DE112007002932T5

DE112007002932T5 - Vierfahren DNA-Sequenzierung mittels Synthese unter Verwendung von abspaltbaren, reversiblen, fluoreszierenden Nucleotidterminatoren

Info

Publication number: DE112007002932T5
Application number: DE112007002932T
Authority: DE
Inventors: Jingyue Ju; Dae Hyun Kim; Lanrong Bi; Qinglin Meng; Xiaoxu Li
Original assignee: Columbia University of New York
Current assignee: Columbia University of New York
Priority date: 2006-12-01
Filing date: 2007-11-30
Publication date: 2009-10-08
Anticipated expiration: 2027-12-01
Also published as: US20130280700A1; GB2457402B; US8298792B2; DE112007002932T8; GB0909600D0; US9528151B2; US20210381043A1; US11098353B2; DE112007002932B4; WO2008069973A2; US11939631B2; US7883869B2; GB2457402A; WO2008069973A3; US20170114403A1; US10000801B2; US20190136308A1; WO2008069973A8; US20100092952A1; US20120021408A1

Abstract

Ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer DNA, umfassend die Durchführung der nachfolgenden Schritte für jeden Rest der zu sequenzierenden DNA:
(a) Inkontaktbringen der DNA mit einer DNA-Polymerase in der Anwesenheit von (i) einem Primer und (ii) vier Nucleotidanaloga unter Bedingungen, die es der DNA-Polymerase gestatten, DNA-Synthese zu katalysieren, wobei (1) die Nucleotidanaloga aus einem Analogon von dGTP, einem Analogon von dCTP, einem Analogon von dTTP oder dUTP sowie einem Analogon von dATP bestehen, (2) jedes Nucleotidanalogon umfasst: (i) eine Base ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil sowie Analoga davon, (ii) eine Desoxyribose, (iii) einen Rest, der in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebunden ist, und (iv) eine spezifische Markierung, die in abspaltbarer Weise an die Base gebunden ist, so dass ein Nucleotidanalogon, das zu dem sequenzierten Rest komplementär ist, durch die DNA-Polymerase in die DNA integriert wird, und (3) jedes...

Description

Die hier offenbarte Erfindung wurde mit Unterstützung des NIH-Zuschusses P50-HG002806 der US-Regierung fertig gestellt. Demzufolge hat die US-Regierung gewisse Rechte an dieser Erfindung.
Innerhalb dieser Anmeldung werden verschiedene Veröffentlichungen als Referenz mit einer Nummer in Klammern angegeben. Vollständige Angaben zu diesen Referenzen sind am Ende der Anmeldung unmittelbar vor den Ansprüchen zu finden. Der Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichungen wird hiermit in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung eingeschlossen, um den Stand der Technik umfassender zu beschreiben, von dem die vorliegende Erfindung ausgeht.
Hintergrund der Erfindung
DNA-Sequenzierung ist die treibende Kraft für Genomforschung und neue Entdeckungen. Die Fertigstellung des Humangenomprojekts bereitete den Weg für das Screening genetischer Mutationen zur Identifikation von Krankheitsgenen im gesamten Genom (1). Es werden exakte Hochdurchsatzverfahren der DNA-Sequenzierung benötigt, um die gesamte menschliche Genomsequenz für Anwendungen in der klinischen Medizin und im Gesundheitswesen zu erforschen. Um die Einschränkungen der gegenwärtig gebräuchlichen auf Elektrophorese basierenden Sequenzierungstechnologie (2–5) zu überwinden, wurde eine Reihe von neuen DNA-Sequenzierungsverfahren untersucht. Solche Ansätze schließen ein: Sequenzierung mittels Hybridisierung (6), auf Massenspektrometrie basierende Sequenzierung (7–9), sequenzspezifische Detektion von einzelsträngiger DNA unter Verwendung von erzeugten Nanoporen (10) sowie die Sequenzierung mittels Ligation (11). In jüngerer Zeit wurden Ansätze zur DNA-Sequenzierung mittels Synthese (SBS), wie zum Beispiel Pyrosequenzierung (12), Sequenzierung einzelner DNA-Moleküle (13) und Polymerasekolonien (14), umfangreich erforscht.
Das Konzept der DNA-Sequenzierung mittels Synthese (SBS) wurde im Jahr 1988 mit einem Versuch zur Sequenzierung von DNA mittels Detektion der Pyrophosphatgruppe entwickelt, die erzeugt wird, wenn ein Nucleotid im Rahmen einer DNA-Polymerasereaktion integriert wird (15). Die Pyrosequenzierung, die auf der Grundlage dieses Konzepts sowie einer Enzymkaskade entwickelt wurde, wurde für die Genomsequenzierung erforscht (16). Dieses Verfahren birgt jedoch inhärente Schwierigkeiten bezüglich der Bestimmung der Anzahl integrierter Nucleotide in homopolymeren Regionen des Templates. Zusätzlich dazu muss jedes der vier Nucleotide separat hinzugefügt und detektiert werden, was die Gesamtdetektionszeit verlängert. Die Akkumulation nicht degradierter Nucleotide und anderer Komponenten könnte im Falle einer Sequenzierung eines langen DNA-Templates ebenfalls die Genauigkeit des Verfahrens herabsetzen. Es ist daher wünschenswert, ein einfaches Verfahren zur direkten Detektion einer Reportergruppe zur Verfügung zu haben, die an dem Nucleotid befestigt ist, das in der Polymerasereaktion in einen wachsenden DNA-Strang integriert wird, anstatt sich auf eine komplexe Enzymkaskade zu verlassen. Das SBS-System, das auf Fluoreszenzdetektion gekoppelt mit einem Chipformat basiert, verfügt über das Potential, den Durchsatz von DNA-Sequenzierungsprojekten beträchtlich zu erhöhen. Demzufolge erforschten mehrere Gruppen ein derartiges System mit der Zielsetzung, ein Ultra-Hochdurchsatzverfahren zur DNA-Sequenzierung zu entwickeln (17–18). Bislang wurde kein umfassender Erfolg bezüglich der Verwendung eines derartigen Systems zur eindeutigen DNA-Sequenzierung veröffentlicht.
Bisher in der Literatur veröffentlichte Arbeiten zur Erforschung des SBS-Verfahrens konzentrieren sich größtenteils auf das Entwickeln und die Synthese eines abspaltbaren chemischen Rests, der an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist, um die 3'-OH-Gruppe der Nucleotide zu schützen (19–21). Das Grundprinzip besteht darin, dass die 3'-OH-Gruppe nach der Entfernung des Fluorophors regeneriert würde, um die nachfolgende Nucleotidaddition zu gestatten. Es wurde jedoch bislang nicht von einer erfolgreichen Integration eines solchen Nucleotids mit einem abspaltbaren Fluoreszenzfarbstoff an der 3'-Position durch DNA-Polymerase in einen wachsenden DNA-Strang berichtet. Der Grund dafür liegt darin, dass die 3'-Position auf der Desoxyribose sehr nah an den Aminosäureresten in der aktiven Stelle der Polymerase liegt und die Polymerase daher sensitiv gegenüber einer Modifikation in diesem Bereich des Riboserings ist, insbesondere bei einem großen Fluorophor (22).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer DNA bereit, umfassend die Durchführung der nachfolgenden Schritte für jeden Rest der zu sequenzierenden DNA:

(a) Inkontaktbringen der DNA mit einer DNA-Polymerase in der Anwesenheit von (i) einem Primer und (ii) vier Nucleotidanaloga unter Bedingungen, die es der DNA-Polymerase gestatten, DNA-Synthese zu katalysieren, wobei (1) die Nucleotidanaloga aus einem Analogon von dGTP, einem Analogon von dCTP, einem Analogon von dTTP oder dUTP sowie einem Analogon von dATP bestehen, (2) jedes Nucleotidanalogon umfasst: (i) eine Base ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil sowie Analoga davon, (ii) eine Desoxyribose, (iii) einen Rest, der in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebunden ist, und (iv) eine spezifische Markierung, die in abspaltbarer Weise an die Base gebunden ist, so dass ein Nucleotidanalogon, das zu dem sequenzierten Rest komplementär ist, durch die DNA-Polymerase in die DNA integriert wird, und (3) jedes der vier Analoga eine spezifische Markierung aufweist, die sich von den spezifischen Markierungen der drei anderen Analoga unterscheidet;
(b) Entfernen von nicht gebundenen Nucleotidanaloga;
(c) erneutes Inkontaktbringen der DNA mit einer DNA-Polymerase in der Anwesenheit von (i) einem Primer und (ii) vier reversiblen Terminatoren unter Bedingungen, die es der DNA-Polymerase gestatten, DNA-Synthese zu katalysieren, wobei (1) die reversiblen Terminatoren aus einem Analogon von dGTP, einem Analogon von dCTP, einem Analogon von dTTP oder dUTP sowie einem Analogon von dATP bestehen, (2) jedes Nucleotidanalogon umfasst: (i) eine Base ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil sowie Analoga davon, wobei an diese Base keine spezifische Markierung gebunden ist, (ii) eine Desoxyribose und (iii) einen Rest, der in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebunden ist;
(d) Entfernen von nicht gebundenen reversiblen Terminatoren;
(e) Bestimmen der Identität des in Schritt (a) integrierten Nucleotidanalogons über Bestimmung der Identität der entsprechenden spezifischen Markierung, mit der Maßgabe, dass Schritt (e) entweder vor Schritt (c) oder im Anschluss an Schritt (d) erfolgen kann; und
(f) im Anschluss an Schritt (e), außer in Bezug auf den letzten zu sequenzierenden DNA-Rest, Abspalten der spezifischen Markierung von den integrierten Nucleotidanaloga, sofern anwendbar, sowie des an das 3'-Sauerstoffatom der Desoxyribose gebundenen Rests,

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bereit, umfassend, in separaten Kompartimenten,

(a) Nucleotidanaloga von (i) GTP, (ii) ATP, (iii) CTP und (iv) TTP oder UTP, wobei jedes Analogon umfasst: (i) eine Base, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil oder einem Analogon davon, (ii) eine Desoxyribose, (iii) einen an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebundenen abspaltbaren Rest und (iv) eine spezifische Markierung, die über eine abspaltbaren Linker an die Base gebunden ist;
(b) reversible Terminatoren, umfassend ein Nucleotidanalogon von (i) GTP, (ii) ATP, (iii) CTP und (iv) TTP oder UTP, wobei jedes Analogon umfasst: (i) eine Base, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil oder einem Analogon davon, wobei an diese Base keine spezifische Markierung gebunden ist, (ii) eine Desoxyribose und (iii) einen an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebundenen abspaltbaren Rest;
(c) für die Verwendung bei DNA-Polymerisation geeignete Reagenzien; und
(d) eine Gebrauchsanweisung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Es wird ein Chip mit immobilisierten DNA-Templaten konstruiert, die zum Selbstpriming zur Initiation der Polymerasereaktion in der Lage sind. Vier Nucleotidanaloga werden so konstruiert, dass jedes an der spezifischen Stelle der Base mittels eines abspaltbaren Linkers mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff sowie mit einem kleinen, chemisch reversiblem Rest (R) zum Schutz der 3'-OH-Gruppe markiert ist. Beim Zugeben der vier Nucleotidanaloga und von DNA-Polymerase wird auf jedem Spot des Chips nur das zum nächsten Nucleotid auf dem Templat komplementäre Nucleotidanalogon mittels Polymerase integriert (Schritt 1). Es wird ein Vierfarben-Fluoreszenz-Imager verwendet, um die Oberfläche des Chips abzubilden, und die spezifische Fluoreszenzemission des spezifischen Farbstoffs auf den Nucleotidanaloga auf jedem Spot des Chips wird die Identität des Nucleotids ergeben (Schritt 2). Im Anschluss an das Abbilden wird die geringe Menge an nicht umgesetzter 3'-OH-Gruppe auf dem selbstgeprimten Templatrest mittels überschüssiger ddNTPs und DNA-Polymerase geschützt, um eine Interferenz mit dem nächsten Synthesezyklus zu vermeiden, oder mittels 3'-O-Allyl-dNTPs, um die Integration zu synchronisieren (Schritt 3). Der Farbstoffrest und die R schützende Gruppe werden entfernt, um mit hoher Ausbeute eine freie 3'-OH-Gruppe zu erzeugen (Schritt 4). Der selbstgeprimte DNA-Rest auf dem Chip ist in diesem Stadium bereit für den nächsten Reaktionszyklus, um die nächste Nucleotidsequenz der Templat-DNA zu identifizieren (Schritt 5).
2. Strukturen von 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510 (λ_abs(max) = 502 nm; λ_em(max) = 510 nm), 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G (λ_abs(max) = 525 nm; λ_em(max) = 550 nm), 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX (λ_abs(max) = 585 nm; λ_em(max) = 602 nm) und 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650 (λ_abs(max) = 630 nm; λ_em(max) = 650 nm).
3. Das Polymerase-Extensionsschema (links) und die MALDI-TOF-MS-Spektren der vier aufeinanderfolgenden Extensionsprodukte und deren deallylierter Produkte (rechts). Primer, extendiert mit 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G (1), und dessen deallyliertes Produkt 2; Produkt 2, extendiert mit 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650 (3), und dessen deallyliertes Produkt 4; Produkt 4, extendiert mit 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX (5), und dessen deallyliertes Produkt 6; Produkt 6, extendiert mit 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510 (7), und dessen deallyliertes Produkt 8. Nach 30 Sekunden Inkubation mit dem Palladium/TPPTS-Cocktail bei 70°C ist die Deallylierung bei beiden Fluorophoren abgeschlossen und die 3'-O-Allyl-Gruppen sind von den extendierten DNA-Produkten abgespalten.
4. DNA-Extensionsreaktion, durchgeführt in Lösungsphase zur Kennzeichnung der vier verschiedenen chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotidanaloga (3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G, 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510). Nach jeder Extensionsreaktion wird das DNA-Extensionsprodukt mittels HPLC für die MALDI-TOF-MS-Messung aufgereinigt, um zu verifizieren, dass es sich um das korrekte Extensionsprodukt handelt. Es wird eine Pdkatalysierte Deallylierungsreaktion durchgeführt, um ein DNA-Produkt zu erzeugen, das als Primer für die nächste DNA-Extensionsreaktion verwendet wird.
5. Herstellung eines azidfunktionalisierten Glaschips durch einen PEG-Linker zur Immobilisierung von alkynmarkiertem selbstprimendem DNA-Templat für SBS.
6. (A) Reaktionsschema von SBS auf einem Chip unter Verwendung von vier chemisch abspaltbaren fluoreszierenden Nucleotiden. (B) Die gescannten vierfarbigen Fluo reszenzbilder für jeden SBS-Schritt auf einem Chip: (1) Integration von 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5; (2) Abspaltung von Allyl-Cy5 und der 3'-Allyl-Gruppe; (3) Integration von 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX; (4) Abspaltung von Allyl-ROX und der 3'-Allyl-Gruppe; (5) Integration von 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G; (6) Abspaltung von Allyl-R6G und der 3'-Allyl-Gruppe; (7) Integration von 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510; (8) Abspaltung von Allyl-Bodipy-FL-510 und der 3'-Allyl-Gruppe; die Bilder (9) bis (25) wurden in ähnlicher Weise erstellt. (C) Ein Plot (vierfarbige Sequenzierungsdaten) von Rohdaten einer Fluoreszenzemissionsintensität bei den vier festgelegten Emissionswellenlängen der vier chemisch abspaltbaren fluoreszierenden Nucleotide.
7. Strukturen von 3'-O-Allyl-dATP, 3'-O-Allyl-dCTP, 3'-O-Allyl-dGTP und 3'-O-Allyl-dTTP.
8(A). Rohdaten einer vierfarbigen DNA-Sequenzierung mit unserer Sequenzierung mittels Synthese unter Verwendung eines Templates, das zwei homopolymere Bereiche enthält. Die einzelnen Basen (A, T, C, G), die 10 aufeinanderfolgenden A's und die 5 aufeinanderfolgenden A's wurden eindeutig identifiziert. Bei den kleinen Gruppen von Peaks zwischen den identifizierten Basen handelt es sich um den fluoreszierenden Hintergrund von dem DNA-Chip, der sich bei Fortschreiten des Zyklus nicht weiter aufbaut. (B) Die Pyrosequenzierungsdaten des gleichen DNA-Templates, das die homopolymeren Regionen (10 T's und 5 T's) enthält. Die ersten vier einzelnen Basen wurden eindeutig identifiziert. Die beiden homopolymeren Regionen (10 A's und 5 A's) erzeugen zwei große Peaks, die es äußerst schwierig machen, aus den Daten die exakte Sequenz zu bestimmen.
9. Einzelbasen-Extensionsreaktion und MALDI-TOF-MS von 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G.
10. Einzelbasen-Extensionsreaktion und MALDI-TOF-MS von 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX (39).
11. Einzelbasen-Extensionsreaktion und MALDI-TOF-MS von 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650 (43) und 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5 (44).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Begriffe
So wie sie hier verwendet werden und sofern nicht anders angegeben ist, soll jeder der nachfolgenden Begriffe der nachfolgend angegebenen Definition entsprechen.

