DE69736434T2

DE69736434T2 - Energieübertragungsfarbstoffe mit verbesserter Fluoreszenz

Info

Publication number: DE69736434T2
Application number: DE69736434T
Authority: DE
Inventors: Linda G. Palo Alto Lee; Sandra L. San Mateo Spurgeon; Barnett San Jose Rosenblum
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2017-05-03
Also published as: DE69736434D1; DE69700935T2; JP3592173B2; JP2000187036A; JP2004068023A; EP0805190A2; JPH1088124A; EP0805190A3; JP2004043819A; DE69700935D1; EP0805190B1; CA2203494A1; ATE335051T1; AU691143B2; JP2003274999A; JP2000154381A; CA2203494C; ATE187752T1; JP3499238B2; JP3090626B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft fluoreszierende Farbstoffe und spezieller fluoreszierende Energieübertragungsfarbstoffe und ihre Verwendung.
Beschreibung von verwandtem Stand der Technik
Verschiedene fluoreszierende Farbstoffe wurden für ein Markieren und Feststellen von Komponenten in einer Probe entwickelt. Im allgemeinen haben fluoreszierende Farbstoffe vorzugsweise eine hohe Quantenausbeute und einen großen Extinktionskoeffizienten, so daß der Farbstoff verwendet werden kann, um kleine Mengen der festzustellenden Komponente zu ermitteln. Fluoreszierende Farbstoffe haben auch vorzugsweise einen großen Stokes-Shift (d. h. den Unterschied zwischen der Wellenlänge, bei welcher der Farbstoff maximales Absorptionsvermögen hat, und der Wellenlänge, bei der der Farbstoff maximale Emission hat), so daß die fluoreszierende Emission leicht von der Lichtquelle unterschieden werden kann, die zur Erregung des Farbstoffes verwendet wird.
Eine Klasse von fluoreszierenden Farbstoffen, die entwickelt wurde, sind die fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffe. Im allgemeinen schließen fluoreszierende Energieübertragungsfarbstoffe einen Donor-Fluorophor und einen Akzeptor-Fluorophor ein. Wenn der Donor-Fluorophor und der Akzeptor-Fluorophor in der Nähe zueinander angeordnet sind und die geeignete Ausrichtung in bezug aufeinander haben, wird bei diesen Farbstoffen die Energieemission von dem DonorFluorophor durch den Akzeptor-Fluorophor absorbiert und bewirkt, daß der Akzeptor-Fluorophor fluoresziert. Es ist daher wichtig, daß der erregte Donor-Fluorophor in der Lage ist, die Erregungsenergie des Donor-Fluorophors effizient zu absorbieren und die Energie zu dem Akzeptor-Fluorophor effizient zu übertragen.
In der Literatur wurden verschiedene fluoreszierende Energieübertragungsfarbstoffe beschrieben. Beispielsweise beschreiben die US-Patentschrift Nr. 4 996 143 und die WO 95/21 266 fluoreszierende Energieübertragungsfarbstoffe, bei denen die Donor- und Akzeptor-Fluorophore durch eine Oligonukleotidkette verbunden sind. Lee et al., Nucleic Acids Research, 20:10, Seiten 2471 bis 2483 (1992), beschreiben einen fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff, welcher 5-Carboxyrhodamin einschließt, welches mit 4'-Aminomethyl-5-carboxyfluorescein durch den 4'-Aminomethylsubstituenten an Fluorescein gebunden ist.
Mehrere diagnostische und analytische Assays wurden entwickelt, die die Feststellung mehrerer Komponenten in einer Probe unter Verwendung fluoreszierender Farbstoffe, z. B. durch Strömungszytometrie (Lanier et al., J. Immunol. 132, Seiten 151 bis 156 [1984]), Chromosomenanalyse (Gray et al., Chromosoma 73, Seiten 9 bis 27 [1979]) und DNA-Sequenzieren, einschließen. Für diese Assays ist es erwünscht, gleichzeitig einen Satz von zwei oder mehr spektral auflösbaren fluoreszierenden Farbstoffen zu verwenden, so daß mehr als eine Zielsubstanz in der Probe gleichzeitig ermittelt werden kann. Gleichzeitige Ermittlung mehrerer Komponenten in einer Probe unter Verwendung von Mehrfachfarbstoffen vermindert die Zeit, die erforderlich ist, um einzelne Komponenten in einer Probe nacheinander zu ermitteln. Im Falle von Multi-Loci-DNA-Sondenassays vermindert die Verwendung mehrfacher spektral auflösbarer fluoreszierender Farbstoffe die Anzahl von Reagenzgläsern, die erforderlich ist, so daß die experimentellen Protokolle vereinfacht und die Herstellung anwendungsspezifischer Kits erleichtert werden. Im Falle automatisierter DNA-Sequenzierung erlaubt die Verwendung mehrfacher spektral auflösbarer fluoreszierender Farbstoffe die Analyse aller vier Basen in einer einzigen Bahn, wodurch der Durchsatz gegenüber Methoden mit einer einzelnen Farbe erhöht und mit elektrophoretischen Zwischenbahnmobilitätsänderungen verbundene Unbestimmtheiten ausgeschaltet werden. Connell et al., Biotechniques, 5, Seiten 342 bis 348 (1987), Prober et al., Science, 238, Seiten 336 bis 341 (1987), Smith et al., Nature, 321, Seiten 674 bis 679 (1986) und Ansorge et al., Nucleic Acids Research, 15, Seiten 4593 bis 4602 (1989).
Es gibt verschiedene Schwierigkeiten, die damit verbunden sind, einen Satz von fluoreszierenden Farbstoffen für gleichzeitige Feststellung mehrerer Zielsubstanzen in einer Probe zu erhalten, insbesondere für Analysen, die eine elektrophoretische Trennung und Behandlung mit Enzymen, z. B. DNA-Sequenzierung, erfordern. Beispielsweise muß jeder Farbstoff in dem Satz von den anderen Farbstoffen spektral auflösbar sein. Es ist schwierig, eine Zusammenstellung von Farbstoffen zu finden, deren Emissionsspektren spektral aufgelöst werden, da die typische Halbwertsbreite der Emissionsbande für organische fluoreszierende Farbstoffe etwa 40 bis 80 nm (Nanometer) ist und die Breite des verfügbaren Spektrums durch die Erregungslichtquelle beschränkt ist. Wenn hier, der Begriff "spektrale Auflösung" unter Bezug auf einen Satz von Farbstoffen verwendet wird, bedeutet dies, daß die fluoreszierenden Emissionsbanden der Farbstoffe ausreichend unterschieden sind, d. h. sich ausreichend nicht überlappen, daß Reagenzien, an denen die betreffenden Farbstoffe befestigt werden, z. B. Polynukleotide, auf der Basis des durch die betreffenden Farbstoffe unter Verwendung von Standard-Photoermittlungssystemen erzeugten fluoreszierenden Signals unterschieden werden können, z. B. unter Verwendung eines Systems von Bandpaßfiltern und Photoelektronenvervielfacherröhren, ladungsgekoppelten Einrichtungen und Spektrographen oder dergleichen, wie durch die Systeme erläutert ist, die in den US-Patentschriften Nr. 4 230 558 und 4 811 218 oder in Wheeless et al., Seiten 21 bis 76 in Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, New York, 1985) beschrieben sind.
Das fluoreszierende Signal eines jeden der Farbstoffe muß auch ausreichend stark sein, so daß jede Komponente mit ausreichender Empfindlichkeit festgestellt werden kann. Beispielsweise können im Fall von DNA-Sequenzierung gesteigerte Probenbeladungen nicht geringe Fluoreszenzwirksamkeiten kompensieren, Pringle et al., DNA Core Facilities Newsletter, 1, Seiten 15 bis 21 (1988). Das durch einen Farbstoff entwickelte Fluoreszenzsignal ist allgemein am größten, wenn der Farbstoff bei seinem Absorptionsmaximum erregt wird. Es ist daher bevorzugt, daß jeder Farbstoff etwa bei seinem Absorptionsmaximum erregt wird.
Eine weitere Schwierigkeit, die mit der Verwendung eines Satzes von Farbstoffen verbunden ist, besteht darin, daß die Farbstoffe allgemein nicht das gleiche Absorptionsmaximum haben. Wenn ein Satz von Farbstoffen verwendet wird, welcher nicht das gleiche Absorptionsmaximum hat, erzeugt man einen Kompromiß zwischen den höheren Kosten, die mit Mehrfachlichtquellen zur Erregung eines jeden Farbstoffes bei seinem Absorptionsmaximum verbunden sind, und der niedrigeren Empfindlichkeit, die bei jedem Farbstoff auftritt, der nicht bei seinem Absorptionsmaximum erregt wird.
Zusätzlich zu den obigen Schwierigkeiten dürfen die Ladung, die Molekülgröße und die Struktur der Farbstoffe die elektrophoretischen Mobilitäten der Bruchstücke nicht nachteilig beeinflussen. Die fluoreszierenden Farbstoffe müssen auch mit der Chemie verträglich sein, die verwendet wird, um die Bruchstücke zu erzeugen oder zu manipulieren, wie beispielsweise Lösungsmittel der DNA-Synthese und Reagenzien, Puffer, Polymeraseenzyme, Ligaseenzyme und dergleichen.
Wegen der mehrfachen Zwänge bei der Entwicklung eines Satzes von Farbstoffen für Mehrfarbanwendungen, besonders im Bereich der Vierfarb-DNA-Sequenzierung, wurden nur einige wenige Sätze von fluoreszierenden Farbstoffen entwickelt. Connell et al., Biotechniques, 5, Seiten 342 bis 348 (1987), Prober et al., Science, 238, Seiten 336 bis 341 (1987) und Smith et al., Nature, 321, Seiten 674 bis 679 (1986).
Eine Klasse von fluoreszierenden Farbstoffen, die sich bei Mehrfarbanwendungen als brauchbar erwies, sind Rhodaminfarbstoffe, z. B. Tetramethylrhodamin (TAMRA); Rhodamin X (ROX), Rhodamin 6G (R6G), Rhodamin 110 (R110) und dergleichen. US-Patentschrift Nr. 5 366 860. Rhodaminfarbstoffe sind in bezug auf Fluoresceinfarbstoffe besonders attraktiv, da 1. Rhodamine typischerweise lichtbeständiger als Fluoresceine sind, 2. mit Rhodamin markierte Didesoxynukleotide bessere Substrate für wärmebeständige Polymeraseenzyme sind und 3. die Emissionsspektren von Rhodaminfarbstoffen signifikant zu dem Rot (höherer Wellenlänge) von Fluoresceinen sind.
Ein Nachteil, der mit derzeit verfügbaren Rhodaminfarbstoffen verbunden ist, besonders in Verbindung mit Mehrfachfeststellungsmethoden, ist das relativ breite Emissionsspektrum der Rhodaminfarbstoffe. Dieses breite Emissionsspektrum beschränkt die spektrale Auflösung zwischen spektral benachbarten Farbstoffen, was die Analyse mehrerer Komponenten solcher Farbstoffkombinationen schwierig macht. Ein zweiter Nachteil, der mit derzeit verfügbaren Rhodaminfarbstoffen verbunden ist, besteht darin, daß ihr Absorptionsspektrum nicht zu der Wellenlänge derzeit erhältlicher, in festem Zustand frequenzverdoppelter grüner Diodenlaser paßt, z. B. zu Neodym-YAG-Lasern in festem Zustand, die eine Emissionslinie bei etwa 532 nm haben. Es ist äußerst vorteilhaft, solche Laser wegen ihrer kompakten Größe, langen Lebensdauer und wirksamen Energieausnutzung zu verwenden.
Energieübertragungs-Fluoreszenzfarbstoffe besitzen mehrere Merkmale, die sie für die Verwendung bei der gleichzeitigen Ermittlung mehrerer Zielsubstanzen in einer Probe, wie bei der DNA- Sequenzierung, attraktiv machen. Beispielsweise kann ein einzelner Donor-Fluorophor in einem Satz von fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen verwendet werden, so daß jeder Farbstoff starke Absorption bei einer gemeinsamen Wellenlänge hat. Dann kann durch Variieren des Akzeptor-Fluorophors in dem Energieübertragungsfarbstoff eine Reihe von Energieübertragungsfarbstoffen mit spektral auflösbaren Fluoreszenzemissionen erzeugt werden.
Fluoreszierende Energieübertragungsfarbstoffe ergeben auch einen größeren effektiven Stokes-Shift als die fluoreszierenden Nichtenergieübertragungsfarbstoffe. Dies ist eine Folge davon, daß der Stokes-Shift für einen fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff auf dem Unterschied zwischen der Wellenlänge, bei welcher der Donor-Fluorophor maximal Licht absorbiert, und der Wellenlänge, bei welcher der Akzeptor-Fluorophor maximal Licht emittiert, beruht. Im allgemeinen besteht ein Bedarf an fluoreszierenden Farbstoffen mit größeren Stokes-Shifts.
Die Empfindlichkeit irgendeines Assays unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffes hängt von der Stärke des Fluoreszenzsignales ab, welches durch den fluoreszierenden Farbstoff entwickelt wird. Es besteht daher ein Bedarf an Fluoreszenzfarbstoffen, die ein starkes Fluoreszenzsignal haben. In bezug auf fluoreszierende Energieübertragungsfarbstoffe hängt die Stärke des Fluoreszenzsignals dieser Farbstoffe davon ab, wie effizient der Akzeptor-Fluorophor die Energieemission des Donor-Fluorophors absorbiert. Dies seinerseits hängt von verschiedenen Variablen ab, wie der Nähe des Donor-Fluorophors zu dem Akzeptor-Fluorophor und der Ausrichtung des Donor-Fluorophors in bezug auf den Akzeptor-Fluorophor. Es besteht somit ein Bedarf an fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen, in welchen die Orientierung zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Fluorophor derart ist, daß Energie zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Fluorophor effizient übertragen wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft fluoreszierende Energieübertragungsfarbstoffe mit verbesserter Fluoreszenz. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Reagenzien, die Energieübertragungsfarbstoffe nach der vorliegenden Erfindung einschließen, Verfahren zur Verwendung der Farbstoffe und Reagenzien sowie Kits, in denen die Farbstoffe und Reagenzien eingeschlossen sind.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Energietransferfarbstoff, der aufweist:
einen Fluorescein- oder Rhodamin-Donorfarbstoff, der in der Lage ist, Licht bei einer ersten Wellenlänge zu absorbieren und hierauf Anregungsenergie zu emittieren,
einen Fluoreszein- oder Rhodamin-Akzeptorfarbstoff, der in der Lage ist, Anregungsenergie, die von dem Donorfarbstoff emittiert wird, zu absorbieren und hierauf bei einer zweiten Wellenlänge zu fluoreszieren und
einen Linker, der die Ringposition 4', 5 oder 6 des Donorfarbstoffs mit der Ringposition 4', 5 oder 6 des Akzeptorfarbstoffs verbindet, wobei der Linker eine funktionelle Gruppe aufweist, die aus der Gruppe, die aus einem Alken, Dien, Alkin, einem fünf- oder sechsgliedrigen Ring mit mindestens einer ungesättigten Bindung und einer kondensierten Ringstruktur besteht, ausgewählt ist,
wobei entweder der Donor- oder der Akzeptorfarbstoff oder beide ein 4,7-Dichlorrhodamin-Farbstoff sind.
Ein Linker zum Verknüpfen eines Donor-Farbstoffs mit einem Akzeptor-Farbstoff in einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff hat die allgemeine Struktur R₂₁Z₁C(O)R₂₂R₂₈, wie unten erläutert, worin R₂₁ ein an den Donor-Farbstoff gebundener C_1-5-Alkylrest ist, C(O) eine Carbonylgruppe ist, Z₁ entweder NH, Schwefel oder Sauerstoff ist, R₂₂ ein an den Carbonylkohlenstoff gebundener Substituent ist, der eine funktionelle Gruppe einschließt, welche unter Alken, Dien, Alkin, einem fünf- oder sechsgliedrigen Ring mit wenigstens einer ungesättigten Bindung oder einer verschmolzenen Ringstruktur ausgewählt ist, und R₂₈ eine funktionelle Gruppe einschließt, die den Linker an den Akzeptor-Farbstoff bindet.
Die in dem Linker verwendete Gruppe R₂₈ kann irgendeine Gruppe sein, die bekanntermaßen verwendet werden kann, um die Gruppe R₂₂ an einen Akzeptor-Farbstoff zu binden. Typischerweise wird die Gruppe R₂₈ an einen Benzolring oder eine andere aromatische Ringstruktur an dem Akzeptor-Farbstoff gebunden. Demnach wird R₂₈ vorzugsweise gebildet, indem man eine elektrophile funktionelle Gruppe am Benzolring oder an einer anderen aromatischen Ringstruktur des Akzeptor-Farbstoffes bildet, wie eine Carbonsäure, ein Säurehalogenid, eine Sulfonsäure, einen Ester, einen Aldehyd, Thio, ein Disulfid, ein Isothiocyanat, ein Isocyanat, ein Sulfonylhalogenid, ein Maleimid, einen Hydroxysuccinimidester, Halogenacetyl, einen Hydroxysulfosuccinimidester, einen Imidoester, ein Hydrazin, Azidonitrophenyl und ein Azid. Die Gruppe R₂₂ kann dann an den Akzeptor-Farbstoff angefügt werden, entweder vor oder nach der Verknüpfung des Donor-Farbstoffes mit der Gruppe R₂₂, indem das elektrophile Agens an dem Akzeptor-Farbstoff mit einem Nukleophil, wie einem Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylnukleophil, reagiert.
Beispielsweise hat bei der nachfolgend erläuterten Ausführungsform der Linker die allgemeine Struktur R₂₁Z₁C(O)R₂₂R₂₉Z₂C(O), worin R₂₁ und R₂₂ wie oben definiert sind, Z₁ und Z₂ jeweils unabhängig voneinander NH, Schwefel oder Sauerstoff bedeuten und R₂₉ ein C_1-5-Alkyl ist und die endständige Carbonylgruppe an die Ringstruktur des Akzeptor-Farbstoffes gebunden ist. Bei der Variation, bei der Z₂ Stickstoff ist, bildet die C(O)R₂₂R₂₉Z₂-Untereinheit eine Aminosäureuntereinheit.
Bei dieser Ausführungsform kann der Linker durch die Umsetzung eines (NHS-Esters) mit aktivierter Carbonylgruppe mit einer Amin-, Hydroxyl- oder Thiolgruppe gebildet werden. Es ist festzustellen, daß eine große Vielzahl anderer Mechanismen zur Bindung einer Gruppe R₂₂ an einen Akzeptor-Farbstoff ins Auge gefaßt werden kann und innerhalb des Erfindungsgedankens fallen soll.
Spezielle Beispiele von fünf- oder sechsgliedrigen Ringen, die als R₂₂ in dem Linker verwendet werden können, schließen Cyclopenten, Cyclohexen, Cyclopentadien, Cyclohexadien, Furan, Thiofuran, Pyrrol, Isopyrrol, Isoazol, Pyrazol, Isoimidazol, Pyran, Pyron, Benzol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin und Oxazin ein, sind hierauf aber nicht beschränkt. Beispiele verschmolzener Ringstrukturen schließen Inden, Benzofuran, Thionaphthen, Indol und Naphthalin ein, sind hierauf aber nicht beschränkt.
In einem bevorzugten Linker sind R₂₁ und R₂₉ Methylen, Z₁ und Z₂ sind NH und R₂₂ ist Benzol, wie nachfolgend gezeigt.
