CN1761756B - 禽类物种中内源性原生殖细胞的耗减 - Google Patents

Abstract

本发明提供了调节禽类中原生殖细胞(PGC)数和/或发育的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种在禽类胚胎中调节原生殖细胞数的方法，包括用与原生殖细胞相关的抗原免疫雌性禽，从而该雌性禽产生的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内禽类胚胎中存在的内源性PGC数。本发明还提供了产生嵌合禽类的方法，增加众多卵中雄性禽的比例的方法，产生禽类配子的方法，及增强核酸在禽类中种系传递的方法。

Description

禽类物种中内源性原生殖细胞的耗减

相关申请的交叉参考 

本申请要求申请日为2003年1月16日的美国临时专利申请系列号60/440,424的优先权，该申请全文引入本文作参考。 

技术领域

本发明涉及调节禽类中原生殖细胞(primordial germ cell)数的方法。更特别地，本发明涉及与原生殖细胞相关抗原结合的抗体在禽类胚胎发生期间调节原生殖细胞发育中的应用。可以将供体原生殖细胞给予经本发明方法处理的禽类所产的卵内存在的禽类胚胎以产生嵌合禽类。 

背景技术

嵌合体是包含衍生自一个以上合子的细胞的复合生物体。实验性嵌合体已经用于在发育期间研究细胞之间的相互作用及进行细胞结局和谱系分析(McLaren，Mammalian Chimeras.Cambridge UniversityPress，Cambridge，England，United Kingdom，1976)。使用分离自非常早期胚胎的细胞产生嵌合体可产生这样的生物体，该生物体发育成具有部分由所述分离的细胞的后代构成的体细胞组织的完全互补体。如果起始材料包括早期生殖细胞或其前体，则所得嵌合体可产生供体和受体基因型双方的配子。另外，嵌合体可以是种内嵌合体(即含有衍生自同一物种的两或多个合子的细胞)或种间嵌合体(即含有衍生自至少两个不同物种的合子的细胞)。 

通过用希望的供体PGC在生殖腺中进行种群恢复而产生种系嵌 合体的效率可以通过减少受体生物体中的PGC数而增强。已经不同程度地成功利用了许多减少PGC的方案。持续暴露于3.4和1.8R/hr剂量水平的γ辐射(0.3-3.4R/hr，⁶⁰Co，20天)导致卵母细胞的完全破坏(Mraz & Woody，Radiation Res 54：63-68，1973)。然而，在0.9R/hr或更高水平孵化频率降低。为降低内源性PGC数进行持续低水平γ射线的应用受限，这是由于可以同时暴露的卵的数目相对较少、需要较长的暴露时间及辐射自身的潜在致畸作用所致。 

也已经尝试了短期暴露于γ射线源(Carsience et al.，Development117：669-75，1993；Thoraval et al.，Poultry Sci 73：1897-1905，1994；Maeda et al.，Poultry Sci 77：905-07，1998)。在这些研究中，在即将注射X期胚盘细胞或透明区细胞之前将未孵育的卵暴露于500-700rads。在短期γ辐射之后，种系嵌合现象的迹象是高度可变的。这种不一致结果的基础归因于“供体细胞被注射进不适当的位置...”(Carsience et al.，Development 117：669-75，1993)。 

也已经描述了尝试使用紫外(UV)光使受体胚胎不育(Reynaud，JEmbryol Exp Morphol 21：485-507，1969；Reynaud，JRoux′s ArchDevelBiol 179：85-110，1976；Aige-Gil & Simkiss，Br Poul Sci 32：427-438，1991)。Aige-Gil&Simkiss断定“照射生殖新月区、特别是在4期孵育时照射不可能不诱导明显异常”。不育的程度看起来与发育异常正相关，因此限制了UV光作为降低内源性PGC的工具的实际应用。 

种系嵌合体的产生对人类及对各种禽物种自身均产生一定的潜在有益作用。种系嵌合体可用作具有希望特性的配子的来源，其然后可与育种程序一起使用以增加禽基因库。更简便地生产特定禽物种的配子的能力对禽兽医和家禽生产领域是有益的。对于濒于灭绝的物种如鸣鹤而言，能够提供现成的雄性精子是非常有益的。对于商业禽类如火鸡而言，希望更迅速而经济地产生雄性精子。对于产肉禽群而言，希望具有增加禽群中雄性禽比率的方式。如此，需要获得禽精子的新 方式。 

因此，人们长期及持续需要增加禽类中种系嵌合体产生的效率的方式。本发明致力于本领域中的这种及其它需要。 

概述 

本发明提供了调节禽胚胎中原生殖细胞数的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用与原生殖细胞相关的抗原免疫一个雌性禽，从而该雌性禽产生的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的禽胚胎中内源性PGC数。在一个实施方案中，所述雌性禽选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、及沙丘鹤组成的一组。在另一个实施方案中，所述雌性禽是鸡。在一个实施方案中，所述抗原包含选自如下一组的一个多肽表位：SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis，及DAZL。在一个实施方案中，所述免疫步骤导致禽胚胎中原生殖细胞数减少。在另一个实施方案中，所述免疫步骤导致禽胚胎中原生殖细胞数增加。 

本发明还提供了一种调节禽胚胎中原生殖细胞发育的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用与原生殖细胞相关的抗原免疫一个雌性禽，从而由该雌性禽产生的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的禽胚胎中PGC的发育。在一个实施方案中，所述抗原包含选自如下一组的一个多肽表位：SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis及DAZL。在一个实施方案中，所述雌性禽选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、和沙丘鹤组成的一组。在另一个实施方案中，所述雌性禽是鸡。在一个实施方案中，所述免疫步骤导致禽胚胎中原生殖细胞的发育抑制。在另一个实施方案中，所述免疫步骤导致禽胚胎中原生殖细胞的发育增强。 

本发明还提供了一种产生嵌合禽的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫一个雌性禽；(b)该 雌性禽产卵，其中卵中包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的受体胚胎中PGC发育、PGC数或其组合；及(c)将供体PGC经卵内给予受体胚胎以产生嵌合禽。在一个实施方案中，所述抗原包含选自如下一组的一个多肽表位：SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis，及DAZL。在一个实施方案中，供体PGC来自与受体胚胎相同的禽物种。在另一个实施方案中，供体PGC来自与受体胚胎不同的禽物种。在一个实施方案中，所述方法进一步包括孵育所述嵌合禽至孵化。 

在本发明方法的一个实施方案中，所述雌性禽选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、和沙丘鹤组成的一组。 

在一个实施方案中，供体PGC来自选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、和鸣鹤组成的一组的禽胚胎。在另一个实施方案中，供体PGC携带一对雄性决定(Z)染色体。在另一个实施方案中，供体PGC选自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月区(germinal crescent)PGC组成的一组。 

