JP5435864B2 - マイクロrnaに関与する方法および組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、概して、分子生物学の分野に関する。より詳しくは、それは、マイクロRNA(miRNA)分子に関与する方法および組成物に関係する。miRNAアレイなどの、分析のためにmiRNAを単離、標識、調製するための、または分析のためのツールとしての方法および組成物を記載する。加えて、診断、治療、および予後診断におけるmiRNAに対する応用がある。
2001年、いくつかのグループが、C.エレガンス(C. elegans)、ショウジョウバエ(Drosophila)、およびヒトから多種多様な「マイクロRNA」(miRNA)を単離および同定するための新しいクローニング方法を使用した(Lagos-Quintana et al., 2001(非特許文献1); Lau et al., 2001(非特許文献2); Lee and Ambros, 2001(非特許文献3))。数百のmiRNAが、植物および動物−ヒトを含む−において同定されており、内因性siRNAを有するようには見えない。したがって、miRNAは、siRNAと類似しているが、それでもなお異なる。
本発明は、細胞におけるmiRNAの役割および機能を特徴付けるためのmiRNAの操作およびmiRNAの使用に関する本発明者らの調査に基づく。それは、miRNAを単離する、それを標識する、miRNAに向けたアレイ(miRNAアレイまたはマイクロアレイ)を調製する、アレイを使用してmiRNAを分析する、ならびに診断的、治療的および予後診断的応用に対してmiRNAを特徴付けるための方法および組成物に関係する。
の、またはより多くの異なるmiRNAプローブ(つまり、同じまたは異なるmiRNA、miRNA前駆体、またはmiRNA遺伝子を標的にする異なる配列を有するmiRNAプローブ)を有するアレイが、具体的に意図される。SEQ ID NO:1〜703の任意に対するプローブを用いる、またはSEQ ID NO:704〜899において同定されるものを含む、本明細書において提供される任意のその他の配列を用いる、以前の文において記載されるそのようなアレイが、具体的に意図される。さらに、態様は、表1Cにおいて同定されるプローブの任意またはすべてを、具体的に含み得る、または採用し得る。プローブは、SEQ ID NO:704〜899の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、またはより多くの近接核酸(またはそこに導き出せる任意の範囲)と同一であるまたは相補的であり得る。または、使用される任意のプローブは、SEQ ID NO:1〜899における任意の配列に対して、少なくともまたは多くとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%相補的または同一(またはそこに導き出せる任意の範囲)であり得る。miRNAアレイとの関連で議論される任意の態様が、本発明のスクリーニングもしくはプロファイリングの方法またはキットにおいて、より一般的に採用され得ることが具体的に意図される。言い換えれば、特定のアレイに何が含まれ得るかを記載する任意の態様は、より一般的にmiRNAプロファイリングとの関連で実施されることがあり、アレイそれ自体に関与する必要はない。
の異なるmiRNAの発現における差が、疾患、病態またはその他の表現型の指標として使用され得ることが、いくつかの態様において意図される。さらに、いくつかの場合において、指標が、特定の疾患、病態、または表現型を有するまたは発生するリスクに関する情報を提供することが意図される。これらの異なるmiRNAは、以下の任意を含む:let-7、let-7A、let-7C、let7D-as、let-7F-2、miR-7、miR-9a、miR-9-as、miR-10a、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-27a、miR-28、miR-29、miR-29b、miR-30a、miR-30a-as、miR-31、miR-32、miR-92、miR-95、miR-99b、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126-as、miR-126a、miR-128、miR-130a、miR-133、miR-133a、miR-135a、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-144、miR-145、miR-150、miR-152、miR-181a、miR-181b、miR-182、miR-183、miR-184、miR-186、miR-188、miR-189、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199、miR-199a、miR-199a-as、miR-200b、miR-201、miR-203、miR-204、miR-205、miR-207、miR-211、miR-212、miR-215、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-239、miR-290、miR-291、miR-291-5P、miR-298、miR-301、miR-326、miR-328、mu-miR-329、miR-331、miR-338、miR-341、miR-342、miR-344、miR-361、およびmiR-425。
本発明は、治療的、予後診断的、および診断的応用に対するmiRNAの使用と同様に、miRNAの調製および特徴付けに関する組成物および方法に向けられる。
マイクロRNA分子(「miRNA」)は、概して、長さが21〜22ヌクレオチドであるが、19および23までのヌクレオチドの長さが報告されている。miRNAは、より長い前駆体RNA分子(「前駆体miRNA」)から各々プロセス化される。前駆体miRNAは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体miRNAは、動物においてDicerと呼ばれる酵素によって切断される、ステムループまたは折り畳み様構造をそれらが形成することを可能にする相補性の2つの領域を有する。Dicerは、リボヌクレアーゼIII様ヌクレアーゼである。プロセス化miRNAは、典型的にはステムの一部である。
本発明は、標識され得る、アレイ分析において使用され得る、または診断的、治療的、もしくは予後診断的応用において採用され得るmiRNAに関係する。RNAは、細胞によって内因的に産生され得る、または化学的もしくは組み換え的に合成もしくは産生され得る。それらは、単離および/または精製され得る。「miRNA」という語は、他に特に示されなければ、その前駆体から切断された後の、プロセス化されたRNAを指す。表1は、どのSEQ ID NOが、miRNAの特定の前駆体配列に対応し、SEQ ID NO内のどの配列が、成熟配列に対応するのかを示す。miRNAの名称は、状況に応じて、しばしば短縮されて接頭語なしで呼ばれ、そのようなものとして理解されると思われる。他に特に示されなければ、本出願において言及されるmiRNAは、mir-Xまたはlet-Xとして同定されるヒト配列であり、Xは番号および/または文字である。
本明細書において使用されるように、「核酸塩基」は、例えば、少なくとも一つの自然発生的な核酸(すなわちDNAおよびRNA)において見出される自然発生的な核酸塩基(すなわちA、T、G、C、またはU)、ならびにそのような核酸塩基の自然発生的または非自然発生的な誘導体および類似体などの、複素環塩基を指す。核酸塩基は、概して、自然発生的な核酸塩基対(例えば、AとT、GとC、およびAとUの間の水素結合)を置換し得る様式で、少なくとも一つの自然発生的な核酸塩基との一つまたは複数の水素結合を形成し得る(「アニールする」または「ハイブリダイズする」)。
本明細書において使用されるように、「ヌクレオシド」は、核酸塩基リンカー部分に共有結合される核酸塩基を含む、個々の化学的ユニットを指す。「核酸塩基リンカー部分」の非限定的な例は、5-炭素原子を含む糖(すなわち、「五炭糖」)であり、デオキシリボース、リボース、アラビノース、または五炭糖の誘導体もしくは類似体を含むが、それらに限定されない。五炭糖の誘導体または類似体の非限定的な例は、2'-フルオロ-2'-デオキシリボースまたは糖環において炭素が酸素原子に置換される炭素環式糖を含む。
本明細書において使用されるように、「ヌクレオチド」は、「骨格部分」をさらに含むヌクレオシドを指す。骨格部分は、概して、核酸を形成するために、ヌクレオチドを含む別の分子または別のヌクレオチドに、ヌクレオチドを共有結合させる。自然発生的なヌクレオチドにおける「骨格部分」は、典型的には、五炭糖に共有結合しているリン部分を含む。骨格部分の付着は、典型的には、五炭糖の3'または5'位において生じる。しかしながら付着のその他の型は、特に、ヌクレオチドが自然発生的な五炭糖またはリン部分の誘導体または類似体を含む場合、当技術分野において公知である。
