WO2012063894A1 - マイクロｒｎａのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物 - Google Patents

マイクロｒｎａのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物 Download PDF

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中城公一
浜川裕之
田中宏史
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国立大学法人愛媛大学
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Definitions

  • the present invention relates to a composition comprising an antisense oligonucleotide of microRNA.
  • Micro RNA is a small molecule RNA consisting of 18-25 bases, and inhibits translation into the protein by binding to the target mRNA.
  • miRNA / miRNA is a small molecule RNA consisting of 18-25 bases, and inhibits translation into the protein by binding to the target mRNA.
  • miRBase® http://www.miRbase.org/
  • these miRNA expression or functional abnormalities are involved in various diseases.
  • Patent Document 1 many miRNAs whose expression is enhanced or suppressed in cancer tissues or cancer cells have been identified by comprehensive expression analysis using miRNA microarrays.
  • MiR-21, miR-155, miR-17-5p, miR-19, etc. are known as miRNAs whose expression is enhanced in cancer.
  • miR-19 is necessary and sufficient for cell carcinogenesis, and its target One of them was shown to be a tumor suppressor gene PTEN.
  • PTEN a tumor suppressor gene
  • miRNAs have decreased expression due to cancer, and such miRNAs have been reported such as let-7, miR-15a, miR-34a, miR-143, miR-145 and the like.
  • let-7 has been shown to correlate with decreased expression and prognosis in lung cancer, and its target is known to contain the oncogene Ras.
  • MiRNA that exerts tumor suppressor-like functions targeting oncogenes is called Tumor suppressor miR.
  • the present invention provides a composition containing an antisense oligonucleotide of microRNA that can inhibit the growth of cancer cells.
  • the present invention includes an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA is from hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-346, and hsa-miR-361-3p.
  • the present invention relates to a composition for suppressing the growth of human cancer cells, selected from the group consisting of:
  • the present invention includes an antisense oligonucleotide of microRNA, and the microRNA is hsa-miR-92a, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-197, hsa-miR-328, hsa-miR-346, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-605, hsa-miR-766, hsa-miR-1228, hsa-miR-1252,
  • the present invention relates to a composition for suppressing the growth of human head and neck cancer cells selected from the group consisting of hsa-miR-1260 and hsa-miR-1271.
  • the present invention growth inhibition of cancer cells becomes possible. Therefore, according to the present invention, it can contribute to cancer treatment and prevention, recurrence prevention, and the like.
  • FIG. 1 is an example of a fluorescent photograph showing the effect of a microRNA antisense oligonucleotide on the growth of human oral squamous cell carcinoma cell GFP-SAS.
  • FIG. 2 is an example of a graph showing the effect of microRNA antisense oligonucleotides on the growth of various cancer cells.
  • FIG. 3 is a graph showing an example of the cancer cell proliferation inhibitory effect of microRNA antisense oligonucleotides in vivo.
  • FIG. 4 is a photograph showing an example of the cancer cell proliferation inhibitory effect of microRNA antisense oligonucleotides in vivo.
  • the present invention includes the following aspects: [1] comprising an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA is selected from the group consisting of hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-346, and hsa-miR-361-3p A composition for inhibiting the growth of human cancer cells; [2] A pharmaceutical composition comprising an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA comprises hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-346, and hsa-miR-361-3p A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of human cancer selected from the group consisting of: [3] In order to suppress the growth of non-human cancer cells, comprising an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA is selected from the group consisting of miR-133, miR-3
  • An antisense oligonucleotide of microRNA wherein the microRNA is hsa-miR-92a, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-197, hsa-miR-328, hsa-miR-346, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-605, hsa-miR-766, hsa-miR-1228, hsa-miR-1252, hsa-miR-1260, And a composition for inhibiting the growth of human head and neck cancer cells selected from the group consisting of hsa-miR-1271; [6] A pharmaceutical composition comprising an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA comprises hsa-miR-92a, hs
  • microRNA / miRNA refers to a kind of low-molecular non-coding RNA, and has a normal meaning used in this technical field.
  • the microRNA referred to using an ID can refer to a database (for example, miRBase® (http://www.miRbase.org/)).
  • microRNA refers to mature microRNA consisting of 18 to 25 bases.
  • microRNA antisense oligonucleotide refers to an oligonucleotide having a base sequence complementary to a target microRNA, and a preferred form is a single-stranded oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotide of the microRNA is an oligonucleotide comprising a base sequence complementary to all or part of the base sequence of the target mature microRNA, more preferably, the target An oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to all or part of the base sequence of mature microRNA.
  • the length of the “microRNA antisense oligonucleotide” in the present invention is, for example, 8-25 nucleotides, 10-24 nucleotides, 10-22 nucleotides, 12-22 nucleotides, 10-20 nucleotides, 12 -20 nucleotides, 10-19 nucleotides, 12-19 nucleotides, 10-18 nucleotides, 12-18 nucleotides, 10-17 nucleotides, 12-17 nucleotides, 10-16 nucleotides, 12-16 nucleotides. It is considered that nonspecific microRNA inhibition can be further suppressed by shortening the length of the oligonucleotide sequence.
  • complementary means that two nucleotide sequences have the ability to correctly pair with each other. For example, if a certain oligonucleotide can hydrogen bond with a nucleotide at the corresponding position in the target microRNA at a certain position, the oligonucleotide and the microRNA are considered to be complementary to each other at that position. . When a sufficient number of nucleotides in the oligonucleotide can form hydrogen bonds with the corresponding nucleotides in the target microRNA and can form a stable complex, the oligonucleotide and the microRNA Are considered complementary to each other.
  • the antisense oligonucleotide of the microRNA is preferably an oligonucleotide comprising or consisting of a base sequence that is 100% complementary to the target microRNA.
  • nucleotide pairing refers to hydrogen bonding between bases.
  • DNA it refers to the binding form of A and T and G and C.
  • RNA A and U.
  • G and C a bonding form of G and C.
  • the antisense oligonucleotide of the microRNA may be an analog other than the above A, T (U), G, and C as long as it can pair with the nucleotide of the target microRNA.
  • the “oligonucleotide” refers to a known nucleic acid analog in addition to DNA and RNA, and an oligonucleotide formed by mixing them.
  • the oligonucleotide may include a modified oligonucleotide in which a known modification is performed.
  • nucleic acid analogs include known nucleic acid analogs such as LNA (Locked Nucleic Acid) and PNA (Peptide Nucleic Acid).
  • the antisense oligonucleotide in the present specification preferably contains a nucleic acid analog, more preferably contains an LNA, and more preferably contains a nucleic acid analog from the viewpoint of improving specificity to a target microRNA and improving cell growth suppression. More preferably, the rate exceeds 50%.
  • microRNA antisense oligonucleotides containing LNA refer to, for example, JP2009-532392 (WO2007 / 000169).
  • the base in the “microRNA antisense oligonucleotide” may be a non-DNA / RNA base other than the base of DNA and RNA, as long as the function of the target microRNA can be inhibited.
  • the RNA may be substituted with fluorine or the like.
  • the bond between nucleosides may be a bond other than a phosphate bond, and from the viewpoint of stability, a sulfur (S) -containing bond. (That is, it is a phosphorothioate type oligonucleotide).
  • S sulfur
  • “suppression of cell growth” includes inhibition of cell growth and cell death, and includes suppression of cell growth in in vivo, in vitro, and ex vivo.
  • “cell” includes human cells and non-human cells. Non-human cells include organisms with microRNA mechanisms. In the present specification, “non-human” includes primates excluding humans, mammals excluding humans, and vertebrates excluding humans.
  • the present invention includes an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA is from hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-346, and hsa-miR-361-3p.
  • the present invention relates to a composition for suppressing the growth of human cancer cells (hereinafter also referred to as “first composition of the present invention”) selected from the group consisting of:
  • the sequences of the microRNA (mature type) are described in SEQ ID NOs: 1 to 4 in Table 1 below, respectively.
  • microRNA antisense oligonucleotide that can be contained in the first composition of the present invention is an oligonucleotide consisting of any one of the base sequences of SEQ ID NOS: 5 to 8 in Table 1 or a partial sequence thereof.
  • the length of the oligonucleotide and the nucleic acid analog are as described above.
  • the 1st composition of this invention can contain 1 type or multiple types of antisense oligonucleotide.
  • one embodiment of the antisense oligonucleotide for the microRNA of hsa-miR-133a or hsa-miR-133b is an anti-sense that can inhibit both hsa-miR-133a and hsa-miR-133b. Includes sense oligonucleotides.