在另一个实施方案中，供体PGC携带一个雌性决定(w)染色体。在一个实施方案中，所述给予是通过卵内注射进行的。在一个实施方案中，当受体胚胎在大约IX期(根据Eyal-Giladi & Kochav分期系统)及大约30期(根据Hamburger & Hamilton分期系统)之间时给予供体PGC。在另一个实施方案中，当受体胚胎在14期(根据Hamburger& Hamilton分期系统)之后时给予供体PGC。在另一个实施方案中，所述给予步骤是通过将胚盘细胞注射到受体胚胎进行的，并且其中胚盘细胞在受体胚胎中分化为供体PGC。 

本发明还提供了一种增加众多禽卵中雄性禽比例的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫一个雌性禽；(b)该雌性禽产卵，从而该卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的受体雌性禽中PGC的发育；(c)经卵 内将雄性(ZZ)PGC给予受体雌性禽；(d)孵育该受体雌性禽直至孵化；(e)饲养该受体雌性禽至性成熟；及(f)该受体雌性禽产生大量禽卵，其中该受体雌性禽产生的大量禽卵中雄性禽的比例高于在未将雄性(ZZ)PGC经卵内给予受体雌性禽的情况中获得的结果。在一个实施方案中，所述抗原包含选自如下一组的一个多肽表位：SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis，及DAZL。在一个实施方案中，所述雌性禽选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、和沙丘鹤组成的一组。在一个实施方案中，供体PGC来自与受体胚胎相同的禽物种。在另一个实施方案中，供体PGC来自与受体胚胎不同的禽物种。在另一个实施方案中，所述PGC选自由生殖腺PGC，血PGC，及生殖新月区PGC组成的一组。在另一个实施方案中，供体PGC来自选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、和鸣鹤组成的一组的禽胚胎。 

在本发明方法的一个实施方案中，所述给予是经卵内注射。在另一个实施方案中，当受体胚胎在大约IX期(根据Eyal-Giladi & Kochav分期系统)及大约30期(根据Hamburger & Hamilton分期系统)之间时给予供体PGC。在另一个实施方案中，当受体胚胎在14期(根据Hamburger & Hamilton分期系统)之后时给予供体PGC。在另一个实施方案中，所述给予步骤是通过将胚盘细胞注射到受体胚胎进行的，并且其中胚盘细胞在受体雌性禽中分化为供体PGC。 

本发明还提供了一种在第一种禽物种中生产来自第二种禽物种的禽配子的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫雌性第一种禽物种，从而雌性禽产的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的第一种禽物种的受体禽的PGC发育；(b)将分离自第二种禽物种的禽的供体PGC导入第一种禽物种的受体禽中；(c)孵育第一种禽物种的受体禽至孵化；及(d)饲养第一种禽物种的受体禽至性成熟，其中第一种禽物种的受体 禽产生来自第二种禽物种的配子。在一个实施方案中，所述抗原包含选自如下一组的一个多肽表位：SSEA-1，VASA，EMA-1，germcell-less，dead end，nanos，stella，fragilis，及DAZL。在一个实施方案中，所述第一种禽物种和第二种禽物种均选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、沙丘鹤，和鸣鹤组成的一组。在一个实施方案中，所述第一种禽物种和第二种禽物种是相同的。在另一个实施方案中，所述第一种禽物种和第二种禽物种是不同的。 

在本发明方法的一个实施方案中，所述给予是通过卵内注射。在一个实施方案中，当第一种禽物种的受体禽在大约IX期(根据Eyal-Giladi & Kochav分期系统)及大约30期(根据Hamburger &Hamilton分期系统)之间时给予供体PGC。在另一个实施方案中，当第一种禽物种的受体禽在14期(根据Hamburger & Hamilton分期系统)之后时给予供体PGC。在另一个实施方案中，所述给予步骤是通过将胚盘细胞注射到第一种禽物种的受体禽进行的，并且其中胚盘细胞在第一种禽物种的受体禽中分化为供体PGC。在一个实施方案中，所述PGC选自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月区PGC组成的一组。 

本发明还提供了一种增强核酸分子在禽中种系传递的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫一个雌性禽，从而该雌性禽产生的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的受体禽中PGC发育；(b)在足以使得众多PGC的至少之一在受体禽的生殖腺建群(colonize)的条件下，将包含所述核酸分子的众多供体PGC给予受体禽；(c)孵育该受体禽至孵化；及(d)饲养该受体禽至性成熟，其中该受体禽产生衍生自供体PGC的配子。在一个实施方案中，所述抗原包含选自如下一组的一个多肽表位：SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis，及DAZL。在一个实施方案中，所述受体禽和供体PGC均 选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、沙丘鹤和鸣鹤组成的一组。在一个实施方案中，供体PGC来自与受体禽相同的禽物种。在另一个实施方案中，供体PGC来自与受体禽不同的禽物种。在一个实施方案中，所述PGC选自由生殖腺PGC、血PGC、及生殖新月区PGC组成的一组。 

在本发明方法的一个实施方案中，当受体禽在大约IX期(根据Eyal-Giladi & Kochav分期系统)及大约30期(根据Hamburger &Hamilton分期系统)之间时给予供体PGC。在另一个实施方案中，当受体禽在14期(根据Hamburger & Hamilton分期系统)之后时给予供体PGC。在另一个实施方案中，所述给予步骤是通过将胚盘细胞注射到受体禽进行的，并且其中胚盘细胞在受体禽中分化为供体PGC。 

本发明的这些及其它方面经参考如下详细描述和所附图表将更加明了。另外，本发明参考了各种出版物。本发明引用的所有专利(包括公布的专利申请)和出版物(包括GENBANK 

序列参考)均以其全文并入参考，补充、解释、提供背景或教导方法学，和/或应用的组合物均并入参考。这些专利和出版物与本发明之间的任何矛盾之处以本发明为准。 

附图简述 

图1-3描述了对暴露于对抗PGC相关抗原而产生的抗体的鸡胚胎中SSEA-1⁺细胞的存在进行免疫组织化学分析的情况。对于每个图而言，将发育中的生殖腺区域的鸡胚胎横切面用单克隆抗体MC-480染色，该抗体识别原生殖细胞上胚胎阶段特异性胚胎抗原-1(stage specific embryonic antigen-1，SSEA-1)。将27期胚胎在4％低聚甲醛中固定，制备7μm石蜡切片，并用MC-480和一种碱性磷酸酶缀合的二级抗体免疫染色。使用NBT-BCIP酶底物检测到阳性染色。 

图4是概括了图1-3中描述的切片检测结果的条形图。用各自的肽免疫母鸡，其产的卵被收集并孵育至达到胚胎27期。将胚胎进行常规的组织学处理，连续切片并用单克隆抗体MC-480(抗SSEA-1)免疫染色以鉴别发育中的生殖腺中的生殖细胞。呈现的数据表示来自用每个肽或肽组合免疫的3只母鸡的卵内胚胎的生殖腺嵴的10个切片中计数的PGC数的平均值。 