核酸は、自然発生的な核酸に存在し得る、核酸塩基の誘導体もしくは類似体、核酸塩基リンカー部分、および/または骨格部分を含み得る、または完全にそれらからなり得る。核酸類似体を有するRNAは、本発明の方法に従って標識されてもよい。本明細書において使用されるように、「誘導体」は、自然発生的な分子の化学的に修飾または変更される型を指し、「模倣体」または「類似体」という語は、自然発生的な分子または部分に構造的に類似し得るまたは類似し得ないが、同様の機能を保有する分子を指す。本明細書において使用されるように、「部分」は、概して、より大きな化学的または分子的構造のより小さな化学的または分子的構成要素を指す。核酸塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチド類似体または誘導体は、当技術分野において周知であり、記載されている(例えば、参照により本明細書に組み入れられるScheit, 1980を参照されたい)。
本発明の標識化方法およびキットは、標識の付着のために修飾され、miRNA分子に取り込まれ得るヌクレオチドの使用を具体的に意図する。そのようなヌクレオチドは、蛍光色素を含む色素、またはビオチンなどの分子で標識され得るものを含む。標識ヌクレオチドは、簡単に利用できる;それらは、市販で取得され得る、またはそれらは当業者にとって公知の反応により合成され得る。
核酸は、例えば、化学的合成、酵素的産生、または生物学的産生などの、当業者にとって公知の任意の技術によって作られ得る。本発明のmiRNAプローブが、化学的に合成されることが、具体的に意図される。
ジエステル法は、主としてKhoranaおよび共同研究者らによって、使用可能な状態まで開発された最初のものであった(Khorana, 1979)。基本的な段階は、ホスホジエステル結合を含むジデオキシヌクレオチドを形成するための、二つの適切に保護されたデオキシヌクレオチドの接合である。ジエステル法は、良く確立されており、DNA分子を合成するために使用されている(Khorana, 1979)。
ジエステル法とトリエステル法との間の主な差は、後者における、反応物質および産物のリン酸原子上の余分な保護基の存在である(Itakura et al., 1975)。リン酸保護基は、通常はクロロフェニル基であり、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド中間体が有機溶剤において可溶なようにする。それ故に、精製は、クロロホルム溶液において行われる。方法におけるその他の改善は、(i)トリマーとより大きなオリゴマーとのブロック連結、(ii)中間体および最終産物の両方の精製に対する高性能液体クロマトグラフィーの大規模な使用、ならびに(iii)固相合成を含む。
これは、多くの有用なオリゴヌクレオチドを合成するために使用され得る、DNA合成の酵素的方法である(Gillam et al., 1978; Gillam et al., 1979)。制御条件下で、ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、主に、短いオリゴヌクレオチドに単一のヌクレオチドを付加する。クロマトグラフィー精製は、望ましい単一の付加化合物が得られるのを可能にする。少なくともトリマーは、手順を開始するために必要とされ、このプライマーは、あるその他の方法によって得られなければならない。ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法は、正常に機能し、関与する手順がほとんどの生化学者に良く知られているという利点を有する。
ポリペプチドの固相合成のために開発されたテクノロジーを利用して、それは、最初のヌクレオチドを固体支持体材料に付着させ、ヌクレオチドの段階的な付加を進めることが可能である。すべての混合および洗浄段階は、簡略化されており、手順は自動化できるようになる。これらの合成は、現在、自動核酸合成器を使用して、日常的に実施されている。
細胞において核酸を産生するための組み換え法は、当業者にとって周知である。これらは、(望ましいRNA分子の大きな量を産生するために)標的細胞または単に宿主細胞であり得る細胞へ核酸を送達するための、ベクター(ウィルス性および非ウィルス性)、プラスミド、コスミド、およびその他の媒体の使用を含む。または、そのような媒体は、RNA分子を生成するための試薬が存在する限りは、細胞を含まないシステムとの関連で使用され得る。そのような方法は、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook, 2003、Sambrook, 2001、およびSambrook, 1989において記載されるものを含む。
核酸は、当業者にとって周知の技術を使用して単離され得るが、特定の態様において、小さな核酸分子を単離するおよび/またはRNA分子を単離するための方法が採用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質からまたはその他の核酸から核酸を分離または単離するために、しばしば使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリクス、フィルターカラム、アルコール沈殿、および/またはその他のクロマトグラフィーを伴う電気泳動に関与し得る。細胞に由来するmiRNAが使用されるまたは評価される場合、方法は、概して、RNAの特定の集団を単離するためにプロセスを導入することに先行して、カオトロピック物質(例えば、イソチオシアン酸グアニジニウム)および/または界面活性剤(例えば、N-ラウリルサルコシン)を用いて、細胞を溶解することに関与する。
いくつかの態様において、本発明は、標識されるmiRNAに関係する。miRNAは、標識化に先行して、最初に単離および/または精製され得る。これは、標識化に先行してmiRNAが単離または精製されない試料におけるその他のRNAとは対照的に、miRNAをより効率的に標識する反応を達成し得る。本発明の多くの態様において、標識は非放射性である。概して、核酸は、標識ヌクレオチドを付加すること(一段階プロセス)、またはヌクレオチドを付加し、かつ付加されたヌクレオチドを標識すること(二段階プロセス)によって、標識され得る。
いくつかの態様において、核酸は、すでに標識されたヌクレオチドまたはすでに標識された複数のヌクレオチドを核酸に触媒的に付加することによって標識される。一つまたは複数の標識ヌクレオチドが、miRNA分子に付加され得る。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,723,509号を参照されたい。
miRNAまたはmiRNAプローブ上の標識は、比色(蛍光を含む可視およびUVスペクトルを含む)、発光、酵素、または陽電子放出であり得る(放射性を含む)。標識は、直接的または間接的に検出され得る。放射性標識は、125I、32P、33P、および35Sを含む。酵素標識の例は、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ-ガラクトシダーゼを含む。標識は、例えば、緑蛍光タンパク質およびフィコエリスリンなどの、発光特性を有するタンパク質であってもよい。
標識核酸を可視化または検出するための多くの技術が、簡単に利用できる。Stanley T. Crooke, 2000による参照は、そのような技術の議論を有し(6章)、参照により組み入れられる。そのような技術は、顕微鏡法、アレイ、蛍光光度法、ライトサイクラーまたはその他のリアルタイムPCRマシン、FACS分析、シンチレーションカウンター、ホスホイメージャー、ガイガーカウンター、MRI、CAT、抗体に基づく検出方法(ウェスタン、免疫蛍光法、免疫組織化学)、組織化学技術、HPLC(Griffey et al., 1997)、分光法、キャピラリーゲル電気泳動(Cummins et al., 1996)、分光法;質量分析;放射線技術;および物質収支技術を含む。
A. アレイ調製
本発明は、複数のmiRNA分子または前駆体miRNA分子に完全にまたはほぼ相補的または同一であり、空間的に離れた組織体における支持体材料上に置かれる核酸分子(プローブ)の秩序マクロアレイまたはマイクロアレイであるmiRNAアレイの調製および使用に関係する。マクロアレイは、典型的には、プローブがスポットされているニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイは、10,000までの核酸分子が、典型的には1〜4平方センチメートルの領域に取り付けられ得るように、核酸プローブをより密に置く。マイクロアレイは、例えば、遺伝子、オリゴヌクレオチドなどの核酸分子を基質上にスポットすることによって、または基質上でインサイチューでオリゴヌクレオチド配列を加工することによって、加工され得る。スポットされたまたは加工された核酸分子は、平方センチメートルあたり約30までの、またはより高い、例えば、平方センチメートルあたり約100までの、またはさらに約1000の非同一核酸分子の高密度マトリクスパターンにおいて適用され得る。マイクロアレイは、典型的には、フィルターアレイのニトロセルロースに基づく材料とは対照的に、固体支持体としてコーティングされたガラスを使用する。miRNA-相補的核酸試料の秩序アレイを有することにより、各々の試料の位置が、追跡され、オリジナルの試料にリンクされ得る。複数の相異なる核酸プローブが固体支持体の表面に安定して結合される様々な異なるアレイデバイスが、当業者にとって公知である。アレイに対する有用な基質は、ナイロン、ガラス、およびシリコンを含む。そのようなアレイは、平均プローブ長、プローブの配列または型、例えば共有または非共有などのプローブとアレイ表面との間の結合の性質、および同類のものを含む、多くの異なる方式において変化し得る。本発明の標識化およびスクリーニング方法ならびにアレイは、プローブがmiRNAを検出するということを除いては、任意のパラメータに関して、その実用性において限定されない;結果として、方法および組成物は、miRNAアレイの様々な異なる型とともに使用され得る。