  • the cancer of human cancer cells for which the first composition of the present invention suppresses growth is not particularly limited, and examples thereof include head and neck cancer, malignant melanoma, basal cell cancer, ovarian cancer, and breast cancer. , Non-small cell lung cancer, renal cell cancer, bladder cancer, recurrent superficial bladder cancer, stomach cancer, prostate cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, lung cancer, cervical cancer, cervical dysplasia Including laryngeal papillomatosis, colon cancer, colorectal cancer, and carcinoid tumors.
  • the cancer of human cancer cells for which the composition of this embodiment suppresses growth preferably includes head and neck cancer, lung cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, and prostate cancer.
  • head and neck cancer refers to cancer that can be formed from the neck excluding the brain and eyes, and generally includes oral cancer, nasal sinus cancer, lip cancer, and pharynx. Cancer, laryngeal cancer, cervical tumor, ear cancer.
  • oral cancer generally refers to cancer that is caused by the mucous membrane of a part constituting the oral cavity, such as gingiva, tongue, cheek, palate, floor of mouth, and salivary gland.
  • the first composition of the present invention may contain a reagent, a drug, and a medium that are suitable for bringing the target human cancer cell into contact with the subject and suppressing the growth of the cell.
  • the first composition of the present invention may be in a lyophilized form.
  • the above-described first composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for treating or preventing the above-described cancer. Therefore, in another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA is hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-346, And a pharmaceutical composition for treating or preventing human cancer selected from the group consisting of hsa-miR-361-3p (hereinafter also referred to as “first pharmaceutical composition of the present invention”). As used herein, prevention of cancer includes prevention of recurrence of cancer.
  • microRNA antisense oligonucleotide that can be included in the first pharmaceutical composition of the present invention is an oligonucleotide comprising any one of the base sequences of SEQ ID NOS: 5 to 8 in Table 1 above or a partial sequence thereof. .
  • the length of the oligonucleotide and the nucleic acid analog are as described above.
  • the 1st pharmaceutical composition of this invention may contain 1 type or multiple types of antisense oligonucleotide.
  • the first pharmaceutical composition of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical carrier is not particularly limited, but, for example, a carrier capable of increasing the efficiency with which a antisense oligonucleotide of micro RNA enters a target site, tissue, cell, etc., for example, atelocollagen, liposome, cationic liposome Etc.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited, and examples thereof include injections, creams, ointments, tablets, suspensions and the like.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include injection, oral, topical, intranasal, rectal, intravenous, and intraarterial administration.
  • the present invention provides, as a further aspect, the growth of a non-human cancer cell comprising an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA is selected from the group consisting of miR-133, miR-346, and miR-361. Relates to a composition for suppressing the above (hereinafter, also referred to as "second composition of the present invention").
  • Antisense nucleotides of microRNAs selected from the group consisting of can be used, and antisense nucleotides for the corresponding microRNA sequences can be used for other organisms as well.
  • the 2nd composition of this invention can contain 1 type or multiple types of antisense oligonucleotide.
  • the cancer of the non-human cancer cell for which the second composition of the present invention suppresses growth is not particularly limited, and examples thereof include head and neck cancer, malignant melanoma, basal cell cancer, ovarian cancer, Breast cancer, non-small cell lung cancer, renal cell cancer, bladder cancer, recurrent superficial bladder cancer, gastric cancer, prostate cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, lung cancer, cervical cancer, cervical formation Includes abnormalities, laryngeal papillomatosis, colon cancer, colorectal cancer, and carcinoid tumors.
  • the cancer of the non-human cancer cell for which the composition of this embodiment suppresses growth preferably includes head and neck cancer, lung cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, and prostate cancer.
  • the 2nd composition of this invention may contain the reagent, chemical
  • the second composition of the present invention may be in a lyophilized form.
  • the present invention provides a non-human pharmaceutical composition comprising an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA comprises hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR.
  • second pharmaceutical composition of the present invention a pharmaceutical composition for treatment or prevention of non-human cancer selected from the group consisting of hsa-miR-361-3p (hereinafter also referred to as "second pharmaceutical composition of the present invention") .)
  • the length of the antisense oligonucleotide and the nucleic acid analog of microRNA that can be contained in the second pharmaceutical composition of the present invention are as described above.
  • the second pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more types of antisense oligonucleotides.
  • the second pharmaceutical composition of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical carrier is not particularly limited, but, for example, a carrier capable of increasing the efficiency with which a antisense oligonucleotide of micro RNA enters a target site, tissue, cell, etc., for example, atelocollagen, liposome, cationic liposome Etc.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited, and examples thereof include injections, creams, ointments, tablets, suspensions and the like.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include injection, oral, topical, intranasal, rectal, intravenous, and intraarterial administration.
  • the present invention includes an antisense oligonucleotide of microRNA, and the microRNA is hsa-miR-92a, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-197, hsa-miR-328, hsa-miR-346, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-605, hsa-miR-766, hsa-miR-1228, hsa-miR-1252,
  • a composition for suppressing the growth of human head and neck cancer cells selected from the group consisting of hsa-miR-1260 and hsa-miR-1271 (hereinafter also referred to as “third composition of the present invention”) .)
  • the third composition of the present invention may contain one or more types of antisense oligonucleotide
  • the cancer whose growth is to be suppressed is human oral squamous cell carcinoma, hsa-miR-92a, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-197, hsa-miR-328, hsa-miR-346, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-605, hsa-miR-766, hsa-miR- It includes an antisense nucleotide targeting a microRNA selected from the group consisting of 1228, hsa-miR-1252, hsa-miR-1260, and hsa-miR-1271.
  • the sequence of the target microRNA is preferably SEQ ID NOS: 1-4 and 9-18 in Table 2 below.
  • an antisense oligonucleotide of microRNA that can be included in the third composition of the present embodiment, from the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 5 to 8 and 19 to 28 in the following Table 2, or a partial sequence thereof The following oligonucleotide is mentioned.
  • the length of the oligonucleotide and the nucleic acid analog are as described above.
  • the cancer whose growth is to be suppressed is a human salivary gland cancer, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, and hsa-miR-361-
  • An antisense nucleotide targeting a microRNA selected from the group consisting of 3p is included.
  • the sequence of the target microRNA (mature type) is preferably SEQ ID Nos. 1, 2 and 4 in Table 3 below.
  • a microRNA antisense oligonucleotide that can be included in the third composition of the present embodiment, an oligo consisting of any one of the base sequences of SEQ ID NOs: 5, 6, and 8 in Table 3 below or a partial sequence thereof Nucleotides are mentioned. The length of the oligonucleotide and the nucleic acid analog are as described above.
  • the third composition of the present invention may contain a reagent, a drug, and a medium that are suitable for bringing the target human cancer cell into contact with the cell and suppressing the growth of the cell.
  • the first composition of the present invention may be in a lyophilized form.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA is hsa-miR-92a, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-197, hsa-miR-328, hsa-miR-346, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-605, hsa-miR-766, hsa-miR- 1228, hsa-miR-1252, hsa-miR-1260, and a pharmaceutical composition for treating or preventing human head and neck cancer selected from the group consisting of hsa-miR-1271
  • the cancer to be treated or prevented is human oral squamous cell carcinoma, hsa-miR-92a, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-197, hsa-miR-328, hsa-miR-346, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-605, hsa-miR-766, hsa-miR- It includes an antisense nucleotide targeting a microRNA selected from the group consisting of 1228, hsa-miR-1252, hsa-miR-1260, and hsa-miR-1271.
  • the target microRNA (mature type) sequences are preferably SEQ ID NOs: 1 to 4 and 9 to 18 in Table 2 above.
  • the oligonucleotide consists of any one of the base sequences of SEQ ID NOS: 5 to 8 and 19 to 28 in Table 2 or a partial sequence thereof. An oligonucleotide is mentioned. The length of the oligonucleotide and the nucleic acid analog are as described above.
  • the cancer to be treated or prevented is human salivary gland cancer, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, and hsa-miR-361-
  • An antisense nucleotide targeting a microRNA selected from the group consisting of 3p is included.
  • the sequence of the target microRNA (mature type) is preferably SEQ ID Nos. 1, 2 and 4 in Table 3 above.
  • an oligo consisting of the base sequence of any of SEQ ID NOs: 5, 6 and 8 in Table 3 above or a partial sequence thereof Nucleotides are mentioned.
  • the length of the oligonucleotide and the nucleic acid analog are as described above.
  • the third pharmaceutical composition of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical carrier is not particularly limited, but, for example, a carrier capable of increasing the efficiency with which a antisense oligonucleotide of micro RNA enters a target site, tissue, cell, etc., for example, atelocollagen, liposome, cationic liposome Etc.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited, and examples thereof include injections, creams, ointments, tablets, suspensions and the like.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include injection, oral, topical, intranasal, rectal, intravenous, and intraarterial administration.
