DE60303865T2 - Mannitol- und Glucitolderivate - Google Patents
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Description
- )Gebiet der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die Mannitol- oder Glucitolderivate enthalten, die für die Synthese von oligomeren Verbindungen verwendet werden können. Die Erfindung betrifft weiterhin Verwendungen dieser oligomeren Verbindungen für Hybridisierungszwecke sowie als Sonden. Weiterhin werden Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, in denen die oligomeren Verbindungen verwendet werden, beschrieben.
- Allgemeiner Stand der Technik
- Auf dem Gebiet der molekularen Diagnose spielt der Nachweis von Ziel-Nukleinsäuren mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) eine große Rolle. Die routinemäßige Durchmusterung von Blutbanken auf das Vorhandensein des Human Immunodeficiency Virus (HIV), des Hepatitis-B-Virus (HBV) oder des Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein Beispiel für die Anwendung der auf PCR beruhenden Diagnose im großen Maßstab. Bei automatischen Systemen für die Analyse auf PCR-Basis verwendet man häufig einen Echtzeit-Nachweis der Produktamplifikation während des PCR-Vorgangs. Der Schlüssel für solche Verfahren ist die Verwendung von modifizierten Oligonukleotiden, die Reportergruppen oder Marker tragen.
- In ihrer einfachsten Form ist die PCR ein In-vitro-Verfahren für die enzymatische Synthese von spezifischen Nukleinsäuresequenzen, wobei zwei Oligonukleotid-Primer verwendet werden, die mit Strang und Gegenstrang hybridisieren und die Zielsequenz, also die interessierende Region in der Zielnukleinsäure, flankieren. Wiederholt durchgeführte Reaktionsschritte, darunter Denaturierung der Matrize, Hybridisierung der Primer und Extension der hybridisierten Primer durch die DNA-Polymerase (DNA: Desoxyribonukleinsäure), führen zu einer exponentiellen Anreicherung eines spezifischen Fragments, dessen Enden durch die 5'-Enden der Primer definiert sind.
- Der Nachweis von DNA-Amplifikationsprodukten, die durch ein PCR-Verfahren erzeugt wurden, kann einerseits in getrennten Arbeitsschritten erfolgen. Diese können die Charakterisierung der amplifizierten Fragmente in bezug auf ihre Migrationsfähigkeit in der Elektrophorese und/oder die Analyse der an einen festen Träger gebundenen denaturierten Amplifikationsprodukte mit Hilfe einer Hybridisierungssonde beinhalten.
- Andererseits kann der Nachweis der DNA-Amplifikationsprodukte in einem sogenannten "homogenen" Assay-System erfolgen. Ein "homogenes" Assay-System umfaßt Reportermoleküle oder Marker, die ein Signal erzeugen, während die Zielsequenz amplifiziert wird. Ein Beispiel für ein "homogenes" Assay-System ist das in
US 5,210,015 ,US 5,804,375 undUS 5,487,972 beschriebene TagMan®-System. Kurz gesagt beruht das Verfahren auf einer doppelt markierten Sonde und der 5'-3'-Exonukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase. Die Sonde ist zu der mit dem PCR-Verfahren zu amplifizierenden Zielsequenz komplementär und liegt während jedes Polymerisationszyklusschritts zwischen den beiden PCR-Primern. Die Sonde trägt zwei Fluoreszenzmarker. Bei einem handelt es sich um einen Reporterfarbstoff wie 6-Carboxyfluorescein (FAM), dessen Emissionsspektren durch einen Energietransfer aufgrund der räumlichen Nähe eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs, nämlich 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), gequencht wird. Während jedes Amplifikationszyklus wird die hybridisierte Sonde durch die Taq-DNA-Polymerase während des Elongationsvorgangs eines DNA-Strangs, an den die Primer hybridisiert haben, verdrängt und abgebaut, wobei letzteres auf die intrinsische 5'-3'-Exonukleaseaktivität der Polymerase zurückzuführen ist. Außerdem befreit dieser Mechanismus den Reporterfarbstoff von der Quencher-Aktivität des TAMRA. Daher steigt die Fluoreszenzaktivität mit einer vermehrten Spaltung der Sonde, was zu der Menge des gebildeten PCR-Produkts proportional ist. Dementsprechend wird die amplifizierte Zielsequenz dadurch gemessen, daß man die Intensität des freigesetzten Fluoreszenzmarkers nachweist. - Ein ähnliches Prinzip des Energietransfers zwischen Fluoreszenzfarbstoffmolekülen trifft auch auf die "homogenen" Assays, bei denen sogenannte "molecular beacons" verwendet werden (
US 6,103,476 ), zu. Bei diesen handelt es sich um haarnadelförmige Nukleinsäuremoleküle mit einem intern gequenchten Fluorophor, dessen Fluoreszenz wiederhergestellt wird, wenn die Moleküle an eine Zielnukleinsäure binden (US 6,103,476 ). Sie sind dergestalt, daß es sich bei dem Schleifenteil des Moleküls um eine Sondensequenz handelt, die zu einer Region innerhalb der Zielsequenz des PCR-Verfahrens komplementär ist. Der Stamm wird dadurch gebildet, daß man komplementäre Armsequenzen an die Enden der Sondensequenz anhybridisiert. An das Ende des einen Arms wird ein fluoreszierender Molekülteil und an das Ende des anderen Arms ein Quencher-Molekülteil gebunden. Der Stamm hält diese beiden Molekülteile in enger Nähe zueinander, was dazu führt, daß die Fluoreszenz des Fluorophors durch Energietransfer gequencht wird. Da es sich bei dem Quencher-Molekülteil um einen nichtfluoreszierenden Chromophor handelt, der die Energie, die er von dem Fluorophor erhält, als Hitze emittiert, kann die Sonde nicht fluoreszieren. Trifft die Sonde auf ein Zielmolekül, so bildet sie einen Hybrid, der länger und stabiler als der Stammhybrid ist, und dessen Festigkeit und Länge das gleichzeitige Vorliegen des Stammhybrids ausschließen. Es findet also bei dem "molecular beacon" eine spontane Konformationsänderung statt, die den Stamm auseinanderzwängt und dazu führt, daß sich der Fluorophor und der Quencher voneinander weg bewegen, was zur Wiederherstellung der Fluoreszenz, die nun nachgewiesen werden kann, führt. - Mehr Beispiele für "homogene" Assay-Systeme werden durch die Formate, die bei dem LightCycler®-Gerät (siehe z. B.
US 6,174,670 ) verwendet werden, bereitgestellt, wobei einige dieser Systeme manchmal als "kissing probe"-Formate bezeichnet werden. Auch hier beruht das Prinzip auf zwei Farbstoffen, die eine Wechselwirkung eingehen, die jedoch dadurch gekennzeichnet sind, daß die Emissionswellenlänge eines Donatorfarbstoffs einen Akzeptorfarbstoff durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer erregt. Bei einem beispielhaft angeführten Verfahren werden als Hybridisierungssonden zwei modifizierte Oligonukleotide verwendet, die an benachbarte interne Sequenzen der Zielsequenz des PCR-Verfahrens hybridisieren. Das am 5'-Ende befindliche modifizierte Oligonukleotid weist als Markierung an seinem 3'-Ende einen Donatorfarbstoff auf. Das am 3'-Ende befindliche modifizierte Oligonukleotid weist als Markierung an seinem 5'-Ende einen Akzeptorfarbstoff auf. Nach Kopf-Schwanz-Hybridisierung der beiden modifizierten Oligonukleotide an die Zielsequenz im Verlauf eines Amplifikationszyklus werden Donator- und Akzeptorfarbstoff eng aneinander gebracht. Bei einer spezifischen Erregung des Donatorfarbstoffs mit Hilfe eines monochromatischen Lichtpulses wird die Fluoreszenz des Akzeptorfarbstoffs nachgewiesen, wodurch man ein Maß für die Menge des gebildeten PCR-Produkts erhält. - Die in "homogenen" Assay-Systemen verwendete(n) oligomere Verbindung oder modifizierten Oligonukleotide umfassen Nukleotide oder modifizierte Nukleotide, also die monomeren Einheiten, an die Marker wie Farbstoffe als Reportermoleküle angehängt werden. Diese monomeren Einheiten weisen folgende Merkmale auf:
- (1) sie können an das Zucker-Phosphat-Polymergrundgerüst einer Nukleinsäure angehängt und/oder darin integriert werden,
- (2) sie verhindern nicht die Paarung des modifizierten Oligonukleotids mit seiner komplementären Zielsequenz,
- (3) sie stellen funktionelle Gruppen für die Bindung von einem oder mehreren Markern bereit.
- Außerdem ist bei dem TagMan®-Format erforderlich, daß die oligomere Verbindung durch die 5'-3'-Exonukleaseaktivität einer matrizenabhängigen DNA-Polymerase werden kann.
- Auf diesem Fachgebiet sind mehrere Verbindungen und ihre Verwendung für den Einbau als monomere Einheiten in Nukleinsäuren bekannt. Diese Verbindungen stellen funktionelle Gruppen und/oder Bindeglieder für die kovalente Bindung von Reportergruppen oder Markern bereit. Im Verlauf der chemischen Synthese der oligomeren Verbindung wird die Grundstruktur der "Nichtnukleotidverbindung" bzw. des "modifizierten Nukleotids" mit dem "Oligonukleotid"-Grundgerüst verbunden, und zwar zum Beispiel mit Hilfe einer Chemie auf Phosphoramiditbasis, was zu einem Phosphodiester führt. So stellt eine bestimmte eingebaute Verbindung also ein modifiziertes Nukleotid innerhalb des neu geschaffenen "modifizierten Oligonukleotids" dar. Ein Marker wird durch eine funktionelle Gruppe eines Bindeglieds gebunden, zum Beispiel, jedoch nicht ausschließlich, eine Aminofunktion, die auf der eigentlichen Gerüststruktur oder auch auf dem "Bindeglied", das das Gerüst mit der funktionellen Gruppe verbindet, vorliegt. Ein Marker kann vor der Synthese eines "modifizierten Oligonukleotids" oder danach bei der Entfernung einer optionalen Schutzgruppe von der funktionellen Gruppe, an die der Marker zu koppeln ist, kovalent an die Verbindung gebunden werden.
- In der
EP 0 135 587 werden Modifikationen von traditionellen Nukleosiden beschrieben, die eine Reportergruppe tragen, welche an eine Substituentengruppe der Nukleotidbase angehängt ist. In derEP 0 313 219 werden Nichtnukleosidreagentien beschrieben, die durch eine geradkettige Kohlenwasserstoff-Gerüststruktur mit einem Bindeglied oder einer Seitengruppe, an die ein Marker gebunden werden kann, gekennzeichnet sind. In derEP 0 313 219 wird nichts über sonstige Arten von Gerüststrukturen und ihre jeweiligen Eigenschaften berichtet. In derUS 5,451,463 werden trifunktionelle Nichtnukleotidreagentien beschrieben, insbesondere Gerüststrukturen auf 1,3-Diol-Basis mit einer primären Aminogruppe. Solche Reagentien können zum Beispiel für die endständige Markierung der 3'-terminalen Enden von Oligonukleotiden verwendet werden. In der WO 97/43451 werden Nichtnukleotidreagentien auf der Basis einer carbocyclischen (C5 bis C7) Gerüststruktur beschrieben, wobei ein substituiertes oder unsubstituiertes Cyclohexan bevorzugt wird. Gemäß dieser Schrift stellt solch eine Struktur Festigkeit bereit, die erforderlich ist, um einen funktionellen Rest, z. B. eine funktionelle Gruppe, an die eine Reportergruppe gekoppelt werden kann, von dem oligomeren Grundgerüst des modifizierten Oligonukleotids weg zu verlängern. Dies ist deshalb erwünscht, weil die Kopplungseffizienz des Reagens nach dem Einbau in ein modifiziertes Oligonukleotid verstärkt wird. Sheng-Hui, S., et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 7 (1997) 1639-1644 beschreiben Nichtnukleotidverbindungen auf der Basis einer Cyclohexan-Gerüststruktur, insbesondere der Verbindung Cyclohexyl-4-amino-l,l-dimethanol. Die Integration in das Oligonukleotid-Grundgerüst wird durch funktionelle Gruppen ermöglicht, die die Methylreste in C1-Stellung substituieren. An die Aminogruppe wird ein Bindeglied, das einen Marker trägt, angehängt. - Außerdem existieren Beschreibungen, die sich mit modifizierten Nukleosiden auf Glucitol- oder Mannitol-Basis befassen. Der Fachwelt sind aus mehreren Schriften Verbindungen bekannt, die sich von 1,5-Anhydro-2,3-didesoxyhexitol ableiten; diese Schriften konzentrieren sich jedoch auf die Hexitolverbindungen als solche oder auf modifizierte Nukleoside auf Hexitolbasis. Solche modifizierten Nukleoside können als Arzneistoffe oder für chemische Synthesezwecke verwendet werden, insbesondere für die Synthese von modifizierten Oligonukleotiden. Pravdic, N., et al., Croatica Chemica Acta 45 (1973) 343-356 beschreiben die Synthese von 1,5-Anhydro-2-acetamido-2,3-didesoxy-Dhexitol, also des -mannitol oder -glucitolderivats (Verbindung XVIII). In der Schrift wird nichts über spezifische Verwendungszwecke für solche Verbindungen außer für die chemische Synthese berichtet. Die
JP 60016982 - Verbindungen, die für den Einbau von Markern in Nukleinsäuren verwendet werden sollen, müssen sorgfältig ausgewählt werden, da sie gegebenenfalls:
- (a) die Basenpaarung stören,
- (b) keine Gerüststruktur mit ausreichender Festigkeit bereitstellen,
- (c) in erster Linie hydrophobe Strukturen bereitstellen, die zu schlechter Wasserlöslichkeit führen,
- (d) chemischen Modifikationen nur beschränkt zugänglich sind,
- (e) Enantiomerenmischungen umfassen.
- Es war daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen für den Einbau von Markern in Nukleinsäuren bereitzustellen.
- Kurze Darstellung der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die Mannitol- oder Glucitolreste umfassen, insbesondere bestimmte Verbindungen, die Mannitol- oder Glucitolreste, die für den Aufbau von oligomeren Verbindungen verwendet werden können, umfassen. Die Erfindung betrifft weiterhin Verwendungen dieser oligomeren Verbindungen für die Hybridisierung und als Sonden. Außerdem werden Verfahren für den Nachweis einer Nukleinsäure in einer Probe beschrieben, bei denen die oligomeren Verbindungen verwendet werden. Weiterhin wird ein Verfahren für die getrennte und direkte Synthese der -mannitol und -glucitolstereoisomere bereitgestellt, wodurch Mischungen dieser beiden Verbindungen nicht mehr getrennt werden müssen.
