JP2003221515A - ４，７−ジクロロローダミン色素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 現在利用可能なローダミン色素より実質的に
狭い発光スペクトル領域を有するローダミン色素のクラ
ス、および現存のローダミン色素に比べて赤色側に約１
５ｎｍまでシフトした吸収スペクトルを有するローダミ
ン色素のクラスを提供する。 【解決手段】 デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌク
レオチド、およびポリヌクレオチドを含む４，７−ジク
ロロローダミン色素化合物で標識化された試薬。ジデオ
キシポリヌクレオチド配列決定およびフラグメント解析
法、ならびにこのような色素化合物および試薬を用いる
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、分子プロ
ーブとして有用な蛍光色素化合物に関する。より詳細に
は、本発明は、蛍光標識試薬として有用な４，７−ジク
ロロローダミン色素に関する。

【０００２】

【従来の技術】（参考文献）

【０００３】

【表１】 生物学的分析物の非放射性検出は、現在の分析バイオテ
クノロジーにおいて、重要な技術である。放射性標識の
必要性をなくすことにより、安全性が高まり、試薬廃棄
物の環境上の影響が著しく低下し、その結果、分析コス
トが低減される。このような非放射性検出方法を使用す
る方法の例には、ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチド
プローブ法、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出、イム
ノアッセイなどが包含される。

【０００４】多くの用途では、混合物中の複数の空間的
に重複した分析物の独立した検出、例えば、単一管の多
重ＤＮＡプローブアッセイ、イムノアッセイ、多色ＤＮ
Ａ配列決定法などが必要である。複数座のＤＮＡプロー
ブアッセイの場合には、多色検出を提供することによ
り、反応管の数を減らすことができ、それにより、実験
プロトコルが簡潔化され、そして適用特異的なキットの
製造が促進される。自動化したＤＮＡ配列決定の場合に
は、多色標識化により、単一レーンの４個の塩基全ての
分析が可能となり、それにより、単色法よりも処理能力
が増え、レーン間の電気泳動の可動性の変化に付随した
不確実性がなくなる。

【０００５】多重検出では、特に、電気泳動分離および
酵素処理が必要な分析（例えば、ＤＮＡ配列決定）に対
して、色素標識の選択について、非常に多くの厳しい制
約が課せられている。第１に、有機蛍光色素の典型的な
発光バンドの半値幅は、約４０〜８０ナノメーター（ｎ
ｍ）であり、利用できるスペクトルの幅は、励起光源に
より制限されるので、その発光スペクトルが分光的に解
析される一連の色素を見つけるのは困難である。第２
に、たとえ、非重複発光スペクトルを有する色素を見出
しても、個々の蛍光効率が低すぎるなら、そのセット
は、依然として、適当ではない。例えば、ＤＮＡ配列決
定の場合には、試料の充填を多くしても、低い蛍光効率
を補填できない（Ｐｒｉｎｇｌｅ）。第３に、数個の蛍
光色素を同時に使用するとき、これらの色素の吸収バン
ドが広範囲に分離するために、同時励起が困難となる。
第４に、これらの色素の電荷、分子サイズおよび立体配
座は、そのフラグメントの電気泳動可動性に悪影響を与
えてはならない。最後に、これらの蛍光色素は、これら
のフラグメントを製造するかまたは操作するのに使用す
る化学物質（例えば、ＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝
液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素など）と適合性で
なければならない。

【０００６】これらの厳しい制約のために、多色用途
（特に、４色ＤＮＡ配列決定の領域）で使用できる蛍光
色素のセットは、少数発見されているにすぎない（Ｓｍ
ｉｔｈ１９９２，１９９５， Ｐｒｏｂｅｒ；Ｃｏｎｎ
ｅｌｌ）。

【０００７】多色用途において特に有用な蛍光色素の１
つのクラスはローダミン色素である（例えば、テトラメ
チルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯ
Ｘ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０
（Ｒ１１０）など（Ｂｅｒｇｏｔ）。（１）代表的に、
ローダミンはフルオレセインよりも光安定であり、
（２）ローダミン標識されたジデオキシヌクレオチド
は、熱安定性ポリメラーゼ酵素のよりよい基質であり、
そして（３）ローダミン色素の発光スペクトルは、フル
オレセインの赤（より高波長）より顕著であるので、ロ
ーダミン色素はフルオレセイン色素に比べて特に魅力的
である。

【０００８】しかし、多重検出法の状況下で現在利用可
能なローダミン色素の１つの重要な欠点は、このような
色素の比較的広い発光スペクトルである。この広い発光
スペクトルは、スペクトルが隣接する色素間で低いスペ
クトル分解能を生じ、それによりこのような色素組み合
わせの多成分分析を困難にする。図７Ａに示される蛍光
スペクトルは、この高程度のスペクトルの重複を実証す
る。現在利用可能なローダミン色素の２つ目の欠点は、
それらの吸収スペクトルが、現在利用可能な固体二重周
波数緑ダイオードレーザー（例えば、ネオジム固体ＹＡ
Ｇレーザー、これは約５３２ｎｍでの発光系列を有す
る）の波長と調和しないことである。これらのコンパク
トなサイズ、長い寿命、および電力の効率的な使用のた
め、このようなレーザーを使用することは非常に有利で
ある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、分子プロー
ブとして有用な４，７−ジクロロローダミン色素のクラ
スの発見に関する。

【００１０】本発明の目的は、現在利用可能なローダミ
ン色素より実質的に狭い発光スペクトル領域を有するロ
ーダミン色素のクラスを提供することにある。

【００１１】本発明の他の目的は、現存のローダミン色
素に比べて赤色側に約１５ｎｍまでシフトした吸収スペ
クトルを有するローダミン色素のクラスを提供すること
にある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】１つの局面において、本
発明は、以下の式を有する化合物であって：

【００１３】

【化８】 ここで：Ｒ_１〜Ｒ_６は、別個に水素、フッ素、塩素、低
級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネー
ト、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコ
キシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選択
されるか、または、一緒になった場合のＲ_１およびＲ_６
がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合のＲ_４お
よびＲ_５がベンゾであり；Ｙ_１〜Ｙ_４は、別個に水素お
よび低級アルキルからなる群から選択されるか、または
一緒になった場合のＹ_１およびＲ_２がプロパノでありか
つＹ_２およびＲ_１がプロパノであるか、もしくは一緒に
なった場合のＹ_３およびＲ_３がプロパノでありかつＹ_４
およびＲ_４がプロパノであり；そしてＸ_１〜Ｘ_３は、別
個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレ
ート、スルホン酸、−ＣＨ_２ＯＨ、および連結基からな
る群から選択される、化合物。

【００１４】好ましい実施態様において、Ｘ_１は、カル
ボキシレートであり得る。

【００１５】別の好ましい実施態様において、Ｘ_２およ
びＸ_３のうちの１つは、連結基であり得る。

【００１６】別の好ましい実施態様において、Ｒ_２およ
びＲ_３は、別個に水素であり得る。

【００１７】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１〜Ｒ
_６は、別個に水素、メチル、およびエチルからなる群か
ら選択され得るか、または一緒になった場合のＲ_１およ
びＲ _６がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合の
Ｒ_４およびＲ_５がベンゾであり得；Ｙ_１〜Ｙ_４は、別個
に水素、メチル、およびエチルからなる群から選択され
得るか、または一緒になった場合のＹ_１およびＲ_２がプ
ロパノでありかつＹ_２およびＲ_１がプロパノであり得る
か、もしくは一緒になった場合のＹ_３およびＲ _３がプロ
パノでありかつＹ_４およびＲ_４がプロパノであり得；Ｘ
_１はカルボキシレートであり得；そしてＸ_２およびＸ_３
は、別個に水素および連結基からなる群から選択され得
る。

【００１８】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１〜Ｒ
_６は、別個に水素であり得；Ｙ_１〜Ｙ_４は、別個に水素
であり得；Ｘ_１はカルボキシレートであり得；そしてＸ
_２およびＸ_３のうちの１つは、連結基であり、他方は水
素であり得る。

【００１９】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１およ
びＲ_４は別個にメチルであり得；Ｒ _２、Ｒ_３、Ｒ_５、お
よびＲ_６は水素であり得；Ｙ_１およびＹ_２のうち１つは
エチルであり、他は水素であり得；Ｙ_３およびＹ_４のう
ち１つはエチルであり、他は水素であり得；Ｘ_１はカル
ボキシレートであり得；そしてＸ_２およびＸ_３のうち１
つは連結基であり、他は水素であり得る。

【００２０】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１〜Ｒ
_６は別個に水素であり；Ｙ_１〜Ｙ_４は別個にメチルであ
り；Ｘ_１はカルボキシレートであり；そしてＸ_２および
Ｘ_３のうち１つは連結基であり、他は水素であり得る。

【００２１】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１およ
びＹ_２は一緒になってプロパノであり得；Ｒ_２およびＹ
_１は一緒になってプロパノであり得；Ｒ_３およびＹ_３は
一緒になってプロパノであり得；Ｒ_４およびＹ_４は一緒
になってプロパノであり得；Ｒ_５およびＲ_６は水素であ
り得；Ｘ_１はカルボキシレートであり得；そしてＸ_２お
よびＸ_３のうち１つは連結基であり、他は水素であり得
る。

【００２２】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１はメ
チルであり得；Ｒ_２〜Ｒ_６は別個に水素であり得；Ｙ_１
およびＹ_２のうち１つはエチルであり、他は水素であり
得；Ｙ_３およびＹ_４は別個に水素であり得；Ｘ_１はカル
ボキシレートであり得；そしてＸ_２およびＸ_３のうち１
つは連結基であり、他は水素であり得る。

【００２３】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１はメ
チルであり得；Ｒ_２〜Ｒ_６は別個に水素であり得；Ｙ_１
およびＹ_２のうち１つはエチルであり、他は水素であり
得；Ｙ_３およびＹ_４は別個にメチルであり得；Ｘ_１はカ
ルボキシレートであり得；そしてＸ_２およびＸ_３のうち
１つは連結基であり、他は水素であり得る。

【００２４】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１、Ｒ
_２、Ｒ_５、およびＲ_６は別個に水素であり得；Ｙ_１およ
びＹ_２は別個にメチルであり得；Ｒ_３およびＹ_３は一緒
になってプロパノであり得；Ｒ_４およびＹ_４は一緒にな
ってプロパノであり得；Ｘ_１はカルボキシレートであり
得；そしてＸ_２およびＸ_３のうち１つは連結基であり、
他は水素であり得る。

【００２５】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１、Ｒ
_２、Ｒ_５、およびＲ_６は別個に水素であり得；Ｙ_１およ
びＹ_２は別個に水素であり得；Ｒ_３およびＹ_３は一緒に
なってプロパノであり得；Ｒ_４およびＹ_４は一緒になっ
てプロパノであり得；Ｘ_１はカルボキシレートであり
得；そしてＸ_２およびＸ_３のうち１つは連結基であり、
他は水素であり得る。

【００２６】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１はメ
チルであり得；Ｒ_２、Ｒ_５およびＲ _６は別個に水素であ
り得；Ｙ_１およびＹ_２のうち１つはエチルであり、他は
水素であり得；Ｒ_３およびＹ_３は一緒になってプロパノ
であり得；Ｒ_４およびＹ_４は一緒になってプロパノであ
り得；Ｘ_１はカルボキシレートであり得；そしてＸ_２お
よびＸ_３のうち１つは連結基であり、他は水素であり得
る。

【００２７】別の好ましい実施態様において、Ｒ_１〜Ｒ
_６は別個に水素であり得；Ｙ_１およびＹ_２は別個に水素
であり得；Ｙ_３およびＹ_４は別個にメチルであり得；Ｘ
_１はカルボキシレートであり得；そしてＸ_２およびＸ_３
のうち１つは連結基であり、他は水素であり得る。