Die fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung kann einen Donor-Farbstoff einschließen, welcher die folgende Xanthenringstruktur mit einer 4'-Ringstellung hat
worin Y₁ Hydroxyl ist und Y₂ Sauerstoff ist oder Y₁ Amin ist und Y₂ Iminium ist, wobei das Iminium und Amin vorzugsweise ein tertiäres Iminium oder Amin sind. R₁₁ bis R₁₇ können irgendein Substituent sein, der mit den Energieübertragungsfarbstoffen der vorliegenden Erfindung verträglich ist, wobei festgestellt wird, daß R₁₁ bis R₁₇ stark variiert werden können, um die Spektral- und Mobilitätseigenschaften der Farbstoffe zu verändern.
Der Energieübertragungsfarbstoff schließt auch einen Akzeptor-Farbstoff ein, der die Erregungsenergie absorbiert, die von dem Donor-Farbstoff emittiert wird und in Reaktion hierauf bei einer zweiten Wellenlänge fluoresziert. Der Energieübertragungsfarbstoff schließt auch einen Linker ein, der den Donor-Farbstoff an den Akzeptor-Farbstoff bindet.
Bei einer Abwandlung hat der Linker die allgemeine Struktur R₂₁Z₁C(O)R₂₂R₂₈, wie oben erläutert, worin R₂₁ ein C_1-5-Alkyl ist, welches in der 4'-Stellung des Xanthen-Donor-Farbstoffes gebunden ist, C(O) eine Carbonylgruppe ist, Z₁ entweder NH, Schwefel oder Sauerstoff ist, R₂₂ ein an den Carbonylkohlenstoff gebundener Substituent ist, der jeweils Alken, Dien, Alkin, ein fünf- oder sechsgliedriger Ring mit wenigstens einer ungesättigten Bindung oder eine verschmolzene Ringstruktur sein kann, und R₂₈ eine funktionelle Gruppe einschließt, die den Linker an den Akzeptor-Farbstoff bindet.
Bei einer weiteren Abwandlung hat der Linker die allgemeine Struktur R₂₁Z₁C(O)R₂₂R₂₉Z₂C(O), wie oben erläutert, worin R₂₁ und R₂₂ wie oben definiert sind, Z₁ und Z₂ jeweils unabhängig voneinander NH, Schwefel oder Sauerstoff sind und R₂₉ ein C_1-5-Alkyl ist und die endständige Carbonylgruppe an die Ringstruktur des Akzeptor-Farbstoffes gebunden ist. Bei der Abwandlung, worin R₂ Stickstoff ist, bildet -C(O)R₂₂R₂₉Z₂- eine Aminosäureuntereinheit.
Bei einer weiteren bevorzugten Abwandlung ist der Linker ein solcher, worin R₂₁ und R₂₉ Methylen, R₁ und Z₂ NH sind und R₂₂ Benzol ist, wie nachfolgend gezeigt.
Der Donor-Farbstoff kann gegebenenfalls ein Glied aus der Farbstoffklasse sein, worin R₁₇ ein Phenyl oder substituiertes Phenyl ist. Wenn Y₁ Hydroxyl und Y₂ Sauerstoff und R₁₇ ein Phenyl oder substituiertes Phenyl sind, ist der Farbstoff ein Glied der Fluorescein-Farbstoffklasse. Wenn Y₁ Amin und Y₂ Iminium und R₁₇ ein Phenyl oder substituiertes Phenyl sind, ist der Farbstoff ein Glied aus der Rhodamin-Farbstoffklasse.
Die fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffe können Donor- und Akzeptor-Farbstoffe mit der allgemeinen Struktur
haben, worin Y₁ Hydroxyl ist und Y₂ Sauerstoff ist oder Y₁ Amin ist und Y₂ Iminium ist, wobei das Iminium und Amin vorzugsweise ein tertiäres Iminium oder Amin sind, und R₁₁ bis R₁₆ Substituenten sind, die mit den Energieübertragungsfarbstoffen der vorliegenden Erfindung verträglich sind.
Wie nachfolgend erläutert, ist bei dieser Ausführungsform der Linker an einen der Substituenten X₃ und X₄ jeweils des Donor- und des Akzeptor-Farbstoffes, vorzugsweise an die Substituenten X₃ der Donor- und Akzeptor-Farbstoffe, gebunden. Bei dieser Ausführungsform ist der Linker vorzugsweise kurz und/oder starr, da sich zeigte, daß dies die Energieübertragung zwischen den Donor- und den Akzeptor-Farbstoffen verbessert.
Außer den oben beschriebenen neuen fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen betrifft die vorliegende Erfindung auch fluoreszierende Reagenzien, die die fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffe enthalten. Im allgemeinen schließen diese Reagenzien irgendein Molekül oder Material ein, an welches die Energieübertragungsfarbstoffe nach der Erfindung gebunden werden können, und die verwendet werden können, um das Vorhandensein des Reagenz auf der Basis der Fluoreszenz des Energieübertragungsfarbstoffes zu ermitteln. Bei einer Ausführungsform wird ein fluoreszierendes Reagenz vorgesehen, welches ein Nukleosid oder ein Mono-, Di- oder Triphosphatnukleotid einschließt, welches mit einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff markiert ist. Das Nukleotid kann ein Desoxynukleotid sein, welches beispielsweise bei der Herstellung von farbstoffmarkierten Oligonukleotiden verwendet werden kann. Das Nukleotid kann auch ein Didesoxynukleosid sein, welches beispielsweise beim Farbstoffterminatorsequenzieren verwendet werden kann. Bei einer anderen Ausführungsform schließt das fluoreszierende Reagenz ein mit einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff markiertes Oligonukleotid ein. Diese Reagenzien können beispielsweise beim Farbstoffprimersequenzieren verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren, welche die fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffe und Reagenzien der vorliegenden Erfindung verwenden. Bei einer Ausführungsform schließt das Verfahren die Bildung einer Reihe unterschiedlich großer, mit einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung markierte Oligonukleotide, eine Trennung der Reihe von markierten Oligonukleotiden aufgrund ihrer Größe, Feststellung der getrennten markierten Oligonukleotide auf der Basis der Fluoreszenz des Energieübertragungsfarbstoffes ein.
Bei einer Ausführungsform dieses Verfahrens wird ein Gemisch von verlängerten markierten Primern durch Hybridisieren einer Nukleinsäuresequenz mit einem Oligonukleotidprimer in Gegenwart von Desoxynukleotidtriphosphaten und wenigstens eines farbstoffmarkierten Didesoxynukleotidtriphosphats und einer DNA-Polymerase gebildet. Die DNA-Polymerase dient dazu, den Primer mit den Desoxynukleotidtriphosphaten zu verlängern, bis ein Didesoxynukleotidtriphosphat vorliegt, welches die Verlängerung des Primers beendet. Wenn beendet, wird das Gemisch von verlängerten Primern getrennt und auf der Basis der Fluoreszenz des Farbstoffes an dem Didesoxynukleosid ermittelt. Bei einer Abwandlung dieser Ausführungsform werden vier verschiedene fluoreszierend markierte Didesoxynukleotidtriphosphate verwendet, d. h. ein fluoreszierend markiertes Didesoxycytosintriphosphat, ein fluoreszierend markiertes Didesoxyadenosintriphosphat, ein fluoreszierend markiertes Didesoxyguanosintriphosphat und ein fluoreszierend markiertes Didesoxythymidintriphosphat. Bei einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens ist der Oligonukleotidprimer im Gegensatz zu dem Desoxynukleotidtriphosphatfluoreszierend markiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits, die Farbstoffe und Reagenzien zur Durchführung der DNA-Sequenzierung unter Verwendung der Farbstoffe und Reagenzien nach der vorliegenden Erfindung enthalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 erläutert die Modifikation eines Carboxysubstituenten an einem Energieübertragungsfarbstoff zu einem aktivierten N-Hydroxysuccinimidyl-(NHS)-ester, welcher dann mit einem Aminohexyloligomer unter Bildung eines farbstoffmarkierten Oligonukleotidprimers umgesetzt wird.
2 vergleicht die Fluoreszenzemissionsstärke einer Reihe von Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung mit anderen Energieübertragungsfarbstoffen und dem Akzeptor-Farbstoff allein.
Die 3A und 3B zeigen mehrere besonders bevorzugte Ausführungsformen von 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffverbindungen, die in den Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Die 4A und 4B zeigen bevorzugte verallgemeinerte Syntheseschemata für die Herstellung der 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffe nach der Erfindung.
4A zeigt eine verallgemeinerte Synthese, bei der der Substituent X₁ etwas anderes als Carboxylat sein kann.
4B zeigt eine verallgemeinerte Synthese, bei der der Substituent X₁ Carboxylat ist.
5 erläutert einen Satz von vier Farbstoffen (3-Carboxy-R110, 5-Carboxy-R6R, 5TMR-B-CF und 5ROX-CF), die spektral auflösbar voneinander sind.
6 erläutert einen Satz von vier Farbstoffen (3-Carboxy-R110, 5-Carboxy-R6R, 5ROX-CF und Cy5-CF), die spektral voneinander auflösbar sind.
7 ist eine Graphik des Gemisches von markierten Oligonukleotiden, die während einer Farbstoffprimersequenzierung unter Verwendung von 5TMR-CF- und 5TMR-B-CF-markierten Primern erzeugt werden.
8 ist eine vierfarbige graphische Darstellung von Farbstoffprimersequenzierung unter Verwendung eines Vierfarbstoffsatzes einschließlich 3-Carboxy-R110, 5-Carboxy-R6G, 5TMR-CF und 5TMR-B-CF.
Die 9A bis 9D vergleichen die Fluoreszenzemissionsstärke einer Reihe von Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung mit dem entsprechenden Akzeptor-Farbstoff allein.
9A liefert das überlagerte Spektrum von 6-CFB-DR110-2 und DR110-2.
9B liefert ein überlagertes Spektrum von 5-CFB-DR6G-2 und DR6G-2.
9C liefert ein überlagertes Spektrum von 6CFB-DTMR-2 und DTMR-2.
9D liefert ein überlagertes Spektrum von 6-CFB-DROX-2 und DROX-2.
10 erläutert einen Satz von vier Farbstoffen (5-CFB-DR110-2, 5-CFB-DR6G-2, 6-CFB-DTMR-2 und 6-CFB-DROX-2), die spektral voneinander auflösbar sind.
11 ist eine graphische Darstellung eines Gemisches von markierten Oligonukleotiden, die während einer Farbstoffprimersequenzierung unter Verwendung von 6-CFB-DTMR-2- und DTMR-2-markierten Primern erzeugt werden.
12 ist eine graphische Darstellung eines Gemisches von markierten Oligonukleotiden, die während einer Farbstoffprimersequenzierung unter Verwendung von 5-CF-TMR-2- und 5-CF-B-TMR-2-markierten Primern erzeugt werden.
13 ist eine vierfarbige graphische Darstellung von Farbstoffprimersequenzierung unter Verwendung eines Vierfarbensatzes einschließlich 5-CFB-DR110-2, 6-CFB-DR6G-2, 5-CFG-DTMR-2 und 5-CFB-DROX-2.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
I. Energieübertragungsfarbstofflinker nach der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft fluoreszierende Energieübertragungsfarbstoffe, die Linker enthalten. Es wurde gefunden, daß diese Linker die effiziente Energieübertragung zwischen einem Donor- und einem Akzeptor-Farbstoff in einem Energieübertragungsfarbstoff erleichtern.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Energietransferfarbstoff bereitgestellt, der aufweist:
einen Fluorescein- oder Rhodamin-Donorfarbstoff, der in der Lage ist, Licht bei einer ersten Wellenlänge zu absorbieren und hierauf Anregungsenergie zu emittieren,
einen Fluorescein- oder Rhodamin-Akzeptorfarbstoff, der in der Lage ist, Anregungsenergie, die von dem Donorfarbstoff emittiert wird, zu absorbieren und hierauf bei einer zweiten Wellenlänge zu fluoreszieren und
einen Linker, der die Ringposition 4', 5 oder 6 des Donorfarbstoffs mit der Ringposition 4', 5 oder 6 des Akzeptorfarbstoffs verbindet, wobei der Linker eine funktionelle Gruppe aufweist, die aus der Gruppe, die aus einem Alken, Dien, Alkin, einem fünf- oder sechsgliedrigen Ring mit mindestens einer ungesättigten Bindung und einer kondensierten Ringstruktur besteht, ausgewählt ist,
wobei entweder der Donor- oder der Akzeptorfarbstoff oder beide ein 4,7-Dichlorrhodamin-Farbstoff sind.
Ein Linker zur Verknüpfung eines Donor-Farbstoffes mit einem Akzeptor-Farbstoff in einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff hat die allgemeine Struktur R₂₁Z₁C(O)R₂₂R₂₈, wie nachfolgend erläutert, wo R₂₁ ein an den Donor-Farbstoff gebundenes C_1-5-Alkyl ist, C(O) eine Carbonylgruppe ist, Z₁ NH, Schwefel oder Sauerstoff ist, R₂₂ ein Substituent ist, welcher ein Alken, Dien, Alkin, einen fünf- und sechsgliedrigen Ring mit wenigstens einer ungesättigten Bindung oder eine verschmolzene Ringstruktur ist, die an den Carbonylkohlenstoff gebunden ist, und R₂₈ eine funktionelle Gruppe einschließt, die den Linker an den Akzeptor-Farbstoff bindet.
Bei einer Ausführungsform dieses Linkers, die nachfolgend erläutert ist, hat der Linker die allgemeine Struktur R₂₁Z₁C(O)R₂₂R₂₉Z₂C(O), worin R₂₁ und R₂₂ wie oben definiert sind, Z₁ und Z₂ jeweils unabhängig voneinander NH, Schwefel oder Sauerstoff sind, R₂₉ ein C_1-5-Alkyl ist und die endständige Carbonylgruppe an die Ringstruktur des Akzeptor-Farbstoffes gebunden ist. Bei der Variation, wo Z₂ Stickstoff ist, bildet die C(O)R₂₂R₂₉Z₂-Untereinheit eine Aminosäureuntereinheit.
Spezielle Beispiele fünf- oder sechsgliedriger Ringe, die als R₂₂ in dem Linker verwendet werden können, sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Cyclopenten, Cyclohexen, Cyclopentadien, Cyclohexadien, Furan, Thiofuran, Pyrrol, Isopyrrol, Isoazol, Pyrazol, Isoimidazol, Pyran, Py ron, Benzol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin und Oxazin. Beispiele verschmolzener Ringstrukturen sind etwa, aber nicht ausschließlich, Inden, Benzofuran, Thionaphthen, Indol und Naphthalin.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Linkers ist jene, worin R₂₁ und R₂₉ Methylen sind, Z₁ und Z₂ NH sind und R₂₂ Benzol ist, wie nachfolgend gezeigt.
Tabelle 3 erläutert Beispiele von -C(O)R₂₂-Untereinheiten von Linkern, die in den Linkern der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
II. Energieübertragungsfarbstoffe nach der vorliegenden Erfindung
Im allgemeinen schließen die Energieübertragungsfarbstoffe nach der vorliegenden Erfindung einen Donor-Farbstoff, der bei einer ersten Wellenlänge Licht absorbiert und Anregungsenergie in Reaktion hierauf emittiert, einen Akzeptor-Farbstoff, der in der Lage ist, die von dem Donor-Farbstoff emittierte Anregungsenergie zu absorbieren und in Reaktion hierauf bei einer zweiten Wellenlänge zu fluoreszieren, und einen Linker ein, der den Donor-Farbstoff an den Akzeptor-Farbstoff bindet. Bezüglich aller hier vorgesehenen Molekülstrukturen ist beabsichtigt, daß diese Molekülstrukturen nicht nur die wiedergegebene exakte Elektronenstruktur einschließen, sondern auch alle Resonanzstrukturen und Protonierungszustände hiervon.
Eine Klasse von fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung enthält einen Donor-Farbstoff, der ein Glied der Xanthen-Farbstoffklasse ist, einen Akzeptor-Farbstoff und einen Linker, welcher ein Glied der Gruppe von Linkern ist, die in Abschnitt I beschrieben ist, mit der Maßgabe, daß entweder einer der Donor- oder Akzeptor-Farbstoffe oder beide ein 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoff ist bzw. sind. Wie hier verwendet, schließen Xanthenfarbstoffe alle Moleküle der allgemeinen Struktur
ein, worin Y₁ Hydroxyl ist, Y₂ Sauerstoff ist und R₁₇ ein Phenyl oder substituiertes Phenyl ist oder X₁ ein Amin, vorzugsweise ein tertiäres Amin, ist, Y₂ Iminium, vorzugsweise tertiäres Iminium, ist und R₁₇ Phenyl oder substituiertes Phenyl ist. Wenn Y₁ Hydroxyl und Y₂ Sauerstoff sind und R₁₇ ein Phenyl oder substituiertes Phenyl ist, ist der Farbstoff ein Glied der Fluorescein-Farbstoffklasse. Wenn Y₁ Amin und Y₂ Iminium sind und R₁₇ein Phenyl oder substituiertes Phenyl ist, ist der Farbstoff ein Glied der Rhodamin-Farbstoffklasse.
R₁₁ bis R₁₇ können irgendein Substituent sein, der mit den Energieübertragungsfarbstoffen der vorliegenden Erfindung verträglich ist, wobei bemerkt wird, daß R₁₁ bis R₁₇ stark variiert werden können, um die Spektral- und Mobilitätseigenschaften der Farbstoffe zu verändern. Die in der Ringstruktur angegebene Zahl gibt die 4'-Stellung an der Xanthenringstruktur an. Für die Energieübertragungsfarbstoffe der vorliegenden Erfindung, in welchen der Linker an die 4'-Stellung der Xanthenringstruktur gebunden ist, entspricht der R₁₄-Substituent dem Linker.
Beispiele von R₁₁- bis R₁₇-Substituenten enthalten, aber nicht ausschließlich, Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, Phenyl, substituiertes Phenyl, wenn benachbarte Substituenten unter Bildung eines Ringes zusammengenommen werden, und Kombinationen hiervon.
Bei einer anderen Ausführungsform ist R₁₇ ein Phenyl oder substituiertes Phenyl der allgemeinen Formel
Substituenten X₁ bis X₅ an dem Phenylring können Wasserstoff, Fluor, Chor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, wo benachbarte Substituenten unter Bildung eines Ringes zusammengenommen sind, und Kombinationen hiervon einschließen.
Bei einer Ausführungsform ist der Donor-Farbstoff ein Glied der Farbstoffklasse, worin Y₁ Amin, Y₂ Iminium und X₂ und X₅ Chlor sind und die hier als 4,7-Dichlorrhodamin-Farbstoffe bezeichnet werden. In die 4,7-Dichlorrhodamin-Farbstoffklasse fallende Farbstoffe und ihre Synthese sind hier wie auch in der WO 97/49 769 beschrieben.
Wie hier verwendet, bedeutet Alkyl geradkettige und verzweigte Kohlenwasserstoffreste, d. h. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, Neopentyl, tert-Pentyl und dergleichen. Substituiertes Alkyl bezeichnet einen Alkylrest, der mit irgendeinem einer Vielzahl von Substituenten substituiert ist, beispielsweise, aber nicht ausschließlich, mit Hydroxy, Amino, Thio, Cyano, Nitro, Sulfo und dergleichen. Halogenalkyl bezeichnet ein substituiertes Alkyl mit einem oder mehreren Halogenatomsubstituenten, gewöhnlich Fluor, Chlor, Brom oder Jod. Alken bezeichnet einen Kohlenwasserstoff, worin eine oder mehrere der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen Doppelbindungen sind und die nicht doppelt gebundenen Kohlenstoffatome Alkyl oder substituiertes Alkyl sind. Alkin bedeutet einen Kohlenwasserstoff, worin eines oder mehrere der Kohlenstoffatome mit einer Dreifachbindung gebunden sind und worin die nicht dreifach gebundenen Kohlenstoffatome Alkyl- oder substituierte Alkylreste sind. Sulfonat bedeutet Reste, die ein Schwefelatom einschließen, welches an drei Sauerstoffatome gebunden ist, einschließlich der Mono- und Disalze hiervon, z. B. Natriumsulfonat, Kaliumsulfonat, Dinatriumsulfonat und dergleichen. Amino bedeutet Reste, die ein Stickstoffatom einschließen, welches an zwei Wasserstoffatome, Alkylreste oder irgendeine Kombination hiervon gebunden ist. Amido bedeutet Reste, die ein Kohlenstoffatom einschließen, das eine Doppelbindung zu einem Sauerstoffatom und eine Einfachbindung zu einem Aminorest haben. Nitril bedeutet Reste, die ein Kohlenstoffatom einschließen, welches eine Dreifachbindung zu einem Stickstoffatom hat. Alkoxy bedeutet einen Rest mit einem Alkylrest, der einfach an ein Sauerstoffatom gebunden ist. Aryl bedeutet einfaches oder mehrfaches Phenyl oder substituiertes Phenyl, z. B. Benzol, Naphthalin, Anthracen, Biphenyl und dergleichen.