- Als besonders vorteilhafte Eigenschaft stellt die 1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxyhexitol-Struktur eine hydrophile Gerüststruktur bereit. Außerdem ist die Hexitolstruktur einer weiteren schlagkräftigen chemischen Synthese zugänglich. So kann zum Beispiel auf schlagkräftige Weise eine DMT-Schutzgruppe selektiv mit dem Hydroxy-Sauerstoff am Kohlenstoffatom 6 des Hexitols gekoppelt werden, weil Mannitol- oder Glucitolstrukturen nur eine einzige primäre Alkoholfunktion aufweisen. Die chemische Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen stellt insbesondere in bezug auf die 2-Aminogruppe einen besonderen Vorteil dar, da sich die Syntheseschritte für die selektive Herstellung von einem der beiden möglichen Stereoisomere eignen. So lassen sich aufwendige Trennungsschritte vermeiden und gleichzeitig definierte Verbindungen herstellen, was für die Herstellung von Verbindungen für die Diagnostik, wo ja ein hohes Qualitätsniveau erforderlich ist, also definierte Produkte und nicht Enantiomere, einen Vorteil darstellt, von den Produktionskosten ganz abgesehen. Wird ein Fluoreszenzmarker an die 2-Aminogruppe gekoppelt, so stellen Verbindungen auf Mannitol- oder Glucitolbasis, wenn diese in eine Nukleinsäure oder eine modifizierte Nukleinsäure eingebaut werden, die strukturelle Grundlage für eine Orientierung des Markers in 5'- oder in 3'-Richtung dar.
- Traditionelle Techniken der Molekularbiologie und Nukleinsäurechemie, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, werden in der Literatur beschrieben; siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Oligonucleotide Synthesis, Gait, M.J., Hrsg., 1984; Nucleic Acid Hybridization, Hames, B.D., and Higgins, S.J., Hrsg., 1984 und eine Heftreihe, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., die alle durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen sind. Alle Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, die hier oben und unten erwähnt sind, sind durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen. - In der Fachwelt ist bekannt, daß ein "Nukleosid" eine Base-Zucker-Kombination ist. Der Basenteil des Nukleosids ist normalerweise eine heterocyclische Base. Die zwei häufigsten Klassen von solchen heterocyclischen Basen sind die Purine und die Pyrimidine.
- "Nukleotide" sind "Nukleoside", die weiterhin eine Phosphatgruppe, die kovalent an den Zuckerteil des Nukleosids gebunden ist, beinhalten. Bei denjenigen "Nukleosiden", die einen Pentafuranosylzucker enthalten, kann die Phosphatgruppe an den 2'-, 3'- oder 5'-Hydroxyrest des Zuckers gebunden sein. Ein "Nukleotid" ist die "monomere Einheit" eines "Oligonukleotids", im vorliegenden Text allgemeiner als "oligomere Verbindung" bezeichnet, bzw. eines "Polynukleotids", allgemeiner als "polymere Verbindung" bezeichnet. Ein weiterer allgemeiner Ausdruck hierfür ist Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA).
- "Modifizierte Nukleotide" (bzw. "Nukleotidanaloga") unterscheiden sich von einem natürlichen "Nukleotid" dadurch, daß sie in gewissem Ausmaß modifiziert sind, bestehen jedoch trotzdem noch aus einer Base, einem Pentafuranosylzucker, einem Phosphatteil, basenartigen, pentofuranosylzuckerartigen und phosphatartigen Teil und deren Kombinationen. So kann zum Beispiel an den Basenteil eines "Nukleotids" ein "Marker" angehängt werden, wodurch man ein "modifiziertes Nukleotid" erhält. Es kann auch eine natürliche Base in einem "Nukleotid" durch z. B. ein 7-Desazapurin ersetzt werden, wodurch man ebenfalls ein "modifiziertes Nukleotid" erhält. Die Begriffe "modifiziertes Nukleotid" bzw. "Nukleotidanalog" werden in der vorliegenden Anmeldung bedeutungsgleich verwendet. Ein "modifiziertes Nukleosid" (bzw. "Nukleosidanaloga") unterscheidet sich von einem natürlichen Nukleotid dadurch, daß es in gewissem Ausmaß modifiziert ist, wie dies oben für ein "modifiziertes Nukleotid" (bzw. ein Nukleotidanalog) umrissen ist.
- Eine "Nichtnukleotidverbindung" unterscheidet sich von einem natürlichen "Nukleotid", kann jedoch im Sinn der vorliegenden Erfindung – ähnlich wie ein "Nukleotid" – noch eine "monomere Einheit" einer "oligomeren Verbindung" sein. Eine "Nichtnukleotidverbindung" muß daher fähig sein, mit "Nukleotiden" eine "oligomere Verbindung" zu bilden. Auch "Nichtnukleotidverbindungen" können einen basenartigen, pentofuranosylzuckerartigen oder einen phosphatartigen Teil enthalten; bei einer "Nichtnukleotidverbindung" sind jedoch nicht alle diese Teile gleichzeitig vorhanden.
- Erfindungsgemäß ist eine "oligomere Verbindung" eine Verbindung, die aus "monomeren Einheiten" besteht, wobei diese nur "Nukleotide" oder "nichtnatürliche Verbindungen", genauer gesagt "modifizierte Nukleotide" (bzw. "Nukleotidanaloga") oder "Nichnukleotidverbindungen", allein oder in Kombinationen davon, sein können. "Oligonukleotide" und "modifizierte Oligonukleotide" (bzw. "Oligonukleotidanaloga") sind im Zusammenhang mit der Erfindung Untergruppen von "oligomeren Verbindungen".
- Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "Oligonukleotid" auf "Polynukleotide", die aus mehreren "Nukleotiden" als "monomerer Einheit" gebildet werden, es gehört also ein "Oligonukleotid" zu einer bestimmten Untergruppe einer "oligomeren Verbindung" oder einer "polymeren Verbindung" von Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) mit "monomeren Einheiten". Gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Ausdruck "Oligonukleotid" nur "Oligonukleotide", die aus natürlich vorkommenden "Nukleotiden" bestehen. Die Phosphatgrup pen werden üblicherweise als Internukleosid-Grundgerüst des "Oligonukleotids" bezeichnet. Die normale Bindung oder Grundgerüst von RNA und DNA ist eine 3'- bis 5'-Phosphodiesterbindung.
- Ein "modifiziertes Oligonukleotid" (bzw. "Oligonukleotidanalog") gehört zu einer weiteren spezifischen Untergruppe der "oligomeren Verbindungen", die ein oder mehrere "Nukleotide", eine oder mehrere "Nichtnukleotidverbindungen" oder "modifizierte Nukleotide" als "monomere Einheiten" aufweist. Der Begriff "modifiziertes Oligonukleotid" (bzw. "Oligonukleotidanalog") bezieht sich also auf Strukturen, die auf im wesentlichen ähnliche Art und Weise wie "Oligonukleotide" agieren und die bedeutungsgleich in der gesamten Anmeldung verwendet werden. Vom Synthesestandpunkt aus kann ein "modifiziertes Oligonukleotid" (bzw. ein "Oligonukleotidanalog") zum Beispiel durch eine chemische Modifikation von "Oligonukleotiden" durch entsprechende Modifikation des Phosphatgrundgerüsts, der Riboseeinheit oder der Nukleotidbasen erzeugt werden (Uhlmann und Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; Verma, S., und Eckstein, F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134). Zu repräsentativen Modifikationen zählen Phosphorothioat-, Phosphorodithioat-, Methylphosphonat-, Phosphotriester- oder Phosphoramidat-Internukleosidbindungen statt Phosphodiester-Internukleosidbindungen; Deaza- oder Azapurine und -pyrimidine statt natürlichen Purin- und Pyrimidinbasen, Pyrimidinbasen mit Substituentengruppen in 5- oder 6-Stellung; Purinbasen mit geänderten Substituentengruppen in 2-, 6- oder 8-Stellung oder in 7-Stellung als 7-Deazapurine; Zucker mit Substituentengruppen in z. B. 2'-Stellung; oder carbocyclische oder acyclische Zuckeranaloga. Weitere Modifikationen, die dem Gedanken der Erfindung entsprechen, sind dem Fachmann bekannt. Diese "modifizierten Oligonukleotide" (bzw. "Oligonukleotidanaloge") werden am besten dahingehend beschrieben, daß sie mit natürlichen "Oligonukleotiden" (bzw. synthetischen "Oligonukleotiden" im natürlichen Sinn) funktionell austauschbar sind, sich jedoch strukturell von diesen unterscheiden. Beispielhafte Modifikationen sind genauer bei Verma, S., und Eckstein, F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134 oder WO 02/12263 beschrieben. Außerdem können Modifikationen erzeugt werden, bei denen Nukleosideinheiten über Gruppen, die die Internukleosid-Phosphat- oder -Zuckerphosphatbindungen ersetzen, verbunden sind. Zu diesen Bindungen zählen auch diejenigen, die bei Verma, S., und Eckstein, F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134 beschrieben sind. Werden für die Verbindung der Nukleosideinheiten Bindungen verwendet, bei denen es sich nicht um Phosphatbindungen handelt, so wurden die erhaltenen Strukturen ebenfalls als "Oligonukleoside" beschrieben.
- "Oligomere Verbindungen" wie "Oligonukleotide" und "modifizierte Oligonukleotide" gemäß der vorliegenden Erfindung können wie im Prinzip im Stand der Technik und dem Fachmann bekannt synthetisiert werden. Verfahren zur Herstellung von oligomeren Verbindungen von bestimmten Sequenzen sind fachbekannt, darunter z. B. Klonieren und Restriktion von entsprechenden Sequenzen sowie die direkte chemische Synthese. Zu den chemischen Syntheseverfahren können zum Beispiel die von Narang, S.A., et al., Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98 beschriebene Phosphotriestermethode, die von Brown, E.L., et al., Methods in Enzymology 68 (1979)109-151 beschriebene Phosphodiestermethode, die in Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859, beschriebene Phosphoramiditmethode, die in Garegg, et al., Chem. Scr. 25 (1985) 280-282 beschriebene H-Phosphonatmethode sowie die in
US 4,458,066 beschriebene Festträgermethode zählen. - Wie bereits erwähnt, ist, wie dem Fachmann bekannt, eine "Nukleinsäure" eine polymere Verbindung von "Nukleotiden". Der Begriff wird im vorliegenden Text für eine "Nukleinsäure" in einer zu analysierenden Probe verwendet, es soll also das Vorhandensein, Fehlen bzw. die Menge der Nukleinsäure in der Probe bestimmt werden. Anders ausgedrückt ist die "Nukleinsäure" das Ziel und kann daher auch als "Zielnukleinsäure" bezeichnet werden. Soll zum Beispiel bestimmt werden, ob Blut das Human Immunodeficiency Virus enthält, so ist die "Zielnukleinsäure" die Nukleinsäure des Human Immunodeficiency Virus.
- Der Begriff "Primer" wird im vorliegenden Zusammenhang wie dem Fachmann bekannt verwendet und bezieht sich auf "oligomere Verbindungen", in erster Linie auf "Oligonukleotide", jedoch auch auf "modifizierte Oligonukleotide", die fähig sind, die DNA-Synthese mit einer matrizenabhängigen DNA-Polymerase zu starten [engl. to "prime"], das heißt also, daß das 3'-Ende des z. B. Oligonukleotids eine freie 3'-OH-Gruppe bereitstellt, an die weitere "Nukleotide" mit Hilfe einer matrizenabhängigen DNA-Polymerase angehängt werden können, wodurch eine 3' → 5'-Phosphodiesterbindung entsteht, wobei Desoxynukleosidtriphosphate verwendet werden und wobei Pyrophosphat freigesetzt wird.
- Der Begriff "Sonde" bezieht sich auf synthetisch oder biologisch erzeugte Nukleinsäuren (DNA oder RNA), die durch absichtliche Erzeugung oder Selektion spezifische Nukleotidsequenzen enthalten, die es ihnen ermöglichen, unter definierten vorbestimmten stringenten Bedingungen spezifisch (also vorzugsweise) mit "Zielnukleinsäuren" zu hybridisieren. Eine "Sonde" kann als "Fangsonde" identifiziert werden, was bedeutet, daß sie die Zielnukleinsäure "einfängt", sodaß diese von unerwünschten Substanzen, die ihren Nachweis unklar machen können, getrennt werden kann. Nach Durchführung der Trennung kann ein Nachweis der eingefangenen "Zielnukleinsäure" mit einer geeigneten Vorgehensweise erfolgen. "Fangsonden" sind häufig bereits an eine Festphase gebunden.
- "Allkyl"-Gruppen stammen vorzugsweise aus der Reihe der Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die in linearer, verzweigter oder zyklischer Form angeordnet sind. Die tatsächliche Länge der Alkylgruppe hängt von der sterischen Situation an der jeweiligen Stellung, an der sich die Alkylgruppe befindet, ab. Liegen sterische Zwänge vor, so wird die Alkylgruppe im allgemeinen kleiner sein, wobei die Methyl- und Ethylgruppe am stärksten bevorzugt sind. Alle Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen können entweder unsubstituiert oder substituiert sein. Eine Substitution durch Heteroatome wie oben umrissen wird zu einer erhöhten Löslichkeit in wäßrigen Lösungen beitragen.
- "Alkenyl"-Gruppen stammen vorzugsweise aus der Reihe der Alkenylgruppen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen. Für die Auswahl treffen ähnliche Überlegungen zu wie für die Alkylgruppen. Auch diese Gruppen können geradkettig, verzweigt und cyclisch sein. Die am stärksten bevorzugte Alkenylgruppe ist die Ethylengruppe. Es kann mehr als eine Doppelbindung in der Alkenylgruppe vorhanden sein.
- "Alkenyl"-Gruppen weisen vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatome auf. Wiederum können diese Kohlenstoffatome geradkettig, verzweigt und cyclisch angeordnet sein. Es kann mehr als eine Dreifachbindung in der Alkenylgruppe vorhanden sein.