【００２８】別の局面において、本発明は、以下の式を
有する標識化ヌクレオチドであって：

【００２９】

【化９】 ここで：Ｄは、以下の式を有する色素化合物であり：

【００３０】

【化１０】 （ここで：Ｒ_１〜Ｒ_６は、別個に水素、フッ素、塩素、
低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネ
ート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アル
コキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選
択されるか、または一緒になった場合のＲ_１およびＲ_６
がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合のＲ _４お
よびＲ_５がベンゾであり；Ｙ_１〜Ｙ_４は、別個に水素お
よび低級アルキルからなる群から選択されるか、または
一緒になった場合のＹ_１およびＲ_２がプロパノでありか
つＹ_２およびＲ_１がプロパノであるか、もしくは一緒に
なった場合のＹ_３およびＲ_３がプロパノでありかつＹ_４
およびＲ_４がプロパノであり；そしてＸ_１〜Ｘ_３は、別
個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレ
ート、スルホン酸、−ＣＨ_２ＯＨ、および連結基からな
る群から選択される）；Ｂは、７−デアザプリン、プリ
ン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；Ｗ_１お
よびＷ_２は別個に、ＨおよびＯＨからなる群から選択さ
れ；Ｗ_３はＯＨ、−ＰＯ_４、−Ｐ_２Ｏ_７、−Ｐ
_３Ｏ_１０、およびそのアナログからなる群から選択さ
れ；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである
場合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのＮ^９−位に
結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、糖部
分はピリミジンのＮ^１−位に結合しており；ここで、Ｂ
とＤとを連結する連結は、Ｒ_１−Ｒ_６またはＸ_１−Ｘ_３
のうちの１つの位置でＤに結合し；およびここで、Ｂが
プリンである場合、連結はプリンの８−位に結合し、Ｂ
が７−デアザプリンである場合、連結は７−デアザプリ
ンの７−位に結合し、そしてＢがピリミジンである場
合、連結はピリミジンの５−位に結合する、ヌクレオチ
ドに関する。

【００３１】好ましい実施態様において、Ｂは、ウラシ
ル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシ
ンからなる群から選択され得る。

【００３２】別の好ましい実施態様において、上記連結
は、以下の式：

【００３３】

【化１１】 であり得る。

【００３４】別の好ましい実施態様において、Ｗ_１およ
びＷ_２は、両方ともＨであり得；およびＷ_３は、−Ｐ_３
Ｏ_１０であり得る。

【００３５】別の好ましい実施態様において、Ｗ_１は、
Ｈであり得；Ｗ_２は、ＯＨであり得；およびＷ_３が−Ｐ
_３Ｏ_１０であり得る。

【００３６】別の好ましい実施態様において、ＢとＤと
を連結する上記連結は、Ｘ_２またはＸ_３のうちの１つの
位置でＤに結合し得る。

【００３７】さらに別の局面において、本発明は、以下
の式を有するヌクレオチドを含有する標識化ポリヌクレ
オチドであって：

【００３８】

【化１２】 ここで：Ｄは以下の式を有する色素化合物であって：

【００３９】

【化１３】 （ここで：Ｒ_１〜Ｒ_６は、別個に水素、フッ素、塩素、
低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネ
ート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アル
コキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選
択されるか、または、一緒になった場合のＲ_１およびＲ
_６はベンゾ、または、一緒になった場合のＲ_４およびＲ
_５はベンゾであり；Ｙ_１〜Ｙ_４は、別個に水素および低
級アルキルからなる群から選択されるか、または一緒に
なった場合のＹ_１およびＲ_２がプロパノでありかつＹ_２
およびＲ _１がプロパノであるか、もしくは一緒になった
場合のＹ_３およびＲ_３がプロパノでありかつＹ_４および
Ｒ_４がプロパノであり；そしてＸ_１〜Ｘ_３は、別個に水
素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレート、
スルホン酸、−ＣＨ_２ＯＨ、および連結基からなる群か
ら選択される、色素化合物である）；Ｂは、７−デアザ
プリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基で
あり；Ｚ_１は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；
Ｚ_２はＨ、ＯＨ、−ＰＯ_４、およびＮｕｃからなる群か
ら選択され、ここでＮｕｃおよびヌクレオシドはホスホ
ジエステル連結またはそのアナログによって結合され、
該連結はＮｕｃの５’−位に結合しており；Ｚ_３はＨ、
−ＰＯ_３またはホスフェートアナログ、およびＮｕｃか
らなる群から選択され、ここでＮｕｃおよびヌクレオシ
ドはホスホジエステル連結またはそのアナログによって
結合され、該連結はＮｕｃの３’−位に結合しており；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場
合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのＮ^９−位に結
合しており、そしてＢがピリミジンである場合、糖部分
はピリミジンのＮ^１−位に結合しており；ここで、Ｂと
Ｄとを連結する連結は、Ｒ_１〜Ｒ_６またはＸ_１〜Ｘ_３の
うちの１つの位置でＤに結合し；およびここで、Ｂがプ
リンである場合、該連結はプリンの８−位に結合し、Ｂ
が７−デアザプリンである場合、該連結は７−デアザプ
リンの７−位に結合し、そしてＢがピリミジンである場
合、該連結はピリミジンの５−位に結合する、ポリヌク
レオチドに関する。

【００４０】１つの好ましい実施態様において、Ｂは、
ウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグ
アノシンからなる群から選択され得る。

【００４１】別の好ましい実施態様において、上記連結
は、以下の式：

【００４２】

【化１４】 であり得る。

【００４３】さらに別の局面において、本発明は、以下
の工程を包含するポリヌクレオチド配列決定の方法であ
って：第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌ
クレオチドの混合物を形成する工程であって、その結
果：第１のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジ
デオキシアデノシンを含み、そして第１の色素で標識さ
れ；第２のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジ
デオキシシチジンを含み、そして第２の色素で標識さ
れ；第３のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジ
デオキシグアノシンを含み、そして第３の色素で標識さ
れ；第４のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジ
デオキシチミジンを含み、そして第４の色素で標識さ
れ；ここで、第１、第２、第３、または第４の色素のう
ちの１つは、４，７−ジクロロローダミン色素であり；
全ての色素が互いからスペクトル分離可能である、工
程；ポリヌクレオチドを電気泳動で分離し、それにより
類似のサイズのポリヌクレオチドのバンドを形成する工
程；色素を蛍光放射させ得る照射ビームでバンドを照射
する工程；および色素の蛍光スペクトルによりバンド中
のポリヌクレオチドのクラスを同定する工程、を包含
し、ここで、４，７−ジクロロローダミン色素は、以下
の式：

【００４４】

【化１５】 （ここで：Ｒ_１〜Ｒ_６は、別個に水素、フッ素、塩素、
低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネ
ート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アル
コキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選
択されるか、または一緒になった場合のＲ_１およびＲ_６
がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合のＲ _４お
よびＲ_５がベンゾであり；Ｙ_１〜Ｙ_４は、別個に水素お
よび低級アルキルからなる群から選択されるか、また
は、一緒になった場合のＹ_１およびＲ_２がプロパノであ
りかつＹ_２およびＲ _１がプロパノであるか、もしくは一
緒になった場合のＹ_３およびＲ_３がプロパノでありかつ
Ｙ_４およびＲ_４がプロパノであり；そしてＸ_１〜Ｘ
_３は、別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カル
ボキシレート、スルホン酸、−ＣＨ_２ＯＨ、および連結
基からなる群から選択される）を有する、方法に関す
る。

【００４５】第１の局面では、本発明の上述の目的およ
び他の目的は、次式を有する化合物により達成される：

【００４６】

【化１６】 ここで可変置換基は以下のように定義される。Ｒ_１〜Ｒ
_６は、別個に水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級
アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、ア
ミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基ある
いはそれらの組合せ、または、一緒になった場合のＲ_１
およびＲ_６がベンゾであるか、または一緒になった場合
のＲ_４およびＲ_５がベンゾである。好ましくは、Ｒ_１−
Ｒ_６は、水素、メチルまたはエチルである。Ｙ_１−Ｙ_４
は、別個に水素あるいは低級アルキル、または一緒にな
った場合のＹ_１およびＲ_２がプロパノでありかつＹ_２お
よびＲ_１がプロパノであるか、もしくは一緒になった場
合のＹ_３およびＲ_３がプロパノでありかつＹ_４およびＲ
_４がプロパノである。Ｘ_１−Ｘ_３は、別個に水素、塩
素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレート、スルホ
ン酸、−ＣＨ_２ＯＨ、および連結基である。好ましく
は、Ｘ_１はカルボキシレートであり、かつＸ_２およびＸ
_３は別個に水素または連結基である。

【００４７】第２の局面では、本発明は、次式を有する
標識化ヌクレオチドを包含する：

【００４８】

【化１７】 ここで可変置換基および連結は以下のように定義され
る。Ｄは、本発明の４，７−ジクロロローダミン色素化
合物である。Ｂは、７−デアザプリン、プリン、または
ピリミジンヌクレオチド塩基、好ましくはウラシル、シ
トシン、デアザアデニン、またはデアザグアノシンであ
る。Ｗ_１およびＷ_２は別個に、ＨまたはＯＨである。Ｗ
_３はＯＨ、−ＰＯ_４、−Ｐ_２Ｏ_７、−Ｐ_３Ｏ_１０であ
り、そのアナログを含む。１つの好ましい実施態様にお
いて、Ｗ_１はＨ、Ｗ_２はＯＨ、およびＷ _３は−Ｐ_３Ｏ
_１０である。第２の好ましい実施態様において、Ｗ_１お
よびＷ_２はＨであり、Ｗ_３は−Ｐ_３Ｏ_１０である。Ｂが
プリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分はプ
リンまたはデアザプリンのＮ^９−位に結合しており、そ
してＢがピリミジンである場合、糖部分はピリミジンの
Ｎ^１−位に結合している。ＢとＤとを連結する連結は、
Ｒ_１−Ｒ_６またはＸ_１−Ｘ_３のうちの１つの位置でＤに
結合する。好ましくは、ＢとＤとを連結する連結は、Ｘ
_２またはＸ_３のうちの１つの位置でＤに結合する。特に
好ましい実施態様において、連結は以下のものである：

【００４９】

【化１８】 Ｂがプリンである場合、この連結はプリンの８−位に結
合し、Ｂが７−デアザプリンである場合、この連結は７
−デアザプリンの７−位に結合し、そしてＢがピリミジ
ンである場合、この連結はピリミジンの５−位に結合す
る。

【００５０】第３の局面において、本発明は以下の式を
有するヌクレオチドを含有する標識化ポリヌクレオチド
を含む：

【００５１】

【化１９】 ここで可変の置換基および連結は以下のように定義され
る。Ｄは、本発明の４，７−ジクロロローダミン色素化
合物である。Ｂは、７−デアザプリン、プリン、または
ピリミジンヌクレオチド塩基、好ましくはウラシル、シ
トシン、デアザアデニン、またはデアザグアノシンであ
る。Ｚ_１は、ＨまたはＯＨである。Ｚ_２はＨ、ＯＨ、−
ＰＯ_４、またはＮｕｃ、隣接ヌクレオチドであり、ここ
でＮｕｃおよびヌクレオシドはホスホジエステル連結ま
たはそのアナログによって結合され、この連結はＮｕｃ
の５’−位に結合している。Ｚ_３はＨ、−ＰＯ_３（ホス
フェートアナログを含む）、またはＮｕｃであり、ここ
でＮｕｃおよびヌクレオシドはホスホジエステル連結ま
たはそのアナログによって結合され、この連結はＮｕｃ
の３’−位に結合している。Ｂがプリンまたは７−デア
ザプリンである場合、糖部分はプリンまたはデアザプリ
ンのＮ^９−位に結合しており、そしてＢがピリミジンで
ある場合、糖部分はピリミジンのＮ^１−位に結合してい
る。ＢとＤとを連結する連結は、Ｒ_１−Ｒ_６またはＸ_１
−Ｘ_３のうちの１つの位置でＤに結合する。好ましく
は、ＢとＤとを連結する連結は、Ｘ_２またはＸ_３のうち
の１つの位置でＤに結合する。特に好ましい実施態様に
おいて、連結は以下のものである：

【００５２】

【化２０】 Ｂがプリンである場合、この連結はプリンの８−位に結
合し、Ｂが７−デアザプリンである場合、この連結は７
−デアザプリンの７−位に結合し、そしてＢがピリミジ
ンである場合、この連結はピリミジンの５−位に結合す
る。