序列表简述 

SEQ ID NO：1和2分别是鸡VASA(CVH)可读框的核酸和氨基酸序列(分别为GENBANK 

Accession No.AB004836和BAB 12337)。 

SEQ ID NO：3和4是包含用于免疫雌性鸡的鸡VASA(CVH)多肽表位的肽序列。SEQ ID NO：3是N末端肽(Vasa-N)，相应于GENBANK 

Accession No：BAB 12337的第42-57位氨基酸，SEQID NO：4是C末端肽(Vasa-C)，相应于GENBANK Accession No：BAB 12337的第645-660位氨基酸。 

SEQ ID NO：5和6分别是鸡DAZL可读框的核酸和氨基酸序列(分别为GENBANK Accession No.AY211387和AAO26019)。 

SEQ ID NO：7和8是包含用于免疫雌性鸡的鸡DAZL多肽的表位的肽序列。SEQID NO：7是N末端肽(Dazl-N)，相应于GENBANK AccessionNo：AAO26019的第2-18位氨基酸，SEQ IDNO：8是C末端肽(DAZL-C)，相应于GENBANK Accession No.AAO26019的第266-282位氨基酸。 

详细描述 

I.定义 

除非特别说明，本文所用所有技术和学术术语均具有本领域技术人员通常理解的适合本发明的含义。为本说明书清楚起见，某些定义 如下。 

当在本文、包括权利要求书中使用时，根据长久以来的专利法实践，术语“一个”意味着“一或多个”。 

如本文所用，术语“大约”当指一个数值或者指质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，涵盖了与指定量有±20％或±10％的变化，在另一个例子中有±5％的变化，在再一个例子中有±1％的变化，在另一个实施例中有±0.1％的变化，这种变化对于实施本发明是适当的。除非另外说明，在本说明书和权利要求书中使用的表示配料数量、反应条件等等的所有数目在一切情况下均应理解为在术语“大约”的范畴内。因此，除非相反地指出，本说明书和所附权利要求书中列出的数字参数是近似值，其可以根据试图通过本发明可获得的希望性质而变化。 

在某些实施方案中，本发明应用抗与原生殖细胞相关的抗原的抗体。术语“抗体”及其语法学上的变化用语是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合一种抗原的抗原结合位点的分子。同样，该术语还指免疫球蛋白蛋白质或其功能部分，包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、杂种抗体、单链抗体(例如，噬菌体文库中表示的单链抗体)、经过诱变的抗体、人源化抗体、及包含一个抗原结合位点的抗体片段(例如，Fab和Fv抗体片段)。因此，“抗体”包括但不限于单克隆抗体、嵌合抗体、重组抗体、合成抗体、半合成抗体，或者化学修饰的具有例如Fv、Fab、scFv或F(ab)₂ 片段的完整抗体。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。 

禽类产生可位于卵黄中的抗体，这些抗体称为“IgY”(卵黄抗体，主要包含IgG型抗体)。通常见Bollen et al.，J Immunol Meth191：113-120，1996；Schade et al.(eds.)，Chicken Egg Yolk Antibodies.Production and Application：IgY-Technology，Springer Verlag，NewYork，New York，United States of America，2000所述。在一个实施方案中，本发明的抗体是禽IgY抗体。本发明的抗体可以来自任何禽类来源。在一些实施方案中，所述抗体是鸡IgY抗体。 

本发明的抗体结合与原生殖细胞相关的抗原。如本文所用，术语“与原生殖细胞相关”是指抗原包含一个表位，该表位或者由原生殖细胞表达的一个多肽(例如一个细胞表面标记)表达或者在翻译后附着于该多肽，或者由能影响原生殖细胞迁移和/或发育的细胞表达(例如迁移因子、生长因子、及由在PGC存在或发育的微环境中存在的细胞表达的多肽)。这种抗原包括但不限于SSAE-1、卵粘蛋白样蛋白(OLP)、Steel因子(c-试剂盒配体)、germ cell-less，dead end、VASA(包括但不限于鸡VASA同系物，CVH)、DAZL、nanos、stella、及fragilis多肽上存在的表位，及由抗体EMA-1、QH-1、FC10.2、S-FC10.2、NC-1、2C9、QCR1、AGC5、AGC7和AGC 13识别的抗原。参见Tajima，Avian Poultry Biol Rev 13：15-20，2002所述。也参见Buehr，Exp Cell Res232，194-207，1997；D′Costa & Petitte，Intl JDevel Biol 43：349-56，1999；Urven et al.，Development 103：299-304，1988；Hay et al.，Cell55：577-587，1988；Lasko & Ashburner，Nature 335：611-617，1988；Raz，Nature Genetics 4：690-700，2003；Houston & King，Development 127：447-56，2000；Cooke et al.，Hum Mol Genet 5：513-516，1996；Kimura etal.，Biochem Biophys Res Commun 262：223-30，1999；Weidinger et al.，Curr Biol 13：1429-34，2003；及本发明引用的参考文献所述。 

如本文所用，术语“SSEA-1抗体”和“抗SSEA-1抗体”可互换使用并且是指一种抗体，在一个实施方案中是IgY抗体，在另一个实施方案中是单克隆抗体，其结合胚胎阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1；Buehr，Exp Cell Res 232，194-207，1997)。SSEA-1是由半乳糖(β1→4)岩藻糖(α1→3)N-乙酰氨基葡萄糖键决定的一种碳水化 合物表位(Gooi et al.，Nature 292：156-158，1981)。一种SSEA-1的单克隆抗体是通过小鼠骨髓瘤细胞与已经用F9畸胎癌细胞免疫的小鼠的脾细胞融合而产生(Solter & Knowles，Proc NatlAcadSci US A 75：5565-5569，1978)。SSEA-1抗体是禽生殖细胞的一种已知的免疫组织化学标记(Karagenc et al.，Dev Genet 19：290-301，1996)。在一个实施方案中，一种抗SSEA-1抗体是克隆MC 480，其可以得自Developmental Studies Hybridoma B ank，The University of lowa，lowaCity，lowa，United States ofAmerica。 

如本文所用，术语“VASA抗体”和“抗VASA抗体”可互换使用并且是指一种抗体，在一个实施方案中是IgY抗体，其结合禽VASA多肽。VASA是一种ATP依赖性RNA解旋酶，是DEAD-box(Asp-Glu-Ala-Asp)家族的一个成员。VASA及其直向同源物在许多物种的生殖质中表达，这些物种包括斑马鱼(Danio rerio)、果蝇(Drosophila melanogaster)、线虫(Caenorhabditis elegans)，并且其已经在其它物种包括非洲爪蟾(Xenopus laevis)、小鼠、及人的PGC中鉴别(参见综述Raz，Nature Genetics 4：690-700，2003)。在这些物种中，VASA及相关多肽参与生殖细胞发育，包括极(pole)PGC发育、增殖及分化，以及配子形成。参见上述文献。鸡VASA(也称为CVH)的核酸和氨基酸序列可以分别在GENBANK 