- Eine "Schutzgruppe" ist eine chemische Gruppe, die an einen funktionellen Rest angehängt wird (zum Beispiel an den Sauerstoff in einer Hydroxygruppe, den Stickstoff in einer Aminogruppe oder den Schwefel in einer Thiolgruppe, wodurch der Wasserstoff ersetzt wird), um die funktionelle Gruppe vor einer unerwünschten Reaktion zu schützen. Eine Schutzgruppe ist weiterhin dadurch definiert, daß sie entfernt werden kann, ohne die biologische Wirksamkeit des gebildeten Moleküls zu zerstören, im vorliegenden Fall die Bindung der Nukleinsäurebindungsverbindung an eine Nukleinsäure. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Schutzgruppen gemäß der vorliegenden Erfindung sind Fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC-), Dimethoxytrityl-(DMT-), Monomethoxytrityl-, Trifluoracetyl-, Levulinyl- oder Silylgruppen. Bevorzugte Schutzgruppen für, z.B. Hydroxygruppen am 5'-Ende eines Nukleotids oder eines Oligonukleotids, stammen aus der Reihe der Tritylgruppen, zum Beispiel Dimethoxytrityl (DMT). Bevorzugte Schutzgruppen an exocyclischen Aminogruppen in Formel I sind Acylgruppen, wobei die Benzoylgruppe (Bz), Phenoxyacetyl oder Acetyl oder Formyl und am stärksten bevorzugt sind, und die Amidinschutzgruppen, wie z.B. die N,N-Dialkylformamidingruppe, vorzugsweise die Dimethyl-, Diisobutyl- und die Di-n-butylformamidingruppe. Bevorzugte O-Schutzgruppen sind die Aroylgruppen, die Diphenylcarbamoylgruppen, die Acylgruppen und die Silylgruppen. Unter diesen ist die Benzoylgruppe am stärksten bevorzugt. Bevorzugte Silylgruppen sind die Trialkylsilylgruppen, wie Trimethylsilyl, Triethylsilyl und tert.-Butyldimethylsilyl. Eine weitere bevorzugte Silylgruppe ist die Trimethylsilyloxymethylgruppe (TOM)(WO99/09044). Weiterhin bevorzugte Schutzgruppen sind ortho-Nitrobenzyl, 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl (NPEOC), lichtaktivierbare Verbindungen wie 2-Nitrophenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) (Giegrich et al., Nucleosides & Nucleosides 17 (1998) 1987) sowie Allyloxycarbonyl.
- "Marker", die häufig auch als "Reportergruppen" bezeichnet werden, sind allgemein Gruppen, die eine Nukleinsäure, insbesondere die erfindungsgemäße "oligomere Verbindung" oder das erfindungsgemäße "modifizierte Oligonukleotid", sowie beliebige Nukleinsäuren, die an sie gebunden sind, vom Rest der Flüssigkeit, also der Probe, unterscheidbar machen (Nukleinsäuren, die einen "Marker" tragen, können auch als markierte Nukleinsäurebindungsverbindungen, markierte Sonden oder einfach Sonden werden bezeichnet). Erfindungsgemäß bevorzugte Marker sind Fluoreszenzmarker, bei denen es sich z.B. um Fluoreszenzfarbstoffe wie einen Fluoresceinfarbstoff, einen Rhodaminfarbstoff, einen Cyaninfarbstoff und einen Cumarinfarbstoff handelt.
- Der Begriff "Bindeglied" bezieht sich auf eine Gruppe von Atomen, die den für die Verwendung bestimmten Rest (z.B. die "Festphase" oder den "Marker") mit der Bindungsposition am "Nukleotid", am "modifizierten Nukleotid" oder an der "Nichtnukleotidverbindung" verbindet. Dies kann z.B. der Basen-, Zucker- oder Phosphatrest eines "Nukleotids" oder eines "modifizierten Nukleotids" (oder unter besonderen Umständen sogar bei einer "Nichtnukleotidverbindung") oder der basenartige, zuckerartige oder phosphatartige Rest einer "Nichtnukleotidverbindung" oder eines "modifizierten Nukleotids" sein. Das "Bindeglied" wird flexibel genug sein, daß die erfindungsgemäße "oligomere Verbindung", insbesondere das "modifizierte Oligonukleotid", an die "Zielnukleinsäure", die zu bestimmen ist, ohne gröbere Störung durch die "Festphase" oder den "Marker" binden kann. "Bindeglieder", insbesondere diejenigen, die nicht hydrophob sind, zum Beispiel auf Basis von aufeinanderfolgenden Ethylenoxyeinheiten, wie sie zum Beispiel in
DE 3943522 beschrieben sind, sind dem Fachmann bekannt. - Erfindungsgemäß kann eine "Festphase" CP-Glas (controlled pore glass), Polystyrol oder Silicagel, wie es für die Oligonukleotidsynthese verwendet wird, sein.
- Im vorliegenden Zusammenhang beziehen sich "Fluoreszenzresonanz-Energietransfer-Beziehung" und ähnliche Ausdrücke auf die benachbarte Hybridisierung einer "oligomeren Verbindung", die mit einem "Donator-Fluoreszenzmarker" markiert ist, und einer weiteren "oligomeren Verbindung", die mit einem "Akzeptorfluoreszenzmarker" markiert ist, an eine "Zielnukleinsäure" auf solche Art und Weise, daß der "Donatorfluoreszenzmarker" Resonanzenergie auf den "Akzeptorfluoreszenzmarker" übertragen kann, so daß der "Akzeptorfluoreszenzmarker" eine meßbare Fluoreszenzemission produziert. Sind der "Donatorfluoreszenzmarker" und der "Akzeptorfluoreszenzmarker" zu weit voneinander entfernt, so kann der "Donatorfluoreszenzmarker" keine Resonanzenergie auf den "Akzeptorfluoreszenzmarker" so übertragen, daß der "Akzeptorfluoreszenzmarker" eine meßbare Fluoreszenz emittiert, und somit der "Donatorfluoreszenzmarker" und der "Akzeptorfluoreszenzmarker" nicht in einer Resonanzenergietransfer-Beziehung stehen.
- Unter "Array" versteht man eine Anordnung von adressierbaren Orten auf einer Einrichtung (siehe z.B.
US 5,143,854 ,US 6,022,963 ,US 6,156,501 , WO 90/15070, WO 92/10092). Die Orte können in zweidimensionalen Arrays, dreidimensionalen Arrays oder sonstigen Matrixformaten angeordnet sein. Die Anzahl der Orte kann im Bereich von mehreren bis mindestens Hunderttausenden liegen. Höchst wichtig ist, daß jeder Ort eine völlig unabhängige Reaktionsstelle darstellt. Jeder Ort trägt eine Nukleinsäure als z.B. "oligomere Verbindung", die als Bindungspartner für eine zweite Nukleinsäure insbesondere eine Zielnukleinsäure, dienen kann. - Detaillierte Beschreibung der Erfindung
- In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Verbindung der Formel Ibereitgestellt, in der Y aus der Gruppe O, S, und NR4, wobei R4 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Acyl, eine Schutzgruppe oder H bedeutet, stammt,
in der X ein Bindeglied bedeutet, wobei n 0 oder 1 bedeutet,
in der R1 von R2, R3 und R4 unabhängig ist und aus der Gruppe - (1) Schutzgruppe,
- (2) Markierung und
- (3) Festphase
- (1) -H,
- (2) Schutzgruppe,
- (3) Festphase und Bindeglied X
- (4) Phosphoramidit
- (5) H-Phosphonat und
- (6) Triphosphat
- In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform bedeutet Y O.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R1 unabhängig von R2, R3 und R4 und stammt aus der Reihe Schutzgruppe und Marker, wobei am stärksten bevorzugt ist, daß R1 einen Marker bedeutet.
- Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind Verbindungen, die sich für die Synthese von erfindungsgemäßen oligomeren Verbindungen eignen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind daher R2 und R3 unabhängig voneinander und unabhängig von R1 oder R4, und R2 stammt aus der Gruppe Festphase und Bindeglied X, ein Phosphoramidit, und ein H-Phosphonat, wobei R3 -H oder eine Schutzgruppe bedeutet und R3 vorzugsweise eine Schutzgruppe bedeutet. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform sind R2 und R3 unabhängig voneinander und unabhängig von R1 oder R4, und R2 bedeutet eine Festphase und ein Bindeglied X und R3 bedeutet -H. In einer weiteren, noch stärker bevorzugten Ausführungsform sind R2 und R3 unabhängig voneinander und unabhängig von R1 oder R4, und R2 bedeutet ein Phosphoramidit oder ein H-Phosphonat, vorzugsweise ein Phosphoramidit, und R3 bedeutet eine Schutzgruppe, wobei R1 einen Marker oder eine Schutzgruppe bedeutet, und wobei R1 vorzugsweise einen Marker bedeutet. In diesem Fall wird bevorzugt, daß X ein Bindeglied bedeutet, wobei n 1 bedeutet.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist X ein Bindeglied, wobei n 1 bedeutet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Bindeglied X der erfindungsgemäßen Verbindung Kohlenstoff- und Sauerstoffatome. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Bindeglied X – (CH2)m oder -(CH2CH2O)m-Reste, wobei m eine ganze Zahl zwischen 0 und 10, vorzugsweise zwischen 1 und 10, bedeutet. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform stammt das Bindeglied X aus der Gruppe
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt die Schutzgruppe aus der Gruppe
- – Fluorenylmethoxycarbonyl,
- – Dimethoxytrityl,
- – Monomethoxytrityl,
- – Trifluoracetyl,
- – Levulinyl und
- – Silyl.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bedeutet R1 einen Marker, vorzugsweise einen Fluoreszenzmarker wie einen Fluoreszenzfarbstoff aus der Gruppe
- – Fluoresceinfarbstoff,
- – Rhodaminfarbstoff,
- – Cyaninfarbstoff und
- – Cumarinfarbstoff.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung ein Derivat des 1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-glucitols mit der unten angegebenen Formeloder des 1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-mannitols mit der unten angegebenen Formel
- Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Verbindung, nämlich ein Glucitol-FAMphosphoramidit, mit der Formel
- Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Verbindung, nämlich ein Mannitol-FAM-phosphoramidit, mit der Formel
- Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Verbindung mit der Formel (FMOC: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl als Schutzgruppe)
- In einer sehr bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine oligomere Verbindung bereitgestellt, die eine monomere Einheit der Formel II enthält,in der Y aus der Gruppe O, S, und NR4, wobei R4 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Acyl, eine Schutzgruppe oder H bedeutet, stammt;
in der X ein Bindeglied bedeutet, wobei n 0 oder 1 bedeutet,
in der R7 von R4, R5 und R6 unabhängig ist und in der R7 aus der Gruppe - (1) -H,
- (2) Schutzgruppe,
- (3) Marker
- (4) Oligonukleotid und
- (5) Festphase
- (1) -H,
- (2) Festphase und Bindeglied X,
- (3) Phosphat und
- (4) Phosphodiester mit einem Nukleotid, einem modifizierten Nukleotid, einem Oligonukleotid oder einem modifizierten Oligonukleotid stammen,
- In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet Y O.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die monomere Einheit ein Derivat des 1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-glucitols mit der unten angegebenen Formeloder des 1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-mannitols mit der unten angegebenen Formel
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R7 von R4, R5 und R6 unabhängig und stammt aus der Gruppe -H, Festphase, Schutzgruppe und Marker, wobei R7 am meisten bevorzugt -H oder ein Marker ist, wobei R7 stärker bevorzugt ein Marker ist.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind R5 und R6 unabhängig voneinander und unabhängig von R7 oder R4, und R5 und R6 stammen aus der Gruppe -H, Phosphat und Phosphodiester mit einem Oligonukleotid oder einem modifizierten Oligonukleotid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind R5 und R6 unabhängig voneinander und unabhängig von R7 oder R4 und bedeuten ein Phosphodiester mit einem Oligonukleotid oder einem modifizierten Oligonukleotid.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist X ein Bindeglied, wobei n 1 bedeutet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Bindeglied X der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung Kohlenstoff- und Sauerstoffatome. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Bindeglied X -(CH2)m- oder -(CH2CH2O)m-Reste, wobei m eine ganze Zahl zwischen 0 und 10, vorzugsweise zwischen 1 und 10, bedeutet. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform stammt das Bindeglied X aus der Gruppe
- In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die Schutzgruppe der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung aus der Gruppe
- (1) Fluorenylmethoxycarbonyl,
- (2) Dimethoxytrityl,
- (3) Monomethoxytrityl,
- (4) Trifluoracetyl,
- (5) Levulinyl oder
- (6) Silyl.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bedeutet R7 der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung einen Marker, vorzugsweise einen Fluoreszenzmarker (oder Fluoreszenzfarbstoff), vorzugsweise aus der Gruppe
- (1) Fluoresceinfarbstoff,
- (2) Rhodaminfarbstoff,
- (3) Cyaninfarbstoff und
- (4) Cumarinfarbstoff.
- Der am stärksten bevorzugte Fluoreszenzmarker ist ein Fluorescein- oder ein Rhodaminfarbstoff.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die erfindungsgemäße oligomere Verbindung eine monomere Einheit, bei der es sich um
- (1) einen zweiten Marker, vorzugsweise einen zweiten Fluoreszenzmarker, stärker bevorzugt ein Bindeglied mit einem zweiten Fluoreszenzmarker, der bzw. das an den Basen-, Zucker- oder Phosphatrest eines Nukleotids gebunden ist, oder um
- (2) einen zweiten Marker, vorzugsweise einen zweiten Fluoreszenzmarker, stärker bevorzugt ein Bindeglied mit einem zweiten Fluoreszenzmarker, der bzw. das an ein modifiziertes Nukleotid oder eine Nichtnukleotidverbindung gebunden ist, handelt.
- Bei dem zweiten Fluoreszenzmarker handelt es sich vorzugsweise um einen Fluoresceinfarbstoff, einen Rhodaminfarbstoff, einen Cyaninfarbstoff oder einen Cumarinfarbstoff. Der am stärksten bevorzugte zweite Fluoreszenzmarker ist ein Rhodamin- oder ein Cyaninfarbstoff.
- Nur dann, wenn ein zweiter Marker oder Fluoreszenzmarker vorliegt, kann der Marker oder Fluoreszenzmarker auch als erster Marker oder erster Fluoreszenzmarker bezeichnet werden; dies nur zur Klarstellung.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die erfindungsgemäße oligomere Verbindung eine monomere Einheit, bei der es sich um
- (1) ein geschütztes Bindeglied, das an dem Basen-, Zucker- oder Phosphatrest eines Nukleotids gebunden ist,
- (2) ein Bindeglied mit einer Schutzgruppe, die an ein modifiziertes Nukleotid oder eine Nichtnukleotidverbindung gebunden ist, handelt.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfaßt das modifizierte Oligonukleotid der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung eine monomere Einheit, die einen Rest aus der folgenden Gruppe umfaßt:
- (1) Cyclohexan-l,l-dimethanol (gemäß
US 6,130,323 ), - (2) 1,3-Propandiol (gemäß
US 5,451,463 ), - (3) 2,2-Di-(3-aminopropyl)-1,3-dihydroxypropan (gemäß
EP 0313 219 ) und - (4) 1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxyhexitol.
- Vorzugsweise umfaßt das modifizierte Oligonukleotid der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung eine monomere Einheit, die erfindungsgemäß einen 1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxyhexitolrest umfaßt.
- Für die Formate, die im LightCycler®-Gerät verwendet werden, wird die erfindungsgemäße Verbindung vorzugsweise an das 3'- oder 5'-Ende der oligomeren Verbindung während dessen Synthese gerichtet sein.
