CN117858958A - 包含分割条形码区的探针和使用方法 - Google Patents

包含分割条形码区的探针和使用方法 Download PDF

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Abstract

在一些方面，本公开涉及用于减少假阳性连接事件的检测的方法。在一些方面，所述方法包括使用双重分割(或"复式分割")探针。当使用具有高连接效率但低特异性的连接酶(例如，连接酶)时，本文的所述方法特别适用于减少假阳性连接事件的检测。还提供了试剂盒，所述试剂盒包含用于此类方法的探针。

Description

包含分割条形码区的探针和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月16日提交的名称为“PROBES COMPRISING A SPLIT BARCODEREGION AND METHODS OF USE”的美国临时专利申请号63/233,599的优先权，该美国临时专利申请全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
电子序列表的引用
电子序列表的内容(202412006740SEQLIST.xml；大小：4,665字节；创建日期：2022年8月8日)全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及用于检测样品中分析物的原位分析的方法和组合物。
背景技术
现有方法可用于原位分析生物样品(诸如细胞或组织)中的核酸。例如，单分子荧光杂交(smFISH)的进步已实现了细胞和组织中RNA的纳米级分辨率成像。然而，用于原位分析的基于寡核苷酸探针的测定方法可能存在灵敏度、特异性和/或检测效率低的问题，并且可能需要细致而费力的优化。需要改进的原位分析方法。本公开解决了这些和其他需求。
发明内容
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与以下各项接触：(i)包含第一杂交区和条形码区的第一部分的第一探针，以及(ii)包含第二杂交区和条形码区的第二部分的第二探针，其中第一杂交区和第二杂交区与生物样品中靶核酸分子中的靶序列互补。在一些实施方案中，条形码区包含与靶核酸分子相对应的一个或多个条形码序列。例如，第一探针和第二探针包含分割条形码序列，其一部分在条形码区的第一部分中提供，而条形码序列的另一部分在条形码区的第二部分中提供。
在本文的任何实施方案中，该方法可以包括连接与靶核酸分子杂交的第一探针和第二探针以形成复合探针。在一些实施方案中，复合探针的形成包括连接条形码区的第一部分和第二部分。
在本文的任何实施方案中，该方法可以包括使生物样品与可检测探针接触，该可检测探针与条形码区的序列或其互补序列杂交。在本文的任何实施方案中，该方法可以包括使生物样品与一种或多种可检测探针接触，该一种或多种可检测探针在与条形码区的第一部分和条形码区的第二部分或其互补序列相对应的序列处与条形码区杂交。在一些实施方案中，在生物样品中检测与一种或多种可检测探针相关联的信号，从而检测生物样品中的靶核酸分子。在本文的任何实施方案中，该方法可以包括原位检测与一种或多种可检测探针相关联的信号。
在本文的任何实施方案中，第一杂交区和第二杂交区可以与靶核酸分子中的相邻靶序列杂交。在本文的任何实施方案中，第一杂交区和第二杂交区可以与靶核酸分子中相隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸的靶序列杂交。在一些实施方案中，靶核酸分子中的第一杂交区和第二杂交区直接通过磷酸二酯键连接。在一些实施方案中，靶核酸分子中的第一杂交区和第二杂交区由长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸的核酸序列连接。
在本文的任何实施方案中，第一杂交区和第二杂交区的长度可以相等。在本文的任何实施方案中，第一杂交区可以比第二杂交区更长或更短。
在本文的任何实施方案中，与靶核酸分子杂交的第一杂交区的解链温度可以与与靶核酸分子杂交的第二杂交区的解链温度相同。在本文的任何实施方案中，与靶核酸分子杂交的第一杂交区的解链温度可以高于或低于与靶核酸分子杂交的第二杂交区的解链温度。在本文的任何实施方案中，解链温度可以相差不超过1℃、不超过2℃、不超过5℃或不超过10℃。在本文的任何实施方案中，解链温度可以相差1℃或更多、2℃或更多、5℃或更多、或10℃或更多。在本文的任何实施方案中，与第二杂交区和靶核酸分子之间形成的双链体相比，第一杂交区和靶核酸分子之间形成的双链体可以同样稳定、不太稳定或更稳定。
在本文的任何实施方案中，第一探针和/或第二探针可以在任何合适的核苷酸位置(例如，在第一探针和/或第二探针的5’、3’和内部序列)包含一个或多个核糖核苷酸。在本文的任何实施方案中，第一杂交区和/或第二杂交区可以包含一个或多个核糖核苷酸。在本文的任何实施方案中，第一杂交区和/或第二杂交区可以包含不超过四个连续的核糖核苷酸。在本文的任何实施方案中，一个或多个核糖核苷酸可以位于和/或靠近第一探针或第二探针的可连接3’末端。在本文的任何实施方案中，一个或多个核糖核苷酸可以位于和/或靠近第一杂交区或第二杂交区的可连接3’末端。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括连接第一杂交区和第二杂交区。在本文的任何实施方案中，可以使用酶促连接或化学连接来连接第一杂交区和第二杂交区的末端，在连接之前有或没有缺口填充。在本文的任何实施方案中，可以使用模板依赖性连接或非模板依赖性连接来连接第一杂交区和第二杂交区的末端，在连接之前有或没有缺口填充。在本文的任何实施方案中，可以使用点击化学来连接第一杂交区和第二杂交区的末端。在本文的任何实施方案中，可以使用具有RNA模板化连接酶活性和/或DNA模板化连接酶活性的连接酶来连接第一杂交区和第二杂交区的末端。在本文的任何实施方案中，可以使用具有RNA模板化DNA连接酶活性和/或RNA模板化RNA连接酶活性的连接酶来连接第一杂交区和第二杂交区的末端。在本文的任何实施方案中，可以使用选自由以下项组成的组的连接酶来连接第一杂交区和第二杂交区的末端：小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4RNA连接酶、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶。在本文的任何实施方案中，可以使用PBCV-1DNA连接酶或其变体或衍生物、T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2)或其变体或衍生物、或CircLigaseTM或其变体或衍生物来连接第一杂交区和第二杂交区的末端。在本文的任何实施方案中，CircLigaseTM可以是CircLigaseTMI或CircLigaseTMII。在本文的任何实施方案中，可以使用用于连接第一杂交区和第二杂交区的相同连接酶来连接条形码区的第一部分和第二部分。可替代地，在本文的任何实施方案中，可以使用与用于连接第一杂交区和第二杂交区的连接酶不同的连接酶来连接条形码区的第一部分和第二部分。
在本文的任何实施方案中，条形码区的第一部分和第二部分的长度可以相等。可替代地，在本文的任何实施方案中，条形码区的第一部分可以比条形码区的第二部分更长或更短。
在本文的任何实施方案中，可以使用酶促连接或化学连接来连接条形码区的第一部分和第二部分的末端，在连接之前有或没有缺口填充。在一些实施方案中，条形码区的第一部分和第二部分的末端是条形码序列的一部分，例如与感兴趣的分析物相对应的条形码序列。在一些实施方案中，条形码区的第一部分和/或第二部分的一个或多个末端是间隔物或衔接子序列的一部分，例如公共或通用的间隔物或衔接子序列。在一些实施方案中，第一部分和/或第二部分的一个或多个末端不形成条形码序列的一部分。
在本文的任何实施方案中，可以使用模板依赖性连接或非模板依赖性连接来连接条形码区的第一部分和第二部分的末端，在连接之前有或没有缺口填充。在本文的任何实施方案中，可以使用点击化学来连接条形码区的第一部分和第二部分的末端。在本文的任何实施方案中，可以使用选自由以下项组成的组的连接酶来连接条形码区的第一部分和第二部分的末端：小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶。在本文的任何实施方案中，ssDNA连接酶可以是CircLigaseTM或其变体或衍生物。在本文的任何实施方案中，CircLigaseTM可以是CircLigaseTMI或CircLigaseTMII。在本文的任何实施方案中，可以使用夹板来连接条形码区的第一部分和第二部分的末端，该夹板与(i)第一部分或其子部分和(ii)第二部分或其子部分(例如，其序列)杂交。在本文的任何实施方案中，夹板可以包含DNA分子。在一些实施方案中，与夹板包含与(i)第一部分或其子部分和/或(ii)第二部分或其子部分的错配时相比，当夹板包含与(i)第一部分或其子部分和(ii)第二部分或其子部分互补的序列时，夹板更稳定地与条形码区杂交。在本文的任何实施方案中，该方法可以包括去除包含与(i)第一部分或其子部分和/或(ii)第二部分或其子部分的错配的夹板，而在相同条件下，与(i)第一部分或其子部分和(ii)第二部分或其子部分互补的夹板保持稳定地与条形码区杂交以进行后续连接。
在本文的任何实施方案中，与夹板杂交的第一部分或其子部分(例如，其序列)的解链温度可以与与夹板杂交的第二部分或其子部分(例如，其序列)的解链温度相同。在本文的任何实施方案中，与夹板杂交的第一部分或其子部分(例如，其序列)的解链温度可以高于或低于与夹板杂交的第二部分或其子部分(例如，其序列)的解链温度。在本文的任何实施方案中，解链温度可以相差不超过1℃、不超过2℃、不超过5℃或不超过10℃。在本文的任何实施方案中，解链温度可以相差1℃或更多、2℃或更多、5℃或更多、或10℃或更多。在本文的任何实施方案中，与第二部分或其子部分(例如，其序列)和夹板之间形成的双链体相比，第一部分或其子部分(例如，其序列)和夹板之间形成的双链体可以同样稳定、不太稳定或更稳定。在本文的任何实施方案中，在夹板与(条形码区的)第一部分或其序列和/或(条形码区的)第二部分或其序列杂交之前，夹板可以是单链的，并且可以不包含双链区。
在本文的任何实施方案中，一个或多个条形码序列各自的长度可以独立地在约5个与约35个核苷酸之间。在本文的任何实施方案中，一个或多个条形码序列各自的长度可以独立地在约10个与约20个核苷酸之间。
在本文的任何实施方案中，条形码区的第一部分可以包含一个、两个或更多个条形码序列。在本文的任何实施方案中，条形码区的第二部分可以包含一个、两个或更多个条形码序列。在本文的任何实施方案中，条形码区可以包含两个或更多个相邻的条形码序列。在本文的任何实施方案中，条形码区可以包含两个或更多个非重叠的条形码序列。在本文的任何实施方案中，条形码区可以包含两个或更多个重叠的条形码序列。可替代地，在本文的任何实施方案中，条形码区可以由一个条形码序列组成。在本文的任何实施方案中，条形码区的长度可以在约8个与约40个核苷酸之间。在本文的任何实施方案中，条形码区的长度可以为至少15个核苷酸，而条形码区的第一部分和第二部分各自的长度可以不超过10个核苷酸。在一些实施方案中，与完整条形码区(或其互补序列)稳定杂交的可检测探针不仅仅与第一部分或第二部分(或其互补序列)稳定杂交。因此，一种或多种可检测探针可以从仅包含一个部分而不包含另一部分的嵌合探针(或其产物)中去除，而一种或多种可检测探针保持与完整条形码区(或其互补序列)稳定杂交。
在本文的任何实施方案中，复合探针可以是线型的。可替代地，在本文的任何实施方案中，复合探针可以是环状的。
在本文的任何实施方案中，与一种或多种可检测探针包含与(i)第一部分或其子部分(例如，其序列)和/或(ii)第二部分或其子部分(例如，其序列)的错配时相比，当一种或多种可检测探针包含与(i)第一部分或其子部分(例如，其序列)和(ii)第二部分或子部分(例如，其序列)互补的序列时，一种或多种可检测探针可以更稳定地与条形码区或其互补序列杂交。在本文的任何实施方案中，该方法可以包括去除包含与(i)第一部分或其子部分(例如，其序列)和/或(ii)第二部分或其子部分(例如，其序列)的错配的可检测探针分子，而在相同条件下，与(i)第一部分或其子部分(例如，其序列)和(ii)第二部分或其子部分(例如，其序列)互补的可检测探针分子保持与条形码区或其互补序列杂交。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括生成条形码区的互补序列，例如，使用复合探针作为模板进行延伸反应以生成条形码区的互补序列。在本文的任何实施方案中，该方法可以包括使复合探针环化并生成环化复合探针的滚环扩增(RCA)产物，其中RCA产物包含条形码区的互补序列的多个拷贝。在本文的任何实施方案中，与一种或多种可检测探针包含与(i)第一部分或其子部分(例如，其序列)和/或(ii)第二部分或子部分(例如，其序列)的互补序列的错配时相比，当一种或多种可检测探针包含(i)第一部分或其子部分(例如，其序列)和(ii)第二部分或其子部分(例如，其序列)时，一种或多种可检测探针可以更稳定地与RCA产物杂交。在本文的任何实施方案中，该方法可以包括去除包含与(i)第一部分或其子部分(例如，其序列)和/或(ii)第二部分或其子部分(例如，其序列)的互补序列的错配的可检测探针分子，而在相同条件下，包含(i)第一部分或其子部分(例如，其序列)和(ii)第二部分或其子部分(例如，其序列)的可检测探针分子保持与RCA产物杂交。
在本文的任何实施方案中，一种或多种可检测探针可以包含可检测标记。在本文的任何实施方案中，可检测标记可以包含荧光团。在本文的任何实施方案中，一种或多种可检测探针可以包含与可检测地标记的探针的序列互补的序列。在本文的任何实施方案中，可检测地标记的探针可以是荧光标记的探针。
在本文的任何实施方案中，靶核酸分子可以包含DNA和/或RNA。在本文的任何实施方案中，靶核酸分子可以是mRNA或cDNA。在本文的任何实施方案中，靶核酸分子可以包含用于生物样品中的分析物或其一部分的标记剂的报告寡核苷酸。在本文的任何实施方案中，分析物可以包括核酸分析物和/或非核酸分析物。在本文的任何实施方案中，标记剂可以包含直接或间接结合非核酸分析物的结合物，并且结合物可以与报告寡核苷酸缀合。在本文的任何实施方案中，非核酸分析物可以是蛋白质分析物。在本文的任何实施方案中，结合物可以包含抗体或其抗原结合片段。在本文的任何实施方案中，靶核酸分子可以包含两种或更多种报告寡核苷酸的连接产物，例如，每种报告寡核苷酸与非核酸分析物的结合物缀合。在本文的任何实施方案中，当两种或更多种报告寡核苷酸因对应的非核酸分析物接近而彼此接近时，可以生成连接产物。
在本文的任何实施方案中，复合探针或其产物可以在生物样品中和/或在包埋生物样品或其分子的基质中原位生成。在本文的任何实施方案中，产物可以是连接产物或滚环扩增产物。在本文的任何实施方案中，复合探针或其产物可以固定在生物样品中和/或在包埋生物样品或其分子的基质中。在本文的任何实施方案中，复合探针或其产物可以与在生物样品中和/或在包埋生物样品或其分子的基质中的一种或多种其他分子交联。
在本文的任何实施方案中，该方法可以包括对生物样品成像以检测与一种或多种可检测探针相关联的信号。在本文的任何实施方案中，成像可以包括荧光显微术。
在本文的任何实施方案中，可以使用顺序杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或它们的组合，在生物样品中原位分析条形码区的序列或其互补序列。
在本文的任何实施方案中，靶核酸可以是从靶RNA分子逆转录的靶cDNA分子。可替代地，在本文的任何实施方案中，靶核酸可以是靶RNA分子，并且第一探针和第二探针可以直接与靶RNA分子杂交，而无需将靶RNA分子逆转录成cDNA。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括使生物样品与以下各项接触：(i)包含第一杂交区和第一条形码序列的第一探针，(ii)包含第二杂交区和第二条形码序列的第二探针，以及(iii)包含第三杂交区的第三探针。在一些实施方案中，第三探针包含第三条形码序列。在一些实施方案中，第一杂交区和第二杂交区与生物样品中靶核酸分子中的相邻靶序列互补，并且第三探针干扰第二探针与靶核酸分子的杂交。在本文的任何实施方案中，第一条形码序列和/或第二条形码序列可以对应于感兴趣的分析物，而第三探针不对应于感兴趣的分析物。在本文的任何实施方案中，第三条形码序列可以对应于不同的感兴趣的分析物。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括连接与靶核酸分子杂交的第一探针和第二探针以形成复合探针，其中该连接包括：(i)连接与相邻靶序列杂交的第一杂交区和第二杂交区；以及(ii)连接第一探针和第二探针的第一条形码序列和第二条形码序列以形成与感兴趣的分析物相对应的复合条形码序列。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括使生物样品与可检测探针接触，该可检测探针在与第一条形码序列和第二条形码序列相对应的序列处与复合条形码序列或其互补序列杂交。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括去除与第一探针和第三探针之间形成的复合探针或其互补序列杂交的可检测探针，同时一种或多种可检测探针保持与第一探针和第二探针之间形成的复合探针或其互补序列杂交。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括检测与生物样品中的一种或多种可检测探针相关联的信号，从而检测生物样品中的感兴趣的分析物。
在本文的任何实施方案中，与第一探针和第三探针之间形成的复合探针或其互补序列杂交的一个或多个可检测探针的相关信号可以在生物样品中呈现为不可见的(未检测到)。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与以下各项接触：(i)包含第一杂交区和第一条形码序列的第一探针，以及(ii)包含第二杂交区和第二条形码序列的第二探针，其中第一杂交区和第二杂交区与生物样品中靶RNA分子中的相邻靶序列互补，并且其中第一条形码序列和第二条形码序列各自对应于靶RNA分子；(b)连接与靶RNA分子杂交的第一探针和第二探针以形成环状探针，其中该连接包括：(i)使用靶RNA分子作为模板，连接与相邻靶序列杂交的第一杂交区和第二杂交区，以及(ii)连接第一探针和第二探针以形成包含与靶RNA分子相对应的第一条形码序列和第二条形码序列的复合探针；以及(c)使生物样品与可检测探针接触，该可检测探针在第一条形码序列和第二条形码序列处与复合探针杂交，其中在生物样品中检测与可检测探针相关联的信号，从而检测生物样品中的靶RNA分子。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与以下各项接触：(i)包含第一杂交区和第一条形码序列的第一探针，以及(ii)包含第二杂交区和第二条形码序列的第二探针，其中第一杂交区和第二杂交区与生物样品中靶RNA分子中的相邻靶序列互补，并且其中第一条形码序列和第二条形码序列各自对应于靶RNA分子；(b)连接与靶RNA分子杂交的第一探针和第二探针以形成环状探针，其中该连接包括：(i)使用靶RNA分子作为模板，连接与相邻靶序列杂交的第一杂交区和第二杂交区，以及(ii)连接第一探针和第二探针以形成包含与靶RNA分子相对应的第一条形码序列和第二条形码序列的复合探针；以及(c)生成复合探针的滚环扩增产物；(d)使生物样品与可检测探针接触，该可检测探针在与第一条形码序列和第二条形码序列相对应的序列处与滚环扩增产物中的复合探针或其互补序列杂交，其中在生物样品中检测与可检测探针相关联的信号，从而检测生物样品中的靶RNA分子。
在本文的任何实施方案中，在复合探针中，第一条形码序列和第二条形码序列可以形成复合条形码序列。在本文的任何实施方案中，复合条形码序列可以是连续的或非连续的。
在本文的任何实施方案中，在复合探针中，第一条形码序列和第二条形码序列可以由一个或多个衔接子序列连接。
在本文的任何实施方案中，第一探针和/或第二探针还可以包含单独或组合地与靶RNA分子相对应的一个或多个附加条形码序列。在一些实施方案中，该方法还可以包括使生物样品与附加可检测探针接触，该附加可检测探针与任何一个或多个附加条形码序列杂交。
在本文的任何实施方案中，可以使用小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4RNA连接酶、T4 DNA连接酶和/或单链DNA(ssDNA)连接酶来使第一探针和/或第二探针环化。
在本文的任何实施方案中，该方法可以包括使生物样品与作为可检测地标记的探针的可检测探针接触，以及使可检测探针去杂交。在本文的任何实施方案中，该方法可以包括用该可检测地标记的探针和/或一种或多种其他可检测地标记的探针重复接触和去杂交步骤。
在本文的任何实施方案中，该方法可以包括使生物样品与作为中间探针的可检测探针接触，其中中间探针可使用可检测地标记的探针来检测，以及使中间探针和/或可检测地标记的探针去杂交。在本文的任何实施方案中，该方法可以包括用该中间探针、该可检测地标记的探针、一种或多种其他中间探针和/或一种或多种其他可检测地标记的探针重复接触和去杂交步骤。
在本文的任何实施方案中，生物样品可以是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)样品、冷冻组织样品或新鲜组织样品。在本文的任何实施方案中，生物样品可以是非均质化的。在本文的任何实施方案中，生物样品可以是固定的或未固定的。在本文的任何实施方案中，生物样品可以是透化的。在本文的任何实施方案中，生物样品可以包埋在基质中。在本文的任何实施方案中，基质可以包含水凝胶。在本文的任何实施方案中，生物样品可以是澄清的。在本文的任何实施方案中，清除可以包括使生物样品与蛋白酶接触。在本文的任何实施方案中，生物样品可以是交联的。在本文的任何实施方案中，生物样品可以是厚度在约1μm与约50μm之间的组织薄片。在本文的任何实施方案中，组织薄片的厚度可以在约5μm与约35μm之间。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含：(a)包含第一杂交区和条形码序列的第一部分的第一探针，以及(b)包含第二杂交区和条形码序列的第二部分的第二探针，其中第一杂交区和第二杂交区与靶RNA分子中的相邻靶序列互补，并且条形码序列对应于靶RNA分子。在一些实施方案中，该试剂盒还可以包含(c)夹板，该夹板与第一探针和第二探针杂交以连接第一部分和第二部分，从而形成包含条形码序列的复合探针。在本文的任何实施方案中，条形码序列的第一部分和第二部分各自的长度可以不超过10个核苷酸。在本文的任何实施方案中，条形码序列的长度可以为至少15个核苷酸。在本文的任何实施方案中，夹板可以是单链的。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含多对第一探针和第二探针，其中：每对的第一探针包含第一杂交区和条形码序列的第一部分，并且每对的第二探针包含第二杂交区和条形码序列的第二部分，其中每对第一探针和第二探针的第一杂交区和第二杂交区与靶核酸分子中的对应靶序列杂交。在本文的任何实施方案中，试剂盒可以包含多个夹板，该多个夹板与每对杂交，使得该对中的第一探针和第二探针被配置为形成复合探针，其中每个复合探针分别包含第一探针和第二探针的条形码区的第一部分和第二部分。在本文的任何实施方案中，每对第一探针和第二探针可以设有对应的独特夹板。在本文的任何实施方案中，多个夹板可以是单链的。在本文的任何实施方案中，试剂盒可以包含至少10种可区分的第一探针和至少10种可区分的第二探针。在本文的任何实施方案中，试剂盒可以包含用于每对对应的第一探针和第二探针的至少10种可区分的夹板。
在本文的任何实施方案中，一个或多个条形码序列和/或其互补序列可以使用任何合适的方法或技术来分析(例如，检测或测序)，包括本文所述的那些，诸如原位测序、荧光原位测序(FISSEQ)、边合成边测序(SBS)、边连接边测序(SBL)、边杂交边测序(SBH)或空间解析转录扩增子读出作图(STARmap)。在本文的任何实施方案中，一个或多个条形码序列和/或其互补序列可以通过用多种可检测探针的顺序杂交和检测来分析，该多种可检测探针诸如为荧光标记的探针和/或能够结合荧光标记的探针以及条形码序列和/或其互补序列的中间探针。
附图说明
以下附图展示了本公开的特征和优点的某些实施方案。这些实施方案无意于以任何方式限制所附权利要求书的范围。
图1显示了示例性探针和使用该探针检测靶核酸分子(例如，RNA或DNA)的方法。第一探针和第二探针分别包含与靶核酸分子杂交的第一杂交区和第二杂交区。第一探针和第二探针还分别包含条形码区的第一部分和第二部分。
图2A至图2G显示了使用本文公开的示例性标记剂的测定法，例如用于检测非核酸分析物或其相互作用或用于检测核酸和非核酸分析物之间的相互作用。
图3A至图3B说明了包含分割的基因特异性序列(例如，基因特异性衔接子和/或条形码序列)的探针可以用于提高检测特异性。图3A显示了使用包含基因特异性衔接子的探针来减少嵌合探针的形成的实例，该嵌合探针可能产生假阳性信号。图3B显示了使用包含分割条形码序列的探针来减少假阳性信号检测的实例。图3A至图3B所示的优点并不相互排斥。
图4显示了减少用于条形码序列检测的假阳性信号的另一个实例，其中该检测包括边杂交边测序(SBH)。
图5显示了示意图，该示意图说明了包含分割的基因特异性序列(例如，基因特异性衔接子和/或条形码序列)的探针可以用于诸如边杂交边测序(SBH)之类的多重检测。
图6A显示了用于检测小鼠脑组织中的Gpr88 RNA分子的示例性探针。图6B显示了使用CircLigaseTM(图6B，左图)或T4 DNA连接酶(图6B，右图)进行分割条形码连接时，与RCA产物相关联的荧光信号的示例性图像。
具体实施方式
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)均出于所有目的全文以引用方式并入本文中，并入程度如同每一单独的出版物均以引用方式单独地并入一样。如果本文阐述的定义与以引用方式并入本文中的专利、专利申请、已公布的专利申请和其他出版物中阐述的定义相反或者说相矛盾，则本文阐述的定义优先于以引用方式并入本文中的定义。
本文所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
I.概述
用挂锁或其他可环化的连接探针探测RNA一直是并且仍然是一个挑战。这是因为目前可用的连接酶在RNA模板上的连接效率和/或特异性(例如，连接酶保真度，即，对连接错配碱基对的区分)不尽如人意。尽管某些连接酶可以产生RNA模板依赖性连接产物(例如，环化挂锁探针)，但它们也能高速产生非模板依赖性连接产物。例如，连接酶，也称为PBCV-1DNA连接酶或小球藻病毒DNA连接酶，有效地催化由互补RNA链夹板化的相邻单链DNA的连接。然而，/>连接酶具有高的非模板依赖性连接效率，并且当它连接与RNA模板杂交的核酸末端时，可能不区分错配的序列。在某种情况下，低连接酶保真度可能导致高水平的假阳性探针连接事件。例如，连接的(例如，环化的)探针可以由分割探针对(例如，与靶核酸杂交的一对探针)形成。当使用两个或更多个单独的探针对时(例如，每个探针对靶向不同的分析物，并且每个探针对中的探针将被连接)，低连接酶保真度可能导致嵌合体的形成，例如，其中来自靶向基因X的探针对的探针连接到来自靶向基因Y的探针对的探针，而不是来自靶向基因X的探针对的另一个探针，从而形成错配的连接探针。在一些情况下，不正确杂交的探针对或其嵌合连接产物在原位测定法中不容易被去除或滤除。例如，包含嵌合探针对的环化探针可能被锁定在连接模板(例如，RNA)周围并拓扑连接，因此它们不能被洗掉(例如，在严格条件下)，从而允许不正确连接的探针对保留在样品中。嵌合环化探针可以产生经受解码(例如，检测)的信号，并且可能无法将真阳性信号(例如，与靶向基因X的探针的连接产物相关联的信号)与假阳性信号(例如，与错配的靶向基因X的探针和靶向基因Y的探针的连接产物相关联的信号)区分开。
在一些实施方案中，不能从生物样品中去除嵌合环化探针和/或其产物，同时将正确的环化探针和/或其产物留在样品中用于检测和分析。在一些实施方案中，一旦生成，嵌合环化探针和/或其产物不能被选择性洗掉。在其他实施方案中，一旦检测到，与嵌合环化探针和/或其产物相关联的信号不能通过与诸如已知核酸序列的参照物进行比较而被轻易滤除。
在一些实施方案中，本文公开了用于在用可环化探针探测核酸(例如，RNA)时减少假阳性信号检测的方法和组合物。在一些实施方案中，与已知方法相比，使用本文公开的方法不太可能生成嵌合环化探针和/或其产物。在一些实施方案中，与已知方法相比，使用本文公开的方法不太可能检测到与嵌合环化探针和/或其产物相关联的假阳性信号。在一些实施方案中，本文提供的探针设计可以改善低连接酶特异性或保真度，例如，通过允许在检测/解码步骤中去除和/或滤除不正确连接的产物(例如，嵌合体)和与之相关联的信号。在一些实施方案中，嵌合连接产物的去除和/或滤除可以在不增加实际连接酶特异性或保真度的情况下进行。在一些情况下，使用本文公开的探针增加了总体检测特异性，即使当使用低保真度连接酶(例如，连接酶)连接一个或多个探针以形成环化探针时。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用包含双重分割(“复式分割(splitsplit)”)探针的探针组。探针组可以包含至少两种或更多种探针。在一些实施方案中，探针组包含至少两种或更多种探针，其中杂交区和条形码区在第一探针和第二探针之间分割。在一些实施方案中，探针组包含两种探针，每种探针包含杂交区(例如，靶识别位点)，并且这两个杂交区被配置为使用靶核酸中的序列作为模板彼此连接。在一些实施方案中，探针组包含在3’末端或5’末端具有杂交区的第一探针，以及在5’末端或3’末端具有杂交区的第二探针。在一些实施方案中，这两种探针各自包含条形码区的一部分，诸如待使用边杂交边测序(SBH)检测的条形码序列的分割部分(例如，图5，左下)或条形码序列的分割组合(例如，图5，右下)。在一些实施方案中，探针组包含在3’末端或5’末端具有条形码区的第一部分的第一探针，以及在5’末端或3’末端具有条形码区的第二部分的第二探针。在一些实施方案中，仅从探针组中的一种探针生成的连接产物及其RCA产物仅携带条形码区的一部分(例如，部分SBH条形码序列)。在一些实施方案中，不应连接在一起的探针的连接(例如，来自靶向不同分析物的两个探针对的探针的错误连接)生成不存在于条形码池(例如，预先确定或预先关联的一组条形码和分析物)中的不正确的条形码序列(例如，嵌合SBH条形码序列)。在一些实施方案中，连接产物或其RCA产物包含不能使用SBH解码的条形码序列(例如，部分或嵌合条形码序列)或其互补序列。在一些实施方案中，连接产物或其RCA产物包含不生成可检测SBH信号的条形码序列(例如，部分或嵌合条形码序列)或其互补序列。在一些实施方案中，连接产物或其RCA产物包含可以在SBH检测和/或解码期间呈现为“不可见”的条形码序列(例如，部分或嵌合条形码序列)或其互补序列。在一些实施方案中，可以在SBH检测和/或解码期间滤除与不正确的条形码序列(例如，部分或嵌合条形码序列)相关联的信号。在一些实施方案中，在检测/解码步骤中使假阳性连接(诸如由于非模板依赖性或非区别性连接(例如，通过连接酶或化学连接)而造成的错误或错配的探针对和/或仅探针组中的子组的连接)呈现为“不可见的”，因此在检测/解码步骤中仅检测到真阳性。在一些情况下，与条形码区不在两种或更多种探针之间分割的探针相比，使用各自具有本文公开的条形码区的一部分的探针，增加了总体检测特异性。
在一些实施方案中，探针连接特异性，例如酶或化学连接反应的保真度或特异性，可以但不必增加。在一些实施方案中，使用本文公开的方法，探针连接特异性可能较低，但仍能实现较高的总体检测特异性。在一些实施方案中，假阳性连接事件可以但不必被抑制。因此，在一些方面，本文公开的方法和探针设计允许使用宽范围的连接酶保真度的连接酶进行原位测定法，包括涉及探针的RNA模板化连接的那些。例如，使用本文公开的探针设计，在RNA模板上具有高连接效率但具有高非模板依赖性连接率的连接酶可以用于具有高测定特异性的RNA原位检测，因为与非模板依赖性连接产物中的部分或嵌合条形码序列相关联的信号可以被滤除，从而最小化假阳性对真阳性信号的检测和分析的影响。在一些实施方案中，检测特异性随着靶向分析物的探针组中探针数量的增加而增加。在一些实施方案中，检测特异性随着各自靶向不同分析物的探针组数量的增加而增加。在一些实施方案中，探针和/或探针组复杂性的增加允许生成并不存在的不可见的探针对，从而进一步增加检测特异性。在一些情况下，使用更多数量的检测探针也可以允许提高所提供的方法增加检测特异性的能力。