AccessionNo.AB004836和BAB 12337找到。 

如本文所用，术语“DAZL抗体”和“抗DAZL抗体”可互换使用并且是指一种抗体，在一个实施方案中是IgY抗体，其结合禽DAZL多肽。DAZL的直向同源物已在许多物种中分离，这些物种包括斑马鱼(Danio rerio)、果蝇(Drosophila melanogaster)、线虫(Caenorhabditiselegans)，并且其已经在其它物种包括非洲爪蟾(Xenopus laevis)、小鼠、及人的PGC中鉴别(参见综述Raz，Nature Genetics 4：690-700，2003)。DAZL多肽(及其直向同源物)是一种RNA结合蛋白，其在斑马鱼 卵的植物极、非洲爪蟾(Xenopus)的生殖质以及若干不同生物体的卵巢和/或睾丸中表达。文献同上。在非洲爪蟾(Xenopus)、小鼠和人中，DAZL在PGC中表达，并且其可能对于一种或两种性别的生殖腺细胞的发育和存活是重要的。参见Raz，Nature Genetics 4：690-700，2003；Xu et al.，Proc Natl Acad Sci US A 98：7414-7419，2001；Houston &King，Development 127：447-56，2000；Mita & Yamashita，Mech Dev94：251-255，2000；Ruggiu et al.，Nature 389：73-77，1997；Reijo et al.，Nature Genetics 10：383-393，1995。鸡DAZL的核酸和氨基酸序列可以分别在GENBANK Accession No.AY211387和AAO26019找到。 

如本文所用，术语“禽”和“禽物种”是指任何禽物种，包括但不限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、及鸵鸟。可以采用任何众多的其它物种进行本发明，特别是当用于保存濒于灭绝的物种如鸣鹤时(这种情况中受体物种是沙丘鹤)。 

如本文所用及除非特别修正，术语“卵”是指含有活的胎禽的禽卵。因此，术语“卵”是指已受精的禽卵，在一个实施方案中是指含有能经历正常胚胎发生的禽胚胎的卵。 

如本文所用，术语“天然的”和“内源的”是指细胞或核酸在胚胎中天然存在。同样，“内源性PGC”是在从未导入外源或供体PGC的受精卵中直接发育的胚胎中存在的PGC。相似地，当就多肽而言时，“天然多肽”是由未转化的禽的天然基因编码的多肽。 

如本文所用，术语“天然发生的”是指与人工产生的截然不同的在自然中发现的物体。例如，以其天然状态在生物体(包括病毒)中存在的、未在实验室中被故意人工修饰或分离的多肽或核苷酸序列是天然发生的。同样，如果多肽或核苷酸序列是由重组分子编码或存在于其内，即使其氨基酸序列或核酸序列与在自然中发现的氨基酸或核酸序列相同，也认为其是“非天然发生的”。 

如本文所用，术语“核酸”和“核酸分子”是指任何脱氧核糖核 酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶链反应(PCR)产生的片段、及通过任何连接、剪切、核酸内切酶作用及核酸外切酶作用产生的片段。 

术语“可操纵地连接”当描述两个核酸区域之间的关系时，是指一种并列状态，使其中所述区域处于一种允许它们以指定方式发挥功能的关系。例如，一个控制序列与一个编码序列“可操纵地连接”是以这样的方式连接，即编码序列的表达是在与控制序列相匹配的条件下达到的，如当合适的分子(例如诱导剂和聚合酶)与控制或调节序列结合时。因此，在一个实施方案中，短语“可操纵地连接”是指一个启动子与一个编码序列以编码序列的转录由启动子控制和调节这样的方式连接。本领域技术人员熟知将启动子与编码序列进行可操纵地连接的技术，相对于感兴趣的编码序列的精确方向和位置依赖于启动子的特异性性质及其他一些因素。 

因此，术语“可操纵地连接”可以指一个启动子区域与一个核苷酸序列以该核苷酸序列的转录由该启动子区域控制和调节这样的方式连接。相似地，也就是说核苷酸序列在其可操纵地连接的启动子的“转录控制”下。本领域技术人员已知将一个启动子区域与一个核苷酸序列可操纵地连接的技术。术语“可操纵地连接”也可以指一个转录终止序列或其它核酸与一个核苷酸序列以该核苷酸序列转录的终止由该转录终止序列控制这样的方式连接。另外，术语“可操纵地连接”可以指一个增强子、沉默子或者其它核酸调节序列当可操纵地与开放读框连接时以正或负的方式调节该开放读框的表达。 

如本文所用，可互换使用的术语“多肽”、“蛋白质”、和“肽”，是指20个蛋白质氨基酸的聚合物，或者氨基酸类似物，无论其大小或功能如何。尽管“蛋白质”通常用于指相对大的多肽，而“肽”通常用于小的多肽，但这些术语在本领域中的应用有重叠和变化。本文所用术语“多肽”除非特别指出则是指肽、多肽和蛋白质。如本文所 用，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”当指基因产物时可互换使用。术语“多肽”涵盖了所有功能的蛋白质，包括酶。因此，典型的多肽包括基因产物、天然发生的蛋白质、同系物、直向同源物、共生同源物、片段，及前述的其它等价物、变体和类似物。 

如本文所用，术语“原生殖细胞”和“PGC”是指在早期胚胎中存在的二倍体细胞，其在成熟的禽中可分化/发育为单倍体配子(即精子和卵子)。如本领域技术人员已知的原生殖细胞可分离自不同的发育时期及分离自发育中的禽胚胎的各个部位，包括但不限于生殖嵴、发育中的生殖腺、血液和生殖新月区。见例如Chang et al.，CellBiolInt 21：495-9，1997；Chang et al.，Cell Biol Int 19：143-9，1995；Allioli etal.，Dev Biol 165：30-7，1994；Swift，Am JPhysiol 15：483-516；及PCT国际出版物NO：WO 99/06533所述。本领域技术人员已知生殖嵴是发育中的胚胎的一部分。见例如Strelchenko，Theriogenology45：130-141，1996；Lavoir，J ReprodDev 37：413-424，1994所述。典型地，PGC在过碘酸-Schiff(PAS)技术中阳性染色。在一些物种中，PGC可以使用抗SSEA抗体(一个例外是火鸡，其PGC不展示SSEA抗原)鉴别。本领域已知分离和纯化PGC的各种技术，包括使用Ficoll密度梯度离心从血液中浓缩PGC(Yasuda et al.，J Reprod Fertil96：521-528，1992)。 

术语“启动子”或“启动子区域”均是指基因内的一个核苷酸序列，其位于编码序列的5’端并发挥指导编码序列转录的功能。启动子区域包含一个转录起始位点，并可另外包括一或多个转录调节元件。在一个实施方案中，本发明的方法应用一个RNA聚合酶III启动子。 

“最小启动子”是一个核苷酸序列，其具有使得基本水平转录发生所需的最小元件。同样，最小启动子是不完整的启动子，而是能指导报道基因构建体在一个实验系统中基本水平转录的启动子的亚序 列。最小启动子包括但不限于CMV最小启动子、HSV-tk最小启动子、猿猴病毒40(SV40)最小启动子、人β-肌动蛋白最小启动子、人EF2最小启动子、腺病毒E1B最小启动子、及热激蛋白(hsp)70最小启动子。最小启动子通常用一或多个转录调节元件增大以影响可操纵地连接的基因的转录。例如，细胞类型特异性或组织特异性转录调节元件可以加入到最小启动子中以产生重组启动子，其以细胞类型特异性或组织特异性方式指导可操纵地连接的核苷酸序列的转录。 