- Für das TagMan®-Format kann der Marker R7, der an die erfindungsgemäße oligomere Verbindung gebunden ist, nach der Synthese intern in der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung am 5'-Ende oder am 3'-Ende der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung lokalisiert sein. Bei dem Marker handelt es sich vorzugsweise um einen Fluoreszenzmarker, vorzugsweise um einen Fluorescein- oder einen Rhodaminfarbstoff. Die erfindungsgemäße oligomere Verbindung kann weiter noch andere Marker umfassen, wobei die Emissionswellenlängen von einem der Marker mit den Absorptionswellenlängen eines der anderen Marker überlappen. Vorzugsweise umfaßt die oligomere Verbindung weiter noch einen zweiten Marker, der als Quencher dient und der die Fluoreszenzemission des Fluoreszenzmarkers, bei dem es sich um Fluorescein handeln kann, quencht. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Quencher um einen fluores zierenden Rhodamin- oder Cyaninfarbstoff oder um einen nichtfluoreszierenden Marker wie Dabcyl ("Dark quencher").
- In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße oligomere Verbindung nicht enzymatisch verlängert werden, um als Sonde im TagMan®-Format verwendet zu werden, wie dies im Prinzip in
US 5,210,015 ,US 5,478,972 oderUS 5,804,375 beschrieben ist. Die monomere Einheit am 3'-Ende der oligomeren Verbindung ist vorzugsweise ein 2',3'-Didesoxynukleotid oder ein 3'-phosphoriliertes Nukleotid. Für das TagMan®-Format kann die erfindungsgemäße monomere Einheit mit einem Marker, vorzugsweise einem Fluoreszenzmarker, sowie eine zweite monomere Einheit mit einem weiteren Marker, vorzugsweise einem zweiten Fluoreszenzmarker, vorzugsweise intern in der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung oder am 5'-Ende und/oder 3'-Ende der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung lokalisiert sein. - Dem Fachmann ist klar, daß der Hexitolring der erfindungsgemäßen Verbidnung oder der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung weitere Substituenten tragen kann und trotzdem noch in den erfindungsgemäßen Verfahren funktionsfähig ist. Insbesondere kann das Hexitol, jedoch auch das Bindeglied, weitere Halogen oder Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl tragen, die gegebenenfalls Heteroatome oder Heteroarylsubstituenten enthalten, die gegebenenfalls durch weitere Substituenten, wie bereits beschrieben, substituiert sind. Diese Verbindungen können dahingehend geprüft werden, ob sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren oder Verwendungszwecken verwendet werden können, und zwar z.B. durch einfache Hybridisierungsversuche mit wie unter 1.5. beschriebenen komplementären Oligonukleotiden, in den bei dem LightCycler®-Gerät oder bei dem TagMan®-Gerät verwendeten Assay-Formaten oder in den erfindungsgemäßen chemischen Syntheseverfahren unter Verwendung von Phophoramidit-Verbindungen oder Verbindungen, die in eine Festphase gebunden sind.
- In einer weiteren Ausführungsform wird bei der erfindungsgemäßen Verbindung, wobei R2 Phosphoramidit oder eine Festphase mit einem Bindeglied X bedeutet und R3 eine Schutzgruppe bedeutet, für die chemische Synthese eines erfindungsgemäßen modifizierten Oligonukleotids verwendet. In einer weiteren Ausführungsform wird die erfindungsgemäße oligomere Verbindung in einer Hybridisierungsreaktion mit einer Nukleinsäure verwendet. Dies kann auch in einem so genannten Array-Format erfolgen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die erfindungsgemäße oligomere Verbindung als Primer, Sonde oder Fangsonde verwendet.
- Die erfindungsgemäßen oligomeren Verbindungen können im Prinzip wie im Stand der Technik und dem Fachmann bekannt synthetisiert werden, besonders bevorzugte Bausteine hierfür sind die erfindungsgemäßen Verbindungen. Verfahren zur Herstellung von oligomeren Verbindungen wie Oligonukleotiden und modifizierten Oligonukleotiden mit spezifischen Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt; dazu zählen zum Beispiel Klonierung und Restriktion von entsprechenden Sequenzen sowie die direkte chemische Synthese. Zu den chemischen Syntheseverfahren können zum Beispiel das von Narang, S.A., et al., Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98, beschriebene Phosphotriesterverfahren, das von Brown, E.L., et al., Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151, beschriebene Phosphodiesterverfahren, das in Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859, beschriebene Phosphoramiditverfahren, das in Garegg et al., Chem. Scr. 25 (1985) 280-282, beschriebene H-Phosphonatverfahren sowie das in
US 4,458,066 beschriebene Verfahren mit festem Träger zählen. Besonders bevorzugt ist das Phosphoramiditverfahren. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird daher ein Verfahren für die chemische Synthese einer erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung bereitstellt, das folgende Schritte umfaßt: - (a) Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei R2 Phosphoramidit bedeutet und R3 eine Schutzgruppe bedeutet,
- (b) Bereitstellen einer 5'-OH-Gruppe eines Nukleosids oder eines modifizierten Nukleosids, das über die 3'-OH-Gruppe an eine Festsphase gebunden ist oder Bereitstellen einer 5'-OH-Gruppe eines Oligonukleotids oder eines modifizierten Oligonukleotids, das an die Festphase über die 3'-OH-Gruppe des Nukleotids oder des modifizierten Nukleotids am 3'-Ende des Oligonukleotids bzw. des modifizierten Oligonukleotids gebunden ist,
- (c) Umsetzen des Phosphoratoms des Phosphoramidits mit der 5'-OH-Gruppe unter Bildung eines Phosphitesters und Oxidieren des Phosphitesters zu einem Phosphotriester
- (d) gegebenenfalls Umsetzen einer nicht umgesetzten 5'-OH-Gruppe aus Schritt (c) mit einer anderen Verbindung, um weitere Reaktionen der nichtreagierten 5'-OH-Gruppe aus Schritt (c) in den anschließenden Schritten zu vermeiden ("Capping"-Reaktion"),
- (e) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (a) bis
- (d) mit Phosphoramiditderivaten von Nukleosiden oder modifizierten Nukleosiden nach Entfernen der Schutzgruppe der erfindungsgemäßen Verbindung, und
- (f) Abspalten der oligomeren Verbindung von der Festphase, Entfernen der Schutzgruppen und dadurch Umwandeln des Phosphotriesters in einen Phosphodiester, sowie
- (g) Isolierung der oligomeren Verbindung.
- Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist mit einem Verfahren für die Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung verwandt, das folgende Schritte umfaßt:
- (a)
Bereitstellen einer Verbindung der Formel III, wobei R8 und R9 entweder eine erste und eine zweite O-Schutzgruppe bedeuten oder gemeinsam einen Benzylidenrest bilden, wobei dessen Methylengruppe an die beiden Sauerstoffatome der Formel III gebunden ist,
- (b) Umsetzen dieser Verbindung der Formel III mit einer Abgangsgruppe
wie p-Toluolsulfonylchlorid, wodurch man zu dem Derivat der Formel
IV gelangt, wobei -Tosyl den p-Toluolsulfonylrest bedeutet;
- (c) Umsetzen der Verbindung der Formel IV mit Azid, wodurch
man zu der Verbindung der Formel V gelangt,
- (d) Entschützen
der Sauerstoffatome in 4- und 6-Stellung
der Verbindung der Formel V, wodurch man zu der Verbindung der Formel
VI gelangt;
- (e) Schützen
des 6-OH-Rests mit einem 4,4'-Dimethoxytritylrest,
wodurch man zu der Verbindung der Formel VII gelangt, wobei DMT den 4,4'-Dimethoxytritylrest bedeutet;
- (f) Reduzieren der Azidofunktion mit einem Reduktionsmittel
wie Triphenylphosphan, wodurch man zu der Verbindung der Formel
VIII gelangt,
- (g) Koppeln eines Rests R1 oder gegebenenfalls
eines Rests R1 mit einem Bindeglied X an
die 2-Aminofunktion,
wodurch man zu der Verbindung der Formel IX, wobei n 0 oder 1 bedeutet,
gelangt,
- (h) Einführen
einer Phosphoramiditfunktion an den Sauerstoff in 4-Stellung, wodurch
man zu der Verbindung der Formel X, wobei n 0 oder 1 bedeutet gelangt,
- (i) sowie Isolieren der Verbindung.
- Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist mit einem Verfahren für die Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung verwandt, das folgende Schritte umfaßt:
- (a)
Bereitstellen einer Verbindung der Formel III,
- (b) wobei R8 und R9 entweder eine erste und eine zweite O-Schutzgruppe bedeuten oder gemeinsam einen Benzylidenrest bilden, wobei dessen Methylengruppe an die beiden Sauerstoffatome der Formel III gebunden ist,
- (c) Umsetzen dieser Verbindung der Formel III mit einer Abgangsgruppe
wie p-Toluolsulfonylchlorid, wodurch man zu dem Derivat der Formel
IV gelangt, wobei -Tosyl den p-Toluolsulfonylrest bedeutet;
- (d) Umsetzen der Verbindung der Formel IV mit einer weiteren
Abgangsgruppe wie Bromid, wodurch man zu der Verbindung der Formel
XI gelangt,
- (e) Umsetzen der Verbindung der Formel XI mit Azid, wodurch
man zu der Verbindung der Formel XII gelangt,
- (f) Entschützen
der Sauerstoffatome in 4- und 6-Stellung
der Verbindung der Formel XII, wodurch man zu der Verbindung der
Formel XIII gelangt;
- (g) Schützen
des 6-OH-Rests mit einem 4,4'-Dimethoxytritylrest,
wodurch man zu der Verbindung der Formel XIV gelangt, wobei DMT den 4,4'-Dimethoxytritylrest bedeutet;
- (h) Reduzieren der Azidofunktion mit einem Reduktionsmittel
wie Triphenylphosphan, wodurch man zu der Verbindung der Formel
XV gelangt,
- (i) Koppeln eines Rests R1 oder gegebenenfalls
eines Rests R1 mit einem Bindeglied X an
die 2-Aminofunktion,
wodurch man zu der Verbindung der Formel XVI, wobei n 0 oder 1 bedeutet,
gelangt,
- (j) Einführen
einer Phosphoramiditfunktion an den Sauerstoff in 4'-Stellung, wodurch
man zu der Verbindung der Formel XVII, wobei n 0 oder 1 bedeutet,
gelangt,
- (k) sowie Isolieren der Verbindung.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Übertragung einer erfindungsgemäßen Verbindung auf ein Polynukleotid oder ein Oligonukleotid vorgesehen, wobei die Verwendung der terminalen Transferase vorgesehen ist. Das Verfahren im Prinzip ist dem Fachmann bekannt. In einer Ausführungsform der Erfindung wird daher ein Verfahren für die enzymatische Synthese einer polymeren Verbindung oder einer oligomeren Verbindung gemäß der Erfindung bereitgestellt, das die folgende Schritte umfaßt:
- (a) Inkubieren einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei R3 dieser Verbindung ein Triphosphat bedeutet,
- (b) mit einer 3'-OH-Gruppe des Nukleotids oder modifizierten Nukleotids am 3'-Ende eines Polynukleotids, Oligonukleotids oder eines modifizierten Oligonukleotids in Gegenwart einer terminalen Transferase, wodurch die Verbindung an die 3'-OH-Gruppe gebunden wird, wodurch Pyrophosphat freigesetzt wird, und
- (c) Isolieren der polymeren oder oligomeren Verbindung.
- In einer weiteren Ausführungsform wird eine Nachmarkierung der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindungen vorgesehen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird daher ein Verfahren zum Binden eines Markers an eine erfindungsgemäße oligomere Verbindung bereitgestellt, wobei R7 der oligomeren Verbindung eine Schutzgruppe bedeutet, das die folgenden Schritte umfaßt:
- – Entfernen der Schutzgruppe R7, und
- – Umsetzen des entschützten Rests der oligomeren Verbindung mit dem Marker.
- Bei dem entschützten Rest handelt es sich um den NH2-, OH- oder SH-Rest, jedoch vorzugsweise um den NH2-Rest.
- Dem Fachmann sind Verfahren zur Durchführung dieser Resktionsschritte bekannt.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen einer Zielnukleinsäure in einer Probe bereitgstellt, das die folgenden Schritte umfaßt:
- (a) Bereitstellen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie die Zielnukleinsäure enthält,
- (b) Bereitstellen einer erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung, die im Wesentlichen zu der Zielnukleinsäure teilweise oder ganz komplementär ist,
- (c) gegebenenfalls Amplifizieren der Zielnukleinsäure mit einer matrizenabhängigen DNA-Polymerase und Primern,
- (d) In-Kontakt-Bringen der Probe mit der oligomeren Verbindung unter Bedingungen, unter denen die oligomere Verbindung an die Zielnukleinsäure binden kann,
- (e) Bestimmen des Bindungsprodukts bzw. des Ausmaßes der Hybridisierung zwischen der Zielnukleinsäure und der oligomeren Verbindung als Maß für das Vorliegen, das Fehlen bzw. die Menge der Zielnukleinsäure.
- Erfindungsgemäße oligomere Verbindung umfaßt vorzugsweise zwei Marker, vorzugsweise zwei Fluoreszenzmarker.
- Die Amplifikation wird vorzugsweise mit der Polymerasekettenreaktion durchgeführt, die spezifisch Zielnukleinsäuren zu nachweisbaren Mengen amplifiziert. Weitere mögliche Amplikikationsreaktionen sind die Ligasekettenreaktion (LCR; Wu, D.Y., und Wallace, R.B., Genomics 4 (1989) 560-569; und Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193); die Polymerase-Ligase-Kettenreaktion (Barany, F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16); Gap-LCR (WO 90/01069); die Repair-Kettenreaktion (
EP 0439182 A2 ), 3SR (Kwoh, D.Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli, J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; WO 92/08808) und NASBA (US 5,130,238 ). Außerdem gibt es die Strangverdrängungsamplifikation (SDA), die transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA), die Qβ-Amplifikation (für eine Übersicht siehe z.B. Whelen, A.C. und Persing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson, R.D. und Myres, T.W., Current Opinion in Biotechnology 4 (1993) 41-47). - Die bevorzugte matrizenabhängige DNA-Polymerase ist die Taq-Polymerase.