R₁₁ bis R₁₇ können auch jeweils unabhängig voneinander ein verknüpfender Rest sein, der benutzt werden kann, um den Energieübertragungsfarbstoff an ein Reagenz, wie ein Nukleotid, Nukleosid oder Oligonukleotid, zu binden. Beispiele von verknüpfenden Resten schließen Isothiocyanat, Sulfonylchlorid, 4,6-Dichlortriazinylamin, Succinimidylester oder anderes aktives Carboxylat ein, wann immer die Komplementärfunktionalität Amin ist. Vorzugsweise ist die Linkergruppe Maleimid, Halogenacetyl oder Jodacetamid, wann immer die Komplementärfunktionalität Sulfhydryl ist. Siehe R. Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. (1992). Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform, wie sie in 1 erläutert ist, ist die verknüpfende Gruppe ein aktivierter NHS-Ester, der aus einer Carboxylgruppe an dem Donor- oder Akzeptor-Farbstoff ausgebildet ist und mit einem Aminohexyloligomer unter Bildung eines farbstoffmarkierten Oligonukleotidprimers umgesetzt werden kann.
Die fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffe dieser Ausführungsform schließen auch einen Akzeptor-Farbstoff, der die von dem Donor-Farbstoff emittierte Anregungsenergie absorbieren und als Reaktion hierauf bei einer zweiten Wellenlänge fluoreszieren kann, und einen Linker, der den Donor-Farbstoff an den Akzeptor-Farbstoff bindet, ein. In der ersten Klasse von Energieübertragungsfarbstoffen ist der Linker ein Glied der Linkerklasse in Abschnitt I und an den Donor-Farbstoff in der 4'-Stellung der Xanthenringstruktur gebunden.
Energieübertragungsfarbstoffe dieser ersten Klasse zeigen verbesserte Fluoreszenzstärke im Vergleich mit dem Akzeptor-Fluorophor selbst und mit fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen mit dem gleichen Donor-Akzeptor-Paar, worin die Verknüpfung zwischen dem Donor-Akzeptor-Paar anders ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine zweite Klasse von fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen, worin die Donor- und Akzeptor-Farbstoffe jeweils die allgemeine Struktur
haben, worin Y₁, Y₂, R₁₁ bis R₁₆ und X₁ bis X₅ wie oben angegeben sind und der Linker an die Donor- und Akzeptor-Farbstoffe durch einen der Substituenten X₃ und X₄ jeweils des Donor- und Akzeptor-Farbstoffes gebunden ist, mit der Maßgabe, daß entweder einer der Donor- oder Akzeptor-Farbstoffe oder beide ein 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoff ist bzw. sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Farbstoffklasse ist der Linker an den Donorund Akzeptor-Farbstoff durch den Substituenten X₃ jedes der Donor- und Akzeptor-Farbstoffe gebunden.
In dieser Farbstoffklasse ist der Linker vorzugsweise kurz und/oder starr, wie dies gefunden wurde, um die Energieübertragung zwischen dem Donor- und Akzeptor-Farbstoff zu verbessern. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine dritte Klasse von fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen, worin der Akzeptor-Farbstoff ein Glied der 4,7-Dichlorrhodamin-Farbstoffklasse, d. h. der Farbstoffe der allgemeinen Struktur
ist, worin
R₁ bis R₄ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl oder, wo R₁ und R₅, R₂ und R₆, R₃ und R₈, R₄ und R₉ zusammengenommen sind, um einen Ring zu bilden, und Kombinationen hiervon sind,
R₅ bis R₁₀ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Sulfon, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, Phenyl oder substituiertes Phenyl oder, wo benachbarte Substituenten zusammengenommen sind, um einen Ring zu bilden, und Kombinationen hiervon sind,
X₁, X₃ und X₄ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Sulfon, Amino, Ammonium, Amido, Nitril oder Alkoxy oder, wo benachbarte Substituenten zusammengenommen sind, um einen Ring zu bilden, und Kombinationen hiervon sind und
X₂ und X₅ Chlor sind.
Bezüglich R₁ bis R₁₀ können X₃ und X₄, R₁ und R₅, R₂ und R₆, R₃ und R₈, R₄ und R₉ sowie X₃ und X₄ jeweils unabhängig von den anderen zusammengenommen werden, um einen 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring zu bilden.
Die Zahlen (4', 5, 6), die in der Ringstruktur angegeben sind, zeigen die Positionen 4', 5 und 6 an der Rhodamin-Ringstruktur. Wie hier diskutiert wird, sind die Ringstellungen 4' und 5 bevorzugte Stellen für die Bindung des Linkers, der in den Energieübertragungsfarbstoffen der vorliegenden Erfindung verwendet wird und den Donor an den Akzeptor-Fluorophor bindet. Die Ringstellungen 4', 5 und 6 sind auch bevorzugte Stellen für die Bindung eines Biomoleküls, wie eines Nukleotids oder Oligonukleotids, an den Energieübertragungsfarbstoff.
Donor-Farbstoffe in dieser Klasse von Energieübertragungsfarbstoffen können irgendeinen Fluorescein- oder Rhodaminfarbstoff einschließen, welcher Anregungsenergie emittiert, welche ei nen 4,7-Dichlorrhodamin-Farbstoff absorbieren und in Reaktion hierauf eine Energieemission erzeugen kann. Bei einer Ausführungsform hat der Donor-Farbstoff eine Xanthenringstruktur mit einer Ringstellung 4', worin der 4,7-Dichlorrhodamin-Akzeptor-Farbstoff durch einen Linker an den Donor-Farbstoff gebunden ist, welcher mit der Ringstellung 4' des Xanthenfarbstoffes verknüpft ist. Der Linker ist vorzugsweise an die Ringstellungen 5 oder 6 des 4,7-Dichlorrhodamin-Akzeptor-Farbstoffes gebunden.
Energieübertragungsfarbstoffe gemäß dieser dritten Farbstoffklasse, d. h. worin 4,7-Dichlorrhodamin der Akzeptor-Farbstoff ist, liefern den Vorteil, daß sie ein relativ schmales Emissionsspektrum im Vergleich mit anderen Rhodaminfarbstoffen haben. Dieses schmale Emissionsspektrum verbessert die Spektralauflösung, die durch einen Satz dieser Farbstoffe erreichbar ist, was eine Mehrkomponentenanalyse unter Verwendung dieser Farbstoffe erleichtert.
Die Klassen von Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung sind hier in weiteren Einzelheiten beschrieben.
TABELLE 1
TABELLE 1 (Forts.)
A. Erste Klasse von Energieübertragungsfarbstoffen
Wie oben beschrieben, schließt die erste Klasse von Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung einen Donor-Farbstoff ein, welcher ein Glied der Fluorescein- oder Rhodamin-Farbstoffklassen ist und somit eine Xanthenringstruktur mit einer Ringstellung 4' hat. In dieser Farbstoffklasse ist der Akzeptor-Farbstoff ein Farbstoff, welcher die von dem Donor-Farbstoff emittierte Anregungsenergie absorbieren und in Reaktion hierauf in einer zweiten Wellenlänge fluoreszieren kann.
Gemäß dieser Ausführungsform kann der Donor ein Glied der Fluorescein- oder Rhodamin-Farbstoffklassen sein, wobei diese Farbstoffe jeweils Glieder der breiteren Xanthen-Farbstoffklasse sind. Die allgemeinen Strukturformeln für diese Xanthenfarbstoffe sind unten erläutert. Die an diesen Farbstoffen erläuterten Substituenten können aus einer großen Vielzahl von Substituenten ausgewählt werden, welche bei diesen verschiedenen Farbstoffklassen eingearbeitet werden können, da alle Farbstoffe mit den allgemeinen Fluorescein- oder Rhodaminringstrukturen in den Gedanken dieser Erfindung fallen sollen.
Beispiele von Donor-Farbstoffen, die bei dieser Ausführungsform verwendet werden können, sind etwa, doch nicht ausschließlich, Fluorescein, Isomere von Carboxyfluorescein (z. B. 5- und 6-Carboxy), Isomere von Carboxy-HEX (z. B. 5- und 6-Carboxy), NAN, CI-FLAN, TET, JOE, ZOE, Rhodamin, Isomere von Carboxyrhodamin (z. B. 5- und 6-Carboxy), Isomere von Carboxy R110 (z. B. 5- und 6-Carboxy), Isomere von Carboxy R6G (z. B. 5- und 6-Carboxy), 4,7-Dichlorfluoresceine (siehe US-Patentschrift Nr. 5 188 934), 4,7-Dichlorrhodamine (siehe US-Patentanmeldung Serien- Nr. 08/672 196, angemeldet am 27. Juni 1996) sowie Isomere von N,N,N',N'-Tetramethylcarboxyrhodamin (TAMRA) (z. B. 5- und 6-Carboxy).
Beispiele von Akzeptor-Farbstoffen, die in dieser Ausführungsform verwendet werden können, sind etwa, aber nicht ausschließlich, Isomere von Carboxyfluorescein (z. B. 5- und 6-Carboxy), 4,7-Dichlorfluoresceine, 4,7-Dichlorrhodamine, Fluoresceine, asymmetrische Benzoxanthenfarbstoffe, Isomere von Carboxy-HEX (z. B. 5- und 6-Carboxy), NAN, CI-FLAN, TET, JOE, ZOE, Rhodamin, Isomere von Carboxyrhodamin (z. B. 5- und 6-Carboxy), Isomere von Carboxy R110 (z. B. 5- und 6-Carboxy), Isomere von Carboxy R6G (z. B. 5- und 6-Carboxy), Isomere von N,N,N',N'-Tetramethylcarboxyrhodamin (TAMRA) (z. B. 5- und 6-Carboxy), Isomere von Carboxy-X-rhodamin (ROX) (z. B. 5- und 6-Carboxy) und Cy5. In Tabelle 2 sind die Strukturen dieser Farbstoffe erläutert.
In der ersten Klasse von Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung ist der Linker an den Donor-Farbstoff in der Stellung 4' der Xanthenringstruktur gebunden. Bei einer Ausführungsform hat der Linker die allgemeine Struktur R₂₁Z₁C(O)R₂₂R₂₈, wie nachfolgend erläutert, worin R₂₁ ein C_1-5-Alkyl ist, welches an die Ringstellung 4' des Donor-Xanthenfarbstoffes gebunden ist, Z₁ NH, Schwefel oder Sauerstoff ist, C(O) eine Carbonylgruppe ist, R₂₂ ein Substituent ist, welcher ein Alken, Dien, Alkin, einen 5- und 6-gliedrigen Ring mit wenigstens einer ungesättigten Bindung oder eine verschmolzene Ringstruktur ist, die an den Carbonylkohlenstoff gebunden ist, und R₂₈ eine funktionelle Gruppe ist, die den Linker an den Akzeptor-Farbstoff bindet.
Beispiele von 5- oder 6-gliedrigen Ringen, die in R₂₂ benutzt werden können, sind etwa, doch nicht ausschließlich Cyclopenten, Cyclohexen, Cyclopentadien, Cyclohexadien, Furan, Thiofuran, Pyrrol, Isopyrrol, Isoazol, Pyrazol, Isoimidazol, Pyran, Pyron, Benzol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimi din, Pyrazin und Oxazin. Beispiele verschmolzener Ringstrukturen sind etwa, aber nicht ausschließlich, Inden, Benzofuran, Thionaphthen, Indol und Naphthalin.
Bei einer Variante dieser Ausführungsform, die nachfolgend erläutert ist, hat der Linker die allgemeine Struktur R₂₁Z₁C(O)R₂₂R₂₉Z₂C(O), worin R₂₁ ein C_1-5-Alkyl ist, welches an die Ringstellung 4' des Donor-Xanthenfarbstoffes gebunden ist, Z₁ und Z₂ jeweils unabhängig voneinander NH, Schwefel oder Sauerstoff sind, C(O) eine Carbonylgruppe ist, R₂₂ ein Substituent ist, welcher ein Alken, Dien, Alkin, einen 5- und 6-gliedrigen Ring mit wenigstens einer ungesättigten Bindung oder eine verschmolzene Ringstruktur, die an den Carbonylkohlenstoff gebunden ist, bedeutet, R₂₉ ein C_1-5-Alkyl ist, und die endständige Carbonylgruppe an die Ringstruktur des Akzeptor-Farbstoffes gebunden ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Linkers ist die, worin R₂₁ und R₂₉ Methylen, Z₁ und Z₂ NH sind und R₂₂ Benzol ist, wie nachfolgend gezeigt.
TABELLE 2
TABELLE 2 (Forts.)
TABELLE 3
Wie in Beispiel 4 und 2 erläutert, zeigen Energieübertragungsfarbstoffe, wie 5-TMR-B-CF, welche einen Donor, Akzeptor und Linker, wie oben aufgeführt, einschließen, verbesserte Fluoreszenz im Vergleich mit dem Akzeptor selbst und mit fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen mit dem gleichen Donor-Akzeptor-Paar, wo der Linker zwischen dem Donor-Akzeptor-Paar anders ist. Ohne durch eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die beobachtete verbesserte Fluoreszenzintensität auf einer verbesserten Energieübertragungsorientierung zwischen dem Donor- und Akzeptor-Farbstoff beruht, welche durch den relativ starren R₂₂-Abschnitt des Linkers erreicht und aufrechterhalten wird. Als ein Ergebnis zeigen die fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffe der vorliegenden Erfindung verbesserte Fluoreszenzstärke im Vergleich mit dem Akzeptor-Fluorophor selbst und mit fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen mit dem gleichen Donor-Akzeptor-Paar, wo der Linker zwischen dem Donor-Akzeptor-Paar anders ist. Die verbesserte Fluoreszenzstärke dieser Farbstoffe ist besonders evident in Gegenwart von 8 M-Harnstoff, welcher dazu dient, eine Farbstoffstapelung zu reduzieren.
Bei einer Variante dieser Ausführungsform ist der Akzeptor ein Glied der Xanthen-Farbstoffklasse mit der allgemeinen Struktur
worin Y₁, Y₂, R₁₁ bis R₁₆ und X₁ bis X₅ wie oben definiert sind.
Gemäß dieser Variante ist es bevorzugt, daß ein Linker, wie die oben beschriebenen, an den Akzeptor-Xanthenfarbstoff über den Substituenten X₃ oder X₄ des Akzeptor-Xanthenfarbstoffes gebunden wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform, wie unten erläutert, wird der Linker an den X₃-Substituenten des Akzeptor-Xanthenfarbstoffes gebunden.
Tabelle 4 liefert Beispiele der obenbeschriebenen Energieübertragungsfarbstoffe nach dieser Ausführungsform der Erfindung. Es wird festgestellt, daß, obwohl die in Tabelle 4 erläuterten Farbstoffe einen 5-Carboxyfluorescein-Donor-Farbstoff und einen TAMRA-Akzeptor-Farbstoff einschließen, verständlich sein sollte, daß eine große Vielzahl anderer Xanthenfarbstoffe leicht als der Donor-Farbstoff substituiert sein kann. Es sollte auch verstanden werden, daß eine große Vielzahl anderer Xanthenfarbstoffe wie auch von Cyanin-, Phthalocyanin- und Squarainfarbstoffen leicht anstelle des TAMRA-Akzeptor-Farbstoffes verwendet werden können, wie oben beschrieben wurde, wobei alle diese Abwandlungen in bezug auf den Donor- und Akzeptor-Farbstoff in den Erfindungsgedanken fallen.
TABELLE 4
TABELLE 4 (Forts.)
B. Zweite Klasse von Energieübertragungsfarbstoffen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine zweite Klasse von fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen, wie nachfolgend erläutert, worin der Donor-Farbstoff und der Akzeptor jeweils Glieder der Xanthen-Farbstoffklasse der allgemeinen Struktur
sind, worin Y₁, Y₂, R₁₁ bis R₁₆ und X₁ bis X₅ wie oben definiert sind.
Gemäß dieser Ausführungsform ist der Linker an den Substituenten X₃ oder X₄ sowohl des Donor- als auch des Akzeptor-Farbstoffes gebunden, wie nachfolgend erläutert.
Bei dieser Ausführungsform umfaßt der Linker eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Alken, Dien, Alkyn, einem fünf- oder sechsgliedrigen Ring mit wenigstens einer ungesättigten Bindung und einer verschmolzenen Ringstruktur. Der Linker ist vorzugsweise kurz und/oder starr, da gefunden wurde, daß dies die Energieübertragung zwischen den Donor- und Akzeptor-Farbstoffen verbessert. Beispielsweise hat bei einer Variante dieser Ausführungsform der Linker vorzugsweise ein Grundgerüst, welches den Donor an den Akzeptor bindet und eine Länge von weniger als 9 Atomen hat. Bei einer anderen Variante dieser Ausführungsform enthält der Linker eine funktionelle Gruppe, die dem Linker einige Grad an struktureller Steifigkeit verleiht, wie ein Alken, Dien, ein Alkin, ein fünf- und sechsgliedriger Ring mit wenigstens einer ungesättigten Bindung oder eine verschmolzene Ringstruktur. Bei noch einer anderen Variante hat der Linker die allgemeine Formel R₂₅Z₃C(O)R₃₇ oder R₂₅Z₃C(O)R₂₆Z₄C(O), worin R₂₅ an den Donor-Farbstoff gebunden ist, C(O) eine Carbonylgruppe ist und R₃₇ ein an den Akzeptor-Farbstoff gebundener Substituent ist, R₂₅ und R₂₆ jeweils aus der Gruppe von C_1-4-Alkyl ausgewählt sind und Z₃ und Z₄ jeweils unabhängig voneinander NH, O oder S bedeuten.
Beispiele von Donor- und Akzeptor-Farbstoffen, die in dieser Ausführungsform verwendet werden können, schließen beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Fluorescein, 5- oder 6- Carboxyfluorescein, 5- oder 6-Carboxy-HEX, NAN, CI-FLAN, TET, JOE, ZOE, 4,7-Dichlorfluoresceine, asymmetrische Benzoxanthenfarbstoffe, Rhodamin, 5- oder 6-Carboxyrhodamin, 5- oder 6-Carboxy-R110, 5- oder 6-Carboxy-R6G, N,N,N',N'-Tetramethyl-(5 oder 6)-carboxyrhodamin (TAMRA), 5- oder 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX) und 4,7-Dichlorrhodamine ein. In Tabelle 2 sind die Strukturen dieser Farbstoffe erläutert.
Bei einer anderen Variante dieser Ausführungsform enthält der Linker eine Gruppe R₂₇Z₅C(O)R₃₇, worin R₂₇ ein an den Donor-Farbstoff gebundenes C_1-5-Alkyl ist, Z₅ NH, Schwefel oder Sauerstoff ist und C(O) eine Carbonylgruppe ist, die an den Akzeptor-Farbstoff gebunden ist.