広く様々な試料のmiRNAが、本発明のアレイテクノロジーを使用して分析され得ることが意図される。内因性miRNAが、本発明の組成物および方法を伴う使用に対して意図されるが、組み換えmiRNA−内因性miRNAまたは前駆体miRNAに相補的または同一である核酸を含む−は、本明細書において記載されるように取り扱われかつ分析され得る。試料は、生物学的試料であってもよく、その場合は、それらは、血液、組織、器官、精液、唾液、涙液、その他の体液、毛嚢、皮膚、または生物学的細胞を含むもしくは構成する任意の試料に由来し得る。または、試料は、生物学的試料ではあり得ないが、細胞を含まない反応混合物(一つまたは複数の生物学的酵素を含み得る)などの、化学的混合物であり得る。
アレイが調製され、試料におけるmiRNAが標識された後、標的核酸の集団は、ハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触し、そのような条件は、行われる特定のアッセイを考慮して、特異性の最適なレベルを提供するために、望ましいように調整され得る。適したハイブリダイゼーション条件は、当業者にとって周知であり、Sambrook et al., 1989および国際公開公報第95/21944号において概説される。多くの態様において特に関心対象であるのは、ハイブリダイゼーションの間のストリンジェントな条件の使用である。ストリンジェントな条件は、当業者にとって公知である。
本発明のアレイは、2つの試料間の差を検出するために使用され得る。具体的に意図される応用は、正常である試料からおよび正常ではない試料に由来するmiRNA間の差または2つの異なって処置された試料間の差を、同定および/または定量することを含む。また、miRNAは、特定の疾患または病態の影響を受けやすいと信じられている試料とその疾患または病態の影響を受けやすくないまたは耐性があると信じられている試料との間で比較されてもよい。正常ではない試料は、疾患もしくは病態の表現型形質を示すもの、またはその疾患もしくは病態に関して正常ではないと信じられているものである。それは、その疾患または病態に関して正常である細胞と比較され得る。表現型形質は、構成要素が遺伝的である、または遺伝的であり得る、または遺伝的であり得ない、疾患または病態の症状を含む、またはそれらへの罹患性を含む。
アレイおよびマイクロアレイの使用に加えて、多くの異なるアッセイが、miRNA、それらの活性、およびそれらの効果を分析するために採用され得ると考えられることが意図される。そのようなアッセイは、RT-PCR、インサイチューハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション保護アッセイ(HPA)(GenProbe)、分岐DNA(bDNA)アッセイ(Chiron)、ローリングサイクル増幅(RCA)、単一分子ハイブリダイゼーション検出(US Genomics)、インベーダーアッセイ(ThirdWave Technologies)、Bridge Litigationアッセイ(Genaco)を含むが、それらに限定されない。
本明細書において記載される組成物の任意は、キットに含まれ得る。非限定的な例において、miRNAを単離する、miRNAを標識する、および/またはアレイを使用してmiRNA集団を評価するための試薬が、キットに含まれる。キットは、miRNAプローブを作り出すまたは合成するための試薬をさらに含み得る。したがって、キットは、適した容器手段において、標識ヌクレオチドまたはその後に標識される非標識ヌクレオチドを取り込むことによってmiRNAを標識するための酵素を含むと思われる。それは、反応バッファー、標識化バッファー、洗浄バッファー、またはハイブリダイゼーションバッファーなどの一つまたは複数のバッファー、miRNAプローブを調製するための化合物、およびmiRNAを単離するための構成要素を含んでもよい。本発明のその他のキットは、miRNAを含む核酸アレイを作るための構成要素を含んでいてもよく、したがって、例えば固体支持体を含み得る。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明者らによって本発明の実施においてよく機能することが発見された技術を示し、したがって、その実施に対して好ましいモードを構成すると考えられ得るということが、当業者によって高く評価されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の態様において多くの変化がなされ得ることを高く評価するべきであり、それでも、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同類のまたは同様の結果を得るべきである。
miRNA単離および濃縮
miRNAは、二段階プロセスを使用して、細胞または組織試料から得られた。第一において、試料におけるRNAのすべてが、試料のその他の内容物から単離される。第二段階において、miRNAが顕著に濃縮されるRNA画分を作り出すために、miRNAを含む小さなRNAが、試料から選択的に抽出される。
試料におけるRNAのすべてを回収するために使用され得る様々な方法があるが、シリカ結合およびRNA溶離が、以下に記載されるように使用された。
miRNA標識化プロセスは、全RNA試料中にあるより大きなmRNAおよびrRNAのほとんどを欠く試料に対して最も効果的である。これらのRNAを試料から除去するために、以下の一つが採用された:70ヌクレオチドよりも大きい試料におけるRNAの大部分を除去するための濃縮プロセス、または長さが15〜30ヌクレオチドであったRNAの集団を得るためのゲル精製プロセス。
単離された全RNAに、300μlの溶解/結合溶液が添加された。次いで、100μlの100%エタノールが添加された。それは、ボルテックスまたはチューブを数回倒置にすることによって、徹底的に混合された。
混入するmRNA、tRNA、およびrRNAから試料におけるmiRNAを単離することは、ゲル電気泳動を使用してなされ得る。ゲル電気泳動に対する二つの方法が使用された。第一は、標準的ゲル条件および電気泳動後のゲルのmiRNA画分の切除を特徴とする。第二は、チューブ電気泳動と呼ばれる方法を特徴とし、ゲルで満たされたチューブが、RNA試料を分画し、miRNA画分の回収を促進するために使用される。
等しい容積のゲルローディングバッファー(95%ホルムアミド、18 mM EDTA、0.01%キシレンシアノール、および0.01%ブロモフェノールブルー)が、150μgほどの全RNAに添加された。次いで、混合物は、95℃で5分間、ウォーターバス中で加熱され、RNAを分画するために15%変性ポリアクリルアミドゲルに加えられた。
チューブ電気泳動は、ナイロンチュービングがポリアクリルアミドゲルマトリクスで満たされ、ゲルチューブが特別な電気泳動デバイスに置かれる方法である。全RNA試料は、チューブの上面に添加され、サイズに基づいてRNAを分画するために、電流が加えられる。miRNA画分は、それが、チューブの端から電気泳動バッファーへ流れる際に、捕獲される。次いで、miRNAは、バッファーから回収される。このプロセスは、以下により詳細に記載される。
miRNAの標識化:反応に影響を及ぼす因子
A. 大腸菌ポリ(A)ポリメラーゼによるmiRNAの3'末端への様々なヌクレオチドの追加
数百ヌクレオチドのポリAテールは、ATPおよび大腸菌ポリ(A)ポリメラーゼを使用して、miRNAの3'末端に効率的に付加された。その他のヌクレオチドは、酵素に対する基質としての役目もし得ると考えられ、最も著しくはUTPである。5-(3-アミノアリール)-UTP、アデノシン'5'-(1-チオ三リン酸)、ウリジン'5'-(1-チオ三リン酸)、8-[(4-アミノ)ブチル]-アミノ-ATP、および8-[(6-アミノ)ブチル]-アミノ-ATPなどの修飾ヌクレオチドは、大腸菌ポリ(A)ポリメラーゼに対する基質であったが、3'テールの長さは、ATPおよびUTPで生成されるものよりも顕著に短かった。修飾ヌクレオチドのみがポリ(A)ポリメラーゼ反応にあった場合、テールは、典型的には、3〜10ヌクレオチド長であった。