A: – Adenin;
C: – Cytosin
DNA: – Desoxyribonucleinsäure;
G: – Guanin;
RNA: – Ribonucleinsäure;
T: – Thymin; und
U: – Uracil.

„Nucleinsäure” soll ein beliebiges Nucleinsäuremolekül bezeichnen, einschließend ohne Einschränkung DNA, RNA sowie Hybride davon. Die Nucleinsäurebasen, die Nucleinsäuremoleküle bilden, können die Basen A, C, G, T und U sein, sowie Derivate davon. Derivate dieser Basen sind im Stand der Technik wohl bekannt und sind in PCR Systems, Reagents and Consumables (Perkin Elmer Catalogue 1996–1997, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, New Jersey, USA) beispielhaft wiedergegeben.
„Art” von Nucleotid bezieht sich auf A, G, C, T oder U.
Mit „Masse-Tag” ist eine molekulare Einheit mit einer vorbestimmten Größe gemeint, die dazu in der Lage ist, mittels einer abspaltbaren Bindung an eine andere Einheit gebunden zu werden.
„Festes Substrat” soll ein beliebiges geeignetes in der Festphase vorhandenes Medium bezeichnen, an dem ein Antikörper oder ein Agens befestigt werden kann.
Wenn ein Wertebereich angegeben ist, so ist selbstverständlich, dass jeder dazwischen liegende Wert, bis herab zu einem Zehntel der Einheit der unteren Grenze, sofern sich aus dem Kontext nicht ausdrücklich etwas anderes ergibt, zwischen der oberen und der unteren Grenze dieses Bereichs, sowie jeglicher weitere angegebene oder dazwischen liegende Wert innerhalb des angegebenen Bereichs von der vorliegenden Erfindung umfasst ist. Die oberen und unteren Grenzen dieser kleineren Bereiche können unabhängig voneinander in die kleineren Bereiche eingeschlossen sein und sind ebenfalls von der Erfindung umfasst, vorbehaltlich einer speziell ausgeschlossenen Grenze in dem angegebenen Bereich. Schließt der angegebene Bereich eine oder beide der Grenzen ein, so sind Bereiche, die einen oder beide dieser eingeschlossenen Grenzen ausschließen, ebenfalls von der Erfindung umfasst.
Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer DNA bereit, umfassend die Durchführung der nachfolgenden Schritte für jeden Rest der zu sequenzierenden DNA:

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem Schritt (e) vor Schritt (c) durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem der Rest, der in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebunden ist, che misch abspaltbar oder photospaltbar ist. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem der Rest, der in den Nucleotidanaloga gemäß Schritt (a) in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebunden ist, ein Allylrest oder ein 2-Nitrobenzylrest ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem der Rest, der in den reversiblen Terminatoren gemäß Schritt (c) in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebunden ist, ein Allylrest oder ein 2-Nitrobenzylrest ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die spezifische Markierung über einen chemisch abspaltbaren oder einen photospaltbaren Linker an die Base gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem es sich bei der über einen abspaltbaren Linker an die Base gebundenen spezifischen Markierung um einen Farbstoff, ein Fluorophor, ein Chromophor, einen kombinatorischen Fluoreszenzenergietransfer-Tag, einen Masse-Tag oder ein Elektrophor handelt.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem der Rest mit Na₂PdCl₄/P(PhSO₃Na)₃ abgespalten werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem der Linker mit Na₂PdCl₄/P(PhSO₃Na)₃ abgespalten werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem der Primer ein selbstprimender Rest ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die DNA an ein festes Substrat gebunden ist. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die DNA über 1,3-dipolare Azid-Alkyn-Zykloadditions-Chemie an das feste Substrat gebunden ist. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die DNA über ein Polyethylenglykolmolekül an das feste Substrat gebunden ist. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die DNA alkynmarkiert ist. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die DNA über ein Polyethylenglykolmolekül an das feste Substrat gebunden ist und das feste Substrat azidfunktionalisiert ist. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die DNA über eine Azidobindung, eine Alkynylbindung oder eine Biotin-Streptavidin-Interaktion auf dem festen Substrat immobilisiert ist
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem das feste Substrat die Form eines Chips, eines Beads, eines Wells, eines Kapillarröhrchens, eines Objektträgers, eines Wafers, eines Filters, einer Faser, eines porösen Mediums oder einer Säule aufweist. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem das feste Substrat Gold, Quarz, Siliciumdioxid, Kunststoff, Glas, Diamant, Silber, Metall oder Polypropylen ist. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem das feste Substrat porös ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem etwa 1.000 oder weniger Kopien der DNA an das feste Substrat gebunden sind. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem 1 × 10⁷, 1 × 10⁶ oder 1 × 10⁴ oder weniger Kopien der DNA an das feste Substrat gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind.
Es ist selbstverständlich, dass in weiteren Ausführungsformen die Nucleotidanaloga photospaltbar sind. So kann beispielsweise 2-Nitrobenzyl einen beliebigen der Allylreste in den hierin beschriebenen Analoga ersetzen. Beispielsweise 3'-O-2-Nitrobenzyl-dGTP-Allyl- Bodipy-650, 3'-O-2-Nitrobenzyl-dGTP-2-Nitrobenzyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dGTP-2-Nitrobenzyl-Bodipy-650. Der Fachmann ist dazu in der Lage, verschiedene andere chemisch oder photochemisch abspaltbare Reste oder Linker zu erkennen, die anstelle der hierin beschriebenen Beispiele verwendet werden können. Zusätzlich dazu können die spezifischen Markierungen ebenfalls variiert werden und die hier angeführten Beispiele sind nicht einschränkend. In einer Ausführungsform wird UV-Licht verwendet, um die photochemisch abspaltbaren Linker und Reste photochemisch abzuspalten.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die reversiblen Terminatoren in Schritt (c) 3'-O-Allyl-dGTP, 3'-O-Allyl-dCTP, 3'-O-Allyl-dATP und 3'-O-Allyl-dUTP sind. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die reversiblen Terminatoren in Schritt (c) 3'-O-2-Nitrobenzyl-dGTP, 3'-O-2-Nitrobenzyl-dCTP, 3'-O-2-Nitrobenzyl-dATP und 3'-O-2-Nitrobenzyl-dUTP sind. In einer Ausführungsform wird der reversible Terminator in den wachsenden DNA-Strang integriert.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die DNA-Polymerase eine 9°N-Polymerase oder eine Variante davon ist. DNA-Polymerasen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen beispielsweise ein: E. coli-DNA-Polymerase I, Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase, Sequenase^TM, Taq-DNA-Polymerase und 9°N-Polymerase-(exo-)-A485L/Y409V.RNA-Polymerase. RNA-Polymerasen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen beispielsweise Bakteriophagen-SP6-, -T7- und -T3-RNA-Polymerasen ein.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls das vorliegende Verfahren bereit, bei dem die DNA über ein Polyethylenglykolmolekül an das feste Substrat gebunden und das feste Substrat azidfunktionalisiert ist, oder die DNA über eine Azidobindung, eine Alkynylbindung oder eine Biotin-Streptavidin-Interaktion auf dem festen Substrat immobilisiert ist; wobei (i) die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind, (ii) die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind, oder (iii) die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP- Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind; und worin die reversiblen Terminatoren in Schritt (c) 3'-O-Allyl-dGTP, 3'-O-Allyl-dCTP, 3'-O-Allyl-dATP und 3'-O-Allyl-dUTP sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Kit zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens bereit, umfassend in separaten Kompartimenten,

Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren das vorliegende Kit bereit, bei dem die Nucleotidanaloga von Teil (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind. Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren das vorliegende Kit bereit, in die Nucleotidanaloga aus Teil (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy- 650, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind. Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren das vorliegende Kit bereit, bei dem die Nucleotidanaloga aus Teil (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind. Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren das vorliegende Kit bereit, bei dem die Nucleotidanaloga aus Teil (b) 3'-O-Allyl-dGTP, 3'-O-Allyl-dCTP, 3'-O-Allyl-dATP und 3'-O-Allyl-dUTP sind. Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren das vorliegende Kit bereit, wobei die reversiblen Terminatoren in Schritt (c) 3'-O-2-Nitrobenzyl-dGTP, 3'-O-2-Nitrobenzyl-dCTP, 3'-O-2-Nitrobenzyl-dATP und 3'-O-2-Nitrobenzyl-dUTP sind.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Kits können mutatis mutandis auf die Sequenzierung von RNA oder die Bestimmung der Identität eines Ribonucleotids angewandt werden.
Verfahren zur Herstellung von abspaltbar geschützten und/oder abspaltbar gebundenen Nucleotidanaloga sind in dem US-Patent Nr. 6,664,079 offenbart, das hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen wird. Kombinatorische Fluoreszenzenergie-Tags sowie Verfahren zu deren Herstellung sind in dem US-Patent Nr. 6,627,748 offenbart, das hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen wird.
In einer Ausführungsform ist die DNA oder Nucleinsäure mittels kovalenter ortsspezifischer Kopplungschemie, die mit DNA kompatibel sind, an der festen Oberfläche befestigt/gebunden.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden experimentellen Details besser verstanden werden; aber Fachleute werden ohne Weiteres erkennen, dass die detailliert beschriebenen speziellen Experimente die vorliegende Erfindung lediglich veranschaulichen, die umfassender in den nachfolgenden Ansprüchen beschrieben ist.
Experimentelle Details
DNA-Sequenzierung mittels Synthese (SBS) auf einer festen Oberfläche während einer Polymerasereaktion bietet ein neuartiges Modell zur Entschlüsselung von DNA-Sequenzen. Hierin offenbart ist der Aufbau eines solchen neuartigen DNA-Sequenzierungs systems unter Anwendung molekulartechnischer Ansätze. In diesem Ansatz werden vier Nucleotide (A, C, G, T) als reversible Terminatoren modifiziert durch Befestigen eines abspaltbaren Fluorophors an der Base sowie durch Schützen der 3'-OH-Gruppe mit einem kleinen, chemisch reversiblen Rest, so dass sie durch DNA-Polymerase nach wie vor als Substrate erkannt werden. Es wird gefunden, dass ein Allylrest erfolgreich als ein Linker zur Bindung eines Fluorophors an 3'-O-Allyl-modifizierte Nucleotide verwendet werden kann, wodurch chemisch abspaltbare, fluoreszierende, reversible Nucleotidterminatoren, 3'-O-Allyl-dNTPs-Allyl-Fluorophor, zur Anwendung bei der SBS ausgebildet werden. Das Fluorophor und die 3'-O-Allyl-Gruppe auf einem DNA-Extensionsprodukt, das durch Integration von 3'-O-Allyl-dNTPs-Allyl-Fluorophor in einer Polymerasereaktion erzeugt wird, werden innerhalb von 30 Sekunden mittels Pd-katalysierter Deallylierung in wässriger Pufferlösung gleichzeitig entfernt. Diese einstufige duale Deallylierungsreaktion gestattet folglich die erneute Initiation der Polymerasereaktion und erhöht die SBS-Effizienz. Aus homopolymeren Bereichen bestehende DNA-Template wurden unter Verwendung dieser neuen Klasse von fluoreszierenden Nucleotidanaloga auf einem DNA-Chip und einem Vierfarben-Fluoreszenzscanner richtig sequenziert.
Es ist bekannt, dass einige modifizierte DNA-Polymerasen höchst tolerant gegenüber Nucleotiden mit extensiven Modifikationen mit voluminösen Gruppen sind, wie zum Beispiel Energietransfer-Farbstoffen an der 5-Position der Pyrimidine (T und C) und der 7-Position der Purine (G und A)(23, 24). Es wurden die ternären Komplexe aus einer Ratten-DNA-Polymerase, einem DNA-Templat-Primer sowie einem Didesoxycytidintriphosphat bestimmt (22), was diese Tatsache belegt. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass, wenn ein spezifischer Fluoreszenzfarbstoff über einen abspaltbaren Linker an die 5-Position der Pyrimidine (T und C) und die 7-Position der Purine (G und A) gebunden ist und ein kleiner chemischer Rest zum Schutz der 3'-OH-Gruppe verwendet wird, die daraus resultierenden Nucleotidanaloga dazu in der Lage sein könnten, sich als Terminatoren in den wachsenden DNA-Strang zu integrieren. Ausgehend von diesem Grundprinzip wurde im Jahr 2000 ein SBS-Ansatz unter Verwendung von abspaltbaren fluoreszierenden Nucleotidanaloga als reversible Terminatoren zur Sequenzierung oberflächenimmobilisierter DNA konzipiert (1)(25). Bei diesem Ansatz werden die Nucleotide an zwei spezifischen Stellen derart modifiziert, dass sie nach wie vor von DNA-Polymerase als Substrate erkannt werden: (i) an jede der vier Basen wird mittels eines abspaltbaren Linkers ein unterschiedliches Fluorophor mit einer individuellen Fluoreszenzemission gebunden und (ii) die 3'-OH-Gruppe wird mittels eines kleinen, chemisch abspaltbaren Rests geschützt. DNA-Polymerase integriert lediglich ein einzelnes Nucleotidanalogon, das komplementär zu der Base auf einem DNA-Templat ist, die kovalent an eine Oberfläche gebunden ist. Nach der Integration wird die spezifische Fluoreszenzemission detektiert, um das integrierte Nucleotid zu identifizieren, und das Fluorophor wird anschließend entfernt. Dann wird die 3'-OH-Gruppe chemisch regeneriert, was den Ablauf des nächsten Zyklus der Polymerasereaktion gestattet. Da die große Oberfläche auf einem DNA-Chip eine hohe Dichte an in Spots aufgetragenen unterschiedlichen DNA-Templaten aufweisen kann, können in jedem Zyklus viele Basen parallel identifiziert werden, was die gleichzeitige Sequenzierung einer großen Anzahl an DNA-Molekülen gestattet. Die Durchführbarkeit einer SBS auf einem Chip unter Verwendung von vier photospaltbaren fluoreszierenden Nucleotidanaloga wurde bereits zu einem früheren Zeitpunkt etabliert (26) und es wurde die Entdeckung gemacht, dass eine Allyl-Gruppe als ein abspaltbarer Linker zur Brückenbindung eines Fluorophors an ein Nucleotid verwendet werden kann (27). Es wurde bereits von dem Entwurf und der Synthese von zwei photospaltbaren fluoreszierenden Nucleotiden als reversible Terminatoren für eine Polymerasereaktion berichtet (28, 29).
Frühere Forschungsbemühungen in unserem Labor haben die Molekularlevelstrategie fest etabliert, um für SBS in rationeller Weise die Nucleotide durch Befestigung eines abspaltbaren fluoreszierenden Rests an die Base sowie durch Schützen der 3'-OH-Gruppe mit einem kleinen, chemisch reversiblen Rest zu modifizieren. Dieser Ansatz wurde vor kurzem von Genomics Industry zur möglichen Bereitstellung einer neuen Plattform für die DNA-Sequenzierung übernommen (30). Hier sind der Entwurf und die Synthese von vier chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotidanaloga als reversible Terminatoren für SBS offenbart. Jedes der Nucleotidanaloga enthält an der Base mittels eines abspaltbaren Allyl-Linkers eine 3'-O-Allyl-Gruppe und ein spezifisches Fluorophor mit einer spezifischen Fluoreszenzemission.
Zunächst wurde etabliert, dass es sich bei diesen Nucleotidanaloga um gute Substrate für die DNA-Polymerase bei einer DNA-Extensionsreaktion in Lösungsphase handelt und dass das Fluorophor und die 3'-O-Allyl-Gruppe in wässriger Lösung mit hoher Effizienz entfernt werden können. Dann wurde SBS unter Verwendung dieser vier chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotidanaloga als reversible Terminatoren zur Identifikation von etwa 20 aufeinanderfolgenden Basen eines auf einem Chip immobilisierten DNA-Templates durchgeführt. Es wurden richtige DNA-Sequenzen für homopolymere Sequenzen enthaltende DNA-Template erhalten. Das DNA-Templat wurde mittels 1,3-dipolarer Azid-Alkyn-Zykloadditions-Chemie auf der Oberfläche des Chips immobilisiert, der einen PEG-Linker enthält. Diese Ergebnisse zeigten an, dass es möglich ist, erfolgreich abspaltbare, fluoreszierende, reversible Nucleotidterminatoren für die Vierfarben-DNA-Sequenzierung mittels Synthese zu entwerfen, indem man ein abspaltbares Fluorophor an die Base befestigt und die 3'-OH-Gruppe mittels eines kleinen, chemisch reversiblen Rests schützt, so dass sie von DNA-Polymerase nach wie vor als Substrate erkannt werden. Eine weiterführende Optimierung dieses Ansatzes wird zu noch umfangreicheren Leselängen bei der Sequenzierung führen.
Entwurf und Synthese von chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotidanaloga als reversible Terminatoren für SBS.
Um die Durchführbarkeit einer de novo DNA-Sequenzierung mittels Synthese auf einem Chip aufzuzeigen, wurden vier chemisch abspaltbare, fluoreszierende Nucleotidanaloga (3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G, 3'-O-Ally/-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650/Cy5)(2) als reversible Terminatoren für eine DNA-Polymerasereaktion entworfen und synthetisiert. Es wurde gezeigt, dass modifizierte DNA-Polymerasen in hohem Maße tolerant gegenüber Nucleotidmodifikationen mit voluminösen Gruppen an der 5-Position von Pyrimidinen (C und U) und der 7-Position von Purinen (A und G) sind. Folglich wurde jedes spezifische Fluorophor mittels eines Allylcarbamat-Linkers an der 5-Position von C/U und der 7-Position von MG befestigt. Aufgrund der unmittelbaren Nähe der 3'-Position auf dem Zuckerring eines Nucleotids zu den Aminosäureresten der aktiven Stelle der DNA-Polymerase wurde ein verhältnismäßig kleiner Allylrest als die reversible 3'-OH-schützende Gruppe ausgewählt. Es wurde gefunden, dass das Fluorophor und die 3'-O-Allyl-Gruppe auf einem DNA-Extensionsprodukt, das durch die Integration der chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotidanaloga erzeugt wird, mittels Pd-katalysierter Deallylierung in wässriger Lösung innerhalb von 30 Sekunden gleichzeitig entfernt werden. Diese einstufige duale Deallylie rungsreaktion gestattet daher die erneute Initiation der Polymerasereaktion. Der detaillierte Synthesevorgang sowie die Charakterisierung der vier neuartigen Nucleotidanaloga in 2 sind in „Materialien und Verfahren” beschrieben.
Zum Nachweis, dass diese fluoreszierenden Nucleotidanaloga bei einer Polymerasereaktion korrekt in basenspezifischer Weise integriert werden, wurden vier aufeinanderfolgende Schritte einer DNA-Extension und Deallylierung in Lösung durchgeführt. Dies gestattet die Isolation des DNA-Produkts in jedem Schritt zur detaillierten Charakterisierung der Molekularstruktur mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie (MS), wie in 3 gezeigt ist. Das erste Extensionsprodukt 5'-U(Allyl-R6G)-3'-O-Allyl (1) wurde mittels HPLC aufgereinigt und unter Verwendung von MALDI-TOF-MS analysiert [3(A)]. Dieses Produkt wurde dann unter Verwendung eines Pd-katalysierten Deallylierungscocktails [1X Thermopol I Reaktionspuffer/Na₂PdCl₄/P(PhSO₃Na)₃] deallyliert. Der aktive Pd-Katalysator wird aus Na₂PdCl₄ und einem Liganden P(PhSO₃Na)₃(TPPTS) erzeugt, um die Deallylierungsreaktion unter DNA-kompatiblen wässrigen Bedingungen zu vermitteln, um sowohl das Fluorophor als auch die 3'-O-Allyl-Gruppe gleichzeitig abzuspalten (28). Das deallylierte Produkt (2) wurde ebenfalls unter Verwendung von MALDI-TOF-MS analysiert [3(B)]. Wie aus 3(A) zu erkennen ist, besteht das MALDI-TOF-MS-Spektrum aus einem deutlichen Peak bei m/z 6469, entsprechend dem DNA-Extensionsprodukt 5'-U(Allyl-R6G)-3'-O-Allyl (1), was bestätigt, dass das Nucleotidanalogon mittels DNA-Polymerase basenspezifisch aus dem Pools aller vier Basen (A, C, G, T) in einen wachsenden DNA-Strang integriert werden kann. 3(B) zeigt das Deallylierungsergebnis des obigen DNA-Produkts. Der Peak bei m/z 6469 ist vollkommen verschwunden, während der Peak, der dem dual deallylierten Produkt 5'-U (2) entspricht, als der einzige dominante Peak bei m/z 5870 erscheint, was beweist, dass die Pd-katalysierte Deallylierungsreaktion sowohl das Fluorophor als auch die 3'-O-Allyl-Gruppe mit hoher Effizienz vollständig abspaltet, ohne dabei die DNA zu beschädigen. Zum Erhalt eines Extensionsprodukts 5'-UG(Allyl-Bodipy-650)-3'-O-Allyl (3) wurde die nächste Extensionsreaktion unter Verwendung dieses deallylierten Produkts mit einer regenerierten freien 3'-OH-Gruppe als einen Primer mit einer Mischung aus vier allylmodifizierten fluoreszierenden Nucleotiden durchgeführt. Wie zuvor beschrieben, wurde das Extensionsprodukt 3 mittels MALDI-TOF-MS analysiert, was einen dominanten Peak bei m/z 6984 ergab [3(C)], und dann zur weiteren MS-Analyse deallyliert, was einen einzelnen Peak bei m/z 6256 (Produkt 4) ergab [3(D)]. Die dritte Extensionsreaktion, die 5'-UGA(Allyl-ROX)-3'-O-Allyl (5) ergab, die vierte Extensionsreaktion, die 5'-UGAC(Allyl-Bodipy-FL-510)-3'-O-Allyl (7) ergab, sowie deren Deallylierungsreaktionen, die die Produkte 6 und 8 ergaben, wurden in ähnlicher Weise durchgeführt und mittels MALDI-TOF-MS analysiert, wie in den 3(E), 3(F), 3(G) und 3(H) gezeigt ist. Die chemischen Strukturen der Extensions- und Abspaltungsprodukte für jeden Schritt sind in 4 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die vier zuvor synthetisierten chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotidanaloga mit hoher Genauigkeit bei einer Polymerasereaktion erfolgreich in den wachsenden DNA-Strang integriert wurden und dass des Weiteren unter Anwendung einer Pd-katalysierten Deallylierungsreaktion sowohl das Fluorophor als auch die 3'-O-Allyl-Gruppe in effizienter Weise entfernt werden, was deren Verwendung bei SBS auf einem Chip realisierbar macht.
Vierfarben-DNA-Sequenzierung mit chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotidanaloga als reversible Terminatoren auf einem DNA-Chip
Die chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotidanaloga wurden dann in einer SBS-Reaktion verwendet, um die Sequenz des auf einer festen Oberfläche immobilisierten DNA-Templates zu identifizieren. Es wurde eine ortsspezifische 1,3-dipolare Azid-Alkyn-Zykloadditions-Chemie angewandt, um das mit Alkyn markierte, selbstprimende DNA-Templat auf der azidfunktionalisierten Oberfläche in der Anwesenheit eines Cu (1)-Katalysators kovalent zu immobilisieren. Der hauptsächliche Vorteil der Verwendung eines selbstprimenden Rests im Vergleich zu einer Verwendung von separaten Primern und Templaten besteht darin, dass die kovalente Bindung des Primers an das Templat in dem selbstprimenden Rest während des SBS-Vorgangs irgendeine mögliche Dissoziation des Primers von dem Templat verhindert. Zur Vermeidung einer nicht-spezifischen Absorption des nicht integrierten fluoreszierenden Nucleotids auf der Oberfläche des Chips wird zwischen den DNA-Templaten und der Oberfläche des Chips ein PEG-Linker eingeführt (5). Es wurde gezeigt, dass dieser Ansatz nach der Abspaltung zur Entfernung des Fluorophors eine äußerst geringe Hintergrundfluoreszenz erzeugt, wie durch die nachfolgend beschriebenen DNA-Sequenzierungsdaten gezeigt wird.
Zunächst wurde unter Verwendung der vier chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden, reversiblen Nucleotidterminatoren (3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5) eine SBS mit einem auf einem Chip immobilisierten DNA-Templat durchgeführt, das keine homopolymeren Sequenzen aufweist; die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Die Struktur des selbstprimenden DNA-Rests ist in 6A schematisch dargestellt, mit den ersten 13 Nucleotidsequenzen im unmittelbaren Anschluss an die Primingstelle. Die de novo Sequenzierungsreaktion auf dem Chip wurde durch die Extension der selbstprimenden DNA unter Verwendung einer Lösung, die alle vier 3'-O-Allyl-dNTPs-Allyl-Fluorophore enthält, sowie einer Mutante der 9°N-DNA-Polymerase initiiert. Zur Vermeidung irgendeines verzögerten Fluoreszenzsignals, das durch einen zuvor nicht extendierten Primingstrang verursacht wird, wurde ein Synchronisierungsschritt hinzugefügt, um die Menge an nicht extendierten Primingsträngen nach der Extension mit den fluoreszierenden Nucleotiden zu reduzieren. Zusammen mit einer Synchronisierungsreaktionsmischung, die aus allen vier 3'-O-Allyl-dNTPs (7) besteht, die aufgrund des fehlenden Fluorophors im Vergleich zu dem voluminöseren 3'-O-Allyl-dNTPs-Allyl-Fluorophor eine höhere Effizienz der Polymeraseintegration aufweisen, wurde die Mutante der 9°N-DNA-Polymerase zur Extension von irgendwelchen verbleibenden Primingstrangs mit einer freien 3'-OH-Gruppe verwendet, um die Integration zu synchronisieren. Die Extension durch 3'-O-Allyl-dNTPs fördert ebenfalls die enzymatische Integration des nächsten Nucleotidanalogons, da nach der Abspaltung zur Entfernung der 3'-O-Allyl-Gruppe das durch 3'-O-Allyl-dNTPs extendierte DNA-Produkt keine Modifikationsgruppen trägt. Nach Waschen wurde die Extension des Primers mit ausschließlich dem komplementären fluoreszierenden Nucleotid durch das Verzeichnen eines roten Signals (der Emission von Cy5) in einem Vierfarben-Fluoreszenzscanner bestätigt [6B(1)]. Im Anschluss an die Detektion des Fluoreszenzsignals wurde die Oberfläche des Chips in einen Deallylierungscocktail [1X Thermopol I Reaktionspuffer/Na₂PdCl₄/P(PhSO₃Na)₃] eingetaucht und 5 Min. lang bei 60°C inkubiert, um sowohl das Fluorophor als auch die 3'-O-Allyl-Gruppe gleichzeitig abzuspalten. Der Chip wurde dann unverzüglich in einen 3M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) eingetaucht und 5 Min. lang bei 60°C inkubiert, um den Pd-Komplex zu entfernen. Die Oberfläche wurde dann gewaschen und es wurde ein vernachlässigbares verbleibendes Fluoreszenzsignal detektiert, um die Abspaltung des Fluorophors zu bestätigen. Im Anschluss daran erfolgte eine weitere Extensionsreaktion unter Verwendung einer 3'-O-Allyl-dNTPs-Allyl-Fluorophor-Mischung, um das nächste fluoreszierende Nucleotid zu integrieren, das zu der nachfolgenden Base auf dem Templat komplementär ist. Der gesamte Vorgang von Integration, Synchronisation, Detektion und Abspaltung wurde mehrere Male unter Verwendung der vier chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden, reversiblen Nucleotidterminatoren zur Identifikation der 13 aufeinanderfolgenden Basen in dem DNA-Templat durchgeführt. Das Fluoreszenz-Image des Chips für jede Nucleotidaddition ist in 6B dargestellt, während ein Plot der Fluoreszenzintensität aufgetragen gegen das Fortschreiten der Sequenzierungsextension (Rohdaten der Vierfarben-Sequenzierung) in 6C dargestellt ist. Die DNA-Sequenzen wurden eindeutig aus den Vierfarben-Fluoreszenz-Rohdaten ohne irgendeine Verarbeitung identifiziert.