Tabelle 5 liefert Beispiele der zweiten Klasse von Energieübertragungsfarbstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung. Es ist festzustellen, daß, obwohl die in Tabelle 5 erläuterten Farbstoffe F-Aminomethylfluorescein-Donor-Farbstoff einschließen, es so verstanden werden sollte, daß eine große Vielzahl anderer Xanthenfarbstoffe leicht als der Donor-Farbstoff eingesetzt werden kann.
TABELLE 5
TABELLE 5 (Forts.)
TABELLE 5 (Forts.)
C. Dritte Klasse von Energieübertragungsfarbstoffen
Die dritte Klasse von fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen schließt einen 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoff als den Akzeptor-Farbstoff sowie einen Fluorescein- oder Rhodaminfarbstoff, welcher eine Emission erzeugt, die der 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoff als den Donor-Farbstoff absorbieren kann, ein. Diese Farbstoffe zeigen verbesserte Fluoreszenzintensität im Vergleich mit dem Akzeptor-Farbstoff allein. Außerdem zeigen 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffe ein engeres Emissionsspektrum als andere Rhodaminfarbstoffe, was ihre Verwendung in Mehrfachkomponentenanalysen erleichtert.
1. 4.7-Dichlorrhodaminfarbstoffe
4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffverbindungen haben die allgemeine Struktur
worin
R₁ bis R₄ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl sind oder, wenn R₁ und R₅, R₂ und R₆, R₃ und R₈ sowie R₉ zusammengenommen sind, einen Ring bilden, sowie Kombinationen hiervon,
R₅ bis R₁₀ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Sulfon, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, Phenyl oder substituiertes Phenyl sind oder, wenn benachbarte Substituenten zusammengenommen sind, einen Ring bilden, und Kombinationen hiervon,
X₁, X₃ und X₄ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Sulfon, Amino, Ammonium, Amido, Nitril oder Alkoxy sind oder, wenn benachbarte Substituenten zusammengenommen sind, einen Ring bilden, und Kombinationen hiervon und
X₂ und X₅ Chlor sind.
Farbstoffe, die in die 4,7-Dichlorrhodamin-Farbstoffklasse fallen, und ihre Synthese sind in dem US-Patent Nr. 5,847,162, angemeldet am 27. Juni 1996, beschrieben.
In bezug auf R₁ bis R₄ können Alkylsubstituenten etwa 1 bis 8 Kohlenstoffatome einschließen (d. h. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, Neopentyl, tert-Pentyl usw.) und geradkettige und verzweigte Kohlenwasserstoffreste sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind R₁ bis R₄ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl oder Ethyl und stärker bevorzugt entweder Wasserstoff oder Methyl.
In bezug auf R₅ bis R₁₀ enthalten Alkyl-, Alken-, Alkin- und Alkoxysubstituenten vorzugsweise zwischen etwa 1 bis 8 Kohlenstoffatome (d. h. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, Neopentyl, tert-Pentyl und dergleichen) und können geradkettige und verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste sein.
In bezug auf R₁ bis R₁₀ können R₁ und R₅, R₂ und R₆, R₃ und R₈, R₄ und R₉ jeweils unabhängig voneinander zusammengenommen werden, um einen 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring zu bilden. Bei einer Ausführungsform sind R₆ und R₇ Benzo und/oder R₉ und R₁₀ Benzo. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind R₅ bis R₁₀ jeweils unabhängig voneinander entweder Wasserstoff, Methyl oder Ethyl und stärker bevorzugt entweder Wasserstoff oder Methyl.
In bezug auf X₁, X₃ und X₄ ist X₁ vorzugsweise ein Carboxylat und kann eine der Gruppen X₃ und X₄ einen Substituenten einschließen, welcher benutzt wird, um den 4,7-Dichlorrhodamin-Akzeptor-Farbstoff mit einem Donor-Farbstoff oder ein Nukleotid oder ein Oligonukleotid mit dem Energieübertragungsfarbstoff zu verknüpfen. Der Substituent R₈ in der Ringstellung 4' kann auch verwendet werden, um den Akzeptor entweder mit dem Donor-Farbstoff oder mit einem Biomolekül, wie einem Nukleotid oder Oligonukleotid, zu verknüpfen.
Bei einem besonders bevorzugten Akzeptor-Farbstoff, der bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann und hier als DR110-2 bezeichnet wird, sind R₁ bis R₁₀ getrennt genommen Wasserstoff, X₁ Carboxylat und eine der Gruppen X₃ und X₄ eine Verknüpfungsgruppe (L), während die anderen Gruppen Wasserstoff bedeuten. Die Struktur von DR110-2 ist nachfolgend gezeigt.
In einem zweiten besonders bevorzugten Akzeptor-Farbstoff, der bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann und der hier als DR6G-2 bezeichnet wird, sind eine der Gruppen R₁ und R₂ Ethyl, wobei die andere Wasserstoff bedeutet, eine der Gruppen R₃ und R₄ Ethyl, wobei die andere Wasserstoff bedeutet, R₅ und R₈ zusammengenommen Methyl, R₆, R₇, R₉ und R₁₀ Wasserstoff, X₁ Carboxylat und eine der Gruppen X₃ und X₄ eine Verknüpfungsgruppe, wobei die andere Wasserstoff ist. Die Struktur von DR6G-2 ist nachfolgend gezeigt.
Bei einem dritten besonders bevorzugten Akzeptor-Farbstoff, der in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann und der hier als DTMR bezeichnet ist, sind R₁ bis R₆ getrennt ge nommen Wasserstoff, Y₁ bis Y₄ getrennt genommen Methyl, X₁ Carboxylat und eine der Gruppen X₂ und X₃ eine verknüpfende Gruppe, wobei die anderen Gruppen Wasserstoff bedeuten. Die Struktur von DTMR ist nachfolgend gezeigt.
In einem vierten besonders bevorzugten Akzeptor-Farbstoff, der in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann und der hier als DROX bezeichnet wird, sind R₁ und R₆ zusammengenommen unter Bildung eines 6-gliedrigen Ringes, sind R₂ und R₃ unter Bildung eines 6-gliedrigen Ringes zusammengenommen, sind R₃ und R₇ unter Bildung eines 6-gliedrigen Ringes zusammengenommen und sind R₄ und R₈ unter Bildung eines 6-gliedrigen Ringes zusammengenommen, sind R₅ und R₆ Wasserstoff, ist X₁ Carboxylat und eine der Gruppen X₃ und X₄ eine Verknüpfungsgruppe, wobei die andere Wasserstoff ist. Die Struktur von DROX ist nachfolgend gezeigt.
Die 3A und 3B zeigen mehrere zusätzliche bevorzugte Ausführungsformen von 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffen, die in den Energieübertragungsfarbstoffen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
In der Verbindung 3A-A ist eine der Gruppen R₁ und R₂ Ethyl, wobei die andere Wasserstoff bedeutet, sind die Reste R₃ und R₄ getrennt genommen Wasserstoff, ist R₆ Methyl, sind R₅ und R₇ bis R₁₀ getrennt genommen Wasserstoff, ist X₁ Carboxylat und ist eine der Gruppen X₃ und X₄ eine Verknüpfungsgruppe, wobei die andere Wasserstoff ist.
In der Verbindung 3A-B ist eine der Gruppen R₁ und R₂ Ethyl, wobei die andere Wasserstoff ist, sind R₃ und R₄ getrennt genommen Methyl, ist R₅ Methyl, sind R₆ bis R₁₀ getrennt genommen Wasserstoff, ist X₁ Carboxylat und ist eine der Gruppen X₃ und X₄ eine Verknüpfungsgruppe, wobei die andere Wasserstoff bedeutet.
In der Verbindung 3A-C sind R₁ und R₂ getrennt genommen Methyl, bilden R₃ und R₉ zusammengenommen einen 6-gliedrigen Ring, bilden R₄ und R₈ zusammengenommen einen 6-gliedrigen Ring, sind R₅, R₆, R₇ und R₁₀ getrennt genommen Wasserstoff, ist X₁ Carboxylat und ist eine der Gruppen X₃ und X₄ eine Verknüpfungsgruppe, wobei die andere Wasserstoff ist.
In der Verbindung 3B-D sind R₁ und R₂ getrennt genommen Wasserstoff, bilden R₃ und R₉ zusammengenommen einen 6-gliedrigen Ring, bilden R₄ und R₈ zusammengenommen einen 6-gliedrigen Ring, sind R₅, R₆, R₇ und R₁₀ getrennt genommen Wasserstoff, ist X₁ Carboxylat und ist eine der Gruppen X₃ und X₄ eine Verknüpfungsgruppe, wenn die andere Wasserstoff ist.
In der Verbindung 3B-E ist eine der Gruppen R₁ und R₂ Ethyl, wobei die andere Wasserstoff ist, bilden R₃ und R₉ zusammengenommen einen 6-gliedrigen Ring, bilden R₄ und R₈ zusammengenommen einen 6-gliedrigen Ring, ist R₅ Methyl, sind R₆, R₇ und R₁₀ getrennt genommen Wasser stoff, ist X₁ Carboxylat und ist eine der Gruppen X₃ und X₄ eine verknüpfende Gruppe, wobei die andere Wasserstoff ist.
In der Verbindung 3B-F sind R₁ und R₂ getrennt genommen Wasserstoff, sind R₃ und R₄ getrennt genommen Methyl, sind R₅ bis R₁₀ getrennt genommen Wasserstoff, ist X₁ Carboxylat und ist eine der Gruppen X₃ und X₄ eine Verknüpfungsgruppe, wobei die andere Wasserstoff ist.
Die 4A und 4B zeigen bevorzugte verallgemeinerte Syntheseschemata für die Herstellung von 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffen, die in den Energieübertragungsfarbstoffen nach dieser Erfindung verwendet werden. Die in jeder Figur gezeigten variablen Substituenten sind wie oben definiert.
4A zeigt eine verallgemeinerte Synthese, bei der der Substituent X₁ etwas anderes als Carboxylat sein kann. In der Figur zeigt X' Reste, die Vorläufer von X₁ sind. Bei der in 4A erläuterten Methode werden zwei Äquivalente eines 3-Aminophenolderivates 4A-A/4A-B wie 3-Dimethylaminophenol, mit einem Äquivalent eines Dichlorbenzolderivates 4A-C, z. B. zyklisches Anhydrid von 4-Carboxy-3,6-dichlor-2-sulfobenzoesäure umgesetzt, d. h. worin X₁' Reste von 4c zusammengenommen sind.
Die Reaktionspartner werden dann 12 h in einer starken Säure, z. B. Polyphosphorsäure oder Schwefelsäure, auf 180 °C erhitzt. Der rohe Farbstoff 4A-D wird durch Zugabe zu Wasser ausgefällt und durch Zentrifugieren isoliert. Um ein symmetrisches Produkt zu bilden, sind die Substituenten der Reaktionspartner 4A-A und 4A-B die gleichen, während zur Bildung eines asymmetrischen Produktes die Substituenten unterschiedlich sind.
4B zeigt eine verallgemeinerte Synthese, bei der der Substituent X₁ Carboxylat ist. Bei dem Verfahren der 4B werden zwei Äquivalente eines 3-Aminophenolderivates 4A-A/4A-B, wie 3-Dimethylaminophenol, mit einem Äquivalent eines Phthalsäureanhydridderivates 4e, z. B. von 3,6-Dichlortrimellitsäureanhydrid, umgesetzt. Die Reaktionspartner werden dann 12 h in einer starken Säure, z. B. Polyphosphorsäure oder Schwefelsäure, auf 180 °C erhitzt. Der rohe Farbstoff 4A-D wird durch Zusatz zu Wasser ausgefällt und durch Zentrifugieren isoliert. Um ein symmetrisches Produkt zu bilden, sind die Substituenten der Reaktionspartner 4A-A und 4A-B die gleichen, während zur Bildung eines asymmetrischen Produktes die Substituenten verschieden sind.
2. Energieübertragungsfarbstoffe mit 4,7-Dichlorrhodamin als der Akzeptor
Im allgemeinen schließen die Energieübertragungsfarbstoffe der vorliegenden Erfindung einen Fluorescein- oder Rhodamin-Donorfarbstoff, der bei einer ersten Wellenlänge Licht absorbiert und Anregungsenergie in Reaktion hierauf emittiert, einen 4,7-Dichlorrhodamin-Akzeptor-Farbstoff, der die von dem Donor-Farbstoff emittierte Anregungsenergie absorbieren und bei einer zweiten Wellenlänge in Reaktion hierauf fluoreszieren kann, und einen Linker, der den Donor-Farbstoff an den Akzeptor-Farbstoff bindet, ein. Bevorzugte Beispiele dieser Farbstoffklasse, welche einen 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoff als den Akzeptor-Farbstoff verwenden, sind in Tabelle 1 erläutert.
Beispiele von Akzeptor-Farbstoffen, die in dieser Farbstoffklasse verwendet werden können, sind etwa, jedoch nicht ausschließlich, DR110-2, DR6G-2, DTMR, DROX, wie oben erläutert, sowie die in den 3A und 3B erläuterten Farbstoffe.
Eine Unterklasse dieser fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffe sind die Farbstoffe gemäß der ersten Farbstoffklasse der vorliegenden Erfindung, worin der Akzeptor-Farbstoff ein 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoff ist. Die allgemeine Struktur dieser Farbstoffe ist nachfolgend erläutert.
Tabelle 4 liefert Beispiele der Energieübertragungsfarbstoffe, die zu der ersten Farbstoffklasse gehören, worin ein 4,7-Dichlorrhodamin als der Akzeptor-Farbstoff verwendet wird. Es ist zu bemerken, daß, obwohl die in Tabelle 4 erläuterten Farbstoffe einen 5-Carboxyfluorescein-Donor-Farbstoff und einen 5- oder 6-Carboxy-DTMR als den Akzeptor-Farbstoff einschließen, dies so verstanden werden sollte, daß eine Vielzahl anderer Xanthenfarbstoffe leicht als Ersatz als der Donor-Farbstoff und eine Vielzahl anderer 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffe leicht für den DTMR-Akzeptor-Farbstoff eingesetzt werden können, obwohl alle diese Abwandlungen in bezug auf die Donor- und Akzeptor-Farbstoffe unter den Erfindungsgedanken fallen sollen.
Eine andere Unterklasse dieser fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffe sind die Farbstoffe gemäß der zweiten Farbstoffklasse der vorliegenden Erfindung, worin der Akzeptor-Farbstoff ein 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoff ist. Die allgemeine Struktur dieser Farbstoffe, bei denen der Donor-Xanthenfarbstoff und der Akzeptor-4,7-Dichlorrodaminfarbstoff in irgendeiner der 5- oder 6-Stellungen der Donor- und Akzeptor-Farbstoffe verknüpft sind, ist nachfolgend erläutert.
Wie oben beschrieben, ist bei dieser Ausführungsform der Linker, der den Donor-Farbstoff an den Akzeptor-Farbstoff bindet, vorzugsweise kurz und/oder starr, da gefunden wurde, daß dies die Energieübertragung zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Farbstoff verbessert. Die obengezeigten Substituentenmarkierungen entsprechen den gleichen Substituentengruppen, wie sie in bezug auf die anderen Farbstoffe angegeben wurden.
Tabelle 5 liefert Beispiele der zweiten Klasse von Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung, worin 4,7-Dichlorrhodamin als der Akzeptor-Farbstoff verwendet wird. Es wird festgestellt, daß, obwohl die in Tabelle 5 erläuterten Farbstoffe einen 5-Aminomethylfluorescein-Donor-Farbstoff einschließen, verstanden werden sollte, daß eine große Vielzahl anderer Xanthenfarbstoffe leicht als Ersatz für den Donor-Farbstoff verwendet werden kann. Es sollte auch verstanden werden, daß eine große Vielzahl anderer 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffe leicht den in Tabelle 5 gezeigten Akzeptor-Farbstoff ersetzen kann, da, wie oben beschrieben wurde, alle diese Abwandlungen in bezug auf die Donor- und Akzeptor-Farbstoffe innerhalb des Erfindungsgedankens fallen sollen.
II. Reagenzien die Energieübertragungsfarbstoffe nach der vorliegenden Erfindung einschließen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch fluoreszierende Reagenzien, die einen fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung enthalten. Wie in weiteren Einzelheiten im Abschnitt III beschrieben, können diese Reagenzien in einer großen Vielzahl von Verfahren zur Feststellung des Vorhandenseins einer Komponente in einer Probe verwendet werden.
Die fluoreszierenden Reagenzien der vorliegenden Erfindung enthalten irgendein Molekül oder Material, an welches die Energieübertragungsfarbstoffe nach der Erfindung gebunden und verwendet werden können, um das Vorhandensein des Reagenz auf der Basis der Fluoreszenz des Energieübertragungsfarbstoffes zu ermitteln. Typen von Molekülen und Materialien, an die die Farbstoffe nach der vorliegenden Erfindung gebunden werden können, um ein Reagenz zu bilden, schließen beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich, Proteine, Polypeptide, Polysaccharide, Nukleotide, Nukleoside, Oligonukleotide, Oligonukleotidanaloge (wie eine Peptidnukleinsäure), Lipide, feste Träger, organische und anorganische Polymere und Kombinationen sowie Kombinationen hiervon, wie Chromosomen, Kerne, lebende Zellen, wie Bakterien, andere Mikroorganismen, Säugetierzellen und -gewebe ein.
Bevorzugte Klassen von Reagenzien der vorliegenden Erfindung sind Nukleotide, Nukleoside, Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloge, die so modifiziert wurden, daß sie einen Energieübertragungsfarbstoff nach der Erfindung einschließen. Beispiele von Verwendungen für Nukleotid- und Nukleosidreagenzien sind etwa, aber nicht ausschließlich, Markierungsoligonukleotide, die durch enzymatische Synthese gebildet werden, z. B. Nukleosidtriphosphate, die in Verbindung mit PCR-Verstärkung verwendet werden, Oligonukleotidsequenzierung vom Sanger-Typ und Kerbentranslationsreaktionen ein. Beispiele von Verwendungen für Oligonukleotidreagenzien sind etwa, aber nicht ausschließlich, DNA-Sequenzierungsprimer, PCR-Primer, Oligonukleotidhybridisierungssonden und dergleichen.
Eine spezielle Ausführungsform der Reagenzien sind markierte Nukleoside (NTP), wie Cytosin, Adenosin, Guanosin und Thymidin, die mit einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung markiert sind. Diese Reagenzien können in einer großen Vielzahl von Verfahren verwendet werden, welche Oligonukleotidsynthese einschließen. Eine andere verwandte Ausführungsform sind markierte Nukleotide, z. B. Mono-, Di- und Triphosphatnukleosidphosphatester. Diese Reagenzien schließen insbesondere Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP), wie Desoxycytosintriphosphat, Desoxyadenosintriphosphat, Desoxyguanosintriphosphat und Desoxythymidintriphosphat ein, die mit einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung markiert sind. Diese Reagenzien können beispielsweise als Polymerasesub strate bei der Herstellung farbstoffmarkierter Oligonukleotide benutzt werden. Diese Reagenzien schließen auch markierte Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTP), wie Didesoxycytosintriphosphat, Didesoxyadenosintriphosphat, Didesoxyguanosintriphosphat und Didesoxythymidintriphosphat ein, die mit einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung markiert sind. Diese Reagenzien können beispielsweise bei der Farbstoffterminierungssequenzierung benutzt werden.
Eine andere Ausführungsform von Reagenzien sind Oligonukleotide, welche einen fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung einschließen. Diese Reagenzien können beispielsweise in Farbstoffprimersequenzierung benutzt werden.