- In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das bei dem TagMan®-Assay verwendete Format vorgesehen, wobei die erfindungsgemäße oligomere Verbindung als Sonde verwendet wird. Die erfindungsgemäße oligomere Verbindung umfaßt daher einen Marker als R7, wobei es sich vorzugsweise um einen Fluoreszenzmarker, vorzugsweise Fluorescein handelt. Die erfindungsgemäße oligomere Verbindung kann weiter noch andere Fluoreszenzmarker umfassen, wobei die Emissionswellenlängen des einen der Fluoreszenzmarker mit den Absorptionswellenlängen eines anderen der Fluoreszenzmarker überlappen. Vorzugsweise umfaßt die oligomere Verbindung weiterhin einen zweiten Fluoreszenzmarker, der als Quencher agiert und der die Fluoreszenzemission des Fluoreszenzmarkers, bei dem es sich um Fluorescein handeln kann, quencht. Bei dem Quencher handelt es sich vorzugsweise um ein fluoreszierendes Rhodamin oder Cyanin. Bei dem Quencher kann es sich auch um eine nichtfluoreszierende Verbindung oder einen nichtfluoreszierenden Farbstoff wie Dabcyl ("Dark quencher") handeln. Die erfindungsgemäße oligomere Verbindung kann nicht enzymatisch verlängert werden, um als Sonde im TagMan®-Format zu dienen, wie dies im Prinzip in
US 5,210,015 ,US 5,478,972 oderUS 5,804,375 beschrieben ist. Bei der monomeren Einheit am 3'-Ende der oligomeren Verbidnung handelt es sich vorzugsweise um ein 2',3'-Didesoxynukleotid oder ein 3'-phosphoryliertes Nukleotid. Für das TagMan®-Format können die erfindungsgemäße Verbindung mit einem Marker sowie eine zweite Verbindung mit dem Marker vorzugsweise intern in dem erfindungsgemäßen modifizierten Oligonukleotid oder am 5'-Ende und/oder 3'-Ende des erfindungsgemäßen modifizierten Oligonukleotids lokalisiert sein. Für das bei dem TagMan®-Assay verwendete Format wird daher bei dem Bestimmungsschritt des Verfahrens die räumliche Beziehung zwischen dem Fluoreszenzmarker und dem zweiten Marker, d.h. dem Quencher, nach der Hybridisierung geändert, vorzugsweise durch die Exonuklease-Hydrolyse einer matrizenabhängigen DNA-Polymerase, vorzugsweise der Taq-Polymerase, der Nukleinsäurebindungsverbindung, wobei aufgrund der Exonuklease-Hydrolyse Marker freigesetzt wird. Der Grad der Hybridisierung zwischen der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung und der Nukleinsäure wird durch die Markermenge, die von der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung nach der Hybridisierung freigesetzt wird, bestimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird daher in Schritt (d) das Ausmaß der Hybridisierung durch die Markermenge, die von der oligomeren Verbindung, die an die Nukleinsäure hybridisiert ist, durch die Exonuklease-Hydrolyse durch die matrizenabhängige DNA-Polymerase freigesetzt wird, bestimmt. - In einer sehr bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die detaillierter auf das TagMan®-Assay-Format eingeht, wird ein Verfahren zum Nachweisen in einer Zielnukleinsäure in einer Probe bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfaßt:
- (a) In-Kontakt-Bringen der Probe, die einzelsträngige Nukleinsäuren umfaßt, mit einem Oligonukleotid, das eine Sequenz, die zu einer Region der Zielnukleinsäure komplementär ist, enthält und einer erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung, wobei R7 einen Fluoreszenzmarker bedeutet und die oligomere Verbindung einen zweiten Fluoreszenmarker bedeutet und wobei die oligomere Verbindung eine Sequenz, die zu einer zweiten Region des selben Zielnukleinsäuresequenzstrangs komplementär ist, enthält, darunter jedoch nicht die durch das Oligonukleotid definierte Nukleinsäuresequenz, wodurch man eine Mischung von Doppelsträngen unter Hybridisierungsbedingungen erzeugt, wobei die Doppelstränge die an das Oligonukleotid und an die oligomere Verbindung so, hybridisierte daß das 3'-Ende des ersten Oligonukleotids stromaufwärts des 5'-Endes der oligomeren Verbindung liegt, anhybridisierte Zielnukleinsäure umfassen,
- (b) Halten der Mischung aus Schritt (a), die eine 5'-3'-Nukleaseaktivität aufweist, unter Bedingungen, die der 5'-3'-Nukleaseaktivität der Polymerase die Spaltung der anhybridisierten oligomeren Verbindung und die Freisetzung von markierten Fragmenten ermöglichen, sowie
- (c) Nachweisen und/oder Bestimmen der Freisetzung von markierten Fragmenten.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Format für das LightCycler®-Gerät wie in
US 6,174,670 beschrieben bereitgestellt. Für Formate, die in dem LightCycler®-Gerät verwendet werden, wird sich die erfindungsgemäße Verbindung vorzugsweise am 3'- oder 5'-Ende, also die monomere Einheit am 3'- oder 5'-Ende der oligomeren Verbindung nach deren Synthese befinden. Bei diesen Formaten wird die Fluoreszenzresonanzenergietransfertechnik (siehe zum Beispiel US-Patente Nr. 4,996,143, 5,565,322, 5,849,489 und 6,162,603) verwendet; sie beruhen darauf, daß wenn ein Donator- und ein entsprechender Akzeptorfluoreszenzmarker innerhalb eines gewissen Abstands voneinander zu liegen kommen, zwischen den beiden Fluoreszenzmarkern ein Energietransfer stattfindet, der sichtbar gemacht oder auf andere Art und Weise qualitativ und/oder quantitativ nachgewiesen werden kann. Für den vorliegenden Zweck können zwei Sonden, die jeweils einen Fluoreszenzmarker enthalten, wobei mindestens eine davon eine erfindungsgemäße oligomere Verbindung ist, an ein Amplifikationsprodukt an bestimmten Stellungen, die durch die Komplementarität der Sonden zu der Zielnukleinsäure bestimmt sind, hybridisieren. Bei dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindung kann es sich um einen Donator- oder Akzeptorfluoreszenzmarker handeln. Beim Hybridisieren der Sonden an das Amplifikationsprodukt an den entsprechenden Stellungen wird ein FRET-Signal erzeugt. Die Fluoreszenzanalyse kann zum Beispiel mit einem photonenzählenden Epifluoreszenzmikroskopsystem (das die entsprechenden dichroitischen Spiegel und Filter für die Verfolgung der Fluoreszenzemission in dem jeweiligen Bereich enthält), einem photonenzählenden Fotomultiplikatorsystem oder einem Fluorimeter durchgeführt werden. Die Erregung zur Einleitung des Energietransfers kann mit einem Argon-Ionenlaser, einer Hochintensitäts-Quecksilber-(Hg-)Bogenlampe einer faseroptischen Lichtquelle oder einer anderen Hochintensitätslichtquelle, die entsprechend für eine Erregung im erwünschten Bereich gefiltert ist, durchgeführt werden. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff "entsprechend" in bezug auf Donator und entsprechende Akzeptor-Fluoreszenzmarker auf einen Akzeptor-Fluoreszenzmarker, dessen Emissionsspektrum mit dem Erregungsspektrum des Donator-Fluoreszenzmarkers überlappt. Dementsprechend kann zwischen diesen beiden ein wirksamer nichtradioaktiver Energietransfer stattfinden. Der bevorzugte Fluoreszenzmarker ist Fluorescein als Donator-Fluoreszenzmarker, wobei der Akzeptor-Fluoreszenzmarker Rhodamin ist; ein Cyaninfarbstoff, vorzugsweise Cy5 wie inUS 6,174,670 beschrieben, ist jedoch bevorzugt. - In einer Ausführungsform der Erfindung wird daher ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens einer Zielnukleinsäure in einer Probe bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfaßt:
Durchführen von mindestens einem Zyklusschritt, wobei ein Zyklusschritt einen Amplifikationsschritt und einen Hybridisierungsschritt umfaßt, wobei bei dem Amplifikationsschritt die Probe mit Primern in Kontakt gebracht wird, um, wenn Zielnukleinsäure in der Probe vorliegt, ein Amplifikationsprodukt zu erzeugen, wobei bei dem Hybridisierungsschritt die Probe mit einem Sondenpaar in Kontakt gebracht wird, wobei die Bestandteile dieses Sondenpaares innerhalb nicht mehr als fünf Nukleotide voneinander zu dem Amplifikationsprodukt hybridisieren, wobei eine erste Sonde dieses Sondenpaars mit einem Donatorfluoreszenzmarker markiert ist und wobei eine zweite Sonde des Sondenpaars mit einem entsprechenden Akzeptorfluoreszenzmarker markiert ist;
sowie Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens von Fluoreszenzresonanzenergietransfer zwischen dem Donatorfluoreszenzmarker der ersten Sonde und dem Akzeptorfluoreszenzmarker der zweiten Sonde, wobei das vorliegen eines Fluoreszenzresonanzenergietransfers das Vorliegen der Zielnukleinsäure in der Probe anzeigt und wobei das Fehlen eines Fluoreszenzresonanzenergietransfers das Fehlen der Zielnukleinsäure in der Probe anzeigt. - In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird daher ein Verfahren zum Nachweisen einer Zielnukleinsäure in einer Probe bereitgestellt, das folgende Schritte umfaßt: Amplifizieren der Nukleinsäure mittels Polymerasekettenreaktion in Gegenwart von zwei Nukleinsäuresonden, wobei es sich bei einer Sonde um eine erfindungsgemäße oligomere Verbindung handelt, die an benachbarte Regionen der Zielnukleinsäure hybridisieren, wobei eine der Sonden mit einem Akzeptorfluoreszenzmarker markiert ist und die andere Sonde mit einem Donatorfluoreszenzmarker eines Fluoreszenzenergietransferpaares markiert ist, so daß bei Hybridisierung der beiden Sonden mit der Zielnukleinsäure der Donator- und der Akzeptorfluoreszenzmarker innerhalb 25 Nukleotide voneinander vorliegen, wobei die Polymerasekettenreaktion die folgenden Schritte umfaßt: Versetzen der Probe mit einer hitzestabilen Polymerase, Nukleotiden und Primern für die Zielnukleinsäure und Durchführung von thermischen Cyclen mit der Probe zwischen zumindest einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur; Erregen der biologischen Probe mit Licht bei einer Wellenlänge, die von dem Donatorfluoreszenzmarker absorbiert wird, sowie Nachweisen der Fluoreszenzemission von dem Fluoreszenzenergietransferpaar.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen einer Zielnukleinsäure in einer Probe bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfaßt: Amplifizieren der Nukleinsäure mittels Polymerasekettenreaktion in Gegenwart von zwei Nukleinsäuresonden, wobei es sich bei einer Sonde um eine erfindungsgemäße oligomere Verbindung handelt, die an benachbarte Regionen der Zielnukleinsäure hybridisieren, wobei eine der Sonden mit einem Akzeptorfluoreszenzmarker markiert ist und die andere Sonde mit einem Donatorfluoreszenzmarker eines Fluoreszenzenergietransferpaares markiert ist, so daß bei Hybridisierung der beiden Sonden mit der Zielnukleinsäure der Donator- und der Akzeptorfluoreszenzmarker innerhalb 25 Nukleotide voneinander vorliegen, wobei die Polymerasekettenreaktion die folgenden Schritte umfaßt: Versetzen der Probe mit einer hitzestabilen Polymerase, Nukleotiden und Primern für die Zielnukleinsäure und Durchführung von thermischen Cyclen mit der Probe zwischen zumindest einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur; Erregen der Probe mit Licht bei einer Wellenlänge, die von dem Donatormarker absorbiert wird, sowie Verfolgen der temperaturabhängigen Fluoreszenz des Fluoreszenzenergietransferpaars.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung ein aus Teilen bestehendes Kit vor, wobei das Kit eine matrizenabhängige Polymerase mit 3' → 5'-Exonukleaseaktivität, vorzugsweise die Taq-Polymerase, einen Satz Primer, Nukleotide sowie eine erfindungsgemäße oligomere Verbindung enthält. Solche fachbekannten Kits umfassen weiterhin Plastikwaren, die während des Amplifikationsvorgangs verwendet werden können, wie zum Beispiel Mikrotiterplatten im 96- oder 384-Well-Format, oder einfach normale Reaktionsröhrchen, die zum Beispiel von Eppendorf, Hamburg, Deutschland hergestellt werden, sowie alle sonstigen Reagenzien für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält das Kit weitere Reagenzien für die Isolation der Nukleinsäure. Das Kit kann daher zusätzlich ein Material mit Affinität für Nukleinsäuren enthalten; vorzugsweise umfaßt das Material mit Affinität für Nukleinsäuren ein Material mit einer Siliziumdioxidoberfläche. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Material mit Siliziumdioxidoberfläche um ein Glas. Stärker bevorzugt handelt es sich bei dem Material um Affinität für Nukleinsäuren um eine Zusammensetzung, die magnetische Glaspartikel wie in WO 96/41811 oder WO 01/37291 beschrieben umfaßt. Das Kit kann weiter oder zusätzlich einen Lysepuffer enthalten, der z.B. chaotrope Agenzien, Detergenzien oder Alkohole oder Mischungen davon enthält und der die Lyse von Zellen ermöglicht, sowie getrennt davon eine Protease, z.B. Proteinase K, für den Abbau von unerwünschten Proteinen. Diese Bestandteile des erfindungsgemäßen Kits können getrennt in Röhrchen oder in Aufbewahrungsbehältnissen bereitgestellt werden. Je nach der Art der Bestandteile können diese sogar auch in einem einzelnen Röhrchen oder einem einzelnen Aufbewahrungsbehältnis bereitgestellt werden. Das Kit kann weiterhin oder zusätzlich eine Waschlösung umfassen, die sich für den Waschschritt der magnetischen Glaspartikel, wenn DNA oder RNA daran gebunden ist, eignet. Diese Waschlösung kann Ethanol und/oder chaotrope Agenzien in einer gepufferten Lösung bzw. Lösungen mit einem sauren pH-Wert ohne Ethanol und/oder chaotrope Agenzien wie oben beschrieben enthalten. Die Waschlösung oder sonstigen Lösungen werden häufig in Form von Stammlösungen, die vor der Verwendung verdünnt werden müssen, bereitgestellt. Das Kit kann weiterhin oder zusätzlich ein Elutionsmittel und einen Elutionspuffer, also eine Lösung oder einen Puffer (z.B. 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) oder reines Wasser enthalten, um die an die magnetischen Glaspartikel gebundene DNA oder RNA zu eluieren. Weiterhin können zusätzliche Reagenzien oder gepufferte Lösungen vorliegen, die für den Aufreinigungsvorgang einer Nukleinsäure also DNA oder RNA verwendet werden können.
- Die folgenden Beispiele, Literaturhinweise, Sequenzprotokolle und Abbildungen dienen dem Verständnis der vorliegenden Erfindung, dessen voller Umfang in den angehängten Ansprüchen dargelegt ist. Es ist klar, daß bei den dargelegten Vorgehensweisen Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Erfindungsgedanken abzuweichen.