  • the present invention comprises an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA is miR-92, miR-133, miR-139, miR-197, miR-328, miR-346, miR-361. , MiR-605, miR-766, miR-1228, miR-1252, miR-1260, and a composition for suppressing the growth of non-human cancer cells selected from the group consisting of miR-1271 (hereinafter, Also referred to as “fourth composition of the present invention”.
  • the 4th composition of this invention can contain 1 type or multiple types of antisense oligonucleotide. Oligonucleotide lengths and nucleic acid analogs that can be included are as described above.
  • the fourth composition of the present invention may be in a lyophilized form.
  • the cancer whose growth is to be suppressed is a non-human oral squamous cell carcinoma, miR-92, miR-133, miR-139, miR-197, miR -328, miR-346, miR-361, miR-605, miR-766, miR-1228, miR-1252, miR-1260, and antisense targeting a microRNA selected from the group consisting of miR-1271 Contains nucleotides.
  • the target microRNA (mature type) sequence an antisense nucleotide for the corresponding microRNA sequence in the target non-human organism can be used.
  • the cancer whose growth is to be suppressed is a non-human salivary gland cancer, and is from the group consisting of miR-133a, miR-133b, and miR-361-3p.
  • antisense nucleotides that target the selected microRNA As the target microRNA (mature type) sequence, an antisense nucleotide for the corresponding microRNA sequence in the target non-human organism can be used.
  • the fourth composition of the present invention described above can be used as a pharmaceutical composition for treating or preventing non-human head and neck cancer. Therefore, in another aspect, the present invention provides a non-human pharmaceutical composition comprising an antisense oligonucleotide of microRNA, wherein the microRNA comprises miR-92, miR-133, miR-139, miR-197. , MiR-328, miR-346, miR-361, miR-605, miR-766, miR-1228, miR-1252, miR-1260, and miR-1271 human head and neck cancer selected from the group
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing (hereinafter also referred to as “the fourth pharmaceutical composition of the present invention”).
  • the length of the antisense oligonucleotide and the nucleic acid analog of microRNA that can be contained in the fourth pharmaceutical composition of the present invention are as described above. Note that the fourth pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more types of antisense oligonucleotides.
  • the cancer to be treated or prevented is a non-human oral squamous cell carcinoma, miR-92, miR-133, miR-139, miR-197, Anti-targeting microRNAs selected from the group consisting of miR-328, miR-346, miR-361, miR-605, miR-766, miR-1228, miR-1252, miR-1260, and miR-1271 Contains sense nucleotides.
  • the target microRNA (mature type) sequence an antisense nucleotide for the corresponding microRNA sequence in the target non-human organism can be used.
  • the fourth pharmaceutical composition of the present invention is a group consisting of miR-133a, miR-133b, and miR-361-3p, wherein the cancer to be treated or prevented is a non-human salivary gland cancer.
  • An antisense nucleotide targeting a microRNA selected from As the target microRNA (mature type) sequence an antisense nucleotide for the corresponding microRNA sequence in the target non-human organism can be used.
  • the fourth pharmaceutical composition of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical carrier is not particularly limited, but, for example, a carrier capable of increasing the efficiency with which a antisense oligonucleotide of micro RNA enters a target site, tissue, cell, etc., for example, atelocollagen, liposome, cationic liposome Etc.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited, and examples thereof include injections, creams, ointments, tablets, suspensions and the like.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include injection, oral, topical, intranasal, rectal, intravenous, and intraarterial administration.
  • compositions in this invention growth of the human cancer cell made into object can be suppressed. Therefore, this invention relates to the method of suppressing the growth of the cancer cell including making these compositions contact the human cancer cell of object as another aspect.
  • the contact method is not particularly limited, and a method that can introduce the antisense oligonucleotide of microRNA in the composition into a cancer cell as a target can be employed.
  • One embodiment of introducing an antisense oligonucleotide of microRNA into a cancer cell is the lipofection method.
  • examples of the dose of the antisense oligonucleotide to cells during the lipofection method and other introduction methods include 10 to 25 nM.
  • the dosage form of the composition to be administered relating to a method for suppressing the growth of cancer cells including administering these pharmaceutical compositions to a subject is not particularly limited. Injections, creams, ointments, tablets, suspensions and the like can be mentioned.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include injection, oral, topical, intranasal, rectal, intravenous, and intraarterial administration. Administration will depend on the severity and responsiveness of the condition being treated and the course of treatment.
  • Optimal dosing schedules can be calculated from measurements of drug accumulation in the subject's body.
  • the optimal dose may vary depending on the relative effectiveness of the individual oligonucleotides. In general, it can be estimated based on the EC50 found to be effective in in vitro and in vivo animal models. Generally, the dose is 0.01 ⁇ g to 1 g / kg body weight, preferably 0.01 to 100 mg / kg body weight, more preferably 1 to 10 mg / kg body weight.
  • the administration frequency may be one or more times per day, one week, one month or one year, or once every 2 to 10 years, or by continuous infusion for several hours to several months. The number of repeated administrations can be estimated based on the measured drug concentration in the body fluid or tissue and the residence time. After successful treatment, it may be desirable for the subject to receive maintenance therapy to prevent recurrence of the condition.
  • the growth of the non-human cancer cell made into object can be suppressed. Therefore, this invention relates to the method of suppressing the growth of the cancer cell including making these compositions contact the nonhuman cancer cell of object as another aspect.
  • the contact method is not particularly limited, and a method that can introduce the antisense oligonucleotide of microRNA in the composition into a cancer cell as a target can be employed.
  • the dosage form of the composition to be administered relating to a method for inhibiting the growth of cancer cells including administering these pharmaceutical compositions to a non-human subject is not particularly limited, For example, injections, creams, ointments, tablets, suspensions and the like can be mentioned.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include injection, oral, topical, intranasal, rectal, intravenous, and intraarterial administration. Administration will depend on the severity and responsiveness of the condition being treated and the course of treatment.
  • Optimal dosing schedules can be calculated from measurements of drug accumulation in the subject's body.
  • the optimal dose may vary depending on the relative effectiveness of the individual oligonucleotides. In general, it can be estimated based on the EC50 found to be effective in in vitro and in vivo animal models. Generally, the dose is 0.01 ⁇ g to 1 g / kg body weight, preferably 0.01 to 100 mg / kg body weight, more preferably 1 to 10 mg / kg body weight.
  • the administration frequency may be one or more times per day, one week, one month or one year, or once every 2 to 10 years, or by continuous infusion for several hours to several months. The number of repeated administrations can be estimated based on the measured drug concentration in the body fluid or tissue and the residence time. After successful treatment, it may be desirable for the subject to receive maintenance therapy to prevent recurrence of the condition.
  • the miRNA knockdown library was used to comprehensively analyze the effects on growth when microRNA was inhibited in the following two types of human head and neck cancer cell lines. Specifically, the following conditions were used. [Cell lines used] GFP stable expression strains GFP-SAS and GFP-ACCM, which were isolated and established by introducing a green fluorescent protein (GFP) gene into human oral squamous cell carcinoma cell line SAS and human salivary gland cancer cell line ACCM, were used.
  • GFP green fluorescent protein
  • Each well of a 96-well plastic plate (trade name: BD Falcon, manufactured by BD) has 160 ⁇ l of 10% FBS-containing DMEM medium containing 2 ⁇ 10 3 human oral cancer cell lines GFP-SAS or GFP-ACCM and 918 types of humans.
  • Opti-MEM containing LNA (Locked Nucleic Acid) / DNA knockdown probe for microRNA (trade name: miRCURY LNA TM microRNA Knockdown Library-Human v12.0, manufactured by EXIQON) 5 pmol each, RNAiMAX (manufactured by Invitrogen) 0.4 ⁇ l 40 ⁇ l (Invitrogen) was mixed and added.
  • OncomiR 14 types of human oral squamous cell carcinoma cell GFP-SAS (Table 4 below) and 2 types of human salivary gland cancer cell GFP-ACCM (Table 5 below) OncomiR was identified.
  • the two types of OncomiR in human salivary gland cancer cells were OncomiR in human oral squamous cell carcinoma cells.
  • IDs, accession numbers, and mature microRNA sequences in the identified OncomiR miRBase are shown.
  • Antisense oligonucleotides for hsa-miR-133a / b, hsa-miR-346, and hsa-miR-361-3p are knockdown probes having the sequences shown in Table 6 below (trade name: miRCURY LNA microRNA Inhibitor, manufactured by EXIQON) Was used. As a negative control, a trade name: miRCURY Knockdown control probe (SEQ ID NO: 32, manufactured by EXIQON) was used. These oligonucleotides contain LNA (trade name: Locked Nucleic Acid) (including about 8 bases of LNA for about 20 bases of DNA).