Vergleich von Vierfarben-SBS und Pyrosequenzierung
Zum weiteren Nachweis des Vorteils des SBS-Verfahrens unter Verwendung der vier chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden, reversiblen Nucleotidterminatoren führten wir eine ähnliche Sequenzierungsreaktion wie zuvor beschrieben auf einem DNA-Templat durch, das zwei separate homopolymere Bereiche enthielt (Spanne von 10 T's und 5 T's), wie in 8 (Panel A) gezeigt ist. Diese Rohdaten der Sequenzierung wurden erzeugt durch die gemeinsame Zugabe von allen vier fluoreszierenden, reversiblen Nucleotidterminatoren zu dem auf dem Chip immobilisierten DNA-Templat, gefolgt von einer Synchronisationsreaktion mit vier 3'-O-Allyl-dNTPs, der Detektion der spezifischen Fluoreszenzemission zur Sequenzbestimmung, dann der Abspaltung des Fluorophors und der 3'-O-Allyl-Gruppe in einem Schritt, um die Sequenzierungszyklen fortzusetzen. Alle 20 Basen, einschließlich der einzelnen Base (A, T, C, G), der 10 wiederholten A's und der 5 wiederholten A's, wurden eindeutig identifiziert. Bei den kleinen Gruppen von Peaks zwischen den identifizierten Basen handelt es sich um fluoreszierenden Hintergrund von dem DNA-Chip, der sich bei Fortschreiten des Zyklus nicht weiter aufbaut. Panel B in 8 zeigt die Pyrosequenzierungsdaten des gleichen die homopolymeren Sequenzen enthaltenden DNA-Templates. Die ersten vier einzelnen Basen wurden eindeutig identifiziert. Die beiden homopolymeren Bereiche (10 A's und 5 A's) bringen zwei große Peaks hervor, aber es ist äußerst schwierig, die exakte Sequenz aus den Daten zu bestimmen.
Schlussfolgerung
Es wurden vier neuartige chemisch abspaltbare, fluoreszierende Nucleotidanaloga synthetisiert und charakterisiert und sie wurden dazu verwendet, vierfarbige Daten einer de novo DNA-Sequenzierung auf einem Chip zu erzeugen. Dabei wurden zwei maßgebliche Voraussetzungen für die Anwendung des SBS-Verfahrens zur Sequenzierung von DNA eindeutig erfüllt. Zum ersten wurde erfolgreich eine Strategie zur Verwendung eines chemisch abspaltbaren Rests zum Schutz der 3'-OH-Gruppe des Nucleotids implementiert, so dass das Nucleotid die Polymerasereaktion terminiert und so die Identifikation des integrierten Nucleotids gestattet. Zusätzlich dazu gestatten diese reversiblen Terminatoren die gleichzeitige Zugabe aller vier Nucleotide bei der Durchführung von SBS. Dadurch wird letztendlich die erforderliche Anzahl an Zyklen zur Komplettierung des Sequenzierungszyklus reduziert, die Exaktheit der Sequenzierung aufgrund der Kompetition der vier Nucleotide in der Polymerasereaktion erhöht und eine exakte Bestimmung der homopolymeren Bereiche des DNA-Templates ermöglicht. Zum zweiten wurde die effiziente Entfernung von sowohl dem Fluorophor als auch der 3'-OH-Schutzgruppe im Anschluss an die Detektion des Fluoreszenzsignals mit Erfolg durchgeführt, was die Effizienz von SBS insgesamt erhöht.
Der ausschlaggebende Faktor, der maßgeblich für die Sequenzierungs-Leselänge unseres Vierfarben-SBS-Ansatzes ist, ist die schrittweise Ausbeute, der durch die Effizienz der Nucleotidintegration bestimmt wird, sowie die Ausbeute der Abspaltung des Fluorophors und der 3'-OH-Schutzgruppe von den DNA-Extensionsprodukten. Diese schrittweise Ausbeute liegt hier bei etwa 99%, basierend auf der Messung des DNA-Produkts in Lösungsphase. Aufgrund von Fluktuationen im Fluoreszenz-Imaging unter Verwendung der derzeit gebräuchlichen manuellen Fluoreszenzscanner ist es schwierig, die Ausbeute auf der Oberfläche exakt zu messen. Das bei der 20. Base immer noch starke Fluoreszenzsignal, wie in 8 gezeigt ist, deutet darauf hin, dass wir in der Lage sein sollten, die Leselänge sogar noch weiter auszudehnen. Was die Leselänge angeht, so ist die Sanger-Sequenzierung mit einer Leselange von mehr als 800 bp noch immer der goldene Standard, wenngleich sie in Bezug auf Durchsatz und Kosten eingeschränkt ist. Die Leselänge bei der Pyrosequenzierung liegt bei etwa 100 bp, jedoch mit einer höheren Fehlerquote aufgrund von Schwierigkeiten bei der exakten Bestimmung der Sequenzen von Homopolymeren. Die Leselange der Vierfarben-SBS auf einem manuellen Fluoreszenzscanner liegt derzeit bei etwa 20 bp mit einer hohen Genauigkeit. Mit der Automatisierung von Extensions-, Abspaltungs- und Waschschritten wird diese Leselange zunehmen. Die DNA-Polymerasen und die Fluoreszenzmarkierungen, die in dem automatisierten Vierfarben-Sanger-Sequenzierungsverfahren verwendet werden, durchlebten beinahe zwei Jahrzehnte ständiger schrittweiser Verbesserungen, nachdem das grundlegende fluoreszierende Sanger-Verfahren etabliert worden war (2, 3). In gleicher Weise ist es wohl zu erwarten, dass das grundlegende Prinzip und die grundlegende Strategie, die in unserem Vierfarben-SBS-Verfahren umrissen sind, weitere Verbesserung der Methodik der Sequenzierung mittels Synthese anregen werden, und zwar durch Entwurf von Hochleistungspolymerasen, die für die abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotidterminatoren maßgeschneidert sind, und durch das Testen alternativer Linker und reversibler 3'-OH-schützender Reste. Es ist mittlerweile etabliert, dass unter Verwendung einer Emulsions-PCR auf Mikrobeads Millionen von unterschiedlichen DNA-Templaten auf einer Oberfläche auf einem Chip immobilisiert werden (11, 16). Diese hohe Dichte an DNA-Templaten gekoppelt mit unserem Vierfarben-SBS-Ansatz wird eine Plattform mit hohem Durchsatz (> 20 Millionen Basen/Chip) und hoher Genauigkeit für eine Vielzahl von Projekten auf dem Gebiet der Sequenzierung und der digitalen Analyse der Genexpression schaffen.
Materialien und Methoden
¹H NMR-Spektren wurden auf einem Bruker DPX-400 (400 MHz) Spektrometer aufgezeichnet und in ppm gegen einen internen CD₃OD- oder DMSO-d₆-Standard (3,31 bzw. 2,50 ppm) dargestellt. Daten wurden wie folgt dargestellt: (s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartet, m = Multiplett, dd = Dublett von Dubletten, ddd = Dublett von Dubletten von Dubletten; Kopplungskontante(n) in Hz; Integration; Zuordnung). Protonen entkoppelte ¹³C NMR-Spektren wurden auf einem Broker DPX-400 (100 MHz) Spektrometer aufgezeichnet und in ppm gegen einen internen CD₃OD-, DMSO-d₆- oder CDCl₃-Standard (49,0, 39,5 bzw. 77,0 ppm) dargestellt. Protonen entkoppelte ³¹P NMR-Spektren wurden auf einem Broker DPX-300 (121,4 MHz) Spektrometer aufgezeichnet und in ppm gegen einen externen 85% H₃PO₄-Standard dargestellt. Hochauflösende Massenspektren (HRMS) wurden auf einem JEOL JMS HX 110A Massenspektrometer erhalten. Verbindungen 30 und 32 wurden von Berry & Associates erworben. Alle Farbstoff-NHS-Ester wurden von Molecular Probes und GE Healthcare erworben. Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich erworben.
Fluorophor = Bodipy-FL-510; R6G; ROX; Bodipy-650; Cy5 3'-O-Allyl-dNTP-NH₂ = 3'-O-Allyl-5-(3-aminoprop-1-ynyl)-2'-desoxycytidin-5'-triphosphat = 3'-O-Allyl-5-(3-aminoprop-1-ynyl)-2'-desoxyurldin-5'-triphosphat = 3'-O-Allyl-7-(3-aminoprpp-1-ynyl)-7-deaza-2'-desoxyadenosin-5'-triphosphat = 3'-O-Allyl-7-(3-aminoprop-1-ynyl)-7-deaza-2'-desoxyguanosin-5'-triphosphat
Syntheseschema zum Herstellen der chemisch abspaltbaren fluoreszierenden Nucleotide. a, DMF/1MNaHCO₃ Lösung; b, N,N'-Disuccinimidyl-Carbonat (DSC), Triethylamin; c, wässriger 0,1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ Puffer (pH 8,7)
I. Synthese von 3'-O-Allyl-dNTPs-Allyl-Fluorophor.
Chemisch abspaltbare fluoreszierende Nucleotide 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX, 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650 und 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5 wurden entsprechend dem obigen Schema synthetisiert. Ein chemisch abspaltbarer Linker 4-Amino-2-methylen-1-butanol (Allyl-Linker) wurde mit dem N-Hydroxysuccinimid-Ester (NHS) des entsprechenden fluoreszierenden Farbstoffs umgesetzt, um ein Allyl-Fluorophor als Zwischenprodukt herzustellen, das durch Reaktion mit N,N'-Disuccinimidylcarbonat in einen Allyl-Fluorophor-NHS-Ester umgewandelt wurde. Die Kopplungsreaktion zwischen den verschiedenen Allyl-Fluorophor-NHS-Estern und 3'-O-Allyl-dNTPs-NH₂ erzeugte die vier chemisch abspaltbaren fluoreszierenden Nucleotide.
1. Synthese von Allyl-Linker
2-Triphenylmethoxymethyl-2-propen-1-o1 (2). Zu einer gerührten Lösung von Tritylchlorid (4,05 g; 14,3 mMol) und 2-Methylenpropan-1,3-diol 1 (1,20 mL; 14,3 mMol) in trockenem CH₂Cl₂ (20 mL) wurde bei Raumtemperatur langsam Triethylamin (4,0 mL; 28,5 mMol) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Std. lang gerührt, und dann wurden Ethylacetat (100 mL) und gesättigtes wässriges NaHCO₃ (30 mL) zugegeben. Die organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem NaHCO₃, NaCl gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat-Hexan (1:10~5) als dem Eluent gereinigt, um 2 als einen weißen Feststoff zu erhalten (2,89 g; 62% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7,42-7,48 (m, 6H, sechs von ArH), 7,27-7,33 (m, 6H, sechs von ArH), 7,20-7,27 (m, 3H, drei von ArH), 5,26 (s, 1H, einer von C=CH₂), 5,17 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,13 (d, J = 6,1 Hz, 2H, CH₂OH), 3,70 (s, 2H, Ph₃COCH₂), 1,72 (t, J = 6,1 Hz, 1H, CH₂OH); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145,4, 143,6, 128,3, 127,6, 126,8, 111,6, 87,0, 65,3, 64,5.
1-Brom-2-triphenylmethoxymethyl-2-propen (3). Zu einer gerührten Lösung von 2 (2,56 g; 7,74 mMol) in CH₂Cl₂ (75 ml), wurden jeweils CBr₄ (3,63 g; 10,83 mMol) und Triphenylphosphin (2,47 g; 9,31 mMol) bei 0°C zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 40 Min. lang gerührt. Bei 0°C wurden Ethylacetat (100 mL) und gesättigtes wässriges NaHCO₃ (30 mL) zugegeben. Die organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem NaCl gewaschen, und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₂Cl₂-Hexan (1:5) als dem Eluent gereinigt, um 3 als weißen Feststoff zu erhalten (3,02 g; 92% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7,42-7,48 (m, 6H, sechs von ArH), 7,27-7,33 (m, 6H, sechs von ArH), 7,20-7,27 (m, 3H, drei von ArH), 5,37 (s, 1H, einer von C=CH₂), 5,31 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,01 (s, 2H, CH₂Br), 3,75 (s, 2H, Ph₃COCH₂); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 143,6, 142,6, 128,4, 127,6, 126,9, 115,8, 86,9, 64,2, 33,5.
3-Triphenylmethoxymethyl-3-butenonitrile (4). Zu einer gerührten Lösung von 3 (1,45 g; 3,69 mMol) in trockenem CH₃CN (37 mL) wurde Trimethylsilylcyanid (0,49 mL; 3,69 mMol) zugegeben. Dann wurde 1 M Tetrabutylammoniumfluorid (TRAF) in THF-Lösung (3,69 mL, 3,69 mMol) bei Raumtemperatur langsam in die obige Reaktionsmischung zugegeben. Die Mischung wurde 20 Min. lang gerührt. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Ethylacetat (100 mL) und gesättigtem wässrigem NaHCO₃ (30 mL) verdünnt. Die organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem NaCl gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von Acetat-Hexan (1:10) als dem Eluent gereinigt, um 4 als weißen Feststoff zu erhalten (1,01 g; 64% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7,39-7,45 (m, 6H, sechs von ArH), 7,21-7,34 (m, 9H, neun von ArH), 5,31 (s, 2H, C=CH₂), 3,64 (s, 2H, Ph₃COCH₂), 3,11 (s, 2H, CH₂CN); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 143,3, 135,5, 128,2, 127,7, 126,9, 116,8, 114,7, 87,0, 65,7, 21,9.
3-Triphenylmethoxymethyl-3-buten-1-amin (5). Zu einer gerührten Lösung von LiAlH₄ (119 mg; 2,98 mMol) in trockenem Ether (5 mL) wurde bei 0°C langsam AlCl₃ (400 mg; 2,94 mMol) zugegeben und die Mischung 15 Min. lang gerührt. Die Mischung von 4 (829 mg; 2,44 mMol) in trockenem Ether (9 mL) wurde zugegeben und dann wurde fortgefahren, bei 0°C für weitere 3 Std. zu Rühren. Danach wurden 10% wässrige NaOH (10 mL) zugegeben, um die Reaktion zu quenchen. Die organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem NaHCO₃, NaCl gewaschen, und über wasserfreiem K₂CO₃ getrocknet. Nach Evaporieren wurde der Rückstand weiter mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:20~5) als dem Eluent gereinigt, um 5 als farbloses Öl zu erhalten (545 mg; 65% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7,41-7,48 (m, 6H, sechs von ArH), 7,26-7,33 (m, 6H, sechs von ArH), 7,19-7,26 (m, 3H, drei von ArH), 5,33 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,96 (s, 1H, einer von C=CH₂), 3,53 (s, 2H, Ph₃COCH₂), 2,70 (m, 2H, CH₂CH₂NH₂), 2,18 (t, J = 6,7 Hz, 2H, CH₂CH₂NH₂), 2,06 (br s, 2H, NH₂); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 143,6, 143,4, 128,1, 127,4, 126,5, 111,3, 86,5, 66,1, 39,8, 37,4; HRMS (FAB+) berechnet für C₂₄H₂₆ON (M+H⁺): 344,2014, ermittelt: 344,2017.
4-Amino-2-methylen-1-butanol (6). Zu einer gerührten Lösung von 5 (540 mg; 1,57 mMol) in CH₃OH (11 mL) wurde HCl (2 M Lösung in Ether; 5,5 mL) bei Raumtemperatur zugegeben und die Mischung wurde 1 Std. lang gerührt. Dann wurde 7M Ammoniak in CH₃OH-Lösung (2,7 mL) in die obige Mischung bei Raumtemperatur zugegeben und fortgefahren, weitere 10 Min. lang zu rühren. Nach Filtration wurde der Feststoff mit CH₃OH gewaschen und mit dem Filtrat kombiniert. Nach Evaporieren wurde das Rohprodukt weiter mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:4) als dem Eluent gereinigt, um 6 als farbloses Öl zu ergeben (151 mg; 95% Ausbeute): ¹14 NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 5,19 (s, 1H, einer von C=CH₂), 5,01 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,06 (s, 2H, CH₂OH), 3,10 (t, J = 7,5 Hz, 2H, CH₂CH₂NH₂), 2,46 (t, J = 7,5 Hz, 2H, CH₂CH₂NH₂); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 145,3, 113,7, 65,5, 39,5, 32,0; MS (FAB+) berechnet für C₅H₁₂ON (M+H⁺): 102,09, ermittelt: 102,12.
2. Synthese von Allyl-Fluorophor
Das Folgende ist ein allgemeines Verfahren für die Synthese von Allyl-Fluorophor. Zu einer gerührten Lösung von 6 (3,5 mg; 34,6 μmol) in DMF (450 μL) wurde wässriges NaHCO₃ (1M Lösung; 100 μL) bei Raumtemperatur zugegeben. Die Mischung wurde 5 Min. lang gerührt. Es wurde Farbstoff-NHS-Ester (N-Hydroxysuccinimid)(5 mg) in DMF (450 μL) zugegeben und dann wurde die Mischung bei Raumtemperatur 6 Std. lang gerührt. Das Rohprodukt wurde weiter durch eine präparative TLC unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ als dem Eluent gereinigt, um Allyl-Fluorophor zu erhalten.
Allyl-Bodipy-FL-510 (7). ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,42 (s, 1H), 7,00 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 6,32 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 6,21 (s, 1H), 5,06 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,87 (s, 1H, einer von C=CH₂, teilweise überlagert von Lösungsmittelsignal), 4,01 (s, 2H, CH₂OH), 3,33 (t, J = 7,5 Hz, 2H, teilweise überlagert von Lösungsmittelsignal), 3,21 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,59 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,51 (s, 3H, einer von ArCH₃), 2,28 (s, 3H), 2,26 (t, J = 7,1 Hz, 2H); HRMS (FAB+) berechnet für C₁₉H₂₄O₂N₃F₂B (M⁺): 375,1933, ermittelt: 375,1957.
Allyl-R6G (8). ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,12 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,05 (dd, J = 1,8, 8,1 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,02 (s, 2H), 6,88 (s, 2H), 5,08 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,92 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,06 (s, 2H, CH₂OH), 3,48-3,56 (m, 6H), 2,40 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,13 (s, 6H), 1,36 (t, J = 7,2 Hz, 6H); HRMS (FAB+) berechnet für C₃₂H₃₆O₅N₃ (M+H⁺): 542,265 5, ermittelt: 542,2648.