II.样品、分析物和靶序列
A.样品和样品加工
本文所公开的样品可以是或源自任何生物样品。在一些实施方案中，本文的样品是其中期望分析靶分子及其在二维或三维空间中的位置的样品。本文所公开的方法和组合物可以用于分析生物样品，所述生物样品可以使用多种技术(包括但不限于活检、手术和激光捕获显微术(LCM))中的任何一种从受试者获得，并且通常包括来自受试者的细胞和/或其他生物材料。生物样品也可以从非哺乳动物生物体(例如，植物、昆虫、节肢动物、线虫、真菌或两栖动物)获得。生物样品也可以从真核生物获得，诸如组织样品、患者来源的类器官(PDO)或患者来源的异种移植物(PDX)。来自生物体的生物样品可以包含一种或多种其他生物体或其组分。例如，除了哺乳动物细胞和非细胞组织组分之外，哺乳动物组织切片可以包含朊病毒、类病毒、病毒、细菌、真菌或来自其他生物体的组分。可以从其获得生物样品的受试者可以是健康或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如，患有疾病诸如癌症的患者)或易患上疾病的个体、和/或需要疗法或怀疑需要疗法的个体。
生物样品可以包括任意数量的大分子，例如，细胞大分子和细胞器(例如，线粒体和细胞核)。生物样品可以作为组织样品(诸如组织切片、活检样品、芯针活检样品、针抽吸物或细针抽吸物)获得。样品可以是流体样品，诸如血液样品、尿液样品或唾液样品，并且其中的细胞和细胞组分可以在将细胞或细胞组分置于基底上之后进行分析。样品可以是皮肤样品、结肠样品、颊拭子、组织学样品、组织病理学样品、血浆或血清样品、肿瘤样品、活细胞、培养细胞、临床样品(例如，全血或血液衍生制品、血细胞或培养的组织或细胞，包括细胞悬浮液)。在一些实施方案中，生物样品可以包含沉积在表面上的细胞，并且细胞可以从身体样品中分离，该身体样品例如为血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液。
无细胞生物样品可以包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可以从身体样品中分离，该身体样品例如为血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液。
生物样品可以源自本文提及的受试者或生物体的均质培养物或群体，或者可替代地源自几种不同生物体的集合，例如，在群落或生态系统中。
生物样品可以包括一个或多个患病细胞。患病细胞可能具有改变的代谢特性、基因表达、蛋白质表达和/或形态学特征。疾病的实例包括炎症性障碍、代谢性障碍、神经系统障碍和癌症。癌细胞可以源自实体瘤、血液恶性肿瘤、细胞系，或者作为循环肿瘤细胞获得。生物样品还可以包括胎儿细胞和免疫细胞。
生物样品可以包括3D基质中的靶分子(例如，蛋白质、RNA和/或DNA)。在一些实施方案中，源自分析物(例如，蛋白质、RNA和/或DNA)或与之相关的扩增子(例如，滚环扩增产物)可以包埋在3D基质中。在一些实施方案中，3D基质可以包含通过化学和/或以酶促方式连接(例如，通过交联)的天然分子和/或合成分子网络。在一些实施方案中，3D基质可以包含合成的聚合物。在一些实施方案中，3D基质包含水凝胶。
可以清除3D基质内的生物样品中不是感兴趣靶标的蛋白质和/或脂质。例如，可以通过酶促蛋白质水解来清除生物样品中的蛋白质(也称为“脱蛋白”)。清除步骤可以在共价固定任何靶分子或其衍生物之前或之后进行。
在一些情况下，在将靶分子(例如，RNA或DNA)、引物、靶分子衍生物(例如，cDNA或扩增子)或探针(例如，可环化探针、中间探针或衔接子)共价固定到合成3D基质上之后，进行清除步骤。在固定后进行清除步骤可以使任何随后的核酸杂交反应能够在样品已经基本上脱蛋白的条件下进行，如通过酶促蛋白质水解(“蛋白质清除”)。该方法可以具有从靶分子中去除核糖体和其他RNA靶结合蛋白或核酸靶结合蛋白(同时保持空间位置)的优点，其中蛋白组分可能阻碍或抑制探针结合。
清除步骤可以包括从3D基质中去除非靶标。清除步骤可以包括降解非靶标。清除步骤可以包括将样品暴露于能够降解蛋白质的酶(例如，蛋白酶)。清除步骤可以包括将样品暴露于去污剂。
可以使用酶、变性剂、螯合剂、化学剂等将蛋白质从样品中清除，这些试剂可以将蛋白质分解成更小的组分和/或氨基酸。这些更小的组分可能更容易被物理去除，和/或可能足够小或足够惰性，使得它们不会显著影响背景。类似地，可以使用表面活性剂等从样品中清除脂质。在一些情况下，例如同时或依次使用这些试剂中的一种或多种。合适的酶的非限制性实例包括蛋白酶，诸如蛋白酶K、蛋白酶或肽酶，或者消化酶，诸如胰蛋白酶、胃蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。合适的变性剂的非限制性实例包括盐酸胍、丙酮、乙酸、尿素或高氯酸锂。能够使蛋白质变性的化学剂的非限制性实例包括溶剂，诸如苯酚、氯仿、异氰酸胍、尿素、甲酰胺等。表面活性剂的非限制性实例包括Triton X-100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)、SDS(十二烷基硫酸钠)、Igepal CA-630或泊洛沙姆。螯合剂的非限制性实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐或聚天冬氨酸。在一些实施方案中，可以将诸如这些的化合物施加到样品以清除蛋白质、脂质和/或其他组分。例如，可以将缓冲溶液(例如，包含Tris或三(羟甲基)氨基甲烷)施加到样品，然后去除。
在一些情况下，也可以清除不是感兴趣的靶分子的核酸。这些非靶核酸可能不会被捕获和/或固定到3D基质上，因此可以用酶去除以降解核酸分子。可以用于去除DNA的DNA酶的非限制性实例包括DNA酶I、dsDNA酶、多种限制性酶等。清除RNA的技术的非限制性实例包括RNA酶，诸如RNA酶A、RNA酶T或RNA酶H，或者化学剂，例如通过碱性水解(例如，通过将pH升高到大于10)。去除糖或细胞外基质的体系的非限制性实例包括酶，诸如几丁质酶、肝素酶或其他糖基化酶。去除脂质的体系的非限制性实例包括酶诸如脂肪酶、化学试剂诸如醇(例如，甲醇或乙醇)，或去污剂诸如Triton X-100或十二烷基硫酸钠。以这种方式，可以去除样品的背景，从而可以促进核酸探针或其他靶标的分析(例如，使用荧光显微术或本文所述的其他技术)。
在一些实施方案中，本文公开的样品可以提供在基底上。在一些实施方案中，本文的基底可以是不溶于水性液体的任何支持物，并且允许在所述支持物上定位生物样品、分析物、特征和/或试剂(例如，探针)。在一些实施方案中，生物样品可以附着到基底上。生物样品的附着可以是不可逆的或可逆的，这取决于样品的性质和分析方法中的后续步骤。在某些实施方案中，通过将合适的聚合物涂层应用到基底上并且使样品与所述聚合物涂层接触，可以使样品可逆地附着到基底上。然后，例如使用至少部分溶解聚合物涂层的有机溶剂，可以将样品从基底上分离。水凝胶是适合用于此目的的聚合物的实例。
在一些实施方案中，基底可以用一种或多种物质涂覆或功能化，以促进样品附着到基底上。可以用于涂覆或功能化基底的合适物质包括但不限于凝集素、聚赖氨酸、抗体和多糖。
可以执行各种步骤来为测定和/或在测定期间制备或处理生物样品。除非另有说明，否则下文所述的制备或处理步骤通常可以以任何方式和以任何顺序组合，以适当地制备或处理特定样品用于和/或进行分析。
(i)组织切片
生物样品可以从受试者获得(例如，通过手术活检、整个受试者切片)或在生长基质或培养皿上体外生长为细胞群，并且作为组织薄片或组织切片制备用于分析。生长的样品可以足够薄，而无需进一步的处理步骤即可进行分析。可替代地，生长的样品和经由活检或切片获得的样品可以使用机械切割装置诸如振动切片机(vibrating blade microtome)制备成薄的组织切片。作为另一种替代方案，在一些实施方案中，薄的组织切片可以通过将生物样品的触摸印记施加到合适的基底材料上来制备。
组织切片的厚度可以是细胞最大横截面尺寸的分数(例如，小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)。然而，也可以使用厚度大于最大横截面细胞尺寸的组织切片。例如，可以使用冷冻切片(cryostat section)，其可以是例如10-20μm厚。
更一般地，组织切片的厚度通常取决于用于制备切片的方法和组织的物理特性，因此可以制备和使用具有各种不同厚度的切片。例如，组织切片的厚度可以是至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、20、30、40或50μm。如果需要或方便，也可以使用更厚的切片，例如至少70、80、90或100μm或更厚。通常，组织切片的厚度在1-100μm、1-50μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-15μm、1-10μm、2-8μm、3-7μm或4-6μm之间，但是如上文所提及，也可以分析厚度大于或小于这些范围的切片。
也可以从单个生物样品中获得多个切片。例如，通过使用切片刀片对活检样品进行系列切片，可以从手术活检样品获得多个组织切片。系列切片之间的空间信息可以以这种方式保存，并且可以连续分析所述切片以获得关于生物样品的三维信息。
(ii)冷冻
在一些实施方案中，可以通过在适合于维持或保存组织结构的完整性(例如，物理特性)的温度下深度冷冻来制备生物样品(例如，如上文所述的组织切片)。可以使用任何数量的合适方法将冷冻组织样品切片(例如切薄片)到基底表面上。例如，可以使用设置在适合于保持组织样品的结构完整性和样品中核酸的化学特性的温度的冷冻切片机(例如，低温恒温器)制备组织样品。这样的温度可以是例如低于-15℃、低于-20℃或低于-25℃。
(iii)固定和后固定
在一些实施方案中，可以使用已建立的方法福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)来制备生物样品。在一些实施方案中，可以使用福尔马林固定和石蜡包埋来制备细胞悬浮液和其他非组织样品。在固定样品并包埋在石蜡或树脂块中后，可以如上文所述对样品进行切片。在分析之前，可以通过在适当的溶剂(例如，二甲苯)中温育组织切片，然后冲洗(例如，99.5％乙醇持续2分钟，96％乙醇持续2分钟，和70％乙醇持续2分钟)，从组织切片中去除石蜡包埋材料(例如，脱蜡)。
作为上文所述的福尔马林固定的替代方案，可以将生物样品固定在多种其他固定剂中的任何一种中，以在分析之前保存样品的生物结构。例如，可以通过浸泡在乙醇、甲醇、丙酮、多聚甲醛(PFA)-Triton以及它们的组合中来固定样品。
在一些实施方案中，对新鲜冷冻样品使用丙酮固定，所述新鲜冷冻样品可以包括但不限于皮质组织、小鼠嗅球、人脑肿瘤、人死后脑和乳腺癌样品。当进行丙酮固定时，可以不进行预透化步骤(下文描述)。或者，丙酮固定可以与透化步骤结合进行。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括一个或多个后固定(post-fixing，也称为postfixation)步骤。在一些实施方案中，在使样品与本文公开的多核苷酸例如一种或多种探针接触之后进行一个或多个后固定步骤。在一些实施方案中，在包含探针和靶的杂交复合物在样品中形成之后进行一个或多个后固定步骤。在一些实施方案中，在本文公开的连接反应(诸如将探针或探针组环化的连接)之前进行一个或多个后固定步骤。
在一些实施方案中，在使样品与非核酸分析物诸如蛋白质分析物的结合剂或标记剂(例如，抗体或其抗原结合片段)接触之后进行一个或多个后固定步骤。标记剂可以包含核酸分子(例如，报告寡核苷酸)，其包含与标记剂对应并且因此与分析物对应(例如，唯一地鉴定)的序列。在一些实施方案中，标记剂可以包含含有一个或多个条形码序列的报告寡核苷酸。
可以使用本文公开的任何合适的固定试剂(例如，在DEPC-PBS中的3％(w/v)多聚甲醛)进行后固定步骤。
(iv)包埋
作为上述石蜡包埋的一种替代方案，可以将生物样品包埋在多种其他包埋材料中的任何一种中以便在切片和其他处理步骤之前为样品提供结构基材。在一些情况下，可以例如在分析从样品获得的组织切片之前去除包埋材料。合适的包埋材料包括但不限于蜡、树脂(例如，甲基丙烯酸树脂)、环氧树脂和琼脂。
在一些实施方案中，可以将生物样品包埋在基质(例如，水凝胶基质)中。在一些方面，可以一次或多次向样品施加包埋材料。以这种方式包埋样品通常涉及将生物样品与水凝胶接触，使得生物样品变得被水凝胶包围。例如，可以通过使样品与合适的聚合物材料接触并且活化聚合物材料以形成水凝胶来包埋样品。在一些实施方案中，形成水凝胶使得水凝胶在生物样品中内化。
在一些实施方案中，生物样品通过形成水凝胶的聚合物材料的交联而固定在水凝胶中。交联可以通过化学和/或以光化学方式进行，或者可替代地通过任何其他水凝胶形成方法进行。
水凝胶-基质的组成和对生物样品的应用通常取决于生物样品的性质和制备(例如，切片的、非切片的、固定类型)。作为一个实例，在生物样品是组织切片时，水凝胶-基质可以包括单体溶液和过硫酸铵(APS)引发剂/四甲基乙二胺(TEMED)加速剂溶液。作为另一个实例，在生物样品由细胞(例如，培养的细胞或从组织样品解离的细胞)组成时，细胞可以与单体溶液和APS/TEMED溶液一起温育。对于细胞，水凝胶-基质凝胶在隔室中形成，所述隔室包括但不限于用于培养、维持或运输细胞的设备。例如，可以用添加到隔室中的单体溶液加APS/TEMED形成水凝胶-基质至约0.1μm至约2mm的深度范围。
生物样品的水凝胶包埋的附加方法和方面描述于例如Chen等人,Science 347(6221):543–548,2015、US2016/0024555、US2019/0276881、US2020/0071751、US2021/0292834、US2021/0230692和US2021/0310052，其全部内容以引用方式并入本文。本文公开的方法可以包括将组织或细胞样品包埋在导电水凝胶内。美国专利公开号2011/0256183(Frank等人)、美国专利号10,138,509(Church等人)、美国专利号10,545,075(Deisseroth等人)和美国专利公开号2019/0233878(Delaney等人)(这些专利以引用方式并入本文)描述了水凝胶及其用于包埋组织和细胞的用途。
(v)染色和免疫组织化学(IHC)
为了促进可视化，可以使用各种各样的染色剂和染色技术来对生物样品染色。例如，在一些实施方案中，可以使用任何数量的染色剂和/或免疫组织化学试剂对样品进行染色。可以执行一个或多个染色步骤来制备或处理用于本文所述的测定的生物样品，或者可以在测定期间和/或之后执行。在一些实施方案中，可以使样品与一种或多种核酸染色剂、膜染色剂(例如，细胞膜或核膜)、细胞学染色剂或它们的组合接触。在一些实例中，染色可以是对蛋白质、磷脂、DNA(例如，dsDNA、ssDNA)、RNA、细胞器或细胞的隔室特异的。可以使样品与一种或多种标记的抗体(例如，对感兴趣的分析物特异的第一抗体和对第一抗体特异的标记的第二抗体)接触。在一些实施方案中，可以使用对染色样品拍摄的一个或多个图像来分割样品中的细胞。
在一些实施方案中，使用亲脂性染料进行染色。在一些实例中，用亲脂性碳菁或氨基苯乙烯染料或它们的类似物(例如，DiI、DiO、DiR、DiD)进行染色。其他细胞膜染色剂可以包括FM和RH染料或对细胞膜蛋白特异的免疫组织化学试剂。在一些实例中，染色剂可以包括但不限于吖啶橙、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、DAPI、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、Hoechst染色剂、碘、甲基绿、亚甲蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、钌红、碘化丙锭、罗丹明(例如，罗丹明B)或番红或其衍生物。在一些实施方案中，可以用苏木精和曙红(H&E)对样品进行染色。
可以使用苏木精和曙红(H&E)染色技术、使用帕帕尼科拉乌染色(Papanicolaoustaining)技术、马松三色染色(Masson’s trichrome staining)技术、银染色技术、苏丹染色技术和/或使用高碘酸希夫(PAS)染色技术对样品进行染色。PAS染色通常在福尔马林或丙酮固定之后进行。在一些实施方案中，可以使用罗曼诺夫斯基染色剂(包括瑞氏染色剂(Wright’s stain)、詹纳尔氏染色剂(Jenner’s stain)、坎-格二氏染色剂(Can-Grunwaldstain)、利什曼染色剂(Leishman stain)和吉姆萨染色剂(Giemsa stain))对样品进行染色。
在一些实施方案中，可以将生物样品脱去染色。可以利用任何合适的使生物样品脱去染色或脱色的方法，并且这些方法通常取决于施加到样品上的染色剂的性质。例如，在一些实施方案中，通过抗体偶联将一种或多种免疫荧光染色剂应用于样品。可以使用诸如通过用还原剂和去污剂洗涤处理来切割二硫键、离液盐处理、用抗原修复溶液处理和用酸性甘氨酸缓冲液处理等技术来去除此类染色剂。用于多重染色和脱去染色的方法描述于例如Bolognesi等人,J.Histochem.Cytochem.2017；65(8):431-444；Lin等人,NatCommun.2015；6:8390；Pirici等人,J.Histochem.Cytochem.2009；57:567–75；以及Glass等人,J.Histochem.Cytochem.2009；57:899–905中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
(vi)等容膨胀(Isometric Expansion)
在一些实施方案中，可以将包埋在基质(例如，水凝胶)中的生物样品等容膨胀。可以使用的等容膨胀方法包括水合，其是膨胀显微术中的一个制备步骤，如Chen等人,Science347(6221):543–548,2015中所述。
可以通过以下方式来进行等容膨胀：将生物样品的一种或多种组分锚定到凝胶上，然后凝胶形成、蛋白质水解和溶胀。在一些实施方案中，可以将样品中的分析物、分析物的产物和/或与样品中的分析物缔合的探针锚定到基质(例如，水凝胶)上。生物样品的等容膨胀可以发生在将生物样品固定在基底上之前或者发生在将生物样品固定在基底上之后。在一些实施方案中，可以在使基底与本文公开的探针接触之前，从基底上去除等容膨胀的生物样品。
通常，用于进行生物样品的等容膨胀的步骤可以取决于样品的特性(例如，组织切片的厚度、固定、交联)和/或感兴趣的分析物(例如，将RNA、DNA和蛋白质锚定到凝胶上的不同条件)。
在一些实施方案中，生物样品中的蛋白质被锚定到可溶胀的凝胶(诸如聚电解质凝胶)上。可抗体以在锚定到可溶胀凝胶上之前、之后或结合锚定到可溶胀凝胶上被引导至蛋白质。生物样品中的DNA和/或RNA也可以通过合适的接头锚定到可溶胀凝胶上。此类接头的实例包括但不限于6-((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基-X SE)(可获自ThermoFisher,Waltham,MA)、Label-IT胺(可获自MirusBio,Madison,WI)和Label X(例如描述于Chen等人,Nat.Methods 13:679-684,2016，其全部内容以引用方式并入本文)。
样品的等容膨胀可以增加样品的后续分析的空间分辨率。空间分布中分辨率的增加可以通过比较等容膨胀的样品和尚未等容膨胀的样品来确定。
在一些实施方案中，生物样品被等容膨胀至如下尺寸：其未膨胀尺寸的至少2x、2.1x、2.2x、2.3x、2.4x、2.5x、2.6x、2.7x、2.8x、2.9x、3x、3.1x、3.2x、3.3x、3.4x、3.5x、3.6x、3.7x、3.8x、3.9x、4x、4.1x、4.2x、4.3x、4.4x、4.5x、4.6x、4.7x、4.8x或4.9x。在一些实施方案中，样品被等容膨胀至其未膨胀尺寸的至少2x且小于20x。
(vii)交联和去交联
在一些实施方案中，在本文公开的测定步骤之前、期间或之后，使生物样品可逆地或不可逆地交联。交联剂包括促进一个分子与另一个分子的连接的化学剂，或者甚至是光。交联剂可以是蛋白质-核酸交联剂、核酸-核酸交联剂和/或蛋白质-蛋白质交联剂。在一些实施方案中，交联剂是可逆交联剂。在一些实施方案中，交联剂是不可逆交联剂。
在一些实施方案中，使待分析的样品与蛋白质-核酸交联剂、核酸-核酸交联剂、蛋白质-蛋白质交联剂或它们的任何组合接触。在一些实例中，交联剂是可逆的交联剂，使得交联的分子可以容易地分离。在一些实例中，交联剂是不可逆的交联剂，使得交联的分子不容易分离。在一些实例中，交联剂是光，诸如紫外光。在一些实例中，交联剂是光激活的。这些交联剂包括甲醛、二琥珀酰亚胺戊二酸酯、UV-254、补骨脂素及其衍生物，诸如氨甲基三氧沙林、戊二醛、乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯]和其他化合物，包括在万维网上的piercenet.com/files/1601673_Cross-link_HB_Intl.pdf处可获得的Thermo ScientificPierce Cross-linking Technical Handbook,Thermo Scientific(2009)中描述的那些化合物。
在一些实施方案中，靶分子可以存在于三维基质材料中，并且共价连接到三维基质材料，使得每个靶分子的相对位置在三维基质材料内是固定的，例如固定化的。以这种方式，提供了任何所需序列的共价结合的靶分子的三维基质。每个靶分子在基质材料内有其自己的三维坐标，并且每个靶分子代表信息。以这种方式，可以将大量信息存储在三维基质中。
在一些实施方案中，可交联探针用于将靶分子锚定到三维基质，使得每个靶分子的相对位置是固定的。在实施方案中，使样品与聚dT锚定探针接触，以将聚腺苷酸化(聚A)RNA结合和锚定到基质。在一些实施方案中，锚定探针(例如，聚dT锚定探针)包含可以共价掺入基质中(例如，在基质聚合期间)的末端acrydite部分或其他可交联部分。在一些实施方案中，聚dT锚定探针的长度可以为约10至20个核苷酸(例如，长度为约15个核苷酸)。在一些实施方案中，锚定探针可以包含锁定的核酸碱基，以稳定聚dT锚定探针与RNA的聚A尾的杂交。
根据另一方面，靶分子可以是分析物的扩增产物，诸如在三维基质材料内产生的扩增子。然后例如通过共聚或交联，可以将扩增子共价连接到基质。这产生了靶分子的结构稳定且化学稳定的三维基质。根据这一方面，靶分子的三维基质允许延长信息存储和读出周期。此外，样品中靶分子的位置可以是稳定的。
在一些方面，分析物、多核苷酸和/或与其结合的分析物或探针的扩增产物(例如，扩增子)可以锚定到聚合物基质。例如，聚合物基质可以是水凝胶。在一些实施方案中，聚合物基质包含官能部分。在一些实施方案中，可以对一种或多种多核苷酸探针和/或其扩增产物(例如，扩增子)进行修饰以含有官能团，该官能团可以用作将多核苷酸探针和/或扩增产物连接到聚合物基质的锚定位点。在一些实施方案中，可以使用交联化学将一种或多种多核苷酸探针和/或扩增产物(例如，扩增子)的官能部分锚定到其他分子和/或聚合物基质。例如，可以使用任何合适的官能部分，诸如胺、acrydite、炔烃、生物素、叠氮化物和硫醇。在用于交联的一些实施方案中，可以将官能部分交联到修饰的dNTP或dUTP或两者上。在一些情况下，可以使用锚定方法(例如，官能部分)的组合，例如，以将一种或多种类型的分子锚定到聚合物基质。
在一些实施方案中，锚定可以包括使用丙烯酰胺基团或点击化学部分。在一些方面，一种或多种多核苷酸探针和/或其扩增产物(例如，扩增子)可以包含修饰的核苷酸，其可以直接具有官能团(例如，丙烯酰胺、点击化学)或被进一步修饰(例如，用NHS酯化学修饰的胺)以含有官能团。在一些实施方案中，可以使用点击反应化学将一种或多种靶分子(或其产物或衍生物)、多核苷酸探针和/或扩增产物(例如，扩增子)偶联至基质(例如，水凝胶)。可以使用任何合适的点击反应和点击反应性基团。在一些情况下，可以通过点击反应将分子栓系到点击反应性基团官能化的水凝胶基质(例如，点击凝胶)。例如，可以将5’叠氮甲基-dUTP掺入到靶分子、多核苷酸探针和/或扩增产物(例如，扩增子)的产物或衍生物中，然后固定到用炔基官能化的水凝胶基质上。在一些实施方案中，缓冲液可以用于点击反应催化，例如，Cu(I)催化的炔烃-叠氮化物环加成(缩写为CuAAC)点击反应催化缓冲液，其催化点击反应中的炔烃-叠氮化物键。
在一些实施方案中，靶分子、多核苷酸探针和/或扩增产物(例如，扩增子)的产物或衍生物可以通过添加包含用于固定的官能部分的核苷酸三磷酸类似物来官能化。在一些实例中，核苷酸三磷酸类似物包括但不限于氨基-烯丙基dUTP、5-TCO-PEG4-dUTP、C8-炔烃-dUTP、5-叠氮甲基-dUTP、5-乙烯基-dUTP、5-乙炔基dUTP，以及包含用于通过交联或在分子和基质之间形成化学键来固定的官能部分的其他核苷酸三磷酸类似物。
在一些实施方案中，基质包括细胞或合成基质，其含有可以通过官能化反应来与靶分子、多核苷酸探针和/或扩增产物(例如，扩增子)的产物或衍生物中的官能部分反应的化学部分(例如，反应性基团)。例如，氨基-烯丙基dUTP可以与内源或外源细胞基质内存在的或者改性合成水凝胶基质中存在的蛋白质和其他生物分子中出现的内源游离胺基团交联，该改性合成水凝胶基质诸如为通过聚丙烯酰胺和N-(3-氨丙基)-甲基丙烯酰胺共聚形成的胺官能化聚丙烯酰胺水凝胶。在一些情况下，含有叠氮化物官能部分的核苷类似物可以与含有炔烃官能部分的合成水凝胶基质(诸如通过丙烯酰胺和炔丙基丙烯酰胺共聚形成的水凝胶基质)交联。
在一些实施方案中，生物样品通过形成水凝胶的聚合物材料的交联而被固定在水凝胶中。交联可以通过化学和/或以光化学方式进行，或者可替代地通过任何其他水凝胶形成方法进行。水凝胶可以包括含有网状系统的大分子聚合物凝胶。在网状系统中，一些聚合物链可以任选地被交联，但是交联并不总是发生。
在一些实施方案中，水凝胶可以包括水凝胶亚单元，诸如但不限于丙烯酰胺、双丙烯酰胺、聚丙烯酰胺及其衍生物、聚(乙二醇)及其衍生物(例如，PEG-丙烯酸酯(PEG-DA)、PEG-RGD)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酸酯化透明质酸(MeHA)、聚脂肪族聚氨酯、聚醚型聚氨酯、聚酯型聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚四亚甲基氧化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等、以及它们的组合。
在一些实施方案中，水凝胶包括杂化材料，例如，水凝胶材料包括合成聚合物和天然聚合物的要素。合适的水凝胶的实例描述于例如美国专利号6,391,937、9,512,422和9,889,422以及美国专利申请公开号2017/0253918、2018/0052081和2010/0055733中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，水凝胶可以形成基底。在一些实施方案中，基底包括水凝胶和一种或多种第二材料。在一些实施方案中，将水凝胶放置在一种或多种第二材料的顶部。例如，水凝胶可以预先形成，然后放置在一种或多种第二材料的顶部、底部或与一种或多种第二材料的任何其他构型中。在一些实施方案中，水凝胶形成发生在基底形成期间接触一种或多种第二材料之后。水凝胶形成也可以发生在位于基底上的结构(例如，孔、脊、突起和/或纹理)内。
在一些实施方案中，在向样品提供探针之前、同时或之后，发生基底上的水凝胶形成。例如，水凝胶形成可以在已经含有探针的基底上进行。
在一些实施方案中，水凝胶形成发生在生物样品内。在一些实施方案中，生物样品(例如，组织切片)被包埋在水凝胶中。在一些实施方案中，水凝胶亚单元被注入到生物样品中，并且水凝胶的聚合由外部或内部刺激引发。
在生物样品内形成水凝胶的实施方案中，可以使用官能化化学。在一些实施方案中，官能化化学包括水凝胶-组织化学(HTC)。适合于HTC的任何水凝胶-组织骨架(例如，合成的或天然的)都可以用于锚定生物大分子和调节官能化。使用HTC骨架变体的方法的非限制性实例包括CLARITY、PACT、ExM、SWITCH和ePACT。在一些实施方案中，生物样品内的水凝胶形成是永久性的。例如，生物大分子可以永久粘附到水凝胶上，允许多个回合的询问。在一些实施方案中，生物样品内的水凝胶形成是可逆的。
在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将另外的试剂添加到水凝胶亚单元中。例如，另外的试剂可以包括但不限于寡核苷酸(例如，探针)、使DNA片段化的核酸内切酶、DNA片段化缓冲液、DNA聚合酶、用于扩增核酸并将条形码附接到扩增片段的dNTP。可以使用其他酶，包括但不限于RNA聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白质酶K和DNAse。另外的试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和开关寡核苷酸。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将光学标记添加到水凝胶亚单元中。
在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将HTC试剂添加到水凝胶中。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将细胞标记剂添加到水凝胶中。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将细胞渗透剂添加到水凝胶中。
可以使用任何合适的方法清除包埋在生物样品中的水凝胶。例如，电泳组织清除方法可以用于从水凝胶包埋的样品中去除生物大分子。在一些实施方案中，水凝胶包埋的样品在清除水凝胶之前或之后储存在介质(例如，固定介质、甲基纤维素或其他半固体介质)中。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括使可逆交联的生物样品解交联。解交联不需要是完全的。在一些实施方案中，可逆交联的生物样品中只有一部分交联分子被解交联并允许迁移。
(viii)组织透化和处理
在一些实施方案中，生物样品可以被透化以促进物质(诸如探针)转移到样品中。如果样品没有被充分透化，则样品中物质(诸如探针)的量可能太低而不能够进行充分的分析。相反，如果组织样品渗透性太强，则组织样品内分析物的相对空间关系可能会丧失。因此，在充分透化组织样品以获得良好的信号强度的同时仍然保持样品中分析物分布的空间分辨率之间的平衡是理想的。
通常，生物样品可以通过将样品暴露于一种或多种透化剂来进行透化。用于此目的的合适试剂包括但不限于有机溶剂(例如，丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如，多聚甲醛)、去污剂(例如，皂苷、Triton X-100TM或Tween-20TM)和酶(例如，胰蛋白酶、蛋白酶)。在一些实施方案中，可以将生物样品与细胞透化剂一起温育，以促进样品的透化。用于样品透化的另外的方法描述于例如Jamur等人,Method Mol.Biol.588:63-66,2010，其全部内容以引用方式并入本文。任何合适的样品透化方法通常都可以与本文所述的样品结合使用。
在一些实施方案中，可以通过向样品中添加一种或多种裂解剂来透化生物样品。合适的裂解剂的实例包括但不限于生物活性试剂，诸如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和各种其他可商购获得的裂解酶。
可以另外地或可替代地将其他裂解剂添加到生物样品中以促进透化。例如，基于表面活性剂的裂解溶液可以用于裂解样品细胞。裂解溶液可以包含离子型表面活性剂，诸如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。更一般地，化学裂解剂可以包括但不限于有机溶剂、螯合剂、去污剂、表面活性剂和离液剂。