不同的启动子具有不同的转录调节元件组合。一个基因在细胞中表达与否依赖于特定转录调节元件的组合，其由该基因的启动子和细胞核内存在的不同的转录因子组成。同样，启动子根据其在体内或体外的功能活性而通常分为“组成型”、“组织特异性”、“细胞类型特异性”、或“可诱导的”启动子。例如，组成型启动子是能在多种细胞类型中指导基因转录的启动子。典型的组成型启动子包括编码某些组成型或“管家”功能的如下基因的启动子：次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)，二氢叶酸还原酶(DHFR；Scharfmann et al.，1991)，腺苷脱氨酶，磷酸甘油酸激酶(PGK)，丙酮酸激酶，磷酸甘油酸变位酶，β-肌动蛋白启动子(见例如，Williams et al.，1993)，及本领域技术人员已知的其它组成型启动子。另一方面，“组织特异性”或“细胞类型特异性”启动子在一些组织和细胞类型中指导转录，但在其它组织和细胞类型中则无活性。典型的组织特异性启动子包括在下文详细描述的那些启动子，以及本领域技术人员已知的其它组织特异性和细胞类型特异性启动子。 

当就启动子而言时，本文所用术语“连接”是指启动子元件的物理性接近，由此它们一起发挥指导可操纵地连接的核苷酸序列的转录功能。 

如本文所用，术语“转录调节序列”或“转录调节元件”均是指启动子区域内的一个核苷酸序列，其可以启动对调节转录因子的应 答。应答可涵盖转录产量的减少或增加，并且是由转录因子与包含转录调节元件的DNA分子的结合而介导。在一个实施方案中，转录调节序列是一个转录终止序列，或者在此称为转录终止信号。 

如本文所用，关于概率的统计学分析术语“显著性”或“显著的”是两或多个实体之间的非随机相关性。为确定一种关系是否“显著”或具有“显著性”，可以对数据进行统计学处理以计算概率，以“p-值”表示。降到用户定义的截断(cutoff)点以下的那些p-值认为是显著的。在一个例子中，p-值低于或等于0.05，在另一个例子中低于0.01、在另一个例子中低于0.005、在又一个例子中低于0.001被认为是显著的。 

术语“调节序列”是在本说明书中普遍使用的一个专业术语，是指多核苷酸序列如起始信号、增强子、调节子、启动子，及终止序列，其是影响与其可操纵地连接的编码序列和非编码序列表达所必需或希望的序列。典型调节序列如Goeddel，1990所述，包括例如猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T7启动子(其表达由T7RNA聚合酶指导)、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd外被蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子如Pho5、酵母a-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子及其它已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒的基因表达的序列，及这些序列的各种组合。这种控制序列的性质和应用根据宿主生物体而有所不同。在原核生物中，这种调节序列一般包括启动子、核糖体结合位点、及转录终止序列。术语“调节序列”是指最小程度包括可影响表达的成分，及也可以包括有益的额外成分，例如前导序列和融合配体序列。 

在某些实施方案中，多核苷酸序列的转录在启动子序列(或其它调节序列)的控制下，所述启动子序列控制多核苷酸在指定细胞类型 中表达。还要理解多核苷酸可以在与那些控制天然发生形式的多核苷酸的表达的序列是相同或不同的调节序列的控制下。 

术语“报道基因”是指一种核酸，包含编码通过存在或活性而易于检测的蛋白质的核苷酸序列，包括但不限于荧光素酶、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白)、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、分泌的胎盘碱性磷酸酶、β-内酰胺酶、人生长激素、及其它分泌的酶报道基因。通常地，报道基因编码宿主细胞不另外产生的多肽，其可通过分析细胞而检测，例如通过对细胞进行直接荧光分析、放射性同位素分析或分光光度分析及典型地不需要杀伤细胞进行信号分析。在某些情况中，报道基因编码一种酶，其使得宿主细胞的荧光性质发生改变，这可通过定性、定量或半定量功能或转录激活而检测。典型酶包括酯酶、β-内酰胺酶、磷酸酶、过氧化物酶、蛋白酶(组织纤溶酶原激活物或尿激酶)及本领域技术人员已知或在将来揭示的其功能可通过适当的生色或荧光底物检测的其它酶。 

如本文所用，术语“转录因子”是指已知胞质或核蛋白，其与基因结合，或者与基因的RNA转录物结合，或者与另一种蛋白质结合，该另一种蛋白质结合基因或RNA转录物或与此另一种蛋白质依次结合基因或RNA转录物的又一种蛋白质，从而调节基因的表达。这种调节可另外通过其它机制达到，“基因的转录因子”的实质是以某种方式改变基因转录水平的因子。术语“转录因子”一般也可以指一种蛋白质，其通过与转录调节元件和进行转录的细胞成分包括RNA聚合酶、转录相关因子(TAF)、染色质重塑蛋白及影响基因转录的任何其它相关蛋白相互作用而调节基因表达。 

术语“载体”是指能运输其已经连接的另一个核酸的一种核酸。根据本发明可使用的一种类型的载体是一种附加体，即能在染色体外复制的核酸。其它载体包括那些能使得它们连接的核酸自主复制和表达的那些载体。能指导与其可操纵地连接的基因表达的载体在本文称 作“表达载体”。通常地，在重组DNA技术中有效的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体最常用的形式。然而，本发明包括同等作用并随后为本领域所已知的这种其它形式的表达载体。 

本文所用术语“表达载体”是指在适当的宿主细胞中能指导特定核苷酸序列表达的DNA序列，包含与感兴趣的核苷酸序列可操纵地连接的一个启动子，所述感兴趣的核苷酸序列与转录终止序列可操纵地连接。其还典型地包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含感兴趣的核苷酸序列的构建体可以是嵌合的。该构建体也可以是天然发生的但已经以用于异源表达的重组形式获得的构建体。感兴趣的核苷酸序列，包括设计为导致核苷酸序列正确表达的任何额外的序列，也可以称作“表达弹夹”。 

如本文所用，术语“异源基因”，“异源DNA序列”，“异源核苷酸序列”，“外源核酸分子”或者“外源DNA节段”均是指源自与指定宿主细胞无关的来源，或者如果来自相同来源则是对其原始形式加以修饰的序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括与特定的宿主细胞是内源的但已经修饰的基因，例如通过诱变或通过分离自天然的转录调节序列。该术语还包括天然发生核苷酸序列的非天然发生的多个拷贝。因此，该术语是指一个DNA节段，其与细胞是外源或异源的，或者与细胞同源但位于宿主细胞核酸内该元件不常发现的位置。 