Allyl-ROX (9). ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,03 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,98 (dd, J = 1,6, 8,1 Hz, 1H), 7,60 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,75 (s, 2H), 5,08 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,91 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,05 (s, 2H, CH₂OH), 3,45-3,57 (m, 10H), 3,03-3,10 (m, 4H), 2,64-2,73 (m, 4H), 2,38 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,04-2,15 (m, 4H), 1,89-1,99 (m, 4H); HRMS (FAB+) berechnet für C₃₈H₄₀O₅N₃ (M+H⁺): 618,2968, ermittelt: 618,2961.
Allyl-Bodipy-650 (10). ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,12 (dd, J = 0,9, 3,8 Hz, 1H), 7,63 (m, 3H), 7,54 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 7,35 (s, 1H), 7,18-7,22 (m, 2H), 7,12 (m, 2H), 7,06 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,85 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 5,06 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,86 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,56 (s, 2H), 4,00 (s, 2H, CH₂OH), 3,28 (m, 4H), 2,23 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,14 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,49-1,62 (m, 4H), 1,25-1,34 (m, 2H); HRMS (FAB+) berechnet für C₃₄H₃₇O₄N₄F₂SB (M⁺): 646,2603, ermittelt: 646,2620.
Allyl-Cy5 (11). ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,75-7,86 (m, 2H), 7,43-7,62 (m, 3H), 6,65 (m, 1H), 6,25-6,53 (m, 5H), 5,06 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,86 (s, 1H, einer von C=CH₂), 4,56 (s, 2H), 4,00 (s, 2H, CH₂OH), 3,28 (m, 6H), 2,03-2,40 (m, 4H), 1,55 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,31 (s, 6H), 1,26 (s, 6H), 1,25-1,64 (m, 6H); HRMS (FAB+) berechnet für C₃₈H₄₈O₈N₃S₂ (M⁺): 738,2888, ermittelt: 738,2867.
3. Synthese von Allyl-Fluorophor-NHS-Ester
Das nachfolgende ist ein allgemeines Verfahren für die Synthese von Allyl-Farbstoff-NHS-Ester. Zu einer gerührten Lösung von Allyl-Fluorophor (4 mg) in trockenem DMF (350 μL) wurden jeweils DSC (8,0 mg; 31,2 μmol) und Triethylamin (5,0 μL; 35,4 μmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 10 Std. lang gerührt. Nach Evaporieren wurde das Rohprodukt weiter durch Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ als dem Eluent gereinigt, um Allyl-Fluorophor-NHS-Ester zu erhalten, der direkt für den nächsten Schritt verwendet wurde.
4. Synthese von 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510 (23)
5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-5-iod-2'-desoxycytidin (18). Zu einer gerührten Mischung von 17 (1,00 g; 2,83 mMol) und Imidazol (462 mg; 6,79 mMol) in wasserfreiem DMF (14,0 mL) wurde tert-Butyldimethylsilylchlorid (TBDMSCI)(510 mg; 3,28 mMol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 20 Std. lang gerührt. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:20) als dem Eluent gereinigt, um 18 als weißen Feststoff zu erhalten (1,18 g; 89% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,18 (s, 1H, 6-H), 6,17 (dd, J = 5,8, 7,5 Hz, 1H, 1'-H), 4,34 (m, 1H, 3'-H), 4,04 (m, 1H, 4'-H), 3,93 (dd, J = 2,5, 11,6 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,84 (dd, J = 2,9, 11,6 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,41-2,48 (ddd, J = 2,5, 5,8, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,01-2,08 (ddd, J = 5,9, 7,6, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 0,95 (s, 9H, C(CH₃)₃), 0,17 (s, 3H, einer von SiCH₃), 0,16 (s, 3H, einer von SiCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 165,5, 156,8, 147,8, 89,4, 88,3, 72,8, 64,6, 57,1, 43,1, 26,7, 19,4, –4,8, –4,9; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₅H₂₇O₄N₃SiI (M+H⁺): 468,0816, ermittelt: 468,0835.
3'-O-Allyl-5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-5-iod-2'-desoxycytidin (19). Zu einer gerührten Lösung von 18 (1,18 g; 2,52 mMol) in wasserfreiem THF (43 mL) wurde 95% NaH-Pulver (128 mg; 5,07 mMol) zugegeben. Die Suspensionsmischung wurde bei Raumtemperatur 45 Min. lang gerührt. Dann wurde bei 0°C Allylbromid (240 μL, 2,79 mMol) zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur 14 Std. lang unter Feuchtigkeitsausschluss gerührt. Es wurde gesättigtes wässriges NaHCO₃ (10 mL) bei 0°C zugegeben und die Reaktionsmischung 10 Min. lang gerührt. Nach Evaporieren wurde der Rückstand in Ethylacetat (150 mL) gelöst. Die Lösung wurde dann mit gesättigtem wässrigem NaHCO₃ und NaCl gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat als dem Eluent gereinigt, um 19 als weißen Feststoff zu erhalten (601 mg; 47% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,15 (s, 1H, 6-H), 6,12 (dd, J = 5,6, 8,0 Hz, 1H, 1'-H), 4,17 (m, 1H, 4'-H), 4,14 (m, 1H, 3'-H), 3,98-4,10 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,93 (dd, J = 2,8, 11,5 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,83 (dd, J = 2,8, 11,5 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,53-2,60 (ddd, J = 1,7, 5,6, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 1,94-2,02 (ddd, J = 5,9, 8,0, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 0,94 (s, 9H, C(CH₃)₃), 0,17 (s, 3H, einer von SiCH₃), 0,16 (s, 3H, einer von SiCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 165,4, 156,7, 147,7, 135,5, 117,2, 88,2, 87,0, 80,4, 70,9, 64,8, 57,3, 40,1, 26,7, 19,4, –4,7, –4,9; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₈H₃₁O₄N₃SiI (M+H⁺): 508,1129, ermittelt: 508,1123.
3'-O-Allyl-5-iod-2'-desoxycytidin (20). Zu einer gerührten Lösung von 19 (601 mg; 1,18 mMol) in wasserfreiem THF (28 mL) wurde 1M TRAF in THF-Lösung (1,31 mL; 1,31 mMol) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 1 Std. lang gerührt. Nach Evaporieren wurde der Rückstand in Ethylacetat (100 mL) gelöst. Die Lösung wurde dann mit gesättigtem wässrigem NaCl gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:10) als dem Eluent gereinigt, um 20 als weiße Kristalle zu erhalten (329 mg; 71% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,47 (s, 1H, 6-H), 6,15 (dd, J = 6,2, 6,7 Hz, 1H, 1'-H), 5,87-5,98 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,26-5,33 (dm, J = 17,2 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,14-5,19 (dm, J = 10,5 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,18 (m, 1H, 3'-H), 4,08 (m, 1H, 4'-H), 3,98-4,10 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,82 (dd, J = 3,2, 13,0 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,72 (dd, J = 3,3, 13,0 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,44-2,51 (ddd, J = 3,2, 6,0, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,07-2,15 (m, 1H, einer von 2'-H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 165,4, 156,9, 148,8, 135,6, 117,0, 87,9, 86,9, 79,6, 71,2, 62,7, 57,2, 39,7; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₂H₁₇O₄N₃I (M+H⁺): 394,0264, ermittelt: 394,0274.
3'-O-Allyl-5-{3-[(trifluoracetyl)amino]prop-l-ynyl)-2'-desoxycytidin (21). Zu einer gerührten Lösung von 20 (329 mg; 0,84 mMol) in wasserfreiem DMF (3,7 mL) wurden Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0)(97 mg; 0,084 mMol) und CuI (35 mg; 0,18 mMol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 10 Min. lang gerührt. Dann wurden in die obige Reaktionsmischung N-Propargyltrifluoracetamid (379 mg; 2,51 mMol) und Et₃N (233 μL; 1,68 mMol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 1,5 Std. lang unter Ausschluss von Luft und Licht gerührt. Nach Evaporieren wurde der Rückstand in Ethylacetat (100 mL) gelöst. Die Mischung wurde mit gesättigtem wässrigem NaHCO₃, NaCl gewaschen, und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (0~1:10) als dem Eluent gereinigt, um 21 als gelbe Kristalle zu erhalten (290 mg; 83% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,31 (s, 1H, 6-H), 6,17 (dd, J = 6,0, 7,3 Hz, 1H, 1'-H), 5,87-5,97 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,26-5,33 (dm, J = 17,3 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,15-5,19 (dm, J = 10,4 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,31 (s, 2H, C≡CCH₂), 4,17 (m, 1H, 3'-H), 4,09 (m, 1H, 4'-H), 3,98-4,10 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,80 (dd, J = 3,4, 12,0 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,72 (dd, J = 3,6, 12,0 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,46-2,53 (ddd, J = 2,9, 5,3, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,04-2,12 (m, 1H, einer von 2'-H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 166,0, 158,4 (q, J = 38 Hz, COCF₃), 156,3, 145,8, 135,6, 117,1 (q, J = 284 Hz, COCF₃), 117,0, 91,9, 90,7, 88,0, 87,0, 79,8, 75,5, 71,2, 62,8, 39,6, 31,0; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₇H₂₀O₅N₄F₃ (M+H⁺): 417,13 86, ermittelt: 417,13 77.
3'-O-Allyl-5-(3-aminoprop-1-ynyl)-2'-desoxycytidin-5'-triphosphat (22). 21 (133 mg; 0,319 mMol) und Protonenschwamm (83,6 mg; 0,386 mMol) wurden über Nacht in einem Vakuumexsikkator über P₂O₅ getrocknet bevor sie in Trimethylphosphat (0,60 mL) gelöst wurden. Frisch destilliertes POCl₃ (36 μL; 0,383 mMol) wurden tropfenweise bei 0°C zugegeben und die Mischung wurde 3 Std. lang gerührt. Dann wurde die Lösung von Tributylammoniumpyrophosphat (607 mg) und Tributylamin (0,61 mL; 2,56 mMol) in was serfreiem DMF (2,56 mL) gut durchmischt und in einer Portion bei Raumtemperatur zugegeben und die Reaktionsmischung 30 Min. lang gerührt. Danach wurde eine Triethylammoniumbicarbonat-Lösung (TEAB)(0,1 M; 16 mL) zugegeben und die Mischung 1 Std. lang gerührt. Dann wurde wässriger Ammoniak (28%; 16 mL) zugegeben und die Reaktionsmischung 12 Std. lang gerührt. Nachdem die meiste Flüssigkeit unter Vakuum entfernt worden war, wurde der Rückstand in Wasser (2 mL) wieder aufgelöst und filtriert. Die wässrige Lösung wurde mit einer DEAE Sephadex A25 Ionenaustauschersäule unter Verwendung von wässriger TEAB-Gradientenlösung (von 0,1 M bis 1,0 M) als Eluent gereinigt, um nach Evaporieren 22 als farblosen Sirup zu erhalten: ¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ 8,43 (s, 1H, 6-H), 6,21 (t, J = 6,7 Hz, 1H, 1'-H), 5,85-6,00 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,28-5,38 (dm, J = 17,3 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,19-5,27 (dm, J = 10,4 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,22-4,41 (m, 3H, 3'-H und C≡CCH₂), 4,05-4,18 (m, 3H, 4'-H und CH₂CH=CH₂), 3,94-4,01 (m, 2H, 5'-H), 2,47-2,59 (m, 1H, einer von 2'-H), 2,20-2,32 (m, 1H, einer von 2'-H); ³¹P NMR (121,4 MHz, D₂O) δ –7,1 (d, J = 19,8 Hz, 1P, γ-P), –11,1 (d, J = 19,1 Hz, 1P, α-P), –21,9 (t, J = 19,5 Hz, 1P, β-P).
3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510 (23). Zu einer gerührten Lösung von Allyl-Bodipy-FL-510-NHS-Ester 12 in DMF (300 μL) wurde 3'-O-Allyl-dCTP-NH₂ 22 in 1M NaHCO₃-Na₂CO₃-Puffer (300 μL; pH 8,7) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 7 Std. lang gerührt und das Rohprodukt wurde durch eine präparative TLC-Platte unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:1) als dem Eluent gereinigt. Das Rohprodukt was weiter durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer 150 × 4,6 mm C18-Säule gereinigt, um Verbindung 23 (Retentionszeit = 35 Min.) zu ergeben. Mobile Phase: A, 4,4 mM Et₃N/98,3 mM 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol in Wasser (pH = 8,1); B, Methanol. Elution wurde durchgeführt von 100% A isokratisch für 10 Min. gefolgt von einem linearen Gradient von 0–50% B für 20 Min. und dann 50% B isokratisch für 20 Min. Das Produkt wurde durch die folgende einbasige Extensionsreaktion zum Erzeugen des DNA-Extensionsprodukts 24 charakterisiert und durch MALDI-TOF MS charakterisiert.
Ein allgemeines Verfahren zur Primerextension unter Verwendung von 3'-O-Allyl-dNTPs-Allyl-Fluorophor. Die Polymerase-Extensions-Reaktionsmischung bestand aus 50 pmol Primer (5'-GTTGATGTACACATTGTCAA-3'), 80 pmol 100-Mer Templat (5'-TACCCGGAGGCCAAGTACGGCGGGTACGTCCTTGACAATGTGTACATCAAC ATCACCTACCACCATGTCAGTCTCGGTTGGATCCTCTATTGTGTCCGGG-3'), 120 pmol 3'-O-Allyl-dNTP-Allyl-Fluorophor, 1X Thermopol II Reaktionspuffer [20 mM Tris-HCl/10 mM (NH₄)₂SO₄/10 mM KCl/2 mM MnCl₂/0,1% Triton X-100 pH 8,8, New England Biolabs], und 6 Einheiten 9° N Polymerase (exo-)A485L/Y409V in einem Gesamtvolumen von 20 μL. Die Reaktion bestand aus 20 Zyklen bei 94°C für 20 Sek., 46°C für 40 Sek., und 60°C für 90 Sek. Nach der Reaktion wurde ein kleiner Teil des DNA-Extensionsprodukts unter Verwendung von einer ZipTip entsalzt und mittels MALDI-TOF MS analysiert, die einen dominanten Peak bei m/z 5935 zeigte, entsprechend dem DNA-Extensionsprodukt, das durch Inkorporieren von 23 erzeugt wurde. Der Rest des Produkts wurde der folgenden Deallylierung unterzogen.
Allgemeines eintopfiges Dual-Deallylierungs-Verfahren von DNA-Extensionsprodukten. Das obige DNA-Produkt (20 pmol) wurde einer Mischung von entgastem 1X Thermopol I Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl/10 mM (NH₄)₂SO₄/10 mM KCl/2 mM MgSO₄/0,1% Triton X-100, pH 8,8, 1 μL), Na₂PdCl₄ in entgastem H₂O (7 μL, 23 nmol) und P(PhSO₃Na)₃ in entgastem H₂O (10 μL, 176 nmol) zugegeben, um eine eintopfige Dual-Deallylierungs-Reaktion durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde dann in einen Heizblock platziert und bei 70°C für 30 Sekunden inkubiert, um quantitativ deallyliertes DNA-Produkt zu ergeben, das durch MALDI-TOF MS als ein einzelner Peak charakterisiert ist.
5. Synthese von 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G (27)
Synthese von 3'-O-Allyl-dUTP-NH₂ 26 wurde entsprechend den Verfahren in Referenz (28) durchgeführt.
3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G (27). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 23. Das Produkt wurde gekennzeichnet durch die einbasige Extensionsreaktion und MALDI-TOF MS in 9.
6. Synthese von 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX (39)
6-Chlor-7-iod-7-deazapurin (31). Zu einer kräftig gerührten Lösung von 30 (1,0 g; 6,51 mMol) in CH₂Cl₂ (55 mL) wurde N-Iodsuccimid (1,70 g; 7,18 mMol) zugegeben. Die Suspensionsmischung wurde bei Raumtemperatur 1 Std. lang gerührt, während der mehr Niederschlag beobachtet wurde. Der Niederschlag wurde abfiltriert und dann in heißem Methanol rekristallisiert, um 31 zu ergeben (1,49 g; 82% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,96 (br s, 1H, NH), 8,59 (s, 1H, 2-H), 7,94 (s, 1H, 8-H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 151,2, 150,4, 150,2, 133,6, 115,5, 51,7; HRMS (FAB+) berechnet für C₆H₄N₃ClI (M+H⁺): 279,9139, ermittelt: 279,9141.
6-Chlor-9-(β-D-2'-desoxyribofuranosyl)-7-iod-7-deazapurin (33). Zu einer gerührten Lösung von 31 (707 mg; 2,53 mMol) in CH₃CN (43 mL) wurden KOH-Pulver (355 mg; 6,34 mMol) und tris[2-(2-Methoxyethoxy)ethyl]amin (TDA-1)(52 μL, 0,165 mMol) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 10 Min. lang gerührt und dann wurde 3,5-di-O-(p-Toluyl)-2-desoxy-D-ribofuranosylchlorid 32 (1,18 g; 2,73 mMol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 1 Std. lang kräftig gerührt und der unlösliche Anteil wurde abfiltriert und mit heißem Aceton gewaschen. Die kombinierte Lösung wurde evaporiert und in 7M Ammoniak in Methanollösung (86 mL) gelöst. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 24 Std. lang gerührt. Nach Evaporieren wurde das Rohprodukt mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (0~4:20) als dem Eluent gereinigt, um 33 als weißen Feststoff zu ergeben (711 mg; 71% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,57 (s, 1H, 2-H), 8,08 (s, 1H, 8-H), 6,72 (dd, J = 6,3, 7,5 Hz, 1H, 1'-H), 4,53 (m, 1H, 3'-H), 4,00 (m, 1H, 4'-H), 3,80 (dd, J = 3,6, 12,0 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,74 (dd, J = 3,6, 12,0 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,56-2,64 (ddd, J = 6,1, 7,5, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,36-2,43 (ddd, J = 3,3, 6,2, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 152,9, 151,7, 151,3, 134,7, 118,5, 89,0, 85,7, 72,6, 63,2, 52,6, 41,7; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₁H₁₂O₃N₃ClI (M+H⁺): 395,9612, ermittelt: 395,9607.
9-[β-D-5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-desoxyribofuranosyl]-6-chlor-7-iod-7-deazapurin (34). Das Verfahren war der Synthese von 18 ähnlich, und das Rohprodukt wurde mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat-Hexan (1:3~2) als dem Eluent gereinigt, um 34 als weißen Feststoff (597 mg; 65% Ausbeute) und 33 (213 mg; 30% Ausbeute) zu ergeben. Das obige Verfahren wurde mit gewonnenem 33 wiederholt, um eine Gesamtausbeute von 86% von 34 zu erzielen: ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,56 (s, 1H, 2-H), 7,99 (s, 1H, 8-H), 6,73 ('t', J = 6,7 Hz, 1H, 1'-H), 4,52 (m, 1H, 3'-H), 4,02 (m, 1H, 4'-H), 3,92 (dd, J = 3,0, 11,4 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,86 (dd, J = 3,1, 11,4 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,47-2,55 (ddd, J = 5,8, 7,1, 13,4 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,40-2,47 (ddd, J = 3,6, 6,3, 13,4 Hz, 1H, einer von 2'-H), 0,94 (s, 9H, C(CH₃)₃), 0,14 (s, 3H, einer von SiCH₃), 0,13 (s, 3H, einer von SiCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 152,8, 151,5, 151,3, 133,8, 118,2, 88,9, 85,4, 72,5, 64,6, 52,6, 42,4, 26,7, 19,5, –4,9, –5,0; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₇H₂₆O₃N₃ClSiI (M+H⁺): 510,0477, ermittelt: 510,0487.