miRNAは、様々な方式で標識された。放射性標識化に対して、0.5〜5μMでのα-32P-ATPまたはα-32P-UTPが、ポリ(A)ポリメラーゼ反応において使用された。数百ヌクレオチドが、各々のmiRNAに追加されてよく、各々のmiRNAに対して実質的な放射性シグナルを提供する。蛍光標識化に対して、色素標識ヌクレオチド(担体標準的ヌクレオチドに加えて)が取り込まれる、またはテーリング反応の後に色素分子が追加され得る反応基を有するヌクレオチドが取り込まれる。後者の方法は、より大きな蛍光を伴うより長いテールを生成した。500μMの最終濃度でのアミノアリールUTPおよび100μMの最終濃度でのUTPの使用は、有利な結果を提供する条件であった。この組み合わせは、典型的には、10〜50ヌクレオチドのテールおよびおそらくmiRNAあたり20もの色素分子を得た。
文献において記載されるポリ(A)ポリメラーゼ反応条件は、全RNAの試料から単離されたngおよびナノグラム下の量のmiRNAを使用する場合は、あまり効率的ではなかった。ポリエチレングリコール(PEG)などの体積排除試薬の添加は、標識化反応を顕著に改善した。10%PEGは、0.1 ngのmiRNAを有する試料において、10倍もの多くの標識材料を提供した。
miRNAポリ-Aテーリング反応のpHの最適化は、pH 6〜7が、文献(Sillero et al., 2001)において推奨されるpH 7.9よりもより良いテーリング効率を提供することを明らかにした。pH 6.5においてポリ(A)ポリメラーゼでテール化されるmiRNAは、文献において記載されるpH 7.9よりも、10倍もの大きなシグナルを提供した。miRNA標識化に対する本発明者らの最終的な反応バッファーは以下であった:10%ポリエチレングリコール(MW 3,350)、10 mM MgCl2、250 mM NaCl、50 mM MES pH 6.5、および1 mM DTT。
miRNAの標識化:二段階蛍光miRNA標識化
1. ポリAポリメラーゼ反応
単離されたmiRNAは、4.0μL H2Oに再懸濁された。以下が、miRNA試料に添加された:10μL 2×ポリ(A)ポリメラーゼ(PAP)バッファー(20%ポリエチレングリコール(MW 3,350)、20 mM MgCl2、500 mM NaCl、100 mM MES pH 6.5、2 mM DTT);2.0μL 25 mM MnCl2;2.0μL NTPミックス(1 mM UTP、5 mM アミノアリール-UTP);2.0μL PAP(2 U/μL)(カタログ番号2030G)。反応混合物は、37℃で2時間インキュベートされた。
アミン修飾miRNAは、NHS-エステルCy3、Cy5、AlexaFluor 555、AlexaFluor 647、およびビオチンなどのアミン修飾標識部分と反応させた。これは、以下の手順によって遂行された。
miRNAの標識化:一段階蛍光miRNA標識化
miRNAは、4.0μL H2Oに再懸濁された。反応は、10μL 2×PAPバッファー(20%ポリエチレングリコール(MW 3,350)、20 mM MgCl2、500 mM NaCl、100 mM MES pH 6.5、2 mM DTT);2.0μL 25 mM MnCl2;2.0μL NTPミックス(1 mM UTP、5 mM Cy3 UTP);および2.0μL PAP(2 U/μL)(カタログ番号2030G)を含んだ。反応混合物は、37℃で2時間インキュベートされた。次いで、10μg剪断酵母RNA(カタログ番号7118)および80μL miRNA結合バッファーが添加され、混合物はRTで5分間インキュベートされた。混合物は、マイクロフィルター(シリカフィルターカラム)に加えられ、次いで、5000 rpmで1分間スピンされた。300μLのmiRNA洗浄バッファー(0.5 M NaCl、55%エタノール)が、マイクロフィルターに加えられ、5000 rpmで1分間スピンされた。洗浄/スピン段階は、それを再度10,000 rpmで1分間スピンする前に、繰り返された。25μLの95℃ ddH2Oが、マイクロフィルターとともに65℃で5分間インキュベートされた。次いで、それは、10,000 rpmで1分間スピンされた。溶離画分は、乾燥され、再懸濁された。
miRNAの標識化:一段階miRNA放射性標識化
miRNAは、4.0μL H2Oに再懸濁された。反応は、10μL 2×PAPバッファー(20%ポリエチレングリコール(MW 3,350)、20 mM MgCl2、500 mM NaCl、100 mM MES pH 6.5、2 mM DTT);2.0μL 25 mM MnCl2;2.0μL α-[32P]-ATPミックス;および2.0μL PAP(2 U/μL)(カタログ番号2030G)を含んだ。反応混合物は、37℃で2時間インキュベートされた。次いで、10μg剪断酵母RNA(カタログ番号7118)および80μL miRNA結合バッファーが添加され、混合物はRTで5分間インキュベートされた。混合物は、マイクロフィルター(シリカフィルターカラム)に加えられ、次いで、5000 rpmで1分間スピンされた。300μLのmiRNA洗浄バッファー(0.5 M NaCl、55%エタノール)が、マイクロフィルターに加えられ、5000 rpmで1分間スピンされた。洗浄/スピン段階は、それを再度10,000 rpmで1分間スピンする前に、繰り返された。25μLの95℃ ddH2Oが、マイクロフィルターとともに65℃で5分間インキュベートされた。次いで、それは、10,000 rpmで1分間スピンされた。溶離画分は、乾燥され、7μLに再懸濁された。
miRNAプローブ最適化
様々なプローブの設計が、標識miRNAからの検出の最高のレベルを得るために試験された。アミン修飾、アミン修飾の位置、および外来のヌクレオチドの利点が、検査される因子であった。化学的に合成されるおよび内因性miRNAの両方とのハイブリダイゼーションに基づいて、21 ntを有するリンカーが、最高のシグナルを引き起こすことが決定されたが、しかしながら、リンカー長は、必要であれば、15 ntまで減少されてもよく、それでも同程度のシグナルを得ると結論された。5'末端よりもむしろ3'末端に位置するスライド付着のために必要なアミン基は、より良い結果を与え、miRNA前駆体に相補的なmiRNAプローブ配列の各々の側への4 bpの付加は、いくつかのmiRNAにおけるシグナルを増加した。
miRNArrayプロトコール
A. アレイ調製
miRNAプローブは、調製され、製造業者の推奨に従って、SpotBot(TeleChem)を使用してスポットされた。次いで、アレイは、以下に記載される方法を使用して処理された。
ハイブリダイゼーション溶液(3×SSC)は、10分間65℃で加熱され、インキュベーションの間中、数回徹底的に混合された。35μlのあらかじめ温められたものが、標識miRNAに添加され、ボルテックスされた。混合物は、加熱温度ブロックにおいて、3分間95℃に加熱された。miRNA/ハイブリダイゼーション溶液混合物が加熱される間、35μlのハイブリダイゼーション溶液が、ハイブリダイゼーションチャンバーの上面および底面湿度貯蔵器に添加され、付加的な150μlが、チャンバーの中心スパン全体に広げられた。アレイは、チャンバーに置かれ、スライドがチャンバーの側面と接触しないことを確実にするために予防措置が取られた。カバースリップが、エッチングされた領域によって輪郭を描かれたサブアレイ上に置かれた。35μlの加熱miRNA混合物が、アレイに添加され、それは、毛管作用によって、カバースリップの別の側に移動させた。ハイブリダイゼーションチャンバーは密封され、アレイは42℃で4〜16時間インキュベートされたが、16時間より長くはない。
スライドは、ハイブリダイゼーションチャンバーから除去され、カバースリップを除去するために、2×SSC/0.1 SDSに浸された。カバースリップが除去された時点で、スライドは、10回上下に動かされ、即座に2×SSCバッファーに置かれた。それらは、洗浄チャンバーにおいて、穏やかな攪拌(150〜200 rpm)により2分間洗浄された。スライドは、新鮮な2×SSCを含む新しい容器における新しいスライドホルダーに移され、上下運動を伴って1分間洗浄された。ホルダーは、新鮮なバッファーを有する新しい容器に移され、付加的に1分間洗浄された。次いで、スライドは、遠心またはピコフュージを使用して乾燥された。
miRNArray再現性
一つの試料におけるRNAなどの生体分子の存在量を、別の試料における生体分子と比較するために使用される任意の方法に対して、プロセスが高度に再現性のあるものであることが重大である。miRNArrayシステムの再現性は、ヒト前立腺および結腸試料のmiRNAプロファイルを繰り返し比較することによって試験された。
miRNA発現正常ヒト組織
未知の試料の組織起源を識別する分子的方法が必要とされる。例は、転移性腫瘍が見出され、その起源が未知である場合である。由来する組織を同定することは、医師が、その他の影響を受けた器官を同定し、ならびに成功のより高い可能性を伴う治療規制を作り出すことを可能にする。
アレイ結果の確認-正常試料
アレイ結果の最終的な試験は、RNA定量化の第二の方法とともにマイクロアレイ発現プロファイルを確認することである。リボヌクレアーゼ保護アッセイが、9つのヒト組織試料における3つの異なるmiRNAの発現を、以前の実施例において生成されたmiRNArrayデータと比較するために、使用された。
肺腫瘍試料のmiRNA分析