Wie hier verwendet, bezeichnet "Nukleosid" eine Verbindung, die aus einer Purin-, Deazapurin- oder Pyrimidinnukleosidbase, z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Deazaadenin, Deazaguanosin und dergleichen, besteht, die mit einer Pentose in der Stellung 1' einschließlich der 2'-Desoxy- und 2'-Hydroxylformen verknüpft ist, die beispielsweise in Kornberg und Baker, DNA-Replikation, 2. Auflage (Freeman, San Francisco, 1992) beschrieben ist. Der Begriff "Nukleotid", wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Phosphatester eines Nukleosids, z. B. Mono-, Di- und Triphosphatester, worin die üblichste Veresterungsstelle die Hydroxylgruppe ist, die an die C-5-Stellung der Pentose gebunden ist. "Analoge" in bezug auf Nukleoside schließen synthetische Nukleoside mit modifizierten Baseresten und/oder modifizierten Zuckerresten ein, wie beispielsweise allgemein von Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980) beschrieben ist. Die Begriffe "markiertes Nukleosid" und "markiertes Nukleotid" bedeuten Nukleoside und Nukleotide, die kovalent durch eine Verknüpfung an einen Energieübertragungsfarbstoff gebunden sind.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Oligonukleotid" lineare Polymere von natürlichen oder modifizierten Nukleosidmonomeren einschließlich Doppel- und Einfachstrang-Desoxyribonukleoside, Ribonukleoside, α-anomere Formen hiervon usw. Gewöhnlich sind die Nukleosidmonomeren durch Phosphodiesterverknüpfungen verknüpft, worin, wie hier verwendet, der Begriff "Phosphodiesterverknüpfung" Phosphodiesterbindungen oder Analoge hiervon einschließlich Phosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphorselenoat, Phosphordiselenoat, Phosphoranilothioat, Phosphoranilidat, Phosphoramidat usw. bedeutet, einschließlich verbundener Gegenionen, z. B. H, NH₄, Na und dergleichen, wenn solche Gegenionen vorhanden sind. Die Oligonukleotide liegen in der Größe im Bereich von einigen wenigen Monomereinheiten, z. B. 8 bis 40, bis zu mehreren tausend Monomereinheiten. Wann immer ein Oligonukleotid durch eine Folge von Buchstaben wiedergegeben wird, wie "ATGCCTG", wird man verstehen, daß die Nukleotide in der Reihenfolge 5' → 3' von links nach rechts gelesen werden und daß "A" Desoxyadenosin, "C" Desoxycytidin, "G" Desoxyguanosin und "T" Thymidin bedeuten, wenn nichts anderes angegeben ist.
Die Nukleosidmarkierung kann unter Verwendung irgendeiner aus einer großen Anzahl bekannter Nukleosidmarkierungstechniken unter Benutzung bekannter Verknüpfungen, Verknüpfungsgruppen und verbundener Komplementärfunktionalitäten erhalten werden. Die Verknüpfung des Farbstoffes und Nukleosids sollte (i) gegenüber den Oligonukleotidsynthesebedingungen beständig sein, (ii) die Oligonukleotid-Zielhybridisierung nicht stören, (iii) mit relevanten Enzymen, wie den Po lymerasen, Ligasen und dergleichen, verträglich sein und (iv) die Fluoreszenz des Farbstoffes nicht unterbinden.
Die Farbstoffe sind vorzugsweise mit dem 5-Kohlenstoffatom von Pyrimidinbasen und dem 7-Kohlenstoffatom von 7-Deazapurinbasen kovalent verknüpft. Über mehrere geeignete Basenmarkierungsverfahren wurde berichtet, und diese können bei der Erfindung verwendet werden, z. B. Gibson et al., Nucleic Acids Research, 15, Seiten 6455 bis 6467 (1987), Gebeyehu et al., Nucleic Acids Research, 15, Seiten 4513 bis 4535 (1987), Haralambidis et al., Nucleic Acids Research, 15, Seiten 4856 bis 4876 (1987), Nelson et al., Nucleosides and Nucleotides, 5 (3), Seiten 233 bis 241 (1986), Bergstrom et al., JACS, 111, Seiten 374 und 375 (1989), US-Patente Nr. 4 855 225, 5 231 191 und 5 449 767.
Vorzugsweise sind die Verknüpfungen Acetylenamido- oder Alkenamidoverknüpfungen, wobei die Verknüpfung zwischen dem Farbstoff und der Nukleotidbase durch Umsetzung eines aktivierten N-Hydroxysuccinimidesters (NHS) des Farbstoffes mit einer alkenylamino-, alkinylethoxyamino- oder alkenylaminoderivatisierten Base eines Nukleotids gebildet wird. Stärker bevorzugt ist die resultierende Verknüpfung Propargyl-1-ethoxyamido-(3-[Amino]-ethoxy-1-propinyl), 3-(Carboxy)-amino-1-propinyl oder 3-Amino-1-propin-1-yl.
Mehrere bevorzugte Verknüpfungen zur Verknüpfung der Farbstoffe nach der Erfindung mit einer Nukleosidbase sind nachfolgend gezeigt.
worin R₁ und R₂ getrennt genommen H, Alkyl, eine Schutzgruppe oder ein fluoreszierender Farbstoff sind.
Die Synthese von alkinylaminoderivatisierten Nukleosiden wird von Hobbs et al. in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 251 786 und von Hobbs et al. in J. Org. Chem., 54, Seite 3420 (1989) beschrieben, auf welche hier Bezug genommen wird. Kurz gesagt werden die alkinylaminoderivatisierten Nukleotide gebildet, indem man das geeignete Halogendidesoxynukleosid (gewöhnlich 5-Jodpyrimidin- und 7-Jod-7-deazapurindidesoxynukleoside, wie von Hobbs et al. [oben zitiert] beschrieben) und Cu(I) in einem Kolben plaziert, mit Argon spült, um Luft zu entfernen, wor auf trockenes DMF zugesetzt wird, gefolgt von der Zugabe eines Alkinylamins, von Triethylamin und Pd(O). Das Reaktionsgemisch kann mehrere Stunden oder so lange gerührt werden, bis Dünnschichtchromatographie den Verbrauch des Halogendidesoxynukleosids anzeigt. Wenn ein ungeschütztes Alkinylamin verwendet wird, kann das Alkinylaminonukleosid durch Konzentrieren des Reaktionsgemisches und Chromatographieren auf Kieselgel unter Verwendung eines Eluierlösungsmittels isoliert werden, welches Ammoniumhydroxid enthält, um das bei der Kupplungsreaktion gebildete Wasserstoffhalogenid zu neutralisieren. Wenn ein geschütztes Alkinylamin verwendet wird, kann dem Reaktionsgemisch Methanol/Methylenchlorid zugegeben werden, gefolgt von der Bicarbonatform eines stark basischen Anionaustauscherharzes. Der Schlamm kann dann etwa 45 min gerührt, filtriert und das Harz mit weiterem Methanol/Methylenchlorid gespült werden. Die vereinigten Filtrate können konzentriert und durch Entspannungschromatographie auf Kieselgel unter Verwendung eines Methanol-Methylenchlorid-Gradienten gereinigt werden. Die Triphosphate erhält man durch Standardmethoden.
Die Synthese von Oligonukleotiden, die mit einem Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung markiert sind, kann unter Verwendung irgendeiner großen Anzahl bekannter Oligonukleotid-Markierungstechniken unter Verwendung bekannter Verknüpfungen, Verknüpfungsgruppen und verbundener Komplementärfunktionalitäten erzielt werden. Beispielsweise können markierte Oligonukleotide enzymatisch synthetisiert werden, wie unter Verwendung einer DNA-Polymerase oder -Ligase, wie z. B. nach Stryer, Biochemistry, Kapitel 24, W. H. Freeman and Company (1981), oder durch chemische Synthese, z. B. mit einer Phosphoramiditmethode, einer Phosphittriestermethode oder dergleichen, siehe z. B. Gait, Oligonukleotidsynthese, IRL Press (1990). Markierungen können während enzymatischer Synthese unter Benutzung markierter Nukleosidtriphosphatmonomere oder während chemischer Synthese unter Verwendung markierter Nichtnukleotid- oder Nukleotidphosphoramidite oder anschließend an die Synthese eingeführt werden.
Wenn das markierte Oligonukleotid unter Verwendung einer enzymatischen Synthese gemacht wird, kann allgemein das folgende Verfahren angewendet werden. Eine Templat-DNA wird denaturiert, und ein Oligonukleotidprimer wird an das Templat-DNA gebunden. Ein Gemisch von Desoxynukleosidtriphosphaten wird der Reaktion zugesetzt, einschließlich dGTP, dATP, dCTP und dTTP, wo wenigstens ein Anteil eines der Desoxynukleotide mit einer Farbstoffverbindung nach der Erfindung, wie oben beschrieben, markiert ist. Als nächstes wird ein Polymeraseenzym unter Bedingungen zugegeben, in denen das Polymeraseenzym aktiv ist. Ein markiertes Polynukleotid wird durch die Einarbeitung der markierten Desoxynukleotide während Polymerasestrangsynthese gebildet. Bei einer alternativen enzymatischen Synthesemethode werden zwei Primer anstelle eines einzigen verwendet, ein Primer komplementär zu dem Plusstrang und der andere komplementär zu dem Minusstrang der Zielverbindung. Die Polymerase ist eine thermostabile Polymerase, und die Reaktionstemperatur wird zwischen einer Denaturierungstemperatur und einer Verlängerungstemperatur gewechselt, wobei exponentiell ein markiertes Gegenstück zu der Zielsequenz durch PCR, z. B. PCR-Protokolle, Innis et al., Herausgeber Academic Press (1990) synthetisiert wird.
Wenn das markierte Oligonukleotid unter Verwendung einer chemischen Synthese gemacht wird, ist es allgemein bevorzugt, daß eine Phosphoramiditmethode benutzt wird. Phosphoramiditverbindungen und die Phosphoramiditmethode der Polynukleotidsynthese sind beim Synthetisieren von Oligonukleotiden wegen der effizienten und schnellen Kopplung und der Stabilität der Ausgangsmaterialien bevorzugt. Die Synthese wird mit der wachsenden Oligonukleotidkette an einen festen Träger gebunden durchgeführt, so daß überschüssige Reagenzien, die in der flüssigen Phase vorliegen, leicht durch Filtration entfernt werden können, wobei man die Notwendigkeit von Reinigungsstufen zwischen den Zyklen ausschaltet.
Im Hinblick auf die Brauchbarkeit von Phosphoramiditreagenzien beim Markieren von Nukleosiden und Oligonukleotiden betrifft die vorliegende Erfindung auch Phosphoramiditverbindungen, die einen Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung einschließen.
Detaillierte Beschreibungen der zur Bildung von Oligonukleotiden nach der Phosphoramiditmethode verwendeten Chemie finden sich bei Caruthers et al., US-Patent Nr. 4 458 066, Caruthers et al. US-Patent Nr. 4 415 732, Caruthers et al., Genetic Engineering, 4, Seiten 1 bis 17 (1982), Users Manual Model 392 und 394 Polynucleotide Synthesizers, Seiten 6-1 bis 6-22, Applied Biosystems, Teil Nr. 901 237 (1991).
Das Folgende beschreibt kurz die Stufen eines typischen Oligonukleotidsynthesezyklus unter Verwendung der Phosphoramiditmethode. Zunächst wird ein fester Träger, der ein geschütztes Nukleotidmonomer einschließt, mit Säure, z. B. Trichloressigsäure, behandelt, um eine 5'-Hydroxylschutzgruppe zu entfernen, wobei das Hydroxyl für eine anschließende Kopplungsreaktion freigesetzt wird. Ein aktiviertes Zwischenprodukt wird dann durch gleichzeitige Zugabe eines geschützten Phosphoramiditnukleosidmonomers und einer schwachen Säure, z. B. Tetrazol, zu dem Reaktionsgemisch gebildet. Die schwache Säure protoniert den Stickstoff des Phosphoramidits unter Bildung eines reaktiven Zwischenproduktes. Nukleosidzugabe ist innerhalb von 30 sec beendet. Danach wird eine Maskierstufe durchgeführt, welche Polynukleotidketten, die nicht einer Nukleosidaddition unterliegen, abbricht. Das Maskieren erfolgt vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid und 1-Methylimidazol. Die Internukleotidverknüpfung wird dann von dem Phosphit zu dem stabileren Phosphotriester durch Oxidation unter Verwendung von Jod als das bevorzugte Oxidationsmittel und Wasser als Sauerstoffdonor umgewandelt. Nach der Oxidation wird die Hydroxylschutzgruppe mit einer protischen Säure, z. B. Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure, entfernt, und der Zyklus wird wiederholt, bis die Kettenverlängerung vollständig ist. Nach der Synthese wird die Polynukleotidkette von dem Träger unter Verwendung einer Base abgespalten, z. B. unter Verwendung von Ammoniumhydroxid oder tert-Butylamin. Die Spaltungsreaktion entfernt auch Phosphatschutzgruppen, z. B. Cyanoethyl. Schließlich werden die Schutzgruppen an den exozyklischen Aminen der Basen und die Hydroxylschutzgruppen an den Farbstoffen durch Behandlung der Polynukleotidlösung in Base bei einer erhöhten Temperatur, z. B. 55 °C, entfernt.
Irgendwelche der Phosphoramiditnukleosidmonomeren können farbstoffmarkierte Phosphoramidite sein. Wenn die 5'-Endposition des Nukleotids markiert ist, kann ein markiertes Nichtnukleotidphosphoramidit nach der Erfindung während der Endkondensationsstufe verwendet werden.
Wenn eine innere Stellung des Oligonukleotids markiert werden soll, kann ein markiertes Nukleotidphosphoramidit nach der Erfindung während irgendeiner der Kondensationsstufen benutzt werden.
Anschließend an ihre Synthese können Oligonukleotide in einer Reihe von Stellungen einschließlich der 5'-Endstellung markiert werden. Siehe Oligonukleotide und Analoge, Herausgeber Eckstein, Kapitel 8, IRL Press (1991) und Orgel et al., Nukleinsäureforschung 11 (18), Seite 6513 (1983), US-Patentschrift Nr. 5 118 800.
Oligonukleotide können auch an ihrem Phosphodiestergrundgerüst (Oligonukleotide und Analoge, Herausgeber Eckstein, Kapitel 9) oder an der 3-Endstellung (Nelson, Nukleinsäureforschung, 20 [23], Seiten 6253 bis 6259 und US-Patente Nr. 5 401 837 und 5 141 813) markiert sein. Für eine Übersicht der Oligonukleotidmarkierungsverfahren siehe R. Haugland in "Angeregte Zustände von Biopolymeren", Herausgeber Steiner, Plenum Press, NY (1983).
Bei einer bevorzugten chemischen Markierungsmethode nach der Synthese wird ein Oligonukleotid folgendermaßen markiert. Ein Farbstoff mit einer Carboxyverknüpfungsgruppe wird in den n-Hydroxysuccinimidester durch Umsetzung mit etwa einem Äquivalent 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid und etwa drei Äquivalenten n-Hydroxysuccinimid in trockenem Ethylacetat während 3 h bei Raumtemperatur umgewandelt. Das Reaktionsgemisch wird mit 5%-igem HCl gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Feststoff konzentriert, welcher in DMSO erneut suspendiert wird. Das DMSO-Farbstoffmaterial wird dann im Überschuß (10 bis 20 mal) einem aminohexylderivatisierten Oligonukleotid in 0,25 M Bicarbonat/Carbonat-Puffer bei pH 9,4 zugesetzt, und man läßt 6 h reagieren, siehe US-Patent Nr. 4 757 141. Das farbstoffmarkierte Oligonukleotid wird von unumgesetztem Farbstoff durch Hindurchschicken durch eine Chromatographiesäule mit Größenausschluß unter Eluieren mit Puffer, z. B. 0,1 molarem Triethylaminacetat (TEAA) getrennt. Die das rohe markierte Oligonukleotid enthaltende Fraktion wird weiter durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Gradientenelution gereinigt.
III. Verfahren unter Verwendung von Farbstoffen und Reagenzien nach der vorliegenden Erfindung
Die Energieübertragungsfarbstoffe und -reagenzien der vorliegenden Erfindung können in einer großen Vielzahl von Verfahren zur Ermittlung des Vorhandenseins einer Komponente in einer Probe durch Markieren der Komponente in der Probe mit einem den Farbstoff enthaltenden Reagenz verwendet werden. Insbesondere sind Energieübertragungsfarbstoffe und -reagenzien der vorliegenden Erfindung gut geeignet für die Verwendung bei Verfahren, welche Trenn- und Fluoreszenzermittlungstechniken kombinieren, besonders Methoden, die die gleichzeitige Feststellung mehrerer sich räumlich überlappender Analyte erfordern. Beispielsweise sind die Farbstoffe und Reagenzien zur Identifizierung von Klassen von Oligonukleotiden, die einem biochemischen Trennverfahren, wie Elektrophorese, unterzogen wurden, wo eine Reihe von Banden oder Flecken von Zielsubstanzen mit ähnlichen physiochemischen Eigenschaften, z. B. Größe, Konformation, Ladung, Hydrophobizität oder dergleichen, einer linearen oder ebenen Anordnung vorhanden sind, besonders gut geeignet. Wie hier verwendet, schließt der Ausdruck "Banden" jegliche räumliche Gruppierung oder Ansammlung von Analyten auf der Grundlage ähnlicher oder räumliche Gruppierung oder Ansammlung von Analyten auf der Grundlage ähnlicher oder identischer physiochemischer Eigenschaften ein. Gewöhnlich entstehen Banden bei der Trennung von Farbstoff-Oligonukleotidkonjugaten durch Elektrophorese.
Klassen von Oligonukleotiden können in einer Vielzahl von Zusammenhängen auftreten. Bei einer bevorzugten Kategorie von Methoden, die hier als "Fragmentanalyse"- oder "genetische Analyse"-Methoden bezeichnet werden, werden markierte Oligonukleotidfragmente durch templatgerichtete enzymatische Synthese unter Verwendung markierter Primer oder Nukleotide erzeugt, z. B. durch Ligierung oder polymerasegerichtete Primerverlängerung. Die Fragmente werden einem größenabhängigen Trennverfahren, z. B. Elektrophorese oder Chromatographie, unterzogen, und die getrennten Fragmente werden anschließend an die Trennung zum Beispiel durch laserinduzierte Fluoreszenz festgestellt. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Klassen von Oligonukleotiden gleichzeitig getrennt, und die verschiedenen Klassen werden durch spektral auflösbare Markierungen unterschieden.
Eine solche Fragmentanalysemethode ist die verstärkte Fragmentlängenpolymorphismusfeststellung (AmpFLP) und beruht auf verstärktem Fragmentlängenpolymorphismus, d. h. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, der durch PCR verstärkt wird. Diese verstärkten Fragment variierender Größe dienen als vernetzte Marker durch nachfolgende Mutantengene durch Familien. Je näher das verstärkte Fragment dem Mutantengen auf dem Chromosom ist, desto höher ist die Verknüpfungskorrelation. Da Gene für viele genetische Störungen nicht identifiziert wurden, dienen diese Verknüpfungsmarker dazu, eine Bewertung eines Krankheitsrisikos oder einer Vaterschaft zu unterstützen. In der AmpFLPs-Technik können die Polynukleotide durch Verwendung eines markierten Oligonukleotids-PCR-Primers oder durch Benutzung markierter Nukleotidtriphosphate in dem PCR markiert werden.
Eine andere Fragmentanalysemethode ist die Kerbentranslation. Kerbentranslation schließt eine Reaktion ein, um unmarkierte Nukleotidtriphosphate in einem Doppelstrang-DNA-Molekül durch markierte zu ersetzen. Freie 3'-Hydroxylgruppen werden in der unmarkierten DNA durch "Kerben" erzeugt, die durch Desoxyribonuklease I (DNAse I)-Behandlung verursacht werden. DNA-Polymerase I katalysiert dann die Addition eines markierten Nukleotids an der 3'-Hydroxylendgruppe der Kerbe. Gleichzeitig eliminiert die 5'- bis 3'-Exonucleaseaktivität dieses Enzyms die Nukleotideinheit von der 5'-Phosphorylendgruppe der Kerbe. Ein neues Nukleotid mit einer freien 3'-OH-Gruppe wird in der Stellung des ursprünglichen herausgeschnittenen Nukleotids eingearbeitet, und die Kerbe wird durch eine Nukleotideinheit in der 3'-Richtung gewechselt. Dieser 3'-Wechsel führt zur Folgeaddition neuer markierter Nukleotide an die DNA zur Entfernung bestehender unmarkierter Nukleotide. Das kerbentranslatierte Polynukleotid wird dann unter Verwendung eines Trennverfahrens, z. B. Elektrophorese, analysiert.