在一些实施方案中，生物样品可以通过非化学透化方法进行透化。可以使用的非化学透化方法包括但不限于物理裂解技术，诸如电穿孔、机械透化方法(例如，使用均化器和研磨球进行研磨珠击打以机械破坏样品组织结构)、声学透化(例如，超声处理)和热裂解技术，诸如加热以诱导样品的热透化。
在分析样品之前，可以向生物样品中添加另外的试剂以执行各种功能。在一些实施方案中，可以向样品中添加DNase和RNase灭活剂或抑制剂如蛋白质酶K和/或螯合剂如EDTA。例如，本文公开的方法可包括用于增加核酸的结合可及性的步骤，例如开放细胞中的DNA以供探针杂交的变性步骤。例如，可以使用蛋白质酶K处理来释放与其结合了蛋白质的DNA。
(ix)RNA种类的选择性富集
在一些实施方案中，当RNA是分析物时，可以选择性地富集一种或多种感兴趣的RNA分析物种类。例如，可以通过向样品中添加一种或多种寡核苷酸来选择一种或多种感兴趣的RNA种类。在一些实施方案中，另外的寡核苷酸是用于通过酶(例如，聚合酶)引发反应的序列。例如，可以使用与一种或多种感兴趣的RNA具有序列互补性的一种或多种引物序列来扩增一种或多种感兴趣的RNA，从而选择性地富集这些RNA。
可替代地，可以使用多种方法中的任何一种向下选择(例如，去除)一种或多种RNA种类。例如，可以向样品施用探针，其选择性地与核糖体RNA(rRNA)杂交，从而减少样品中rRNA的池和浓度。另外和可替代地，双链特异性核酸酶(DSN)处理可以去除rRNA(参见例如，Archer等人,Selective and flexibledepletion of problematic sequences from RNA-seq libraries at the cDNA stage,BMC Genomics,15 401,(2014)，其全部内容以引用方式并入本文)。此外，羟基磷灰石层析可以去除丰富的种类(例如，rRNA)(参见例如，Vandernoot,V.A.,cDNA normalization by hydroxyapatite chromatography to enrichtranscriptome diversity in RNA-seq applications,Biotechniques,53(6)373-80,(2012)，其全部内容以引用方式并入本文)。
生物样品可以包含一种或多种感兴趣的分析物。提供了用于进行多重测定以分析单个生物样品中的两种或更多种不同分析物的方法。
B.分析物
可以使用本文公开的方法和组合物来检测和分析多种不同的分析物。在一些方面，分析物可以包括待分析的任何生物物质、结构、部分或组分。在一些实施方案中，本文所述的任何靶核酸分子可以对应于分析物。例如，靶核酸分子可以是内源核酸分析物(例如，DNA或RNA)、内源核酸分析物的产物、直接或间接结合内源核酸分析物的探针、或者直接或间接结合内源核酸分析物的探针的产物。在一些方面，分析物可以包括待分析的任何生物物质、结构、部分或组分。在一些方面，本文公开的靶可以类似地包括任何感兴趣的分析物。在一些实例中，可以直接或间接检测靶或分析物。
分析物可以源自特定类型的细胞和/或特定的亚细胞区域。例如，分析物可以源自胞质溶胶、源自细胞核、源自线粒体、源自微粒体，并且更一般地，源自细胞的任何其他隔室、细胞器或部分。特异性地靶向某些细胞隔室和细胞器的透化剂可以用于从细胞中选择性地释放出分析物以进行分析，和/或允许一种或多种试剂(例如，用于分析物检测的探针)接近细胞或细胞隔室或细胞器中的分析物。
分析物可以包括任何生物分子或化学化合物，包括蛋白质或肽、脂质或核酸分子，或者小分子(包括有机分子或无机分子)。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒或其片段或产物。分析物可以是任何物质或实体，可以为其开发特异性结合配偶体(例如亲和结合配偶体)。这样的特异性结合配偶体可以是核酸探针(用于核酸分析物)并且可以直接导致RCA模板的生成。可替代地，可以将特异性结合配偶体偶联到核酸上，所述核酸可以使用RCA策略进行检测，例如在使用或产生可以作为RCA模板的环状核酸分子的测定中。
特别感兴趣的分析物可以包括核酸分子，诸如DNA(例如，基因组DNA、线粒体DNA、质体DNA、病毒DNA等)和RNA(例如，mRNA、微小RNA、rRNA、snRNA、病毒RNA等)；以及合成的和/或经修饰的核酸分子(例如，包括包含合成的或经修饰的核苷酸诸如LNA、PNA、吗啉代等或由这些物质组成的核酸结构域)；蛋白质分子，诸如肽、多肽、蛋白质或朊病毒、或者包括蛋白质或多肽组分等的任何分子、或其片段；或脂质或碳水化合物分子或包含脂质或碳水化合物组分的任何分子。分析物可以是单个分子或含有两个或更多个分子亚单元的复合物，所述分子亚单元例如包括但不限于蛋白质-DNA复合物，所述分子亚单元可以或可以不彼此共价结合并且它们可以是相同的或不同的。因此，除了细胞或微生物之外，这样的复合分析物也可以是蛋白质复合物或蛋白质相互作用物。因此，这样的复合物或相互作用可以是同源多聚体或异源多聚体。分子(例如蛋白质)的聚集体也可以是靶分析物，例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集体。分析物也可以是蛋白质或肽与核酸分子(诸如DNA或RNA)之间的复合物，例如蛋白质与核酸(例如，调控因子(诸如转录因子)与DNA或RNA)之间的相互作用物。
(i)内源分析物
在一些实施方案中，本文的靶分子对应于这样的分析物，其对于生物样品而言是内源的，并且可以包括核酸分析物和非核酸分析物。可以将本文公开的方法和组合物以任何合适的组合用于分析核酸分析物(例如，使用直接或间接与核酸分析物杂交的核酸探针或探针组，诸如第一探针和第二探针)和/或非核酸分析物(例如，使用包含报告寡核苷酸并且直接或间接与非核酸分析物结合的标记剂)。
非核酸分析物的实例包括但不限于脂质、碳水化合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接的或O-连接的)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体、蛋白质的泛素化变体、蛋白质的硫酸化变体、病毒衣壳蛋白、细胞外蛋白质和细胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，分析物在细胞内部或在细胞表面上，诸如跨膜分析物或附着于细胞膜的分析物。在一些实施方案中，分析物可以是细胞器(例如，细胞核或线粒体)。在一些实施方案中，分析物是细胞外分析物，诸如分泌的分析物。示例性分析物包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、细胞外基质蛋白、细胞表面蛋白的翻译后修饰(例如磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化或脂化)状态、缺口连接或粘附连接。
核酸分析物的实例包括DNA分析物，诸如单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、基因组DNA、甲基化DNA、特定甲基化DNA序列、片段化DNA、线粒体DNA、原位合成的PCR产物和RNA/DNA杂合体。DNA分析物可以是组织样品中存在的另一种核酸分子(例如，DNA或RNA(诸如mRNA))的转录物。
核酸分析物的实例还包括RNA分析物，诸如各种类型的编码和非编码RNA。不同类型的RNA分析物的实例包括信使RNA(mRNA)，包括新生RNA、前mRNA、初级转录RNA以及加工的RNA(诸如加帽的mRNA(例如，具有5'7-甲基鸟苷帽)、聚腺苷酸化mRNA(在3'末端的聚A尾)和一个或多个内含子已去除的剪接mRNA)。本文公开的分析物中还包括未加帽的mRNA、未聚腺苷酸化的mRNA和未剪接的mRNA。RNA分析物可以是组织样品中存在的另一种核酸分子(例如，DNA或RNA(诸如病毒RNA))的转录物。不翻译成蛋白质的非编码RNA(ncRNA)的实例包括转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，以及小的非编码RNA，诸如微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、细胞外RNA(exRNA)、小卡哈尔体(Cajal body)特异性RNA(scaRNAs)和长ncRNA(诸如Xist和HOTAIR)。RNA可以是小的(例如，长度小于200个核酸碱基)或大的(例如，长度大于200个核酸碱基的RNA)。小RNA的实例包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。RNA可以是细菌rRNA(例如，16s rRNA或23s rRNA)。
在本文所述的一些实施方案中，分析物可以是变性核酸，其中所得的变性核酸是单链的。核酸可以是变性的，例如，任选地使用甲酰胺、热或者甲酰胺和热两者变性的。在一些实施方案中，核酸没有被变性而用于本文公开的方法中。
在某些实施方案中，可以从活细胞中提取分析物。可以调整处理条件，以确保生物样品在分析期间保持活的，并且从样品的活细胞中提取(或释放)分析物。活细胞来源的分析物只能从样品中获得一次，或者可以从持续保持活的状态的样品中以一定间隔获得。
本文公开的方法和组合物可以用于分析任何数量的分析物。例如，被分析的分析物的数量可以是存在于样品的一个区域中或基底的单独特征内的至少约2种、至少约3种、至少约4种、至少约5种、至少约6种、至少约7种、至少约8种、至少约9种、至少约10种、至少约11种、至少约12种、至少约13种、至少约14种、至少约15种、至少约20种、至少约25种、至少约30种、至少约40种、至少约50种、至少约100种、至少约1,000种、至少约10,000种、至少约100,000种或更多种不同的分析物。
在本文所述的任何实施方案中，分析物包含靶序列。在一些实施方案中，靶序列可以是样品的内源序列、在样品中产生的序列、添加到样品中的序列或与样品中的分析物缔合的序列。在一些实施方案中，靶序列是单链靶序列。在一些实施方案中，分析物包含一个或多个单链靶序列。在一个方面，第一单链靶序列与第二单链靶序列不相同。在另一个方面，第一单链靶序列与一个或多个第二单链靶序列相同。在一些实施方案中，一个或多个第二单链靶序列包含在与第一单链靶序列相同的分析物(例如，核酸)中。可替代地，一个或多个第二单链靶序列包含在与第一单链靶序列不同的分析物(例如，核酸)中。
(ii)标记剂
在一些实施方案中，本文提供了使用一种或多种标记剂分析样品中的内源分析物(例如，RNA、ssDNA和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物)的方法和组合物。在一些实施方案中，分析物标记剂可以包括与分析物(例如，样品中的内源分析物)相互作用的试剂。在一些实施方案中，标记剂可以包含指示与标记剂相互作用的分析物或其部分的报告寡核苷酸。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴别标记剂的条形码序列。在一些情况下，被标记剂接触的样品可以进一步与探针(例如，单链探针序列)接触，所述探针与标记剂的报告寡核苷酸杂交，以便鉴定与标记剂缔合的分析物。在一些实施方案中，分析物标记剂包含分析物结合部分和标记剂条形码结构域，所述标记剂条形码结构域包含一个或多个条形码序列，例如与分析物结合部分和/或分析物对应的条形码序列。分析物结合部分条形码包括与分析物结合部分缔合或以其他方式鉴定分析物结合部分的条形码。在一些实施方案中，通过鉴定其相关的分析物结合部分条形码来鉴定分析物结合部分，也可以鉴定分析物结合部分所结合的分析物。分析物结合部分条形码可以是给定长度的核酸序列和/或与分析物结合部分缔合的序列。分析物结合部分条形码通常可以包括本文所述的条形码的方面中的任何一个。
在一些实施方案中，所述方法包括在使样品与一种或多种标记剂接触之后的一个或多个后固定步骤。
在本文所述的方法和系统中，能够结合于或以其他方式偶联至一个或多个特征的一种或多种标记剂可以用于表征分析物、细胞和/或细胞特征。在一些情况下，细胞特征包括细胞表面特征。分析物可以包括但不限于蛋白质、受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、缺口连接、粘附连接或它们的任何组合。在一些情况下，细胞特征可以包括细胞内分析物，诸如蛋白质、蛋白质修饰(例如，磷酸化状态或其他翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或它们的任何组合。
在一些实施方案中，结合物或分析物结合部分可以包括能够结合分析物(例如，生物分析物，例如，大分子成分)的任何分子或部分。标记剂可以包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、亲脂部分(诸如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接体、T细胞受体衔接体、B细胞受体衔接体、抗体前药、适体、单抗体、affimer、darpin和蛋白质支架或它们的任何组合。标记剂可以包括(例如，连接至)报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸指示结合基团所结合的细胞表面特征。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴别标记剂的条形码序列。例如，对一种类型的细胞特征(例如，第一细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的第一报告寡核苷酸，而对不同细胞特征(例如，第二细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的不同报告寡核苷酸。关于示例性标记剂、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429；美国专利公开20190177800；以及美国专利公开20190367969，这些专利均全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，分析物结合部分包括一种或多种抗体或其抗原结合片段。包括分析物结合部分的抗体或抗原结合片段可以特异性地结合靶分析物。在一些实施方案中，分析物是蛋白质(例如，生物样品(例如，细胞)表面上的蛋白质或细胞内蛋白质)。在一些实施方案中，包含多个分析物结合部分的多个分析物标记剂结合生物样品中存在的多种分析物。在一些实施方案中，所述多种分析物包括单个种类的分析物(例如，单个种类的多肽)。在其中所述多种分析物包括单个种类的分析物的一些实施方案中，所述多种分析物标记剂的分析物结合部分是相同的。在其中所述多种分析物包括单个种类的分析物的一些实施方案中，所述多种分析物标记剂的分析物结合部分是不同的(例如，所述多种分析物标记剂的成员可以具有两个或更多个种类的分析物结合部分，其中两个或更多个种类的分析物结合部分的每一个种类结合单个种类的分析物，例如在不同的结合位点)。在一些实施方案中，所述多种分析物包括多个不同种类的分析物(例如，多个不同种类的多肽)。
在其他情况下，例如为了促进样品复用，对特定细胞特征具有特异性的标记剂可以具有偶联至第一报告寡核苷酸的第一多种标记剂(例如，抗体或亲脂部分)和偶联至第二报告寡核苷酸的第二多种标记剂。
在一些方面，这些报告寡核苷酸可以包含一定核酸条形码序列，所述核酸条形码序列允许鉴定报告寡核苷酸与之偶联的标记剂。将寡核苷酸选择为报告子可以提供以下优点：能够在序列方面产生显著多样性，同时还易于连接至大多数生物分子(例如，抗体等)，而且是可检测的。
报告寡核苷酸连接(偶联)至标记剂可以通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或连接中的任何一种来实现。例如，寡核苷酸可以使用化学缀合技术(例如，可从InnovaBiosciences获得的抗体标记试剂盒)共价连接至标记剂(诸如蛋白质，例如抗体或抗体片段)的一部分，以及使用其他非共价连接机制进行连接，例如使用生物素酰化抗体和带有亲和素或链霉亲和素接头的寡核苷酸(或包括偶联至寡核苷酸的一个或多个生物素酰化接头的珠粒)。抗体和寡核苷酸生物素酰化技术是可用的。参见例如Fang等人,“Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling andAffinity Purification of Synthetic Oligonucleotides,”Nucleic Acids Res.2003年1月15日；31(2):708-715，其出于所有目的全文以引用方式并入本文。同样，蛋白质和肽生物素酰化技术已经被开发并且是现成的。参见例如美国专利号6,265,552，其出于所有目的以引用方式并入本文。此外，点击反应化学可以用于将报告寡核苷酸偶联到标记剂上。可商购获得的试剂盒(诸如来自Thunderlink和Abcam的那些)以及本领域中常见的技术可以在适当时用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。在另一个实例中，标记剂间接(例如，经由杂交)偶联至报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸包含鉴别该标记剂的条形码序列。例如，标记剂可以直接偶联(例如，共价结合)至杂交寡核苷酸，该杂交寡核苷酸包含与报告寡核苷酸的序列杂交的序列。杂交寡核苷酸与报告寡核苷酸的杂交将标记剂偶联至报告寡核苷酸。在一些实施方案中，诸如在施加刺激时，报告寡核苷酸可从标记剂释放。例如，报告寡核苷酸可以通过不稳定键(例如，化学不稳定、光不稳定、热不稳定等)连接至标记剂，如本文其他地方针对从支持物释放分子大体描述的。在一些情况下，本文所述的报告寡核苷酸可以包括一个或多个可以用于后续加工的功能序列。
在一些情况下，标记剂可以包含报告寡核苷酸和标签。标签可以是荧光团、放射性同位素、能够发生比色反应的分子、磁性颗粒或者能够检测的任何其他合适的分子或化合物。标签可以直接或间接缀合至标记剂(或报告寡核苷酸)(或，标签可以缀合至可结合于标记剂或报告寡核苷酸的分子)。在一些情况下，标签缀合至与报告寡核苷酸的序列互补(例如，杂交)的第一寡核苷酸。
在一些实施方案中，来自生物样品的多个不同种类的分析物(例如，多肽)可以随后与生物样品的一种或多种物理特性相关联。例如，多种不同种类的分析物可以与生物样品中分析物的位置相关联。这样的信息(例如，当分析物结合部分识别多肽时的蛋白质组信息)可以与其他空间信息(例如，来自生物样品的遗传信息，诸如DNA序列信息、转录组信息(例如，转录物序列)或两者)结合使用。例如，细胞的细胞表面蛋白可以与细胞的一种或多种物理特性(例如，细胞的形状、尺寸、活性或类型)相关联。所述一种或多种物理特性可以通过对细胞成像来表征。细胞可以被分析物标记剂结合，所述标记剂包含结合细胞表面蛋白的分析物结合部分和鉴定该分析物结合部分的分析物结合部分条形码。样品(例如，组织样品或细胞)中的蛋白质分析结果可以与样品中的DNA和/或RNA分析相关联。
(iii)内源分析物和/或标记剂的产物
在一些实施方案中，本文的靶分子是生物样品中内源分析物和/或标记剂的产物。在一些实施方案中，本文提供了用于分析生物样品中内源分析物和/或标记剂的一种或多种产物的方法和组合物。在一些实施方案中，分析了内源分析物(例如，病毒或细胞DNA或RNA)或产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物)或其衍生物。在一些实施方案中，分析了直接或间接结合生物样品中分析物的标记剂(或与其连接的报告寡核苷酸)。在一些实施方案中，分析了直接或间接结合生物样品中分析物的标记剂的产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物)或衍生物。
a.杂交
在一些实施方案中，内源分析物和/或标记剂的产物是杂交产物，其包含在两个不同分子内成对的基本上互补或互补的核酸序列，其中一个分子是内源分析物或标记剂(例如，与其连接的报告寡核苷酸)。另一个分子可以是另一种内源分子或另一种标记剂，诸如探针。配对可以通过任何方法实现，其中核酸序列通过碱基配对与基本上或完全互补的序列结合以形成杂交复合物。出于杂交的目的，如果两个核酸序列各自单独的碱基的至少60％(例如，至少70％、至少80％或至少90％)彼此互补，则这两个核酸序列是“基本上互补的”。
各种中间探针和中间探针组可以与内源分析物和/或标记剂(例如，与其连接的报告寡核苷酸)杂交，并且每个探针可以包含一个或多个条形码序列。示例性带条形码的探针或探针组可以基于挂锁探针、有缺口的挂锁探针、SNAIL(夹板核苷酸辅助分子内连接(Splint Nucleotide Assisted Intramolecular Ligation))探针组、PLAYR(RNA邻近连接测定法(Proximity Ligation Assay for RNA))探针组、PLISH(邻近连接原位杂交(Proximity Ligation in situ Hybridization))探针组、RNA模板化连接探针、L形探针(例如，在与其靶序列杂交时包含靶杂交序列及5’或3’突出部的探针)或U形探针(例如，在与其靶序列杂交时包含靶杂交序列及5’突出部和3’突出部的探针)。特定的探针或探针组设计可以变化。在一些实施方案中，第III节中描述的探针组(例如，连接形成复合探针的第一探针和第二探针)与生物样品中的靶核酸分子(例如，内源分析物分子)的序列杂交。
b.连接
在一些实施方案中，内源分析物和/或标记剂的产物是可以由本文提供的任何探针检测的连接产物。在一些实施方案中，在两种或更多种内源分析物之间形成连接产物。在一些实施方案中，在内源分析物与标记剂之间形成连接产物。在一些实施方案中，在两种或更多种标记剂之间形成连接产物。在一些实施方案中，连接产物是内源分析物的分子内连接。在一些实施方案中，连接产物是标记剂的分子内连接，例如，在与靶序列杂交时可环化探针或探针组的环化。靶序列可以包含在内源分析物(例如，核酸如基因组DNA或mRNA)或其产物(例如，来自细胞mRNA转录物的cDNA)中，或包含在标记剂(例如，报告寡核苷酸)或其产物中。在一些实施方案中，与生物样品中的靶核酸分子(例如，内源分析物分子)的序列杂交的第III节中描述的探针组(例如，连接形成复合探针的第一探针和第二探针)连接生成环状模板以生成扩增产物。在一些实施方案中，本文提供的方法包括从两种或更多种探针分子生成环状模板(例如，在第III节中公开的复合探针)，并且探针分子的5’末端序列和另一个探针分子的3’末端序列连接。在一些实施方案中，生成环状模板包括两个或更多个连接事件，其中至少一个连接事件使用靶核酸作为模板进行连接，并且至少另一个连接事件使用与靶核酸不同的夹板进行。夹板可以但不必包含与靶核酸杂交的区域。在一些实施方案中，在生成环状模板后，夹板(或其一部分)和/或靶核酸(或其一部分)可以用于使用环状模板作为模板引发滚环扩增。
在一些实施方案中，本文提供了能够进行DNA模板化连接(诸如从cDNA分子)的探针或探针组。参见例如美国专利8,551,710，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供了能够进行RNA模板化连接的探针或探针组。参见例如美国专利公开2020/0224244，其据此全文以引用方式并入。
c.引物延伸和扩增
在一些实施方案中，产物是分析物、标记剂、与分析物结合的探针或探针组(例如，与基因组DNA、mRNA或cDNA结合的探针)、或与标记剂结合的探针或探针组(例如，与来自相同或不同标记剂的一种或多种报告寡核苷酸结合的探针)的引物延伸产物。
引物通常是可以在核酸延伸反应中用作核酸聚合酶底物的具有3'末端的单链核酸序列。RNA引物由RNA核苷酸形成并且用于RNA合成，而DNA引物由DNA核苷酸形成并且用于DNA合成。引物也可以包含RNA核苷酸和DNA核苷酸(例如，以随机或设计的模式)两者。引物还可以包含本文所述的可以具有另外的功能的其他天然或合成核苷酸。在一些实例中，DNA引物可以用于引发RNA合成，反之亦然(例如，RNA引物可以用于引发DNA合成)。引物的长度可以变化。例如，引物可以是约6个碱基至约120个碱基。例如，引物可以包含多达约25个碱基。在一些情况下，“引物”可以指引物结合序列。引物延伸反应通常指两个核酸序列通过其相应末端互补核酸序列(例如，3’末端)的重叠而连接(例如，杂交)的任何方法。这样的连接之后可以是用另一个核酸序列作为延伸模板进行一个或两个末端的核酸延伸(例如，酶促延伸)。酶促延伸可以通过包括但不限于聚合酶和/或逆转录酶的酶来进行。
在一些实施方案中，内源分析物和/或标记剂的产物是一种或多种多核苷酸(例如，环状探针或可环化探针或探针组)的扩增产物。在一些实施方案中，通过执行滚环扩增(RCA)来实现扩增。在其他实施方案中，添加与环状探针或环化探针杂交的引物，并且原样用于扩增。在一些实施方案中，RCA包括线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合。
在一些实施方案中，扩增在或在约20℃与约60℃之间的温度下进行。在一些实施方案中，扩增在或在约30℃与约40℃之间的温度下进行。在一些方面，扩增步骤(诸如滚环扩增(RCA))在为或约25℃与为或约50℃之间的温度(诸如为或约25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、45℃、47℃或49℃)下进行。
在一些实施方案中，本文的产物包括在一系列反应中产生的分子或复合物，所述一系列反应例如以任何合适的组合的杂交、连接、延伸、复制、转录/逆转录和/或扩增(例如，滚环扩增)。例如，包含本文所公开的探针的靶序列的产物可以是由样品中的细胞核酸和外源添加的核酸探针形成的杂交复合物。外源添加的核酸探针可以任选地连接到细胞核酸分子或另一种外源核酸分子上。在其他实例中，包含本文公开的探针的靶序列的产物可以是可环化探针或探针组的RCA产物，其与细胞核酸分子(例如，基因组DNA或mRNA)或其产物(例如，转录物如cDNA、两个探针的DNA模板化连接产物或两个探针的RNA模板化连接产物)杂交。在其他实例中，包含本文公开的探针的靶序列的产物可以是与RCA产物杂交的探针。探针可以包含不与RCA产物杂交但与另一探针(例如，包含用于连接一个或多个修饰的核苷酸的第二突出部的探针)杂交的突出部。
C.靶序列和条形码
本文公开的探针或探针组(例如，第一探针或第二探针)的靶序列可以包含在本文公开的任何分析物中，包括内源分析物(例如，病毒或细胞核酸)、标记剂(例如，与其连接的报告寡核苷酸)、或内源分析物和/或标记剂的产物。
在一些方面，靶序列中的一个或多个包含一个或多个条形码，例如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个条形码。条形码可以在空间上解析生物样品中发现的分子组分，例如在细胞或组织样品内的分子组分。条形码可以以可逆或不可逆方式连接至分析物或另一个部分或结构(例如，探针)。条形码可以在样品中核酸分子的序列确定之前或期间加入到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的片段中。条形码可以允许鉴定和/或定量单独读段(例如，条形码可以是或可以包括独特分子标识符或“UMI”)。在一些方面，条形码包含约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或超过30个核苷酸。
在一些实施方案中，条形码包括一起充当单个条形码的两个或多个子条形码。例如，多核苷酸条形码可以包含被一个或多个非条形码序列分开的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。在一些实施方案中，一个或多个条形码还可以提供用于靶向功能的平台，诸如寡核苷酸、寡核苷酸-抗体缀合物、寡核苷酸-链霉亲和素缀合物、经修饰的寡核苷酸、亲和纯化、可检测部分、酶、用于检测测定或其他功能的酶、和/或用于多核苷酸的检测和鉴定的酶。
在本文的任何实施方案中，条形码可以使用任何合适的方法或技术来分析(例如，检测或测序)，包括本文所述的那些，诸如原位测序、靶向原位测序、荧光原位测序(FISSEQ)、边合成边测序(SBS)、边连接边测序(SBL)、边杂交边测序(SBH)或空间解析转录扩增子读出作图(STARmap)。在本文的任何实施方案中，本文提供的方法可以包括通过用多种标记的探针(例如，检测寡核苷酸)顺序杂交和检测来分析条形码。
在一些实施方案中，在条形码测序方法中，检测条形码序列以鉴定包含比条形码序列本身更长的核酸分子(DNA或RNA)的其他分子，这与直接测序更长的核酸分子相反。在一些实施方案中，给定N个碱基的测序读段，N聚体条形码序列包含4N的复杂性，并且与非条形码测序方法诸如直接测序相比，分子鉴定可能需要短得多的测序读段。例如，使用5个核苷酸的条形码序列可以鉴定1024个分子种类(45＝1024)，而8个核苷酸的条形码可以用于鉴定多达65,536个分子种类，这个数字大于人类基因组中不同基因的总数。在一些实施方案中，检测的是与靶分子相对应的条形码序列，而不是内源序列，就每个测序周期的信息量而言，这可以为高效读出。因为条形码序列是预先确定的，所以它们也可以被设计成表征错误检测和纠正机制，参见例如美国专利公开20190055594以及美国专利公开20210164039，其据此全文以引用方式并入。
III.核酸探针
本文在一些方面公开了被引入到细胞中或用于以其他方式接触生物样品(诸如组织样品)的核酸探针和/或探针组(例如，多核苷酸探针和/或探针组)。探针(例如，本文公开的第一探针、第二探针和/或复合探针)可以包含通常通过沃森-克里克碱基配对与核酸杂交的多种实体中的任何一种，诸如DNA、RNA、LNA、PNA等。核酸探针通常含有能够直接或间接与靶核酸的至少一部分结合的靶向序列。核酸探针可能能够与特定的靶核酸(例如，mRNA或如本文所讨论的其他核酸)结合。在一些实施方案中，核酸探针可以使用可检测标记和/或通过使用能够与核酸探针结合的二级核酸探针来检测。在一些实施方案中，核酸探针(例如，一级探针和/或二级探针)与一种或多种生物和/或化学反应相容。例如，本文公开的核酸探针可以充当聚合酶的模板或引物、连接酶的模板或底物、点击化学反应的底物和/或核酸酶(例如，用于切割或消化的核酸内切酶或核酸外切酶)的底物。
在一些实施方案中，本文提供了包含至少两种或更多种探针(例如，第一探针和第二探针)的核酸探针组(例如，分割的一级探针)，该至少两种或更多种探针可以连接形成复合探针(例如，环化探针)。在一些实施方案中，探针组包含至少两种或更多种探针，其中杂交区(例如，与靶核酸分子中的靶序列互补)和条形码区在第一探针和第二探针之间分割(例如，如图1所示)。在一些实施方案中，探针组包含在3’末端具有杂交区的第一探针，以及在5’末端具有杂交区的第二探针。在一些实施方案中，这两种探针各自包含条形码区的一部分，诸如待使用边杂交边测序(SBH)检测的条形码序列的分割部分或条形码序列的分割组合。在一些实施方案中，探针组包含在5’末端具有条形码区的第一部分的第一探针，以及在3’末端具有条形码区的第二部分的第二探针。在一些实施方案中，探针组包含在5’末端具有条形码区的第一部分并在3'末端具有杂交区的第一探针，以及在5'末端具有杂交区并在3’末端具有条形码区的第二部分的第二探针。