【００５３】第４の局面において、本発明はポリヌクレ
オチド配列決定の方法を包含し、このような方法は以下
の工程を含む。第１、第２、第３、および第４のクラス
のポリヌクレオチドの混合物を形成し、その結果、第１
のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシ
アデノシンを含み、そして第１の色素で標識され、第２
のクラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシ
シチジンを含み、そして第２の色素で標識され、第３の
クラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシグ
アノシンを含み、そして第３の色素で標識され、第４の
クラスの各ポリヌクレオチドは３’−末端ジデオキシチ
ミジンを含み、そして第４の色素で標識される。色素
は、第１、第２、第３、または第４の色素のうちの１つ
は、本発明の４，７−ジクロロローダミン色素であり、
他の色素は、互いからスペクトル分離可能であるように
選択される。ポリヌクレオチドを電気泳動で分離し、そ
れにより類似のサイズのポリヌクレオチドのバンドを形
成し、色素を蛍光放射させ得る照射ビームでバンドを照
射し、そして色素の蛍光スペクトルによりバンド中のポ
リヌクレオチドのクラスを同定する。

【００５４】本発明のこれらおよび他の局面、目的、特
徴、ならびに利点は、以下の説明、図面、および添付の
請求の範囲を参考にしてよりよく理解される。

【００５５】

【発明の実施の形態】本発明の好ましい実施態様を、こ
こで、詳細に言及する。その例は、添付の図に示され
る。本発明は、その好ましい実施態様に関連して記述さ
れているものの、それらは、本発明をこれらの実施態様
に限定する意図はないことが分かる。逆に、本発明は、
添付の請求の範囲で規定した本発明の範囲内に含まれ得
る代替、改良および等価物を含むことを意図している。

【００５６】一般に、本発明は、蛍光色素として有用な
新規なクラスの４，７−ジクロロローダミン化合物、こ
のような色素を分子標識として使用する試薬、およびこ
のような色素および試薬を分析生物工学の領域で使用す
る方法を包含する。本発明の化合物は、多色蛍光ＤＮＡ
配列決定およびフラグメント解析の領域で、特に用途が
見出されている。

【００５７】本発明は、一部は、４，７−ジクロロロー
ダミンの蛍光特性、および関連色素の発見をベースとす
る。それらの放射バンド幅は、４，７−ジクロロ誘導体
を欠くアナログよりも、通常、２０〜３０％狭く、それ
らの放射、および最大吸収は、４，７−ジクロロ誘導体
を欠くアナログよりも、通常、約１０〜３０ｎｍ高い波
長に存在する。

【００５８】（Ｉ．定義）他に述べない場合、本明細書
で使用する以下の用語および言い回しは、以下の意味を
有することを意図する：「連結基」（Ｌ）は、試薬に結
合される「補足的官能基」と反応し得る（例えば、色素
を試薬に連結する「結合」を形成する反応）官能基を言
う。使用される特定の連結基は、補足的官能基の性質、
および所望の結合のタイプに依存する。いくつかの場
合、連結基は、補足的官能基との反応の前に、活性化さ
れなければならない（例えば、ジクロロヘキシルカルボ
ジイミドおよびＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと、Ｎ−
ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）エステルを形成す
るカルボキシレート連結基の活性化）。好ましくは、補
足官能基がアミンの場合常に、本発明の連結基は、イソ
チオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨ
Ｓエステル、塩化スルホニル、アルデヒドまたはグリオ
キサール、エポキシド、カーボネート、ハロゲン化アリ
ール、イミドエステル、カルボジイミド、酸無水物、
４，６−ジクロロトリアジニルアミン、または他の活性
カルボキシレートである。好ましくは、補足官能基が、
スルフヒドリルの場合常に、連結基は、ハロアセチル、
ハロゲン化アルキル、マレイミド、ハロアセチル、アジ
リジン、アクリロイル、アリール化剤（例えば、フルオ
ロベンゼン、など）である。補足官能基が、カルボキシ
レートの場合、連結基は、好ましくは、ジアゾアラン、
ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、およびカ
ルボジイミド（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）である。特に好ま
しい実施態様では、連結基は、アミン補足官能基と反応
する活性化ＮＨＳエステルであり、活性化ＮＨＳエステ
ルを形成する場合、カルボキシレート連結基を含む本発
明の色素が、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ
−ヒドロキシコハク酸イミドと反応し、ＮＨＳエステル
を形成する。以下の表１は、代表的な連結基のサンプル
を、互換性のある補足官能基および得られる結合と共に
示す。

【００５９】

【表２】 用語「低級アルキル」は、１〜８の炭素原子を含む直鎖
および分岐の炭化水素部分（すなわち、メチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソ
ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペ
ンチル、など）を意味する。用語「プロパノ」は、特
に、部分−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−を意味する。「低級置
換アルキル」は、電子吸引性置換基（例えば、ハロ、シ
アノ、ニトロ、スルホ、など）を含む低級アルキルを意
味する。「低級ハロアルキル」は、１つ以上のハロゲン
原子置換基（通常、フルオロ、クロロ、ブロモ、または
ヨード）を有する低級置換アルキルを意味する。「低級
アルケン」は、低級アルキルまたは低級置換アルキル
（ここで、１つ以上の炭素−炭素結合が、二重結合であ
る）を意味する。「低級アルキン」は、低級アルキル、
または低級置換アルキル（ここで、１つ以上の炭素−炭
素結合が、三重結合である）を意味する。「スルホネー
ト」は、２つの酸素原子に二重結合し、そして１つの酸
素原子に単結合した硫黄原子を含む部分（それらの一塩
基塩、二塩基塩を含む（例えば、ナトリウムスルホホネ
ート、カリウムスルホネート、ジナトリウムスルホネー
ト、など））を意味する。「スルホン」は、２つの酸素
原子に二重結合した硫黄原子を含む部分を意味する。
「アミノ」は、２つの水素原子、低級アルキル部分、ま
たはそれらの任意の組み合わせに結合した窒素原子を含
む部分を意味する。「アミド」は、酸素原子に二重結合
し、そしてアミノ部分に単結合した炭素原子を含む部分
を意味する。「ニトリル」は、窒素原子に三重結合した
炭素原子を含む部分を意味する。「低級アルコキシ」
は、酸素原子に単結合した低級アルキルを含む部分を意
味する。「アリール」は、単独の、または複数のフェニ
ル、または置換フェニル（例えば、ベンゼン、ナフタレ
ン、アントラセン、ビフェニル、など）を意味する。

【００６０】用語「ヌクレオシド」は、１’位でペント
ースと結合したプリン、デアザプリン、またはピリミジ
ンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シ
トシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグ
アノシン、など）からなる化合物（２’−デオキシ型お
よび２’−ヒドロキシル型（Ｓｔｒｙｅｒ）を含む）を
意味する。本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」
は、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、トリリン
酸エステル）を意味し、ここで、エステル化の最も一般
的な位置は、ペントースのＣ−５位に結合したヒドロキ
シル基である。本発明の開示中の多くの場合、用語ヌク
レオシドは、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを含むこ
とを意図する。ヌクレオシドに関する「アナログ」は、
修飾された塩基部分、修飾された糖部分、および／また
は修飾されたリン酸エステル部分（例えば、（Ｓｃｈｅ
ｉｔ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）に記載）を含む合成アナログ
を含む。用語「標識化ヌクレオシド」は、式Ｉの色素化
合物を共有結合したヌクレオシドを意味する。

【００６１】本明細書で使用する場合、用語「ポリヌク
レオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、２本およ
び１本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチ
ド、それらのα−アノマー形、などを含む天然のヌクレ
オチドモノマーまたはそれらのアナログの直線状ポリマ
ーを意味する。通常、ヌクレオシドモノマーは、リン酸
ジエステル結合によって結合され、ここで、本明細書中
で使用される場合、用語「リン酸ジエステル結合」は、
リン酸ジエステル結合、またはそれらのアナログ（ホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレ
ノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチ
オエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデー
ト、などを含む（対イオンが存在する場合、結合対イオ
ン（例えば、Ｈ、ＮＨ_４、Ｎａなど）を含む））を意味
する。ポリヌクレオチドは、代表的には、大きさの種類
においては、数モノマー単位から、例えば８〜４０、数
千モノマー単位までの範囲である。ポリヌクレオチド
が、文字の配列（例えば、”ＡＴＧＣＣＴＧ”）によっ
て表される場合常に、ヌクレオチドは、５’〜＞３’順
序で、左から右へであり、他の方法で示され無ければ、
「Ａ」はデオキシアデノシンを意味し、「Ｃ」はデオキ
シシチジンを意味し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意
味し、および「Ｔ」はチミジンを意味することが理解さ
れる。

【００６２】本明細書で使用される場合、色素のセット
に関する用語「スペクトル分解」は、色素の蛍光放射ス
ペクトルが、十分に分かれ（すなわち、十分に重なって
いない）、通常の光検出系（例えば、帯域通過フィルタ
ー（ｂａｎｄ ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）および光電子
倍増管（ｐｈｏｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂ
ｅ）の系、分光器（ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈ）と組み
合わせた荷電結合素子、など（（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅ
ｒ；Ｗｈｅｅｌｅｓｓ）に記載の系によって例示され
る））を用いて、それぞれの色素に結合している試薬
（例えば、ポリヌクレオチド）が、それぞれの色素によ
って生じる蛍光シグナルのベースによって区別され得る
ことを意味する。

【００６３】（ＩＩ．４，７−ジクロロローダミン色素
化合物）第一の局面では、本発明は、すぐ下の式Ｉで示
す一般構造を有する新規なクラスの４，７−ジクロロロ
ーダミン色素化合物を包含する。（本明細書中で提供し
た全ての分子構造は、提示した正確な電子構造だけでな
く、それらの全ての共鳴構造およびプロトン付加状態を
含むことを意図していることに注意のこと）。

【００６４】

【化２１】 式Ｉにおいて、Ｒ_１からＲ_６は、別々に、水素、フッ
素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキ
ン、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリ
ル、低級アルコキシ、連結基、またはそれらの組み合わ
せである。あるいは、Ｒ_１およびＲ_６は、一緒になっ
て、ベンゾであり、および／または、Ｒ_４およびＲ
_５は、ベンゾである。好ましい実施態様では、Ｒ_１から
Ｒ_６は、別々に、水素、メチル、またはエチルである。
より好ましくは、Ｒ_１からＲ_６は、別々に、水素、また
はメチルである。

【００６５】Ｙ_１からＹ_４は、別々に、水素、および低
級アルキルからなる群から選択される。あるいは、Ｙ_１
は、Ｒ_２と一緒になってプロパノであり、およびＹ
_２は、Ｒ _１と一緒になって、プロパノであり、および／
または、Ｙ_３は、Ｒ_３と一緒になってプロパノであり、
およびＹ_４は、Ｒ_４と一緒になって、プロパノである。
好ましくは、Ｙ_１からＹ_４は、別々に、水素、メチル、
またはエチルである。

【００６６】Ｘ_１〜Ｘ_３は、別々に、水素、塩素、フッ
素、低級アルキル、カルボキシレート、スルホン酸、−
ＣＨ_２ＯＨ、または連結基である。好ましくは、Ｘ
_１は、カルボキシレートである。好ましい実施態様で
は、Ｘ_２またはＸ_３の１つは、連結基である。

【００６７】本発明の１つの特に好ましい化合物（本明
細書では、ＤＲ１１０として示す）では、Ｒ_１〜Ｒ
_６は、別々に、水素であり、Ｙ_１〜Ｙ_４は、別々に、水
素であり、Ｘ_１は、カルボキシレートであり、そしてＸ
_２およびＸ_３の１つは、連結基（Ｌ）であり、その他
は、水素である。ＤＲ１１０の構造を以下に式ＩＩとし
て示す。

【００６８】

【化２２】 本発明の第２の特に好ましい化合物（本明細書では、Ｄ
Ｒ６Ｇとして示す）では、Ｒ_１およびＲ_４は、別々に、
メチルであり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_５およびＲ_６は、水素で
あり、Ｙ_１およびＹ_２の一方はエチルであり、他方は、
水素であり、Ｙ _３およびＹ_４の一方はエチルであり、他
方は、水素であり、Ｘ_１は、カルボキシレートであり、
そしてＸ_２およびＸ_３の一方は、連結基であり、他方
は、水素である。ＤＲ６Ｇの構造を以下に式ＩＩＩとし
て示す。