実験の一つのセットにおいて、腫瘍および正常隣接組織(NAT)試料は、7人の肺癌患者から得られた。実験の第二のセットにおいて、腫瘍およびNAT試料は、16人の付加的な肺癌患者から評価された。最終データセットは、第一の表に示される第一の7つの試料+16個の付加的な試料を含む。
アレイ結果の確認-肺腫瘍/NAT試料
上に記載される正常組織試料のように、RNA定量化の第二の方法は、実験の第一のセットにおいて、miRNArrayプロセスによって差次的に発現されることが観測されたmiRNAが、実際に差次的に発現されたのかどうかを確認するために使用された。肺癌患者の2人に由来する腫瘍/NAT試料が、miR-16、miR-21、miR-143、miR-145、およびlet-7の発現に対して分析された。正常試料におけるmiRNA発現プロファイルの比較において観測されたように、miRNArrayシステムからの定量的データは、第二の分析に非常に類似していた(図7)。上のように、これはmiRNArrayシステムの妥当性確認である。さらに、それは、代わりとなるRNA分析システムが、臨床環境において、定義されるmiRNAの発現を分析するために使用され得ると考えられることを示す。
結腸腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織(NAT)試料は、実験の第一のセットにおいて、6人の結腸癌患者から得られた。実験の第二のセットにおいて、腫瘍およびNAT試料は、18人の付加的な結腸癌患者から評価された。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner(Axon)を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。miRNAエレメントのいくつかに対する腫瘍:NATのシグナル比は、図8に示される。実験の第一のセットに由来する第一の6つの結腸腫瘍/NAT試料の少なくとも4つにおいて差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、表6Aにおいて以下に提供される。実験の第一および第二のセットの組み合わせからのデータは、表6Bに提供される。腫瘍試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、所与の試料が癌性であるかどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的な標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
様々な腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織(NAT)試料は、3人の乳癌患者、2人の甲状腺癌患者、および1人の膀胱癌患者から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner(Axon)を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。
試料変動
多くの分子診断的方法の想定は、腫瘍試料が、癌性組織全体で比較的同じであるということである。この想定の妥当性は、1人の患者に由来する単一の甲状腺腫瘍の2つの単離体のmiRNAプロファイルを測定することによって試験された。
固定組織試料からのmiRNAプロファイル
ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒド固定組織は、臨床的に興味深い試料の莫大な資料を示す。臨床環境において、ほとんどの腫瘍およびその他の疾患組織は、固定され、分析され、無期限に保存される。これらの歴史的試料を分析することは、固定試料の分子的特徴を試料が由来する患者に対する臨床帰結に合致させる機会を、科学者に与える。研究者は、固定組織に対してRNA分析を行うことの利点を長く認識してきたが、試料から高質のRNAを単離することが本質的に不可能であるので、固定組織は使用されていない。これは、固定剤が、RNA分子に化学的部分を取り入れ、それらを本質的にすべての定量的RNA技術と互換性がないようにするという事実による。
分解RNAを有する試料からのmiRNAプロファイリング
異なる試料の遺伝子発現プロファイルを比較している研究者によって直面される別の問題は、RNAが脆弱であるということである。組織におけるヌクレアーゼならびに手違いによって取り入れられるものは、試料におけるmRNAおよびその他の興味深いRNA分子を分解する可能性がある。RNA分析のほとんどの方法は、RNA分解によって影響を受け、分析における一つまたは複数のRNA試料が、少なくとも部分的に分解される場合、信頼できるデータを得ることを本質的に不可能にする。固定試料におけるmiRNAを用いた驚くべき結果を鑑みて、miRNA発現プロファイルに対する組織におけるRNA分解の影響を試験することが決められた。
血液試料のmiRNA分析
多くの診断的アッセイは、血液が、簡単に利用でき、かつ患者の健康をしばしば表すので、血液試料をアッセイするために設計される。miRNAが血液試料において分析され得ることを確認するために、10人の異なる個人に由来する試料が得られた。試料の各々に由来する全RNAは、再利用可能シリンジデバイスにおけるLK4白血球除去フィルター(Pall)に付着された10 mlシリンジに、全血液を流し込むことによって単離された。血液は、試料あたり〜75秒の期間にわたって、LK4フィルターを通り抜けた。次いで、フィルターデバイスは、3 mlのAmbionのRNAlater(登録商標)を含む3 mlシリンジに移され、滴下形式で、捕獲WBCを含むフィルターを通り抜けた。次いで、プランジャが引っ込められ、RNAlater(登録商標)の残留液滴が排出されたが、フィルターは湿ったまま放置された。次いで、処置されたWBCを有するフィルターは、デバイスから除去され、15 mlコニカルに移された。フィルターは、RNA抽出が始まる前に、およそ1時間室温で保存された。
発癌性miRNA-差次的発現および癌調節
以前の実施例において示されるように、同じ癌患者に由来する腫瘍試料と正常隣接組織試料との間で差次的に発現される多くのmiRNAが同定されている。興味深いことに、異なる癌の間で差次的に発現されるmiRNAにおいて、顕著な重複があり、変更された場合に癌をもたらす細胞プロセスに影響するmiRNAのコアセットがあることを示唆する。以下は、miRNA調節ミスと癌との間のリンクを開発することを目的とした実験を記載する。
肺癌患者に由来する22個の腫瘍および正常隣接組織(NAT)試料が、上に記載されるmiRNAアレイシステムを使用して分析された。アレイは、分析され、各々のmiRNAの相対発現が、各々の患者に由来する腫瘍と正常隣接組織との間で比較された。様々なmiRNAが、異なる患者にわたって腫瘍におけるそれらの相対発現に基づいてクラスターされた(図14)。6つのmiRNA(miR-126、30a、143、145、188、および331)は、患者の70%より多くの腫瘍において、顕著により低いレベルで発現された。3つのmiRNA(miR-21および200b)は、患者の70%より多くの腫瘍において、顕著により高いレベルで発現された。多くのこれらのmiRNAの差次的発現は、ノーザン分析によって検証された(図15)。
結腸癌患者に由来する25個の腫瘍およびNAT試料が、本発明者らのmiRNAアレイプロセスを使用して分析された。肺癌比較と同様に、様々なmiRNAが、異なる結腸癌患者にわたって腫瘍におけるそれらの相対発現に基づいてクラスター化された(図14)。5つのmiRNA(miR-143、145、195、130a、およびmiR-331)は、患者の70%より多くの腫瘍において、顕著により低いレベルで発現された。5つのmiRNA(miR-223、31、21、17、および106)は、患者の70%より多くの腫瘍において、顕著により高いレベルで発現された。
8つの異なるmiRNAが、本発明者らが分析した肺および結腸患者試料のほとんどに対して、腫瘍試料と正常隣接試料との間で差次的に発現されたことは興味深い(図16)。これらの同じmiRNAは、本発明者らが分析した乳、胸腺、膀胱、膵臓、および前立腺癌患者において差次的に発現されることも見出され、これらのmiRNAは、変更された場合に癌をもたらす細胞プロセスを制御し得ることが示唆される。
特定のmiRNAが、癌遺伝子の調節ミスを介して癌に関与している可能性があるかどうかに取り組むために、本発明者らは、本発明者らのマイクロアレイ分析において同定されたmiRNAへの顕著な相同性を有する配列に対して、150の周知の癌遺伝子の3'非翻訳領域(UTR)をスキャンした。潜在的標的部位は、2つの基準に基づいて選択された:
(1)miRNAの位置2〜9と癌遺伝子との間の完全相補性。このmiRNAコア配列は、miRNAの活性に重大であるとして同定されており、公知のmiRNA標的部位は、この部位において本質的に100%相補性を有する(Doench et al. 2004)。
(2)miRNA/mRNA相互作用の全体のTm。コア配列に加えて、miRNAとmRNAとの間の全体の結合安定性が、miRNA活性の重要な指標であることが示されている(Doench et al., 2004)。