- Beschreibung der Abbildungen
-
1 : Synthese von mit Fluorescein markierten Phosphoramiditen auf Basis von 1,5- Anhydro-3-desoxy-D-mannitol (8) und -glucitol (15). -
2 : Die Markierungsreagenzien FAM- und HEX-cx-Phosphoramidit von der Fa. Biogenex (FAM: Fluorescein; HEX: Hexachlorofluorescein) -
3 : Synthese von 6-O-DMT-1,5-Anhydro-2,3-didesoxy-2-(N-Fmoc-6-aminocaproylamido)-D-mannitol-4-phosphoramidit (17) -
4 : Hybridisierungsversuche mit modifizierten Oligonukleotiden, in die über eine erfindungsgemäße Hexitderivatverbindung ein FAM-Rest eingebaut wurde (Flu = erfindungsgemäße FAM-Mannitverbindung, wobei FAM über ein Bindeglied an den Mannitrest gebundenes Fluorescein bedeutet). - 1. BEISPIELE
- 1.1 Herstellungsbeispiele - allgemeine Beschreibung der Synthese
- Die Synthese der neuen Bausteine 8 und 15 beginnt mit dem im Handel erhältlichen 4,6-O-Benzyliden-l,5-anhydro-3-desoxy-D-glucitol 1 und wird in
1 umrissen. Erst wurde die 2-Hydroxygruppe mit einer Ausbeute von 89% zu 2 tosyliert, das als Zwischenprodukt für das schlußendliche mannitisomere Reagenz diente. Um zu dem entsprechenden Glucitderivat zu gelangen, war es erforderlich, die Konfiguration am Kohlenstoffatom 2 zu invertieren. Dies gelang durch eine nukleophile Substitutionsreaktion des SN2-Typs mit Lithiumbromid in Pyridin, wodurch man zu 9 mit einer Ausbeute von 66% gelangte. Die Zwischenprodukte 2 und 9 wurden mit Natriumazid in DMF umgesetzt, um wiederum die Konfiguration am Kohlenstoffatom C-2 durch eine nukleophile Substitutionsreaktion des SN2-Typs zu invertieren, wodurch man das mannitolisomere 2-Azidoderivat 3 und das glucitolisomere 2-Azidoderivat 10 in einer Ausbeute von 97% bzw. 66% erhielt. Die Entschützung der Benzylidengruppe mit 80%iger Essigsäure lief beinahe quantitativ ab, wodurch man 4 (93%) und 11 (98%) erhielt. Danach wurde mit 77%iger Ausbeute die Dimethoxytritylgruppe eingeführt, wodurch man die Zwischenprodukte 5 und 12 erhielt. Durch Reduktion der Azidogruppe mittels Staudinger-Reaktion erhielt man die 2-Aminoderivate 6 und 13 in 93%iger bzw. 91%iger Ausbeute. Durch Umsetzen von 6 und 13 mit 6-Carboxyfluoresceindipivaloat, das in situ mit Chlorameisensäure isobutylester in DMF und N-Methylmorpholin aktiviert worden war, erhielt man die Verbindungen 7 und 14 in 75%iger Ausbeute. Umsetzen mit 2-Cyanoethoxydiisopropylaminochlorphosphan und Hünigscher-Base in Dichlormethan ergab die entsprechenden fluoresceinmarkierten Phosphoramidite in Mannitolkonfiguration (8) in 81%iger Ausbeute bzw. in Glucitolkonfiguration (15) in 88%iger Ausbeute. - Ausgehend von 4,6-O-Benzyliden-l,5-anhydro-3-desoxy-Dglucitol 1 konnte eine Gesamtausbeute von 34,9% für das mit Dipivaloyl geschützte, mit 6-Carboxyfluorescein markierte Phosphoramidit 8 in Mannitkonfiguration bzw. 17,6% für das entsprechende Phosphoramidit 15 in Glucitolkonfiguration erzielt werden, was höher als die Gesamtausbeute bei dem Biogenex-Linkersyntheseweg (
US 6,130,323 ) ist. - Die mit FAM markierten Phosphoramidite 8 und 15 wurden mittels 1H-NMR, 31P-NMR und HPLC charakterisiert. Neben der besseren Zugänglichkeit bei der Synthese in bezug auf leichte Durchführbarkeit der Syntheseschritte und Ausbeute existieren noch weitere Vorteile bei den neuen Monomeren im Vergleich zu den Derivaten von Biogenex. Beide Orientierungen des Markermoleküls innerhalb eines Oligonukleotids, die entweder in 5'-Richtung oder in 3'-Richtung weisen, können leicht erhalten werden, und zwar dadurch, daß man die Bausteine entweder in Mannitolkonfiguration (8) oder in Glucitolkonfiguration (15) verwendet. Dies ist bei gewissen FRET-Anwendungen vorteilhaft. Werden lipophile Marker verwendet, so ist bezüglich der Löslichkeit eine zusätzliche Etherfunktion im Hexitolring von Vorteil.
- 1.2 Herstellungsbeispiele - detaillierte Beschreibung der Synthese
- 1.2.1 1,5-Anhydro-2-O-tosyl-4,6-O-benzyliden-3-desoxy-D-glucitol (2)
- 15 g (63,8 mmol) 1,5-Anhydro-4,6-O-benzyliden-3-desoxy-D-glucitol (CMS Chemicals Ltd.) und 16,6 g (86,2 mmol) p-Toluolsulfonylchlorid wurden in 80 ml Pyridin gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde mit 300 ml Wasser versetzt, wodurch das Produkt auskristallisierte. Zur Vervollständigung der Kristallisation wurde der Ansatz 5 h lang bei +4°C gerührt. Der Feststoff wurde abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Hochvakuum über Indikator-Silikagel (mit Farbumschlag nach Blau) getrocknet, wodurch man 22,0 g (88%) eines farblosen Feststoffs erhielt.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 7,86 (d, 2H, Tos), 7,51 (d, 2H, Tos), 7,41-7,34 (m, 5H, Benzyliden), 5,56 (s, 1H, Benzyliden-CH), 4,56 (m, 1H, Glucitol-C-2), 4,18/4,14 (dd, 1H, Glucitol-CH), 3,84/3,80 (dd, 1H, Glucitol-CH), 3,62-3,53 (m, 2H, Glucitol-CH), 3,43-3,37 (m, 1H, Glucitol-CH), 3,31-3,25 (m, 1H, Glucitol-CH), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,14 (m, 1H, Glucitol-C-3-H), 1,75 (q, 1H, Glucitol-C-3-H) - 1.2.2 1,5-Anhydro-2-azido-4,6-O-benzyliden-2,3-didesoxy-D-mannitol (3)
- 10 g (25,0 mmol) 1,5-Anhydro-2-O-tosyl-4,6-O-benzyliden-3-desoxy-D-glucitol (2) und 6,5 g (100 mmol) Natriumazid wurden in 250 ml DMF gelöst und 4,5 h lang bei 130°C gerührt. Danach wurde das DMF abgedampft. Der Rückstand wurde in 400 ml Essigester gelöst und zweimal mit 200 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Na2SO4 getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde in 25 ml Essigester gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Essigester 2:3). Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 6,5 g (97%) eines farblosen Feststoffs erhielt.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 7,43-7,35 (m, 5H, Benzyliden), 5,65 (s, 1H, Benzyliden-CH), 4,17-4,12 (m, 2H, Mannitol-CH), 3,90-3,80 (m, 2H, Mannitol-CH), 3,72-3,65 (m, 2H, Mannitol-CH), 3,39-3,32 (m, 1H, Mannitol-C-2-H), 2,12-2,07 (m, 1H, Mannitol-C-3-H), 1,93-1,84 (m, 1H, Mannitol-C-3-H) - 1.2.3 1,5-Anhydro-2-azido-2,3-didesoxy-D-mannitol (4)
- 13 g (49,9 mmol) 1,5-Anhydro-2-azido-4,6-O-benzyliden-2,3-didesoxy-D-mannitol (3) wurden in 700 ml 80%iger Essigsäure gelöst und die Lösung wurde 1 h lang bei 80°C gerührt. Danach wurde der Ansatz auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 ml Essigester gelöst, wonach mit 250 ml n-Hexan versetzt wurde. Der Kolben wurde über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Der Überstand wurde abdekantiert und der ölige Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 8,0 g (93%) eines gelben Öls erhielt.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 4,98 (br s, 1H, OH), 4,58 (br s, 1H, OH), 3,81-3,77 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,70-3,65 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,57-3,37 (m, 3H, Mannitol-CH), 3,04-2,99 (m, 1H, Mannitol-C-2-H), 2,09-2,02 (m, 1H, Mannitol-C-3-H), 1,66-1,58 (m, 1H, Mannitol-C-3-H) - 1.2.4 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1,5-anhydro-2-azido-2,3-didesoxy-D-mannitol (5)
- 7,6 g (44 mmol) 1,5-Anhydro-2-azido-2,3-didesoxy-D-mannitol (4) wurden gemeinsam mit 3 × 40 ml Pyridin eingedampft und anschließend in 120 ml Pyridin gelöst. Danach wird innerhalb 1 h unter Rühren bei Raumtemperatur mit 19,6 g (53,3 mmol) 4,4'-Dimethoxytritylchlorid in 120 ml Pyridin versetzt. Der Ansatz wurde noch 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Pyridin eingedampft und der Rückstand wurde in 800 ml Essigester gelöst und zweimal mit 400 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 30 ml Essigester gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Essigester/1% Triethylamin – Gradient). Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 15,8 g (77%) eines gelblichen Schaums erhielt.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 7,41 (d, 2H, DMT), 7,32-7,18 (m, 7H, DMT), 6,87 (d, 4H, DMT), 4,86 (d, 1H, OH), 3,89 (m, 2H, Mannitol-C-1-H), 3,73 (s, 6H, OCH3), 3,60-3,55 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,48-3,43 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,34-2,27 (m, 2H, Mannitol-C-6-H), 2,99 (m, 1H, Mannitol-C-H-2), 2,09-2,04 (m, 1H, Mannitol-C-3-H), 1,68-1,59 (m, 1H, Mannitol-C-3-H) - 1.2.5 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1,5-anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-mannitol (6)
- 6,5 g (13,7 mmol) 6-O-DMT-1,5-anhydro-2-azido-2,3-didesoxy-D-mannitol (5) wurden in 70 ml Pyridin und 50 ml 32%igem wäßrigem Ammoniak gelöst und anschließend mit 6,1 g (23,3 mmol) Triphenylphosphan versetzt. Der Ansatz wurde 18 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in 400 ml Essigester gelöst und zweimal mit 200 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Essigester gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (Essigester/Methanol/1% Triethylamin – Gradient). Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 5,7 g (93%) eines farblosen Schaums erhielt.
1H-NMR (CDCl3, in ppm): 7,42 (d, 2H, DMT), 7,34-7,19 (m, 7H, DMT), 6,84 (d, 4H, DMT), 3,89-3,80 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,79 (s, 6H, OCH3), 3,69-3,65 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,52-3,46 (2m, 2H, Mannitol-CH), 3,32-3,26 (m, 2H, Mannitol-C-H-1), 3,13 (m, 1H, Mannitol-C-H-2), 2,10-1,90 (m, 4H, Mannitol-C-3-H, NH2, OH), 1,68-1,59 (m, 1H, Mannitol-C-3-H) - 1.2.6 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-(O,O'-dipivalyolfluoresceinyl-6-carboxamido)-1,5-anhydro-2,3-didesoxy-D-mannitol (7)
- 0,76 g (1,27 mmol) 6-Carboxylfluoresceindipivaloat und 155 μl (1,4 mmol) N-Methylmorpholin wurden in 15 ml DMF unter Ar-Atmosphäre gelöst. Danach wurde der Ansatz auf –25°C gekühlt und mit 170 μl (1,3 mmol) Chlorameisensäure-i-butylester versetzt. Nachdem der Ansatz 30 min. lang bei –25°C gerührt wurde, wurde innerhalb von 15 min. mit 0,56 g (1,27 mmol) 6-O-DMT-1,5-anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-mannitol (6) sowie 140 μl (1,3 mmol) N-Methylmorpholin in 10 ml DMF versetzt. Danach wurde 1 h lang bei –25°C gerührt. Nun wurde das DMF abgedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml Essigester gelöst und zweimal mit 100 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml Essigester gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Essigester/1% Triethylamin-Gradient). Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 0,92 g (75%) eines farblosen Feststoffs erhielt.
1H-NMR (CDCl3, in ppm): 8,09 (d, 1H, Fluorescein), 7,93 (d, 1H, Fluorescein), 7,56 (s, 2H, Fluorescein), 7,41 (d, 2H, DMT), 7,33-7,25 (m, 7H, DMT), 7,09 (s, 2H, Fluorescein), 6,85-6,79 (m, 8H, 4H von DMT, 4H von Fluorescein), 6,55 (d, 1H, NH), 4,35 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,91-3,70 (2m, 2H, Mannitol-CH), 3,81 (s, 6H, OCH3), 3,64-3,60 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,52-3,46 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,36-3,30 (m, 2H, Mannitol-CH), 2,88 (m, 1H, Mannitol-CH), 2,39 (m, 1H, Mannitol-C-3-H), 1,70-1,60 (m, 2H, Mannitol-C-3-H, OH), 1,37 (s, 18H, t-Butyl) - 1.2.7 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-(O,O'-dipivalyolfluoresceinyl-6-carboxamido)-1,5-anhydro-2,3-didesoxy-D-mannitol-4-O-[N,N-diisopropyl-(2-cyanoethyl)]-phosphoramidit (8)
- 0,92 g (0,94 mmol) 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-(O,O'-dipivalyol-fluoresceinyl-6-carboxamido)-1,5-anhydro-2,3-didesoxy-D-mannitol (7) wurden in 30 ml Dichlormethan unter Ar-Atmosphäre gelöst. Danach wurde mit 285 μl (1,67 mmol) N-Ethyldiisopropylamin und innerhalb von 15 min. mit 296 mg (1,26 mmol) Chlor-2-cyanoethyoxydiisopropylaminophosphan in 15 ml Dichlormethan versetzt. Der Ansatz wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nun wurde mit 150 ml Dichlormethan versetzt. Der Ansatz wurde zweimal mit 100 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml n-Hexan/Aceton 1:1 gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Aceton – Gradient). Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 0,9 g (81%) eines farblosen Schaums erhielt.