【００６９】

【化２３】 本発明の第３の特に好ましい化合物（本明細書では、Ｄ
ＴＭＲとして示す）では、Ｒ_１〜Ｒ_６は、別々に、水素
であり、Ｙ_１〜Ｙ_４は、別々に、メチルであり、Ｘ
_１は、カルボキシレートであり、そしてＸ_２およびＸ_３
の一方は、連結基であり、他方は、水素である。ＤＴＭ
Ｒの構造を以下に式ＩＶとして示す。

【００７０】

【化２４】 本発明の第４の特に好ましい化合物（本明細書では、Ｄ
ＲＯＸとして示す）では、Ｒ_１およびＹ_２は、一緒にな
って、プロパノであり、Ｒ_２およびＹ_１は、一緒になっ
て、プロパノであり、Ｒ_３およびＹ_３は、一緒になっ
て、プロパノであり、Ｒ_４およびＹ_４は、一緒になっ
て、プロパノであり、Ｒ_５およびＲ_６は、水素であり、
Ｘ_１は、カルボキシレートであり、そしてＸ_２およびＸ
_３の一方は、連結基であり、他方は、水素である。ＤＲ
ＯＸの構造を以下に式Ｖとして示す。

【００７１】

【化２５】 本発明の色素化合物のいくつかの追加の特に好ましい実
施態様を、図１Ａおよび１Ｂに示す。化合物１ａにおい
て、Ｒ_１は、メチルであり、Ｒ_２〜Ｒ_６は、別々に、水
素であり、Ｙ_１およびＹ_２の一方はエチルであり、他方
は、水素であり、Ｙ_３およびＹ_４は、別々に、水素であ
り、Ｘ_１は、カルボキシレートであり、そしてＸ_２およ
びＸ_３の一方は、連結基であり、他方は、水素である。
化合物１ｂにおいて、Ｒ_１は、メチルであり、Ｒ_２〜Ｒ
_６は、別々に、水素であり、Ｙ_１およびＹ_２の一方はエ
チルであり、他方は、水素であり、Ｙ_３およびＹ_４は、
別々に、メチルであり、Ｘ_１は、カルボキシレートであ
り、そしてＸ_２およびＸ_３の一方は、連結基であり、他
方は、水素である。化合物１ｃにおいて、Ｒ_１、Ｒ _２、
Ｒ_５およびＲ_６は、別々に、水素であり、Ｙ_１およびＹ
_２は、別々に、メチルであり、Ｒ_３およびＹ_３は、一緒
になって、プロパノであり、Ｒ_４およびＹ_４は、一緒に
なって、プロパノであり、Ｘ_１は、カルボキシレートで
あり、そしてＸ_２およびＸ_３の一方は、連結基であり、
他方は、水素である。化合物１ｄにおいて、Ｒ_１、
Ｒ_２、Ｒ_５およびＲ_６は、別々に、水素であり、Ｙ_１お
よびＹ_２は、別々に、水素であり、Ｒ_３およびＹ_３は、
一緒になって、プロパノであり、Ｒ _４およびＹ_４は、一
緒になって、プロパノであり、Ｘ_１は、カルボキシレー
トであり、そしてＸ_２およびＸ_３の一方は、連結基であ
り、他方は、水素である。化合物１ｅにおいて、Ｒ
_１は、メチルであり、Ｒ_２、Ｒ_５およびＲ_６は、別々
に、水素であり、Ｙ_１およびＹ_２の一方はエチルであ
り、他方は、水素であり、Ｒ_３およびＹ_３は、一緒にな
って、プロパノであり、Ｒ_４およびＹ_４は、一緒になっ
て、プロパノであり、Ｘ_１は、カルボキシレートであ
り、そしてＸ_２およびＸ_３の一方は、連結基であり、他
方は、水素である。化合物１ｆにおいて、Ｒ_１〜Ｒ
_６は、別々に、水素であり、Ｙ_１およびＹ_２は、別々
に、水素であり、Ｙ_３およびＹ_４は、別々に、メチルで
あり、Ｘ_１は、カルボキシレートであり、そしてＸ _２お
よびＸ_３の一方は、連結基であり、他方は、水素であ
る。

【００７２】図８Ａおよび８Ｂは、本発明の４，７−ジ
クロロローダミン色素の調製のための好ましい一般化さ
れた合成スキームを示す。各図において示される変換可
能な置換基は、上記で定義されたものである。

【００７３】図８Ａは、置換基Ｘ_１がカルボキシレート
より他のものであり得る一般化された合成スキームを示
す。図において、Ｘ’は、Ｘ_１の前駆体である部分を示
す。図８Ａの方法において、２当量の３−アミノフェノ
ール誘導体８ａ／８ｂ（例えば、３−ジメチルアミノフ
ェノール）が、１当量のジクロロベンゼン誘導体８ｃ
（例えば、４−カルボキシ−３，６，ジクロロ−２−ス
ルホ安息香酸環式無水物（すなわち、ここで、８ｃのＸ
_１’部分は、一緒になって以下である））と反応する。

【００７４】

【化２６】 次いで、反応物を、１２時間、強酸（例えば、ポリリン
酸、または硫酸）中で、１８０℃で加熱する。粗色素８
ｄを、水の添加によって沈澱し、遠心分離によって単離
する。対称体の生成物を形成するために、反応物８ａお
よび８ｂの置換基は、同じであり、一方、非対称体の生
成物を形成するために、置換基は、異なる。

【００７５】図８Ｂは、置換基Ｘ_１がカルボキシレート
である一般化された合成を示す。図８Ｂの方法におい
て、２当量の３−アミノフェノール誘導体８ａ／８ｂ
（例えば、３−ジメチルアミノフェノール）が、１当量
のフタル酸無水物誘導体８ｅ（例えば、３，６−ジクロ
ロトリメリット酸無水物と反応する。次いで、反応物
を、１２時間、強酸（例えば、ポリリン酸、または硫
酸）中で、１８０℃で加熱する。粗色素８ｄを、水の添
加によって沈澱し、遠心分離によって単離する。対称体
の生成物を形成するために、反応物８ａおよび８ｂの置
換基は、同じであり、一方、非対称体の生成物を形成す
るために、置換基は、異なる。 ＩＩＩ．４，７−ジクロロローダミン色素化合物を利用
する試薬 他の局面では、本発明は、式Ｉの４，７−ジクロロロー
ダミン色素化合物で標識した試薬を包含する。本発明の
試薬は、事実上、本発明の色素が結合できるいずれのも
のでもよい。好ましくは、この色素は、この試薬に直接
または結合を介して共有結合される。試薬には、タンパ
ク質、ポリペプチド、多糖類、ヌクレオチド、ヌクレオ
シド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機およ
び無機重合体、およびそれらの組合せおよび集合（例え
ば、染色体、核、生存細胞（例えば、細菌、他の微生
物、哺乳類細胞、組織糖タンパク）など）が挙げられ
る。 Ａ．ヌクレオチド試薬 本発明の好ましい種類の試薬は、本発明の非対称ベンゾ
キサンテン色素を含有するヌクレオチドおよびヌクレオ
シドを包含する。このようなヌクレオチド／ヌクレオシ
ド試薬は、酵素合成により形成した標識ポリヌクレオチ
ド（例えば、ＰＣＲ増幅、サンガー型ポリヌクレオチド
配列決定およびニック翻訳反応の文脈で使用されるヌク
レオチド三リン酸）の文脈で、特に有用である。

【００７６】本発明の好ましいヌクレオチド／ヌクレオ
シドは、式ＶＩで以下に示されており、

【００７７】

【化２７】 ここで、Ｂは、ヌクレオシド塩基（例えば、ウラシル、
シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシン）で
ある。Ｗ_１およびＷ_２は、別個に、Ｈ、ＯＨ、または−
ＯＣＨ３である。Ｗ_３は、ＯＨ、−ＰＯ_４、−Ｐ
_２Ｏ_７、−Ｐ_３Ｏ_１０またはそれらのアナログ（例え
ば、リン酸チオエート、リン酸アニリデート、リン酸ア
ロニチオエート、リン酸アミジエートおよび他の類似の
リン酸アナログ）であり、これには、もし存在するな
ら、会合対イオン（例えば、Ｈ、Ｎａ、ＮＨ_４など）が
含まれる。Ｄは、式Ｉの色素化合物である。

【００７８】Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのと
き、その糖部分は、プリンまたはデアザプリンのＮ^９−
位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部
分は、ピリミジンのＮ^１−位にて結合している。

【００７９】ＢおよびＤを連結している結合は、Ｒ_１〜
Ｒ_６またはＸ_１〜Ｘ_３位の１つで、Ｄに結合している。
好ましくは、この結合は、Ｘ_２またはＸ_３の１つには結
合している。 好ましくは、Ｂがプリンのとき、Ｂおよ
びＤを結合している結合は、プリンの８−位に結合して
おり、Ｂが７−デアザプリンのとき、結合は、７−デア
ザプリンの７−位に結合しており、Ｂがピリミジンのと
き、結合は、ピリミジンの５−位にて結合している。

【００８０】１つの特に好ましい実施態様では、本発明
のヌクレオチドは、以下に式ＶＩＩで示す構造を有する
ジデオキシヌクレオチドトリリン酸エステル（存在する
場合、会合した対イオンを含む）である。

【００８１】

【化２８】 式ＶＩＩに示したもののような標識ジデオキシヌクレオ
チドは、サンガー型ＤＮＡ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ）
において、鎖停止剤すなわち「ターミネーター」とし
て、特定の用途が見出されている。

【００８２】第二の特に好ましい実施態様では、本発明
のヌクレオチドは、以下の式ＶＩＩＩに示した構造を有
するデオキシヌクレオチド三リン酸である（もし存在す
るなら、会合対イオンを含めて）。

【００８３】

【化２９】 式ＶＩＩＩに示したもののような標識デオキシヌクレオ
チドは、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ）
において、ポリメラーゼ伸長産物を標識する手段とし
て、特定の用途が見出されている。

【００８４】ヌクレオチド／ヌクレオシド標識化は、公
知の結合、連結基および関連する相補官能性を用いて、
非常に多くの公知の連結基および関連する相補官能基を
用いた公知のヌクレオシド／ヌクレオチド標識化技術の
いずれかを使用して、達成でき、好ましい連結基の説明
について上記参照。この色素およびヌクレオシドを結合
する結合は、（ｉ）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダ
イゼーションを妨害せず、（ｉｉ）適切な酵素（例え
ば、ポリメラーゼ、リガーゼなど）と相溶性であり、そ
して（ｉｉｉ）この色素の蛍光を消失させてはならな
い。

【００８５】１つの好ましい実施態様では、本発明の色
素は、ピリミジン塩基の５−炭素または７−デアザプリ
ン塩基の７−炭素に共有結合される。本発明で使用でき
る数個の適当な塩基標識化操作が報告されている（Ｇｉ
ｂｓｏｎ；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｌ
ｉｓ；Ｎｅｌｓｏｎ １９９２；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｎ；
Ｆｕｎｇ １９９８；Ｗａｒｄ；Ｗｏｏ．）。

【００８６】好ましくは、この結合は、アセチレン性ア
ミド結合またはアルケン性アミド結合であり、この色素
とヌクレオチド塩基との間の結合は、この色素の活性化
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルと、
ヌクレオチドのアルキニルアミノまたはアルケニルアミ
ノ誘導体化塩基とを反応させることにより、形成され
る。より好ましくは、得られた結合は、３−（カルボキ
シ）アミノ−１−プロピニルまたは３−アミノ−１−プ
ロピン−１−イルである（式ＩＸ．１）。本発明の色素
をヌクレオシド塩基に結合するための数個の好ましい結
合は、式ＩＸ．１、式ＩＸ．２および式ＩＸ．３にて、
以下に示す。