癌遺伝子発現に対するmiRNAの効果の測定
miRNA標的部位予測を確認することは、様々な方式でなされ得る。ショウジョウバエおよびC.エレガンスにおいて、遺伝的アプローチが適用されており、miRNAおよび推定miRNA標的部位における突然変異が作られ、類似の表現型を引き起こすことが示されている(Ha et al., 1996; Vella et al., 2004)。哺乳類細胞において、遺伝的アプローチははるかに難しいが、レポーター構築は、推定標的遺伝子の3'UTRが、推定miRNA結合部位における突然変異を含むレポーターベクター制御に対して不均衡なレベルで細胞において調節されることを示すために使用されている(Lewis et al. 2003)。加えて、ベクターおよびオリゴヌクレオチドは、推定標的遺伝子の内因性レベルに対する効果を決定するために、細胞におけるmiRNAを取り入れるまたは阻害するために使用されている(Lewis et al., 2003; Kiriakidou et al. 2004)。後者のアプローチは、miRNA標的部位予測を認証するために行われている。
狼瘡におけるmiRNA
全身性紅斑性狼瘡(SLE;狼瘡)は、最終的には免疫複合体媒介標的器官不全をもたらす慢性炎症性自己免疫疾患である。それは、CD4+ Tヘルパー細胞の過剰な活性化およびCD8+ T細胞毒性活性の抑制によって特徴付けられ、天然抗体および病原性自己抗体の過剰産生をもたらす。最近、いくつかのヒストン修飾が、狼瘡患者から単離された末梢血単核細胞(PBMC)において報告された。狼瘡の診断は、主に、症状がとても広く変化し、それらが頻繁に出たり止んだりするので、かつ疾患が、とても多くのその他の障害を模倣するので、今もなお頻繁に間違いである。さらに、診断は、使用される特定の治療を示さない。治療法がないので、狼瘡の今日の処置は、今もなお、主として症状緩和に合わせられ、診断には合わせられない。高特異性および感度をもつ診断的アッセイは、非常に重要であると考えられる。
miRNAおよびプリオン病
主におよびおそらく単独で単一のタンパク質からなるプリオンと呼ばれる新しい感染性粒子は、認知および運動機能の致命的な低下を産生する感染性海綿状脳症の群の、可能性が高い原因物質である。証拠は、関与するタンパク質が、偏在性の組織分布を有する正常型からの誤った折り畳みによって病原性状態に達することを示す。
脳卒中関連miRNA
脳卒中は、ヒトにおける死および永久的障害の主要な原因である。それらは、脳の領域への血流が閉塞される場合に生じ、脳組織の死を引き起こし得る。脳卒中の2つの主な型がある:虚血性および出血性。虚血性脳卒中は、血液を脳へ供給する動脈における閉塞によって引き起こされ、血流の欠乏(虚血)を引き起こす。出血性脳卒中は、脳において破裂された血管(出血)の出血によって引き起こされる。脳卒中に関与するmiRNAを理解することは、検出および/または処置を強化し得ると考えられる。
乳腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織(NAT)試料は、6人の乳癌患者から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner(Axon)を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。乳腫瘍/NAT試料の少なくとも80%において差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、表9において提供される。腫瘍試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、所与の試料が癌性かどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
甲状腺腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織(NAT)試料は、6人の甲状腺癌患者から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner(Axon)を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。甲状腺腫瘍/NAT試料の少なくとも80%において差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、表10において提供される。腫瘍試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、所与の試料が癌性かどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
前立腺腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織(NAT)試料は、前立腺癌患者から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner(Axon)を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。前立腺腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、表11において提供される。腫瘍試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、所与の試料が癌性かどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
膀胱腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織(NAT)試料は、膀胱癌患者から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner(Axon)を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。膀胱腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、表12において提供される。腫瘍試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、所与の試料が癌性かどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
クローン病におけるmiRNA
クローン病は、限局性回腸炎とも呼ばれる;それは、腸の慢性、進行性、炎症性疾患である。症状は、最も一般的には、下痢および痛みの症状である。体重減少、疲労、および過敏性は、疾患の特徴である。排便は、感染のために、粘液、血液、および膿をしばしば含む。脂肪が、排便において生じることがあり、それらはかさばりかつ悪臭があるようになる。クローン病の根本的原因は、未知であり、疾患を有する患者のための市販されている治療的選択肢がある。クローン病の分子的原因を同定することは、強化された診断ならびに治療をもたらし得ると考えられる。
miRNAおよび子宮頸癌
子宮頸管の癌は、世界的に女性の間で癌関連死の第2番目の原因である。疫学的および分子的調査は、ヒトパピローマウィルス(HPV)が、子宮頸癌の大部分(〜99%)の病原物質であることを実証した。100より多い異なるHPV型が、今までのところ特徴付けられており、新しい型が、このリストに定期的に付加される。同定されたHPVの間で、約3分の1(the third)(46)が、生殖管に感染する。これらのHPV型は、性的に感染し、それらが引き起こす損傷の悪性進行に対する傾向に従って、低リスクまたは高リスクにさらに分類され得る。高リスク粘膜HPV型は、浸潤癌へと進行し得る上皮内損傷を引き起こす。日常的な細胞学スクリーニングおよび再帰HPV試験が、子宮頸癌検出を改善し、死亡率を軽減したが、費用のかかる侵襲的な試験および患者における感情的ストレスをもたらす、現在の試験の低予測値を含む、顕著な問題および障壁が残っている。
白血病試料のmiRNA分析
白血病は、T細胞の癌である。白血病の2つの最も一般的な型は、急性骨髄性白血病および慢性リンパ球性白血病である。急性骨髄性白血病は、主に未発達または初期の(まだ完全に発生または分化していない)細胞に影響を及ぼす急速に進行する疾患である。これらの未熟細胞は、それらの正常な機能を実施することができない。慢性白血病は、ゆっくりと進行し、より多くのより発生した細胞の成長を可能にする。概して、これらのより成熟した細胞は、それらの正常な機能のいくつかを実施し得る。miRNAが白血病によってどのように影響を受けるのか、またはどのように白血病に貢献している可能性があるのかを理解するために、白血病患者に由来する試料が、正常な個人に由来する試料と比較された。
アルツハイマー病試料のmiRNA分析
アルツハイマー病は、徐々にヒトの記憶ならびに学習する、論理的に考える、判断する、意思疎通する、および日々の活動を実施する能力を破壊する進行性脳障害である。アルツハイマー病が進行すると、個人は、不安、不信感、または動揺、ならびに妄想または幻覚などの、人格および行動における変化も経験し得る。