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • Opti-MEM containing 80 ⁇ l of complete medium containing 2 ⁇ 10 3 various human cancer cells in each well of a 96-well plastic plate, knockdown probe 2.5 pmol of the sequence shown in Table 3 below for miRNA, and 0.2 ⁇ l of RNAiMAX (Invitrogen) 20 ⁇ l (Invitrogen) was mixed and added. After culturing for 80 hours, the fluorescence of GFP emitted by viable cells in each well was observed with a fluorescence microscope. The result is shown in FIG.
  • antisense oligonucleotides for hsa-miR-133a / b, hsa-miR-346, and hsa-miR-361-3p in Table 6 below are those of human oral squamous cell carcinoma cell GFP-SAS. Proliferation was completely suppressed.
  • Antisense oligonucleotides to hsa-miR-133a / b, hsa-miR-346, and hsa-miR-361-3p in Table 6 above are as follows: The effect on cell proliferation after introduction into various cancer cells was evaluated under the following conditions.
  • GFP-SAS and GFP-ACCM which were established by introducing the green fluorescent protein (GFP) gene into the human oral squamous cell carcinoma cell line SAS and the human salivary gland cancer cell line ACCM, human oral squamous epithelium Cancer cell line B88, human pancreatic cancer cell line MIAPaCa-2, human biliary tract cancer cell line HuCCT1, human lung squamous cell carcinoma cell line EBC-1, human lung adenocarcinoma cell line A549, human prostate cancer cell Strains LNCaP (androgen dependent), PC-3 (androgen independent) were used.
  • GFP green fluorescent protein
  • Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum (FBS; manufactured by Biosource International), 100 ⁇ g / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin, 0.25 mg / ml amphotericin B (produced by Invitrogen) was used for culturing these cell lines.
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM fetal bovine serum
  • RPMI1640 medium manufactured by Sigma-Aldrich
  • Opti-MEM containing 80 ⁇ l of complete medium containing 2 ⁇ 10 3 various human cancer cells in each well of a 96-well plastic plate, knockdown probe 2.5 pmol of the sequence shown in Table 3 above for miRNA, and 0.2 ⁇ l of RNAiMAX (Invitrogen) 20 ⁇ l (Invitrogen) was mixed and added. After culturing for 80 hours, the number of cells in each well was quantified using Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojindo). As a negative control, a trade name: miRCURY Knockdown control probe (SEQ ID NO: 32, manufactured by EXIQON) was used. The result is shown in FIG.
  • antisense oligonucleotides for hsa-miR-133a / b, hsa-miR-346, and hsa-miR-361-3p in Table 6 above are used for cancer cells other than head and neck cancer. However, it showed a growth inhibitory effect.
  • FIGS. 3 is a graph showing the tumor size calculated under the following conditions after 3, 6, 9, and 12 days after administration of antisense oligonucleotide and control
  • FIG. 4 is a photograph of the tumor after 12 days. .
  • Tumor model mice were prepared by transplanting 1 ⁇ 10 6 GFP-SAS cells subcutaneously on the back of 6-week-old male Balb / C nude mice. On day 12 after transplantation, tumor formation was confirmed, and an LNA / DNA antisense oligonucleotide and a control LNA / DNA oligonucleotide against hsa-miR-361-3p (both phosphorothioate-type oligonucleotides having the base sequences described in Table 6 above) About 20 bases of DNA (containing about 8 bases of LNA) was systemically administered via the tail vein, and systemically administered 7 days later.
  • the antitumor activity of nucleotides was evaluated.
  • the antisense oligonucleotide for hsa-miR-361-3p showed a cancer cell growth inhibitory effect even in vivo.
  • the present invention is useful in drug development related to cancer, cancer medical fields, cancer research fields, and the like.
  • SEQ ID NOs: 1-4 MicroRNA sequences registered in miRBase (hsa-miR-133a / b MIMAT0000427 / MIMAT0000770, hsa-miR-346 MIMAT0000773, hsa-miR-361-3p MIMAT0004682)
  • SEQ ID NO: 5-8 Complementary sequence of SEQ ID NO: 1-4
  • SEQ ID NO: 9-18 MicroRNA sequence registered in miRBase (hsa-miR-92a MIMAT0000092, hsa-miR-139-5p MIMAT0000250, hsa-miR -197 MIMAT0000227, hsa-miR-328 MIMAT0000752, hsa-miR-605 MIMAT0003273, hsa-miR-766 MIMAT0003888, hsa-miR-1228 MIMAT0005583, hsa-miR-1252 MIMAT0005944, hsa-m

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Abstract

がん細胞の生育阻害が可能な、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド含む組成物の提供。 一態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトがん細胞の生育を抑制するための組成物に関する。その他の態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒト頭頸部がん細胞の生育を抑制するための組成物に関する。

Description

マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物
　本発明は、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。
　マイクロＲＮＡ（microRNA / miRNA）は、１８～２５塩基からなる小分子ＲＮＡであり、標的ｍＲＮＡに結合することで、そのタンパク質への翻訳を阻害する。現在までに約１，１００種類のヒトmiRNAがデータベース（例えば、miRBase (http://www.miRbase.org/)）に登録されており、これらmiRNAの発現或いは機能異常が種々の疾患に関与していることが明らかにされている（非特許文献１参照）。特に、がんに関しては、miRNAマイクロアレイを用いた網羅的発現解析によって、がん組織又はがん細胞で発現亢進又は発現抑制されているmiRNAが多数同定されている（特許文献１）。
　がんで発現亢進するmiRNAとしては、miR-21、miR-155、miR-17-5p、miR-19等が知られており、中でもmiR-19は細胞がん化に必要十分であり、その標的の一つががん抑制遺伝子ＰＴＥＮであることが示された。このようにがん抑制遺伝子を標的としてがん遺伝子的な性質を有するmiRNAは、OncomiRと呼ばれている。
　また、多くのmiRNAはがんで発現低下しており、そのようなmiRNAとしては、let-7、miR-15a、miR-34a、miR-143、miR-145等が報告されている。なかでも、let-7は、肺がんにおいて発現低下と予後とが相関することが明らかにされており、その標的にがん遺伝子Ｒａｓが含まれていることが知られている。がん遺伝子を標的としてがん抑制遺伝子様の機能を発揮するmiRNAは、Tumor suppressor miRと呼ばれる。
　一方、OncomiRなどのような疾病に関与するmiRNAを標的分子として阻害しようとする試みも行われている。例えば、標的miRNAと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより、細胞内で標的miRNAと二本鎖を形成させて標的miRNAの機能を阻害することが提案されている（特許文献２）。
特表２００８－５００８３７号公表 特表２００９－５３２３９２号公表
Schickel R, et al. Oncogene 27: 5959-5974, 2008.