【００８７】

【化３０】 アルキニルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、（Ｈ
ｏｂｂｓ １９８９，１９９２）によって記載され、要
約すると、このアルキニルアミノ誘導体化ヌクレオチド
は、適当なハロジデオキシヌクレオシド（通常、５−ヨ
ードピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンジ
デオキシヌクレオシド）およびＣｕ（Ｉ）をフラスコに
入れ、アルゴンをフラッシュして空気を取り除き、無水
ＤＭＦを添加し、続いて、アルキニルアミン、トリエチ
ルアミンおよびＰｄ（０）を添加することにより、形成
される。この反応混合物は、数時間、または薄層クロマ
トグラフィーがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示
すまで、撹拌し得る。未保護のアルキニルアミンを使用
するとき、このアルキニルアミノヌクレオシドは、この
反応混合物を濃縮し、そして水酸化アンモニウムを含有
する溶出溶媒を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィ
ーにかけて、カップリング反応で生成したヒドロハライ
ドを中和することにより、単離できる。保護アルキニル
アミンを使用するとき、この反応混合物には、メタノー
ル／塩化メチレンを添加し得、続いて、重炭酸塩形態の
強塩基性アニオン交換樹脂を添加し得る。次いで、この
スラリーは、約４５分間撹拌し得、濾過し得、樹脂は、
追加のメタノール／塩化メチレンで洗浄し得る。合わせ
た濾液は濃縮し得、そしてメタノール−塩化メチレン勾
配を用いたシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ
ーにより精製し得る。トリホスフェートは、標準的な方
法により得られる。

【００８８】（Ｂ．ポリヌクレオチド試薬）本発明のさ
らに他の好ましい種類の試薬には、本発明の４，７−ジ
クロロローダミン色素で標識したポリヌクレオチドが包
含される。このような標識ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ
配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーションプローブなどを含めた非
常に多くの状況で、有用である。

【００８９】本発明のポリヌクレオチドには、次式を有
するヌクレオチドが挙げられる：

【００９０】

【化３１】 ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリンまたはピリミ
ジンヌクレオチド塩基である。Ｚ_１は、Ｈ、ＯＨ、−Ｏ
ＣＨ_３である。Ｚ_２は、ＯＨ、−ＰＯ_４、−Ｐ_２Ｏ_７、
−Ｐ_３Ｏ_１０またはそれらのアナログ（例えば、リン酸
チオエート、リン酸アニリデート、リン酸アニロチオエ
ート、リン酸アミデートおよび他の類似のリン酸アナロ
グ（存在するならば、結合対イオン、例えばＨ、Ｎａ、
ＮＨ_４など）またはＮｕｃであり、ここで、Ｎｕｃは、
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを
意味する。式ＸのヌクレオシドおよびＮｕｃは、ホスホ
ジエステル結合またはそれらのアナログにより連結さ
れ、この結合は、好ましくは、Ｎｕｃの５’−位に結合
している。Ｚ_３は、Ｈ、ＨＰＯ_３またはそれらのアナロ
グまたはＮｕｃであり、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌク
レオシドは、ホスホジエステル結合またはそれらのアナ
ログにより連結されており、この結合は、Ｎｕｃの３’
−位に結合している。そしてＤは、式Ｉの色素化合物で
ある。塩基Ｂは、本発明のヌクレオチド試薬について記
述のようにして、この糖部分および色素化合物に結合さ
れる。ここで定義されるように、式Ｘの標識ヌクレオチ
ドは、５’−末端ヌクレオチド、３’−末端ヌクレオチ
ド、またはポリヌクレオチドのいずれかの内部ヌクレオ
チドであり得る。

【００９１】好ましい１つの実施態様では、本発明の標
識ポリヌクレオチドには、供与体色素と受容体色素との
間で、蛍光エネルギーの移動が起こるように配置した複
数の色素（本発明の色素化合物である少なくと１つ）が
挙げられる。このような複数色素ポリヌクレオチドは、
分光調整可能なプローブまたはＤＮＡ配列決定プライマ
ー（Ｊｕ；Ｌｅｅ）として用途が見出されている。

【００９２】標識ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ
ポリメラーゼまたはリガーゼ（Ｓｔｒｙｅｒ）を用い
て、酵素的に合成するか、または例えば、ホスホルアミ
ダイト法、亜リン酸トリエステル法などによる化学合成
によるか（Ｇａｉｔ）のいずれかにより、合成できる。
標識は、上記の標識ヌクレオチド三リン酸モノマーを使
用して、酵素合成中に導入してもよく、または合成に引
き続いて導入してもよい。

【００９３】一般に、この標識ポリヌクレオチドが、酵
素合成により製造されるなら、以下の操作が使用でき
る。テンプレートＤＮＡが変性され、このテンプレート
ＤＮＡに、オリゴヌクレオチドプライマーがアニールさ
れる。この反応系に、デオキシヌクレオチド三リン酸お
よび／またはジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＧＴ
Ｐ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄ
ＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＴＴＰを含
めて）が添加され、この場合、このデオキシヌクレオチ
ドおよび／またはジデオキシヌクレオチドの１個の少な
くとも断片は、上記の本発明の色素化合物で標識され
る。次に、ポリメラーゼ酵素が活性である条件下にて、
ポリメラーゼ酵素が添加される。ポリメラーゼ鎖合成中
に、この標識デオキシヌクレオチドおよび／またはジオ
キシヌクレオチドの混入により、標識ポリヌクレオチド
が形成される。別の酵素的合成法では、１個のプライマ
ーの代わりに２個のプライマーが使用され、１個のプラ
イマーは、この標的の＋（プラス）鎖に相補的であり、
他は、この標的の−（マイナス）鎖に相補的であり、こ
のポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、その
反応温度は、変性温度と延長温度の間で反復され、それ
により、ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｉｎｎｉｓ）によっ
て、標識成分が標的配列へと急激に合成される。

【００９４】合成に引き続いて、このポリヌクレオチド
は、非常に多くの位置で標識でき、これらの位置には、
５’−末端（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ； Ｏｒｇｅｌ； Ｓｍ
ｉｔｈ）；ホスホジエステル骨格（Ｅｃｋｓｔｅｉ
ｎ）；３’−末端（Ｎｅｌｓｏｎ １９９２ａ ； Ｎ
ｅｌｓｏｎ １９９２ｂ ； Ｎｅｌｓｏｎ １９９
５）が含まれる。オリゴヌクレオチド標識化操作の総説
については、（Ｓｔｅｉｎｅｒ）を参照のこと。

【００９５】１つの好ましい合成後化学標識化法では、
オリゴヌクレオチドは、以下のようにして標識化され
る。カルボキシ連結基を含む色素は、無水酢酸エチル中
にて、室温で３時間にわたり、およそ１当量の１，３−
ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびおよそ３当量の
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることによ
り、ＮＨＳエステルに転化される。この反応混合物は、
５％ ＨＣｌで洗浄され、硫酸マグネシウムで乾燥さ
れ、濾過され、そして固形物になるまで濃縮され、この
固形物は、ＤＭＳＯに再懸濁される。このＤＭＳＯ色素
ストックは、次いで、過剰で（１０〜２０倍）、ｐＨ
９．４にて、０．２５ Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中の
アミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオチドに添加さ
れ、そして６時間反応される（Ｆｕｎｇ １９９８）。
この色素標識したオリゴヌクレオチドは、緩衝液（例え
ば、０．１Ｍトリエチルアミン酢酸塩（ＴＥＡＡ））で
溶出するサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通すこ
とにより、未反応色素から分離される。この粗標識オリ
ゴヌクレオチドを含有する画分は、勾配溶離液を使用す
る逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製される。

【００９６】（ＩＶ．本発明の化合物および試薬を使用
する方法）本発明の色素および試薬は、蛍光検出を使用
するいずれかの方法（特に、複数の空間的に重複した分
析物の同時検出を必要とする方法）によく適合する。本
発明の色素および試薬は、生化学分離操作（例えば、電
気泳動）を受けるポリヌクレオチドの種類を同定するの
に、特によく適合し、この場合、類似の物理化学的特性
（例えば、サイズ、コンホメーション、電荷、疎水性な
ど）を有する標的物質のバンドまたはスポットが、線状
または平面状の配列において存在する。本明細書中で使
用する用語「バンド」は、類似のまたは同一の物理化学
的な特性を基準にして、いずれかの空間的な配置または
集塊を含む。通常、バンドは、色素−ポリヌクレオチド
複合体の電気泳動による分離において、生じる。

【００９７】ポリヌクレオチドの分類は、種々の状況に
おいて生じ得る。「フラグメント解析」法または「遺伝
解析」法と称する好ましいカテゴリーの方法では、標識
プライマーまたはヌクレオチドを用いたテンプレート定
方向酵素的合成（例えば、結合またはポリメラーゼ定方
向プライマー伸長による）により、標識ポリヌクレオチ
ド断片が生じる。これらの断片は、サイズ依存性分離プ
ロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）
に供される。分離した断片は、この分離に引き続いて、
例えば、レーザー誘発した蛍光により、検出される。特
に好ましい実施態様では、複数の種類のポリヌクレオチ
ドが同時に分離され、異なる種類のものは、分光学的に
分析可能な標識により、識別される。

【００９８】このようなフラグメント解析の１方法は、
増幅断片長多型検出（ＡｍｐＦＬＰ）として知られてい
るが、ＰＣＲにより増幅した増幅断片長の多型現象（す
なわち、制限断片長の多型現象）に基づいている（Ｖｏ
ｓ）。種々のサイズのこれらの増幅断片は、系統による
次の突然変異遺伝子のための連鎖マーカーとして役立
つ。増幅断片が、染色体上の突然変異遺伝子に近づくほ
ど、この結合の相関が高くなる。多く遺伝的疾患に対す
る遺伝子は、同定されていないので、これらの結合マー
カーは、疾患のリスクまたは起源を評価するのに役立
つ。このＡｍｐＦＬＰ方法では、このポリヌクレオチド
は、標識ポリヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いるこ
とにより、またはＰＣＲ中の標識ヌクレオチド三リン酸
を使用することにより、標識できる。

【００９９】他の代表的なフラグメント解析法は、可変
数のタンデム繰り返し、すなわち、ＶＮＴＲを基準にし
ている（Ｗｅｂｂｅｒ；Ｃａｓｋｅｙ）。ＶＮＴＲは、
特定の配列の隣接した複数コピーを含有する二本鎖ＤＮ
Ａの領域であり、繰り返し単位の数は、可変である。Ｖ
ＮＴＲ遺伝子座の例には、ｐＹＮＺ２２、ｐＭＣＴ１１
８およびＡｐｏ Ｂがある。ＶＮＴＲ法のサブセットに
は、微小サテライト繰り返しまたは短タンデム繰り返し
（ＳＴＲ）、すなわち、短い（２個〜４個の塩基）繰り
返し配列により特徴付けられるＤＮＡのタンデム繰り返
しの検出を基準にしている。ヒトにて最も豊富に点在し
た繰り返しＤＮＡファミリーの１つには、（ｄＣ−ｄ
Ａ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチド繰り返しファ
ミリー（これはまた、（ＣＡ）ｎジヌクレオチド繰り返
しファミリーとも呼ばれる）である。ヒトのゲノムに
は、５０，０００個〜１００，０００個程度の（ＣＡ）
ｎ繰り返し領域があると考えられ、典型的には、１ブロ
ックあたり、１５個〜３０個の繰り返しを有する。これ
らの繰り返し領域の多くは、長さが多様であり、従っ
て、有用な遺伝子マーカーとして供され得る。好ましく
は、ＶＮＴＲ法またはＳＴＲ法では、色素標識ＰＣＲプ
ライマーを用いることにより、ポリヌクレオチド断片に
標識が導入される。