Eine andere beispielhafte Fragmentanalysemethode beruht auf der variablen Anzahl von Tandemwiederholungen oder VNTRs. VNTRs sind Bereiche der doppelstrangigen DNA, die benachbarte Mehrfachkopien einer speziellen Sequenz enthalten, wobei die Anzahl von sich wiederholenden Einheiten variabel ist. Beispiele von VNTR-Fällen sind pYNZ22, pMCT118 und Apo B. Eine Unterkombination von VNTR-Methoden sind jene Methoden, die auf der Feststellung von Mikrosatellitwiederholungen oder kurzen Tandemwiederholungen (STRs) beruhen, d. h. Tandemwiederholungen von DNA, die durch eine kurze (zwei bis vier Basen) Wiederholungssequenz gekennzeichnet sind. Eine der ergiebigsten eingestreuten, sich wiederholenden DNA-Familien bei Menschen ist die Nukleotidwiederholungsfamilie (dC-dA)n-(dG-dT)n (auch als die Dinukleotidwiederholungsfamilie [CA]n bezeichnet). Es wird angenommen, daß es so viele wie 50 000 bis 100 000 (CA)n-Wiederholungsbereiche im menschlichen Genom gibt, typischerweise mit 15 bis 30 Wiederholungen je Block. Viele dieser Wiederholungsbereiche haben polymorphe Länge und können daher als brauchbare genetische Marker dienen. Vorzugsweise wird bei VNTR- oder STR-Methoden eine Markierung in die Polynukleotidfragmente durch Verwendung eines farbstoffmarkierten PCR-Primers eingeführt.
Eine andere beispielhafte Fragmentanalysemethode ist das DNA-Sequenzieren. Im allgemeinen schließt das DNA-Sequenzieren eine Verlängerungs-/Abbruchreaktion eines Oligonukleotidprimers ein. In das Reaktionsgemisch eingeschlossen sind Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), die verwendet werden, um den Primer zu verlängern. Auch eingeschlossen in das Reaktionsgemisch ist wenigstens ein Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP), welches, wenn auf dem verlängerten Primer eingeführt, weitere Verlängerung des Primers verhindert. Nachdem die Verlängerungsreaktion abgebrochen wurde, werden die verschiedenen Abbruchprodukte, die gebildet werden, getrennt und analysiert, um die Positionierung der verschiedenen Nukleoside zu bestimmen.
Fluoreszenz-DNA-Sequenzierung kann allgemein in zwei Kategorien unterteilt werden, "Farbstoffprimersequenzierung" und "Farbstoffabbruchmittelsequenzierung". Beim Farbstoffprimersequenzieren wird ein fluoreszierender Farbstoff in den zu verlängernden Primer eingeführt. Vier getrennte Verlängerungs-/Abbruchreaktionen laufen dann parallel, wobei jede Verlängerungsreaktion ein unterschiedliches Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) enthält, um die Verlängerungsreaktion abzubrechen. Nach dem Abbruch werden die Reaktionsprodukte durch Gelelektrophorese getrennt und analysiert. Siehe beispielsweise Ansorge et al., Nucleic Acids Res., 15, Seiten 4593 bis 4602 (1987).
Bei einer Abwandlung des Farbstoffprimersequenzierens werden unterschiedliche Primer in den vier getrennten Verlängerungs-/Abbruchreaktionen verwendet, wobei jeder Primer einen anderen spektral auflösbaren Farbstoff enthält. Nach dem Abbruch werden die Reaktionsprodukte aus den vier Verlängerungs-/Abbruchreaktionen vereinigt, elektrophoretisch getrennt und auf einem einzigen Weg ermittelt. Siehe beispielsweise Smith et al., Nature, 321, Seiten 674 bis 679 (1986). So können bei dieser Abwandlung des Farbstoffprimersequenzierens durch Verwendung von Primern, die einen Satz von spektral auflösbaren Farbstoffen enthalten, Produkte aus mehr als einer Verlängerungs-/Abbruchreaktion gleichzeitig festgestellt werden.
Beim Farbstoffabbruchmittelsequenzieren wird ein fluoreszierender Farbstoff an jedes der Didesoxynukleosidtriphosphate gebunden. Eine Verlängerungs-/Abbruchreaktion wird dann durchgeführt, bei der ein Primer unter Verwendung von Desoxynukleosidtriphosphaten verlängert wird, bis das markierte Didesoxynukleosidtriphosphat in den verlängerten Primer eingearbeitet ist, um weitere Verlängerung des Primers zu verhindern. Nach Abbruch werden die Reaktionsprodukte für jedes Didesoxynukleosidtriphosphat getrennt und ermittelt. Bei einer Ausführungsform werden getrennte Verlängerungs-/Abbruchreaktionen für jedes der vier Didesoxynukleosidtriphosphate durchgeführt. Bei einer anderen Ausführungsform wird eine einzelne Verlängerungs-/Abbruchreaktion durchgeführt, die die vier Didesoxynukleosidtriphosphate enthält, wobei jedes mit einem anderen spektral auflösbaren fluoreszierenden Farbstoff markiert ist.
So bekommt man nach einem Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von Farbstoffprimersequenzierung unter Verwendung eines oder mehrerer Oligonukleotidreagenzien nach der vorliegenden Erfindung. Gemäß dieser Methode wird ein Gemisch verlängerter markierter Primer durch Hybridisieren einer Nukleinsäuresequenz mit einem fluoreszierend markierten Oligonukleotidprimer in Gegenwart von Desoxynukleosidtriphosphaten, wenigstens eines Didesoxynukleosidtriphosphates und einer DNA-Polymerase gebildet. Der fluoreszierend markierte Oligonukleotidprimer enthält eine Oligonukleotidsequenz komplementär zu einem Bereich der Nukleinsäuresequenz, die sequenziert wird, sowie einen fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff, der an das Oligonukleotid gebunden ist.
Gemäß der Methode verlängert die DNA-Polymerase den Primer mit den Desoxynukleosidtriphosphaten, bis ein Didesoxynukleosidtriphosphat eingearbeitet ist, welches eine Verlängerung des Primers abbricht. Nach dem Abbruch wird das Gemisch verlängerter Primer getrennt. Die Sequenz der Nukleinsäuresequenz wird dann durch fluoreszierende Feststellung des gebildeten Gemisches von verlängerten Primern ermittelt.
Bei einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens laufen vier Farbstoffprimersequenzierungsreaktionen ab, wobei jede Primersequenzierungsreaktion einen unterschiedlichen fluoreszierend markierten Oligonukleotidprimer und ein unterschiedliches Didesoxynukleosidtriphosphat (ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP) einschließt. Nach dem Ablaufen der vier Farbstoffprimersequenzierungsreaktionen können die resultierenden Gemische von verlängerten Primern vereinigt werden. Das Gemisch von verlängerten Primern kann dann getrennt werden, wie beispielsweise durch Elektrophorese, und das fluoreszierende Signal von jedem der vier unterschiedlichen fluoreszierend markierten Oligonukleotidprimer festgestellt werden, um die Sequenz der Nukleinsäuresequenz zu bestimmen.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung bekommt man ein Verfahren zur Durchführung der Farbstoffabbruchmittelsequenzierung unter Verwendung eines oder mehrerer Didesoxynukleosidtriphosphate, die mit einem Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung markiert sind. Gemäß dieser Methode wird ein Gemisch von verlängerten Primern durch Hybridisieren einer Nukleinsäuresequenz mit einem Oligonukleotidprimer in Gegenwart von Desoxynukleosidtriphosphaten, wenigstens eines fluoreszierend markierten Didesoxynukleotidtriphosphates und einer DNA-Polymerase gebildet. Das fluoreszierend markierte Didesoxynukleotidtriphosphat schließt ein Didesoxynukleosidtriphosphat ein, welches mit einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung markiert ist.
Gemäß dieser Methode verlängert die DNA-Polymerase den Primer mit den Desoxynukleosidtriphosphaten, bis ein fluoreszierend markiertes Didesoxynukleosidtriphosphat in den verlängerten Primer eingearbeitet ist. Nach dem Abbruch wird das Gemisch von verlängerten Primern getrennt. Die Sequenz der Nukleinsäuresequenz wird dann durch Bestimmung des an den verlängerten Primer gebundenen fluoreszierend markierten Didesoxynukleosids ermittelt.
Bei einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens schließt die Stufe der Bildung eines Gemisches von verlängerten Primern eine Hybridisierung der Nukleinsäuresequenz mit vier verschiedenen fluoreszierend markierten Didesoxynukleosidtriphosphaten ein, d. h. mit einem fluoreszierend markierten Didesoxycytosintriphosphat, einem fluoreszierend markierten Didesoxyadenosintriphosphat, einem fluoreszierend markierten Didesoxyguanosintriphosphat und einem fluoreszierend markierten Didesoxythymidintriphosphat.
Bei jeder der obenbeschriebenen Fragmentanalysemethoden werden die markierten Oligonukleotide vorzugsweise durch elektrophoretische Verfahren getrennt, z. B. Gould und Matthews, a. a. O., Rickwood und Hames, Herausgeber, Gelelektrophorese von Nukleinsäuren: Ein praktischer Weg (IRL Press Limited, London, 1981) oder Osterman, Methoden der Protein- und Nukleinsäureforschung, Band 1, Springer-Verlag Berlin (1984). Vorzugsweise ist der Typ der elektrophoretischen Matrix vernetztes oder unvernetztes Polyacrylamid mit einer Konzentration (Gewicht pro Volumen) zwischen etwa 2 und 20 Gew.-%. Stärker bevorzugt liegt die Polyacrylamidkonzentration zwischen etwa 4 und 8 %. Vorzugsweise enthält speziell im Zusammenhang mit dem DNA-Sequenzieren die Elektrophoresematrix ein Strangtrennungs- oder Denaturierungsmittel, wie Harnstoff, Formamid oder dergleichen. Detaillierte Verfahren zum Aufbau solcher Matrizes sind von Maniatis et al. in "Fraktionierung von niedermolekularer DNA und RNA in Polyacrylamidgelen mit einem Gehalt von 98 % Formamid oder 7 M Harnstoff" in Methods in Enzymology, 65, Seiten 299 bis 305 (1980), Maniatis et al. "Kettenverlängerungsbegrenzung kleiner doppel- und einfachstrangiger DNA-Moleküle durch Polyacrylamidgelelektrophorese", Biochemistry, 14, Seiten 3787 bis 3794 (1975), Maniatis et al., Molekulares Klonen: Ein Laboratoriumshandbuch (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982), Seiten 179 bis 185 und ABI PRISM^® 377 DNA Sequencer User's Manual, Ref. A., Januar 1995, Kapitel 2 (p/n 903 433, The Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA), auf die hier jeweils Bezug genommen wird, beschrieben. Die optimale Polymerkonzentration, pH-Einstellung, Temperatur, Konzentration des Denaturierungsmittels usw., die bei einer speziellen Trennung verwendet werden, hängen von vielen Faktoren, einschließlich des Größenbereiches der zu trennenden Nukleinsäuren, der Basenzusammensetzungen, ob sie einzel- oder doppelstrangig sind, und der Natur der Klassen, für welche Information durch Elektrophorese gewünscht wird, ab. Demnach kann die Anwendung der Erfindung Standardvorversuche erfordern, um die Bedingungen für spezielle Trennungen zu optimieren. Beispielhalber wurden Oligonukleotide mit Größen im Bereich zwischen etwa 20 und 300 Basen getrennt und gemäß der Erfindung in der folgenden Matrix ermittelt: 6 % Polyacrylamid, hergestellt aus 19 Teilen zu 1 Teil Acrylamid zu Bisacrylamid, gebildet in einem tris-Borat EDTA-Puffer bei pH 8,3.
Nach elektrophoretischer Trennung werden die Farbstoff-Oligonukleotidkonjugate durch Messung der Fluoreszenzemission von den farbstoffmarkierten Polynukleotiden ermittelt. Um eine solche Ermittlung durchzuführen, werden die Polynukleotide mit Standardeinrichtungen beleuchtet, z. B. mit Quecksilberdampflampen hoher Intensität, Lasern oder dergleichen. Vorzugsweise ist die Beleuchtungseinrichtung ein Laser mit einem Beleuchtungsstrahl mit einer Wellenlänge zwischen 488 und 550 nm. Stärker bevorzugt werden die Farbstoff-Polynukleotide mit Laserlicht beleuchtet, das von einem Argonionenlaser, besonders mit den Emissionslinien eines Argonionenlasers von 488 und 514 nm oder der Emissionslinie eines Neodym-YAG-Lasers in festem Zustand bei 532 nm erzeugt wird. Verschiedene Argonionenlaser sind im Handel erhältlich, die gleichzeitig bei diesen Linien lasen, z. B. bei der Cyonics, Ltd. (Sunnyvale, Kalifornien), Modell 2001 oder dergleichen. Die Fluoreszenz wird dann durch einen lichtempfindlichen Detektor, z. B. eine Lichtvervielfacherröhre, eine beladene gekoppelte Einrichtung oder dergleichen festgestellt.
IV. Kits mit den Energieübertragungsfarbstoffen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits mit Kombinationen von fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffen und/oder -reagenzien. Bei einer Ausführungsform enthält der Kit wenigstens zwei spektral auflösbare Energieübertragungsfarbstoffe nach der vorliegenden Erfindung. In diesem Kit enthalten die Energieübertragungsfarbstoffe vorzugsweise den gleichen Donor-Farbstoff, so daß eine einzige Lichtquelle erforderlich ist, um die Farbstoffe anzuregen.
Bei einer anderen Ausführungsform enthält der Kit Didesoxycytosintriphosphat, Didesoxyadenosintriphosphat, Didesoxyguanosintriphosphat und Didesoxythymidintriphosphat, wobei jedes Didesoxynukleotidtriphosphat mit einem Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung markiert ist. Bei einer Ausführungsform ist jeder Energieübertragungsfarbstoff spektral auflösbar gegenüber den anderen Energieübertragungsfarbstoffen, die an die anderen Didesoxynukleotidtriphosphate gebunden sind. In diesem Kit enthält der Energieübertragungsfarbstoff vorzugsweise den gleichen ersten Xanthenfarbstoff.
Bei noch einer anderen Ausführungsform enthält der Kit wenigstens zwei Oligonukleotide, wobei jedes Oligonukleotid einen Energieübertragungsfarbstoff nach der vorliegenden Erfindung einschließt. Bei einer Ausführungsform enthält jedes Oligonukleotid einen Energieübertragungsfarbstoff, welcher spektral gegenüber den Energieübertragungsfarbstoffen, die an die anderen Oligonukleotide gebunden sind, auflösbar ist. Bei einer anderen Ausführungsform enthält der Kit wenigstens vier Oligonukleotide, welche jeweils einen spektral auflösbaren Energieübertragungsfarbstoff enthalten.
Die fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoffe und ihre Verwendung beim DNA-Sequenzieren ist durch die folgenden Beispiele erläutert. Weitere Ziele und Vorteile als die oben angegebenen, werden aus den Beispielen ersichtlich.
Beispiele
1. Synthese von 5TMR-B-CF
5TMR-B-CF wurde aus 5-TMR NHS 4'-Aminomethyl-5-carboxyfluorescein gemäß den in Beispiel 1A–C beschriebenen Reaktionsfolgen synthetisiert. 5TMR-B-CF wurde dann in 5TMR-B-CF-NHS gemäß den in 1D beschriebenen Reaktionsfolgen umgewandelt, so daß der Farbstoff mit einem Nukleosid, Nukleotid oder Oligonukleotidprimer gekoppelt werden konnte.
A. Synthese von 5-TMR-B
Ein Gemisch von 4-Aminomethylbenzoesäure (3 mg, 19 μmol), 5-TMR NHS (5 mg, 9 μmol) und Triethylamin (20 μl) wurde in Dimethylformamid (DMF, 200 μl) in einem 1,5 1-Eppendorf-Röhrchen suspendiert. Das Gemisch wurde 10 min auf 60 °C erhitzt. Der Reaktionsfortschritt wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Kieselgel unter Eluieren mit einem 400/30/10-Gemisch von Dichlormethan, Methanol und Essigsäure überwacht. Die unlösliche 4-Aminomethylbenzoesäure wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, und die DMF-Lösung wurde in 5%-iges HCl (1 ml) dekantiert. Das unlösliche 5TMR-B wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 5%-igem HCl (2 × 1 ml) gewaschen und in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Das Produkt wurde in DMF (200 μl) gelöst und verwendet, um 5TMR-B-NHS herzustellen.
B. Synthese von 5-TMR-B-NHS
Eine Lösung von 5TMR-B in DMF (125 μl) Diisopropylethylamin (10 μl) und Disuccinimidylcarbonat (10 mg) wurde in einem 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen vereinigt und auf 60 °C erhitzt. Der Reaktionsfortschritt wurde durch TLC auf Kieselgel unter Eluieren mit einem 600/60/16-Gemisch von Dichlormethan, Methanol und Essigsäure überwacht. Nach 5 min schien die Reaktion vollständig abgelaufen zu sein. Die Lösung wurde in Methylenchlorid (3 ml) verdünnt und mit 250 mM Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,4 × 1 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und zur Trockene auf einer Vakuumzentrifuge konzentriert. Der Feststoff wurde in DMF (100 μl) aufgelöst. Die Ausbeute wurde durch Verdünnen eines Anteils mit Puffer von pH 9 und Messung der Absorption bei 552 nm bestimmt. Unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 50 000 cm^–1 M^–1 war die Konzentration an 5TMR-B-NHS 4,8 mM. Die Ausbeute aus 5TMR NHS war 8 %.
C. Synthese von 5TMR-B-CF
Eine Lösung von 5TMR-B-NHS (1 μmol in 250 μl DMF) wurde mit einer Lösung von 4'-Aminomethyl-5-carboxyfluorescein (CF, 2,2 μmol in 100 μl DMSO) und Triethylamin (20 μl) in einem 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen vereinigt. Die Reaktion wurde durch HPLC unter Verwendung einer C8-Umkehrphasensäule mit einer Gradientenlösung von 15 bis 35 % Acetonitril gegenüber 0,1 M Triethylammoniumacetat überwacht. Die HPLC-Analyse zeigte, daß das 5TMR-B-NHS verbraucht wurde und dabei überschüssiges unumgesetztes CF hinterließ. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5%-igem HCl (1 ml) verdünnt, und das Produkt wurde durch Zentrifugieren getrennt und hinterließ das unumgesetzte CF in der wäßrigen Phase. Der Feststoff wurde mit 5%-igem HCl (4 × 1 ml) gewaschen, in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in DMF (300 μl) aufgenommen. Die Ausbeute war quantitativ.
D. Synthese von 5-TMR-B-CF-NHS
Ein Lösung von 5TMR-B-CF (0,6 μmol in 100 μl DMF), 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (DEC, 2 mg) sowie N-Hydroxysuccinimid (4 mg) wurde in einem 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen vereinigt. Das Gemisch wurde kurz mit Ultraschall behandelt und auf 60 °C erhitzt. Die Reaktion wurde durch TLC auf Kieselgel unter Eluieren mit einem 600/60/16-Gemisch von Dichlormethan, Methanol und Essigsäure überwacht. Die Reaktion war in 30 min vollständig abgelaufen, und es wurde mit 5%-igem HCl verdünnt. Das Produkt wurde durch Zentrifugieren getrennt und in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Der aktivierte Farbstoff wurde in DMF (20 μl) gelöst.