　がん治療の可能性をより高めるため、さらなるOncomiRの同定と、該OncomiRを阻害できる分子の開発が期待されている。そこで、本発明は、がん細胞の生育阻害が可能な、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド含む組成物を提供する。
　本発明は、一態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトがん細胞の生育を抑制するための組成物に関する。
　本発明は、その他の態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒト頭頸部がん細胞の生育を抑制するための組成物に関する。
　本発明によれば、がん細胞の生育阻害が可能となる。したがって、本発明によれば、がんの治療や予防、再発予防などに寄与できる。
図１は、ヒト口腔扁平上皮がん細胞GFP-SASの増殖に対するマイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響を示す蛍光写真の一例である。 図２は、さまざまながん細胞の増殖に対するマイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響を示すグラフの一例である。 図３は、in vivoにおけるマイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドのがん細胞増殖抑制効果の一例を示すグラフである。 図４は、in vivoにおけるマイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドのがん細胞増殖抑制効果の一例を示す写真である。
　本発明は、以下の態様、すなわち、
［１］マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトがん細胞の生育を抑制するための組成物；
［２］マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトのがんの治療又は予防のための医薬組成物；
［３］マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、miR-133、miR-346、及びmiR-361からなる群から選択される、非ヒトのがん細胞の生育を抑制するための組成物；
［４］前記がんが、頭頸部がん、肺がん、胆道がん、膵臓がん、及び前立腺がんからなる群から選択される、［１］から［３］のいずれかに記載の組成物；
［５］マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒト頭頸部がん細胞の生育を抑制するための組成物；
［６］マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒトの頭頸部がんの治療又は予防のための医薬組成物；
［７］マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、miR-92、miR-133、miR-139、miR-197、miR-328、miR-346、miR-361、miR-605、miR-766、miR-1228、miR-1252、miR-1260、及びmiR-1271からなる群から選択される、非ヒトの頭頸部がん細胞の生育を抑制するための組成物；
［８］ヒトがん細胞の生育を抑制する方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を前記がん細胞に接触させることを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトがん細胞の生育を抑制する方法；
［９］ヒトのがんの治療又は予防方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトのがんの治療又は予防方法；
［１０］非ヒトのがん細胞の生育を抑制する方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を前記がん細胞に接触させることを含み、前記マイクロＲＮＡが、miR-133、miR-346、及びmiR-361からなる群から選択される、非ヒトのがん細胞の生育を抑制する方法；
［１１］前記がんが、頭頸部がん、肺がん、胆道がん、膵臓がん、及び前立腺がんからなる群から選択される、［８］から［１０］のいずれかに記載の方法；
［１２］ヒト頭頸部がん細胞の生育を抑制する方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を前記がん細胞に接触させることを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒト頭頸部がん細胞の生育を抑制する方法；
［１３］ヒトの頭頸部がんの治療又は予防方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を前記がん細胞に接触させることを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒトの頭頸部がんの治療又は予防方法；
［１４］非ヒトの頭頸部がん細胞の生育を抑制する方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記マイクロＲＮＡが、miR-92、miR-133、miR-139、miR-197、miR-328、miR-346、miR-361、miR-605、miR-766、miR-1228、miR-1252、miR-1260、及びmiR-1271からなる群から選択される、非ヒトの頭頸部がん細胞の生育を抑制する方法；
に関する。
　本明細書において、「マイクロＲＮＡ（microRNA/miRNA）」とは、低分子non-codingRNAの一種をいい、当該技術分野において使用される通常の意味を示す。本明細書においてＩＤを用いて言及するマイクロＲＮＡは、データベース（例えば、miRBase (http://www.miRbase.org/)）を参照できる。本明細書においてマイクロＲＮＡは、特に言及がない場合、成熟型の１８～２５塩基からなるマイクロＲＮＡをいう。
　本明細書において「マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的とするマイクロＲＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをいい、好ましい形態は、一本鎖のオリゴヌクレオチドである。本発明の一実施形態として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とする成熟型マイクロＲＮＡの塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、標的とする成熟型マイクロＲＮＡの塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
　本発明における「マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド」の長さは、一実施形態において、例えば、８～２５ヌクレオチド、１０～２４ヌクレオチド、１０～２２ヌクレオチド、１２～２２ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、１２～２０ヌクレオチド、１０～１９ヌクレオチド、１２～１９ヌクレオチド、１０～１８ヌクレオチド、１２～１８ヌクレオチド、１０～１７ヌクレオチド、１２～１７ヌクレオチド、１０～１６ヌクレオチド、１２～１６ヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドの配列の長さを短くすることで非特異的なマイクロＲＮＡ阻害が一層抑制できることが考えられる。
　本明細書において、「相補的（又は、相補性）」とは、２つのヌクレオチド配列が互いに正しく対合する能力を持つことをいう。例えば、あるオリゴヌクレオチドが、ある位置において、標的とするマイクロＲＮＡにおける対応する位置のヌクレオチドと水素結合することができれば、該オリゴヌクレオチドと該マイクロＲＮＡとはその位置で互いに相補性であると考えられる。該オリゴヌクレオチド中の十分な数のヌクレオチドが標的マイクロＲＮＡ中の対応するヌクレオチドと水素結合を形成することができ、安定な複合体を形成することができるときは、該オリゴヌクレオチドと該マイクロＲＮＡとは互いに相補性であると考えられる。オリゴヌクレオチドの配列がin vitro又はin vivoで安定であるには、その標的マイクロＲＮＡと１００％相補性である必要はない。すなわち、用語「相補性」及び「特異的にハイブリダイズすることができる」は、オリゴヌクレオチドが標的分子と十分に強く特異的に結合し、非標的マイクロＲＮＡの機能に影響を与えずに標的の正常機能と望ましい干渉をもたらすことを意味する。本発明のその他の実施形態において、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、標的とするマイクロＲＮＡと１００％相補的な塩基配列を含む、或いは、からなるオリゴヌクレオチドである。
　本明細書において、ヌクレオチドの対合は、塩基間の水素結合をいい、ＤＮＡでいえば、ＡとＴとの結合形態及びＧとＣとの結合形態をいい、ＲＮＡでいえば、ＡとＵとの結合形態及びＧとＣとの結合形態を含む。マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とするマイクロＲＮＡのヌクレオチドと対合可能な範囲で上記Ａ，Ｔ（Ｕ），Ｇ，及びＣ以外の類似体であってもよい。
　本明細書において「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ及びＲＮＡに加え、公知の核酸アナログ、並びにこれらが混合されて構成されるオリゴヌクレオチドをいう。前記オリゴヌクレオチドは、公知の修飾が施された修飾オリゴヌクレオチドの形態を含みうる。核酸アナログとしては、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）等の公知の核酸アナログを含む。本明細書におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的マイクロＲＮＡへの特異性の向上、及び細胞増殖抑制の向上の点から、核酸アナログを含むことが好ましく、ＬＮＡを含むことがより好ましく、核酸アナログの含有率が５０％を超えることがより好ましい。ＬＮＡを含むマイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、特表2009‐532392（WO2007/000169）を参照できる。
　本明細書において「マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド」における塩基は、標的マイクロＲＮＡの機能を阻害できる範囲であれば、ＤＮＡ及びＲＮＡの塩基以外の非ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基であってもよく、ＤＮＡ及びＲＮＡがフッ素などで置換された形態であってもよい。また、本明細書における「マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド」において、ヌクレオシド間の結合は、リン酸エステル結合の以外の結合であってもよく、安定性の点からは、硫黄（Ｓ）含有結合（すなわち、ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドであること）が好ましい。なお、本明細書における「マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド」は、公知のもの、及び、市販のものを利用できる。
　本明細書において「細胞の生育の抑制」は、細胞の増殖の阻害及び細胞の死滅を含み、in vivo、in vitro、ex vivoにおける細胞の生育の抑制を含む。本明細書において「細胞」は、ヒト細胞及び非ヒト細胞を含む。非ヒト細胞としては、マイクロＲＮＡの機構を備える生物が挙げられる。また、本明細書において、「非ヒト」は、ヒトを除く霊長類、ヒトを除く哺乳類、ヒトを除く脊椎動物を含む。
　［第１の組成物］
　本発明は、一態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトがん細胞の生育を抑制するための組成物（以下、「本発明の第１の組成物」ともいう。）に関する。前記マイクロＲＮＡ（成熟型）の配列は、それぞれ、下記表１の配列番号１～４に記載される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の第１の組成物に含まれうるマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの一例として、上記表１の配列番号５～８のいずれかの塩基配列又はその部分配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドの長さ及び核酸アナログについては、上述のとおりである。なお、本発明の第１の組成物は、１種類又は複数種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含みうる。