【０１００】特に好ましいフラグメント解析法では、本
発明に従って同定された種類のものは、４個の可能な末
端塩基と分光学的に分析可能な色素のセットのメンバー
との間で、対応が確立されるように、末端ヌクレオチド
によって規定される（Ｆｕｎｇ １９８９）。このよう
なセットは、市販の分光光度計を用いて、発光および吸
収バンド幅を測定することにより、本発明の色素から容
易に組み立てられる。さらに好ましくは、ＤＮＡ配列決
定の化学的方法または鎖停止法の状況にて、階級が生
じ、最も好ましくは、この鎖停止法、すなわち、ジデオ
キシＤＮＡ配列決定すなわちサンガー配列決定の状況に
おいて、階級が生じる。この方法は、配列が決定される
べき一本鎖または二本鎖ＤＮＡテンプレートを用いた、
インビボでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を包
含する。合成は、このテンプレートにオリゴヌクレオチ
ドプライマーがアニールする１個の部位だけで、開始さ
れる。この合成反応は、連続ＤＮＡ伸長を支持しないヌ
クレオチド類似物の含入により、停止される。この鎖停
止ヌクレオチド類似物には、２’，３’−ジデオキシヌ
クレオシド５’−三リン酸（ｄｄＮＴＰ）があり、これ
は、３’から５’へのＤＮＡ鎖の伸長に必要な３’−Ｏ
Ｈ基がない。適切な割合のｄＮＴＰ（２’−デオキシヌ
クレオシド５’−三リン酸）および４個のｄｄＮＴＰの
１個を使用すると、酵素触媒した重合は、このｄｄＮＴ
Ｐが含入できる各部位で、鎖集団の断片において、停止
される。各反応に対して、標識プライマーまたは標識ｄ
ｄＮＴＰを使用するなら、この配列情報は、高分解能電
気泳動による分離後、蛍光により検出できる。

【０１０１】上記の各々のフラグメント解析法におい
て、標識ポリヌクレオチドは、好ましくは、電気泳動操
作により、分離される（ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍ
ｅｓ；Ｏｓｔｅｒｍａｎ）。好ましくは、電気泳動マト
リックスのタイプは、約２〜２０重量％の間の濃度（重
量対容量）を有する架橋または非架橋ポリアクリルアミ
ドである。さらに好ましくは、このポリアクリルアミド
濃度は、約４〜８％の間である。好ましくは、ＤＮＡ配
列決定の状況では、特に、この電気泳動マトリックス
は、鎖分離または変性剤（例えば、尿素、ホルムアミド
など）を含有する。このようなマトリックスを構築する
詳細な手順は、（Ｍａｎｉａｔｉｓ １９８０；Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ １９７５；ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ３７
７ ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎ
ｕａｌ）に与えられる。特定の分離において使用される
最適なポリマー濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度など
は、多くの要因に依存し、これらには、分離されるべき
核酸のサイズ範囲、それらの塩基組成、それらが一本鎖
か二本鎖か、およびその情報が電気泳動により追究され
る分類の性質が含まれる。従って、本発明の適用には、
特定の分離のための条件を最適化するためには標準予備
試験が要求され得る。

【０１０２】電気泳動分離に引き続いて、色素−ポリヌ
クレオチド複合体は、この色素標識ポリヌクレオチドか
らの蛍光発光を測定することにより検出される。このよ
うな検出を行うために、この標識ポリヌクレオチドは、
標準的な手段、例えば、高強度水銀蒸気ランプ、レーザ
ーなどにより照射される。好ましくは、この照射手段
は、４８８ ｎｍと５５０ ｎｍの間の波長の照射ビー
ムを有するレーザーである。さらに好ましくは、この色
素−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンレーザー（特
に、４８８ ｎｍおよび５１４ ｎｍの発光系列のアル
ゴンイオンレーザー）、または５３２ ｎｍの発光系列
のネオジム固相ＹＡＧレーザーにより発生したレーザー
光によって、照射される。いくつかのアルゴンイオンレ
ーザーが市販されており、これらは、これらの系列で、
同時にレーザーとして使える（例えば、Ｃｙｏｎｉｃ
ｓ、Ｌｔｄ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）の
Ｍｏｄｅｌ ２００１など）。次いで、光感受性検出器
（例えば、光電子増倍管、荷電結合素子など）により、
その蛍光が検出される。

【０１０３】（ＩＶ．実施例）本発明は、以下の実施例
を考慮することにより、さらに明確となるが、これらの
実施例は、単に、本発明の例示であることを意図し、い
ずれの点でも、本発明の範囲を限定しない。

【０１０４】他に指示がなければ、全ての試薬は、Ａｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． （Ｍｉｌｗａ
ｕｋｅｅ、ＷＩ）から購入した。３，６−ジクロロトリ
メリト酸無水物を（Ｋｈａｎｎａ）に記載のように調製
した。

【０１０５】（実施例１） ＤＲ１１０（式ＩＩ）の調製

【０１０６】

【化３２】 ３−アミノフェノール（０．２５ｇ、２．３ｍｍｏ
ｌ）、３，６−ジクロロトリメリト酸無水物（０．３３
ｇ、１．３ｍｍｏｌ）および硫酸（１ｍＬ）の混合物を
配合して、そして１２時間１９０℃まで加熱した。水
（１０ｍＬ）を反応液に加え、そして、得られた黒固形
物は濾過により分離した。次いで、固形物を、アセトニ
トリル（１０ｍＬ）で抽出した。得られたオレンジ色の
溶液は乾燥状態に濃縮し、そして、残基は炭酸塩／重炭
酸塩緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ ９、１０ｍＬ）に溶解
した。溶液を、濃ＨＣｌで酸性化し、赤い沈澱物を遠心
分離によって集め、そして減圧遠心分離器において乾燥
した。赤い固形物を、得た（３２ｍｇ、５％収率）。Ｄ
Ｒ１１０生成物の溶液の吸光度極大は、４０％アセトニ
トリル／トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液中
で、５１６ｎｍであった。

【０１０７】（実施例２） ＤＴＭＲ（式ＩＶ）の調製

【０１０８】

【化３３】 ３−ジメチルアミノフェノール（３．６ｍｍｏｌ、０．
５ｇ）（３，６−ジクロロメリト酸無水物（５００ｍ
ｇ、１．９ｍｍｏｌ）、およびポリリン酸（ＰＰＡ）
（５ｇ）の混合物を配合し、１２時間１８０℃まで加熱
した。水（２０ｍＬ）を赤褐色の反応物に加え、混合物
を濾過して、そして５％ ＨＣｌで洗浄した。暗い固形
物を、得た（７９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、８％収
率）。ＤＴＭＲ生成物の溶液の吸光度極大は、４０％ア
セトニトリル／トリエチルアンモニウムアセテート緩衝
液中で、５７０ｎｍであった。

【０１０９】（実施例３） ＤＲＯＸ（式Ｖ）の調製

【０１１０】

【化３４】 ８−ヒドロキシユロリジン（１４０ｍｇ、０．７３ｍｍ
ｏｌ）、３，６−ジクロロトリメリト酸無水物（０．３
８ｍｍｏｌ、ｌＯＯｍｇ）およびポリリン酸（１ｇ）の
混合物を配合して、そして１６時間１８０℃まで加熱し
た。水（１０ｍＬ）を添加し、そして溶液を濾過した。
固形物を水性ＨＣＩで洗浄し、そして乾燥させて８７ｍ
ｇの紫の固形物（０．１４ｍｍｏｌ、３７％）を得た。 実施例４ ＤＲ６Ｇ（式ＩＩＩ）の調製

【０１１１】

【化３５】 ３−アミノメチル−ｐ−クレゾール（０．６６ｍｍｏ
ｌ、１００ｍｇ）、３，６−ジクロロトリメリト酸無水
物（０．３８ｍｍｏｌ、１００ｍｇ）およびポリリン酸
（０．５ｇ）の混合物を配合して、１２時間、１８０℃
まで加熱した。水（１０ｍＬ）を赤褐色の反応物に添加
し、そして混合物を濾過した。固形物を、１Ｍ炭酸塩／
重炭酸塩緩衝液（ｐＨ ９、２５ｍＬ）に入れ、そして
濾過した。濾液を、濃ＨＣｌで酸性化し、そして固形物
を遠心分離によって収集し、そして乾燥させた。固形物
はアセトニトリル（１０ｍＬ）で抽出し、そして抽出物
を粘着性の固形物に濃縮した。固形物を、ジメチルホル
ムアミド（０．６ｍＬ）に溶解した。収率を、アリコー
トを４０％アセトニトリル／トリエチルアンモニウムア
セテート緩衝液に希釈すること、およびＵＶ／可視光分
光光度計で吸光度を測定することにより推定した。５
０，０００ｃｍ^−１Ｍ^−１の吸光係数を使用して、吸光
極大は５４０ｎｍであり、そして収率は９％であること
が見い出された。

【０１１２】（実施例５） ＤＲ６ＧのＮＨＳエステルの調製

【０１１３】

【化３６】 ジメチルホルムアミド中のＤＲ６Ｇ（０．１ｍＬ中に６
μｍｏｌ）の溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（２２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）および１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
（１２ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）と混合した。反応の進
行を、ジクロロメタン、メタノールおよび酢酸（６０
０：６０：１６）の混合物を溶離液として使用して、シ
リカゲル上の薄層クロマトグラフィによって、モニター
した。出発物質が消費された後、反応物をジクロロメタ
ン（１０ｍＬ）で希釈して、５％ＨＣＩ（１０ｍＬ）で
洗浄した。両方の相に不溶であった物質を捨てた。有機
相を、２５０ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩（１０ｍＬ）および
５％ ＨＣＩ（１０ｍＬ）で連続的に洗浄した。溶液を
乾燥し（ＭｇＳ０_４）、そして暗色の油に濃縮した。残
留物を、ジメチルホルムアミド（０．２ｍＬ）中に入れ
て、そして−２０℃で保存した。

【０１１４】−２０℃での３日間の後、金色の反射する
結晶がジメチルホルムアミド溶液中で形成した。上清を
デカントし、そして捨てた。残留物を、メチルスルホキ
シド（０．１ｍＬ）中に、溶解した。アリコートを、４
０％アセトニトリル／トリエチルアンモニウムアセテー
ト緩衝液に希釈した。５０．０００ ｃｍ^−１Ｍ^−１の
吸光係数を使用して、吸光度極大が５４８ｎｍであり、
そして収率が７％であることが見い出された。

【０１１５】（実施例６） ＤＲ６Ｇ標識したジデオキシアデノシン三リン酸の調製

【０１１６】

【化３７】 ｄｄＡＴＰ−ＮＨ_２（５μＬ、２０ｍＭ、０．１μｍｏ
ｌ）（Ｈｏｂｂｓ １９８９、１９９２）、ＤＲ６Ｇ−
ＮＨＳ（０．１５μｍｏｌ）および２５０ｍＭ炭酸塩／
重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９（５μＬ）の溶液を混合した。
室温での１０分間の後、溶液を陰イオン交換カラムを有
するＨＰＬＣに供し、そして４０％アセトニトリル／６
０％ ０．１Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩から４
０％アセトニトリル／６０％ １．５Ｍトリエチルアン
モニウム重炭酸塩への勾配で溶出し遊離色素を除去し
た。色素標識ヌクレオチドおよび標識されていないヌク
レオチドを含有する画分を減圧遠心分離器で濃縮し、そ
して逆相カラムを使用して第２のＨＰＬＣに供した。標
識されていないヌクレオチドおよび色素標識ヌクレオチ
ドの各色素異性体を１５％アセトニトリル／８５％
０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテートから３５％
アセトニトリル／６５％ ０．１Ｍトリエチルアンモニ
ウムアセテートへの溶出勾配を使用して分離した。色素
標識ヌクレオチドの含有溶液を、減圧遠心分離器で濃縮
し、そして１０ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ
９）に再溶解し、そしてＵＶ／可視光分光光度計におい
て溶液の吸光度を測定することによって、定量した。収
率は、およそ１％であった。

【０１１７】（実施例７） 色素標識オリゴヌクレオチドの調製 ５’−アミノヘキシル官能化オリゴヌクレオチドの色素
標識オリゴヌクレオチドの溶液、（１０μＬ、１ｍＭ）
およびＤＲ６Ｇ−ＮＨＳ（ｌＯμＬ、メチルスルホキシ
ド１２ｍＭ中）および炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（２μ
Ｌ、１Ｍ）を混合した。アミノヘキシル誘導体化プライ
マーを、合成の最終サイクルにおいてＡｍｉｎｏｌｉｎ
ｋ−２を使用して自動化固相ＤＮＡ合成（ＰＥ Ａｐｐ
ｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４００８０
８）により調製した。室温での１０分間の後、溶液をＳ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５上のゲル濾過に供し遊離色素
を分離した。色素標識オリゴヌクレオチドおよび標識さ
れていないオリゴヌクレオチドを含有する画分を収集
し、そして逆相カラム上のＨＰＬＣ精製に供した。標識
されていないオリゴヌクレオチドおよび色素標識したオ
リゴヌクレオチドの各色素アイソマーを、１０％アセト
ニトリル／８５％ ０．１Ｍトリエチルアンモニウムア
セテートから３０％アセトニトリル／６５％ ０．１Ｍ
トリエチルアンモニウムアセテートへの溶出勾配を使用
して分離した。色素標識オリゴヌクレオチド含有溶液
を、減圧遠心機で濃縮し、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０（ＴＥ）含有緩衝液に再
溶解した。