当两个核酸的每个序列在子代核酸中组合时，则这两个核酸是“重组的”。当两个核酸均是重组的底物时，则这两个序列是“直接重组的”。当序列是使用一个中间物如交换寡核苷酸重组时，则这两个序列是“间接重组的”。对于间接重组，只是这些序列之一是重组的实际底物，在一些情况中，无一序列是重组底物。 

如本文所用，术语“调节元件”是指参与控制核苷酸序列表达的核苷酸序列。调节元件可包含与感兴趣的核苷酸序列可操纵地连接的 启动子和终止信号。调节序列还包括增强子和沉默子。它们还典型地包含该核苷酸序列正确翻译所需的序列。 

如本文所用，术语“显著增加”是指数量(例如PGC数)的增加高于测定技术中固有的误差幅度，在一个实施方案中在基线数量(例如在未处理的野生型胚胎的特异发育时期在特异的位置存在的PGC的平均数)上增加大约10％或更高，在另一个实施方案中增加大约25％或更高，及在另一个实施方案中增加大约50％或更高。 

如本文所用，术语“显著少于”和“显著降低”是指数量(例如PGC数)的降低高于测定技术中固有的误差幅度，在一个实施方案中在基线数量(例如在未处理的野生型胚胎的特异性发育时期在特异的位置存在的PGC的平均数)上降低大约10％或更高，在另一个实施方案中降低大约25％或更高，及在另一个实施方案中降低大约50％或更高。 

如本文所用，术语“特异性结合”及其语法学上的变化用语是指抗体与关联表位的结合亲和性。就揭示的方法而言，“特异性结合”是指涵盖了在生理学条件(例如在禽胚胎中可发现PGC的位置内)下抗体(例如IgY分子)与抗原之间的结合，导致包含该表位的大分子的正常生物学活性的调节。换句话说，在一个实施方案中，如果在发育中的胚胎中IgY分子结合的大分子的生物学活性相对于在另一个发育中的胚胎中在无IgY分子的情况中在相似胚胎期中的活性改变，则IgY分子与表位之间的相互作用被认为是特异性的。 

同样，短语“与抗体特异性(或选择性)结合”及“与...特异性免疫反应”当对于多肽或肽上存在的表位而言时，是指在存在异源多肽群及其它生物制剂的情况中确定多肽存在的结合反应。因此，在设计的免疫分析条件下，指定的抗体结合特定的多肽但不以显著量结合样品中存在的其它多肽。在这种条件下与抗体的特异性结合可需要根据其对特定多肽的特异性而选择的抗体。例如，可以选择针对PGC 相关的抗原产生的抗体以获得与该抗原特异性免疫反应而与其它抗原则否的抗体。可以使用多种免疫分析方式以选择与特定多肽特异性免疫反应的抗体。例如，通常使用固相ELISA免疫分析、Western印迹、或免疫组织化学，以选择与某个多肽特异性免疫反应的单克隆抗体。见Harlow & Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratories，Cold Spring Harbor，New York，United States ofAmerica，1988，其描述了可用于确定特异性免疫反应的免疫检测方式和条件。典型地，特异性或选择性反应是背景信号或噪音的至少两倍，及更典型地是背景的10-100倍以上。 

如本文所用，术语“转化”是指将异源DNA导入禽细胞、禽组织或禽内的方法。转化的禽细胞、禽组织和禽应理解为不仅涵盖了转化过程的终产物，而且还包含其转基因子代。 

如本文所用，术语“转化的”、“转基因的”及“重组的”是指其中已经导入异源核酸分子的宿主生物体如禽PGC。核酸分子可以稳定整合入宿主的基因组中，或者核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞、组织、或细胞应理解为不仅涵盖了转化方法的终产物，而且还包含其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主是指野生型生物体，例如野生型禽PGC，其不含有异源核酸分子。 

II.免疫禽类及在卵黄中抗体的沉积 

禽类，尤其是鸡，由于在卵产生期间大量抗体被从血清移至卵黄的事实而逐渐成为大规模生产多克隆抗体的常用原料。见Rose et al.，Eur J Immunol 4：521，1974所述。本发明利用这种现象通过用在卵黄内收集的PGC相关的抗原免疫雌性禽而在胚胎内实现PGC发育。这些抗体然后在禽胚胎发生期间结合其关联抗原，从而影响与PGC发育相关的多肽的生物学活性。 

A.抗原和表位 

本发明涵盖了包含或者由多肽表位组成的多肽，可用于产生与该表位结合的IgY抗体。在另一个非限制性实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：2或6所示氨基酸序列，表位存在于具有SEQ ID NO：3、4、7或8所示氨基酸序列的肽抗原上。然而，应注意本文揭示的肽如Vasa-N、Vasa-C、Dazl-N和Dazl-C只是代表性的，其它抗原肽和多肽，包括全长形式的与PGC发育相关的多肽(包括但不限于包含SEQ ID NO：2或6所示氨基酸序列的多肽)可用作免疫原。 

如本文所用，术语“表位”是指在禽中具有抗原或免疫原性活性的多肽的一部分，在一个实施方案中是在鸡中。在一个实施方案中，本发明涵盖了包含一个表位的多肽，以及编码这个多肽的多核苷酸。如本文所用，“免疫原性表位”是指在禽中激发抗体应答的蛋白质的一部分，这通过本领域已知的任何方法确定，例如通过产生本文所述抗体的方法确定。如本文所用，术语“抗原性表位”是指抗体可免疫特异性结合的蛋白质的一部分，这通过本领域已知的任何方法确定，例如，通过本文所述的免疫分析确定。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但不必然排除与其它抗原的交叉反应。抗原性表位不需要必须是免疫原性的。应理解如本文所用术语“表位”涵盖了在禽中具有抗原或免疫原性活性的多肽的任何部分，包括但不限于多肽自身的氨基酸亚群(在本文也称为肽抗原)，但也包括在该多肽中掺入额外组分的多肽的任何修饰物(例如翻译后加入一或多个碳水化合物基团)。 

起表位作用的片段可以通过任何常规方法产生。见例如Houghten，Proc Natl AcadSci US A 82：5131-5135，1985所述；及另外见U.S.专利NO：4,631,211所述。 

在本发明中，抗原性表位在一个实施方案中含有至少4个氨基酸的一个序列，在另一个实施方案中含有至少5个，在另一个实施方案中含有至少6个，在另一个实施方案中含有至少7个，在另一个实施方案 方案中至含有少8个，在另一个实施方案中含有至少9个，在另一个实施方案中含有至少10个，在另一个实施方案中含有至少15个，在另一个实施方案中含有至少20个，在另一个实施方案中含有至少25个，及在另一个实施方案中含有大约15-30个氨基酸的序列。包含免疫原性或抗原性表位的代表性多肽的长度为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。抗原性表位用于例如产生抗体，包括IgY抗体，其特异性结合该表位。抗原性表位可用作在免疫分析中靶定分子。见例如Wilson et al.，Cell 37：767-778，1984；Sutcliffe et al.，Science 219：660-666，1983所述。 