9-[β-D-3'-O-Allyl-5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-desoxyribofuranosyl]-6-chlor-7-iod-7-deazapurin (35). Zu einer gerührten Lösung von 34 (789 mg; 1,55 mMol) in CH₂Cl₂ (48 mL) wurden jeweils Tetrabutylammoniumbromid (TBAB)(255 mg; 0,77 mMol), Allylbromid (0,69 mL, 7,74 mMol) und 40% wässrige NaOH-Lösung (24 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 1 Std. lang gerührt. Es wurde Ethylacetat (150 mL) zugegeben und die organische Schicht abgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat (2 × 50 mL) extrahiert. Die kombinierte organische Schicht wurde mit gesättigtem wässrigem NaHCO₃, NaCl gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat-Hexan (1:6) als dem Eluent gereinigt, um 35 als gelbes Öl zu ergeben (809 mg; 95% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,52 (s, 1H, 2-H), 7,94 (s, 1H, 8-H), 6,64 (dd, J = 6,1, 7,6 Hz, 1H, 1'-H), 5,88-5,99 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,28-5,34 (dm, J = 17,3 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,16-5,21 (dm, J = 10,4 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,28 (m, 1H, 3'-H), 4,13 (m, 1H, 4'-H), 4,01-4,11 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,88 (dd, J = 3,6, 11,2 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,80 (dd, J = 3,1, 11,3 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,51-2,57 (ddd, J = 2,7, 6,0, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,42-2,50 (ddd, J = 5,7, 7,7, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 0,93 (s, 9H, C(CH₃)₃), 0,13 (s, 3H, einer von SiCH₃), 0,12 (s, 3H, einer von SiCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 152,8, 151,4, 151,3, 135,5, 133,6, 118,2, 117,2, 86,5, 85,6, 80,2, 71,0, 64,8, 52,8, 39,7, 26,7, 19,4, –4,8, –5,0; HRMS (FAB+) berechnet für C₂₀H₃₀O₃N₃ClSiI (M+H⁺): 550,0790, ermittelt: 550,0773.
3'-O-Allyl-7-deaza-7-iod-2'-desoxyadenosin (36). Zu einer gerührten Lösung von 35 (809 mg; 1,47 mMol) in wasserfreiem THF (34 mL) wurde 1M TRAF in THF-Lösung (1,62 mL; 1,62 mMol) zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur 1 Std. lang gerührt. Nach Evaporieren wurde der Rückstand in 7M Ammoniak in Methanollösung (24 mL) gelöst. Die Lösung wurde in einem Autoklav 15 Std. lang bei 115–120°C gerührt. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:20) als dem Eluent gereinigt, um 36 als weißen Feststoff zu ergeben (514 mg; 84% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,08 (s, 1H, 2-H), 7,56 (s, 1H, 8-H) 6,45 (dd, J = 5,8, 8,6 Hz, 1H, 1'-H), 5,90-6,00 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,29-5,35 (dm, J = 17,2 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,16-5,21 (dm, J = 10,5 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,28 (m, 1H, 3'-H), 4,12 (m, 1H, 4'-H), 4,02-4,12 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,78 (dd, J = 3,7, 12,1 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,70 (dd, J = 3,6, 12,1 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,53-2,61 (ddd, J = 5,8, 8,6, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,41-2,47 (ddd, J = 2,0, 5,8, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 158,5, 152,3, 150,3, 135,7, 128,8, 117,0, 105,3., 86,8, 86,4, 80,7, 71,0, 63,7, 51,3, 38,8; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₄H₁₈O₃N₄I (M+H⁺): 417,0424, ermittelt: 417,0438.
3'-O-Allyl-7-deaza-7-{3-[(trifluoracetyl)amino]prop1-ynyl}-2'-desoxyadenosin (37). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 21, und das Rohprodukt wurde mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat-Hexan (1:1~0) als dem Eluent gereinigt, um 37 als gelben Feststoff zu erbeben (486 mg; 90% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,08 (s, 1H, 2-H), 7,60 (s, 1H, 8-H), 6,41 (dd, J = 5,8, 8,6 Hz, 1H, 1'-H), 5,89-6,00 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,29-5,35 (dm, J = 17,3 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,16-5,21 (dm, J = 10,4 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,31 (s, 2H, C≡CCH₂), 4,29 (m, 1H, 3'-H), 4,13 (m, 1H, 4'-H), 4,01-4,11 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,79 (dd, J = 3,6, 12,1 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,71 (dd, J = 3,5, 12,1 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,54-2,62 (ddd, J = 5,8, 8,6, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,42-2,48 (ddd, J = 1,9, 5,8, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 158,8, 158,6 (q, J = 38 Hz, COCF₃), 152,9, 149,6, 135,6, 128,1, 117,1 (q, J = 284 Hz, COCF₃), 117,0, 104,5, 96,3, 87,3, 86,9, 86,8, 80,7, 77,0, 71,0, 63,8, 38,7, 31,1; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₉H₂₁O₄N₅F₃ (M+H⁺): 440,1546, ermittelt: 440,1544.
3'-O-Allyl-7-(3-aminoprop-1-ynyl)-7-deaza-2'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (38). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 22, um 38 als farblosen Sirup zu erhalten: 1H NMR (300 MHz, D₂O) δ 8,02 (s, 1H, 2-H), 7,89 (s, 1H, 8-H), 6,54 (t, J = 6,6 Hz, 1H, 1'-H), 5,89-6,02 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,30-5,39 (dm, J = 17,3 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,20-5,27 (dm, J = 10,4 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,48 (s, 2H, C≡CCH₂), 4,35 (m 1H, 3'-H), 4,05-4,17 (m, 4H, CH₂CH=CH₂ und 5'-H), 3,99 (m, 1H, 4'-H), 2,50-2,59 (m, 2H, 2'-H); ³¹P NMR (121,4 MHz, D₂O) δ –6,1 (d, J = 21,1 Hz, 1P, γ-P), –10,8 (d, J = 8,8 Hz, 1P, α-P), –21,9 (t, J = 19,9 Hz, 1P, β-P).
3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX (39). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 23. Das Produkt wurde charakterisiert durch einbasige Extensionsreaktion und MALDI-TOF MS. Siehe 10.
7. Synthese von 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650 (43) und 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5 (44)
Synthese von 3'-O-Allyl-dGTP-NH₂ 42 wurde entsprechend den Verfahren in Referenz (29) durchgeführt.
3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650 (43) und 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5 (44). Die Verfahren waren ähnlich der Synthese von 23. Das Produkt wurde charakterisiert durch einbasige Extensionsreaktion und MALDI-TOF MS. Siehe 11.
II. Synthese von 3'-O-Allyl-dNTPs
1. Synthese von 3'-O-Allyl dCTP (51)
5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-desoxycytidin (48). Zu einer gerührten Lösung von 2'-Desoxycytidin 47 (1,00 g; 4,40 mMol) in trockenem Pyridin (37 mL) wurde TBDMSCl (814 mg; 5,39 mMol) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 Std. lang gerührt. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:10) als dem Eluent gereinigt, um 48 als weißen Feststoff zu ergeben (1,26 g; 84% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,03 (d, J = 7,5 Hz, 1H, 6-H), 6,23 (t, J = 6,3 Hz, 1H, 1'-H), 5,86 (d, J = 7,5 Hz, 1H, 5-H), 4,35 (m, 1H, 3'-H), 3,91-3,98 (m, 2H, 4'-H und einer von 5'-H), 3,85 (dd, J = 2,5, 11,3 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,36-2,43 (ddd, J = 4,1, 6,1, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,05-2,13 (m, 1H, einer von 2'-H), 0,94 (s, 9H, C(CH₃)₃), 0,14 (s, 3H, einer von SiCH₃), 0,13 (s, 3H, einer von SiCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 167,1, 157,6, 142,1, 95,6, 88,7, 87,4, 71,7, 64,1, 42,7, 26,5, 19,3, –5,2, –5,3; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₅H₂₈O₄N₃Si (M+H+): 342,1849, ermittelt: 342,1844.
3'-O-Allyl-5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-desoxycytidin (49). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 19 und das Rohprodukt wurde mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:20) als dem Eluent gereinigt, um 49 als gelben Feststoff zu ergeben (480 mg; 35% Ausbeute): ¹H (400 MHz, CD₃OD) δ 7,97 (d, J = 7,5 Hz, 1H, 6-H), 6,21 (t, J = 6,5 Hz, 1H, 1'-H), 5,87 (d, J = 7,5 Hz, 1H, 5-H), 5,87-5,97 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,26-5,33 (dm, J = 17,2 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,15-5,20 (dm, J = 10,5 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,16 (m, 1H, 3'-H), 4,11 (m, 1H, 4'-H), 3,97-4,11 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,92 (dd, J = 3,2, 11,4 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,84 (dd, J = 2,8, 11,4 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,46-2,51 (ddd, J = 3,1, 5,9, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,00-2,08 (m, 1H, einer von 2'-H), 0,94 (s, 9H, (CH₃)₃), 0,13 (s, 6H, Si(CH₃)₂); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 167,2, 157,7, 141,9, 135,6, 117,1, 95,7, 87,5, 86,6, 79,7, 71,1, 64,4, 39,8, 26,5, 19,3, –5,1, –5,2; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₅H₂₈O₄N₃Si (M+H⁺): 342,1849, ermittelt: 342,1844.
3'-O-Allyl-2'-desoxycytidin (50). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 20 und das Rohprodukt wurde mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-THF (1:12) und CH₃OH-Ethylacetat (1:4) als dem Eluent gereinigt, um 50 als weißen Schaum zu ergeben (269 mg; 80% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,96 (d, J = 7,5 Hz, 1H, 6-H), 6,21 (dd, J = 5,9, 7,6 Hz, 1H, 1'-H), 5,89 (d, J = 7,5 Hz, 1H, 5-H), 5,87-5,98 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,27-5,33 (dm, J = 17,3 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,15-5,19 (dm, J = 10,4 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,17 (m, 1H, 3'-H), 3,98-4,10 (m, 3H, 4'-H und CH₂CH=CH₂), 3,77 (dd, J = 3,6, 12,0 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,71 (dd, J = 3,7, 12,0 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,43-2,50 (ddd, J = 2,7, 5,9, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,03-2,11 (ddd, J = 6,2, 7,7, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 167,1, 157,7, 142,2, 135,5, 117,0, 96,0, 87,5, 86,6, 80,0, 71,0, 63,0, 39,1; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₂H₁₈O₄N₃ (M⁺H⁺): 268,1297, ermittelt: 268,1307.
3'-O-Allyl-2'-desoxycytidin-5'-triphosphat (51). 50 (86 mg; 0,32 mMol) und Protonenschwamm (84 mg; 0,39 mMol) wurden über Nacht in einem Vakuumexsikkator über P₂O₅ getrocknet bevor sie in Trimethylphosphat (0,60 mL) gelöst wurden. Frisch destilliertes POCl₃ (35,8 μL; 0,383 mMol) wurde bei 0°C tropfenweise zugegeben und die Mischung wurde 3 Std. lang gerührt. Dann wurde die Lösung von Tributylammoniumpyrophosphat (607 mg) und Tributylamin (0,61 mL; 2,56 mMol) in wasserfreiem DMF (2,6 mL) gut durchgemischt und in einer Portion bei Raumtemperatur zugegeben und die Reaktion 30 Min. lang gerührt. Danach wurde Triethylammoniumbicarbonat-Lösung (TEAB)(0,1 M; 16 mL) zugegeben und die Mischung 2 Std. lang gerührt. Nachdem die meiste Flüssigkeit unter Vakuum entfernt worden war, wurde der Rückstand in Wasser (2 mL) wieder aufgelöst und filtriert. Die wässrige Lösung wurde mittels DEAE Sephadex A25 Ionenaustauschersäule unter Verwendung von wässriger TEAB-Gradientenlösung (von 0,1 M bis 1,0 M) als Eluent gereinigt, um nach Evaporieren 51 als farblosen Sirup zu ergeben: ¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ 7,90 (d, J = 7,4 Hz, 1H, 6-H), 6,20 (dd, J = 5,9, 7,6 Hz, 1H, 1'-H), 5,92 (d, J = 7,4 Hz, 1H, 5-H), 5,85-5,97 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,25-5,34 (m, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,15-5,20 (m, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,15 (m, 1H, 3'-H), 3,96-4,10 (m, 3H, 4'-H und CH₂CH=CH₂), 3,70-3,80 (m, 2H 5'-H), 2,43-2,52 (m, 1H, einer von 2'-H), 2,05-2,14 (m, 1H, einer von 2'-H); ³¹P NMR (121,4 MHz, D₂O) δ –8,8 (d, J = 19,0 Hz, 1P, γ-P), –11,3 (d, J = 19,6 Hz, 1P, α-P), –22,9 (t, J = 19,5 Hz, 1P, β-P).
2. Synthese von 3'-O-Allyl-dTTP (53)
Synthese von 3'-O-Allylthymidin 52 wurde entsprechend den Verfahren in Referenz (28) durchgeführt.
3'-O-Allylthymidin-5'-triphosphat (53). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 51, um 53 als farblosen Sirup zu erhalten: ¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ 7,80 (m, 1H, 6-H), 6,23 (dd, J = 6,2, 8,1 Hz, 1H, 1'-H), 5,85-5,97 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,25-5,32 (m, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,15-5,21 (m, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,17 (m, 1H, 3'-H), 3,97-4,11 (m, 3H, 4'-H und CH₂CH=CH₂), 3,70-3,80 (m, 2H, 5'-H), 2,30-2,41 (m, 1H, einer von 2'-H), 2,11-2,23 (m, 1H, einer von 2'-H), 1,86 (d, J = 1,2 Hz, 3H, CH₃); ³¹P NMR (121,4 MHz, D₂O) δ –7,1 (d, J = 20,1 Hz, 1P, γ-P), –10,8 (d, J = 19,5 Hz, 1P, α-P), –21,8 (t, J = 19,5 Hz, 1P, β-P).
3. Synthese von 3'-O-Allyl-dATP (59)
N⁶-[(Dimethylamino)methylen]-2'-desoxyadenosin (55). Zu einer gerührten Lösung von 2'-Desoxyadenosinmonohydrat 54 (1,00 g; 3,71 mMol) in Methanol (43 mL) wurde N,N-Dimethylformamiddimethylacetal (2,48 mL; 18,6 mMol) zugegeben. Die Reaktion wurde 16 Stunden lang bei 50°C gerührt. Nach Evaporieren wurde CH₂Cl₂-Hexan (1:1) zugegeben. Der gebildete weiße Feststoff wurde dann abfiltriert, gesammelt und mit Hexan gewaschen, um 55 als weißen Feststoff zu ergeben (1,13 g; 99% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,92 (s, 1H, CHN(CH₃)₂), 8,44 (s, 1H, 2-H), 8,43 (s, 1H, 8-H), 6,48 (dd, J = 6,2, 7,8 Hz, 1H, 1'-H), 4,59 (m, 1H, 3'-H), 4,07 (m, 1H, 4'-H), 3,86 (dd, J = 3,1, 12,2 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,76 (dd, J = 3,5, 12,2 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,25 (s, 3H, einer von NCH₃), 3,24 (s, 3H, einer von NCH₃), 2,80-2,88 (ddd, J = 5,9, 7,8, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,40-2,47 (ddd, J = 2,8, 6,1, 13,4 Hz, 1H, einer von 2'-H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 161,0, 159,9, 152,8, 151,1, 142,8, 127,0, 89,7, 86,9, 72,9, 63,5, 41,5 (N(CH₃)₂), 35,3; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₃H₁₉O₃N₆ (M+H⁺): 307,1519, ermittelt: 307,1511.
5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-N⁶-[(dimethylamino)methylen]-2'-desoxyadenosin (56). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 18, und das Rohprodukt wurde mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:20) als dem Eluent gereinigt, um 56 als weißen Schaum zu ergeben (1,11 g; 72% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,90 (s, 1H, CHN(CH₃)₂), 8,45 (s, 1H, 2-H), 8,43 (s, 1H, 8-H), 6,49 (t, J = 6,5 Hz, 1H, 1'-H), 4,59 (m, 1H, 3'-H), 4,04 (m, 1H, 4'-H), 3,95 (dd, J = 3,7, 11,3 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,85 (dd, J = 2,8, 11,3 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,25 (s, 3H, einer von NCH₃), 3,24 (s, 3H, einer von NCH₃), 2,73-2,81 (m, 1H, einer von 2'-H), 2,48-2,55 (ddd, J = 4,0, 6,4, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 0,90 (s, 9H, C(CH₃)₃) 0,08 (s, 3H, einer von SiCH₃), 0,07 (s, 3H, einer von SiCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 160,6, 159,7, 153,0, 151,7, 141,8, 126,5, 88,9, 85,7, 72,1, 64,3, 41,6, 41,5, 35,3, 26,5, 19,3, –5,0, –5,1; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₉H₃₃O₃N₆Si (M+H⁺): 421,2383 ermittelt: 421,2390.
3'-O-Allyl-5'-O-(t-butyldimethylsilyl)-N⁶-((dimethylamino)methylen]-2'-desoxyadenosin (57). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 35 und das Rohprodukt wurde mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:25) und CH₃OH-Ethylacetat (1:10) als dem Eluent gereinigt, um 57 als farbloses Öl zu ergeben (875 mg; 72% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,90 (s, 1H, CHN(CH₃)₂), 8,44 (s, 1H, 2-H), 8,41 (s, 1H, 8-H), 6,45 (dd, J = 6,3, 7,2 Hz, 1H, 1'-H), 5,91-6,01 (m 1H, CH₂CH=CH₂), 5,30-5,37 (dm, J = 17,2 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,18-5,22 (dm, J = 10,5 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,37 (m, 1H, 3'-H), 4,17 (m, 1H, 4'-H), 4,05-4,15 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,91 (dd, J = 4,6, 11,1 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,83 (dd, J = 3,8, 11,1 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,25 (s, 3H, einer von NCH₃), 3,24 (s, 3H, einer von NCH₃), 2,76-2,83 (ddd, J = 6,0, 7,3, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,59-2,65 (ddd, J = 3,0, 6,1, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 0,90 (s, 9H, C(CH₃)₃), 0,08 (s, 6H, Si(CH₃)₂); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 160,7, 159,7, 153,1, 151,8, 141,9, 135,6, 126,5, 117,1, 86,7, 85,9, 80,1, 71,1, 64,5, 41,5, 38,7, 35,3, 26,5, 19,3, –5,0, –5,1; HRMS (FAB+) berechnet für C₂₂H₃₇O₃N₆Si (M+H⁺): 461,2696, ermittelt: 461,2695.
3'-O-Allyl-2'-desoxyadenosin (58). Zu einer gerührten Lösung von 57 (875 mg; 1,90 mMol) in wasserfreiem THF (45 mL) wurde 1 M TRAF in THF-Lösung (2,09 mL; 2,09 mMol) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Evaporieren wurde der Rückstand in 7 M Ammoniak in Methanollösung (34 mL) gelöst. Die Mischung wurde dann 9 Std. lang bei 50°C in einem verschlossenen Kolben gerührt. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:10) als dem Eluent gereinigt, um 58 als weißen Feststoff zu erhalten (548 mg; 99% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,30 (s, 1H, 2-H), 8,17 (s, 1H, 8-H), 6,38 (dd, J = 5,8, 8,6 Hz, 1H, 1'-H), 5,91-6,01 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,30-5,37 (dm, J = 17,3 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,17-5,22 (dm, J = 10,6 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,36 (m, 1H, 3'-H), 4,21 (m, 1H, 4'-H), 4,04-4,15 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,85 (dd, J = 3,2, 12,3 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,74 (dd, J = 3,2, 12,3 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,75-2,83 (ddd, J = 5. 7, 8,6, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,52-2,58 (ddd, J = 1,8, 5,8, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 157,1, 153,1, 149,5, 141,2, 135,6, 120,6, 117,0, 87,5, 87,2, 80,9, 71,0, 63,9, 38,7; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₃H₁₈O₃N₅ (M+H+): 292,1410, ermittelt: 292,1426.