在一些实施方案中，可以使多于一种类型的二级核酸探针与样品接触，例如，同时或按任何合适的次序顺序接触，如在顺序探针杂交/去杂交循环中。在一些实施方案中，二级探针可以包含与复合探针的产物(例如，RCA产物)结合的探针，该复合探针由靶向分析物的第一探针和第二探针形成。在一些实施方案中，二级探针可以包含可检测探针(例如，中间探针，诸如L形探针)，其在与条形码区的第一部分和条形码区的第二部分相对应的序列处与复合探针的RCA产物杂交。在一些实施方案中，可以使多于一种类型的二级探针与样品接触，例如，同时或按任何合适的次序顺序接触，如在顺序探针杂交/去杂交循环中。在一些实施方案中，可以使多于一种类型的更高级核酸探针与样品接触，例如，同时或按任何合适的次序顺序接触，如在顺序探针杂交/去杂交循环中。在一些实施方案中，可以使多于一种类型的可检测地标记的核酸探针与样品接触，例如，同时或按任何合适的次序顺序接触，如在顺序探针杂交/去杂交循环中。在一些实施方案中，可检测地标记的探针可以包括与一种或多种一级探针(例如，第一探针和/或第二探针)、一种或多种二级探针、一种或多种更高级探针、一级/第二/更高级探针之间的一种或多种中间探针和/或一种或多种可检测地标记的或不可检测地标记的探针结合的探针(例如，在杂交链反应(HCR)、分支DNA反应(bDNA)等的情况下)。在一些实施方案中，可以使至少2、至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少300、至少1,000、至少3,000、至少10,000、至少30,000、至少50,000、至少100,000、至少250,000、至少500,000或至少1,000,000种可区分的核酸探针(例如，一级、二级、更高级探针和/或可检测地标记的探针)与样品接触，例如，同时或按任何合适的次序顺序接触。在本文公开的任何探针接触步骤之间，方法可以包括一个或多个介于中间的反应和/或处理步骤，如靶核酸的修饰、探针或其产物的修饰(例如，通过杂交、连接、延伸、扩增、切割、消化、分支迁移、引物交换反应、点击化学反应、交联、可检测标记的附接、激活光反应性部分等)、探针或其产物的去除(例如，切割掉探针的一部分和/或对整个探针去杂交)、信号修饰(例如，猝灭、掩蔽、光漂白、信号增强(例如，通过FRET)、信号放大等)、信号去除(例如，切割掉或永久灭活可检测标记)、交联、去交联和/或信号检测。
探针的靶结合序列(有时也称为杂交区、靶向区/序列或识别区/序列)可以位于探针内的任何地方。例如，与靶核酸结合的复合一级探针(例如，第一探针或第二探针)的杂交区可以在探针中任何条形码序列的5’或3’。在一些实施方案中，杂交区可以包含与靶核酸的一部分基本上互补的序列。在一些实施方案中，所述部分可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补的。
一级探针组(例如，第一探针或第二探针)的杂交区可以参照样品中存在或怀疑存在的靶核酸(例如，细胞RNA或细胞分析物的标记剂的报告寡核苷酸)来确定。在一些实施方案中，可以使用多于一个靶结合序列或杂交区来鉴定包含靶核酸或与靶核酸相关联的特定分析物。多于一个靶结合序列或杂交区可以在同一探针中或在不同探针中。例如，可以顺序和/或同时使用多种探针，其可以与相同的靶核酸的不同区域结合(例如，杂交)。在一些实施方案中，杂交区在第一探针和第二探针之间分割。在其他实例中，探针可以包含杂交区，该杂交区可以结合不同的靶核酸序列，例如相同基因的各种内含子和/或外显子序列(例如，用于检测剪接变体)，或者不同基因的序列，例如用于检测包含不同靶核酸序列的产物，诸如基因组重排(例如，倒位、转座、易位、插入、缺失、复制和/或扩增)。
在使核酸探针与样品接触之后，可以通过确定可检测标记(如果存在)来直接检测所述探针，和/或通过使用直接或间接与所述探针或其产物结合的一种或多种其他探针来检测所述探针。所述一种或多种其他探针可以包含可检测标记。例如，一级核酸探针或探针组(例如，包含第一探针和第二探针)可以结合样品中的靶核酸，并且可以引入二级核酸探针以结合一级核酸探针或探针组的扩增产物，其中随后可以使用可检测地标记的探针检测二级核酸探针或其产物。也可以使用直接或间接与二级核酸探针或其产物结合的更高级探针，并然后可以使用可检测地标记的探针来检测所述更高级探针或其产物。
在一些实施方案中，检测可以是空间的，例如，二维的或三维的。在一些实施方案中，检测可以是定量的，例如，可以确定一级核酸探针(和靶核酸)的量或浓度。在一些实施方案中，取决于应用，一级探针、二级探针、更高级探针和/或可检测地标记的探针可以包含能够与核酸杂交的多种实体中的任一种，例如，DNA、RNA、LNA和/或PNA等。
二级核酸探针可以包含识别序列，该识别序列能够与由第一探针和第二探针或其产物形成的复合探针结合或杂交，例如在由第一探针和第二探针形成的复合探针的条形码序列或其部分处，或在条形码序列或其部分的互补序列处(例如，在二级探针与一级探针的RCA产物杂交的情况下)。在一些实施方案中，二级核酸探针可以结合由第一探针和第二探针或其产物形成的复合探针中的条形码序列(其可以是连续的或彼此间隔的)的组合。在一些实施方案中，二级核酸探针可以结合在第一探针和第二探针或使用第一探针和第二探针作为模板生成的产物中的条形码序列的组合。在一些实施方案中，二级核酸探针可以结合在第一探针或第二探针或使用复合探针作为模板生成的产物中的条形码序列。在一些实施方案中，结合是特异性的，或者结合可以使得识别序列优先与存在的条形码序列或其互补序列中的仅一者结合或杂交。二级核酸探针还可以含有一种或多种可检测标记。如果使用多于一种二级核酸探针，则可检测标记可以相同或不同。
识别序列可以具有任何长度，并且相同或不同的二级核酸探针中的多个识别序列可以具有相同或不同的长度。如果使用多于一个识别序列，则识别序列可以独立地具有相同或不同的长度。例如，识别序列的长度可以是至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40或至少50个核苷酸。在一些实施方案中，识别序列的长度可以不超过48、不超过40、不超过32、不超过24、不超过16、不超过12、不超过10、不超过8或不超过6个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，识别序列可以具有5至8个核苷酸之间、6至12个核苷酸之间或7至15个核苷酸之间等的长度。在一个实施方案中，识别序列具有与一级核酸探针或其产物的条形码序列或其互补序列相同的长度。在一些实施方案中，识别序列可以与条形码序列或其互补序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％互补。
在一些实施方案中，核酸探针(诸如由第一探针和第二探针或二级核酸探针形成的复合探针)也可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个、20个或更多个、32个或更多个、40个或更多个或50个或更多个条形码序列。条形码序列可以位于核酸探针内的任何地方。在一些实施方案中，本文公开的分割条形码区可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个条形码序列。如果存在多于一个条形码序列，则条形码序列可以彼此相邻定位，和/或与其他序列穿插。在一些实施方案中，条形码序列中的两个或更多个也可以至少部分地重叠。在一些实施方案中，同一探针中的两个或更多个条形码序列不重叠。在一些实施方案中，同一探针中的所有条形码序列由至少一个磷酸二酯键彼此分开(例如，它们可以彼此紧邻但不重叠)，如分开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸。
本文公开的分割条形码区中的条形码序列可以是任何长度。如果使用多于一个条形码序列，则条形码序列可以独立地具有相同或不同的长度，如长度为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50个核苷酸。在一些实施方案中，条形码序列的长度可以不超过120、不超过112、不超过104、不超过96、不超过88、不超过80、不超过72、不超过64、不超过56、不超过48、不超过40、不超过32、不超过24、不超过16或不超过8个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，条形码序列可以在5至10个核苷酸之间、8至15个核苷酸之间等。
本文公开的分割条形码区中的条形码序列可以是任意的或随机的。在某些情况下，条形码序列选择为减少或最小化与样品中其他组分的同源性，例如，使得条形码序列本身不与怀疑在细胞或其他样品内的其他核酸结合或杂交。在一些实施方案中，在特定的条形码序列与另一序列(例如，样品中的细胞核酸序列或添加到样品中的探针中的其他条形码序列)之间，同源性可以小于10％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在一些实施方案中，同源性可以小于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个碱基，并且在一些实施方案中，所述碱基为连续碱基。
在一些实施方案中，本文公开的第一/第二探针对的群体中的不同条形码序列的数量小于核酸探针的不同靶(例如，核酸分析物和/或蛋白质分析物)的数量，但不同的靶仍然可以例如通过用条形码序列的不同组合编码探针而从彼此唯一地鉴定。然而，并非需要使用给定的一组条形码序列的所有可能组合。例如，每种探针可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个等或更多个条形码序列。在一些实施方案中，核酸探针的群体可以各自含有相同数量的条形码序列，但在其他情况下，各种探针上可以存在不同数量的条形码序列。
在一些实施方案中，一级探针组包含第一探针和第二探针，它们一起包含在这两种探针之间分割的条形码区。在一些情况下，第一探针包含条形码区的第一部分，并且第二探针包含条形码区的第二部分。在一些方面，当第一探针和第二探针与靶核酸杂交并连接或接合形成复合探针时，探针对的分割条形码区形成完整的条形码区。在一些实施方案中，第一探针可以包含第一杂交区和第一条形码序列，而不同的第二探针可以包含第二杂交区(不同于第一探针中的第一杂交区)和第二条形码序列。在一些情况下，条形码区的第一部分和第二部分可以各自包含如本文所述的一个或多个条形码序列。在一些情况下，连接在一起的条形码区的第一部分和第二部分形成如本文所述的条形码序列。
在一些实施方案中，第一探针和第二探针的条形码区的第一部分和第二部分可以分别包含相同或不同的条形码序列。作为说明性的实例，第一探针可以包含第一杂交区、第一条形码序列和第二条形码序列，而第二不同的探针可以包含第二杂交区(不同于第一探针中的第一杂交区)、与第一探针中相同的第一条形码序列，但是包含第三条形码序列而不是第二条形码序列。由此可以通过确定样品中给定位置处存在的或与给定探针相关联的各种条形码序列组合来区分此类探针。
在一些实施方案中，本文公开的核酸探针可以使用4个碱基中的仅2个或仅3个来制备，例如在探针内将所有“G”排除在外和/或将所有“C”排除在外。缺少“G”或“C”的序列可以形成非常小的二级结构，并且在某些实施方案中可以有助于更均匀、更快速的杂交。
在一些实施方案中，本文公开的核酸探针可以含有可检测标记如荧光团。在一些实施方案中，测定中使用的多种核酸探针中的一种或多种探针可能缺少可检测标记，而所述多种核酸探针中的一种或多种其他探针各自包含选自不同可检测标记(例如，红色、绿色、黄色和蓝色荧光团)的有限池的可检测标记，并且可检测标记的不存在可以用作单独的“颜色”。因此，并非在所有情况下都需要可检测标记。在一些实施方案中，本文公开的一级核酸探针或探针组(例如，第一探针和第二探针)缺乏可检测标记。虽然可以将可检测标记掺入到一级核酸探针或探针组(例如，第一探针和第二探针)的扩增产物中(诸如通过将修饰的核苷酸掺入到可环化或环化的探针的RCA产物中)，但是在一些实施方案中扩增产物不是可检测地标记的。在一些实施方案中，与由第一探针和第二探针或其产物形成的复合探针结合的探针(例如，与条形码区的序列或其互补序列或其产物结合的二级核酸探针)包含可检测标记，并且可以用于检测由第一探针和第二探针或其产物形成的复合探针。在一些实施方案中，本文公开的二级核酸探针缺少可检测标记，可以使用与二级核酸探针或其产物结合的可检测地标记的探针(例如，在二级核酸探针或其产物中的条形码序列或其互补序列处)来检测二级核酸探针或其产物。在一些实施方案中，与可检测地标记的探针相关联的信号可以用于检测二级探针中的一个或多个条形码序列和/或由第一探针和第二探针形成的复合探针中的一个或多个条形码序列，例如通过使用可检测地标记的探针的顺序杂交、边连接边测序和/或边杂交边测序。在一些实施方案中，条形码序列(例如，在由第一探针和第二探针形成的复合探针中)用于组合地编码多种感兴趣的分析物。因此，可以使用与生物样品中特定位置处可检测地标记的探针相关联的信号来产生各自对应于样品中的分析物的不同信号签名，从而鉴定特定位置处的分析物，例如，以对样品进行原位空间分析。
在一些实施方案中，本文的核酸探针包含一种或多种其他组分，如一种或多种引物结合序列(例如，以允许探针的酶促扩增)、酶识别序列(例如，用于核酸内切酶切割)等。核酸探针的组分可以按任何合适的次序布置。
在一些方面，分析物被一级探针组(例如，第一探针和第二探针)靶向，该一级探针组通过掺入包含一个或多个条形码序列(例如，可以被检测或以其他方式“被读取”的序列)的条形码区而带条形码，该一个或多个条形码序列与一级探针中直接或间接结合靶向的分析物的序列(例如，杂交区)分开。在一些方面，一级探针进而被二级探针靶向，该二级探针也通过掺入一个或多个条形码序列而带条形码，该一个或多个条形码序列与二级探针中直接或间接结合一级探针或其产物的识别序列分开。在一些实施方案中，二级探针可以结合由第一探针和第二探针形成的复合探针中的条形码序列。在一些实施方案中，二级探针可以结合RCA产物中条形码序列的互补序列，该RCA产物使用由第一探针和第二探针形成的复合探针作为模板而生成。在一些方面，可以使用三级探针和任选地甚至更高级探针来靶向二级探针，例如在二级探针或其产物中的条形码序列或其互补序列处。在一些实施方案中，三级探针和/或甚至更高级探针可以包含一个或多个条形码序列和/或一个或多个可检测标记。在一些实施方案中，三级探针为与二级探针(或其产物)的条形码序列(或其互补序列)杂交的可检测地标记的探针。在一些实施方案中，通过检测与样品中可检测地标记的探针相关联的信号，可以确定样品中一种或多种分析物的位置和分析物的身份。在一些实施方案中，可以在样品中原位分析特定分析物的存在/不存在、绝对或相对丰度、量、水平、浓度、活性和/或与另一种分析物的关系。
在一些实施方案中，本文提供了结合靶核酸检测、信号放大(例如，通过核酸扩增如RCA和/或多种可检测地标记的探针的杂交，如在杂交链反应等中)和条形码解码的探针、探针组和测定方法。
在一些方面，一级探针组、二级探针和/或更高级探针可以选自由环状探针、可环化探针和线型探针组成的组。在一些实施方案中，环状探针可以是在与靶核酸和/或一种或多种其他探针杂交之前预环化的探针。在一些实施方案中，可环化探针可以是可以在与靶核酸和/或一种或多种其他探针如夹板杂交时环化的探针。在一些实施方案中，线型探针可以是包含靶识别序列和不与靶核酸杂交的序列的探针，如5’突出部、3’突出部和/或接头或间隔物(其可以包含核酸序列或非核酸部分)。在一些实施方案中，序列(例如，5’突出部、3’突出部和/或接头或间隔物)不与靶核酸杂交，但可以彼此杂交和/或与一种或多种其他探针如可检测地标记的探针杂交。
具体的探针设计可以随应用而异。例如，本文公开的一级探针组、二级探针和/或更高级探针在与模板(例如，靶核酸和/或探针诸如夹板)杂交时可能需要缺口填充以环化。在一些实施方案中，本文公开的一级探针组、二级探针和/或更高级探针可以是有缺口的探针(例如，在与模板杂交时需要缺口填充以环化的探针)、L形探针(例如，在与靶核酸或探针杂交时包含靶识别序列及5’或3’突出部的探针)、U形探针(例如，在与靶核酸或探针杂交时包含靶识别序列、5’突出部和3’突出部的探针)、V形探针(例如，在与靶核酸或探针杂交时包含至少两个靶识别序列和靶识别序列之间的接头或间隔物的探针)、用于邻近连接的探针或探针组(诸如在全文以引用方式并入本文的US 7,914,987和US 8,580,504中描述的那些，以及用于同时检测和定量核酸分子和蛋白质-蛋白质相互作用的邻近连接测定法(PLA)的探针)或它们的任何合适组合。在一些实施方案中，本文公开的一级探针组、二级探针和/或更高级探针可以包含使用DNA模板化连接和/或RNA模板化连接来与其自身或另一探针连接的探针。在一些实施方案中，一级探针组中的第一探针和第二探针可以使用DNA模板化连接和/或RNA模板化连接来连接。在一些实施方案中，本文所公开的一级探针、二级探针和/或更高级探针可以是DNA分子，并且可以包含一种或多种其他类型的核苷酸、经修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物，如一种或多种核糖核苷酸。在一些实施方案中，一级探针组中的第一探针和/或第二探针是DNA分子。在一些实施方案中，一级探针组中的第一探针和/或第二探针包含核糖核苷酸。在一些实施方案中，连接可以是DNA模板上的DNA连接。在一些实施方案中，连接可以是RNA模板上的DNA连接，并且探针可以包括RNA模板化连接探针。在一些实施方案中，一级探针组中的第一探针和/或第二探针是RNA分子或包含一个或多个核糖核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的一级探针、二级探针和/或更高级探针可以包含可环化的探针(例如，挂锁样探针)或探针组。可以使用本文描述的探针设计的任何合适的组合。
在一些实施方案中，本文所述的探针组(例如，第一探针和第二探针)可以是可环化的探针或探针组，或者实际上更一般地，可环化的报告分子可以用于生成RCA模板，该RCA模板用于生成RCA产物。在一些实施方案中，探针或报告分子是具有可连接末端的线型分子的形式，其可以通过将末端直接或间接地彼此连接在一起，或者连接到插入(“缺口”)寡核苷酸的相应末端，或者连接到可环化RCA模板的延伸3’末端而被环化。可环化模板还可以以两个或更多个部分即两个或更多个分子(例如，寡核苷酸)提供，其可以连接在一起形成环。当所述RCA模板是可环化的时，其在RCA之前通过连接环化。连接可以使用连接模板进行模板化。在一些情况下，靶分析物可以提供连接模板，或者其可以单独提供。可环化的RCA模板(例如，复合探针)将在其相应3’和5’末端包含与连接模板中的对应同源互补区(或结合位点)互补的区域，在两端直接彼此连接的情况下，这些区域可能是相邻的，或在将发生间接连接的情况下，这些区域可能是不相邻的，中间有一个“缺口”序列。
在一些实施方案中，第一探针和第二探针的末端可以通过与充当连接模板的靶核酸分子(诸如靶分析物)上的相邻序列杂交而彼此接近，从而允许末端连接在一起形成环状核酸分子，允许环化探针(例如，复合探针)充当RCA反应的模板。在这样的实例中，与靶核酸分子杂交的第一探针和第二探针的末端序列将对所讨论的靶分析物是特异性的，并且将在RCA产物中重复复制。因此，它们可以充当指示该靶分析物的标记序列。因此，可以看出，RCA产物中的标记序列可以等同于靶分析物本身中存在的序列。可替代地，可以在第一探针和第二探针的非靶互补部分中提供标记序列(例如，标签或条形码序列)。在更进一步的实施方案中，标记序列可以存在于缺口寡核苷酸中，该缺口寡核苷酸在第一探针和第二探针的相应杂交末端之间杂交，其中这些探针与靶分子中不相邻的序列杂交。此类缺口填充探针类似于分子倒置探针。
在一些方面，第一探针和第二探针可以是能够与靶核酸分子(诸如靶分析物)杂交并被环化的线型核酸分子。在一些情况下，第一探针和第二探针的杂交区可以在彼此接近但不直接相邻的位点处与靶核酸分子杂交，从而在两个末端之间产生缺口。因此，为了填充第一杂交区和第二杂交区之间的第一探针和第二探针的两个末端之间的缺口，可能有必要提供聚合酶和核苷酸源或附加的缺口填充寡核苷酸，使得它可以被连接。
在一些实施方案中，本文公开的探针可以包含一个或多个区域，该一个或多个区域能够侵入和置换探针的一个或多个其他区域。这样的探针在单核苷酸多态性的检测中特别有用。因此，本公开的检测方法可以用于检测靶核酸序列中的单核苷酸多态性或实际上任何变体碱基。可以设计用于这种方法的探针，使得第一探针的3’可连接末端与感兴趣的靶分子中的核苷酸(变异核苷酸)互补并能够杂交，并且第二探针5’末端的5’附加序列(5’侧翼)的3’末端的核苷酸与相同的所述核苷酸互补，但被3’可连接末端阻止与其杂交(例如，它是置换的核苷酸)。切割第二探针以去除附加序列提供了5’可连接末端，如果3’可连接末端与靶核酸分子正确杂交(例如，互补)，则5’可连接末端可以连接到第一探针的3’可连接末端。根据该原理设计的探针(例如，如Krzywkowski等人,Nucleic Acids Research45,e161,2017和US2020/0224244中所述，这些文献以引用方式并入本文)在感兴趣的位置处提供了不同变体之间的高度区分，因为只有其中3’可连接末端与感兴趣的位置处的核苷酸互补的探针可以参与连接反应。
在一些实施方案中，本文公开的核酸探针可以由多种组分预组装，例如，在使核酸探针与靶核酸或样品接触之前。在一些实施方案中，本文公开的核酸探针可以在使靶核酸或样品与多种组分接触期间和/或之后组装。在一些实施方案中，本文公开的核酸探针在样品中原位组装。在一些实施方案中，所述多种组分可以按任何合适的次序和以任何合适的组合与靶核酸或样品接触。例如，第一探针和第二探针可以与靶核酸接触，以允许第一探针和/或第二探针与靶核酸之间的结合。任选地，可以在探针之间和/或探针中的任一者或两者与靶核酸之间进行涉及第一探针和第二探针和/或靶核酸的反应，诸如杂交、连接、引物延伸和/或扩增、化学或酶促切割、点击化学或它们的任何组合。在一些实施方案中，可以在反应之前、期间或之后添加任何附加组分。在一些实施方案中，核酸探针可以以逐步方式原位组装，每个步骤添加一种或多种组分，或在所有组分被组装在一起的动态过程中组装。一个或多个去除步骤(例如，通过诸如在严格条件下洗涤样品)可以在组装过程中的任何时间点进行，以在该时间点去除或去稳定不需要的中间体和/或组分，并增加精确探针组装和组装的探针(例如，由第一探针和第二探针形成的复合探针)的特异性靶结合的机会。
IV.探针连接和信号放大
在本文公开的任何实施方案中，探针可以包含分割的分析物特异性区域，诸如分割条形码区和/或基因特异性衔接子。例如，可以在两种或更多种探针中提供条形码区，该两种或更多种探针可以被组装(例如，通过连接)成包含条形码区中的条形码序列的特定探针或探针组。可以设计用于检测条形码序列的可检测探针，使得只检测正确组装的探针，而不检测包含不完整或嵌合条形码序列或区域的不正确探针。
例如，在边杂交边测序(SBH)测定法中，用挂锁或其他可环化的连接探针探测RNA仍然具有挑战性。这是因为目前可用的连接酶要么对RNA不是很高效(例如，对DNA更高效)，要么非常缺乏特异性(例如，产生大量非模板依赖性连接产物)。例如，连接酶在连接由RNA模板化的DNA末端时非常高效，但也具有非常高的非模板依赖性连接效率，并且在连接时不区分序列。当使用两个或更多个单独的探针对时，这可能导致错误的探针对(也称为嵌合体)。对于原位实验，这些错误的探针对不能被洗掉，因为环化探针被锁定在RNA周围并拓扑连接。在这些方法中，每个环化探针可以产生可以被解码的信号，并且不可能区分真阳性事件和假阳性事件。
在一些实施方案中，本文提供了用于减少假阳性事件(诸如SBH中的连接事件)的检测的改进方法和组合物。在一些方面，本文公开的方法可以用于核酸分析物和/或非核酸分析物(例如，蛋白质)的邻近测定法。在一些实施方案中，一种分析物可以与具有条形码(例如，SBH条形码)的第一部分的第一探针或探针组相关联，另一种分析物可以与具有条形码(例如，SBH条形码)的第二部分的第二探针或探针组相关联。在一些实施方案中，只有当分析物(例如，蛋白质)真正邻近时，才会生成可检测的信号。在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于非基于RCA的测定法。在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于HCR应用。在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于多重FISH应用。
在一些方面，所提供的方法涉及分析(例如，检测或确定)复合探针(例如，连接的第一探针和第二探针)和/或其产物或衍生物中存在的一个或多个序列。在一些情况下，对捕获的一个或多个图像进行分析，并且可以包括处理所述一个或多个图像和/或量化观察到的信号。例如，分析可以包括处理在样品的特定区域中检测到的一种或多种细胞类型、一种或多种类型的生物标志物、生物标志物的数量或水平、和/或细胞的数量或水平的信息。在一些实施方案中，分析包括检测序列，例如样品中存在的条形码。在一些实施方案中，分析包括小点(puncta)的定量(例如，如果检测到扩增产物)。在一些情况下，分析包括确定是否存在与来自特定面板的一种或多种生物标志物相关的特定细胞和/或信号。在一些实施方案中，可以将获得的信息与阳性和阴性对照相比较，或与特征的阈值相比较以确定样品是否表现出某种特征或表型。在一些情况下，信息可以包括来自细胞、区域的信号，和/或包括来自多个可检测标记的读数。在一些情况下，分析还包括显示来自分析或检测步骤的信息。在一些实施方案中，可以使用软件来使数据的处理、分析和/或显示自动化。
在一些实施方案中，本文公开的方法还可以包括一个或多个信号放大部件。在一些实施方案中，本公开涉及使用探针杂交原位检测核酸序列并产生与探针相关联的放大信号，其中背景信号减少、灵敏度增加。
A.探针连接
在一些实施方案中，探针或探针组中的至少一种探针包含本文公开的分割条形码区，以及与靶核酸杂交的分割杂交区。在一些实施方案中，除了形成正确连接的杂交区之外，分割条形码区必须与另一分割条形码区(例如，在另一探针中)正确配对，以便形成可检测的条形码区，而不正确或错配的探针对(“嵌合体”)是不可检测的。可以设计可检测探针，使得它们仅检测正确形成的条形码区，而不检测嵌合条形码区。在一些实施方案中，来自第一探针和第二探针的序列一起形成例如使用本文第V节中公开的方法可检测的条形码区。
图1显示了在与靶核酸分子杂交时，第一探针和第二探针可以经由第一部分和第二部分连接以形成复合探针，其中第一杂交区和第二杂交区可以连接以使复合探针环化。条形码区的第一部分和第二部分的连接以及第一杂交区和第二杂交区的连接可以由相同的连接酶或不同的连接酶催化，并且可以同时发生(例如，在相同的反应体积中)或以任何合适的顺序发生。
在一些实施方案中，在与靶核酸分子杂交时，第一探针和第二探针可以经由条形码区的第一部分和第二部分连接(例如，通过连接反应)以形成复合探针。可以使用与条形码区的序列杂交的可检测探针来检测复合探针，该条形码区可以包含一个或多个条形码序列，诸如与靶核酸分子或其序列相对应的条形码序列。在一些实施方案中，可检测探针可以在与条形码区的第一部分相对应的序列和与条形码区的第二部分相对应的序列处与条形码区杂交。在一些实施方案中，可检测探针可以与条形码区的第一部分的互补序列和条形码区的第二部分的互补序列杂交。滚环扩增(RCA)产物可以由复合探针或与复合探针杂交的探针生成。可以使用与RCA产物中条形码区的互补序列杂交的可检测探针来检测RCA产物。可以分析与可检测探针相关联的信号，以检测样品中的靶核酸分子或其序列。
在一些实施方案中，可以使用酶促连接或化学连接来连接第一杂交区和第二杂交区的末端，在连接之前有或没有缺口填充。在一些实施方案中，可以使用模板依赖性连接或非模板依赖性连接来连接第一杂交区和第二杂交区的末端，在连接之前有或没有缺口填充。在一些实施方案中，可以使用点击化学来连接第一杂交区和第二杂交区的末端。在一些实施方案中，可以使用具有DNA模板化连接酶活性的连接酶来连接第一杂交区和第二杂交区的末端，例如，当靶核酸分子包含DNA诸如标记剂的报告寡核苷酸时(例如，如图2A至图2E所示)。在一些实施方案中，可以使用具有RNA模板化连接酶活性的连接酶来连接第一杂交区和第二杂交区的末端，例如，当靶核酸分子包含RNA时，诸如当靶核酸分子是mRNA时。在一些实施方案中，第一杂交区和第二杂交区的末端包含末端DNA碱基和/或末端RNA碱基。例如，第一杂交区可以包含5’DNA碱基，而第二杂交区包含3’RNA碱基，或者第一杂交区可以包含3’RNA碱基，而第二杂交区包含5’DNA碱基。在一些实施方案中，可以使用具有RNA模板化DNA连接酶活性和/或RNA模板化RNA连接酶活性的连接酶来连接第一杂交区和第二杂交区的末端。在一些实施方案中，可以使用选自由以下项组成的组的连接酶来连接第一杂交区和第二杂交区的末端：小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶。在一些实施方案中，可以使用PBCV-1DNA连接酶或其变体或衍生物、T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2)或其变体或衍生物、或CircLigaseTM或其变体或衍生物来连接第一杂交区和第二杂交区的末端，任选地其中CircLigaseTM是CircLigaseTMI或CircLigaseTMII。在一些实施方案中，可以使用用于连接第一杂交区和第二杂交区的相同连接酶来连接条形码区的第一部分和第二部分。可替代地，在一些实施方案中，可以使用与用于连接第一杂交区和第二杂交区的连接酶不同的连接酶来连接条形码区的第一部分和第二部分。
在一些实施方案中，可以使用模板依赖性连接或非模板依赖性连接来连接条形码区的第一部分和第二部分的末端，在连接之前有或没有缺口填充。在一些实施方案中，可以使用点击化学来连接条形码区的第一部分和第二部分的末端。在一些实施方案中，可以使用选自由以下项组成的组的连接酶来连接条形码区的第一部分和第二部分的末端：小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶，任选地其中ssDNA连接酶是CircLigaseTM或其变体或衍生物，任选地其中CircLigaseTM是CircLigaseTMI或CircLigaseTMII。在一些实施方案中，可以使用夹板来连接条形码区的第一部分和第二部分的末端，该夹板与(i)第一部分或其子部分(例如，其序列)和(ii)第二部分或其子部分(例如，其序列)杂交，任选地其中该夹板是DNA分子。在一些实施方案中，夹板是单链DNA分子。
在一些实施方案中，连接涉及化学连接。在一些实施方案中，连接涉及模板依赖性连接。在一些实施方案中，连接涉及非模板依赖性连接。在一些实施方案中，连接涉及酶促连接。
在一些实施方案中，酶促连接涉及连接酶的使用。在一些方面，本文所用的连接酶包括通常用于将多核苷酸连接在一起或连接单个多核苷酸末端的酶。RNA连接酶、DNA连接酶或另一种连接酶可以用于将两个核苷酸序列连接在一起。连接酶包括ATP依赖性双链多核苷酸连接酶、NAD-i依赖性双链DNA或RNA连接酶和单链多核苷酸连接酶，例如在EC6.5.1.1(ATP依赖性连接酶)、EC 6.5.1.2(NAD+依赖性连接酶)、EC 6.5.1.3(RNA连接酶)中所述的任何一种连接酶。连接酶的具体实例包括细菌连接酶(诸如大肠杆菌DNA连接酶)、Tth DNA连接酶、热球菌属(Thermococcus)物种(菌株9°N)DNA连接酶(9°NTMDNA连接酶，NewEngland Biolabs)、Taq DNA连接酶、AmpligaseTM(Epicentre Biotechnologies)和噬菌体连接酶(诸如T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶和T7 DNA连接酶)以及它们的突变体。在一些实施方案中，连接酶是T4 RNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是splintR连接酶。在一些实施方案中，连接酶是单链DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是T4 DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是具有DNA夹板化DNA连接酶活性的连接酶。在一些实施方案中，连接酶是具有RNA夹板化DNA连接酶活性的连接酶。
在一些实施方案中，本文的连接是直接连接。在一些实施方案中，本文的连接是间接连接。“直接连接”意指多核苷酸的末端彼此紧邻杂交以形成连接酶的底物，从而导致它们彼此连接(分子内连接)。可替代地，“间接”意指多核苷酸的末端彼此不相邻地杂交，例如被一个或多个插入核苷酸或“缺口”隔开。在一些实施方案中，所述末端不直接彼此连接，而是通过一个或多个插入(所谓的“缺口”或“填充缺口的”(寡)核苷酸)的中间物或通过延伸探针的3'末端来“填充”与所述插入核苷酸对应的“缺口”而发生(分子间连接)。在一些情况下，多核苷酸的杂交末端之间的一个或多个核苷酸的缺口可以被一个或多个与夹板或靶核酸互补的“缺口”(寡)核苷酸“填充”。缺口可以是1个至60个核苷酸的缺口或1个至40个核苷酸的缺口或3个至40个核苷酸的缺口。在具体实施方案中，缺口可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸的缺口、在所示值之间的任何整数(或整数范围)个的核苷酸的缺口。在一些实施方案中，所述末端区域之间的缺口可以通过缺口寡核苷酸或通过延伸多核苷酸的3'末端来填充。在一些情况下，连接涉及将探针的末端连接到至少一个缺口(寡)核苷酸上，使得缺口(寡)核苷酸掺入到所得的多核苷酸中。在一些实施方案中，在本文的连接之前进行缺口填充。在其他实施方案中，本文的连接不需要缺口填充。