1H-NMR (CDCl3, in ppm): 8,02-6,76 (m, 23H, 13H vom DMT, 9H vom Fluorescein, NH), 4,35-3,12 (m, 11H, CH2OP, 7H vom Mannitol, CH (iPr)), 3,80/3,79 (2 s, 6H, OCH3), 2,47 (t, 2H, CH2CN), 2,35-2,13 (m, 1H, Mannitol-C-H-3), 1,85-1,72 (m, 1H, Mannitol-C-3-H), 1,37/1,32 (3s, 18H, t-Butyl), 1,07-0,84 (3d, 12H, CH3 vom iPr)
31P-NMR (CDCl3, in ppm): 150,1/148,2 - 1.2.8 1,5-Anhydro-2-Brom-4,6-O-benzyliden-2,3-didesoxy-D-mannitol (9)
- 3,0 g (7,8 mmol) 1,5-Anhydro-2-O-tosyl-4,6-O-benzyliden-3-desoxy-D-glucitol (2) und 2,2 g (25 mmol) Lithiumbromid wurden in 60 ml Pyridin gelöst und 7 Tage bei 60°C gerührt. Danach wurde das Pyridin abgedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml Essigester gelöst und mittels Flash-Chromatographie an Silikagel gereinigt (n-Hexan/Essigester-Gradient). Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 1,5 g (64%) eines farblosen Feststoffs erhielt.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 7,44-7,34 (m, 5H, Benzyliden), 5,72 (s, 1H, Benzyliden-CH), 4,80 (m, 1H, Mannitol-CH), 4,17 (m, 1H, Mannitol-CH), 4,08 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,94 (m, 2H, Mannitol-CH), 3,75 (t, 1H, Mannitol-CH), 3,46-3,39 (m, 1H, Mannitol-CH), 2,29-2,18 (m, 2H, Mannitol-C-3-H) - 1.2.9 1,5-Anhydro-2-azido-4,6-O-benzyliden-2,3-didesoxy-D-glucitol (10)
- 1,45 g (4,85 mmol) 1,5-Anhydro-2-brom-4,6-O-benzyliden-2,3-desoxy-D-mannitol (9) und 1,26 g (19,4 mmol) Natriumazid wurden in 30 ml DMF gelöst und 7 h lang bei 90°C gerührt. Danach wurde der Ansatz eingedampft und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Essigester 6:1). Die Produktfraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 0,83 g (66%) eines farblosen Feststoffs erhielt.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 7,44-7,36 (m, 5H, Benzyliden), 5,62 (s, 1H, Benzyliden-CH), 4,20-4,15 (m, 1H, Glucitol-CH), 4,00-3,96 (m, 1H, Glucitol-CH), 3,86-3,59 (2m, 3H, Glucitol-CH), 3,32-3,21 (m, 2H, Glucitol-CH), 2,42-2,38 (m, 1H, Glucitol-C-3-H), 1,59 (q, 1H, Glucitol-C-3-H) - 1.2.10 1,5-Anhydro-2-azido-2,3-didesoxy-D-glucitol (11)
- 0,8 g (3,1 mmol) 1,5-Anhydro-2-azido-4,6-O-benzyliden-2,3-didesoxy-D-glucitol (10) wurden in 80 ml 80%iger Essigsäure gelöst und 1 h bei 80°C gerührt. Danach wurde der Ansatz auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 4 ml Essigester gelöst und dann mit 40 ml n-Hexan versetzt. Der Überstand wurde abdekantiert und der ölige Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 0,52 g (98%) eines farblosen Öls erhielt.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 5,02 (db, 1H, OH), 4,52 (tb, 1H, OH), 3,90-3,85 (m, 1H, Glucitol-CH), 3,67-3,58 (m, 2H, Glucitol-CH), 3,40-3,31 (m, 2H, Glucitol-CH), 3,05-2,92 (2m, 2H, Glucitol-CH), 2,28 (m, 1H, Glucitol-C-3-H), 1,32 (q, 1H, Mannitol-C-3-H) - 1.2.11 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1,5-anhydro-2-azido-2,3-didesoxy-D-glucitol (12)
- 0,52 g (3,0 mmol) 1,5-Anhydro-2-azido-2,3-didesoxy-D-glucitol (11) wurden in 9 ml Pyridin gelöst. Danach wurde innerhalb von 30 min. unter Rühren bei Raumtemperatur mit 1,1 g (3,2 mmol) 4,4'-Dimethoxytritylchlorid in 9 ml Pyridin versetzt. Es wurde noch 3 h bei Raumtemperatur weitergerührt. Nun wurde das Pyridin abgedampft und der Rückstand wurde in 100 ml Essigester gelöst und zweimal mit 60 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml Essigester gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Essigester/1% Triethylamin-Gradient) im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 1,1 g (77%) eines farblosen Schaums erhielt.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 7,40 (d, 2H, DMT), 7,32-7,18 (m, 7H, DMT), 6,87 (d, 4H, DMT), 4,99 (d, 1H, OH), 3,99-2,98 (m, 7H, Glucitol-CH), 3,73 (s, 6H, OCH3), 2,30 (m, 1H, Glucitol-C-3-H), 1,34 (m, 1H, Glucitol-C-3-H) - 1.2.12 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1,5-anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-glucitol (13)
- 1,1 g (2,3 mmol) 6-O-DMT-1,5-Anhydro-2-azido-2,3-didesoxy-D-glucitol (12) wurden in 11 ml Pyridin und 9 ml 32%igem wäßrigem Ammoniak gelöst und anschließend wurde mit 1,0 g (3,9 mmol) Triphenylphosphan versetzt. Der Ansatz wurde 18 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in 180 ml Essigester gelöst und zweimal mit 100 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml Essigester gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Essigester/1% Triethylamin-Gradient) im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 0,94 g (91%) eines farblosen Schaums erhielt.
1H-NMR (DMSO-d6, in ppm): 7,40 (d, 2H, DMT), 7,31-7,12 (m, 7H, DMT), 6,87 (d, 4H, DMT), 4,67 (br s, 1H, OH), 3,77 (m, 1H, Glucitol-CH), 3,72 (s, 6H, OCH3), 3,50-3,06 (m, 5H, 3H Glucitol-CH, NH2), 2,96 (dd, 1H, Glucitol-CH), 2,82 (t, 1H, Glucitol-CH), 2,63 (m, 1H, Glucitol-CH), 2,06 (m, 1H, Glucitol-C-3-H), 1.07 (q, 1H, Glucitol-C-3-H) - 1.2.13 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-(O,O'-dipivalyolfluoresceinyl-6-carboxamido)-1,5-anhydro-2,3-didesoxy-D-glucitol (14)
- 1,22 g (2,0 mmol) 6-Carboxyfluoresceindipivaloat und 255 μl (2,25 mmol) N-Methylmorpholin wurden unter Ar-Atmosphäre in 25 ml DMF gelöst. Danach wurde der Ansatz auf –25°C gekühlt und mit 280 μl (2,1 mmol) Chlorameisensäure-i-butylester versetzt. Nachdem 30 min. lang bei –25°C gerührt worden war, wurde innerhalb von 30 min. mit 0,90 g (2,0 mmol) 6-O-DMT-1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-glucitol (13) sowie 225 μl (2,0 mmol) N-Methylmorpholin in 20 ml DMF versetzt. Danach wurde 1 h lang bei –25°C gerührt. Nun wurde das DMF abgedampft. Der Rückstand wurde in 150 ml Essigester gelöst und zweimal mit 100 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Essigester gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Essigester/1% Triethylamin-Gradient). Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 1,44 g (75%) eines farblosen Feststoffs erhielt.
1H-NMR (CDCl3, in ppm): 8,09 (d, 2H, Fluorescein), 7,42 (d, 2H, DMT), 7,33-7,22 (m, 8H, 7H vom DMT, 1H vom Fluorescein), 7,06 (d, 2H, Fluorescein), 6,85-6,77 (m, 8H, 4H vom DMT, 4H von Fluorescein), 6,33 (d, 1H, NH), 4,18 (m, 1H, Glucitol-CH), 4,03-3,98 (m, 1H, Glucitol- CH), 3,79 (s, 6H, OCH3), 3,75 (m, 1H, Glucitol-CH), 3,46 (m, 1H, Glucitol-CH), 3,31-3,26 (m, 2H, Glucitol-CH), 3,14-3,03 (m, 2H, Glucitol-CH), 2,31 (m, 1H, Mannitol-C-3-H), 1,62 (m, 1H, Mannitol-C-3-H), 1,40 (b, 1H, OH), 1,38 (s, 18H, t-Butyl) - 1.2.14 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-(O,O'-dipivalyolfluoresceinyl-6-carboxamido)-1,5-anhydro-2,3-didesoxy-D-glucitol-4-O-[N,N-diisopropyl-(2-cyanoethyl)]-phosphoramidit (15)
- 0,48 g (0,49 mmol) 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-(O,O'-dipivalyol-fluoresceinyl-6-carboxamido)-1,5-anhydro-2,3-didesoxy-D-glucitol (14) wurden unter Ar-Atmosphäre in 15 ml Dichlormethan gelöst. Danach wurde mit 160 μl (0,89 mmol) N-Ethyldiisopropylamin und innerhalb von 15 min. mit 170 mg (0,67 mmol) Chlor-2-cyanoethyloxydiisopropylaminophosphan in 7 ml Dichlormethan versetzt. Der Ansatz wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde mit 100 ml Dichlormethan versetzt. Es wurde zweimal mit 50 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml n-Hexan/Aceton 1:1 gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Aceton-Gradient). Die Produktfraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 0,51 g (88%) eines farblosen Feststoffs erhielt.
1H-NMR (CDCl3, in ppm): 8,12 (m, 2H, Fluorescein), 7,52-7,21 (m, 10H, 9H von DMT, 1H vom Fluorescein), 7,08 (m, 2H, Fluorescein), 6,86-6,78 (m, 8H, 4H vom DMT, 4H vom Fluorescein), 6,51/6,39 (2d, 1H, NH), 4,30-3,17 (m, 11H, CH2OP, 7H vom Glucitol, CH (iPr)), 3,80/3,79 (2s, 6H, OCH3), 2,54/2,36 (t, 2H, CH2CN), 2,45 (m, 1H, Glucitol-C-H-3), 1,78-1,60 (m, 1H, Glucitol-C-3-H), 1,38/1,37 (2 s, 18H, t-Butyl), 1,11-0,88 (4d, 12H, CH3 vom iPr)
31P-NMR (CDCl3, in ppm): 148,9/147,7 - 1.2.15 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-[N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-6-aminohexanoylamido]-1,5-anhydro-2,3-didesoxy-D-mannitol (16)
- 0,87 g (2,8 mmol) N-Fmoc-6-Aminohexansäure und 300 μl (3,0 mmol) N-Methylmorpholin wurden unter Ar-Atmosphäre in 25 ml DMF gelöst. Danach wurde der Ansatz auf –25°C abgekühlt und mit 350 μl (2,8 mmol) Chlorameisensäurei-buthylether versetzt. Nachdem 30 min. lang bei –25°C gerührt worden war, wurde innerhalb von 15 min. mit 1,2 g (2,5 mmol) 6-O-DMT-1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-mannitol (6) und 270 μl (2,5 mmol) N-Methylmorpholin in 15 ml DMF versetzt. Danach wurde der Ansatz 1 h bei –25°C gerührt. Nun wurde das DMF abgedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml in Essigester gelöst und zweimal mit 100 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml n-Hexan/Essigester 1:4 gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Essigester-Gradient). Die Produktfraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 1,35 g (70%) eines farblosen Schaums erhielt.
1H-NMR (CDCl3, in ppm): 7,76 (d, 2H, Fmoc), 7,58 (d, 2H, Fmoc), 7,43-7,17 (m, 13H, 9H von DMT, 4H von Fmoc), 6, 84 (d, 4H, DMT), 5, 93 (d, 1H, NH), 4, 89 (tb, 1H, NH), 4,37 (d, 2H, Fmoc), 4,20 (m, 2H, 1H vom Mannitol-CH, 1H von Fmoc), 3,79-3,67 (m, 1H, Mannitol-CH), 3,77 (s, 6H, OCH3), 3,56-3,01 (5m, 7H, 5H Mannitol-CH, CH2N), 2, 25 (m, 1H, Mannitol-C-3-H), 2,17 (t, 2H, CH2CO), 1,65-1,33 (3m, 8H, Mannitol-C-3-H, OH, CH2 vom Hexanoyl) - 1.2.16 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-[N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-6-aminohexanoylamido]-1,5-anhydro-2,3-didesoxy-D-mannitol,-4-O-[N,N-diisopropyl-(2-cyanoethyl)]phosphoramidit (17)
- 1,3 g (1,69 mmol) 6-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2-[N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-6-aminohexanoylamido]-1,5-anhydro-2,3-didesoxy-D-mannitol (16) wurden unter Ar-Atmosphäre in 45 ml Dichlormethan gelöst. Danach wurde mit 550 μl (3,07 mmol) N-Ethyldiisopropylamin und innerhalb von 15 min. mit 590 mg (2,31 mmol) Chlor-2-cyanoethyoxydiisopropylaminophosphan in 20 ml Dichlormethan versetzt. Der Ansatz wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde mit 100 ml Dichlormethan versetzt. Es wurde zweimal mit 100 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml n-Hexan/Aceton 1:1 gelöst und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel gereinigt (n-Hexan/Aceton-Gradient). Die Produktfraktionen wurden vereinigt, eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man 1,5 g (90%) eines farblosen Schaums erhielt.
1H-NMR (CDCl3, in ppm): 7,77 (d, 2H, Fmoc), 7,61 (d, 2H, Fmoc), 7,50 (d, 2H, Fmoc), 7,43-7,19 (m, 11H, 9H vom DMT, 2H vom Fmoc), 6,82 (d, 4H, DMT), 6,31 (d, 1H, NH), 4,90 (t, 1H, NH), 4,38 (d, 2H, Fmoc), 4,22-3,10 (5m, 14H, 7H von Mannitol-CH, 1H vom Fmoc, CH2OP,m CH2N, CH (iPr), 3,78 (s, 6H, OCH3), 2,78/2,58 (2t, 2H, CH2CN), 2,35 (m, 1H, Mannitol-C-3-H), 2,19 (m, 2H, CH2CO), 1,78-1,27 (2m, 7H, Mannitol-C-3-H, CH2 vom Hexanoyl), 1,06/0,89 (2d, 12H, CH3 (iPr))
31P-NMR (CDCl3, in ppm): 150,0/148,3 - 1.3 Synthese von modifizierten Oligonukleotiden unter Verwendung von Phosphoramiditen
- FAM-Mannitol- (8) oder FAM-Glucitol- (15) -phosphoramidite können in Oligonukleotide mit Hilfe der automatischen Oligonukleotidsynthese unter Verwendung des Phosphoramiditansatzes eingebaut und mit z.B. dem FAM-cx-Biogenex-Linker verglichen werden (
2 ). Die unterschiedlichen Sonden können in unterschiedlichen Formaten nach Standardmethoden geprüft werden und schneiden bezüglich Hintergrundsignal, Signalverstärkung und cT-Wert, z.B. im TagMan®-Format, vergleichbar gut ab. - 1.4 Synthese von modifizierten Oligonukleotiden mit Nachmarkierung
- Um Marker nach der Synthese einbauen zu können, wurde ein durch Fmoc geschützter 6-Aminocaproyl-Bindegliedrest an den Mannitbaustein 6 gekoppelt und das Zwischenprodukt 16 wurde anschließend in ausgezeichneter Ausbeute in das entsprechende 6-O-DMT-1,5-Anhydro-2,3-didesoxy-2-(N-Fmoc-6-aminocaproyl-amido)-D-mannitol-4-phosphoramidit (17) umgewandelt, wobei analoge Reaktionsbedingungen wie oben beschrieben (1.2.15 und 1.2.16) angewandt wurden (
3 ). Die Verbindung 17 wurde mittels 1H-NMR, 31P-NMR und HPLC charakterisiert. Das Monomer 17 konnte mit hoher Kopplungsausbeute in Oligonukleotide eingebaut werden. Nach Abspaltung von dem Syntheseträger und Entschützung waren mehrere Marker (Cumarine, Rhodamine, Cyanine usw.) erfolgreich eingebaut. - 1.5 Hybridisierungsversuche mit modifizierten Oligonukleotiden
- Die in
4 dargestellten Oligonukleotide und modifizierten Oligonukleotide wurden wie oben beschrieben (1.3) synthetisiert und durch Bestimmung des Schmelzpunkts nach Standardverfahren auf ihr Hybridisierungsverhalten in PCR-Puffer (50 mM Tris, 3 mM Magnesiumchlorid) geprüft. Der Schmelzpunkt wurde bei 260 nm mit einem Uvikon-Photometer Typ 931, Kontron Instruments, bestimmt. Die Endkonzentration von jedem Oligonukleotidstrang im Tm-Puffer betrug 1 μM. Temperaturprofil: 15°C-95°C über 160 min. (Aufheizen und Abkühlen); Aufheizgeschwindigkeit: 0,5°C/min. - Man sieht, daß die modifizierten Oligonukleotide die Fähigkeit, mit komplementären Oligonukleotiden zu hybridisieren, beibehalten (siehe
4 ). - Literatur
-
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stammt,
in der R2 und R3 unabhängig voneinander und von R1 oder R4 sind und in der R2 und R3 aus der Gruppe
stammen,
mit der Maßgabe, daß R3 jedoch nicht R2 Triphosphat bedeuten kann und, wenn R3 ein Triphosphat bedeutet, R1 keine Festphase bedeutet,
mit der Maßgabe, daß R2 und R3 nicht zugleich eine Festphase, R2 und R3 nicht zugleich ein Phosphoramidit,
R2 und R3 nicht zugleich ein H-Phosphonat, R2 und R3 nicht zugleich -H oder R2 und R3 nicht zugleich eine Schutzgruppe bedeuten können oder daß R2 und R3 nicht zugleich ein Phosphoramidit und ein H-Phosphonat, oder nicht zugleich eine Festphase und ein Phosphoramidit oder nicht zugleich eine Festphase und H-Phosphonat bedeuten,
sowie mit der Maßgabe, daß, wenn ein Rest aus der Gruppe R1, R2 oder R3 eine Festphase bedeutet, die anderen beiden Reste aus der Gruppe R1, R2 oder R3 nicht eine Festphase bedeuten.