アルツハイマー病マウスモデルのmiRNA分析
アルツハイマー病(AD)は、認知症の最も一般的な型だが、現在、ADに対する分子的試験はなく、最も確実な診断は、ヒト脳切片における細胞外アミロイド斑および細胞内神経原線維タングルを同定するための死後の組織学的検査によってのみなされ得る。前途有望な新しい治療は、最も確実な診断に対する方法が開発され得るならば、ADのより良い管理の前途を提示する。早期および後期発症ヒトADの両方は、ApoEアポリポタンパク質トランスポーターをコードする配列の特定のハプロタイプにリンクされている。Apo Eマウス(JAX系統02052)は、ヒトアルツハイマー病(1,2,3)に対する動物モデルとしての役目をする。これらのマウスは、アポリポタンパク質E遺伝子におけるApoetm/Uncノックアウト突然変異に対する同型であり、脂質輸送における欠陥、コレステロール代謝における欠陥、および脳における黄色腫性損傷をもたらす。これらのマウスは、ストレス、害された学習および記憶、ならびにシナプス損害に対する変更された反応も示す。ADに関連するバイオマーカーを同定するために、本発明者らは、差次的発現miRNAを認証するために、Ambionにおいて開発された新しいマイクロアレイシステム、その後の、qRT-PCRアッセイを使用して、ApoEおよび対照マウスの脳領域におけるmRNAおよびマイクロRNA(miRNA)転写の全体的な発現プロファイリングを実施した。これらの調査は、対象マウスと比較してApoEの特定の脳領域において差次的に発現されるmiRNA、miR-182の同定を引き起こした。miR-182分子は、試験されたすべての脳領域(皮質、視床下部、小脳、および海馬)において異常調節され(dysregulated)、最も劇的な差は、ADマウスの皮質において〜10倍下方調節された(qRT-PCRによって決定されるように)。コンピューター分析が、候補mRNA標的を同定するために使用され、関連遺伝子産物レベルが、ADマウスにおいて査定された。これらの努力は、ADの診断および処置に対して有用な新しいRNAに基づくバイオマーカーの発見をもたらし得る。
多発性硬化症脳試料のmiRNA分析
正常脳とともに多発性硬化症を有する患者の脳に由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner(Axon)を使用して定量され、多発性硬化症および正常試料からのシグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。以下のmiRNAは、多発性硬化症脳試料の各々においてより高く発現された:miR-370、miR-30A、miR-132、mu-miR-298、miR-422A、miR-31、およびmiR-155。以下のmiRNAは、多発性硬化症脳試料の各々においてより低く発現された:mu-miR-322、miR-326、miR-328、miR-9as、miR-137、miR-126、miR-21、miR-181B、およびmiR-218。多発性硬化症試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、ヒトが多発性硬化症を有するかどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。
T細胞発生に関連するmiRNA
T細胞は、白血病およびリンパ腫の両方、ならびにHIV感染の主要な構成要素である。これらの疾患を理解することは、T細胞の分子的構成要素を理解することを必要とする。顕著な量が、T細胞発生に関してすでに公知である。T細胞発生は、胸腺において生じる;胸腺微小環境が、陽性および陰性選択と同様に分化を方向付ける。骨髄において造血幹細胞から発生したリンパ前駆細胞は、機能的T細胞へのそれらの抗原非依存性成熟を完成するために胸腺へ移動する。胸腺において、T細胞は、TCR、CD3、CD4またはCD8、およびCD2を含む、それらの特異的T細胞マーカーを発生する。前駆細胞が、CD2を発現し始めるが、まだそれらのTCR遺伝子を再配列していない場合(CD2+ CD3-)、それらは、ThおよびTc系統に対するマーカーであるCD4およびCD8に対して二重陰性である(CD4- CD8-)。胸腺における二重陰性細胞のうち、約20%は、再配列されたgd TCRを有し、約20%は、非常に均質なab TCRを有し、60%は、成熟ab T細胞の大部分になるようにされる。これらの細胞は、次に、接着分子CD44を発現し、次いで、IL-2受容体のα鎖(CD25)を発現する。CD44low CD25+二重陰性T細胞は、TCRβ鎖を再配列する。β鎖再配列は、D-J接合で始まり、V-DJ接合が続く。成功したb鎖再配列の機会が、2つのDJCb遺伝子クラスターの存在によって増加される。第一のクラスターにおける再配列が失敗した場合、第二における再配列が生じ得る。
心臓肥大に関連するmiRNA
慢性心不全を有する患者は、心臓肥大と呼ばれる心臓の拡張を発生する。心臓肥大の原因および影響は、大規模に立証されているが、分子シグナルを細胞変化にリンクする基礎をなす分子的メカニズムまたは心臓シグナル伝達経路は、ほとんど理解されないままである。心臓肥大を誘導するmiRNAは、診断的または治療的診療に対する標的を供給すると考えられる。
電気泳動精製システム
以前の実施例は、少ない容積の分離ゲルマトリクス(各々が0.5 mlよりも少ない)を有する小さな電極バッファーチャンバーを含むマイクロ電気泳動システムを使用するmiRNAの精製に関与した。この精製は、すべての望ましい種が、サイズスペクトルの小さな端にあるという事実に頼る。これは、これらの種がゲルマトリクスを通って完全に移動した後に、単にすべての下層電極バッファーの除去による試料の収集を可能にする。種は、アルコール沈殿または高アルコール濃度におけるガラスファイバーフィルター上での固定化(Ambion特許出願においてカバーされる)によって濃縮され得る。これは、試料を特定のnmサイズの孔を有するフィルターに通り抜けさせることに類似しているが、それは、原動力が、大気または遠心圧下での担体液の通過よりもむしろ、種の電気泳動運動であるという点で識別可能である。また、通り抜けられる分離マトリクスの全厚さが、実質的にはより大きいので(〜150対<1 mm)、分離は、より効率的である。システムは、下層電極バッファーを除去しかつ補充することによる連続収集をするために使用されてもよい。
Claims (33)
- 患者から入手された生物学的試料におけるmiRNAを分析するための方法であって、
前記試料からmiR-21を含むmiRNA発現プロファイルを生成する段階、および
前記発現プロファイルを非癌性の試料におけるmiRNA発現プロファイルと比較する段階を含み、
前記患者から入手された生物学的試料におけるmiR-21の発現レベルが、前記非癌性の試料におけるmiR-21の発現レベルに比較して増加していることに基づいて、前記患者から入手された生物学的試料が癌患者由来の試料であると同定され、かつ前記癌が、膀胱癌、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、および甲状腺癌からなる群より選択される、
方法。 - miRNAプロファイルが、let-7、let-7A、let-7C、let-7F-2、miR-7、miR-9a、miR-9-as、miR-10a、miR-15A、miR-16、miR-17、miR-20、miR-22、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-28、miR-29、miR-29b、miR-30a、miR-30a-as、miR-31、miR-92、miR-95、miR-99b、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-125a、miR-126、miR-126-as、miR-130a、miR-133、miR-135a、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-144、miR-145、miR-152、miR-181a、miR-181b、miR-182、miR-183、miR-186、miR-188、miR-189、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199a、miR-199a-as、miR-200b、miR-201、miR-203、miR-205、miR-211、miR-215、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-290、miR-291、miR-291-5P、miR-298、miR-301、miR-326、miR-328、mu-miR-329、miR-331、miR-341、miR-342、miR-344、miR-361、およびmiR-425からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに関与する、請求項1記載の方法。
- miRNAプロファイルが、miR-126、miR-143、miR-145、miR-188、miR-200B、miR-219、およびmiR-331の少なくとも1つに対するプロファイリングに関与する、請求項2記載の方法。