在一些实施方案中，多核苷酸连接产生的多核苷酸的解链温度高于未连接的多核苷酸的解链温度。因此，在一些方面，在后续步骤(包括扩增和检测)之前，连接稳定了含有连接的多核苷酸的杂交复合物。
在一些方面，使用高保真连接酶，诸如热稳定的DNA连接酶(例如，Taq DNA连接酶)。热稳定的DNA连接酶在升高的温度下有活性，通过在接近DNA链的解链温度(Tm)的温度下温育连接允许进一步的区分。与退火的完全碱基配对的底物相比，这选择性地降低了退火的错配底物的浓度(预期在错配周围具有稍低的Tm)。因此，高保真连接可以通过连接酶活性位点的固有选择性和平衡条件的组合来实现，以降低退火错配dsDNA的发生率。
在一些实施方案中，本文的连接是连接彼此邻近的两个(或更多个)核酸序列的邻近连接，例如，通过酶促手段(例如，连接酶)。在一些实施方式中，邻近连接可以包括“缺口填充”步骤，其涉及跨越两个感兴趣的核酸分子之间的距离，基于模板核酸分子的核酸序列，通过聚合酶掺入一个或多个核酸(参见例如美国专利号7,264,929，其全部内容以引用方式并入本文)。各种不同的方法可以用于邻近连接核酸分子，包括(但不限于)“粘性末端”和“平末端”连接。此外，单链连接可以用于在单链核酸分子上进行邻近连接。粘性末端邻近连接涉及在连接事件本身之前，待连接的两个核酸分子之间互补单链序列的杂交。平末端邻近连接通常不包括来自每个核酸分子的互补区域的杂交，因为两个核酸分子在连接位点处都缺乏单链突出部。
图2A至图2F显示了使用各自包含结合物(例如，抗体或其抗原结合部分)和报告寡核苷酸的一种或多种标记剂来原位检测分析物。在一些实施方案中，标记剂包含结合物(例如，抗体或其抗原结合部分)和报告寡核苷酸。结合物可以直接结合分析物或间接结合分析物，诸如通过一种或多种结合第一抗体的第二抗体(“任选的Ab”)。包含分割条形码区的探针可以与报告寡核苷酸杂交，并连接形成复合探针(例如，环化探针)。可以如图1所示的那样检测复合探针或其产物(例如，RCA产物)。在一些实施方案中，报告寡核苷酸包含与标记剂相对应的序列，因此对应于(例如，唯一地鉴定)标记剂标记的分析物(例如，蛋白质分析物)或细胞特征。在一些实施方案中，标记剂可以包含含有一个或多个条形码序列的报告寡核苷酸。因此，报告寡核苷酸可以是本文公开的核酸分析物，并且可以使用本文公开的任何方法进行分析。例如，如图2A所示，可以使用一对分割探针来分析直接或间接结合分析物(例如，蛋白质分析物)的标记剂的报告寡核苷酸。可以使用报告寡核苷酸作为杂交区连接的模板和/或使用夹板(未显示)作为分割条形码区中条形码连接的模板来连接(例如，环化)分割探针。
在一些实施方案中，分析物(核酸分析物或非核酸分析物)可以被两种标记剂(例如，抗体)特异性地结合，每种标记剂连接至报告寡核苷酸(例如，DNA)，该报告寡核苷酸可以参与邻近连接，例如，使用图2B或图2E所示的分割探针对，或图2C或图2D所示的分割探针对和连接体。分子间(例如，蛋白质和核酸之间，或者三种或更多种蛋白质和/或核酸之间)的相互作用也可以使用本文公开的探针来检测，例如，如图2F至图2G所示。例如，邻近连接反应可以包括连接至抗体对的报告寡核苷酸，如果抗体已经彼此接近(例如，通过结合相同的靶蛋白(复合物))，则这些抗体对可以通过连接而接合，然后形成的DNA连接产物用于使PCR扩增模板化，如例如等人,Methods.(2008),45(3):227-32中所述，该文献的全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，邻近连接反应可以包括报告寡核苷酸连接至抗体，每种抗体与结合对或复合物的一个成员结合，例如以便分析结合对或复合物的成员之间的结合。对于使用邻近的寡核苷酸检测分析物，参见例如美国专利申请公开号2002/0051986，其全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，邻近的两种分析物可以被两种标记剂(例如，抗体)特异性地结合，每种标记剂连接至报告寡核苷酸(例如，DNA)，所述报告寡核苷酸当邻近时当结合至它们各自的靶时可以参与连接、复制和/或序列解码反应。
在图2B中，可以使用夹板(未显示)来连接分割条形码区，并且可以使用平末端连接或粘性末端连接来连接第一杂交区和第一报告寡核苷酸(报告寡核苷酸1)之间的双链体以及第二杂交区和第二报告寡核苷酸(报告寡核苷酸2)之间的双链体。分割条形码区的夹板化连接和平末端或粘性末端的连接可以由相同的连接酶或不同的连接酶催化。例如，T4DNA连接酶可以用于催化夹板化连接和平末端或粘性末端连接。一旦分割探针对被环化，夹板就可以用作RCA的引物。可替代地，单独的引物(例如，与环化探针的非分析物特异性区域杂交的引物)可以用于引发RCA。图2E显示了包含两个分割条形码区(分割条形码区1和分割条形码区2)的分割探针对可以用于检测分析物(分析物1和分析物2)之间的相互作用。可以分别使用夹板1和夹板2来连接分割条形码区。分割条形码区1和分割条形码区2可以相同或不同。因此，夹板1和夹板2也可以相同或不同。报告寡核苷酸1和探针1之间的双链体和/或报告寡核苷酸2和探针2之间的双链体可以包含分别对应于分析物1或2(或分析物1或2的特异性结合物)的条形码序列。可以分别使用探针1和探针2作为模板，将报告寡核苷酸1和报告寡核苷酸2连接到夹板2。四个夹板连接中的任何两个或更多个夹板连接(两个在条形码区，并且两个在报告寡核苷酸和夹板2之间)可以被相同的连接酶或不同的连接酶催化，例如T4 DNA连接酶。在图2C和图2D中，连接体可以用于使报告寡核苷酸之间的连接模板化(图2C)或连接在报告寡核苷酸上模板化的两个连接(图2D)。未显示用于分割条形码连接的夹板，并且图2C和图2D中的任何两个或更多个夹板连接可以被相同的连接酶或不同的连接酶催化，例如T4 DNA连接酶。
在一些实施方案中，可以使用本文公开的分割探针对来分析一种或多种非核酸分析物(例如，蛋白质)和一种或多种核酸分子(例如，DNA或RNA)之间的相互作用。图2F显示了检测分析物和靶核酸分子之间的相互作用的实例。报告寡核苷酸可以直接或间接连接到分析物。例如，分析物可以是与报告寡核苷酸共价缀合的蛋白质。可替代地，报告寡核苷酸可以与直接或间接结合蛋白质的结合物(例如，抗体)共价缀合。报告寡核苷酸可以与探针1杂交，例如，在与分析物(例如，蛋白质)或其特定结合物相对应的任选条形码处杂交。分割条形码区可以包含如图所示的条形码1和条形码2。探针1中的条形码1和/或用于分析物(例如，蛋白质)的任选条形码可以对应于分析物或其特定结合物，而探针2中的条形码2可以对应于靶核酸分子。当分析物(例如，蛋白质)和靶核酸分子直接或间接相互作用和/或彼此接近时，形成包含分割探针对、夹板和报告寡核苷酸的杂交复合物。可以进行洗涤以去除非特异性杂交的分子。图2F中的任何两个或所有连接可以被相同的连接酶或不同的连接酶催化，例如T4 DNA连接酶。一旦分割探针被环化，夹板或单独的引物就可以用于使用环化探针作为模板来引发RCA。与RCA产物相关联的信号的原位检测可以用于基于接近度来分析分析物和靶核酸之间的相互作用。图2G显示了检测分析物1(例如，蛋白质1)、分析物2(例如，蛋白质2)和靶核酸分子(例如，DNA或RNA)之间的相互作用的实例。报告寡核苷酸1可以与探针1杂交，例如，在与分析物1(例如，蛋白质1)或其特定结合物相对应的任选条形码处杂交。同样，报告寡核苷酸2可以与探针2杂交，例如，在与分析物2(例如，蛋白质2)或其特定结合物相对应的任选条形码处杂交。分割条形码区可以包含如图所示的条形码1、条形码2和条形码3或多于三个条形码(未显示)。任何一个条形码都可以用于使报告寡核苷酸的连接模板化，而报告寡核苷酸又用作模板在分割条形码区中的条形码之间进行夹板化连接。图2G中的任何两个或所有连接可以被相同的连接酶或不同的连接酶催化，例如T4 DNA连接酶。一旦分割探针被环化，连接的报告寡核苷酸就可以被切割，并且切割的寡核苷酸可以用于引发RCA。可替代地，单独的引物可以用于使用环化探针作为模板来引发RCA。与RCA产物相关联的信号的原位检测可以用于基于接近度来分析这些分析物和靶核酸之间的相互作用。在图2B至图2G中的任一图中，分析物1和分析物2可以是核酸或非核酸分析物，例如蛋白质。分析物1和分析物2可以是单独的分子，例如，能够彼此非共价相互作用以形成复合物的两种蛋白质，诸如受体/配体对或酶的两个亚基。可替代地，分析物1和分析物2可以在同一分子中。例如，分析物1和分析物2可以是同一蛋白质中的两个结构域。
在一些实施方案中，本文公开的方法可以包括一个或多个信号放大部件，诸如RCA、HCR等。在其他实施方案中，本文公开的方法可以不包括信号放大部件。
B.滚环扩增(RCA)
在一些实施方案中，本文公开的探针(例如，通过连接第一探针和第二探针而形成的复合探针)通过滚环扩增进行扩增。在一些实施方案中，复合探针可以包含一个或多个条形码。在一些实施方案中，条形码由检测一级探针结合，检测一级探针不需要是荧光的，但包括靶结合部分(例如，用于与一种或多种一级探针杂交)和多个其他条形码(例如，二级条形码，相对于一级探针上的一级条形码而言)。在一些实施方案中，检测一级探针的条形码被可检测地标记的检测寡核苷酸如荧光标记的寡核苷酸靶向。在一些实施方案中，使用一个或多个解码方案来解码信号，如荧光，用于序列确定。示例性解码方案见述于Eng等人,“Transcriptome-scale Super-Resolved Imaging in Tissues by RNA SeqFISH+,”Nature 568(7751):235-239(2019)；Chen等人,“Spatially resolved,highlymultiplexed RNA profiling in single cells,”Science；348(6233):aaa6090(2015)；US10,457,980B2；US2016/0369329 A1；WO 2018/026873 A1；US2020/0080139A1；US20210017587A1；和US2017/0220733 A1中，所有这些文献均全文以引用方式并入。在一些实施方案中，这些测定使得能够同时实现信号放大、组合解码和纠错方案。
在一些实施方案中，该方法包括使用由第一探针和第二探针形成的复合探针，该复合探针在扩增反应(例如，RCA)中与感兴趣的核酸杂交。在一些实施方案中，RCA包括线型RCA。在一些实施方案中，RCA包括分支RCA。在一些实施方案中，RCA包括树状RCA。在一些实施方案中，RCA包括前述的任何组合。在一些实施方案中，环状核酸为使用连接形成的构建体。在一些实施方案中，使用模板引物延伸然后连接来形成环状构建体。在一些实施方案中，使用任何前述的组合来形成环状构建体。在一些实施方案中，连接为DNA-DNA模板化连接。在一些实施方案中，连接为RNA-RNA模板化连接。示例性的RNA模板化连接探针和方法见述于US2020/0224244中，其全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，连接为RNA-DNA模板化连接。在一些实施方案中，提供夹板作为连接的模板。在一些实施方案中，夹板是单链的。
在一些实施方案中，本文公开的探针(例如，第一探针或第二探针或复合探针)可以包含可以被结构特异性切割酶识别的5’侧翼，该切割酶例如为能够识别单链5’突出部和DNA双链体之间的连接并切割单链突出部的酶。应理解，为结构特异性切割酶的底物的支化三链结构可以由一个探针部分的5’末端和另一个探针部分的3’末端(当二者均已与靶核酸分子杂交时)以及由单部分探针的5’和3’末端形成。适合于此类切割的酶包括侧翼核酸内切酶(FENS)，其是一类具有核酸内切活性并且能够催化单链与双链DNA的衔接点处磷酸二酯键的水解切割的酶。因此，在一些实施方案中，通过结构特异性切割酶(例如，侧翼核酸内切酶)进行在第一靶特异性结合位点的5’处的附加序列的切割。合适的侧翼核酸内切酶见述于Ma等人,2000.JBC 275,24693-24700中和US2020/0224244中，并且可以包括P.furiosus(Pfu)、A.fulgidus(Afu)、M.jannaschii(Mja)或M.thermoautotrophicum(Mth)。在其他实施方案中，能够识别和降解具有游离5’末端的单链寡核苷酸的酶可以用于从如上所述的结构切割附加序列(5’侧翼)。因此，具有5’核酸酶活性的酶可以用于切割5’附加序列。这样的5’核酸酶活性可以是5’核酸外切酶活性和/或5’核酸内切酶活性。5’核酸酶能够识别单链寡核苷酸的游离5’末端并降解所述单链寡核苷酸。5’核酸外切酶通过将寡核苷酸从其5’末端降解成组成单核苷酸来降解具有游离5’末端的单链寡核苷酸。5’核酸内切酶活性可以在一个或多个核苷酸处内部切割5’侧翼序列。一旦该酶识别出游离5’末端，该酶就会穿过单链寡核苷酸到达双链体区域，并将单链区域切割成较大的组成核苷酸(例如，二核苷酸或三核苷酸)，或切割整个5’单链区域，从而发生5’核酸酶活性，例如如Lyamichev等人,1999.PNAS 96,6143-6148中针对Taq DNA聚合酶和其5’核酸酶所描述。具有5’核酸酶活性的优选酶包括核酸外切酶VIII，或来自水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌或黄色栖热菌的天然或重组DNA聚合酶，或来自其的核酸酶结构域。
在一些情况下，在环状复合探针核酸形成后，添加扩增引物。在其他情况下，扩增引物与一级和/或二级探针一起添加。在一些情况下，扩增引物也可以与靶核酸和复合探针互补。在一些实施方案中，进行洗涤步骤以去除任何未结合的探针、引物等。在一些实施方案中，洗涤为严格洗涤。洗涤步骤可以在过程期间的任何时间点进行以去除非特异性结合的探针、已连接的探针等。
在一些情况下，在存在适当的dNTP前体和其他辅因子的情况下添加DNA聚合酶后，扩增引物通过模板的多个拷贝的复制而被延长。扩增步骤可以利用等温扩增或非等温扩增。在一些实施方案中，在杂交复合物形成和任何随后的环化(诸如第一探针和第二探针连接形成复合探针)之后，环状复合探针发生滚环扩增而生成包含复合探针的多个拷贝的RCA产物(例如，扩增子)。
可以使用的DNA聚合酶的合适实例包括但不限于：大肠杆菌DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、VENTTMDNA聚合酶、DEEPVENTTMDNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、/>Hot Start Taq DNA聚合酶、/>TaqDNA聚合酶、Crimson Taq DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、Hemo/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>High-Fidelity DNA聚合酶、Platinum Pfx DNA聚合酶、AccuPrime Pfx DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Klenow片段、Pwo DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶。
在一些实施方案中，滚环扩增产物使用选自以下的聚合酶产生：Phi29 DNA聚合酶、Phi29样DNA聚合酶、M2 DNA聚合酶、B103 DNA聚合酶、GA-1DNA聚合酶、phi-PRD1聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(外切-)DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、DNA聚合酶III、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bst聚合酶、rBST DNA聚合酶、N29 DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶、T7RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶及其变体或衍生物。
在一些实施方案中，在存在适当的dNTP前体和其他辅因子的情况下添加DNA聚合酶后，引物被延伸以产生环状RCA模板的多个拷贝。该扩增步骤可以包括等温扩增和/或非等温扩增。在一些实施方案中，在杂交复合物形成和扩增探针或引物结合之后，杂交复合物发生滚环扩增而生成包含与环状模板互补的序列的多个拷贝的互补DNA扩增子(例如，多联体或纳米球)。滚环扩增(RCA)技术包括但不限于线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合。(参见例如，Baner等人,Nucleic Acids Research,26:5073-5078,1998；Lizardi等人,Nature Genetics 19:226,1998；Mohsen等人,Acc Chem Res.2016年11月15日；49(11):2540–2550；Schweitzer等人Proc.Natl Acad.Sci.USA 97:101 13-1 19,2000；Faruqi等人,BMC Genomics 2:4,2000；Nallur等人,Nucl.Acids Res.29:el 18,2001；Dean等人Genome Res.1 1:l095-1099,2001；Schweitzer等人,Nature Biotech.20:359-365,2002；美国专利号6,054,274、6,291,187、6,323,009、6,344,329和6,368,801)。用于RCA的示例性聚合酶包括DNA聚合酶，诸如phi29聚合酶、Klenow片段、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶(BST)、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I。在一些方面，可以采用已经被工程化或突变以具有期待的特征的DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是phi29 DNA聚合酶。
在一些方面，在扩增步骤期间，可以将经修饰的核苷酸添加到反应中，以将经修饰的核苷酸掺入扩增产物(例如，纳米球)中。经修饰的核苷酸的实例包括胺修饰的核苷酸。在所述方法的一些方面，例如，用于将所产生的扩增产物(例如，纳米球)锚定或交联到支架、细胞结构和/或其他扩增产物(例如，其他纳米球)上。在一些实例中，支架还含有修饰或官能团，所述修饰或官能团能够与探针组或扩增产物的修饰或官能团反应或掺入探针组或扩增产物的修饰或官能团。在一些实例中，支架可以包含寡核苷酸、聚合物或化学基团，以提供基质和/或支持结构。在一些方面，扩增产物包含经修饰的核苷酸，诸如胺修饰的核苷酸。在一些实施方案中，胺修饰的核苷酸包含丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺部分修饰。其他胺修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氨基烯丙基-dUTP部分修饰、5-炔丙基氨基-dCTP部分修饰、N6-6-氨基己基-dATP部分修饰或7-脱氮杂-7-炔丙基氨基-dATP部分修饰。
在一些方面，可以将多核苷酸和/或扩增产物(例如，扩增子)锚定到聚合物基质上。例如，聚合物基质可以是水凝胶。在一些实施方案中，可以对一种或多种多核苷酸探针进行修饰以含有官能团，该官能团可以用作将多核苷酸探针和/或扩增产物连接到聚合物基质(诸如3D基质)的锚定位点。根据所提供的实施方案可以采用的示例性修饰和聚合物基质包括例如US2016/0024555、US2018/0251833和US2017/0219465中描述的那些。3D基质可以包含共价或非共价连接到其上的多个核酸。3D基质可以是凝胶基质。3D基质可以是水凝胶基质。3D基质可以保存多个核酸分子的绝对或相对3D位置。在例如US2019/0276881、US2020/0071751、US2021/0292834、US2021/0230692和US2021/0310052中已经描述了用于将样品包埋在基质中的方法，这些文献全文以引用方式并入本文。
在一些情况下，基质形成材料可以用于形成3D基质。基质形成材料可以是可聚合的单体或聚合物，或可交联的聚合物。基质形成材料可以是聚丙烯酰胺、丙烯酰胺单体、纤维素、藻酸盐、聚酰胺、琼脂糖、葡聚糖或聚乙二醇。基质形成材料可以通过使用特定于基质形成材料的方法以及方法、试剂和条件使基质形成材料聚合和/或交联来形成基质。基质形成材料可以形成聚合物基质。基质形成材料可以形成聚电解质凝胶。基质形成材料可以形成水凝胶凝胶基质。
基质形成材料可以形成包含多个核酸的3D基质，同时保持核酸的空间关系。在这个方面，多个核酸可以固定在基质材料内。可以通过核酸与基质形成材料共聚来将多个核酸固定在基质材料内。也可以通过核酸与基质材料交联或以其他方式与基质形成材料交联来将多个核酸固定在基质材料内。也可以通过与基质的共价连接或通过与基质的配体-蛋白质相互作用来将多个核酸固定在基质内。
基质可以是多孔的，从而允许在核酸位点将试剂引入到基质中以用于核酸的扩增。可以根据各种方法制备多孔基质。例如，可以使用合适的丙烯酰胺∶双丙烯酰胺比率控制交联密度，使聚丙烯酰胺凝胶基质与acrydite改性的链霉亲和素单体和生物素酰化的DNA分子共聚。通过添加附加交联剂诸如官能化聚乙二醇，可以实现对分子筛尺寸和密度的附加控制。
3D基质可以是足够光学透明的，或者可以具有适用于高通量信息读出的序列确定化学和深度三维成像的光学特性。
扩增产物可以固定在基质内，通常在核酸被扩增的位置，从而产生扩增子的局部集落。扩增产物可以通过空间因素固定在基质内。扩增产物也可以通过共价键或非共价键固定在基质内。以这种方式，可以认为扩增产物连接到基质上。通过固定到基质上，诸如通过共价键或交联，保持了原始扩增子的尺寸和空间关系。通过固定到基质上，诸如通过共价键或交联，扩增产物对机械应力下移动或散开有抗性。
在一些方面，扩增产物共聚合和/或共价连接到周围的基质上，从而保留了它们的空间关系和任何其固有的信息。例如，如果扩增产物是由在基质中包埋的细胞内的DNA或RNA产生的那些，则扩增产物也可以被官能化以形成与基质的共价连接，保留它们在细胞内的空间信息，从而提供亚细胞定位分布模式。在一些实施方案中，所提供的方法涉及在水凝胶亚单元的存在下包埋一种或多种多核苷酸探针组和/或扩增产物，以形成一种或多种水凝胶包埋的扩增产物。在一些实施方案中，所描述的水凝胶-组织化学包括将核酸共价连接到用于组织清除、酶扩散和多循环序列确定的原位合成水凝胶上，而现有的水凝胶-组织化学方法则不能。在一些实施方案中，为了使扩增产物能够包埋在组织-水凝胶设置中，将胺修饰的核苷酸包含在扩增步骤(例如，RCA)中，使用丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯官能化为丙烯酰胺部分，并且与丙烯酰胺单体共聚合以形成水凝胶。
在一些实施方案中，RCA模板可以包含靶分析物或其一部分，其中靶分析物是核酸，或者RCA模板可以作为分析物的替代物或标记来提供或产生。如上所述，基于RCA的检测系统可以用于检测不同的分析物，例如，其中通过由在测定法中提供或生成的环状RCA模板生成RCA产物来提供信号，并且检测RCA产物以检测分析物。因此，RCA产物可以被视为报告分子，其被检测以检测靶分析物。然而，RCA模板也可以被视为靶分析物的报告分子；RCA产物是基于RCA模板产生的，并且包含RCA模板的互补拷贝。RCA模板决定了被检测到的信号，并且因此指示靶分析物。如下文将更详细描述的，RCA模板可以是探针或探针的一部分或组分，或者可以由探针产生，或者可以是检测测定的组分(例如，检测测定中的试剂)，其用作测定的报告分子、或报告分子的一部分、或信号产生系统。因此，用于产生RCA产物的RCA模板可以是环状(例如，环化的)报告核酸分子，即来自任何基于RCA的检测测定，所述检测测定使用或产生环状核酸分子作为测定的报告分子。
扩增后，例如通过使用可检测地标记的探针和成像来确定或以其他方式分析扩增子(例如，RCA产物)或其部分的序列。扩增产物的测序或分析可以包括边杂交边测序、边连接边测序和/或荧光原位测序，和/或其中原位杂交包括顺序荧光原位杂交。在一些情况下，使用例如本文描述的二级和更高级探针及检测寡核苷酸检测RCA产物的序列。
图1显示了示例性探针和使用该探针检测靶核酸分子(例如，RNA或DNA)的方法。包含靶核酸分子(例如，细胞核酸或标记剂的报告寡核苷酸)的样品可以同时或以任何合适的顺序与第一探针和第二探针接触。第一探针和第二探针分别包含与靶核酸分子杂交的第一杂交区和第二杂交区。第一探针和第二探针还分别包含条形码区的第一部分和第二部分。在与靶核酸分子杂交时，第一探针和第二探针可以经由第一部分和第二部分连接(例如，发生连接反应)以形成复合探针，其中第一杂交区和第二杂交区可以任选地连接以使复合探针环化。可以使用与条形码区的序列杂交的可检测探针来检测复合探针，该条形码区可以包含与靶核酸分子相对应的一个或多个条形码序列。滚环扩增(RCA)产物可以由复合探针或与复合探针杂交的探针生成。可以使用与RCA产物中条形码区的互补序列杂交的可检测探针来检测RCA产物。可检测探针可以用可检测标记(例如，荧光团)来标记和/或使用与可检测探针的序列(例如，在3’突出部或5’突出部)杂交的可检测地标记的探针进行检测。可以分析与可检测探针相关联的信号，以检测样品中的靶核酸分子。靶核酸分子可以是如图2所示的报告寡核苷酸。
在一些实施方案中，与夹板包含与(i)第一部分或其子部分和/或(ii)第二部分或其子部分的错配时相比，当夹板包含与(i)第一部分或其子部分和(ii)第二部分或其子部分互补的序列时，夹板更稳定地与条形码区杂交。在一些实施方案中，该方法包括去除包含与(i)第一部分或其子部分和/或(ii)第二部分或其子部分的错配的夹板，而在相同条件下，与(i)第一部分或其子部分和(ii)第二部分或其子部分互补的夹板保持稳定地与条形码区杂交以进行后续连接。
图3A至图3B说明了包含分割的基因特异性序列(例如，基因特异性衔接子和/或条形码序列)的探针可以用于提高检测特异性。图3A显示了使用包含基因特异性衔接子的探针来减少嵌合探针的形成的实例，该嵌合探针可能产生假阳性信号。在第一杂交区和第二杂交区与基因X序列(例如，mRNA)正确杂交时，可以使用与基因X特异性衔接子杂交的夹板来连接第一基因X特异性衔接子和第二基因X特异性衔接子。连接的基因X特异性探针可以环化并进行RCA，并且产生真阳性信号，从而检测基因X序列(图3A，左图)。有时基因Y探针可能不正确地靠近基因X探针进行杂交。因为基因X探针包含基因X特异性衔接子，而基因Y探针包含基因Y特异性衔接子，所以基因X特异性夹板和基因Y特异性夹板(未显示)都不能使探针末端靠近以进行连接。可以减少假阳性信号，因为没有生成基因X/基因Y嵌合探针连接或RCA产物(图3A，右图)。图3B显示了使用包含分割条形码序列的探针来减少假阳性信号检测的实例。在确实形成了嵌合探针和/或RCA产物的情况下(例如由于低杂交特异性和/或低连接酶保真度)，假阳性信号可以呈现为“不可见的”。由于只检测到真阳性信号，嵌合产物的存在不会干扰条形码序列的检测，例如用于边杂交边测序(SBH)。
图3A至图3B所示的优点并不相互排斥。例如，当使用基因特异性夹板使连接模板化时，图3B左图中的探针可以减少基因X/基因Y嵌合探针连接的形成。在一些情况下，由于所使用的试剂(例如，连接效率高但保真度低的连接酶)，嵌合探针形成的可能性很高。例如，杂交区可以使用RNA模板化连接酶(诸如)来连接，并且条形码区可以使用非模板依赖性连接(例如，使用CircLigaseTM)来连接。图3B右图显示了由于嵌合探针形成而产生的假阳性信号可以被滤除。
图4显示了减少用于条形码序列检测的假阳性信号的另一个实例。包含条形码区BC1(包含两个部分BC1a和BC1b)的RCA产物与用于BC1的可检测探针杂交。作为一个实例，BC1a和BC1b的长度可以各为8个核苷酸，并且可检测探针包含与BC1a和BC1b杂交的16个核苷酸的序列。特异性杂交的可检测探针产生与对应于待检测的正确分析物(例如，分析物1)的BC1相关联的真阳性信号。“假阳性”RCA产物可以由不正确连接的探针生成，例如，包含对应于分析物1的BC1a(或其互补序列)的第一探针连接到包含对应于分析物9的BC9b(或其互补序列)的第二探针。第二探针(针对分析物9)可以非特异性结合分析物1，并且第一探针和第二探针的杂交区可以由连接酶(例如，低保真度连接酶)连接，以生成包含BC1a+BC9b嵌合体的RCA产物，其中BC1a和BC9b的长度可以各自为8个核苷酸。然而，(用于BC1或BC9的)两种可检测探针都不能特异性结合BC1a+BC9b嵌合体，因为每种可检测探针只与一半的嵌合体杂交。用于BC1和BC9的可检测探针可以从BC1a+BC9b嵌合体中解离，从而没有检测到与“假阳性”RCA产物相关联的信号。相反，在相同条件下，用于BC1的可检测探针可以保持与包含BC1的正确RCA产物杂交。因此，假阳性信号可以呈现为“不可见的”。
C.其他信号放大方法
示例性的信号放大方法包括可检测反应性分子在探针杂交位点周围的靶向沉积、分支结构的靶向组装(例如，bDNA或使用锁定核酸(LNA)的分支测定法)、通过酶促滚环扩增(RCA)的多联体的程序化原位生长(例如，如在US2019/0055594中所述，该专利以引用方式并入本文)、杂交链反应、使用连续几轮化学连接的拓扑连环DNA结构的组装(clampFISH)、通过发夹介导的连环化的信号放大(例如，如在US2020/0362398中所述，该专利以引用方式并入本文)，例如引物交换反应，诸如通过交换反应的信号放大(SABER)或具有DNA交换的SABER(交换-SABER)。在一些实施方案中，可以使用非酶促信号放大方法。
可检测反应性分子可以包括酪胺，如用于酪胺信号放大(TSA)或多重催化报告沉积(CARD)-FISH中。在一些实施方案中，可检测反应性分子可以从可检测标记如荧光团释放和/或切割。在一些实施方案中，本文公开的方法包括生物样品的多重分析，包括探针杂交、荧光成像和信号去除的连续循环，其中信号去除包括从荧光团标记的反应性分子(例如，酪胺)去除荧光团。示例性的可检测反应性试剂和方法描述于US 6,828,109、US2019/0376956、US2022/0026433、US 2022/0128565和US2021/0222234中，所有这些文献均全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可以使用杂交链反应(HCR)实现信号放大。HCR是一种基于核酸分子的杂交触发链的无酶核酸扩增，从HCR单体开始，这些单体彼此杂交形成带切口的核酸聚合物。该聚合物是HCR反应的产物，其最终被检测以指示靶分析物的存在。HCR详细描述于Dirks和Pierce,2004,PNAS,101(43),15275-15278中以及US 7,632,641和US 7,721,721中(也参见US 2006/00234261；Chemeris等人,2008Doklady Biochemistry andBiophysics,419,53-55；Niu等人,2010,46,3089-3091；Choi等人,2010,Nat.Biotechnol.28(11),1208-1212；和Song等人,2012,Analyst,137,1396-1401)。HCR单体通常包含发夹或其他亚稳态核酸结构。在最简单的HCR形式中，当引入“引发剂”核酸分子时，两种不同类型的稳定发夹单体(这里称为第一和第二HCR单体)经历杂交链反应事件，形成带长切口的双链DNA分子。HCR单体具有发夹结构，该发夹结构包含双链茎区、连接茎区的两条链的环区和在双链茎区的一端处的单链区。当单体处于发夹结构中时暴露(并因此可用于与另一分子例如引发剂或其他HCR单体杂交)的单链区可以被称为“立足点区”(或“输入结构域”)。第一HCR单体各自还包含与第二HCR单体的暴露的立足点区中的序列互补的序列。第一HCR单体中的这种互补性序列可以被称为“相互作用区”(或“输出结构域”)。类似地，第二HCR单体各自包含相互作用区(输出结构域)，例如与第一HCR单体的暴露的立足点区(输入结构域)互补的序列。在不存在HCR引发剂的情况下，这些相互作用区受到二级结构的保护(例如，它们不暴露)，因此发夹单体是稳定的或动力学被困的(也称为“亚稳态”)，并保持为单体(例如，防止系统快速平衡)，因为第一和第二组HCR单体不能彼此杂交。然而，一旦引入引发剂，它就能够与第一HCR单体的暴露的立足点区杂交，并侵入它，导致其打开。这将暴露第一HCR单体的相互作用区(例如，与第二HCR单体的立足点区互补的序列)，从而允许其与立足点区处的第二HCR单体杂交并侵入第二HCR单体。这种杂交和侵入进而打开第二HCR单体，暴露其相互作用区(其与第一HCR单体的立足点区互补)，并允许其与另一第一HCR单体杂交并侵入另一第一HCR单体。反应以这种方式继续，直至所有HCR单体都被耗尽(例如，所有HCR单体都并入到聚合物链中)。最终，该链反应导致形成第一和第二单体物种的交替单元的带切口的链。因此需要HCR引发剂的存在以便通过与第一HCR单体杂交并侵入第一HCR单体来触发HCR反应。第一和第二HCR单体被设计成彼此杂交并因此可以定义为彼此同源。它们还与给定的HCR引发剂序列同源。彼此相互作用(杂交)的HCR单体可以被描述为一组HCR单体或HCR单体或发夹系统。在一些实施方案中，HCR引发剂包含用于与第一探针和/或第二探针的一部分杂交的序列。例如，HCR引发剂可以与条形码区的第一部分和条形码区的第二部分杂交。