3'-O-Allyl-2'-desoxyadenosin-5'-triphosphat (59). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 51, um 59 als farblosen Sirup zu erhalten: ¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ 8,46 (s, 1H, 2-H), 8,19 (s, 1H, 8-H), 6,43 (dd, J = 6,3, 7,2 Hz, 1H, 1'-H), 5,90-6,02 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,31-5,40 (dm, J = 17,1 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,21-5,28 (dm, J = 10,8 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,55 (m, 1H, 3'-H), 4,40 (m, 1H, 4'-H), 4,06-4,20 (m, 4H, CH₂CH=CH₂ und 5'-H), 2,61-2,82 (m, 2H, 2'-H); ³¹P NMR (121,4 MHz, D₂O) δ –8,9 (d, J = 19,1 Hz, 1P, γ-P), –11,2 (d, J = 19,7 Hz, 1P, α-P), –22,8 (t, J = 19,9 Hz, 1P, β-P).
4. Synthese von 3'-O-Allyl-dGTP (65)
2-Amino-6-chlor-9-[β-D-5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-desoxyribofuranosyl]purin (61). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 18, und das Rohprodukt wurde mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:20) als dem Eluent gereinigt, um 61 als weißen Feststoff zu ergeben (1,20 g; 86% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,25 (s, 1H, 8-H), 6,34 (t, J = 6,4 Hz, 1H, 1'-H), 4,56 (m, 1H, 3'-H), 4,01 (m, 1H, 4'-H), 3,90 (dd, J = 3,5, 11,4 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,84 (dd, J = 3,8, 11,4 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,67-2,74 (m, 1H, einer von 2'-H), 2,43-2,50 (ddd, J = 4,2, 6,4, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 0,89 (s, 9H, C(CH₃)₃), 0,07 (s, 3H, einer von SiCH₃), 0,06 (s, 3H, einer von SiCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 161,1, 154,2, 151,2, 142,0, 124,9, 88,9, 85,5, 72,0, 64,3, 41,4, 26,5, 19,3, –5,1 (zwei SiCH₃); HRMS (FAB+) berechnet für C₁₆H₂₇O₃N₅ClSi (M+H⁺): 400,1572, ermittelt: 400,1561.
2-Amino-6-chlor-9-[β-D-3'-O-Allyl-5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-desoxyribo-furanosyl]-purin (62). Das Verfahren war das gleiche wie jenes von 35, und das von 60 umgewandelte Rohprodukt 61 wurde mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat-Hexan (1:2) als dem Eluent gereinigt, um 62 als weißen Feststoff zu ergeben (832 mg; 63% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,23 (s, 1H, 8-H), 6,30 (t, J = 6,7 Hz, 1H, 1'-H), 5,89-5,99 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,28-5,35 (dm, J = 17,3 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,16-5,21 (dm, J = 10,5 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,33 (m, 1H, 3'-H), 4,13 (m, 1H, 4'-H), 4,03-4,12 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,86 (dd, J = 4,3, 11,2 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,81 (dd, J = 3,9, 11,2 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,68-2,75 (m, 1H, einer von 2'-H), 2,53-2,59 (ddd, J = 3,2, 6,2, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 0,88 (s, 9H, C(CH₃)₃), 0,08 (s, 3H, einer von SiCH₃), 0,07 (s, 3H, einer von SiCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 161,1, 154,2, 151,2, 141,9, 135,5, 124,9, 117,1, 86,7, 85,6, 80,0, 71,1, 64,5, 38,7, 26,5, 19,3, –5,1, –5,2; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₉H₃₁O₃N₅ClSi (M+H⁺): 440,1885, ermittelt: 440,1870.
3'-O-Allyl-5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2'-desoxyguanosin (63). Zu einer gerührten Suspension von 95% NaH-Pulver (223 mg; 8,83 mMol) in wasserfreiem THF (82 mL) wurde 3-Hydroxypropionitril (550 μL; 8,00 mMol) zugegeben und die Mischung 20 Min. lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde 62 (832 mg; 1,89 mMol) in wasserfreiem THF (20 mL) zugegeben und die Mischung 1 Std. lang bei 40°C gerührt. Bei Raumtemperatur wurde 80% Essigsäure (630 μL; 8,83 mMol) zugegeben und 20 Min. lang gerührt. Nach Evaporieren wurde Ethylacetat (100 mL) zugegeben. Die Mischung wurde mit gesättigtem wässrigem NaHCO₃, NaCl gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Evaporieren wurde der Rückstand mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:20) als dem Eluent gereinigt, um 63 als weißen Feststoff zu ergeben (661 mg; 83% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,92 (s, 1H, 8-H), 6,22 (dd, J = 6,4, 7,3 Hz, 1H, 1'-H), 5,89-5,99 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,29-5,35 (dm, J = 17,3 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,17-5,21 (dm, J = 10,5 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,30 (m, 1H, 3'-H), 4,11 (m, 1H, 4'-H), 4,03-4,12 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,79-3,86 (m, 2H, 5'-H), 2,56-2,64 (ddd, J = 5,9, 7,4, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,49-2,55 (ddd, J = 3,0, 6,1, 13,5 Hz, 1H, einer von 2'-H), 0,91 (s, 9H, C(CH₃)₃), 0,10 (s, 3H, einer von SiCH₃), 0,09 (s, 3H, einer von SiCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 158,7, 153,4, 151,0, 135,3, 134,1, 117,2, 117,1, 85,0, 83,8, 78,7, 70,2, 63,3, 38,2, 26,1, 18,5, –5,1, –5,3; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₉H₃₂O₄N₅Si (M+H⁺): 422,2224, ermittelt: 422,2209.
3'-O-Allyl-2'-desoxyguanosin (64). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 20 und das Rohprodukt wurde mittels Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:10) als dem Eluent gereinigt, um 64 als weißen Feststoff zu ergeben (434 mg; 90% Ausbeute): ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7,94 (s, 1H, 8-H), 6,22 (dd, J = 5,9, 8,4 Hz, 1H, 1'-H), 5,90-6,00 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,29-5,36 (dm, J = 17,2 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,17-5,21 (dm, J = 10,5 Hz, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,31 (m, 1H, 3'-H), 4,14 (m, 1H, 4'-H), 4,03-4,13 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,80 (dd, J = 3,8, 12,0 Hz, 1H, einer von 5'-H), 3,72 (dd, J = 3,7, 12,0 Hz, 1H, einer von 5'-H), 2,63-2,71 (ddd, J = 5,9, 8,4, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H), 2,45-2,52 (ddd, J = 2,1, 5,9, 13,6 Hz, 1H, einer von 2'-H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 156,4, 153,4, 150,6, 135,1, 134,8, 116,5, 116,3, 84,9, 82,6, 79,1, 69,0, 61,8, 36,4; HRMS (FAB+) berechnet für C₁₃H₁₈O₄N₅ (M+H⁺): 308,1359, ermittelt: 308,1358.
3'-O-Allyl-2'-desoxyguanosin-5'-triphosphat (65). Das Verfahren war ähnlich der Synthese von 51, um 65 als farblosen Sirup zu erhalten: ¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ 7,90 (s, 1H, 8-H), 6,21 (dd, J = 6,1, 8,1 Hz, 1H, 1'-H), 5,86-5,96 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5,27-5,35 (m, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 5,15-5,20 (m, 1H, einer von CH₂CH=CH₂), 4,30 (m, 1H, 3'-H), 4,15 (m, 1H, 4'-H), 4,02-4,14 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 3,75-3,85 (m, 2H, 5'-H), 2,60-2,73 (m, 1H, einer von 2'-H), 2,42-2,50 (m, 1H, einer von 2'-H); ³¹P NMR (121,4 MHz, D₂O) δ –10,9 (d, J = 18,9 Hz, 1P, γ-P), –11,3 (d, J = 19,6 Hz, 1P, α-P), –22,9 (t, J = 19,6 Hz, 1P, β-P).
III. Konstruktion eines Chips mit immobilisiertem, selbstprimendem DNA-Templat.
Der DNA-Chip wurde wie in 5 gezeigt konstruiert, was die drei nachfolgenden Schritte beinhaltete:
Synthese des alkynfunktionalisierten DNA-Templates. Die 5'-Amino-Haarnadel-DNA-Template (GeneLink, NY) 5'-NH₂-TTT-TTG-TTT-TTT-TTT-TCG-ATC-GAC-TTA-AGG-CGC-TTG-CGC-CTT-AAG-TCG-3' und 5'-NH₂-AGT-CAG-TCT-CTC-ATC-TCG-ACA-TCT-ACG-CTA-CTC-GTC-GAT-CGG-AAA-CAG-CTA-TGA-CCA-TGC-TTG-CAT-GGT-CAT-AGC-TGT-TTC-C-3' wurden durch die Zugabe von 300 μL DMSO-Lösung von 6-Heptyn-NHS-Ester [Succinimidyl-N-(6-Heptynoat)](0,8 M) in die 1000 μL DNA-Templatlösung (200 μM, in 0,25 M Na₂CO₃/NaHCO₃-Puffer, pH 9,0) mit 6-Heptynsäure gekoppelt. Die Reaktionsmischung wurde 5 h lang bei Raumtemperatur gerührt, um eine terminale Alkynylgruppe am 5'-Ende der Haarnadel-DNA zu erzeugen. Die daraus resultierende alkynfunktionalisierte DNA wurde durch Größen-Ausschluss-Chromatographie unter Verwendung von PD-10-Säulen (GE Health, NJ) von dem überschüssigen Reagens getrennt. Weiteres Entsalzen mit einer Oligonucleotid-Aufreinigungskartusche (Applied Biosystems, CA) und Trocknen erzeugte das Rohprodukt, das weiter aufgereinigt wurde mittels Umkehrphasen-HPLC (Waters HPLC-System enthaltend Waters Delta 600 Controller, Rheodyne 7725i Injektor und 2996 Photodioden-Array-Detektor, Milford, MA) unter Verwendung einer C-18 Umkehr-Säule (Xterra MS C18, 4,6 mm × 50 mm, 2,5 μm) bei einer Durchflussmenge von 0,5 mL/Min., mit Detektion bei 260 nm und Elution mit einem linearen Gradienten von 12–34,5% von B in A über 40 Min. (A: 4,4 mM Triethylamin und 100 mM wässrige Hexafluorisopropylalkohollösung, pH 8,1; B: Methanol). Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter Vakuum bis zur Trockenheit evaporiert. Es wurde eine MALDI-TOF-MS verwendet, um das Produkt auf einem matrixgestützten Voyager DE Laserspektrometer (Applied Biosystems, CA) unter Verwendung von 3-Hydroxypicolinsäure als Matrix zu charakterisieren.
Azidfunktionalisierung einer aminomodifizierten Glasoberfläche. Der aminomodifizierte Glasobjektträger (Corning^® GAPS II) wurde gereinigt und durch Eintauchen in eine basische Lösung [N,N-Diisopropyl-Ethylamin (DIPEA)/Dimethylformamid (DMF), 1:9 (V/V)] 30 Min. lang vorbehandelt. Der Glasobjektträger wurde dann mit DMF gewaschen und in die 2 mL DMF-Kopplungslösung transferiert, die 100 mM O-(2-Azidoethyl)-O'-[2-(Diglykolylamin)-Ethyl] Heptaethylenglykol (Fluka, Schweiz), Benzotriazol-1-yl-oxy-Tris-Pyrrolidino-Phosphoniumhexafluorophosphat (PyBOP)(Novabiochem, CA) und 200 mM DIPEA enthält. Das Reaktionsgefäß wurde 4 h lang bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt. Der azidfunktionalisierte Glasobjektträger wurde gründlich mit DMF und Ethanol gewaschen und dann unter einem Argongasstrom getrocknet.
DNA-Immobilisierung auf der azidmodifizierten Glasoberfläche unter Verwendung von 1,3-dipolarer Alkyn-Azid-Zykloadditions-Chemie. Durch Mischen von Tetrakis-(Acetonitril) Kupfer (I) Hexafluorphosphat (2 mM/DMSO), Tris-(Benzyltriazolylmethyl) Amin (TBTA)(2 mM/DMSO), Natriumascorbat (2,6 mM/H₂O) und Alkynyl-DNA (50 μM/H₂O) in einem volumetrischen Verhältnis von 3:3:2,3:3 wurde eine Kopplungsmischung hergestellt. Diese Kopplungsmischung wurde dann unter Zuhilfenahme von adhäsiven Silikonisolatoren (Grace Bio-Labs, OR) zur Bildung von gleichmäßigen Spots auf der Glasoberfläche in Tropfen zu 11,0 μL auf den azidfunktionalisierten Glasobjektträger aufgespottet. Der mit DNA-Spots versehene Glasobjektträger wurde in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur 8 h lang inkubiert, dann mit deionisiertem Wasser und SPSC-Puffer (50 mM Natriumphosphat/1M NaCl, pH 7,5) eine halbe Stunde lang gewaschen, um nicht-spezifisch gebundene DNA zu entfernen, und schließlich mit dH₂O gespült. Die Ausbildung einer stabilen Haarnadelstruktur wurde durch Bedecken der DNA-Spots mit 1X Thermopol II Reaktionspuffer (10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X-100, 4 mM MnCl₂, pH 8,8), Inkubation in einer Feuchtkammer 5 Min. lang bei 95°C zur Dissoziation von irgendwelcher partiellen Haarnadelstruktur, und nachfolgendes langsames Abkühlen zum Re-Annealing sichergestellt.
IV. Kontinuierliche DNA-Polymerasereaktion unter Verwendung von vier chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotiden als reversible Terminatoren in Lösung.
Wir charakterisierten die vier Nucleotidanaloga 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650 mittels Durchführung von vier kontinuierlichen DNA-Extensionsreaktionen unter sequentieller Verwendung eines Primers (5'-AGAGGATCCAACCGAGAC-3') und eines synthetischen DNA-Templates (5'-GTGTACATCAACATCACCTACCACCATGTCAGTCTCGGTTGGATCCTCTATTGTGTCCGG-3'), basierend auf einem Abschnitt des Exons 7 des humanen p53-Gens. Bei den vier Nucleotiden in dem Templat, die unmittelbar neben der Annealingstelle des Primers liegen, handelt es sich um 3'-ACTG-5'. Es wurde zunächst eine Polymerase-Extensionsreaktion unter Verwendung eines Pools aller vier Nucleotidanaloga zusammen mit dem Primer und dem Templat durchgeführt, die ein um eine Base extendiertes Produkt hervorbrachte. Die Reaktionsmischung für diese und alle nachfolgenden Extensionsreaktionen bestand aus 80 pmol Templat, 50 pmol Primer, 100 pmol 3'-O-Allyl-dNTPs-Allyl-Fluorophor, 1X Thermopol II Reaktionspuffer, 40 nmol Mn²⁺ und 2U einer Mutante der 9°N-DNA-Polymerase(exo-) A485L/Y409V in einem Gesamtvolumen von 20 μL. Die Reaktion bestand aus 20 Zyklen 20 Sek. lang bei 94°C, 40 Sek. lang bei 48°C und 90 Sek. lang bei 62°C. Im Anschluss wurde das Extensionsprodukt unter Anwendung einer Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt. Die Fraktion, die das gewünschte DNA-Produkt enthielt, wurde zur Analyse unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie gesammelt und gefriergetrocknet. Zur Deallylierung wurde das aufgereinigte DNA-Extensionsprodukt, das die fluoreszierenden Nucleotidanaloga trug, in entgastem Wasser resuspendiert, zu einem Deallylierungscocktail [1X Thermopol I Reaktionspuffer/Na₂PdCl₄/P(PhSO₃Na)₃] gegeben und 30 Sek. lang inkubiert, um ein deallyliertes DNA-Produkt zu erhalten, das durch MALDI-TOF-MS charakterisiert wurde. Das DNA-Produkt, bei dem zur Erzeugung einer freien 3'-OH-Gruppe sowohl das Fluorophor als auch die 3'-O-Allyl-Gruppe entfernt worden waren, wurde als ein Primer für eine zweite Extensionsreaktion unter Verwendung von 3'-O-Allyl-dNTPs-Allyl-Fluorophor verwendet. Das zweite extendierte DNA-Produkt wurde dann mittels HPLC aufgereinigt und deallyliert. Die dritte und vierte Extension wurden in ähnlicher Weise durchgeführt, wobei das zuvor extendierte und deallylierte Produkt als der Primer verwendet wurde.
V. Vierfarben-SBS-Reaktion auf einem Chip mit vier chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotiden als reversible Terminatoren.
Es wurden 10 Mikroliter einer Lösung bestehend aus 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510 (3 pmol), 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G (10 pmol), 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX (5 pmol) und 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5 (2 pmol), 1 U einer Mutante der 9°N-DNA-Polymerase sowie 1X Thermopol II Reaktionspuffer in Spots auf die Oberfläche des Chips aufgetragen, wo der selbstgeprimte DNA-Rest immobilisiert war. Dem zu dem DNA-Templat komplementären Nucleotidanalogon wurde 10 Min. lang bei 68°C die Integration in den Primer gestattet. Zur Synchronisation von irgendwelchen nicht integrierten Templaten wurde eine Extensionslösung bestehend aus jeweils 30 pmol 3'-O-Allyl-dCTP, 3'-O-Allyl-dTTP, 3'-O-Allyl-dATP und 3'-O-Allyl-dGTP, 1U einer Mutante der 9°N-DNA-Polymerase sowie 1X Thermopol II Reaktionspuffer auf dem gleichen Spot aufgetragen und 10 Min. lang bei 68°C inkubiert. Nach 5-minütigem Waschen des Chips mit einem SPSC-Puffer enthaltend 0,1% Tween 20 wurde die Oberfläche mit dH₂O gespült, kurz getrocknet und dann mit einem Vierfarben-ScanArray-Express-Scanner (Perkin-Elmer Life Sciences) gescannt, um das Fluoreszenzsignal zu detektieren. Der Vierfarben-Scanner ist mit vier Laser mit Anregungswellenlängen von 488, 543, 594 und 633 nm sowie mit auf 522, 570, 614 und 670 nm zentrierten Emissionsfiltern ausgestattet. Zur Deallylierung wurde der Chip in einen Deallylierungscocktail [1X Thermopol I Reaktionspuffer/Na₂PdCl₄/P(PhSO₃Na)₃ eingetaucht und 5 Min lang bei 60°C inkubiert. Der Chip wurde unmittelbar im Anschluss daran in einen 3M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) eingetaucht und 5 Min. lang bei 60°C inkubiert. Abschließend wurde der Chip mit Acetonitril/dH₂O (1:1, V/V) und dH₂O gespült. Die Oberfläche des Chips wurde erneut gescannt, um die Intensität der Fluoreszenz nach der Deallylierung mit der ursprünglichen Fluoreszenzintensität zu vergleichen. Diesem Vorgang folgte die nächste Polymerase-Extensionsreaktion unter Verwendung von 3'-O-Allyl-dNTPs-Allyl-Fluorophor und 3'-O-Allyl-dNTPs, mit anschließenden Wasch-, Fluoreszenzdetektions- sowie Deallylierungsprozessen, die wie zuvor beschrieben durchgeführt wurden. Der gleiche Zyklus wurde unter Verwendung der Mischung der vier chemisch abspaltbaren, fluoreszierenden Nucleotide in einer Polymerasereaktion mehrere Male wiederholt, um de novo DNA-Sequenzierungsdaten hinsichtlich verschiedener unterschiedlicher DNA-Templates zu erhalten.
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Zusammenfassung:
Diese Erfindung stellte ein Verfahren zum Sequenzieren von einsträngiger DNA unter Verwendung einer Nanopore und modifizierter Nucleotide zur Verfügung.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Perkin Elmer Catalogue 1996–1997, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, New Jersey, USA [0020]