- miRNAプロファイルが、let-7、miR-16、miR-17、miR-22、miR-24、miR-26a、miR-29b、miR-30a、miR-125a、miR-181a、miR-182、miR-183、miR-195、miR-201、miR-205、miR-328、およびmiR-342の少なくとも1つに対するさらなるプロファイリングに関与する、請求項3記載の方法。
- 癌が乳癌である、請求項1記載の方法。
- miRNAプロファイルがmiR-15A、miR-21、miR-24、miR-135A、miR-145、miR-200B、miR-205、miR-211、miR-298、およびmu-miR-329からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較してmiRNAの一つまたは複数の発現における差が乳癌を示す、請求項5記載の方法。
- miRNAプロファイルが少なくともmiR-15A、miR-21、miR-24、miR-135A、miR-145、miR-200B、miR-205、miR-211、miR-298、およびmu-miR-329に対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較してmiRNAの一つまたは複数の発現における差が乳癌を示す、請求項6記載の方法。
- 非癌性試料と比較してmiR-135A、miR-145、miR-205、miR-211、miR-298、もしくはmu-miR-329の発現における減少および/またはmiR-15A、miR-21、miR-24、もしくはmiR-200Bの発現における増加が乳癌を示す、請求項6記載の方法。
- 癌が結腸癌である、請求項1記載の方法。
- miRNAプロファイルが、miR-31、miR-106A、miR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135A、miR-143、miR-145、miR-200B、miR-203、およびmiR-223からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較してmiRNAの一つまたは複数の発現における差が結腸癌を示す、請求項9記載の方法。
- miRNAプロファイルがmiR-21、miR-31、miR-106A、miR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135A、miR-143、miR-145、miR-200B、miR-203、およびmiR-223からなる群より選択される少なくとも3つのmiRNAに対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較してmiRNAの一つまたは複数の発現における差が結腸癌を示す、請求項10記載の方法。
- miRNAプロファイルが、miR-31、miR-106A、miR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135A、miR-143、miR-145、miR-200B、miR-203、およびmiR-223に対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較してmiRNAの一つまたは複数の発現における差が結腸癌を示す、請求項10記載の方法。
- 非癌性試料と比較してmiR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135A、miR-143、もしくはmiR-145の発現における減少および/またはmiR-21、miR-31、miR-106A、miR-200B、miR-203、もしくはmiR-223の発現における増加が結腸癌を示す、請求項10記載の方法。
- 癌が前立腺癌である、請求項1記載の方法。
- miRNAプロファイルがmiR-15A、miR-29、miR-141、miR-188、miR-290、およびmiR-331からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が前立腺癌を示す、請求項14記載の方法。
- miRNAプロファイルがmiR-15A、miR-21、miR-29、miR-141、miR-188、miR-290、およびmiR-331に対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が前立腺癌を示す、請求項15記載の方法。
- 非癌性試料と比較してmiR-188、miR-290、もしくはmiR-331の発現における減少および/またはmiR-15A、miR-21、miR-29、もしくはmiR-141の発現における増加が前立腺癌を示す、請求項14記載の方法。
- 癌が甲状腺癌である、請求項1記載の方法。
- miRNAプロファイルがmiR-15A、miR-30A-as、miR-31、miR-135A、miR-138、miR-152、miR-199A-as、miR-200B、miR-203、およびmiR-331からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が甲状腺癌を示す、請求項18記載の方法。
- miRNAプロファイルがmiR-15A、miR-21、miR-30A-as、miR-31、miR-135A、miR-138、miR-152、miR-199A-as、miR-200B、miR-203、およびmiR-331に対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が甲状腺癌を示す、請求項19記載の方法。
- 非癌性試料と比較してmiR-30A-as、miR-31、miR-135A、miR-138、miR-152、miR-199A-as、miR-203、もしくはmiR-331の発現における減少および/またはmiR-15A、miR-21、もしくはmiR-200Bの発現における増加が甲状腺癌を示す、請求項19記載の方法。
- 癌が肺癌である、請求項1記載の方法。
- miRNAプロファイルがlet-7a、let-7c、miR-26a、miR-30A-AS、miR-95、miR-125a、miR-126、miR-200b、miR-205、miR-331、およびmiR-342からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が肺癌を示す、請求項22記載の方法。
- miRNAプロファイルがlet-7a、let-7c、miR-21、miR-26a、miR-30A-AS、miR-95、miR-125a、miR-126、miR-200b、miR-205、miR-331、およびmiR-342からなる群より選択される少なくとも3つのmiRNAに対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が肺癌を示す、請求項23記載の方法。
- miRNAプロファイルがlet-7a、let-7c、miR-21、miR-26a、miR-30A-AS、miR-95、miR-125a、miR-126、miR-200b、miR-205、miR-331、およびmiR-342に対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が肺癌を示す、請求項24記載の方法。
- 非癌性試料と比較してlet-7a、let-7c、miR-26a、miR-30A-AS、miR-95、miR-125a、miR-126、miR-331、もしくはmiR-342の発現における減少および/またはmiR-21、miR-200B、もしくはmiR-205の発現における増加が肺癌を示す、請求項25記載の方法。
- 癌が膀胱癌である、請求項1記載の方法。
- miRNAプロファイルがmiR-9as、miR-133、miR-143、miR-145、miR-182、およびmiR-200Bからなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が膀胱癌を示す、請求項27記載の方法。
- miRNAプロファイルがmiR-9as、miR-21、miR-133、miR-143、miR-145、miR-182、およびmiR-200Bに対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が膀胱癌を示す、請求項28記載の方法。
- 非癌性試料と比較してmiR-133、miR-143、もしくはmiR-145の発現における減少および/またはmiR-9as、miR-21、miR-182、もしくはmiR-200Bの発現における増加が膀胱癌を示す、請求項28記載の方法。
- 試料が固定された、請求項1記載の方法。
- 試料におけるmRNAおよび/またはrRNAの少なくとも50%が分解されている、請求項1記載の方法。
- 試料におけるmRNAおよび/またはrRNAの少なくとも90%が分解されている、請求項31記載の方法。
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