相似地，可以使用免疫原性表位例如根据本领域熟知的方法诱导抗体。见例如Sutcliffe et al.，如前；Wilson et al.，如前；Chow et al.，Proc Natl AcadSci US A 82：910-914，1985；及Bittle et al.，J Gen Virol66：2347-2354，1985所述。包含一或多个免疫原性表位的多肽可以与一个载体蛋白如白蛋白一起呈递给禽系统(例如鸡)以激发抗体应答，或者如果该多肽足够长(至少大约25个氨基酸)，则该多肽可以不用载体而呈递。然而，包含少如8-10个氨基酸的免疫原性表位已经示出足以产生至少能结合变性的多肽中的线性表位的抗体(例如在Western印迹中)。 

本发明的具有表位的多肽可用于诱导抗体，根据本领域熟知的方法进行，包括但不限于体内免疫方法。见例如Sutcliffe et al.，如前；Wilson et al.，如前；及Bittle et al.，如前所述。如果使用体内免疫方法，则禽可以用游离肽免疫；然而，抗肽抗体效价可以通过将所述肽与大分子载体偶联而加强，所述载体如匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风毒素。例如，含有半胱氨酸残基的肽可以使用一个接头如马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)与载体偶联，而其它肽可以使用更一般的连接剂如戊二醛与载体偶联。禽 如鸡用游离的或载体偶联的肽免疫，例如通过肌内注射(例如注入胸大肌)含有大约10-1000微克的肽或载体蛋白及Freund′s佐剂或已知刺激免疫应答的任何其它佐剂的乳液进行免疫。一些加强注射可以例如在间隔大约2周应用，以提供使用吸附于固体表面的游离肽通过ELISA分析可以检测的抗肽抗体的有效效价。免疫的动物的血清中抗肽抗体的效价可以通过抗肽抗体的选择而增加，例如根据本领域熟知的方法通过肽在固体表面上的吸附及选择的抗体的洗脱而进行。 

B.缀合物和佐剂 

如本领域所熟知，给定的组合物其免疫原性可以改变。因此通常必须加强宿主免疫系统，这可以通过将肽或多肽免疫原与载体缀合而实现。代表性的载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。多肽与载体蛋白缀合的方法为本领域所熟知，包括戊二醛、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺及双-二氮化对二氨基联苯的使用。 

也如本领域所熟知，特定的免疫原组合物的免疫原性可以通过使用免疫应答的非特异性刺激物(已知为佐剂)而增强。代表性佐剂包括完全Freund′s佐剂(含有灭活的Mycobacteriun tuberculosis的免疫应答非特异性刺激物)、不完全的Freund′s佐剂、氢氧化铝、及TITERMAX 佐剂(TMA；CytRx Corp.，Norcross，Georgia，UnitedStates of America)。 

多克隆抗体的生产中使用的免疫原组合物的数量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而变化。可以使用许多途径给予免疫原(经皮下、肌内、静脉内和腹膜内给予)。在一个实施方案中，禽是通过胸大肌肌内注射抗原制品而免疫。多克隆抗体的产生可以通过在免疫后的各个时间点取免疫的动物血样而监测。随后也可以给予加强注射。重复加强和效价测定的程序直至达到合适的效价。当获得希望水 平的免疫原性时，使免疫的动物血液流出，分离血清并贮存。 

C.抗体从卵黄中的分离 

结合与PGC相关的抗原的抗体在用抗原(例如用包含抗原的肽)免疫的雌性禽产生的卵的卵黄中沉积。在一些实施方案中，抗体可使用本领域技术人员已知的技术从卵黄中分离。见例如Akita et al.，JImmunol Meth 160：207-214，1993；Akita et al.，J FoodSci57：629-634，1992；U.S.Patent NO：4,357,272所述。如U.S.PatentNO：4,357,272所教导，IgY可以通过用聚乙二醇(PEG)沉淀而从卵黄中纯化。简而言之，收集卵黄并在蒸馏水中洗涤以除去蛋清。卵黄可经过一个玻璃漏斗进入量筒中，使得卵黄囊破裂并释出卵黄，在该量筒中收集卵黄。测定卵黄的体积并加入相当于2体积卵黄的缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水；PBS)并彻底混和。加入PEG(例如PEG 6000)至终浓度为3.5％(重量∶体积；w∶v)。搅拌该混合物直至PEG完全溶解。然后将该混合物在12,000g离心10分钟。离心步骤导致离心管中产生三个相。顶层是黄色脂肪层，中间层是清澈的上清层，底层是由卵黄块和蛋白质“沉淀”组成的。可将含有IgY的上清液和脂肪层轻轻倒入在漏斗颈部含有脱脂棉塞的漏斗中。该棉塞除去脂质层。然后测定清澈的过滤物的体积并轻轻搅拌加入PEG，至终浓度为12gPEG/100ml卵黄提取物。在这个浓度，PEG使得IgY完全置换。然后将沉淀如前所述离心。沉淀物可以在磷酸盐缓冲液中再溶解为原始体积，并用12％PEG再沉淀一次IgY并离心。剩余的PEG可以通过再离心和抽吸任何液体的两次循环而除去(IgY在沉淀中发现)。之后，将最终的沉淀物以相当于半体积的得到沉淀物的卵黄的磷酸盐缓冲液进行溶解，尽管以较小的体积溶解沉淀物，但如果需要可以获得更浓缩的溶液。对于注射进希望更完全除去PEG的动物中，IgY可以通过用半饱和的硫酸铵沉淀IgY随后离心而除去微量的PEG。PEG在硫酸铵水溶液相中形成液相，而IgY形成在离心管底部的第三相。 

通过这种方式或本领域已知的任何其它方法纯化的IgY可用于使用本领域已知的技术的免疫分析中，包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀等。标准的二级试剂如抗IgY二级抗体可得自许多生产商，包括Research Diagnostics Inc.，Flanders，New Jersey，United States of America，及Aves Labs，Inc.，Tigard，Oregon，UnitedStates of America。 

III.调节PGC增殖和发育的方法 

本发明提供了调节禽胚胎中PGC发育的方法。本发明的方法提供的调节可表现为胚胎中PGC的性质或数量上的差异，包括但不限于发育中的胚胎中存在的PGC数相对于在未进行本发明方法处理的相同物种的相同胚胎期的胚胎中正常发现的PGC数的减少或增加。或者，所述调节可表现为干扰胚胎中PGC的正常发育，由此PGC在迁移至生殖腺或者一旦其进入胚胎生殖腺的微环境即发育方面均不能正常发育。 