【０１１８】（実施例８） 本発明の４，７−ジクロロローダミンジデオキシヌクレ
オチドターミネーターを利用した単色配列決定反応 色素ターミネーター反応を、 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ
Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌ（Ｐ
Ｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ
４０２１１６）の基本プロトコルに従って、Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳで行っ
た。（ＦＳ酵素は、二つの点変異（Ｇ４６ＤおよびＦ６
６７Ｙ）を有する組換えｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉ
ｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼである）。ｄＮＴＰ混合物
および色素ターミネーター以外の全ての試薬は、ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ^ＴＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃ
ｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ
（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／
ｎ ４０２１１７）由来であった。反応成分のプレミッ
クスは、以下のように調製した。容積は、毎反応（ｐｅ
ｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ）ベースである： ５×緩衝液 ４μＬ ｄＮＴＰ混合物 １μＬ テンプレート：ｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚｆ（＋）、０．２μｇ／μＬ ５μＬ プライマー：−２１ Ｍ１３（正方向）、０．８ｐｍｏｌ／μＬ ２μＬ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ＦＳ ０．５μＬ 水 ２．５μＬ 。

【０１１９】反応物を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４
８０ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＥ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ Ｎ８
０１−ｌＯＯ）用の０．５ｍｌチューブに準備した。全
反応容積は、１５μＬの上記の反応プレミックス、適切
な量の色素標識ターミネーター、および水を含む２０μ
Ｌであった。単色色素ターミネーター反応を、Ａおよび
Ｇターミネーターについては１ｐモルの色素ターミネー
ター、あるいはＣおよびＴターミネーターについては１
５ｐモルで準備した。少数の場合において、ＣまたはＴ
についての色素ターミネーターは濃度が低すぎたため、
５μＬが１５ｐモル未満の色素ターミネーターを生じ
た。これらの場合には、５μＬの色素ターミネーターを
使用して、水は反応物に添加しなかった。３０μＬのミ
ネラルオイルを各反応物の容量の上部に添加し、熱サイ
クルの間の蒸発を低減させた。

【０１２０】反応は、以下のように熱サイクルさせた： ９６℃ ３０秒 ５０℃ １５秒 ６０℃ ４分 を２５サイクル 続いてサイクルを４℃に保った。

【０１２１】全ての反応物をＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピ
ンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ， Ａｄｅｌｐｈｉａ， ＮＪ， ｐ／ｎ ＣＳ−９
０１）上でスピンカラム精製により精製した。カラム中
のゲル材料を０．８ｍｌの脱イオン水で室温で少なくと
も３０分間水和させた。カラムを水和し、そしてゲル材
料中に泡が混入されていないことが明らかになった後、
上側のキャップ次いで下側のキャップを除去した。カラ
ムを重力により排水させた。次いで、カラムをＣｅｎｔ
ｉ−Ｓｅｐキットに提供される洗浄チューブ中に挿入
し、そして可変速度微小遠心分離器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ Ｍｏｄｅｌ ５４１５）中で１３００×ｇで２分間
遠心分離した。カラムを洗浄チューブから取り出し、そ
してサンプル回収チューブへ挿入した。反応混合物を油
の下からガラスピペットを使用して慎重に取り出し、そ
してＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐカラムの上に充填した。カラ
ムを可変速度微小遠心分離器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍ
ｏｄｅｌ ５４１５）中で１３００×ｇで２分間遠心分
離した。サンプルを減圧遠心分離器中で乾燥させた。

【０１２２】乾燥させたサンプルを２５μＬのＴｅｍｐ
ｌａｔｅ ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｐ
Ｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ
４０１６７４）に再懸濁し、ボルテックスし、９５℃で
２分間加熱し、氷上で冷却し、再度ボルテックスし、そ
して遠心分離（１３，０００×ｇ）した。１０μＬの精
製サンプルを、ＰＥ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ３１０
ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ （ＰＥ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ３１０−００−
１００／１２０）での使用に適したサンプルバイアル
（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／
ｎ ４０１９５７）にアリコートした。Ｍｏｄｅｌ ３
１０上での電気泳動には、５０ｃｍの検出器に対する長
さを有する、長さ６１ｃｍ、５０μｍＩＤ非被膜融合シ
リカキャピラリー（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２８４０）を使用した。キャ
ピラリーを直線状のジメチルポリアクリルアミド（ＤＭ
Ａ）篩ポリマー（Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ）、緩衝液、お
よび核酸変性剤（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２８３７）を含有する溶液で満
たした。サンプルを、２．５ｋＶで３０秒間、電気運動
的に注入した。電気泳動をキャピラリー温度を４２℃に
維持しながら１２．２ｋＶで２時間実施した。

【０１２３】図３Ａ〜３Ｈは、本発明のいくつかの異な
るジデオキシターミネーターを使用した単色Ｃ停止反応
の電気泳動図を示す。標識を、Ｃ末端ジデオキシヌクレ
オチドターミネーターに付着した。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ
（＋）の塩基１２〜８２を各電気泳動図に示す。各電気
泳動図において使用した特定の色素標識を、以下の表に
示す：

【０１２４】

【表３】 （「１」および「２」という名称は、使用する特定の色
素アイソマーを示す。１アイソマーおよび２アイソマー
は、Ｃ−８カラムおよび１５％アセトニトリル／８５％
０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテートから３５
％アセトニトリル／６５％ ０．１Ｍ トリエチルアン
モニウムアセテートへの溶出勾配を利用する逆相分離系
における遊離色素の溶出順序によって規定する。） 図４Ａ〜４Ｇは、本発明のいくつかの異なるジデオキシ
ターミネーターを使用する単色Ｔ停止反応の電気泳動図
を示す。標識を、Ｔ末端ジデオキシヌクレオチドターミ
ネーターに付着した。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の塩基７
〜８４を各電気泳動図に示す。各電気泳動図において使
用した特定の標識を、以下の表に示す：

【０１２５】

【表４】 図５Ａ〜５Ｉは、本発明のいくつかの異なるジデオキシ
ターミネーターを使用する単色Ａ停止反応の電気泳動図
を示す。標識を、Ａ末端ジデオキシヌクレオチドターミ
ネーターに付着した。ＰＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の塩基９
４〜１６７を各電気泳動図に示す。各電気泳動図におい
て使用した特定の標識を、以下の表に示す：

【０１２６】

【表５】 図６Ａ〜６Ｈは、本発明のいくつかの異なるジデオキシ
ターミネーターを使用した単色Ｇ停止反応の電気泳動図
を示す。標識を、Ｇ末端ジデオキシヌクレオチドターミ
ネーターに付着した。ＰＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の塩基１
８５〜２５２を各電気泳動図に示す。各電気泳動図にお
いて使用した特定の標識を、以下の表に示す：

【０１２７】

【表６】 以上のデータは、本発明の色素標識したジデオキシター
ミネーターが、蛍光に基づくサンガー型のＤＮＡ配列決
定における使用に適していることを示す。

【０１２８】（実施例９） 本発明の４，７ジクロロローダミンジデオキシヌクレオ
チドターミネーターを利用する４色配列決定反応 ４色のＤＮＡ配列決定反応液を調製し、そして実質的に
実施例８に記載のように分析した。

【０１２９】図２Ａは、４色の配列決定反応の電気泳動
図を示す。ここでは、４つのジデオキシヌクレオチドタ
ーミネーターを以下のように標識した：ｄｄＧはＤＲ１
１０色素で、ｄｄＡはＤＲ６Ｇ−２色素で、ｄｄＣはＤ
ＴＭＲ−１色素で、およびｄｄＴはＤＲＯＸ−１色素
で。図は、ＰＧＥＭ（登録商標）テンプレートの塩基１
９６〜２３８を示す。

【０１３０】（実施例１０） 本発明の４，７ジクロロローダミンオリゴヌクレオチド
プライマーを利用する４色配列決定反応 色素プライマー反応を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭＤｙｅ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ｐ／ｎ ４０２１１４）
に総括的に記載されるようにＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商
標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳを使用して実施した。プ
ライマーおよびテンプレート以外の全ての試薬は、ＡＢ
Ｉ ＰＲＩＳＭ^ＴＭＤｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（ＰＥ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ｐ／ｎ ４０
２１２５）由来であった。色素標識した−２１ Ｍ１３
プライマーを、０．４ｐモル／μＬの濃度で溶解した。
プライマーを以下のように標識した：Ｃ反応はＤＲ１１
０で、Ａ反応はＤＲ６Ｇで、Ｇ反応はＤＴＭＲで、およ
びＴ反応はＤＲＯＸで。反応成分のプレミックスを以下
のように４つの各塩基反応用に調製した：

【０１３１】

【表７】 Ｍ１３ｍｐ１８配列決定テンプレートを、０．０５μｇ
／μＬの濃度で溶解した。

【０１３２】配列決定反応を、以下のように、０．２ｍ
ｌの薄壁Ｇｅｎｅ Ａｍｐ９６００ＤＮＡサーマルサイ
クラーチューブ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ， ｐ／ｎ Ｎ８０１−０５４０）中に準備し
た。

【０１３３】

【表８】 反応は、以下の温度プロフィールを使用してサイクルさ
せた： ９６℃ １０秒； ５５℃ ５秒 ７０℃ １分間 を１５サイクル 続いて、 ９６℃ １０秒 ７０℃ １分間 を１５サイクル に続いて４℃での保持サイクル。

【０１３４】４つの反応液を８０μＬの９５％エタノー
ル中で混合し、氷上で１０分間放置し、そして微小遠心
分離器中で最高速で１５分間遠心分離した。エタノール
上清を除去し、そしてペレットを減圧遠心分離器中で乾
燥させた。

【０１３５】ペレットを６μＬ充填緩衝液中に再懸濁
し、そしてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭＭｏｅｌ ３７７
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ３７７−０１−２００
／２０８）上で、標準フィルターセットＡまたは長波長
セッティングを有する改変フィルターセットのいずれか
使用して、分析した。図２Ｂは、塩基５０〜塩基９３ま
での得られたデータのサンプリングを示す。

【０１３６】（実施例１１） 伝統的なローダミンおよび本発明の４，７，−ジクロロ
ローダミンの蛍光発光スペクトルの比較 伝統的なローダミンで標識したオリゴヌクレオチドにつ
いての発光スペクトルを本発明の４，７，−ジクロロロ
ーダミンで標識したオリゴヌクレオチドについての蛍光
発光スペクトルと比較した。各標識オリゴヌクレオチド
の濃度は、ＴＥ緩衝液中で０．４μＭであった。ローダ
ミン色素の励起は、４８８ｎｍであり、そして４，７−
ジクロロローダミン色素の励起は５００ｎｍであった。
スペクトルを、発光極大に対して標準化した。測定は、
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５０機器を使用して
行った。

【０１３７】図７Ａは、４つの公知のローダミン色素５
−Ｒ１１０、５−Ｒ６Ｇ、６−ＴＭＲ、および６−ＲＯ
Ｘ（Ｂｅｒｇｏｔ）の発光スペクトルを示す。図７Ｂ
は、本発明の４つの好ましい４，７−ジクロロローダミ
ン色素、ＤＲ１１０、ＤＲ６Ｇ−２、ＤＴＭＲ−２、お
よびＤＲＯＸ−２の発光スペクトルを示す。４，７−ジ
クロロローダミン色素についてのこの減少した発光スペ
クトル幅は、多数の空間的に重複する種が検出されるべ
きである場合に要求される多成分分析技術を実施するた
めの能力の増加をもたらす。