HCR反应可以用多于两种物种或类型的HCR单体进行。例如，可以使用涉及三种HCR单体的系统。在这样的系统中，每个第一HCR单体可以包含与第二HCR单体的立足点区结合的相互作用区；每个第二HCR可以包含与第三HCR单体的立足点区结合的相互作用区；并且每个第三HCR单体可以包含与第一HCR单体的立足点区结合的相互作用区。然后，HCR聚合反应将如上所述进行，不同的是所得产物将是连续具有第一、第二和第三单体的重复单元的聚合物。可以使用具有更大数量的HCR单体组的对应系统。
在一些实施方案中，类似于使用发夹单体的HCR反应，线性寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)也可用于信号放大。在一些实施方案中，本文提供了一种检测样品中的分析物的方法，其包括：(i)进行线型寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)，其中使引发剂与至少第一和第二物种的多种LO-HCR单体接触以产生与靶核酸分子杂交的聚合LO-HCR产物，其中第一物种包含与引发剂互补的第一杂交区和与第二物种互补的第二杂交区，其中第一物种和第二物种是线型的单链核酸分子；其中所述引发剂以一个或多个部分提供，并且直接或间接与靶核酸分子杂交或包含在靶核酸分子中；以及(ii)检测聚合物产物，从而检测分析物。在一些实施方案中，第一物种和/或第二物种可以不包含发夹结构。在一些实施方案中，所述多种LO-HCR单体可以不包含亚稳态二级结构。在一些实施方案中，LO-HCR聚合物可以不包含分支结构。在一些实施方案中，进行线型寡核苷酸杂交链反应包括使靶核酸分子与引发剂接触以提供与靶核酸分子杂交的引发剂。在本文的任何实施方案中，靶核酸分子和/或分析物可以是RCA产物。用于LO-HCR的示例性方法和组合物见述于US2021/0198723中，其全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，核酸序列的原位检测包括用于分支信号放大的组件。在一些实施方案中，组件复合物包含直接或间接(通过一种或多种寡核苷酸)与复合探针或由其生成的RCA产物的序列杂交的放大器。在一些实施方案中，组件包括一个或多个放大器，每个放大器包括放大器重复序列。在一些方面，标记所述一个或多个放大器。本文描述了一种使用前述组件的方法，其包括例如在多重错误鲁棒荧光原位杂交(MERFISH)应用中使用该组件，其中分支DNA扩增用于信号读出。在一些实施方案中，放大器重复序列为约5-30个核苷酸，并且在放大器中重复N次。在一些实施方案中，放大器重复序列为约20个核苷酸，并且在放大器中重复至少两次。在一些方面，标记所述一个或多个放大器重复序列。对于示例性的分支信号放大，参见例如美国专利公开号US20200399689A1、US20220064697A1和Xia等人,Multiplexed Detection of RNA using MERFISH and branched DNAamplification.Scientific Reports(2019)，其每一者以引用方式完全并入本文。
在一些实施方案中，复合探针或由其生成的RCA产物的序列可以用特定方法来检测，该方法包括通过进行引物交换反应(PER)来进行信号放大。在各种实施方案中，在其3’末端上具有结构域的引物与催化发夹结合，并通过链置换聚合酶延伸出新结构域。例如，在其3’末端上具有结构域1的引物与催化发夹结合，并通过链置换聚合酶延伸出新结构域1，重复循环产生重复的结构域1序列的多联体。在各种实施方案中，链置换聚合酶为Bst聚合酶。在各种实施方案中，催化发夹包括释放链置换聚合酶的终止子。在各种实施方案中，分支迁移置换延伸的引物，然后延伸的引物可以解离。在各种实施方案中，引物经历重复循环而形成多联体引物。在各种实施方案中，使多种多联体引物与包含使用本文所述的方法产生的RCA产物的样品接触。在各种实施方案中，可以使RCA产物与多种多联体引物和多种标记的探针接触。关于示例性的分子和PER反应组分，参见例如美国专利公开号US20190106733，其以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，复合探针或由其生成的RCA产物的序列可以通过提供检测探针来检测，该检测探针诸如为用于进行形成扩增产物的链反应(例如，HCR)的探针。在一些实施方案中，分析包括确定扩增产物的全部或一部分的序列。在一些实施方案中，分析包括检测扩增产物中存在的序列。在一些实施方案中，扩增产物的全部或一部分的序列指示靶核酸中感兴趣的区域的身份。在其他实施方案中，所提供的方法涉及分析(例如，检测或确定)存在于多核苷酸探针中的一个或多个序列(例如，存在于第一和/或第二探针的突出部区域中的条形码序列)。
V.检测和分析
在一些实施方案中，该方法包括确定扩增产物的全部或一部分的序列，诸如存在于扩增产物中的一个或多个条形码序列。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括对扩增产物或探针的全部或一部分进行测序和/或与扩增产物或探针原位杂交。在一些实施方案中，序列确定步骤涉及边杂交边测序、边连接边测序和/或荧光原位测序、基于杂交的原位测序和/或其中原位杂交包括顺序荧光原位杂交。例如，如图5所示，包含分割的基因特异性序列(例如，基因特异性衔接子和/或条形码序列)的探针可以用于诸如边杂交边测序(SBH)之类的多重检测。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：(a)使生物样品与以下各项接触：(i)包含第一杂交区、测序引物结合位点和条形码区(例如，基因特异性衔接子)的第一部分的第一探针，以及(ii)包含第二杂交区和条形码区的第二部分的第二探针，其中第一杂交区和第二杂交区与生物样品中靶核酸分子中的靶序列互补；(b)通过连接条形码区的第一部分和第二部分来连接与靶核酸分子杂交的第一探针和第二探针以形成复合探针；(c)使复合探针与结合测序引物结合位点的测序引物接触；以及(d)通过使用测序引物进行边连接边测序(SBL)来确定条形码区的序列，其中该序列包含第一部分的序列和第二部分的序列。在错配的第一探针和第二探针被连接的情况下，由SBL确定的序列不存在于条形码池(例如，预先确定或预先关联的一组条形码和分析物)中，从而允许鉴定假阳性信号。
在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括检测通过杂交链反应(HCR)反应产生的聚合物，对于示例性的探针和HCR反应组分，参见例如US2017/0009278，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，检测或确定包括使用荧光团、同位素、质量标签或其组合标记的检测寡核苷酸与扩增产物杂交。在一些实施方案中，检测或确定包括对扩增产物成像。在一些实施方案中，靶核酸为组织样品中的mRNA，并且在靶核酸和/或扩增产物位于组织样品中原位时进行检测或确定。
在一些方面，所提供的方法包括对扩增产物(例如，扩增子)和/或多核苷酸的一个或多个部分成像，例如，通过检测探针的结合并检测可检测标记。在一些实施方案中，检测探针包含可以测量和定量的可检测标记。术语“标记”和“可检测标记”包含与待检测分子相关联(例如，与之缀合)的直接或间接可检测部分，例如可检测探针，包括但不限于荧光团、放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素或半抗原)等。
术语“荧光团”包括能够表现出在可检测范围内的荧光的物质或其一部分。可以根据所提供的实施方案使用的标记的特定实例包括但不限于藻红蛋白、Alexa染料、荧光素、YPet、CyPet、Cascade blue、别藻蓝蛋白、Cy3、Cy5、Cy7、罗丹明、丹酰、伞形酮、德克萨斯红、鲁米诺、吖啶酯、生物素、绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、NADPH、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶和脲酶。
组织样品中的荧光检测常常会因强背景荧光的存在而受到阻碍。“自发荧光”是用于区分背景荧光(其可以由多种来源产生，包括醛固定、细胞外基质组分、红细胞、脂褐素等)与来自荧光标记抗体或探针的所需免疫荧光的通用术语。组织自发荧光可能导致难以将归因于荧光抗体或探针的信号与一般背景区分开来。在一些实施方案中，本文公开的方法利用一种或多种试剂来减少组织自发荧光，例如自发荧光消除剂(Sigma/EMDMillipore)、TrueBlack脂褐素自发荧光淬灭剂(Biotium)、MaxBlock自发荧光减少试剂盒(MaxVision Biosciences)和/或非常强烈的黑色染料(例如，苏丹黑或相当的深色发色团)。
在一些实施方案中，可以使用含有可检测标记的可检测探针来检测本文所述的一种或多种多核苷酸和/或扩增产物(例如，扩增子)。在一些实施方案中，所述方法涉及将含有可检测标记的可检测探针与样品一起温育，洗涤未结合的可检测探针，和例如通过成像来检测标记。
可检测标记的实例包括但不限于各种放射性部分、酶、辅基、荧光标记、发光标记、生物发光标记、金属颗粒、蛋白质-蛋白质结合对和蛋白质-抗体结合对。荧光蛋白的实例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三吖嗪胺荧光素、丹酰氯和藻红蛋白。
生物发光标记的实例包括但不限于荧光素酶(例如，细菌、萤火虫和叩甲)、荧光素、水母素等。具有视觉可检测信号的酶系统的实例包括但不限于半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、磷酸酶、过氧化物酶和胆碱酯酶。可鉴定标记还包括放射性化合物如125I、35S、14C或3H。可鉴定标记可从多种来源商购获得。
荧光标记和与这样的荧光标记缀合的核苷酸和/或多核苷酸的实例包括例如以下中描述的那些：Hoagland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,第九版(Molecular Probes,Inc.,Eugene,2002)；Keller和Manak,DNA Probes,第2版(Stockton Press,New York,1993)；Eckstein,editor,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；以及Wetmur,CriticalReviews in Biochemistry and Molecular Biology,26:227-259(1991)。在一些实施方案中，适用于所提供的实施方案的示例性技术和方法包括例如US 4,757,141、US 5,151,507和US 5,091,519中描述的那些。在一些实施方案中，使用一种或多种荧光染料作为标记的靶序列的标记，例如，如以下中所述：US 5,188,934(4,7-二氯荧光素染料)；US 5,366,860(可光谱解析的罗丹明染料)；US 5,847,162(4,7-二氯罗丹明染料)；US 4,318,846(醚取代的荧光素染料)；US 5,800,996(能量转移染料)；US 5,066,580(黄嘌呤染料)；和US 5,688,648(能量转移染料)。也可以用量子点进行标记，如US 6,322,901、US 6,576,291、US 6,423,551、US 6,251,303、US 6,319,426、US 6,426,513、US 6,444,143、US 5,990,479、US6,207,392、US2002/0045045和US2003/0017264中所述。如本文所用，术语“荧光标记”包含信号传导部分，其通过一种或多种分子的荧光吸收和/或发射性质传送信息。示例性的荧光性质包括荧光强度、荧光寿命、发射谱特性和能量转移。
容易掺入到核苷酸和/或多核苷酸序列中的可商购获得的荧光核苷酸类似物的实例包括但不限于Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)、荧光素-！2-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、德克萨斯红TM-5-dUTP、CASCADE BLUETM-7-dUTP、BODIPY TMFL-14-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、BODIPY TMTR-14-dUTP、RHOD AMINE GREENTM-5-dUTP、OREGON GREENRTM488-5-dUTP、德克萨斯红TM-l2-dUTP、BODIPYTM630/650-14-dUTP、BODIPYTM650/665-14-dUTP、ALEXA FLUORTM488-5-dUTP、ALEXAFLUORTM532-5-dUTP、ALEXA FLUORTM568-5-dUTP、ALEXA FLUORTM594-5-dUTP、ALEXAFLUORTM546-14-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、德克萨斯红TM-5-UTP、mCherry、CASCADE BLUETM-7-UTP、BODIPYTMFL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、BODIPYTMTR-14-UTP、RHOD AMINE GREENTM-5-UTP、ALEXA FLUORTM488-5-UTP和ALEXA FLUORTM546-14-UTP(Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.)。用于定制合成具有其他荧光团的核苷酸的方法包括Henegariu等人,(2000)Nature Biotechnol.18:345，其全文以引用方式并入本文。
可得到的用于合成后附着的其他荧光团包括但不限于ALEXA FLUORTM350、ALEXAFLUORTM532、ALEXA FLUORTM546、ALEXA FLUORTM568、ALEXA FLUORTM594、ALEXA FLUORTM647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、丹酰、丽丝胺罗丹明B、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 514、太平洋蓝、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明、德克萨斯红(可得自Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)、Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)。还可以使用FRET串联荧光团，包括但不限于PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、APC-Cy7、PE-Alexa染料(610、647、680)和APC-Alexa染料。
在一些情况下，可以使用金属银或金颗粒来增强来自荧光标记的核苷酸和/或多核苷酸序列的信号(Lakowicz等人,(2003)Bio Techniques 34:62)。
生物素或其衍生物也可以用作核苷酸和/或多核苷酸序列上的标记，并随后由可检测地标记的抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白衍生物(例如，藻红蛋白缀合的链霉抗生物素蛋白)或可检测地标记的抗生物素抗体结合。地高辛可以作为标记掺入并随后由可检测地标记的抗地高辛抗体(例如，荧光素化抗地高辛)结合。氨基烯丙基-dUTP残基可以掺入到多核苷酸序列中并随后与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)衍生的荧光染料偶联。一般来说，缀合物对的任何成员都可以掺入到检测多核苷酸中，条件是可检测地标记的缀合物配对物可以结合以允许检测。如本文所用，术语抗体是指任何类别的抗体分子或其任何子片段，如Fab。
针对多核苷酸序列的其他合适的标记可以包括荧光素(FAM)、地高辛、二硝基苯酚(DNP)、丹酰、生物素、溴脱氧尿苷(BrdU)、六聚组氨酸(6xHis)和磷-氨基酸(例如，P-tyr、P-ser、P-thr)。在一些实施方案中，使用以下半抗原/抗体对进行检测，其中每种抗体都用可检测标记衍生化：生物素/a-生物素、地高辛/a-地高辛、二硝基苯酚(DNP)/a-DNP、5-羧基荧光素(FAM)/a-FAM。
在一些实施方案中，核苷酸和/或多核苷酸序列可以被间接标记，尤其是用半抗原标记，然后半抗原被捕获剂结合，例如在US 5,344,757、US 5,702,888、US 5,354,657、US5,198,537和US 4,849,336以及PCT公开WO 91/17160中公开的。许多不同的半抗原-捕获剂对可供使用。示例性的半抗原包括但不限于生物素、脱生物素(des-biotin)和其他衍生物、二硝基苯酚、丹酰、荧光素、Cy5和地高辛。对于生物素，捕获剂可以是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或抗体。抗体可以用作其他半抗原的捕获剂(许多染料-抗体对可商购获得，例如，Molecular Probes,Eugene,Oreg.)。
在一些方面，分析和/或序列确定可以在室温下进行，以在低背景噪声和减少错误的情况下最好地保存组织形态。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括随着测序的进行消除错误累积。
在一些实施方案中，分析和/或序列确定涉及洗涤以去除未结合的多核苷酸，其后显露荧光产物以便成像。
在一些方面，检测涉及使用检测方法，诸如流式细胞术；测序；探针结合和电化学检测；pH改变；由与DNA标签结合的酶诱导的催化作用；量子纠缠；拉曼光谱；太赫兹波技术；和/或扫描电子显微术。在一些方面，流式细胞术为质量细胞术或荧光激活的流式细胞术。在一些方面，检测包括进行显微术、扫描质谱法或本文描述的其他成像技术。在这样的方面，检测包括测定信号，例如荧光信号。
在一些方面，使用许多不同类型的显微术中的任何一种来进行检测(包括成像)，例如共聚焦显微术、双光子显微术、光场显微术、完整组织扩张显微术和/或CLARITYTM-优化的光片显微术(COLM)。
在一些实施方案中，使用荧光显微术来进行检测探针的检测和成像。在一些方面，荧光显微镜为光学显微镜，其使用荧光和磷光代替或补充反射和吸收来研究有机或无机物质的性质。在荧光显微术中，用在样品中激发荧光的波长的光照射样品。然后通过显微镜物镜对荧光成像，荧光波长通常比照射波长长。该技术中可以使用两个滤光片；照射(或激发)滤光片，其确保照射接近单色且在正确的波长下，和第二发射(或屏障)滤光片，其确保没有激发光源到达检测器。或者，这些功能都可以由单个二向色滤光片实现。“荧光显微镜”包括使用荧光来生成图像的任何显微镜，无论其是像落射荧光显微镜这样的更简单的装置，还是像共聚焦显微镜这样的更复杂的设计，其都使用光学切片来获得荧光图像的更好分辨率。
在一些实施方案中，使用共聚焦显微术来进行检测探针的检测和成像。共聚焦显微镜使用点照射和检测器前方光学共轭平面中的针孔来消除离焦信号。由于只能检测到非常靠近焦平面的荧光产生的光，故图像的光学分辨率，特别是在样品深度方向上，比宽视场显微镜要好得多。然而，由于来自样品荧光的许多光在针孔处被阻挡，故分辨率的这种提高是以信号强度的降低为代价的——因此通常需要长的曝光时间。由于一次仅照射样品中的一个点，故2D或3D成像需要在试样中以规则光栅(例如，平行扫描线的矩形图案)扫描。焦平面的可实现厚度主要由所用光的波长除以物镜的数值孔径限定，但也由试样的光学性质限定。薄光学切片使得这些类型的显微镜在样品的3D成像和表面轮廓分析方面特别好。CLARITYTM-优化的光片显微术(COLM)提供了用于大型澄清样品的快速3D成像的替代显微术。COLM询问大型免疫染色组织，允许提高采集速度并产生更高质量的生成数据。
可以采用的其他类型的显微术包括明场显微术、斜照显微术、暗场显微术、相差显微术、微分干涉差(DIC)显微术、干涉反射显微术(也称为反射干涉差或RIC)、单平面照明显微术(SPIM)、超高分辨率显微术、激光显微术、电子显微术(EM)、透射电子显微术(TEM)、扫描电子显微术(SEM)、反射电子显微术(REM)、扫描透射电子显微术(STEM)和低电压电子显微术(LVEM)、扫描探针显微术(SPM)、原子力显微术(ATM)、弹道电子发射显微术(BEEM)、化学力显微术(CFM)、导电原子力显微术(C-AFM)、电化学扫描隧道显微镜(ECSTM)、静电力显微术(EFM)、流体力显微镜(FluidFM)、力调制显微术(FMM)、特征导向扫描探针显微术(FOSPM)、开尔文探针力显微术(KPFM)、磁力显微术(MFM)、磁共振力显微术(MRFM)、近场扫描光学显微术(NSOM)(或SNOM、扫描近场光学显微术、SNOM、压电响应力显微术(PFM)、PSTM、光子扫描隧道显微术(PSTM)、PTMS、光热显微光谱/显微术(PTMS)、SCM、扫描电容显微术(SCM)、SECM、扫描电化学显微术(SECM)、SGM、扫描门显微术(SGM)、SHPM、扫描霍尔探针显微术(SHPM)、SICM、扫描离子电导显微术(SICM)、SPSM自旋偏振扫描隧道显微术(SPSM)、SSRM、扫描扩散电阻显微术(SSRM)、SThM、扫描热显微术(SThM)、STM、扫描隧道显微术(STM)、STP、扫描隧道电位法(STP)、SVM、扫描电压显微术(SVM)、同步加速器x-射线扫描隧道显微术(SXSTM)和完整组织扩张显微术(exM)。
在一些实施方案中，序列确定(例如，使用探针杂交的测序和/或序列检测)可以在原位进行。原位序列确定可以涉及以顺序的、模板依赖性方式掺入标记的核苷酸(例如，荧光标记的单核苷酸或二核苷酸)或使标记的引物(例如，标记的无规六聚体)与核酸模板杂交使得可以确定掺入的核苷酸或标记的引物延伸产物的身份(例如，核苷酸序列)，并因此确定相应的模板核酸的核苷酸序列。原位序列确定的方面描述于例如Mitra等人,(2003)Anal.Biochem.320,55-65和Lee等人,(2014)Science,343(6177),1360-1363中。此外，用于进行原位序列确定的方法和系统的实例描述于US2016/0024555、US2019/0194709中以及US10,138,509、US10,494,662和US.10,179,932中。用于原位序列确定的示例性技术包括但不限于STARmap(描述于例如Wang等人,(2018)Science,361(6499)5691中)、MERFISH(描述于例如Moffitt,(2016)Methods in Enzymology,572,1-49中)、基于探针杂交的序列确定(例如，描述于例如Gyllborg等人,Nucleic Acids Res(2020)48(19):e112中)以及FISSEQ(描述于例如US2019/0032121中)。
在一些实施方案中，序列确定可以通过边合成边测序(SBS)来进行。在一些实施方案中，测序引物与一个或多个条形码处或附近的序列互补。在这样的实施方案中，边合成边测序可以包括逆转录和/或扩增以生成引物序列可从其结合的模板序列。示例性SBS方法包括例如但不限于US 2007/0166705、US2006/0188901、US 7,057,026、US2006/0240439、US2006/0281109、US 2011/005986、US2005/0100900、US 9,217,178、US2009/0118128、US2012/0270305、US 2013/0260372和US2013/0079232描述的那些。
在一些实施方案中，核酸(例如，包含条形码序列的核酸诸如探针或RCA产物)的序列确定可以通过探针的顺序杂交(例如，边杂交边测序和/或顺序原位荧光杂交)来进行。顺序杂交可以涉及包含寡核苷酸和可检测标记的可检测探针的顺序杂交。在一些实施方案中，本文公开的方法包括本文公开的可检测探针的顺序杂交，包括可检测地标记的探针(例如，荧光团缀合寡核苷酸)和/或本身未被可检测地标记但能够结合可检测地标记的探针(例如，经由核酸杂交)并被可检测地标记的探针检测的探针。包含可检测探针的顺序荧光杂交的示例性方法见述于US2019/0161796、US2020/0224244、US2022/0010358、US2021/0340618和WO 2021/138676中，所有这些文献均以引用方式并入本文。在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括通过用多种标记的探针(例如，检测寡核苷酸)顺序杂交和检测来分析标识符序列(例如，分析物序列或条形码序列)。
在一些实施方案中，序列确定包括使生物样品与一种或多种直接或间接与滚环扩增产物杂交的中间探针接触，其中一种或多种中间探针可使用一种或多种可检测地标记的探针进行检测，以及从滚环扩增产物中去杂交一种或多种中间探针和/或一种或多种可检测地标记的探针。在一些实施方案中，所述一种或多种中间探针包含一个或多个突出部区域(例如，探针的不与滚环扩增产物杂交的5'和/或3'末端)。包含单个突出部区域的探针可以被称为“L-形探针”，包含两个突出部的探针可以被称为“U-形探针”。在一些情况下，突出部区域包含用于结合一种或多种可检测地标记的探针的结合区域。在一些实施方案中，检测包括使生物样品与对应于不同条形码序列或其部分的中间探针池和对应于不同的可检测标记的可检测地标记的探针池接触。在一些实施方案中，使生物样品依次与不同的中间探针池接触。在一些情况下，在多个顺序杂交步骤(例如，用不同的中间探针池)中使用共同或通用的可检测地标记的探针池。
在一些实施方案中，本文提供了使用顺序探针杂交原位分析样品中的分析物的方法。在一些方面，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括：a)生成环化探针(例如，在第III节中描述的复合探针)的滚环扩增产物(RCP)，RCP包含标识符序列，诸如条形码序列或分析物序列，其中标识符序列与感兴趣的分析物相关联，并被分配信号代码序列；b)使生物样品与第一中间探针(例如，L-探针)和第一可检测地标记的探针接触，以生成包含与RCP杂交的第一中间探针和与第一中间探针杂交的第一可检测地标记的探针的第一复合物，其中第一中间探针包含(i)与标识符序列(例如，条形码序列或分析物序列)互补的识别序列(例如，靶结合序列)和(ii)第一着陆序列(例如，突出部序列)，并且其中第一可检测地标记的探针包含与第一着陆序列互补的序列；c)检测与所述第一可检测地标记的探针相关联的第一信号，其中所述第一信号对应于信号代码序列中的第一信号代码；d)使生物样品与第二中间探针(例如，L-探针)和第二可检测地标记的探针接触，以生成包含与RCP杂交的第二中间探针和与第二中间探针杂交的第二可检测地标记的探针的第二复合物，其中第二中间探针包含(i)与标识符序列(例如，条形码序列或分析物序列)互补的识别序列(例如，靶结合序列)和(ii)第二着陆序列(例如，突出部序列)，并且其中第二可检测地标记的探针包含与第二着陆序列互补的序列；和e)检测与所述第二可检测地标记的探针相关联的第二信号，其中所述第二信号对应于信号代码序列中的第二信号代码，其中包含所述第一信号代码和所述第二信号代码的信号代码序列在生物样品中的一定位置处测得，由此解码标识符序列(例如，条形码序列或分析物序列)并鉴定生物样品中该位置处感兴趣的分析物。在一些实施方案中，第一可检测地标记的探针的可检测标记和第二可检测地标记的探针的可检测标记是相同的。在一些实施方案中，第一可检测地标记的探针和第二可检测地标记的探针的可检测标记是不同的。在一些实施方案中，第一信号代码和第二信号代码是相同的。在一些实施方案中，第一信号代码和第二信号代码是不同的。
在一些实施方案中，第一中间探针(例如，第一L-探针)、第二中间探针(例如，第二L-探针)和一种或多种后续探针(例如，后续中间探针诸如后续L-探针)以预先确定的序列依次与生物样品接触，该预先确定的序列对应于分配给标识符序列(例如，条形码序列或分析物序列)的信号代码序列，其中一种或多种后续探针各自包含(i)与标识符序列(例如，条形码序列或分析物序列)互补的识别序列，以及(ii)与可检测地标记的探针池(例如，跨越不同探针杂交循环的通用库)中的可检测地标记的探针互补的突出部序列。在一些实施方案中，生物样品在与第二中间探针和一种或多种后续探针接触之前与第一中间探针接触。在一些实施方案中，生物样品在与第一中间探针接触之后并在与一种或多种后续探针接触之前与第二中间探针接触。在一些实施方案中，生物样品在与第一中间探针接触之后与一种或多种后续探针接触。在一些实施方案中，生物样品在与第一中间探针和第二中间探针接触之后与一种或多种后续探针接触。
在一些实施方案中，第一可检测地标记的探针和第二可检测地标记的探针在可检测地标记的探针池中。可检测地标记的探针池可以包含至少两种可检测地标记的探针，并且可以用于生物样品中两种或更多种靶分析物(例如，靶核酸)的多重分析。在一些实施方案中，b)中的接触包括使生物样品与通用的可检测地标记的探针池接触，并且d)中的接触包括使生物样品与通用的可检测地标记的探针池接触。在一些实施方案中，在b)中的接触中使用的通用的可检测地标记的探针池与在d)中的接触中使用的通用的可检测地标记的探针池相同。在一些实施方案中，通用池包含可检测地标记的探针，每个可检测地标记的探针具有对应于用于与探针(例如，中间探针如L-探针)中的着陆序列(例如，突出部序列)杂交的不同核酸序列的可检测标记。在一些实施方案中，通用池中不同的可检测地标记的探针的数量为四。
在一些实施方案中，使所述一种或多种后续探针与生物样品接触以确定信号代码序列中的信号代码，直到已确定足够的信号代码来解码标识符序列(例如，条形码序列或分析物序列)，从而鉴定靶分析物(例如，靶核酸)。在一些实施方案中，该方法还包括在使样品与后续探针接触并且可检测地标记的探针与后续探针杂交之前，从生物样品中去除第一中间探针和/或第一可检测地标记的探针的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括在使样品与后续探针接触并且可检测地标记的探针与后续探针杂交之前，从生物样品中去除第二中间探针和/或第二可检测地标记的探针的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定存在于生物样品中的位置(例如，不同位置)处的多种不同的靶分析物。在一些实施方案中，每种不同的靶分析物被分配不同的信号代码序列，并被包含多个条形码序列中的不同条形码序列的互补序列的环化探针(例如，第III节中描述的复合探针)靶向。在一些实施方案中，每个探针池中不同探针(例如，具有不同的结合至条形码序列的识别序列的L-探针)的数量大于通用的可检测地标记的探针池中不同的可检测地标记的探针的数量。在一些实施方案中，通用池中不同的可检测地标记的探针的数量为四。在一些实施方案中，每个探针(例如，L-探针)池中不同探针的数量为约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约500、约1,000或更多。在一些实施方案中，每个探针池中探针的不同识别序列(例如，结合至条形码序列的识别序列)的数量为至少约10，如至少约20、30、40、50、100、200、500、1,000或更多中的任一个。