stammt,
in der R5 und R6 voneinander unabhängig und von R4 oder R7 unabhängig sind, und in der R5 und R6 aus der Gruppe
mit der Maßgabe, daß R5 und R6 nicht zugleich -H bedeuten, oder daß R5 und R6 nicht zugleich eine Festphase und ein Bindeglied X bedeuten, oder daß R5 und R6 nicht zugleich Phosphat bedeuten, oder daß R5 und R6 nicht zugleich -H und ein Phosphat bedeuten,
sowie mit der Maßgabe, daß, wenn ein Rest aus der Gruppe R5, R6 oder R7 eine Festphase bedeutet, die anderen Reste aus der Gruppe R5, R6 oder R7 nicht eine Festphase bedeuten.
Claims (31)
- Verbindung der Formel I,in der Y aus der Gruppe O, S, und NR4, wobei R4 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Acyl, eine Schutzgruppe oder H bedeutet, stammt, in der X ein Bindeglied bedeutet, wobei n 0 oder 1 bedeutet, in der R1 von R2, R3 und R4 unabhängig ist und aus der Gruppe (1) Schutzgruppe, (2) Markierung und (3) Festphase stammt, in der R2 und R3 unabhängig voneinander und von R1 oder R4 sind und in der R2 und R3 aus der Gruppe (1) -H, (2) Schutzgruppe, (3) Festphase und Bindeglied X (4) Phosphoramidit (5) H-Phosphonat und (6) Triphosphat stammen, mit der Maßgabe, daß R3 jedoch nicht R2 Triphosphat bedeuten kann und, wenn R3 ein Triphosphat bedeutet, R1 nicht eine Festphase bedeutet, mit der Maßgabe, daß R2 und R3 nicht zugleich eine Festphase, R2 und R3 nicht zugleich ein Phosphoramidit, R2 und R3 nicht zugleich ein H-Phosphonat, R2 und R3 nicht zugleich -H oder R2 und R3 nicht zugleich eine Schutzgruppe bedeuten können oder daß R2 und R3 nicht zugleich ein Phosphoramidit und ein H-Phosphonat, oder nicht zugleich eine Festphase und ein Phosphoramidit oder nicht zugleich eine Festphase und H-Phosphonat bedeuten, sowie mit der Maßgabe, daß, wenn ein Rest aus der Gruppe R1, R2 oder R3 eine Festphase bedeutet, die anderen beiden Reste aus der Gruppe R1, R2 oder R3 nicht eine Festphase bedeuten.
- Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindeglied X Kohlenstoff- und Sauerstoffatome umfaßt.
- Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindeglied X Reste -(CH2)m oder – (CH2CH2O)m umfaßt, wobei m eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 bedeutet.
- Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindeglied X aus der Gruppe
- Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Y O bedeutet.
- Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe aus der Reihe (1) Fluorenylmethoxycarbonyl, (2) Dimethoxytrityl, (3) Monomethoxytrityl, (4) Trifluoracetyl, (5) Levulinyl und (6) Silyl stammt.
- Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker aus der Gruppe (1) Fluoresceinfarbstoff, (2) Rhodaminfarbstoff, (3) Cyaninfarbstoff und (4) Cumarinfarbstoff stammt.
- Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Verbindung um ein Derivat von 1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-mannitolol oder 1,5-Anhydro-2-amino-2,3-didesoxy-D-glucitolol handelt.
- Oligomere Verbindung, die eine monomere Einheit der Formel II enthält,in der Y aus der Gruppe O, S, und NR4, wobei R4 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Acyl, eine Schutzgruppe oder H bedeutet, stammt; in der X ein Bindeglied bedeutet, wobei n 0 oder 1 bedeutet, in der der R7 von R4, R5 und R6 unabhängig ist und in der R7 aus der Gruppe (1) -H, (2) Schutzgruppe, (3) Marker (4) Oligonukleotid und (5) Festphase stammt, in der R5 und R6 voneinander unabhängig und von R4 oder R7 unabhängig sind und in der R5 und R6 aus der Gruppe (1) -H, (2) Festphase und Bindeglied X, (3) Phosphat und (4) Phosphodiester mit einem Nukleotid, einem modifizierten Nukleotid, einem Oligonukleotid oder einem modifizierten Oligonukleotid stammen, mit der Maßgabe, daß R5 und R6 nicht zugleich -H bedeuten, oder daß R5 und R6 nicht zugleich eine Festphase und ein Bindeglied X bedeuten, oder daß R5 und R6 nicht zugleich Phosphat bedeuten, oder daß R5 und R6 nicht zugleich -H und ein Phosphonat bedeuten, sowie mit der Maßgabe, daß, wenn ein Rest aus der Gruppe R5, R6 oder R7 eine Festphase bedeutet, die anderen beiden Reste aus der Gruppe R5, R6 oder R7 nicht eine Festphase bedeuten.
- Oligomere Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindeglied X Kohlenstoff- und Sauerstoffatome umfaßt.
- Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindeglied X Reste – (CH2)m oder – (CH2CH2O)m umfaßt, wobei m eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 bedeutet.
- Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindeglied X aus der Gruppe
- Oligomere Verbindung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß Z NH bedeutet und Y O bedeutet.
- Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe aus der Reihe (1) Fluorenylmethoxycarbonyl, (2) Dimethoxytrityl, (3) Monomethoxytrityl, (4) Trifluoracetyl, (5) Levulinyl oder (6) Silyl stammt.
- Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Marker um einen Fluoreszenzmarker handelt.
- Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das modifizierte Oligonukleotid eine monomere Einheit umfaßt, bei der es sich um (1) ein Bindeglied mit einem zweiten Marker, der an ein Nukleotid gebunden ist, oder um (2) ein Bindeglied mit einem zweiten Marker, der an ein modifiziertes Nukleotid oder eine Nichtnukleotidverbindung gebunden ist, handelt.
- Oligomere Verbindung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zweiten Marker um einen zweiten Fluoreszensmarker handelt.
- Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzmarker oder der zweite Fluoreszenzmarker aus der Gruppe (1) Fluoresceinfarbstoff, (2) Rhodaminfarbstoff, (3) Cyaninfarbstoff und (4) Cumarinfarbstoff stammt.
- Oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die oligomere Verbindung nicht enzymatisch verlängert werden kann.
- Oligomere Verbindung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der monomeren Einheit am 3'-Ende der oligomeren Verbindung um – ein 2',3'-Didesoxynukleotid oder – ein 3'-Phosphoryliertes Nukleotid handelt.
- Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei R2 ein Phosphoramidit oder eine Festphase mit einem Bindeglied X bedeutet und R3 eine Schutzgruppe bedeutet, für die chemische Synthese einer oligomeren Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 20.
- Verwendung einer oligomeren Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 20 in einer Hybridisierungsreaktion mit einer Nukleinsäure.
- Verwendung einer oligomeren Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 20 als Primer, Sonde oder Fangsonde.
- Verfahren für die chemische Synthese einer oligomeren Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 20, das folgende Schritte umfaßt: (a) Bereitstellen einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei R2 Phosphoramidit bedeutet und R3 eine Schutzgruppe bedeutet, (b) Bereitstellen einer 5'-OH-Grupe eines Nukleosids oder eines modifizierten Nukleosids, das über die 3'-OH-Gruppe an eine Festsphase gebunden ist oder Bereitstellen einer 5'-OH-Gruppe eines Oligonukleotids oder eines modifizierten Oligonukleotids, das an die Festphase über die 3'-OH-Gruppe des Nukleosids oder des modifizierten Nukleosids am 3'-Ende des Oligonukleotids bzw. des modifizierten Oligonukleotids gebunden ist, (c) Umsetzen des Phosphoratoms des Phosphoramidits mit der 5'-OH-Gruppe unter Bildung eines Phosphitesters und Oxidieren des Phosphitesters zu einem Phosphortriester (d) gegebenenfalls Umsetzen einer nicht umgesetzten 5'-OH-Gruppe aus Schritt (c) mit einer anderen Verbindung, um weitere Reaktionen der nichtreagierten 5'-OH-Gruppe aus Schritt (c) in den anschließenden Schritten zu vermeiden. (e) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (a) bis (d) mit Phosphoramiditderivaten von Nukleosiden oder modifizierten Nukleosiden nach Entfernen der Schutzgruppe der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, und (f) Abspalten der oligomeren Verbindung von der Festphase, Entfernen der Schutzgruppen und dadurch Umwandeln des Phosphotriesters in einen Phosphodiester, sowie (g) Isolierung der oligomeren Verbindung.
- Verfahren für die enzymatische Synthese einer polymeren Verbindung oder einer oligomeren Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 20, das folgende Schritte umfaßt: (a) Inkubieren einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei R3 dieser Verbindung ein Triphosphat bedeutet, mit einer 3'-OH-Gruppe des Nukleotids oder modifizierten Nukleotids am 3'-Ende eines Polynukleotids, Oligonukleotids, modifizierten Olionukleotids in Gegenwart einer terminalen Transferase, wodurch die Verbindung an das 3'-OH gebunden wird, wodurch Pyrophosphat freigesetzt wird, und (b) Isolieren der polymeren oder oligomeren Verbindung.
- Verfahren zum Binden eines Markers an eine oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 20, wobei R7 der oligomeren Verbindung eine Schutzgruppe bedeutet, das die folgenden Schritte umfaßt (a) Entfernen der Schutzgruppe R7, und (b) Umsetzen des entschützten Rests der oligomeren Verbindung mit dem Marker.
- Verfahren zum Nachweisen einer Zielnukleotidsäure in einer Probe, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Bereitstellen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie die Zielnukleinsäure enthält, (b) Bereitstellen einer oligomeren Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 20, die im Wesentlichen zu der Zielnukleinsäure teilweise oder ganz komplementär ist, (c) gegebenenfalls Amplifizieren der Zielnukleinsäure mit einer matrizenabhängigen DNA-Polymerase und Primern, (d) In-Kontakt-Bringen der Probe mit der oligomeren Verbindung unter Bedingungen, unter denen die oligomere Verbindung an die Zielnukleinsäure binden kann, (e) Bestimmen des Bindungsprodukts bzw. des Ausmaßes der Hybridisierung zwischen der Zielnukleinsäure und der oligomeren Verbindung als Maß für das Vorliegen, das Fehlen bzw. die Menge der Zielnukleinsäure.
- Verfahren nach Anspruch 27, wobei es sich bei der oligomeren Verbindung um eine oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 15 bis 20 handelt.
- Verfahren nach Anspruch 27 bis 28, wobei in Schritt (d) das Ausmaß der Hybridisierung durch die Menge des ersten oder zweiten Fluoreszenzmarkers, der aus der mit der Zielnukleinsäure hybridisierten oligomeren Verbindung durch Exonuklease-Hydrolyse durch die matrizenanhängige DNA-Polymerase freigesetzt wird, bestimmt wird.
- Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens einer Zielnukleinsäure in einer Probe, das die folgenden Schritte umfaßt: Durchführen von mindestens einem Zyklusschritt, wobei ein Zyklusschritt einen Amplifikationsschritt und einen Hybridisierungsschritt umfaßt, wobei bei dem Amplifikationsschritt die Probe mit Primern in Kontakt gebracht wird, um, wenn Zielnukleinsäure in der Probe vorliegt, ein Amplifikationsprodukt zu erzeugen, wobei bei dem Hybridisierungsschritt die Probe mit einem Sondenpaar in Kontakt gebracht wird, wobei es sich bei mindestens einer der Sonden um eine oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 9-20 handelt, wobei R7 einen Marker bedeutet, wobei die Bestandteile dieses Sondenpaares innerhalb nicht mehr als fünf Nukleotide voneinander zu dem Amplifikationsprodukt hybridisieren, wobei eine erste Sonde dieses Sondenpaars mit einem Donatorfluoreszenzmarker markiert ist und wobei eine zweite Sonde des Sondenpaars mit einem entsprechenden Akzeptorfluoreszenzmarker markiert ist; sowie Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens von Fluoreszenzresonanzenergietransfer zwischen dem Donatorfluoreszenzmarker der ersten Sonde und dem Akzeptorfluoreszenzmarker der zweiten Sonde, wobei das Vorliegen eines Fluoreszenzresonanzenergietransfers das Vorliegen der Zielnukleinsäure in der Probe anzeigt und wobei das Fehlen eines Fluoreszenzresonanzenergietransfers das Fehlen der Zielnukleinsäure in der Probe anzeigt.
- Aus Teilen bestehendes Kit, das – eine matrizenabhängige Polymerase mit 3'→ 5'-Exonukleaseaktivität, – einen Satz Primer, – Nukleotide sowie – eine oligomere Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 20, wobei R7 einen Marker bedeutet, umfaßt.
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