2. Synthese von 5ROX-CF
Eine Lösung von 5ROX NHS (2 μmol in 100 μl DNSO) wurde mit CF (2 μmol in 100 μl DMSO) und Triethylamin (10 μl) vermischt. Die Reaktion erfolgte durch HPLC auf einer C8-Umkehrphasensäule unter Verwendung von Gradienteneluieren von 20 bis 40 % Acetonitril gegenüber 0,1 M TEAA verfolgt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5%-igem HCl (1 ml) verdünnt und das Produkt durch Zentrifugieren gesammelt, mit 5%-igem HCl (1 × 1 ml) gewaschen und in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Das Produkt wurde in DMF (200 μl) aufgenommen.
3. Synthese von Cy5-CF
Eine Lösung von CF (0,4 μmol in 20 μl CMSO) und Triethylamin (2 μl) wurde zu Mono-Cy5 NHS (etwa 0,3 μmol) zugesetzt. Die Reaktion erfolgte durch HPLC auf einer C8-Umkehrphasensäule unter Verwendung von Gradienteneluieren von 10 bis 30 % Acetonitril gegenüber 0,1 M TEAA. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5%-igem HCl (1 ml) verdünnt, und das Produkt wurde durch Zentrifugieren gesammelt, mit 5%-igem HCl (1 × 1 ml) gewaschen und in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Das Produkt wurde in DMF (100 μl) aufgenommen.
4. Vergleich der Fluoreszenzstärke von Energieübertragungsfarbstoffen
Das folgende Beispiel vergleicht die Fluoreszenzemissionsstärke einer Reihe von Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung. Farbstofflösungen von 5TMR, 6TMR-CF, 5TMR-gly-CF, 5TMR-CF, 5TMR-B-CF, 5TMR-gly-5AMF, 5TMR-5AMF und 5TMR-lys-5FAM wurden in 1 × TBE/8M-Harnstoff gemessen. Jede Farbstofflösung hatte eine optische Dichte von 0,1 bei 560 nm und wurde bei 488 nm angeregt.
TABELLE 7
Die Strukturen jedes dieser Farbstoffe sind in Tabelle 7 erläutert. 2 ist eine Balkendarstellung der relativen Fluoreszenz jedes dieser Farbstoffe.
Wie aus 2 ersichtlich ist, wurde gefunden, daß Energieübertragungsfarbstoffe, worin der Linker an den Akzeptor in der Ringposition 5 gebunden ist (5TMR-CF und 5TMR-B-CF), signifikant stärkere Fluoreszenz haben als der Akzeptor-Farbstoff selbst oder wenn der Akzeptor-Farbstoff in der Ringstellung 6 verknüpft wird (6TMR-CF). Wie auch aus 2 ersichtlich ist, zeigte sich, daß Energieübertragungsfarbstoffe, worin der Vernetzer die Formel R₁XC(O)R₂ hat, worin R₂ Benzol ist, (5TMR-B-CF) signifikant bessere Fluoreszenz im Vergleich mit dem Farbstoff haben, worin der Linker die Formel -CH₂NHCO-(5TMR-CF) oder -CH₂NHCOOH₂NHCO-(5TMR-gly-5AMF) hat.
Wie auch aus 2 ersichtlich ist, wurde gefunden, daß Energieübertragungsfarbstoffe, worin der Linker sowohl an den Donor als auch an den Akzeptor in der Ringstellung 5 gebunden ist (5TMR-5AMF und 5TMR-gly-5AMF), signifikante Fluoreszenz haben. Interessanterweise zeigt sich, daß die Verwendung eines Lysinlinkers nicht zu einer merklichen Energieübertragung zwischen dem Donor und Akzeptor führt.
5. Farbstoffprimersequenzierung unter Verwendung von Energieübertragungsfarbstoff
In diesem Beispiel wurde Farbstoffprimersequenzierung bei M13 (SEQ. ID. NO.: 1) durchgeführt, um die relative Helligkeit von 5TMR-CF- und 5TMR-B-CF-markierten Oligonukleotiden zu vergleichen. In diesem Beispiel wurde Farbstoffprimersequenzierung gemäß dem ABI PRISM^® 377 DNA Sequencer User's Manual, Rev. B, Januar 1995, Kapitel 2, Seite 402114, The Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA) durchgeführt. 5TMR-CF und 5TMR-B-CF wurden jeweils an das 5'-Ende von M13-21-Primer (SEO. ID. NO.: 2) gebunden. Äquimolare Lösungen eines jeden Primers wurden mit dem M13 (SEQ. ID. NO.: 1) vermischt und mit einem einzigen Didesoxynukleotidgemisch (ddA/dNTP) und Taq FS sequenziert. Eine graphische Darstellung des resultierenden Gemisches von Oligonukleotiden, die unter Verwendung von 5TMR-CF- und 5TMR-B-CF-markierten Primern festgestellt wurden, ist in 7 wiedergegeben. Wie aus 7 ersichtlich ist, sind mit 5TMR-B-CF markierte Oligonukleotide heller als mit 5TMR-CF markierte Oligonukleotide. Wie auch aus 7 ersichtlich ist, ist die Mobilität von mit 5TMR-B-CF markierten Oligonukleotiden etwa ein Nukleotid geringer als bei den mit 5TMR-CF markierten Oligonukleotiden.
6. Farbstoffprimersequenzierung unter Verwendung von vier Farbstoffen
Farbstoffprimersequenzierung wurde an M13 (SEQ. ID. NO.: 1) unter Verwendung eines Satzes von vier Farbstoffen durchgeführt, die an den M13-21-Primer (SEQ. ID. NO.: 2) gebunden waren, wie in Beispiel 5 beschrieben ist. 8 ist eine Vierfarbaufzeichnung der beim Sequenzieren erzeugten farbstoffmarkierten Oligonukleotide. Der Peak für Cytosin entspricht der Fluoreszenz von 5-Carboxy-R110. Der Peak für Adenosin entspricht der Fluoreszenz von 5-Carboxy-R6G. Der Peak für Guanosin entspricht der Fluoreszenz von TMR-B-CF. Der Peak für Thymidin entspricht der Fluoreszenz von ROX-CF.
Wie aus 8 ersichtlich ist, zeigt jedes der farbstoffmarkierten Oligonukleotide signifikante Fluoreszenzintensität. Außerdem zeigen die verschiedenen farbstoffmarkierten Oligonukleotide ausreichend ähnliche Mobilität, so daß gute Auflösung der Peakreihe erreicht wird.
7. Synthese von 6-CFB-DTMR-2-NHS
6-CFB-DTMR-2 wurde aus DTMR-2 und 6-CFB gemäß den in den Beispielen 1A-B beschriebenen Reaktionsfolgen synthetisiert. 6-CFB-DTMR-2 wurde dann gemäß der in 1C beschriebenen Reaktionsfolge in 6-CFB-DTMR-2-NHS umgewandelt, so daß der Farbstoff an ein Nukleosid, Nukleotid oder einen Oligonukleotidprimer gekoppelt werden konnte.
A. Synthese von DTMR-2-NHS
Eine Lösung von DTMR-2 in DMF, N-Hydroxysuccinimid und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid wurden in einem Eppendorf-Röhrchen vereinigt und auf 60 °C erhitzt. Der Reaktionsfortschritt wurde durch TLC auf Kieselgel überwacht. Nachdem die Reaktion als vollständig abgelaufen erschien, wurde die Lösung mit Methylenchlorid verdünnt und mit 250 mM Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,4 × 1 ml) und dann mit einer HCl-Lösung (5%-ig, 1 × 1 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und auf einer Vakuumzentrifuge zur Trockene konzentriert.
B. Synthese von 6-CF-B-DTMR-2
Eine Lösung von 6-CFB in Dimethylsulfoxid (100 μl, 11 mM) wurde mit einer Lösung von DTMR-2-Succidimidylester in Dimethylformamid (100 μl, 22 mM) und Triethylamin (20 μl) vereinigt. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Lösung von Salzsäure (5%-ig, 1 ml) zugegeben, und der Feststoff wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Der rote Feststoff wurde in Carbonat/Bicarbonat-Puffer (250 mM, pH 9, 100 μl) aufgelöst und mit verdünnter HCl wieder ausgefällt. Der Feststoff wurde in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in Dimethylformamid (200 μl) gelöst. Die Konzentration der Farbstofflösung wurde durch Verdünnen eines Anteils mit 40%-igem Acetonitril/0,1 M Trimethylammoniumacetat-Puffer (pH 7) bestimmt. Unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 80 000 cm^–1m^–1 für Fluorescein fand man, daß die 6-CF-B-DTMR-2-Lösung 4 mM (70%-ige Ausbeute) war.
C. Synthese von 6-CF-B-DTMR-NHS
Eine Lösung von 6-CF-B-DTMR-2 in Dimethylformamid (200 μl, 4 mM) wurde mit N-Hydroxysuccinimid (10 mg) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (5 μg) vereinigt. Weiteres N-Hydroxysuccinimid (10 mg) wurde zugegeben. Der Reaktionsfortschritt wurde durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel unter Eluieren mit Dichlormethan zu Methanol zu Essigsäure in einem 600 : 60 : 16-Gemisch überwacht. Wenn die Reaktion vollständig abgelaufen war, wurde verdünnte HCl (5%-ig, 1 ml) zugegeben und das Produkt durch Zentrifugieren getrennt. Der Feststoff wurde in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in Dimethylformamid (100 μl) aufgelöst. Die Konzentration der Farbstofflösung wurde durch Verdünnen eines Anteils mit 40%-igem Acetonitril/0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer (pH 7) bestimmt. Unter Annahme eines Extinkti onskoeffizienten von 80 000 cm^–1m^–1 für Fluorescein fand man, daß die 6-CF-B-DTMR-NHS-Lösung 5,4 mM war (68%-ige Ausbeute).
8. Vergleich der Fluoreszenzstärke von Farbstoffen
Das folgende Beispiel vergleicht die Fluoreszenzemissionsstärke einer Reihe von Energieübertragungsfarbstoffen nach der vorliegenden Erfindung mit dem entsprechenden Akzeptor-Farbstoff. Gemäß diesem Beispiel wurde jeder Farbstoff an eine 21-Primersequenz (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT) (SEQ. ID. NO.: 1) mit einer Aminohexylbindung am 5'-Ende gebunden. Die Oligonukleotide wurden quantitativ auf der Basis der Absorption bei 260 nm unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 180 000 cm^–1m^–1 bestimmt. Spektren wurden bei einer Primerkonzentration von 0,4 μm in 8M Harnstoff, 1 × Tris/Borat/EDTA (TBE)-Puffer mit einer Anregung bei 488 nm erhalten. 9A zeigt das überlagerte Spektrum von 5-CFB-DR110-2 und DR110-2. 9B zeigt das überlagerte Spektrum von 5-CFB-DR6G-2 und DR6G-2. 9C liefert das überlagerte Spektrum von 6-CFB-DTMR-2 und DTMR-2. 9D zeigt das überlagerte Spektrum von 6-CFB-DROX-2 und DROX-2.
Die Strukturen jedes dieser Farbstoffe sind in Tabelle 1 erläutert. Wie aus den 9A–D ersichtlich ist, wurde gefunden, daß Energieübertragungsfarbstoffe signifikant stärkere Fluoreszenz als der Akzeptor-Farbstoff selbst haben.
10 zeigt die normalisierten Fluoreszenzemissionsspektren von vier farbstoffmarkierten Oligonukleotiden. Die Spektren wurden mit einer Primerkonzentration von 0,4 μm in 8M Harnstoff, 1 × Tris/Borat/EDTA (TBE)-Puffer mit einer Anregung bei 488 nm erhalten. Die in 10 gezeigten Farbstoffe schließen 5-CFB-DR110-2, 5-CFB-DR6G-2, 6-CFB-DTMR-2 und 6-CFB-DROX-2 ein. Wie aus 10 ersichtlich ist, werden alle vier Energieübertragungsfarbstoffe in Relation zueinander gut aufgelöst.
9. Farbstoffprimersequenzierung unter Verwendung von Energieübertragungsfarbstoff
In diesem Beispiel wurde die Primersequenzierung von M13 (SEQ. ID. NO.: 2) unter Verwendung von 5-CF-TMR-2-, 5-CF-B-TMR-2-, 6-CF-B-DTMR-2- und DTMR-2-markierten Primern durchgeführt. In diesem Beispiel wurde die Farbstoffprimersequenzierung gemäß ABI PRISM^® 377 DNA Sequencer User's Manual, Rev. B., Januar 1995, Kapitel 2 (p/n 402 114, The Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA) durchgeführt. Der Farbstoff wurde an das 5'-Ende des M13-21-Primers (SEQ. ID. NO.: 3) gebunden. Äquimolare Lösungen jedes Primers wurden mit dem M13 (SEQ. ID. NO.: 2) vermischt und mit einem einzigen Didesoxynukleotidgemisch (ddA/dNTP) und Taq FS sequenziert. Aufzeichnungen der resultierenden Oligonukleotidgemische, die unter Verwendung von 5-CF-TMR-2- und 5-CF-B-TMR-2-markierten Primern festgestellt wurden, sind in 11 wiedergegeben. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, liefert 5-CF-B-TMR-2 ein signifikant stärkeres Signal als 5-CF-TMR-2, was die Fluoreszenzverbesserung zeigt, die man mit dem mit 5-CF-B-TMR-2 verwendeten Linker bekommt.
Aufzeichnungen der resultierenden Gemische von Oligonukleotiden, die unter Verwendung von 6-CF-B-DTMR-2- und DTMR-2-markierten Primern festgestellt wurden, sind in 12 wiedergegeben. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, ergibt 6-CF-B-DTMR-2 ein signifikant stärkeres Signal als DTMR-2, was die Fluoreszenzverbesserung zeigt, die man durch den Energieübertragungsfarbstoff erhält.
10. Farbstoffprimersequenzierung unter Verwendung von vier Farbstoffen
Farbstoffprimersequenzierung erfolgte an M13 (SEQ. ID. NO.: 2) unter Verwendung eines Satzes von vier Farbstoffen, die an den M13-21-Primer (SEQ. ID. NO.: 3) gebunden sind, wie in Beispiel 5 beschrieben. 13 ist eine Vierfarbaufzeichnung der beim Sequenzieren erzeugten farbstoffmarkierten Oligonukleotide. Der Peak für Cytosin entspricht der Fluoreszenz von 5-CFB-DR110-2. Der Peak für Adenosin entspricht der Fluoreszenz von 6-CFB-DR6G-2. Der Peak für Guanosin entspricht der Fluoreszenz von 5-CFB-DTMR-2. Der Peak für Thymidin entspricht der Fluoreszenz von 5-CFB-DROX-2.
Wie aus 13 ersichtlich ist, zeigt jedes der farbstoffmarkierten Oligonukleotide signifikante Fluoreszenzintensität. Außerdem zeigen die verschiedenen farbstoffmarkierten Oligonukleotide genügend ähnliche Mobilität, so daß eine gute Auflösung der Peakreihe erreicht wird.
Aspekte der Erfindung sind im angefügten Anhang definiert.
SEQUENZPROTOKOLL
ANHANG

1. Energieübertragungsfarbstoff mit der Struktur
worin DONOR ein Farbstoff ist, der Licht mit einer ersten Wellenlänge absorbieren und Anregungsenergie als Reaktion emittieren kann, AKZEPTOR der Farbstoff ist, der die von dem DONOR-Farbstoff emittierte Anregungsenergie absorbieren und als Reaktion bei einer zweiten Wellenlänge fluoreszieren kann, Z₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus NH, Schwefel und Sauerstoff besteht, R₂₁ eine an den DONOR-Farbstoff gebundene C_1-5-Alkylgruppe ist, R₂₂ ein Substituent ist, der eine funktionelle Gruppe einschließt, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alken, Dien, Alkin, einem fünf- und sechsgliedrigen Ring mit wenigstens einer ungesättigten Bindung oder einer verschmolzenen Ringstruktur, die an den Carbonylkohlenstoff gebunden ist, besteht, und R₂₈ eine funktionelle Gruppe ist, die den Linker an den AKZEPTOR-Farbstoff bindet.
2. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, worin R₂₂ einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring einschließt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cyclopenten, Cyclohexen, Cyclopentadien, Cyclohexadien, Furan, Thiofuran, Pyrrol, Isopyrrol, Isoazol, Pyrazol, Isoimidazol, Pyran, Pyron, Benzol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Oxazin, Inden, Benzofuran, Thionaphthen, Indol und Naphthalin ausgewählt ist.
3. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, worin der Farbstoff die Struktur
hat, worin Z₂ aus der Gruppe NH, Schwefel und Sauerstoff ausgewählt ist und R₂₉ eine C_1-5-Alkylgruppe ist.
4. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, worin der Farbstoff die nachfolgende Struktur hat
5. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, worin der DONOR-Farbstoff eine Verbindung aus der Xanthenklasse der Farbstoffe ist.
6. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 5, worin der AKZEPTOR-Farbstoff eine Verbindung einer Farbstoffklasse ist, die aus der Gruppe der Xanthen-, Cyanin-, Phthalocyanin- und Squarainfarbstoffe ausgewählt ist.
7. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, worin der DONOR-Farbstoff eine Verbindung einer Farbstoffklasse ist, die aus der Gruppe der Fluoreszein-, Rhodamin- und asymmetrischen Benzoxanthenfarbstoffe ausgewählt ist.
8. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 7, worin der AKZEPTOR-Farbstoff eine Verbindung einer Farbstoffklasse ist, die unter den Xanthen-, Cyanin-, Phthalocyanin- und Squarainfarbstoffen ausgewählt ist.
9. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, worin der DONOR-Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Carboxyfluoreszein-, 4,7-Dichlorfluoreszeinfarbstoffen, asymmetrischen Benzoxanthenfarbstoffen, Rhodamin, 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffen, Carboxyrhodaminen, N,N,N',N'-Tetramethylcarboxyrhodaminen, Carboxy R110 und Carboxy R6G besteht.
10. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, worin der AKZEPTOR-Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 4,7-Dichlorfluoreszeinfarbstoffen, asymmetrischen Benzoxanthenfarbstoffen, Rhodamin, 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffen, Carboxyrhodaminen, N,N,N',N'-Tetramethylcarboxyrhodaminen, Carboxy R110, Carboxy R6G, Carboxy-X-rhodaminen und Cy5 ausgewählt ist.
11. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 1, worin der AKZEPTOR-Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DR110-2, DR6G-2, DTMR und DROX besteht.
12. Energieübertragungsfarbstoff mit der Struktur
worin Y₁ und Y₂ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxyl, Sauerstoff, Iminium und Amin besteht, Z₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus NH, Schwefel und Sauerstoff besteht, R₁₁-R₁₃ und R₁₅-R₁₇ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, Phenyl, substituiertem Phenyl, wenn benachbarte Substituenten zur Bildung eines Ringes zusammengenommen werden, und Kombinationen hiervon besteht, R₂₁ eine C_1-5-Alkylgruppe ist, R₂₂ ein Substituent ist, welcher eine funktionelle Gruppe einschließt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus einem Alken, Dien, Alkin, eine fünf- und sechsgliedrigen Ring wenigstens einer ungesättigten Bindung oder einer verschmolzenen Ringstruktur, die an den Carbonylkohlenstoff gebunden ist, besteht, R₂₈ eine funktionelle Gruppe einschließt, die den Linker an den AKZEPTOR-Farbstoff bindet, und AKZEPTOR ein Farbstoff ist, der Anregungsenergie absorbieren kann, die von einer Verbindung der Xanthenfarbstoffklasse emittiert wird.
13. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 12, worin R₂₂ ein fünf- oder sechsgliedriger Ring ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cyclopenten, Cyclohexen, Cyclopentadien, Cyclohexadien, Furan, Thiofuran, Pyrrol, Isopyrrol, Isoazol, Pyrazol, Isoimidazol, Pyran, Pyron, Benzol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Oxazin, Inden, Benzofuran, Thionaphthen, Indol und Naphthalin besteht.
14. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 12, worin der Farbstoff die Struktur
hat, worin Z₂ aus der Gruppe NH, Schwefel und Sauerstoff ausgewählt ist und R₂₉ eine C_1-5-Alkylgruppe ist.
15. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 12, worin der Farbstoff die nachfolgende Struktur hat
16. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 12, worin der AKZEPTOR-Farbstoff eine Verbindung einer Farbstoffklasse ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Xanthen-, Cyanin-, Phthalocyanin- und Squarainfarbstoffen besteht.
17. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 12, worin der DONOR-Farbstoff eine Verbindung einer Farbstoffklasse ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Fluoreszein-, Rhodamin- und asymmetrischen Benzoxanthenfarbstoffen besteht.
18. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 17, worin der AKZEPTOR-Farbstoff eine Verbindung einer Farbstoffklasse ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Xanthen-, Cyanin-, Phthalocyanin- und Squarainfarbstoffen besteht.
19. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 12, worin der DONOR-Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Carboxyfluoreszeinen, 4,7-Dichlorfluoreszeinfarbstoffen, asymmetrischen Benzoxanthenfarbstoffen, Rhodamin, Carboxyrhodaminen, N,N,N',N'-Tetramethylcarboxyrhodaminen, Carboxy R100 und Carboxy R6G besteht.
20. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 19, worin der AKZEPTOR-Farbstoff eine Verbindung einer Farbstoffklasse ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Xanthen-, Cyanin-, Phthalocyanin- und Squarainfarbstoffen besteht.
21. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 12, worin der AKZEPTOR-Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 4,7-Dichlorfluoreszeinfarbstoffen, asymmetrischen Benzoxanthenfarbstoffen, Rhodamin, 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffen, Carboxyrhodaminen, N,N,N',N'-Tetramethylcarboxyrhodaminen, Carboxy R110, Carboxy R6G, Carboxy-X-rhodaminen und Cy5 besteht.
22. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 12, worin der AKZEPTOR die allgemeine Struktur
hat, worin Y₁ und Y₂ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxyl, Sauerstoff, Iminium und Amin besteht, R₁₁-R₁₆ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, Phenyl, substituiertem Phenyl, wenn benachbarte Substituenten zusammengenommen werden, um einen Ring zu bilden, und Kombinationen hiervon besteht, X₁ bis X₅ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, wenn benachbarte Substituenten zur Bildung eines Ringes zusammengenommen werden, und Kombinationen hiervon besteht, und einer der Reste X₃ und X₄ an die R₂₈-Gruppe gebunden ist.
23. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 12, worin der AKZEPTOR-Farbstoff die allgemeine Struktur
hat, worin R₁ bis R₄ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff und Alkyl oder, wenn eine oder mehrere der Gruppen R₁ und R₅, R₂ und R₆, R₃ und R₈, R und R₉ unter Bildung eines Ringes zusammengenommen werden, besteht, R₅ bis R₁₀ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Sulfon, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, Phenyl und substituiertem Phenyl oder, wenn zwei oder mehr aus R₅ bis R₁₀ zusammengenommen sind, um einen oder mehrere Ringe zu bilden, besteht, X₁, X₃ und X₄ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Sulfon, Amino, Ammonium, Amido, Nitril oder Alkoxy besteht, X₂ und X₅ Chlor sind und einer der Reste X₃ und X₄ an R₂₈ gebunden ist.
24. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 23, worin die von Substituenten R₅ bis R₁₀ gebildeten Ringe 5-, 6- oder 7-gliedrige Ringe sind.
25. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 23, worin eine oder mehrere der Gruppen R₁ und R₅, R₂ und R₆, R₃ und R₈, R₄ und R₉ unter Bildung eines 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ringes zusammengenommen sind.
26. Energieübertragungsfarbstoff nach Anspruch 23, worin R₁ bis R₁₀, X₁, X₃ und X₄ so ausgewählt sind, daß sie einem Farbstoff entsprechen, der aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
27. Fluoreszierender Energieübertragungsfarbstoff der allgemeinen Struktur
worin Y₁, Y₁', Y₂ und Y₂' jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxyl, Sauerstoff, Iminium und Amin besteht, R₁₁ bis R₁₆ und R₁₁' bis R₁₆' jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, Phenyl, substituiertem Phenyl, wenn benachbarte Substituenten unter Bildung eines Ringes zusammengenommen sind, und Kombinationen hiervon besteht und X₁ bis X₅ und X₁' bis X₅' jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, wenn benachbarte Substituenten unter Bildung eines Ringes zusammengenommen werden, und Kombinationen hiervon besteht, Y₁, Y₂, R₁₁ bis R₁₆ und X₁ bis X₅ so ausgewählt sind, daß sie einem DONOR-Farbstoff entsprechen, der bei einer ersten Wellenlänge Licht absorbieren und als Reaktion Anregungsenergie emittieren kann, Y₁', Y₂', R₁₁' bis R₁₆' und X₁' bis X₅' so ausgewählt sind, daß sie einem AKZEPTOR-Farbstoff entsprechen, welcher die von dem DONOR-Farbstoff emittierte Anregungsenergie absorbieren und als Reaktion bei einer zweiten Wellenlänge fluoreszieren kann, und einer der Reste X₃ und X₄ und einer der Reste X₃' und X₄' zusammengenommen werden, um einen Linker zu bilden, der den DONOR-Farbstoff mit dem AKZEPTOR-Farbstoff verknüpft, so daß Energie von dem DONOR-Farbstoff auf den AKZEPTOR-Farbstoff übertragen wird.
28. Fluoreszierender Energieübertragungsfarbstoff der allgemeinen Struktur
worin Y₁, Y₁', Y₂ und Y₂' jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxyl, Sauerstoff, Iminium und Amin besteht, R₁₁ bis R₁₆ und R₁₁' bis R₁₆' jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, Phenyl, substituiertem Phenyl, wenn benachbarte Substituenten unter Bildung eines Ringes zusammengenommen sind, und Kombinationen hiervon besteht und X₁ bis X₅ und X₁' bis X₅' jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Carboxyl, Alkyl, Alken, Alkin, Sulfonat, Amino, Ammonium, Amido, Nitril, Alkoxy, wenn benachbarte Substituenten unter Bildung eines Ringes zusammengenommen werden, und Kombinationen hiervon besteht, Y₁, Y₂, R₁₁ bis R₁₆ und X₁ bis X₅ so ausgewählt sind, daß sie einem DONOR-Farbstoff entsprechen, der bei einer ersten Wellenlänge Licht absorbieren und als Reaktion Anregungsenergie emittieren kann, Y₁', Y₂', R₁₁' bis R₁₆' und X₁' bis X₅' so ausgewählt sind, daß sie einem AKZEPTOR-Farbstoff entsprechen, welcher die von dem DONOR-Farbstoff emittierte Anregungsenergie absorbieren und als Reaktion bei einer zweiten Wellenlänge fluoreszieren kann, und einer der Reste X₃ und X₄ und einer der Reste X₃' und X₄' zusammengenommen werden, um einen Linker der allgemeinen Formel R₂₅Z₃C(O)R₂₆Z₄C(O) zu bilden, worin R₂₅ ein an den DONOR-Farbstoff bei dem X₃- oder X₄-Substituenten gebundener C_1-4-Alkylrest ist, Z₃ und Z₄ unabhängig voneinander entweder NH, O oder S sind, C(O) eine Carbonylgruppe ist und die endständige Carbonylgruppe an den AKZEPTOR-Farbstoff bei dem X₃'- oder X₄'-Substituenten gebunden ist.
29. Fluoreszierender Energieübertragungsfarbstoff aus der Gruppe
30. Fluoreszierend markiertes Reagenz mit einem Reagenz aus der Gruppe, die aus einem Nukleosid, Nukleosidmonophosphat, Nukleosiddiphosphat, Nukleosidtriphosphat, Oligonukleotid und Oligonukleotidanalogem, modifiziert, um mit einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff verknüpft zu werden, besteht, und einem fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 29.
31. Fluoreszierend markiertes Reagenz nach Anspruch 30, bei dem das Reagenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Desoxynukleosid, Desoxynukleosidmonophosphat, Desoxynukleosiddiphosphat und Desoxynukleosidtriphosphat besteht.
32. Fluoreszierend markiertes Reagenz nach Anspruch 31, bei dem die Desoxynukleotide aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Desoxycytosin, Desoxyadenosin, Desoxyguanosin und Desoxythymidin besteht.
33. Fluoreszierend markiertes Reagenz nach Anspruch 30, bei dem das Reagenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Didesoxynukleosid, Didesoxynukleosidmonophosphat, Didesoxynukleosiddiphosphat und Didesoxynukleosidtriphosphat besteht.
34. Fluoreszierend markiertes Reagenz nach Anspruch 30, bei dem die Didesoxynukleotide aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Desoxycytosin, Desoxyadenosin, Desoxyguanosin und Desoxythymidin besteht.
35. Fluoreszierend markiertes Reagenz nach Anspruch 30, bei dem das Reagenz ein Oligonukleotid ist.
36. Fluoreszierend markiertes Reagenz nach Anspruch 35, bei dem das Oligonukleotid ein 3'-Ende hat, welches durch Verwendung einer Polymerase ausdehnbar ist.
37. Verfahren zur Sequenzierung einer Nukleinsäuresequenz, in dem man ein Gemisch eines verlängerten markierten Primers durch Hybridisieren einer Nukleinsäuresequenz mit einem fluoreszierend markierten Oligonukleotid-Primer in Gegenwart von Desoxynukleosidtriphosphaten, wenigstens eines Didesoxynukleosidtriphosphats und einer DNA-Polymerase bildet, wobei die DNA-Polymerase den Primer mit den Desoxynukleosidtriphosphaten verlängert, bis ein Didesoxynukleosidtriphosphat eingearbeitet ist, welches die Verlängerung des Primers beendet, das Gemisch von verlängerten Primern trennt und die Sequenz der Nukleinsäuresequenz durch fluoreszierendes Messen des gebildeten Gemisches von verlängerten Primern bestimmt, wobei der fluoreszierend markierte Oligonukleotid-Primer eine Oligonukleotidsequenz komplementär zu einem Abschnitt der gebildeten Nukleinsäuresequenz einschließt und ein durch eine Polymerase verlängerbares 3'-Ende und einen an das Oligonukleotid gebundenen fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 30 hat.
38. Verfahren zur Sequenzierung einer Nukleinsäuresequenz, bei dem man ein Gemisch von verlängerten Primern durch Hybridisieren einer Nukleinsäuresequenz mit einem Primer in Gegenwart von Desoxynukleosidtriphosphaten, wenigstens eines fluoreszierend markierten Didesoxynukleosidtriphosphats und einer DNA-Polymerase, wobei die DNA-Polymerase den Primer mit den Desoxynukleosidtriphosphaten verlängert, bis ein fluoreszierend markiertes Didesoxynukleosidtriphosphat auf dem verlängerten Primer eingearbeitet ist, welches die Verlängerung des Primers beendet, bildet, das Gemisch von verlängerten Primern trennt und die Sequenz der Nukleinsäuresequenz durch Feststellung des an das getrennte Gemisch von verlängerten Primern gebundenen fluoreszierend markierten Didesoxynukleotids bestimmt, wobei das fluoreszierend markierte Didesoxynukleosidtriphosphat ein Didesoxynukleosidtriphosphat und einen an das Didesoxynukleosidtriphosphat gebundenen fluoreszierenden Energieübertragungsfarbstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 30 einschließt.

Claims

Ein Energietransferfarbstoff, der aufweist: einen Fluorescein- oder Rhodamin-Donorfarbstoff, der in der Lage ist, Licht bei einer ersten Wellenlänge zu absorbieren und hierauf Anregungsenergie zu emittieren, einen Fluorescein- oder Rhodamin-Akzeptorfarbstoff, der in der Lage ist, Anregungsenergie, die von dem Donorfarbstoff emittiert wird, zu absorbieren und hierauf bei einer zweiten Wellenlänge zu fluoreszieren und einen Linker, der die Ringposition 4', 5 oder 6 des Donorfarbstoffs mit der Ringposition 4', 5 oder 6 des Akzeptorfarbstoffs verbindet, wobei der Linker eine funktionelle Gruppe aufweist, die aus der Gruppe, die aus einem Alken, Dien, Alkin, einem fünf- oder sechsgliedrigen Ring mit mindestens einer ungesättigten Bindung und einer kondensierten Ringstruktur besteht, ausgewählt ist, wobei entweder der Donor- oder der Akzeptorfarbstoff oder beide ein 4,7-Dichlorrhodamin-Farbstoff sind.
Energietransferfarbstoff gemäß Anspruch 1, wobei die funktionelle Gruppe ein Alken ist.
Energietransferfarbstoff gemäß Anspruch 1, wobei die funktionelle Gruppe ein Dien ist.
Energietransferfarbstoff gemäß Anspruch 1, wobei die funktionelle Gruppe ein Alkin ist.
Energietransferfarbstoff gemäß Anspruch 1, wobei die funktionelle Gruppe ein fünfgliedriger Ring ist, der mindestens eine ungesättigte Bindung hat.
Energietransferfarbstoff gemäß Anspruch 1, wobei die funktionelle Gruppe ein sechsgliedriger Ring ist, der mindestens eine ungesättigte Bindung hat.
Energietransferfarbstoff gemäß Anspruch 1, wobei die funktionelle Gruppe eine kondensierte Ringstruktur ist.
Energietransferfarbstoff gemäß Anspruch 1, wobei die funktionelle Gruppe ein fünf- oder sechsgliedriger Ring ist, der aus der Gruppe, die aus Cyclopenten, Cyclohexen, Cyclopentadien, Cyclohexadien, Furan, Thiofuran, Pyrrol, Isopyrrol, Isoazol, Pyrazol, Isoimidazol, Pyran, Pyron, Benzol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Oxazin, Inden, Benzofuran, Thionaphthen, Indol und Naphthalen besteht, ausgewählt ist.
Energietransferfarbstoff gemäß Anspruch 8, wobei die funktionelle Gruppe ein Benzol ist.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Emissionsmaximum des Akzeptorfarbstoffs wenigstens etwa 100 nm größer ist als das Absorptionsmaximum des Donorfarbstoffs.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Emissionsmaximum des Akzeptorfarbstoffs größer als etwa 600 nm ist.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Donorfarbstoff aus der Gruppe, die aus Carboxyfluoresceinen, 4,7-Dichlorfluoresceinfarbstoffen, asymmetrischen Benzoxanthenfarbstoffen, Rhodamin, 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffen, Carboxyrhodaminen, N,N,N',N'-Tetramethylcarboxyrhodaminen, Carboxy R110 und Carboxy R6G besteht, ausgewählt ist.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Akzeptorfarbstoff aus der Gruppe, die aus einem 4,7-Dichlorfluoresceinfarbstoff, einem asymmetrischen Benzoxanthenfarbstoff, einem Rhodaminfarbstoff, einem 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoff, einem Carboxyrhodaminfarbstoff, einem N,N,N',N'-Tetramethylcarboxyrhodaminfarbstoff, Carboxy R110, Carboxy R6G und einem Carboxy-X-Rhodaminfarbstoff besteht, ausgewählt ist.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Akzeptorfarbstoff aus der Gruppe, die aus DR110-2, DR6G-2, DTMR und DROX besteht, ausgewählt ist:
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Verbindung an ein Mitglied der Gruppe, die aus einem Nukleosid, Nukleosidmonophosphat, Nukleosiddiphosphat, Nukleosidtriphosphat, Oligonukleotid und Oligonukleotidanalogen besteht, gekoppelt ist.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Verbindung an ein Mitglied der Gruppe, die aus Desoxynukleosid, Desoxynukleosidmonophosphat, Desoxynukleosiddiphosphat und Desoxynukleosidtriphosphat besteht, gekoppelt ist.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Verbindung an ein Mitglied der Gruppe, die aus Desoxycytosin, Desoxyadenosin, Desoxyguanosin und Desoxythymidin besteht, gekoppelt ist.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Verbindung an ein Mitglied der Gruppe, die aus Didesoxynukleosid, Didesoxynukleosidmonophosphat, Didesoxynukleosiddiphosphat und Didesoxynukleosidtriphosphat besteht, gekoppelt ist.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Verbindung an ein Mitglied der Gruppe, die aus Didesoxycytosin, Didesoxyadenosin, Didesoxyguanosin und Didesoxythymidin besteht, gekoppelt ist.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Verbindung an ein Oligonukleotid gekoppelt ist.
Energietransferfarbstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Verbindung an ein Oligonukleotid gekoppelt ist, das ein 3'-Ende hat, welches durch die Verwendung einer Polymerase verlängerbar ist.
Kit für die Sequenzierung einer Nukleinsäuresequenz, das aufweist: mehrere fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotidtriphosphate, wobei jedes unterschiedliche Didesoxynukleotidtriphosphat einen anderen fluoreszierenden Farbstoff angefügt hat und wenigstens ein fluoreszierender Farbstoff eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 aufweist.
Kit für die Sequenzierung einer Nukleinsäuresequenz, das aufweist: mehrere fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotidtriphosphate, wobei jedes unterschiedliche Didesoxynukleotidtriphosphat einen anderen Fluoreszenzfarbstoff angefügt hat und jeder Fluoreszenzfarbstoff eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 aufweist.
Verfahren zum Nachweisen von Oligonukleotide, das folgendes umfaßt: Formieren einer Gruppe von Oligonukleotiden unterschiedlicher Größe, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, wobei wenigstens ein Fluoreszenzfarbstoff eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1–9 aufweist, Auftrennen der Gruppe von markierten Oligonukleotiden nach ihrer Größe und Nachweisen der getrennten markierten Oligonukleotide durch Anregen der Fluoreszenzfarbstoffe und Messen des Lichts, das von den Fluoreszenzfarbstoffen emittiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Formieren einer Gruppe von Oligonukleotiden unterschiedlicher Größe, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, das Herstellen einer Mischung von verlängerten Primern durch Hybridisieren einer Nukleinsäuresequenz mit einem Oligonukleotid-Primer in Anwesenheit von Desoxynukleosidtriphosphaten, wenigstens einem fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleosidtriphosphat und einer DNA-Polymerase umfaßt, wobei die DNA-Polymerase den Primer mit den Desoxynukleosidtriphosphaten so lange verlängert, bis ein fluoreszenzmarkiertes Didesoxynukleosidtriphosphat in den verlängerten Primer aufgenommen ist, was die Verlängerung des Primers beendet, wobei das Verfahren weiterhin umfaßt, daß man die Sequenz der Nukleinsäuresequenz durch Nachweis der getrennten markierten Oligonukleotide bestimmt.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Formieren einer Gruppe von Oligonukleotiden unterschiedlicher Größe, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, das Herstellen einer Mischung von verlängerten Primern durch Hybridisieren einer Nukleinsäuresequenz mit einem Oligonukleotid-Primer, der mit einem Energietransferfarbstoff markiert ist, in Anwesenheit von Desoxynukleosidtriphosphaten, wenigstens einem Didesoxynukleosidtriphosphat und einer DNA-Polymerase umfaßt, wobei die DNA-Polymerase den Primer mit Desoxynukleosidtriphosphaten solange verlängert, bis ein Didesoxynukleosidtriphosphat in den verlängerten Primer aufgenommen ist, was die Verlängerung des Primers beendet, wobei das Verfahren weiterhin umfaßt, daß man die Sequenz der Nukleinsäuresequenz durch Nachweis der getrennten markierten Oligonukleotide bestimmt.