extrahiert. Die organischen Schichten
wurden zusammengenommen und über
Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen
im Vakuum entfernt. Reinigung des Rückstands durch Silicagel-Säulenchromatographie ergab 36
mg der Verbindung 15 von 24 in
einer Ausbeute von 58%.
-
Die
Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Beispiele 20 bis 22 werden
in Tabelle 4 gezeigt. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, verbessert
die Zugabe von Essigsäure
und Triethylamin zum Zeitpunkt der TBDMS-Entfernungsreaktion mit
Tetrabutylammoniumfluorid die Ausbeute um beinahe 20%, vermutlich
weil Essigsäure
und Triethylamin die Acidität
und Basizität
des Reagens Tetrabutylammoniumfluorid moderierte und dadurch die
Entstehung von Zersetzungsprodukten unterdrückte.
-
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist es möglich,
eine Nucleinsäure-Sonde
mit einem in der Mitte der Nucleinsäuresequenz über einen Aminoalkylphosphonat-Linker
als Markierung befestigten Interkalator zu erhalten. Insbesondere
wird erstmals berichtet, dass es möglich ist, eine Nucleinsäure-Sonde
mit einem in der Konfiguration verschiedenen Phosphoratom durch
Verwendung der Unterschiede der Rf-Werte zu erhalten.