【０１３８】全ての刊行物および特許出願は、本明細書
中で、各個々の刊行物または特許出願が、特異的かつ別
々に参照として援用されるように示されているのと同程
度に参考として援用される。

【０１３９】以上に少しの実施態様のみが詳細に記載さ
れているが、有機化学の当業者は、多くの改変が本発明
の開示から逸脱することなく、好ましい実施態様におい
て可能であることを明白に理解する。全てのこのような
改変は、以下の請求の範囲内に包含されることが意図さ
れる。

【０１４０】

【発明の効果】本発明は、分子プローブとして有用な
４，７−ジクロロローダミン色素のクラスであって、現
在利用可能なローダミン色素より実質的に狭い発光スペ
クトル領域を有するローダミン色素のクラス、および現
存のローダミン色素に比べて赤色側に約１５ｎｍまでシ
フトした吸収スペクトルを有するローダミン色素のクラ
スを提供し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａおよび１Ｂは、本発明の数種の好ましい
実施態様の色素化合物の構造を示す。

【図２】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の色素標識化ジデ
オキシターミネーター（２Ａ）および色素標識プライマ
ー（２Ｂ）を用いた４色配列決定反応の電気泳動図を示
す。

【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、本発明の数種の異なるジデ
オキシターミネーターを用いた単色Ｃ終結反応の電気泳
動図を示す。

【図３Ｂ】図３Ｅ〜３Ｈは、本発明の数種の異なるジデ
オキシターミネーターを用いた単色Ｃ終結反応の電気泳
動図を示す。

【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、本発明の数種の異なるジデ
オキシターミネーターを用いた単色Ｔ終結反応の電気泳
動図を示す。

【図４Ｂ】図４Ｅ〜４Ｇは、本発明の数種の異なるジデ
オキシターミネーターを用いた単色Ｔ終結反応の電気泳
動図を示す。

【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは、本発明の数種の異なるジデ
オキシターミネーターを用いた単色Ａ終結反応の電気泳
動図を示す。

【図５Ｂ】図５Ｆ〜５Ｉは、本発明の数種の異なるジデ
オキシターミネーターを用いた単色Ａ終結反応の電気泳
動図を示す。

【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄは、本発明の数種の異なるジデ
オキシターミネーターを用いた単色Ｇ終結反応の電気泳
動図を示す。

【図６Ｂ】図６Ｅ〜６Ｈは、本発明の数種の異なるジデ
オキシターミネーターを用いた単色Ｇ終結反応の電気泳
動図を示す。

【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、存在するローダミン
化合物で標識されたオリゴヌクレオチド（７Ａ）と、本
発明の数種の好ましい４，７−ジクロロローダミンオリ
ゴヌクレオチド化合物（７Ｂ）との蛍光発光スペクトル
を比較したものである。

【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、存在するローダミン
化合物で標識されたオリゴヌクレオチド（７Ａ）と、本
発明の数種の好ましい４，７−ジクロロローダミンオリ
ゴヌクレオチド化合物（７Ｂ）との蛍光発光スペクトル
を比較したものである。

【図８Ａ】図８Ａは、本発明の色素化合物の調製のため
の好ましい合成を示す。

【図８Ｂ】図８Ｂは、本発明の色素化合物の調製のため
の好ましい合成を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ ４Ｃ０６３ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ０７Ｄ 311/80 ＺＮＡ ４Ｈ０５０ // Ｃ０７Ｄ 311/80 ＺＮＡ 405/12 ４Ｈ０５６ 405/12 Ｃ０７Ｆ 9/6561 Ｚ Ｃ０７Ｆ 9/6561 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 スコット シー． ベンソン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94611, オークランド， ファラロン ウェイ 6490 (72)発明者 バーネット ビー． ローゼンブルム アメリカ合衆国 カリフォルニア 95118, サン ノゼ， エステル アベニュー 1521 (72)発明者 サンドラ エル． スパンゲオン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94403, サン マテオ， ロス プラドス スト リート 3361 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA09 HA13 4B063 QA13 QQ41 QR08 QR31 QR42 QR62 QR66 QS16 QS36 QX02 4C050 AA01 BB07 CC07 DD02 EE02 FF01 GG01 HH01 4C057 BB02 CC01 DD01 MM05 4C062 HH21 4C063 AA01 BB08 CC79 DD03 EE10 4H050 AA01 AB92 AB99 4H056 BA02 BB05 BB14 BC02 BD01 BD05 BF07 BF24F BF34 BF35 FA08

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の式を有する標識化ヌクレオチドで
   あって： 【化１】 ここで：Ｄは、以下の式を有する色素化合物であり： 【化２】 （ここで：Ｒ_１〜Ｒ_６は、別個に水素、フッ素、塩素、
   低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネ
   ート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アル
   コキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選
   択されるか、または一緒になった場合のＲ_１およびＲ_６
   がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合のＲ _４お
   よびＲ_５がベンゾであり；Ｙ_１〜Ｙ_４は、別個に水素お
   よび低級アルキルからなる群から選択されるか、また
   は、一緒になった場合のＹ_１およびＲ_２がプロパノであ
   りかつＹ_２およびＲ _１がプロパノであるか、もしくは一
   緒になった場合のＹ_３およびＲ_３がプロパノでありかつ
   Ｙ_４およびＲ_４がプロパノであり；そしてＸ_１〜Ｘ
   _３は、別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カル
   ボキシレート、スルホン酸、−ＣＨ_２ＯＨ、および連結
   基からなる群から選択される）；Ｂは、７−デアザプリ
   ン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であ
   り；Ｗ_１およびＷ_２は別個に、ＨおよびＯＨからなる群
   から選択され；Ｗ_３はＯＨ、−ＰＯ_４、−Ｐ_２Ｏ_７、−
   Ｐ_３Ｏ_１０、およびそのアナログからなる群から選択さ
   れ；ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである
   場合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのＮ^９−位に
   結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、糖部
   分はピリミジンのＮ^１−位に結合しており；ここで、Ｂ
   とＤとを連結する連結は、Ｒ_１〜Ｒ_６またはＸ_１〜Ｘ_３
   のうちの１つの位置でＤに結合し；そしてここで、Ｂが
   プリンである場合、該連結はプリンの８−位に結合し、
   Ｂが７−デアザプリンである場合、該連結は７−デアザ
   プリンの７−位に結合し、そしてＢがピリミジンである
   場合、該連結はピリミジンの５−位に結合する、ヌクレ
   オチド。
2. 【請求項２】 Ｂがウラシル、シトシン、デアザアデニ
   ン、およびデアザグアノシンからなる群から選択され
   る、請求項１に記載の標識化ヌクレオチド。
3. 【請求項３】 前記連結が以下の式： 【化３】 である、請求項１に記載の標識化ヌクレオチド。
4. 【請求項４】 Ｗ_１およびＷ_２が両方ともＨであり；そ
   してＷ_３が−Ｐ_３Ｏ_１０である、請求項１に記載の標識
   化ヌクレオチド。
5. 【請求項５】 Ｗ_１がＨであり；Ｗ_２がＯＨであり；そ
   してＷ_３が−Ｐ_３Ｏ_１０である、請求項１に記載の標識
   化ヌクレオチド。
6. 【請求項６】 ＢとＤとを連結する前記連結が、Ｘ_２ま
   たはＸ_３のうちの１つの位置でＤに結合する、請求項１
   に記載の標識化ヌクレオチド。
7. 【請求項７】 以下の式を有するヌクレオチドを含有す
   る標識化ポリヌクレオチドであって： 【化４】 ここで：Ｄは、以下の式を有する色素化合物であり： 【化５】 （ここで：Ｒ_１〜Ｒ_６は、別個に水素、フッ素、塩素、
   低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネ
   ート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アル
   コキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選
   択されるか、または一緒になった場合のＲ_１およびＲ_６
   がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合のＲ _４お
   よびＲ_５がベンゾであり；Ｙ_１〜Ｙ_４は、別個に水素お
   よび低級アルキルからなる群から選択されるか、また
   は、一緒になった場合のＹ_１およびＲ_２がプロパノであ
   りかつＹ_２およびＲ _１がプロパノであるか、または一緒
   になった場合のＹ_３およびＲ_３がプロパノでありかつＹ
   _４およびＲ_４がプロパノであり；そしてＸ_１〜Ｘ_３は、
   別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシ
   レート、スルホン酸、−ＣＨ_２ＯＨ、および連結基から
   なる群から選択される）；Ｂは、７−デアザプリン、プ
   リン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；Ｚ_１
   は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；Ｚ_２はＨ、
   ＯＨ、−ＰＯ_４、およびＮｕｃからなる群から選択さ
   れ、ここでＮｕｃおよびヌクレオシドはホスホジエステ
   ル連結またはそのアナログによって結合され、該連結は
   Ｎｕｃの５’−位に結合しており；Ｚ_３はＨ、−ＰＯ_３
   またはホスフェートアナログ、およびＮｕｃからなる群
   から選択され、ここでＮｕｃおよびヌクレオシドはホス
   ホジエステル連結またはそのアナログによって結合さ
   れ、該連結はＮｕｃの３’−位に結合しており；ここ
   で、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖
   部分はプリンまたはデアザプリンのＮ^９−位に結合して
   おり、そしてＢがピリミジンである場合、糖部分はピリ
   ミジンのＮ^１−位に結合しており；ここで、ＢとＤとを
   連結する連結は、Ｒ_１〜Ｒ_６またはＸ_１〜Ｘ_３のうちの
   １つの位置でＤに結合し；そしてここで、Ｂがプリンで
   ある場合、該連結はプリンの８−位に結合し、Ｂが７−
   デアザプリンである場合、該連結は７−デアザプリンの
   ７−位に結合し、そしてＢがピリミジンである場合、該
   連結はピリミジンの５−位に結合する、ポリヌクレオチ
   ド。
8. 【請求項８】 Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザアデ
   ニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択され
   る、請求項７に記載の標識化ポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】 前記連結が以下の式： 【化６】 である、請求項７に記載の標識化ポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】以下の工程を包含するポリヌクレオチド
    配列決定の方法であって：第１、第２、第３、および第
    ４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を形成する工程
    であって、その結果：該第１のクラスの各ポリヌクレオ
    チドは３’−末端ジデオキシアデノシンを含み、そして
    第１の色素で標識され；該第２のクラスの各ポリヌクレ
    オチドは３’−末端ジデオキシシチジンを含み、そして
    第２の色素で標識され；該第３のクラスの各ポリヌクレ
    オチドは３’−末端ジデオキシグアノシンを含み、そし
    て第３の色素で標識され；該第４のクラスの各ポリヌク
    レオチドは３’−末端ジデオキシチミジンを含み、そし
    て第４の色素で標識され；ここで、該第１、第２、第
    ３、または第４の色素のうちの１つは、４，７−ジクロ
    ロローダミン色素であり；全ての色素が互いからスペク
    トル分離可能である、工程；該ポリヌクレオチドを電気
    泳動で分離し、それにより類似のサイズのポリヌクレオ
    チドのバンドを形成する工程；該色素を蛍光放射させ得
    る照射ビームで該バンドを照射する工程；および該色素
    の蛍光スペクトルにより該バンド中のポリヌクレオチド
    のクラスを同定する工程、を包含し、 ここで、該４，７−ジクロロローダミン色素は、以下の
    式： 【化７】 （ここで：Ｒ_１〜Ｒ_６は、別個に水素、フッ素、塩素、
    低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネ
    ート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アル
    コキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選
    択されるか、または一緒になった場合のＲ_１およびＲ_６
    がベンゾであるか、もしくは一緒になった場合のＲ _４お
    よびＲ_５がベンゾであり；Ｙ_１〜Ｙ_４は、別個に水素お
    よび低級アルキルからなる群から選択されるか、または
    一緒になった場合のＹ_１およびＲ_２がプロパノでありか
    つＹ_２およびＲ_１がプロパノであるか、もしくは一緒に
    なった場合のＹ_３およびＲ_３がプロパノでありかつＹ_４
    およびＲ_４がプロパノであり；そしてＸ_１〜Ｘ_３は、別
    個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレ
    ート、スルホン酸、−ＣＨ_２ＯＨ、および連結基からな
    る群から選択される）を有する、方法。