　なお、本明細書において、hsa-miR-133a又はhsa-miR-133bのマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの一実施形態としては、hsa-miR-133a及びhsa-miR-133bの双方を阻害できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
　本発明の第１の組成物が生育を抑制する対象のヒトがん細胞のがんは、特に制限されず、例えば、頭頸部がん、悪性黒色腫、基底細胞がん、卵巣がん、乳がん、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、再発性表在性膀胱がん、胃がん、前立腺がん、胆道がん、膵臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮頸部形成異常、喉頭乳頭腫症、結腸がん、結腸直腸がん、及びカルチノイド腫瘍を含む。本態様の組成物が生育を抑制する対象のヒトがん細胞のがんは、好ましくは、頭頸部がん、肺がん、胆道がん、膵臓がん、及び前立腺がんを含む。
　本明細書において、「頭頸部がん」とは、脳と眼を除いた首から上にできるがんをいい、一般的に、口腔がん、鼻副鼻腔がん、口唇がん、咽頭がん、喉頭がん、頸部腫瘍、耳のがんを含む。また、本明細書において、口腔がんとは、一般に、歯肉、舌、頬部、口蓋、口底、唾液腺等の口腔を構成する部位の粘膜により発生するがんをいう。
　本発明の第１の組成物は、対象のヒトがん細胞と接触させて当該細胞の生育を抑制するために適した試薬、薬剤、媒体を含んでもよい。或いは、本発明の第１の組成物は、凍結乾燥された形態であってもよい。
　［第１の医薬組成物］
　上述した本発明の第１の組成物は、上述したがんの治療又は予防のための医薬組成物として使用できる。したがって、本発明は、その他の態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトのがんの治療又は予防のための医薬組成物（以下、「本発明の第１の医薬組成物」ともいう。）に関する。本明細書において、がんの予防は、がんの再発の予防を含む。
　本発明の第１の医薬組成物に含まれうるマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの一例として、上記表１の配列番号５～８のいずれかの塩基配列又はその部分配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドの長さ及び核酸アナログについては、上述のとおりである。なお、本発明の第１の医薬組成物は、１種類又は複数種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含みうる。
　本発明の第１の医薬組成物には、さらに、薬学的に許容されるキャリアを含んでもよい。前記薬学的キャリアとしては、特に制限されないが、例えば、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的の部位、組織、細胞等に侵入する効率を高めることができるキャリア、例えば、アテロコラーゲン、リポソーム、カチオンリポソーム等が挙げられる。本態様の医薬組成物の剤形は、特に制限されず、例えば、注射剤、クリーム剤、軟膏、錠剤、懸濁剤等が挙げられる。また、投与方法も特に制限されず、例えば、注射、経口、局所、鼻内、直腸、静脈内、動脈内投与等が挙げられる。
　［第２の組成物］
　本発明は、さらなる態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、miR-133、miR-346、及びmiR-361からなる群から選択される非ヒトのがん細胞の生育を抑制するための組成物（以下、「本発明の第２の組成物」ともいう。）に関する。例えば、イヌのがん細胞の生育を抑制する場合には、cfa-miR-133a/b/c(MIMIAT0009834, 0009835, 0009833)、cfa-miR-346(MIMIAT0004949)、及びcfa-miR-361(MIMIAT0006751)からなる群から選択されるマイクロＲＮＡのアンチセンスヌクレオチドを使用することができ、他の生物についても同様に対応するマイクロＲＮＡ配列についてのアンチセンスヌクレオチドを使用できる。なお、本発明の第２の組成物は、１種類又は複数種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含みうる。
　本発明の第２の組成物が生育を抑制する対象の非ヒトがん細胞のがんは、特に制限されず、例えば、頭頸部がん、悪性黒色腫、基底細胞がん、卵巣がん、乳がん、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膀胱がん、再発性表在性膀胱がん、胃がん、前立腺がん、胆道がん、膵臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮頸部形成異常、喉頭乳頭腫症、結腸がん、結腸直腸がん、及びカルチノイド腫瘍を含む。本態様の組成物が生育を抑制する対象の非ヒトがん細胞のがんは、好ましくは、頭頸部がん、肺がん、胆道がん、膵臓がん、及び前立腺がんを含む。本発明の第２の組成物は、対象の非ヒトがん細胞と接触させて当該細胞の生育を抑制するために適した試薬、薬剤、媒体を含んでもよい。或いは、本発明の第２の組成物は、凍結乾燥された形態であってもよい。
　［第２の医薬組成物］
　上述した本発明の第２の組成物は、上述したがんの治療又は予防のための医薬組成物として使用できる。したがって、本発明は、その他の態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む非ヒトの医薬組成物であって、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、非ヒトのがんの治療又は予防のための医薬組成物（以下、「本発明の第２の医薬組成物」ともいう。）に関する。本発明の第２の医薬組成物に含まれうるマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さ及び核酸アナログについては、上述のとおりである。なお、本発明の第２の医薬組成物は、１種類又は複数種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含みうる。
　本発明の第２の医薬組成物には、さらに、薬学的に許容されるキャリアを含んでもよい。前記薬学的キャリアとしては、特に制限されないが、例えば、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的の部位、組織、細胞等に侵入する効率を高めることができるキャリア、例えば、アテロコラーゲン、リポソーム、カチオンリポソーム等が挙げられる。本態様の医薬組成物の剤形は、特に制限されず、例えば、注射剤、クリーム剤、軟膏、錠剤、懸濁剤等が挙げられる。また、投与方法も特に制限されず、例えば、注射、経口、局所、鼻内、直腸、静脈内、動脈内投与等が挙げられる。
　［第３の組成物］
　本発明は、その他の態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒト頭頸部がん細胞の生育を抑制するための組成物（以下、「本発明の第３の組成物」ともいう。）に関する。なお、本発明の第３の組成物は、１種類又は複数種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含みうる。
　本発明の第３の組成物は、一実施形態において、生育を抑制する対象のがんがヒト口腔扁平上皮がんであり、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを標的とするアンチセンスヌクレオチドを含む。標的とするマイクロＲＮＡ（成熟型）の配列は、下記表２の配列番号１～４及び９～１８であることが好ましい。また、本実施形態の第３の組成物に含まれうるマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの一例として、下記表２の配列番号５～８及び１９～２８のいずれかの塩基配列又はその部分配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドの長さ及び核酸アナログについては、上述のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明の第３の組成物は、その他の実施形態において、生育を抑制する対象のがんがヒト唾液腺がんであり、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを標的とするアンチセンスヌクレオチドを含む。標的とするマイクロＲＮＡ（成熟型）の配列は、下記表３の配列番号１、２及び４であることが好ましい。また、本実施形態の第３の組成物に含まれうるマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの一例として、下記表３の配列番号５、６及び８のいずれかの塩基配列又はその部分配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドの長さ及び核酸アナログについては、上述のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明の第３の組成物は、対象のヒトがん細胞と接触させて当該細胞の生育を抑制するために適した試薬、薬剤、媒体を含んでもよい。或いは、本発明の第１の組成物は、凍結乾燥された形態であってもよい。
　［第３の医薬組成物］
　上述した本発明の第３の組成物は、ヒトの頭頸部がんの治療又は予防のための医薬組成物として使用できる。したがって、本発明は、その他の態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒトの頭頸部がんの治療又は予防のための医薬組成物（以下、「本発明の第３の医薬組成物」ともいう。）に関する。なお、本発明の第３の医薬組成物は、１種類又は複数種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含みうる。
　本発明の第３の医薬組成物は、一実施形態において、治療又は予防対象のがんがヒト口腔扁平上皮がんであり、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを標的とするアンチセンスヌクレオチドを含む。標的とするマイクロＲＮＡ（成熟型）の配列は、上記表２の配列番号１～４及び９～１８であることが好ましい。また、本発明の第３の組成物に含まれうるマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの一例として、上記表２の配列番号５～８及び１９～２８のいずれかの塩基配列又はその部分配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドの長さ及び核酸アナログについては、上述のとおりである。
　本発明の第３の医薬組成物は、その他の実施形態において、治療又は予防対象のがんがヒト唾液腺がんであり、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを標的とするアンチセンスヌクレオチドを含む。標的とするマイクロＲＮＡ（成熟型）の配列は、上記表３の配列番号１、２及び４であることが好ましい。また、本実施形態の第３の組成物に含まれうるマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの一例として、上記表３の配列番号５、６及び８のいずれかの塩基配列又はその部分配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドの長さ及び核酸アナログについては、上述のとおりである。
　本発明の第３の医薬組成物には、さらに、薬学的に許容されるキャリアを含んでもよい。前記薬学的キャリアとしては、特に制限されないが、例えば、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的の部位、組織、細胞等に侵入する効率を高めることができるキャリア、例えば、アテロコラーゲン、リポソーム、カチオンリポソーム等が挙げられる。本態様の医薬組成物の剤形は、特に制限されず、例えば、注射剤、クリーム剤、軟膏、錠剤、懸濁剤等が挙げられる。また、投与方法も特に制限されず、例えば、注射、経口、局所、鼻内、直腸、静脈内、動脈内投与等が挙げられる。