在一些实施方案中，序列确定可以使用单分子边连接边测序来进行。这样的技术利用DNA连接酶来并入寡核苷酸并鉴别这样的寡核苷酸的并入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸与之杂交的序列中的特定核苷酸的身份相关的不同标记。边连接边测序中涉及的方面和特征见述于例如Shendure等人,Science(2005),309:1728-1732中，以及US 5,599,675；US 5,750,341；US 6,969,488；US 6,172,218；和US 6,306,597，这些文献均全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，探针(例如，本文公开的第一探针、第二探针和/或复合探针)的条形码被可检测地标记的检测寡核苷酸(诸如荧光标记的寡核苷酸)靶向。在一些实施方案中，使用一个或多个解码方案来解码信号，如荧光，用于序列确定。在本文的任何实施方案中，条形码(例如，一级条形码序列和/或二级条形码序列)可以使用任何合适的方法或技术来分析(例如，检测或测序)，包括本文所述的那些，诸如原位测序、靶向原位测序、荧光原位测序(FISSEQ)或空间解析转录扩增子读出作图(STARmap)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括通过用多个标记的探针(例如，检测寡核苷酸)顺序杂交和检测来分析条形码。示例性解码方案见述于Eng等人,“Transcriptome-scale Super-Resolved Imaging inTissues by RNA SeqFISH+,”Nature 568(7751):235-239(2019)；Chen等人,“Spatiallyresolved,highly multiplexed RNA profiling in single cells,”Science；348(6233):aaa6090(2015)；Gyllborg等人,Nucleic Acids Res(2020)48(19):e112；US10,457,980B2；US10,510,435B2；US2016/0369329 A1；WO 2018/026873 A1；和US2017/0220733 A1中，所有这些文献均全文以引用方式并入。在一些实施方案中，这些测定使得能够同时实现信号放大、组合解码和纠错方案。
在一些实施方案中，可以使用核酸杂交来进行测序。这些方法利用与条形码序列的至少一部分互补的标记的核酸解码器探针。可以用具有可区分标签的许多不同探针的池来进行多重解码。核酸杂交测序的非限制性实例见述于例如US 8,460,865中和Gunderson等人,Genome Research14:870-877(2004)中。
在一些实施方案中，可以在测序期间使用DNA聚合酶活性的实时监测。例如，可以通过荧光共振能量转移(FRET)来检测核苷酸并入，如例如Levene等人,Science(2003),299,682-686、Lundquist等人,Opt.Lett.(2008),33,1026-1028和Korlach等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2008),105,1176-1181中所述。
VI.组合物和试剂盒
本文还提供了试剂盒，该试剂盒例如包含一种或多种多核苷酸，例如第III节中描述的任何多核苷酸，以及用于进行本文提供的方法的试剂，例如包括本文描述的杂交、连接、扩增、检测、测序和/或样品制备在内的一个或多个步骤所需的试剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含靶核酸，例如第II节中描述的任何靶核酸。在一些实施方案中，任何或所有多核苷酸为DNA分子。在一些实施方案中，靶核酸为信使RNA分子。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种连接酶，例如用于从分割探针对形成环状复合探针的连接酶。在一些实施方案中，试剂盒还包含聚合酶，例如用于例如使用第IV节中描述的任何方法扩增环化复合探针的聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于扩增的引物。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种检测试剂，诸如第V节中公开的那些。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含：(a)包含第一杂交区和条形码序列的第一部分的第一探针，以及(b)包含第二杂交区和条形码序列的第二部分的第二探针，其中第一杂交区和第二杂交区与靶RNA分子中的相邻靶序列互补，并且条形码序列对应于靶RNA分子。在一些实施方案中，该试剂盒还可以包含(c)夹板，该夹板与第一探针和第二探针杂交以连接第一部分和第二部分，从而形成包含条形码序列的复合探针。在一些实施方案中，条形码序列的第一部分和第二部分各自的长度可以不超过10个核苷酸。在一些实施方案中，条形码序列的长度可以为至少15个核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含：(a)多个第一探针，(b)多个第二探针，其中每个第一探针和第二探针的第一杂交区和第二杂交区与靶核酸分子中的对应靶序列杂交。在一些实施方案中，试剂盒还可以包含(c)多个夹板，该多个夹板与第一探针和第二探针中的每一者(每对第一探针和第二探针)杂交以形成复合探针。在一些实施方案中，每个复合探针分别包含第一探针和第二探针的条形码区的第一部分和第二部分。在一些实施方案中，每个第一探针和第二探针设有对应的独特夹板分子。在一些方面，提供了第一探针、第二探针和夹板的池来靶向多个靶核酸分子。例如，该池包含至少2种、至少5种、至少10种、至少25种、至少50种、至少75种、至少100种、至少300种、至少1,000种、至少3,000种、至少10,000种、至少30,000种、至少50,000种、至少100,000种、至少250,000种、至少500,000种或至少1,000,000种可区分的第一探针以及至少2种、至少5种、至少10种、至少25种、至少50种、至少75种、至少100种、至少300种、至少1,000种、至少3,000种、至少10,000种、至少30,000种、至少50,000种、至少100,000种、至少250,000种、至少500,000种或至少1,000,000种可区分的第二探针。在一些实施方案中，该池还包含用于每对对应的第一探针和第二探针的至少2种、至少5种、至少10种、至少25种、至少50种、至少75种、至少100种、至少300种、至少1,000种、至少3,000种、至少10,000种、至少30,000种、至少50,000种、至少100,000种、至少250,000种、至少500,000种或至少1,000,000种可区分的夹板。
试剂盒的各种组分可以存在于单独的容器中，或者某些相容的组分可以预先组合到单个容器中。在一些实施方案中，试剂盒还含有使用试剂盒组分实施所提供的方法的说明书。
在一些实施方案中，试剂盒可以含有用于进行所提供的方法的一个或多个步骤所需的试剂和/或消耗品。在一些实施方案中，试剂盒含有用于固定、包埋和/或透化生物样品的试剂。在一些实施方案中，试剂盒含有试剂，诸如用于连接和/或扩增的酶和缓冲液，诸如连接酶和/或聚合酶。在一些方面，试剂盒还可以包含本文所述的任何试剂，例如洗涤缓冲液和连接缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒含有用于检测和/或测序的试剂，如条形码检测探针或可检测标记。在一些实施方案中，试剂盒任选地含有其他组分，例如核酸引物、酶和试剂、缓冲液、核苷酸、经修饰的核苷酸、用于另外的测定的试剂。
在一些方面，所提供的实施方案可以应用于分析核酸序列的原位方法中，如原位转录组分析或原位测序，例如来自其中空间信息已被保留的完整组织或样品的核酸序列。在一些方面，实施方案可以应用于用于多重核酸分析的成像或检测方法中。在一些方面，所提供的实施方案可以用于鉴定或检测靶核酸中感兴趣的区域。
在一些实施方案中，感兴趣的区域包含单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，感兴趣的区域为单核苷酸变体(SNV)。在一些实施方案中，感兴趣的区域包含单核苷酸置换。在一些实施方案中，感兴趣的区域包含点突变。在一些实施方案中，感兴趣的区域包含单核苷酸插入。
在一些方面，实施方案可以应用于研究和/或诊断应用中，例如，用于表征或评估来自受试者的特定细胞或组织。所提供的方法的应用可以包括生物医学研究和临床诊断。例如，在生物医学研究中，应用包括但不限于用于生物研究或药物筛选的空间解析基因表达分析。在临床诊断中，应用包括但不限于检测患者样品的基因标志物如疾病、免疫反应、细菌或病毒DNA/RNA。
在一些方面，实施方案可以应用于以亚细胞分辨率可视化整个组织中遗传编码标志物的分布，例如染色体异常(倒位、重复、易位等)、遗传杂合性的丧失、指示疾病倾向或良好健康的等位基因的存在、对治疗有反应的可能性，或个性化医疗或世系中。
VIII.术语
在整个本公开中使用特定术语来解释所描述的装置、系统、方法和组合物的各个方面。
已经描述了本公开的一些示意性实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，前述内容仅是示意性的而非限制性的，已仅以举例的方式呈现。许多修改和其他示意性实施方案在本领域普通技术人员的范围内并且被视为落在本公开的范围内。特别地，尽管本文中呈现的许多实例涉及方法动作或系统要素的特定组合，但应理解，这些动作和这些要素可以以其他方式组合以实现相同的目标。
如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个(a/an)”和“该”包括复数指代物。例如，“一个”或“一种”意指“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”值或参数的引用包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
在整个本公开中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对要求保护的主题的范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了在该范围内的所有可能的子范围以及单独的数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个居间值以及该陈述的范围中的任何其他陈述的或居间的值均涵盖在要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在要求保护的主题内，但受制于陈述的范围中的任何具体排除的极限。在陈述的范围包括这些极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些包括的极限中的任一个或两个极限的范围也包括在要求保护的主题中。不管范围的广度如何，这都适用。
在权利要求中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数词来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素优于另一个权利要求要素的任何优先级、先后次序或顺序，也不意味着执行方法的多个动作的时间顺序，而是仅用作将具有某一名称的一个权利要求要素与具有用于区分权利要求要素的相同名称(但使用的序数词不同)的另一个要素区分开的标签。类似地，在权利要求中使用a)、b)等或i)、ii)等本身并不意味着任何优先级、先后次序或步骤顺序。类似地，在说明书中使用这些术语本身并不意味着任何要求的优先级、先后次序或顺序。
(i)条形码
“条形码”为传达或能够传达信息(例如，关于样品和/或探针中的分析物的信息)的标记或标识符。条形码可以是分析物的一部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接到分析物。特定条形码相对于其他条形码可以是独特的。
条形码可以具有多种不同的形式。例如，条形码可以包括多核苷酸条形码、随机核酸和/或氨基酸序列以及合成核酸和/或氨基酸序列。
条形码可以对生物样品中发现的分子组分进行空间解析(例如，以单细胞的分辨率)。在一些实施方案中，条形码包括一起充当单个条形码的两个或多个子条形码。例如，多核苷酸条形码可以包含被一个或多个非条形码序列分开的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。
(ii)核酸和核苷酸
术语“核酸”和“核苷酸”旨在符合其在本领域中的用途并且包括天然存在的物质或其功能类似物。核酸的特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交(例如，能够与两种核酸杂交，使得可以在两种杂交的核酸之间发生连接)或能够用作特定核苷酸序列的复制模板。天然存在的核酸一般具有含磷酸二酯键的骨架。类似物结构可以具有替代的骨架连接。天然存在的核酸一般具有脱氧核糖(例如，存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如，存在于核糖核酸(RNA)中)。
核酸可以包含具有糖部分的多种类似物中的任一种的核苷酸。核酸可以包含天然或非天然核苷酸。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可以具有选自由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可以具有选自由尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)组成的组的一个或多个碱基。
(iii)探针和靶
“探针”或“靶”，当用于指核酸或核酸序列时，在方法或组合物的上下文中旨在作为核酸或序列的语义标识符，并且不将核酸或序列的结构或功能限制在明确指出的范围之外。
(iv)寡核苷酸和多核苷酸
术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指长度为约2个至约500个核苷酸的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的、酶促(例如，通过聚合)或使用“分割池(split-pool)”方法制备的。寡核苷酸可以包括核糖核苷酸单体(例如，可以是寡核糖核苷酸)和/或脱氧核糖核苷酸单体(例如，寡脱氧核糖核苷酸)。在一些实例中，寡核苷酸可以包括寡核苷酸中脱氧核糖核苷酸单体和核糖核苷酸单体的组合(例如，脱氧核糖核苷酸单体和核糖核苷酸单体的随机或有序组合)。例如，寡核苷酸可以为4至10、10至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至350、350至400、或400-500个核苷酸的长度。寡核苷酸可以包括一个或多个与多聚体结构(例如，共价或非共价)连接的官能部分。例如，寡核苷酸可以包括一个或多个可检测标记(例如，放射性同位素或荧光团)。
(v)杂交(Hybridizing、Hybridize)、退火(Annealing、Anneal)
术语“杂交(hybridizing、hybridize)”、“退火(annealing、anneal)”在本公开中可互换使用，并且是指两个不同分子内基本上互补或互补的核酸序列的配对。配对可以通过任何方法实现，其中核酸序列通过碱基配对与基本上或完全互补的序列结合以形成杂交复合物。出于杂交的目的，如果两个核酸序列各自单独的碱基的至少60％(例如，至少70％、至少80％或至少90％)彼此互补，则这两个核酸序列是“基本上互补的”。
(vi)引物
“引物”为具有3’末端的单链核酸序列，所述3’末端可以用作核酸延伸反应中的核酸聚合酶的底物。RNA引物由RNA核苷酸形成并且用于RNA合成，而DNA引物由DNA核苷酸形成并且用于DNA合成。引物也可以包含RNA核苷酸和DNA核苷酸(例如，以随机或设计的模式)两者。引物还可以包含本文所述的可以具有另外的功能的其他天然或合成核苷酸。在一些实例中，DNA引物可以用于引发RNA合成，反之亦然(例如，RNA引物可以用于引发DNA合成)。引物的长度可以变化。例如，引物可以是约6个碱基至约120个碱基。例如，引物可以包含多达约25个碱基。在一些情况下，引物可以指引物结合序列。
(vii)引物延伸
两个核酸序列可以通过它们各自的末端互补核酸序列(例如，3'末端)的重叠而连接(例如，杂交)。这样的连接之后可以是用另一个核酸序列作为延伸模板进行一个或两个末端的核酸延伸(例如，酶促延伸)。酶促延伸可以通过包括但不限于聚合酶和/或逆转录酶的酶来进行。
(viii)核酸延伸
“核酸延伸”通常涉及以模板依赖性方式向分子(如但不限于核酸序列)中并入一种或多种核酸(例如，A、G、C、T、U、核苷酸类似物或其衍生物)，使得连续的核酸被酶(如聚合酶或逆转录酶)并入，从而生成新合成的核酸分子。例如，可以通过使用互补核酸序列作为核酸合成的模板将与互补核酸序列杂交的引物用于合成新的核酸分子。类似地，与聚(dT)序列杂交的mRNA转录物的3’聚腺苷酸化尾可以用作对应cDNA分子的单链合成的模板。
(ix)PCR扩增
“PCR扩增”是指使用聚合酶链反应(PCR)来生成遗传物质的拷贝，包括DNA和RNA序列。用于实施PCR的合适试剂和条件描述于例如美国专利4,683,202、4,683,195、4,800,159、4,965,188和5,512,462中，所述专利的全部内容以引用方式并入本文。在典型的PCR扩增中，反应混合物包括待扩增的遗传物质、酶、一种或多种用于引物延伸反应的引物和用于反应的试剂。寡核苷酸引物具有足够的长度以在退火条件下提供与互补遗传物质的杂交。引物的长度通常取决于扩增结构域的长度，但通常将为至少4个碱基、至少5个碱基、至少6个碱基、至少8个碱基、至少9个碱基、至少10个碱基对(bp)、至少11bp、至少12bp、至少13bp、至少14bp、至少15bp、至少16bp、至少17bp、至少18bp、至少19bp、至少20bp、至少25bp、至少30bp、至少35bp，并且可以长达40bp或更长，其中引物的长度通常将在18至50bp的范围内。遗传物质可以与单个引物或一组两个引物(正向引物和反向引物)接触，这取决于是否需要引物延伸、遗传物质的线性或指数扩增。
在一些实施方案中，PCR扩增过程使用DNA聚合酶。DNA聚合酶活性可以由一种或多种不同的DNA聚合酶提供。在某些实施方案中，DNA聚合酶来自细菌，例如，DNA聚合酶是细菌DNA聚合酶。例如，DNA聚合酶可以来自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、嗜热菌属或火球菌属的细菌。
可以使用的DNA聚合酶的合适实例包括但不限于：大肠杆菌DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、VENTTMDNA聚合酶、DEEPVENTTMDNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、/>Hot Start Taq DNA聚合酶、/>TaqDNA聚合酶、Crimson Taq DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、Hemo/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>High-Fidelity DNA聚合酶、Platinum Pfx DNA聚合酶、AccuPrime Pfx DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Klenow片段、Pwo DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶。
术语“DNA聚合酶”不仅包括天然存在的酶，还包括其所有经修饰的衍生物，还包括天然存在的DNA聚合酶的衍生物。例如，在一些实施方案中，DNA聚合酶可能已经被修饰以去除5'-3'核酸外切酶活性。可以使用的DNA聚合酶的序列修饰衍生物或突变体包括但不限于保留了野生型序列的至少一些功能(例如DNA聚合酶活性)的突变体。突变可以影响在不同的反应条件下(例如温度、模板浓度、引物浓度等)酶的活性分布，例如提高或降低聚合速率。突变或序列修饰也可能影响核酸外切酶活性和/或酶的热稳定性。
在一些实施方案中，PCR扩增可以包括反应，诸如但不限于链置换扩增反应、滚环扩增反应、连接酶链反应、转录介导的扩增反应、等温扩增反应和/或环介导的扩增反应。
在一些实施方案中，PCR扩增使用与靶DNA片段的3'标签互补的单一引物。在一些实施方案中，PCR扩增使用第一引物和第二引物，其中所述第一引物的至少3'末端部分与靶核酸片段的3'标签的至少一部分互补，并且其中所述第二引物的至少3'末端部分展示靶核酸片段的5'标签的至少一部分的序列。在一些实施方案中，第一引物的5'末端部分与靶核酸片段的3'标签不互补，并且第二引物的5'末端部分不展示靶核酸片段的5'标签的至少一部分的序列。在一些实施方案中，第一引物包含第一通用序列和/或第二引物包含第二通用序列。
在一些实施方案中，可以使用DNA连接酶将PCR扩增产物连接到附加序列。DNA连接酶活性可以由一种或多种不同的DNA连接酶提供。在一些实施方案中，DNA连接酶来自细菌，例如，DNA连接酶是细菌DNA连接酶。在一些实施方案中，DNA连接酶来自病毒(例如，噬菌体)。例如，DNA连接酶可以是T4 DNA连接酶。适合于连接步骤的其他酶包括但不限于TthDNA连接酶、Taq DNA连接酶、嗜热球菌(菌株9oN)DNA连接酶(9oNTM DNA连接酶，可得自NewEngland Biolabs,Ipswich,MA)和AmpligaseTM(可得自Epicentre Biotechnologies,Madison,WI)。也可以使用它们的衍生物(例如序列修饰的衍生物)和/或突变体。
在一些实施方案中，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来扩增遗传物质。所需逆转录酶活性可以由一种或多种不同的逆转录酶提供，其合适的实例包括但不限于：M-MLV、MuLV、AMV、HIV、ArrayScriptTM、MultiScribeTM、ThermoScriptTM及I、II、III和IV酶。“逆转录酶”不仅包括天然存在的酶，还包括其所有此类修饰的衍生物，还包括天然存在的逆转录酶的衍生物。
此外，逆转录可以使用M-MLV、MuLV、AMV和HIV逆转录酶的序列修饰的衍生物或突变体(包括保留野生型序列的至少一些功能活性(例如逆转录酶活性)的突变体)来进行。逆转录酶可以作为组合物的一部分提供，所述组合物包括其他组分，例如增强或改善逆转录酶活性的稳定组分，诸如RNA酶抑制剂、DNA依赖性DNA合成抑制剂，例如放线菌素D。逆转录酶的许多序列修饰的衍生物或突变体(例如M-MLV)、以及包括未经修饰和经修饰的酶的组合物是可商购获得的，例如ArrayScriptTM、MultiScribeTM、ThermoScriptTM、以及I、II、III和IV酶。
某些逆转录酶(例如禽成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶和莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV、MMLV)逆转录酶)可以使用RNA(cDNA合成)和单链DNA(ssDNA)两者作为模板合成互补DNA链。因此，在一些实施方案中，逆转录反应可以使用能够使用RNA和ssDNA两者作为延伸反应模板的酶(逆转录酶)，例如AMV或MMLV逆转录酶。
在一些实施方案中，RNA和/或DNA的定量通过实时PCR(也称为定量PCR或qPCR)进行，该实时PCR使用诸如但不限于“TAQMANTM”或的技术，或在毛细管(“LightCycler毛细管”)上进行。在一些实施方案中，通过光学吸光度和用实时PCR来确定遗传物质的定量。在一些实施方案中，通过数字PCR来确定遗传物质的定量。在一些实施方案中，可以将分析的基因与对应于表达(mRNA)和数量(DNA)的参考核酸提取物(DNA和RNA)进行比较，以便比较靶核酸的表达水平。
(x)抗体
“抗体”为识别并结合互补靶抗原的多肽分子。抗体通常具有类似于Y形状的分子结构形状。天然存在的抗体，称为免疫球蛋白，属于免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE中之一。抗体也可以以合成方式产生。例如，为单克隆抗体的重组抗体可以使用合成基因来合成，做法是从源细胞回收抗体基因、扩增到适当的载体中并将该载体引入到宿主中以使得宿主表达重组抗体。一般而言，重组抗体可以使用合适的寡核苷酸引物和/或杂交探针从任何物种的产生抗体的动物克隆。可以使用重组技术来生成抗体和抗体片段，包括非内源性物种。
合成抗体可以来源于非免疫球蛋白来源。例如，抗体可以从核酸(例如，适体)和从非免疫球蛋白蛋白支架(如肽适体)产生，高变环被插入其中以形成抗原结合位点。基于核酸或肽结构的合成抗体可以比免疫球蛋白衍生的抗体小，从而导致更大的组织穿透。
抗体还可以包括affimer蛋白，其是分子量通常为约12-14kDa的亲和试剂。Affimer蛋白通常以高亲和力和高特异性两者与靶(例如，靶蛋白)结合。此类靶的实例包括但不限于泛素链、免疫球蛋白和C反应蛋白。在一些实施方案中，affimer蛋白衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂，并包括肽环和提供结合位点的可变N-末端序列。
抗体还可以指“表位结合片段”或“抗体片段”，如本文所用，其通常是指能够结合与完整抗体相同的表位的完整抗体的一部分，虽然其程度不一定相同。尽管多种类型的表位结合片段是可能的，但是表位结合片段通常包含至少一对结合在一起(例如，通过二硫键)以保留抗原结合位点的重链可变区和轻链可变区(分别为VH和VL)，并且不包含Fc区的全部或一部分。抗体的表位结合片段可以通过任何合适的技术(例如，重组DNA技术，或者完整抗体的酶促或化学切割)从给定抗体获得，并且通常能够以与筛选完整抗体相同的方式来筛选特异性。在一些实施方案中，表位结合片段包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fd片段或Fv片段。在一些实施方案中，术语“抗体”包括抗体衍生的多肽，诸如单链可变片段(scFv)、双体或其他多聚体scFv、重链抗体、单结构域抗体，或者包含抗体的足够部分(例如，一个或多个互补决定区(CDR))以赋予多肽特异性抗原结合能力的其他多肽。
(xi)标记、可检测标记和光学标记
术语“可检测标记”、“光学标记”和“标记”在本文中可互换使用，是指与待检测的分子(例如，探针或分析物)相关联(例如，缀合)的直接或间接可检测的部分。可检测标记可以是本身可直接检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶促标记的情况下，可以是可间接检测的，例如，通过催化底物化合物或组合物的化学改变，所述底物化合物或组合物是可直接检测的。可检测标记可以适用于小规模检测和/或适用于高通量筛选。因此，合适的可检测标记包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料。
可检测标记可以被定性地检测(例如，光学地或光谱地)，或者可以被定量。定性检测通常包括其中确认可检测标记的存在或出现的检测方法，而可量化检测通常包括具有可量化(例如，数值可报告)值如强度、持续时间、极化和/或其他性质的检测方法。在一些实施方案中，可检测标记与特征或和特征相关联的探针结合。例如，可检测地标记的特征可以包括荧光、比色或化学发光标记(参见例如Rajeswari等人,J.Microbiol Methods 139:22-28,2017以及Forcucci等人,J.Biomed Opt.10:105010,2015，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，可以将多个可检测标记与待检测的特征、探针或组合物结合。例如，可以在核酸聚合或扩增期间掺入可检测标记(例如，-标记的核苷酸，诸如/>-dCTP)。可以使用任何合适的可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记为荧光团。例如，荧光团可以来自包括以下物质的组：7-AAD(7-氨基放线菌素D)、吖啶橙(+DNA)、吖啶橙(+RNA)、Alexa/>350、Alexa/>430、Alexa/>488、Alexa/>532、Alexa/>546、Alexa/>555、Alexa/>568、Alexa/>594、Alexa/>633、Alexa/>647、Alexa/>660、Alexa/>680、Alexa/>700、Alexa/>750、别藻蓝蛋白(APC)、AMCA/AMCA-X、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、7-氨基-4-甲基香豆素、6-氨基喹啉、苯胺蓝、ANS、APC-Cy7、ATTO-TAGTMCBQCA、ATTO-TAGTMFQ、金胺O-福尔根、BCECF(高pH)、BFP(蓝色荧光蛋白)、BFP/GFP FRET、BOBOTM-1/BO-PROTM-1、BOBOTM-3/BO-PROTM-3、/>FL、/>TMR、/>TR-X、/>530/550、/>558/568、/>564/570、/>581/591、/>630/650-X、/>650-665-X、BTC、钙黄绿素、钙黄绿素蓝、CalciumCrimsonTM、Calcium Green-1TM、Calcium OrangeTM、/>White、5-羧基荧光素(5-FAM)、5-羧基萘基荧光素、6-羧基罗丹明6G、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、羧基-X-罗丹明(5-ROX)、Cascade/>Cascade YellowTM、CCF2(GeneBLAzerTM)、CFP(青色荧光蛋白)、CFP/YFP FRET、色霉素A3、Cl-NERF(低pH)、CPM、6-CR 6G、CTC甲臜、Cychrome(PE-Cy5)、丹磺酰胺、丹磺酰尸胺、丹磺酰氯、DAPI、Dapoxyl、DCFH、DHR、DiA(4-Di-16-ASP)、DiD(DilC18(5))、DIDS、Dil(DilC18(3))、DiO(DiOC18(3))、DiR(DilC18(7))、Di-4 ANEPPS、Di-8 ANEPPS、DM-NERF(4.5-6.5pH)、DsRed(红色荧光蛋白)、EBFP、ECFP、EGFP、/>-97醇、曙红、赤藓红、溴化乙锭、乙锭均二聚物-1(EthD-1)、氯化铕(III)、5-FAM(5-羧基荧光素)、固蓝、荧光素-dT亚磷酰胺、FITC、Fluo-3、Fluo-4、/>Fluoro-GoldTM(高pH)、Fluoro-GoldTM(低pH)、Fluoro-Jade、/>1-43、Fura-2(高钙)、Fura-2/BCECF、Fura RedTM(高钙)、Fura RedTM/Fluo-3、GeneBLAzerTM(CCF2)、红移GFP(rsGFP)、野生型GFP、GFP/BFP FRET、GFP/DsRed FRET、Hoechst 33342和33258、7-羟基-4-甲基香豆素(pH 9)、1,5IAEDANS、Indo-1(高钙)、Indo-1(低钙)、吲哚二羰花青、吲哚三羰花青、JC-1、6-JOE、JOJOTM-1/JO-PROTM-1、LDS 751(+DNA)、LDS 751(+RNA)、LOLOTM-1/LO-PROTM-1、萤光黄、LysoSensorTMBlue(pH 5)、LysoSensorTMGreen(pH 5)、LysoSensorTMYellow/Blue(pH 4.2)、/>Green、Red、/>Yellow、Mag-Fura-2、Mag-Indo-1、Magnesium GreenTM、Marina/>4-甲基伞形酮、光辉霉素、/>Green、/>Orange、Red、NBD(胺)、尼罗红、Oregon/>488、Oregon/>500、Oregon/>514、Pacific Blue、PBF1、PE(R-藻红蛋白)、PE-Cy5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、PerCP(多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质)、PerCP-Cy5.5(TruRed)、PharRed(APC-Cy7)、C-藻蓝蛋白、R-藻蓝蛋白、R-藻红蛋白(PE)、PI(碘化丙啶)、PKH26、PKH67、POPOTM-1/PO-PROTM-1、POPOTM-3/PO-PROTM-3、碘化丙啶(PI)、PyMPO、Pyrene、派洛宁Y、Quantam Red(PE-Cy5)、氮芥喹吖因、R670(PE-Cy5)、Red 613(PE-德克萨斯红)、红色荧光蛋白(DsRed)、试卤灵、RH 414、Rhod-2、罗丹明B、罗丹明绿TM、罗丹明红TM、罗丹明标记鬼笔环肽、罗丹明110、罗丹明123、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、S65A、S65C、S65L、S65T、SBFI、SITS、/>-1(高pH)、/>-2、/>-1(高pH)、/>-1(低pH)、Sodium GreenTM、/>#1、#2、/>11、/>13、/>17、45、/>Blue、/>Green、/>Orange、5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)、四甲基罗丹明(TRITC)、/>//>-X、/>-X(NHS酯)、噻二碳菁、噻唑橙、/>-1//>-1、/>-3//>-3、/>-5、Tri-color(PE-Cy5)、TRITC(四甲基罗丹明)、TruRed(PerCP-Cy5.5)、WW 781、X-罗丹明(XRITC)、Y66F、Y66H、Y66W、YFP(黄色荧光蛋白)、/>-1//>-1、/>-3//>-3、6-FAM(荧光素)、6-FAM(NHS酯)、6-FAM(叠氮化物)、HEX、TAMRA(NHS酯)、Yakima Yellow、MAX、TET、TEX615、ATTO 488、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO647N、TYE 563、TYE 665、TYE 705、5’/>700、5’/>800、5’/>800CW(NHS酯)、WellRED D4染料、WellRED D3染料、WellRED D2染料、/>640(NHS酯)和Dy 750(NHS酯)。