Claims

Ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer DNA, umfassend die Durchführung der nachfolgenden Schritte für jeden Rest der zu sequenzierenden DNA: (a) Inkontaktbringen der DNA mit einer DNA-Polymerase in der Anwesenheit von (i) einem Primer und (ii) vier Nucleotidanaloga unter Bedingungen, die es der DNA-Polymerase gestatten, DNA-Synthese zu katalysieren, wobei (1) die Nucleotidanaloga aus einem Analogon von dGTP, einem Analogon von dCTP, einem Analogon von dTTP oder dUTP sowie einem Analogon von dATP bestehen, (2) jedes Nucleotidanalogon umfasst: (i) eine Base ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil sowie Analoga davon, (ii) eine Desoxyribose, (iii) einen Rest, der in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebunden ist, und (iv) eine spezifische Markierung, die in abspaltbarer Weise an die Base gebunden ist, so dass ein Nucleotidanalogon, das zu dem sequenzierten Rest komplementär ist, durch die DNA-Polymerase in die DNA integriert wird, und (3) jedes der vier Analoga eine spezifische Markierung aufweist, die sich von den spezifischen Markierungen der drei anderen Analoga unterscheidet; (b) Entfernen von nicht gebundenen Nucleotidanaloga; (c) erneutes Inkontaktbringen der DNA mit einer DNA-Polymerase in der Anwesenheit von (i) einem Primer und (ii) vier reversiblen Terminatoren unter Bedingungen, die es der DNA-Polymerase gestatten, DNA-Synthese zu katalysieren, wobei (1) die reversiblen Terminatoren aus einem Analogon von dGTP, einem Analogon von dCTP, einem Analogon von dTTP oder dUTP sowie einem Analogon von dATP bestehen, (2) jedes Nucleotidanalogon umfasst: (i) eine Base ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil sowie Analoga davon, wobei an diese Base keine spezifische Markierung gebunden ist, (ii) eine Desoxyribose und (iii) einen Rest, der in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebunden ist; (d) Entfernen von nicht gebundenen reversiblen Terminatoren; (e) Bestimmen der Identität des in Schritt (a) integrierten Nucleotidanalogons über Bestimmung der Identität der entsprechenden spezifischen Markierung, mit der Maßgabe, dass Schritt (e) entweder vor Schritt (c) oder im Anschluss an Schritt (d) erfolgen kann; und (f) im Anschluss an Schritt (e), außer in Bezug auf den letzten zu sequenzierenden DNA-Rest, Abspalten der spezifischen Markierung von den integrierten Nucleotidanaloga, sofern anwendbar, sowie des an das 3'-Sauerstoffatom der Desoxyribose gebundenen Rests, wodurch die Sequenz der DNA bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Schritt (e) vor Schritt (c) durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebundene Rest chemisch abspaltbar oder photospaltbar ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebundene Rest in den Nucleotidanaloga von Schritt (a) ein Allylrest oder ein 2-Nitrobenzylrest ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der in abspaltbarer Weise an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebundene Rest in den reversiblen Terminatoren von Schritt (c) ein Allylrest oder ein 2-Nitrobenzylrest ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die spezifische Markierung über einen chemisch abspaltbaren oder photospaltbaren Linker an die Base gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die über einen abspaltbaren Linker an die Base gebundene spezifische Markierung ein Farbstoff, ein Fluorophor, ein Chromophor, ein kombinatorischer Fluoreszenzenergietransfer-Tag, ein Masse-Tag oder ein Elektrophor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Rest durch Na₂PdCl₄/P(PhSO₃Na)₃ chemisch abspaltbar ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der Linker durch Na₂PdCl₄/P(PhSO₃Na)₃ chemisch abspaltbar ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Primer ein selbstprimender Rest ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA an ein festes Substrat gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die DNA über 1,3-dipolare Azid-Alkyn-Zykloadditions-Chemie an das feste Substrat gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die DNA über ein Polyethylenglykolmolekül an das feste Substrat gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die DNA alkynmarkiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die DNA über ein Polyethylenglykolmolekül an das feste Substrat gebunden ist und das feste Substrat azidfunktionalisiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die DNA über eine Azidobindung, eine Alkynylbindung oder eine Biotin-Streptavidin-Interaktion auf dem festen Substrat immobilisiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das feste Substrat in Form eines Chips, eines Beads, eines Wells, eines Kapillarröhrchens, eines Objektträgers, eines Wafers, eines Filters, einer Faser, eines porösen Mediums oder einer Säule vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das feste Substrat Gold, Quarz, Siliciumdioxid, Kunststoff, Glas, Diamant, Silber, Metall oder Polypropylen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das feste Substrat porös ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei etwa 1.000 oder weniger Kopien der DNA an das feste Substrat gebunden sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die reversiblen Terminatoren in Schritt (c) 3'-O-Allyl-dGTP, 3'-O-Allyl-dCTP, 3'-O-Allyl-dATP und 3'-O-Allyl-dUTP sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die reversiblen Terminatoren in Schritt (c) 3'-O-2-Nitrobenzyl-dGTP, 3'-O-2-Nitrobenzyl-dCTP, 3'-O-2-Nitrobenzyl-dATP und 3'-O-2-Nitrobenzyl-dUTP sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase eine 9°N-Polymerase oder eine Variante davon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA über ein Polyethylenglykolmolekül an das feste Substrat gebunden ist und das feste Substrat azidfunktionalisiert ist oder die DNA über eine Azidobindung, eine Alkynylbindung oder eine Biotin-Streptavidin-Interaktion auf dem festen Substrat immobilisiert ist; wobei (i) die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind, (ii) die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind oder (iii) die vier Nucleotidanaloga in Schritt (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind; und wobei die reversiblen Terminatoren in Schritt (c) 3'-O-Allyl-dGTP, 3'-O-Allyl-dCTP, 3'-O-Allyl-dATP und 3'-O-Allyl-dUTP sind.
Ein Kit zur Durchführung des Verfahren gemäß Anspruch 1, umfassend, in separaten Kompartimenten, (a) Nucleotidanaloga von (i) GTP, (ii) ATP, (iii) CTP und (iv) TTP oder UTP, wobei jedes Analogon umfasst: (i) eine Base, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil oder einem Analogon davon, (ii) eine Desoxyribose, (iii) einen an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebundenen abspaltbaren Rest und (iv) eine spezifische Markierung, die über eine abspaltbaren Linker an die Base gebunden ist; (b) reversible Terminatoren, umfassend ein Nucleotidanalogon von (i) GTP, (ii) ATP, (iii) CTP und (iv) TTP oder UTP, wobei jedes Analogon umfasst: (i) eine Base, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil oder einem Analogon davon, wobei an diese Base keine spezifische Markierung gebunden ist, (ii) eine Desoxyribose und (iii) einen an den 3'-Sauerstoff der Desoxyribose gebundenen abspaltbaren Rest; (c) für die Verwendung bei DNA-Polymerisation geeignete Reagenzien; und (d) eine Gebrauchsanweisung.
Kit gemäß Anspruch 28, wobei die Nucleotidanaloga von Teil (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Cy5, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind.
Kit gemäß Anspruch 28, wobei die Nucleotidanaloga von Teil (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind.
Kit gemäß Anspruch 28, wobei die Nucleotidanaloga von Teil (a) 3'-O-Allyl-dGTP-Allyl-Bodipy-650, 3'-O-Allyl-dCTP-Allyl-Bodipy-FL-510, 3'-O-Allyl-dATP-Allyl-ROX und 3'-O-Allyl-dUTP-Allyl-R6G sind.
Kit gemäß Anspruch 28, wobei die Nucleotidanaloga von Teil (b) 3'-O-Allyl-dGTP, 3'-O-Allyl-dCTP, 3'-O-Allyl-dATP und 3'-O-Allyl-dUTP sind.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die reversiblen Terminatoren in Schritt (c) 3'-O-2-Nitrobenzyl-dGTP, 3'-O-2-Nitrobenzyl-dCTP, 3'-O-2-Nitrobenzyl-dATP und 3'-O-2-Nitrobenzyl-dUTP sind.