　［第４の組成物］
　本発明は、さらなる態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、miR-92、miR-133、miR-139、miR-197、miR-328、miR-346、miR-361、miR-605、miR-766、miR-1228、miR-1252、miR-1260、及びmiR-1271からなる群から選択される非ヒトのがん細胞の生育を抑制するための組成物（以下、「本発明の第４の組成物」ともいう。）に関する。なお、本発明の第４の組成物は、１種類又は複数種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含みうる。含まれうるオリゴヌクレオチドの長さ及び核酸アナログについては、上述のとおりである。なお、本発明の第４の組成物は、凍結乾燥された形態であってもよい。
　本発明の第４の組成物は、一実施形態において、生育を抑制する対象のがんが非ヒト口腔扁平上皮がんであり、miR-92、miR-133、miR-139、miR-197、miR-328、miR-346、miR-361、miR-605、miR-766、miR-1228、miR-1252、miR-1260、及びmiR-1271からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを標的とするアンチセンスヌクレオチドを含む。標的とするマイクロＲＮＡ（成熟型）の配列は、対象となる非ヒト生物における対応するマイクロＲＮＡ配列についてのアンチセンスヌクレオチドを使用できる。
　本発明の第４の組成物は、その他の実施形態において、生育を抑制する対象のがんが非ヒト唾液腺がんであり、miR-133a、miR-133b、及びmiR-361-3pからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを標的とするアンチセンスヌクレオチドを含む。標的とするマイクロＲＮＡ（成熟型）の配列は、対象となる非ヒト生物における対応するマイクロＲＮＡ配列についてのアンチセンスヌクレオチドを使用できる。
　［第４の医薬組成物］
　上述した本発明の第４の組成物は、非ヒトの頭頸部がんの治療又は予防のための医薬組成物として使用できる。したがって、本発明は、その他の態様として、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む非ヒトの医薬組成物であって、前記マイクロＲＮＡが、miR-92、miR-133、miR-139、miR-197、miR-328、miR-346、miR-361、miR-605、miR-766、miR-1228、miR-1252、miR-1260、及びmiR-1271からなる群から選択されるヒトの頭頸部がんの治療又は予防のための医薬組成物（以下、「本発明の第４の医薬組成物」ともいう。）に関する。本発明の第４の医薬組成物に含まれうるマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さ及び核酸アナログについては、上述のとおりである。なお、本発明の第４の医薬組成物は、１種類又は複数種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含みうる。
　本発明の第４の医薬組成物は、一実施形態において、治療又は予防の対象のがんが非ヒト口腔扁平上皮がんであり、miR-92、miR-133、miR-139、miR-197、miR-328、miR-346、miR-361、miR-605、miR-766、miR-1228、miR-1252、miR-1260、及びmiR-1271からなる群から選択されるマイクロＲＮＡを標的とするアンチセンスヌクレオチドを含む。標的とするマイクロＲＮＡ（成熟型）の配列は、対象となる非ヒト生物における対応するマイクロＲＮＡ配列についてのアンチセンスヌクレオチドを使用できる。
　本発明の第４の医薬組成物は、その他の実施形態において、治療又は予防の対象のがんが非ヒト唾液腺がんであり、miR-133a、miR-133b、及びmiR-361-3pからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを標的とするアンチセンスヌクレオチドを含む。標的とするマイクロＲＮＡ（成熟型）の配列は、対象となる非ヒト生物における対応するマイクロＲＮＡ配列についてのアンチセンスヌクレオチドを使用できる。
　本発明の第４の医薬組成物には、さらに、薬学的に許容されるキャリアを含んでもよい。前記薬学的キャリアとしては、特に制限されないが、例えば、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的の部位、組織、細胞等に侵入する効率を高めることができるキャリア、例えば、アテロコラーゲン、リポソーム、カチオンリポソーム等が挙げられる。本態様の医薬組成物の剤形は、特に制限されず、例えば、注射剤、クリーム剤、軟膏、錠剤、懸濁剤等が挙げられる。また、投与方法も特に制限されず、例えば、注射、経口、局所、鼻内、直腸、静脈内、動脈内投与等が挙げられる。
　［ヒトがん細胞の増殖抑制方法］
　本発明における第１及び第３の組成物によれば、対象とするヒトのがん細胞の生育を抑制できる。したがって、本発明は、その他の態様として、これらの組成物を対象のヒトがん細胞と接触させることを含むがん細胞の生育を抑制する方法に関する。接触方法は特に制限されず、前記組成物中のマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象とするがん細胞に導入できる方法が採用できる。マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドをがん細胞に導入する実施形態の一つとしてリポフェクション法が挙げられる。また、リポフェクション法及びその他の導入方法時における前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への投与量としては、例えば、１０～２５ｎＭが挙げられる。
　［ヒトのがんの治療及び又は予防方法］
　本発明における第１及び第３の医薬組成物によれば、対象とするヒトのがんの治療や予防が可能となる。したがって、本発明は、その他の態様として、これらの医薬組成物を対象に投与することを含むがん細胞の生育を抑制する方法に関する投与する組成物の剤形は、特に制限されず、例えば、注射剤、クリーム剤、軟膏、錠剤、懸濁剤等が挙げられる。また、投与方法も特に制限されず、例えば、注射、経口、局所、鼻内、直腸、静脈内、動脈内投与等が挙げられる。投与は、治療する病状の重症度と反応性、及び治療経過に依存する。最適な投薬スケジュールは、対象の体内への薬剤の蓄積量の測定値から計算することができる。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的有効性によって異なりうる。一般的には、in vitro及びin vivo動物モデルで有効であることが分かったＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般的には、用量は０．０１μｇ～１ｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは１～１０ｍｇ／ｋｇ体重である。投与回数としては、１日、１週間、１月間又は１年間に１回又はそれ以上、又は２～１０年間に１回投与するか、あるいは数時間～数カ月間連続注入により投与することができる。投与の反復回数は、測定した体液又は組織中の薬剤濃度と滞留時間に基づいて推定することができる。治療の成功後、病状の再発を防ぐために対象は維持療法を受けることが望ましい場合もある。
　［非ヒトがん細胞の増殖抑制方法］
　本発明における第２及び第４の組成物によれば、対象とする非ヒトのがん細胞の生育を抑制できる。したがって、本発明は、その他の態様として、これらの組成物を対象の非ヒトがん細胞と接触させることを含むがん細胞の生育を抑制する方法に関する。接触方法は特に制限されず、前記組成物中のマイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象とするがん細胞に導入できる方法が採用できる。
　［非ヒトのがんの治療及び又は予防方法］
　本発明における第２及び第４の医薬組成物によれば、対象とする非ヒトのがんの治療や予防が可能となる。したがって、本発明は、その他の態様として、これらの医薬組成物を非ヒト対象に投与することを含むがん細胞の生育を抑制する方法に関する投与する組成物の剤形は、特に制限されず、例えば、注射剤、クリーム剤、軟膏、錠剤、懸濁剤等が挙げられる。また、投与方法も特に制限されず、例えば、注射、経口、局所、鼻内、直腸、静脈内、動脈内投与等が挙げられる。投与は、治療する病状の重症度と反応性、及び治療経過に依存する。最適な投薬スケジュールは、対象の体内への薬剤の蓄積量の測定値から計算することができる。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的有効性によって異なりうる。一般的には、in vitro及びin vivo動物モデルで有効であることが分かったＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般的には、用量は０．０１μｇ～１ｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは１～１０ｍｇ／ｋｇ体重である。投与回数としては、１日、１週間、１月間又は１年間に１回又はそれ以上、又は２～１０年間に１回投与するか、あるいは数時間～数カ月間連続注入により投与することができる。投与の反復回数は、測定した体液又は組織中の薬剤濃度と滞留時間に基づいて推定することができる。治療の成功後、病状の再発を防ぐために対象は維持療法を受けることが望ましい場合もある。
　１．ヒト頭頸部がん細胞にけるOncomiRの同定
　miRNA knockdown libraryを用い、下記２種類のヒト頭頸部がん細胞株におけるマイクロＲＮＡを阻害した場合の生育に対する影響を網羅的に解析した。具体的には下記の条件で行った。
〔使用した細胞株〕
　ヒト口腔扁平上皮がん細胞株ＳＡＳ及びヒト唾液腺がん細胞株ＡＣＣＭにgreen fluorescent protein（ＧＦＰ）遺伝子を導入して分離樹立したＧＦＰ安定発現株GFP-SAS及びGFP-ACCMを使用した。
〔miRNA knockdown library を用いた網羅的機能解析〕
　９６ウェルプラスチックプレート（商品名：BD Falcon、BD社製）の各ウェルに、ヒト口腔がん細胞株GFP-SASあるいはGFP-ACCMを２ｘ１０３個含む１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地１６０μｌと９１８種類のヒトマイクロＲＮＡに対するLNA(Locked Nucleic Acid)/DNA knockdown probe（商品名：miRCURY LNATM microRNA Knockdown Library-Human v12.0、EXIQON社製）各５ｐｍｏｌ、RNAiMAX（Invitrogen社製）０．４μｌを含むOpti-MEM（Invitrogen社製）４０μｌを混合し、加えた。８０時間培養した後、各ウェルのＧＦＰ蛍光強度をWallac ARVO MX 1420 Multilabel Counter（PerkinElmer社製）にて測定し、つづいてCell Counting Kit-8（Dojindo社製）を用いて細胞数を定量した。
　上記のknockdown libraryを用いた網羅的機能解析により、ヒト口腔扁平上皮がん細胞GFP-SASにおいて１４種類（下記表４）、ヒト唾液腺がん細胞GFP-ACCMにおいて２種類（下記表５）のOncomiRを同定した。なお、ヒト唾液腺がん細胞における２種類のOncomiRは、いずれもヒト口腔扁平上皮がん細胞におけるOncomiRであった。なお、下記表４及び５において、同定されたOncomiRのmiRBase（データベース）におけるＩＤ、アクセション番号、及び、成熟マイクロＲＮＡの配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　２．アンチセンスオリゴヌクレオチド導入による増殖抑制の確認
　下記のhsa-miR-133a/b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを下記条件でヒト口腔扁平上皮がん細胞GFP-SASに導入し、細胞増殖に与える影響を評価した。
〔使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド〕