如上文所提及的，在一些实施方案中，可检测标记为发光或化学发光部分或者包括发光或化学发光部分。常见的发光/化学发光部分包括但不限于过氧化物酶，诸如辣根过氧化物酶(HRP)、大豆过氧化物酶(SP)、碱性磷酸酶和荧光素酶。给定适当的底物(例如，氧化试剂加上化学发光化合物)，这些蛋白质部分可以催化化学发光反应。许多化合物家族可以在各种条件下提供化学发光。化学发光化合物家族的非限制性实例包括5-氨基-6,7,8-三甲氧基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮鲁米诺和二甲基氨基[ca]苯并类似物。这些化合物可以在碱性过氧化氢或次氯酸钙和碱的存在下发光。化学发光化合物家族的其他实例包括例如，2,4,5-三苯基咪唑、对二甲基氨基和-甲氧基取代基、草酸酯诸如草酰活性酯、对硝基苯基、N-烷基吖啶酯、萤光素、光泽精或吖啶酯。在一些实施方案中，可检测标记是或包括基于金属或基于质量的标记。例如，小簇金属离子、金属或半导体可以充当质量代码。在一些实例中，金属可以选自元素周期表的3-15族，例如Y、La、Ag、Au、Pt、Ni、Pd、Rh、Ir、Co、Cu、Bi或它们的组合。
实施例
包括以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本公开的范围。
实施例1：使用具有分割条形码区的探针对检测样品中的靶RNA分子
本实施例展示了用于原位检测生物样品中的RNA分子的方法。特别地，包括具有分割靶杂交区和分割条形码区的第一探针和第二探针的“复式分割”探针对可以用于通过“屏蔽”(例如，不检测)由于非特异性探针杂交和连接而形成的不正确连接的探针对来增强检测特异性。
Gpr88的一对分割探针(图6A中所示的Gpr88_5和Gpr88_3)用于检测新鲜冷冻小鼠脑组织切片中的mRNA转录物。一对具有乱序杂交区序列的乱序分割探针(图6A中所示的Scramble_5和Scramble_3)用作对照。
Gpr88_5(SEQ ID NO:1)：AACTCACGACGGTGTACACATGCGTCTATTTAGTGGAGCCATAGGCGTAA。
Gpr88_3(SEQ ID NO:2)：CGACGTATAGTCTACGAGTTTGCAGTCACGGGGCCTGAGGTCTCAGTGGC。
Scramble_5(SEQ ID NO:3)：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGCGTCTATTTAGTGGAGCCTGACCCGTGC，其中每个N可以独立地是任何核苷酸残基。
Scramble_3(SEQ ID NO:4)：CCATAGGTATTCTACGAGTTTGCAGTCACGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN，其中每个N可以独立地是任何核苷酸残基。
分割探针对在包含SSC和甲酰胺的杂交缓冲液中与组织样品杂交并温育。对于与样品中RNA杂交的探针对，使用连接酶缓冲液中的/>连接酶进行“下部连接”(杂交区之间)，并洗涤样品。使用非模板依赖性连接或模板化连接进行(连接的探针对的分割条形码区的)“上部连接”。对于非模板依赖性连接，CircLigaseTM连接酶缓冲液中的CircLigaseTM。对于模板化连接，使用用于Gpr88探针和乱序探针的夹板使由T4 DNA连接酶缓冲液中的T4 DNA连接酶进行的连接模板化。在使用包含Phi29反应缓冲液、dNTPs和Phi29聚合酶的RCA反应混合物对环化探针进行滚环扩增(RCA)之前，洗涤样品。使用荧光标记的可检测探针检测样品中的RCA产物。使用与任一分割探针(例如，第一探针或第二探针)上的锚定序列杂交的荧光标记的可检测探针来检测乱序分割探针，并且使用跨越分割探针(例如，跨越第一探针和第二探针)结合分割条形码区的荧光标记的可检测探针来检测gpr88探针。
图6B显示了使用CircLigaseTM(图6B，左图)或T4 DNA连接酶(图6B，右图)进行分割条形码连接时，与RCA产物相关联的荧光信号(对于Gpr88探针或乱序探针)的示例性图像。在这两个实验中，正如预期的那样，通过检测样品中的随机RNA或DNA序列，乱序探针生成了基因非特异性信号。通过检测靶杂交区和条形码区之间的探针区中的锚定序列，有可能观察到由“半圆”生成的信号，这表明具有常规非分割条形码序列的可环化探针(例如，挂锁探针)会产生非特异性的假阳性信号。相反，使用本文公开的分割条形码设计，只有两个正确的分割探针对合在一起形成匹配的复合探针时，才会检测到真阳性信号，即存在靶核酸分子。图6B显示了Gpr88的特异性信号可以通过使用“复式分割”探针设计来检测，以使来自嵌合探针的假阳性信号不可检测。
这些结果表明，“复式分割”探针设计可以用于减少和/或区分假阳性信号并增强检测特异性，特别是用于原位检测样品中的RNA分子。
本公开不旨在在范围上限制于特定公开的实施方案，这些特定公开的实施方案是例如为了示意公开内容的各种方面而提供的。根据本文的描述和教导，对所描述的这些组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和实质的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开的范围内。

Claims (87)

1.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与以下各项接触：
(i)包含第一杂交区和条形码区的第一部分的第一探针，以及
(ii)包含第二杂交区和所述条形码区的第二部分的第二探针，
其中所述第一杂交区和所述第二杂交区与所述生物样品中靶核酸分子中的靶序列互补，并且
其中所述条形码区包含与所述靶核酸分子相对应的一个或多个条形码序列；
(b)通过连接所述条形码区的所述第一部分和所述第二部分来连接与所述靶核酸分子杂交的所述第一探针和所述第二探针以形成复合探针；以及
(c)使所述生物样品与一种或多种可检测探针接触，所述一种或多种可检测探针在与所述条形码区的所述第一部分和所述条形码区的所述第二部分或其互补序列相对应的序列处与所述条形码区杂交，
其中在所述生物样品中检测与所述一种或多种可检测探针相关联的信号，从而检测所述生物样品中的所述靶核酸分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一杂交区和所述第二杂交区与所述靶核酸分子中的相邻靶序列杂交。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一杂交区和所述第二杂交区与所述靶核酸分子中相隔0、1、2、3、4、5个或更多个核苷酸的靶序列杂交。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一杂交区和所述第二杂交区的长度相等。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一杂交区比所述第二杂交区更长或更短。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与所述靶核酸分子杂交的所述第一杂交区的解链温度等于与所述靶核酸分子杂交的所述第二杂交区的解链温度。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与所述靶核酸分子杂交的所述第一杂交区的解链温度高于或低于与所述靶核酸分子杂交的所述第二杂交区的解链温度。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述解链温度相差不超过1℃、不超过2℃、不超过5℃或不超过10℃。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述解链温度相差1℃或更多、2℃或更多、5℃或更多、或10℃或更多。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中与所述第二杂交区和所述靶核酸分子之间的所述杂交相比，所述第一杂交区和所述靶核酸分子之间的所述杂交同样稳定、不太稳定或更稳定。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一探针和/或所述第二探针包含一个或多个核糖核苷酸。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第一杂交区和/或所述第二杂交区包含不超过四个连续的核糖核苷酸。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述一个或多个核糖核苷酸位于和/或靠近所述第一探针或所述第二探针的可连接3’末端。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述一个或多个核糖核苷酸位于和/或靠近所述第一杂交区或所述第二杂交区的可连接3’末端。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，所述方法还包括连接所述第一杂交区和所述第二杂交区。
16.根据权利要求15所述的方法，其中使用酶促连接或化学连接来连接所述第一杂交区和所述第二杂交区的所述末端，在连接之前有或没有缺口填充。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中使用模板依赖性连接或非模板依赖性连接来连接所述第一杂交区和所述第二杂交区的所述末端，在连接之前有或没有缺口填充。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中使用点击化学来连接所述第一杂交区和所述第二杂交区的所述末端。
19.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中使用具有RNA模板化连接酶活性和/或DNA模板化连接酶活性的连接酶来连接所述第一杂交区和所述第二杂交区的所述末端。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中使用选自由以下项组成的组的连接酶来连接所述第一杂交区和所述第二杂交区的所述末端：小球藻病毒DNA连接酶(PBCVDNA连接酶)、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中使用PBCV-1DNA连接酶或其变体或衍生物、T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2)或其变体或衍生物、或CircLigase或其变体或衍生物来连接所述第一杂交区和所述第二杂交区的所述末端。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述条形码区的所述第一部分和所述第二部分的长度相等。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述条形码区的所述第一部分比所述条形码区的所述第二部分更长或更短。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中使用酶促连接或化学连接来连接所述条形码区的所述第一部分和所述第二部分的所述末端，在连接之前有或没有缺口填充。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中使用模板依赖性连接或非模板依赖性连接来连接所述条形码区的所述第一部分和所述第二部分的所述末端，在连接之前有或没有缺口填充。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中使用点击化学来连接所述条形码区的所述第一部分和所述第二部分的所述末端。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中使用选自由以下项组成的组的连接酶来连接所述条形码区的所述第一部分和所述第二部分的所述末端：小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中使用夹板来连接所述条形码区的所述第一部分和所述第二部分的所述末端，所述夹板与(i)所述第一部分或其子部分和(ii)所述第二部分或其子部分杂交。
29.根据权利要求28所述的方法，其中与所述夹板包含与(i)所述第一部分或其子部分和/或(ii)所述第二部分或其子部分的错配时相比，当所述夹板包含与(i)所述第一部分或其子部分和(ii)所述第二部分或其子部分互补的序列时，所述夹板更稳定地与所述条形码区杂交，并且
任选地其中所述方法包括去除包含与(i)所述第一部分或其子部分和/或(ii)所述第二部分或其子部分的错配的所述夹板，而在相同条件下，与(i)所述第一部分或其子部分和(ii)所述第二部分或其子部分互补的所述夹板保持与所述条形码区杂交以进行后续连接。
30.根据权利要求28所述的方法，其中与所述夹板杂交的所述第一部分或其子部分的解链温度等于与所述夹板杂交的所述第二部分或其子部分的解链温度；或
其中与所述夹板杂交的所述第一部分或其子部分的解链温度高于或低于与所述夹板杂交的所述第二部分或其子部分的解链温度。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述解链温度相差不超过1℃、不超过2℃、不超过5℃或不超过10℃。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述解链温度相差1℃或更多、2℃或更多、5℃或更多、或10℃或更多。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述夹板是单链的。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述一个或多个条形码序列各自的长度独立地在约5个与约35个核苷酸之间。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述条形码区的所述第一部分包含一个、两个或更多个条形码序列，和/或其中所述条形码区的所述第二部分包含一个、两个或更多个条形码序列。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述条形码区包含两个或更多个相邻的条形码序列。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述条形码区包含两个或更多个非重叠的条形码序列和/或两个或更多个重叠的条形码序列。
38.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述条形码区由一个条形码序列组成。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述条形码区的长度在约8个与约40个核苷酸之间。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述复合探针是线型或环状的。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中与所述一种或多种可检测探针包含与(i)所述第一部分或其子部分和/或(ii)所述第二部分或其子部分的错配时相比，当所述一种或多种可检测探针包含与(i)所述第一部分或其子部分和(ii)所述第二部分或子部分互补的序列时，所述一种或多种可检测探针更稳定地与所述条形码区或其互补序列杂交。
42.根据权利要求41所述的方法，所述方法包括去除包含与(i)所述第一部分或其子部分和/或(ii)所述第二部分或其子部分的错配的所述一种或多种可检测探针，而在相同条件下，与(i)所述第一部分或其子部分和(ii)所述第二部分或其子部分互补的所述一种或多种可检测探针保持与所述条形码区或其互补序列杂交。
43.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使用所述复合探针作为模板进行延伸反应以生成所述条形码区的所述互补序列。
44.根据权利要求43所述的方法，所述方法包括使所述复合探针环化并生成所述环化复合探针的滚环扩增(RCA)产物，其中所述RCA产物包含所述条形码区的所述互补序列的多个拷贝。
45.根据权利要求44所述的方法，其中与所述一种或多种可检测探针包含与(i)所述第一部分或其子部分和/或(ii)所述第二部分或子部分的所述互补序列的错配时相比，当所述一种或多种可检测探针包含(i)所述第一部分或其子部分和(ii)所述第二部分或其子部分时，所述一种或多种可检测探针更稳定地与所述RCA产物杂交。
46.根据权利要求45所述的方法，所述方法包括去除包含与(i)所述第一部分或其子部分和/或(ii)所述第二部分或其子部分的所述互补序列的错配的可检测探针分子，而在相同条件下，包含(i)所述第一部分或其子部分和(ii)所述第二部分或其子部分的可检测探针分子保持与所述RCA产物杂交。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述一种或多种可检测探针包含可检测标记。
48.根据权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述一种或多种可检测探针包含与可检测地标记的探针的序列互补的序列。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子包含DNA和/或RNA。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子包含用于所述生物样品中的分析物或其一部分的标记剂的报告寡核苷酸。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述标记剂包含直接或间接结合非核酸分析物的结合物，其中所述结合物与所述报告寡核苷酸缀合。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述靶核酸分子包含两种或更多种报告寡核苷酸的连接产物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中当所述两种或更多种报告寡核苷酸因所述对应的非核酸分析物接近而彼此接近时，生成所述连接产物。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的方法，其中所述复合探针或其产物在所述生物样品中和/或在包埋所述生物样品或其分子的基质中原位生成。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中所述复合探针或其产物固定在所述生物样品中和/或在包埋所述生物样品或其分子的基质中。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中所述复合探针或其产物与在所述生物样品中和/或在包埋所述生物样品或其分子的基质中的一种或多种其他分子交联。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的方法，其中所述方法包括对所述生物样品成像以检测与所述一种或多种可检测探针相关联的所述信号。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中使用顺序杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或它们的组合，在所述生物样品中原位分析所述条形码区或其互补序列。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是从靶RNA分子逆转录的靶cDNA分子。
60.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是靶RNA分子，并且所述第一探针和所述第二探针直接与所述靶RNA分子杂交，而无需将所述靶RNA分子逆转录成cDNA。
61.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与以下各项接触：
(i)包含第一杂交区和第一条形码序列的第一探针，
(ii)包含第二杂交区和第二条形码序列的第二探针，以及
(iii)包含第三杂交区和第三条形码序列的第三探针，
其中所述第一杂交区和所述第二杂交区与所述生物样品中靶核酸分子中的相邻靶序列互补，并且所述第三探针干扰所述第二探针与所述靶核酸分子的所述杂交，并且
其中所述第一条形码序列和/或所述第二条形码序列对应于感兴趣的分析物，所述第三探针不对应于所述感兴趣的分析物，并且所述第三条形码序列对应于不同的感兴趣的分析物；
(b)连接与所述靶核酸分子杂交的所述第一探针和所述第二探针以形成复合探针，其中所述连接包括：
(i)连接与所述相邻靶序列杂交的所述第一杂交区和所述第二杂交区；以及
(ii)连接所述第一探针和所述第二探针的所述第一条形码序列和所述第二条形码序列以形成与所述感兴趣的分析物相对应的复合条形码序列；
(c)使所述生物样品与可检测探针接触，所述可检测探针在与所述第一条形码序列和所述第二条形码序列相对应的序列处与所述复合条形码序列或其互补序列杂交；
(d)去除与所述第一探针和所述第三探针之间形成的复合探针或其互补序列杂交的可检测探针，同时所述可检测探针保持与所述第一探针和所述第二探针之间形成的所述复合探针或其互补序列杂交；以及
(e)检测与所述生物样品中的所述可检测探针相关联的信号，从而检测所述生物样品中的所述感兴趣的分析物，其中在所述生物样品中没有检测到与所述第一探针和所述第三探针之间形成的所述复合探针或其互补序列杂交的所述可检测探针的相关信号。
62.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与以下各项接触：
(i)包含第一杂交区和第一条形码序列的第一探针，以及
(ii)包含第二杂交区和第二条形码序列的第二探针，
其中所述第一杂交区和所述第二杂交区与所述生物样品中靶RNA分子中的相邻靶序列互补，并且
其中所述第一条形码序列和所述第二条形码序列各自对应于所述靶RNA分子；
(b)连接与所述靶RNA分子杂交的所述第一探针和所述第二探针以形成环状探针，其中所述连接包括：
(i)使用所述靶RNA分子作为模板，连接与所述相邻靶序列杂交的所述第一杂交区和所述第二杂交区，以及
(ii)连接所述第一探针和所述第二探针以形成包含与所述靶RNA分子相对应的所述第一条形码序列和所述第二条形码序列的复合探针；以及
(c)使所述生物样品与可检测探针接触，所述可检测探针在所述第一条形码序列和所述第二条形码序列处与所述复合探针杂交，
其中在所述生物样品中检测与所述可检测探针相关联的信号，从而检测所述生物样品中的所述靶RNA分子。
63.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与以下各项接触：
(i)包含第一杂交区和第一条形码序列的第一探针，以及
(ii)包含第二杂交区和第二条形码序列的第二探针，
其中所述第一杂交区和所述第二杂交区与所述生物样品中靶RNA分子中的相邻靶序列互补，并且
其中所述第一条形码序列和所述第二条形码序列各自对应于所述靶RNA分子；
(b)连接与所述靶RNA分子杂交的所述第一探针和所述第二探针以形成环状探针，其中所述连接包括：
(i)使用所述靶RNA分子作为模板，连接与所述相邻靶序列杂交的所述第一杂交区和所述第二杂交区，以及
(ii)连接所述第一探针和所述第二探针以形成包含与所述靶RNA分子相对应的所述第一条形码序列和所述第二条形码序列的复合探针；以及
(c)生成所述复合探针的滚环扩增产物；
(d)使所述生物样品与可检测探针接触，所述可检测探针在与所述第一条形码序列和所述第二条形码序列相对应的序列处与所述滚环扩增产物中的所述复合探针或其互补序列杂交，
其中在所述生物样品中检测与所述可检测探针相关联的信号，从而检测所述生物样品中的所述靶RNA分子。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中在所述复合探针中，所述第一条形码序列和所述第二条形码序列形成复合条形码序列。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的方法，其中在所述复合探针中，所述第一条形码序列和所述第二条形码序列由一个或多个衔接子序列连接。
66.根据权利要求62至65中任一项所述的方法，其中所述第一探针和/或所述第二探针还包含单独或组合地与所述靶RNA分子相对应的一个或多个附加条形码序列。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述方法还包括使所述生物样品与附加可检测探针接触，所述附加可检测探针与任何一个或多个所述附加条形码序列杂交。
68.根据权利要求62至67中任一项所述的方法，其中使用小球藻病毒DNA连接酶(PBCVDNA连接酶)、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶和/或单链DNA(ssDNA)连接酶来使所述第一探针和所述第二探针环化。
69.根据权利要求62至68中任一项所述的方法，所述方法包括：
使所述生物样品与作为可检测地标记的探针的所述可检测探针接触，以及
使所述可检测探针去杂交，
其中用所述可检测地标记的探针和/或一种或多种其他可检测地标记的探针重复所述接触和去杂交步骤。
70.根据权利要求62至68中任一项所述的方法，所述方法包括：
使所述生物样品与作为中间探针的所述可检测探针接触，其中所述中间探针可使用可检测地标记的探针来检测，以及
使所述中间探针和/或所述可检测地标记的探针去杂交，
其中用所述中间探针、所述可检测地标记的探针、一种或多种其他中间探针和/或一种或多种其他可检测地标记的探针重复所述接触和去杂交步骤。
71.根据权利要求1至70中任一项所述的方法，其中所述生物样品是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)样品、冷冻组织样品或新鲜组织样品。
72.根据权利要求1至71中任一项所述的方法，其中所述生物样品是非均质化的。
73.根据权利要求1至72中任一项所述的方法，其中所述生物样品是固定的或未固定的。
74.根据权利要求1至73中任一项所述的方法，其中所述生物样品是透化的。
75.根据权利要求1至74中任一项所述的方法，其中所述生物样品包埋在基质中。
76.根据权利要求1至75中任一项所述的方法，其中所述生物样品是澄清的。
77.根据权利要求1至76中任一项所述的方法，其中所述生物样品是交联的。
78.根据权利要求1至77中任一项所述的方法，其中所述生物样品是厚度在约1μm与约50μm之间的组织薄片。
79.一种用于分析生物样品的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含第一杂交区和条形码序列的第一部分的第一探针，以及
(b)包含第二杂交区和所述条形码序列的第二部分的第二探针，
其中所述第一杂交区和所述第二杂交区与靶RNA分子中的相邻靶序列互补，并且所述条形码序列对应于所述靶RNA分子，并且
其中所述试剂盒包含：
(c)夹板，所述夹板与所述第一探针和所述第二探针杂交以连接所述第一部分和所述第二部分，从而形成包含所述条形码序列的复合探针。
80.根据权利要求79所述的试剂盒，其中所述条形码序列的所述第一部分和所述第二部分的长度不超过10个核苷酸，并且所述条形码序列的长度为至少15个核苷酸。
81.根据权利要求79或80所述的试剂盒，其中所述夹板是单链的。
82.一种用于分析生物样品的试剂盒，所述试剂盒包含多对第一探针和第二探针，其中：
每对的所述第一探针包含第一杂交区和条形码序列的第一部分，并且
每对的所述第二探针包含第二杂交区和所述条形码序列的第二部分，并且
其中每对第一探针和第二探针的所述第一杂交区和所述第二杂交区与靶核酸分子中的对应靶序列杂交。
83.根据权利要求82所述的试剂盒，所述试剂盒还包含：
多个夹板，所述多个夹板与每对杂交，使得所述对中的所述第一探针和所述第二探针被配置为形成复合探针，其中每个复合探针分别包含所述第一探针和所述第二探针的所述条形码区的所述第一部分和所述第二部分。
84.根据权利要求83所述的试剂盒，其中每对第一探针和第二探针设有对应的独特夹板。
85.根据权利要求83或84所述的试剂盒，其中所述多个夹板是单链的。
86.根据权利要求83至85中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含至少10种可区分的第一探针和至少10种可区分的第二探针。
87.根据权利要求83至86中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含用于每对对应的第一探针和第二探针的至少10种可区分的夹板。
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