　hsa-miR-133a/b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、下記表６の配列のknockdown probe（商品名：miRCURY LNA microRNA Inhibitor、EXIQON社製）を用いた。なお、ネガティブコントロールとしては、商品名：miRCURY Knockdown control probe（配列番号３２、EXIQON社製）を使用した。これらのオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ（商品名；Locked Nucleic Acid）を含む（約２０塩基のＤＮＡに対して約８塩基程度のＬＮＡを含む）。
〔miRNA knockdown probeの導入と細胞増殖評価法〕
　９６ウェルプラスチックプレートの各ウェルに、種々のヒトがん細胞を２ｘ１０３個含むcomplete medium８０μｌとmiRNAに対する下記表３の配列のknockdown probe２．５ｐｍｏｌ、RNAiMAX（Invitrogen社製）０．２μｌを含む Opti-MEM（Invitrogen社製）２０μｌを混合し、加えた。８０時間培養した後、各ウェルの生存細胞が発するGFPの蛍光を蛍光顕微鏡観察した。その結果を図１に示す。
　図１に示すとおり、下記表６のhsa-miR-133a/b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト口腔扁平上皮がん細胞GFP-SASの増殖を完全に抑制した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　３．アンチセンスオリゴヌクレオチド導入による種々のがん細胞に対する増殖抑制の確認
　上記表６のhsa-miR-133a/b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、下記のさまざまながん細胞に導入して細胞増殖に与える影響を下記条件で評価した。
〔使用した細胞株〕
　ヒト口腔扁平上皮がん細胞株ＳＡＳ及びヒト唾液腺がん細胞株ＡＣＣＭにgreen fluorescent protein（ＧＦＰ）遺伝子を導入して分離樹立したＧＦＰ安定発現株GFP-SAS及びGFP-ACCMに加え、ヒト口腔扁平上皮がん細胞株B88、ヒト膵臓がん細胞株MIAPaCa-2、ヒト胆道がん細胞株HuCCT1、ヒト肺扁平上皮がん細胞株EBC-1、ヒト肺腺がん細胞株A549、ヒト前立腺がん細胞株 LNCaP（アンドロゲン依存性）、PC-3（アンドロゲン非依存性）を用いた。これら細胞株の培養には、１０％牛胎児血清（FBS；Biosource International社製)、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．２５ｍｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（Invitrogen社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）あるいはRPMI1640培地（Sigma-Aldrich社製）を増殖培養液として用い、空気中に５％の割合で炭酸ガスを含む培養器内で、３７℃にて行った。
〔miRNA knockdown probe の導入と細胞増殖評価法〕
　９６ウェルプラスチックプレートの各ウェルに、種々のヒトがん細胞を２ｘ１０３個含むcomplete medium８０μｌとmiRNAに対する上記表３の配列のknockdown probe２．５ｐｍｏｌ、RNAiMAX（Invitrogen社製）０．２μｌを含むOpti-MEM（Invitrogen社製）２０μｌを混合し、加えた。８０時間培養した後、各ウェルの細胞数をCell Counting Kit-8（Dojindo社製）を用いて細胞数を定量した。なお、ネガティブコントロールとしては、商品名：miRCURY Knockdown control probe（配列番号３２、EXIQON社製）を使用した。その結果を図２に示す。
　図２に示すとおり、上記表６のhsa-miR-133a/b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、頭頸部がん以外のがん細胞に対しても増殖抑制効果を示した。
　４．hsa-miR-361-3pに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivoにおけるがん細胞に対する増殖抑制の確認
　hsa-miR-361-3pに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びネガティブコントロールをそれぞれ、下記条件で腫瘍モデルマウスに投与して腫瘍の増殖（大きさ）の経時変化を観察した。その結果を図３及び図４に示す。図３は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びコントロールを投与して３、６、９、及び１２日後の腫瘍の大きさを下記条件で算出したグラフであり、図４は、１２日後における腫瘍の写真である。
〔腫瘍モデルマウス、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与方法及び観察方法〕
腫瘍モデルマウスは、GFP-SAS細胞１ｘ１０６個を６週齢雄のBalb/Cヌードマウス背部皮下に移植して作製した。移植後１２日目に腫瘍形成を確認し、hsa-miR-361-3p に対するLNA/DNAアンチセンスオリゴヌクレオチド及びコントロールLNA/DNAオリゴヌクレオチド（いずれも上記表６に記載の塩基配列のホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド；約２０塩基のＤＮＡに対して約８塩基程度のＬＮＡを含む）を尾静脈から８ｎｍｏｌ全身投与し、さらに７日後にも同様に全身投与した。初回投与から３、６、９、及び１２日後に腫瘍体積を［腫瘍体積＝長径×短径×高さ×0.5236 ］の計算式を用いて算出し、抗hsa-miR-361-3pアンチセンスオリゴヌクレオチドの抗腫瘍活性を評価した。
　図３及び図４に示す通り、hsa-miR-361-3pに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはin vivoにおいてもがん細胞の増殖抑制効果を示した。
　本発明は、がんに関する医薬開発、がんの医療分野、がんの研究分野等において有用である。
配列番号1～4：miRBaseに登録されているマイクロＲＮＡの配列（hsa-miR-133a/b MIMAT0000427/ MIMAT0000770、hsa-miR-346 MIMAT0000773、hsa-miR-361-3p MIMAT0004682）
配列番号5～8：配列番号1～4の相補配列
配列番号9～18：miRBaseに登録されているマイクロＲＮＡの配列（hsa-miR-92a MIMAT0000092、hsa-miR-139-5p MIMAT0000250、hsa-miR-197 MIMAT0000227、hsa-miR-328 MIMAT0000752、hsa-miR-605 MIMAT0003273、hsa-miR-766 MIMAT0003888、hsa-miR-1228 MIMAT0005583、hsa-miR-1252 MIMAT0005944、hsa-miR-1260 MIMAT0005911、hsa-miR-1271 MIMAT0005796）
配列番号19～28：配列番号9～18の相補配列
配列番号29：抗hsa-miR-133a/bアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号30：抗hsa-miR-346アンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号31：抗hsa-miR-361-3pアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号32：ネガティブコントロール

Claims (14)

  1. マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトがん細胞の生育を抑制するための組成物。
  2. マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトのがんの治療又は予防のための医薬組成物。
  3. マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、miR-133、miR-346、及びmiR-361からなる群から選択される、非ヒトのがん細胞の生育を抑制するための組成物。
  4. 前記がんが、頭頸部がん、肺がん、胆道がん、膵臓がん、及び前立腺がんからなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
  5. マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒト頭頸部がん細胞の生育を抑制するための組成物。
  6. マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒトの頭頸部がんの治療又は予防のための医薬組成物。
  7. マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記マイクロＲＮＡが、miR-92、miR-133、miR-139、miR-197、miR-328、miR-346、miR-361、miR-605、miR-766、miR-1228、miR-1252、miR-1260、及びmiR-1271からなる群から選択される、非ヒトの頭頸部がん細胞の生育を抑制するための組成物。
  8. ヒトがん細胞の生育を抑制する方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を前記がん細胞に接触させることを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトがん細胞の生育を抑制する方法。
  9. ヒトのがんの治療又は予防方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-346、及びhsa-miR-361-3pからなる群から選択される、ヒトのがんの治療又は予防方法。
  10. 非ヒトのがん細胞の生育を抑制する方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を前記がん細胞に接触させることを含み、前記マイクロＲＮＡが、miR-133、miR-346、及びmiR-361からなる群から選択される、非ヒトのがん細胞の生育を抑制する方法。
  11. 前記がんが、頭頸部がん、肺がん、胆道がん、膵臓がん、及び前立腺がんからなる群から選択される、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
  12. ヒト頭頸部がん細胞の生育を抑制する方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を前記がん細胞に接触させることを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒト頭頸部がん細胞の生育を抑制する方法。
  13. ヒトの頭頸部がんの治療又は予防方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を対象に投与することを含み、前記マイクロＲＮＡが、hsa-miR-92a、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-197、hsa-miR-328、hsa-miR-346、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-605、hsa-miR-766、hsa-miR-1228、hsa-miR-1252、hsa-miR-1260、及びhsa-miR-1271からなる群から選択される、ヒトの頭頸部がんの治療又は予防方法。
  14. 非ヒトの頭頸部がん細胞の生育を抑制する方法であって、マイクロＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を前記がん細胞に接触させることを含み、前記マイクロＲＮＡが、miR-92、miR-133、miR-139、miR-197、miR-328、miR-346、miR-361、miR-605、miR-766、miR-1228、miR-1252、miR-1260、及びmiR-1271からなる群から選択される、非ヒトの頭頸部がん細胞の生育を抑制する方法。
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