一些研究小组已经报道了化学制品和放射在调节禽胚胎中PGC水平中的应用。用于降低内源性PGC水平的一种特殊的化学制品是白消安(busulfan)(见Aige-Gil & Simkiss，Res VetSci 50：139，1991；Vick et al.，J Reprod Fert 98：637；Bresler et al.，Br Poutry Sci35：241，1994；Hallett & Wentworth，Poultr Sci 70：1619，1991；U.S.PatentApplication Publication NO：20030111016所述)。化合物白消安(1，4-二甲磺酸丁酯，BU)在白血病的治疗中用作化疗剂(Bhagwatwar et al.，Cancer，Chemother Pharmacol 37：401-08，1996)。在1963年，Hemsworth和Jackson论证了在大鼠中给予BU可明显削弱PGC的发育(Hemsworth & Jackson，J Reprod Dev 6：229-33，1963)。将BU注射进鸡胚胎的卵黄囊中导致多重畸形(Swartz，Teratology 21：1-8，1980)。Hallett和Wentworth(Poult Sci 70：1619-23，1991)也报道了在将BU 的蛋白悬浮液注射进鹌鹑卵中之后孵化能力显著降低。在一些BU处理的鹌鹑中，表现为生殖腺中生殖细胞缺少，而其它相似处理的禽表现正常。作者提示“BU输送至胚胎中的不一致”也许可以解释观测的变化。他们推断揭示一种非毒性的溶剂系统对消除使用悬浮液相关的不一致的结果是必需的。Aige-Gil & Simkiss(Br Poult Sci32：427-438，1991)在鸡胚胎中使用BU的盐水或芝麻油悬浮液，或者溶解于二甲基亚砜(DMSO)中的BU。单独给予DMSO产生使用盐水未观测到的胚胎死亡、发育延缓及畸形。当BU悬浮于芝麻油中并注射进卵黄中时，致畸效应显著最小化。注射处于芝麻油中的100μg BU导致不育指数为95+％。在随后的实验中，Vick及其同事(J ReprodFertil 98：637-41，1993)报道了注射25、50及250μg BU显著减少鸡胚胎中生殖腺生殖细胞。他们估计当与未用BU处理的胚胎相比时，BU处理使种系嵌合率提高3.5倍。Bresler等(Br Poult Sci 35：241-47，1994)论证了用BU处理及随后注射PGC可导致生殖腺显著种群恢复。注射悬浮于芝麻油中的50μg BU，使得6天龄的鸡胚胎的左侧和右侧生殖腺中PGC分别减少75％和78％。在将生殖新月区细胞的悬浮液注射进BU处理的胚胎中之后，左侧和右侧生殖腺中PGC数分别增加到对照组的72％和115％。输送BU至生殖腺的可变性及所产生的降低PGC数的有效性中的不一致，限制了这种技术的应用。 

在美国专利申请出版物NO：20030111016中，发明人在给予供体PGC之前使用白消安降低内源性PGC。简而言之，在一个玻璃瓶中将15mg白消安溶解于5ml二甲基甲酰胺(DMF)。向此溶液中加入5ml芝麻油。将混合物完全旋动以产生乳液。该乳液中白消安的浓度为1.5μg/μl。为每个批次注射制备新鲜的白消安乳液。将受精卵在37.5℃，60％相对湿度下孵育22小时。然后将卵水平置于孵育器中2小时。每个卵的钝端用70％乙醇清洁。使用弯曲镊子在覆盖气室的壳上做一小孔，而不破坏外部壳膜。使用皮下注射器针头(21G×1.5英 寸)，将50μl白消安乳液(含有75μg白消安)通过气室水平注射进卵黄中。将乳液在使用之前完全旋动。在整个注射程序中将卵保持水平。壳上的孔用透明胶带密封。注射后将卵垂直孵育。 

在27期(H & H)收集白消安处理的胚胎并在4％低聚甲醛中固定。将胚胎包埋于石蜡中，以7μm厚度切片，并用SSEA-1抗体进行免疫组织化学染色。计数每个胚胎的10个随机选择的切片中左侧和右侧生殖腺中的PGC数，并使用等式IS＝(N--X)/N计算不育指数(IS)，其中N是对照生殖腺的PGC数，X是白消安处理的胚胎的PGC数(Reynaud，J Embryol Exp Morphol 21：485-507，1969)。确定芝麻油、DMF和白消安对27期的鸡胚胎存活力的作用，并还评定给予白消安后处理的禽的孵化能力。显示出白消安降低了PGC数，特别是以75μg剂量在芝麻油和DMF中乳化时尤其如此，尽管处理的胚胎的存活力是未处理的对照组的1/4至1/2。 

在一些实施方案中，本发明提供了调节禽胚胎中原生殖细胞数的方法，所述方法包括用与原生殖细胞相关的抗原免疫雌性禽，从而该雌性禽生产的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的禽胚胎中内源性PGC数。 

如本文所用，术语“调节”是指一个生物化学实体如PGC的任何或所有化学和生物学活性或性质的增加、降低或其它改变。同样，术语“调节”可以指发育中的胚胎中存在的PGC数相对于相同物种相同胚胎期的非嵌合胚胎而变化。例如，术语“调节”可以意味着“抑制”、“降低”或“阻抑”，但术语“调节”的应用不限于这种解释。如本文所用，术语“抑制”、“降低”、“阻抑”、“负调节”及语法学上的变化用语可互换使用，是指一种活性，其可使胚胎中存在的PGC数或发育降低至低于在没有PGC相关多肽上存在的抗原的抗体的情况下观测到的结果。在一个实施方案中，抗体分子(例如抗VASA、DAZL、EMA-1等的IgY)的抑制导致在用供体PGC种群恢复之前的 胚胎中存在的PGC数减少。 

在另一个实施方案中，禽胚胎中存在的PGC数在存在PGC相关多肽上存在的抗原的抗体情况中高于不存在该抗体的情况。 

本文所用术语“调节”是指在用供体PGC种群恢复之前胚胎中PGC数(或其发育)的正调节(即激活、增强或刺激)和负调节(即抑制、降低或阻抑)。因此，术语“调节”当对于功能性质或生物学活性或过程(例如PGC的发育，包括但不限于增殖)而言时，是指正调节(例如激活、增强或刺激)、负调节(例如抑制、降低或阻抑)、或另外改变一些这种性质、活性或过程(例如PGC发育和增殖)的能力。 

在本发明特殊的实施方案中，受体禽中内源性PGC数在导入供体PGC之前是降低的。在这种方式中，供体PGC可在受体禽的生殖腺进行种群恢复，并可以提高产生嵌合禽的效率及衍生自供体禽的配子(和子代)的比例。内源性PGC可降低至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或者更多。在其它的特殊实施方案中，受体禽基本不育，这个术语在本文已解释。受体禽中内源性PGC数的定向减少可以基于许多考虑因素，包括但不限于希望的数目和衍生自供体禽的配子比例，与达到内源性PGC降低的方法相关的任何不利作用的最小化，等等。 

换而言之，可以实践本发明揭示的方法，以便衍生自供体PGC 的配子(和/或子代)与受体禽的PGC的比率可以是大约10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、90/10或更高。在一些实施方案中，可以实践本发明的方法以便少于50％的配子(和/或子代)衍生自供体PGC。衍生自供体PGC相对低比例的配子和/或子代在那些应用中是可接受的，其中只需要来自嵌合禽的相对较少数的供体配子和/或子代，和/或来自嵌合禽的供体配子和/或子代是有商业价值的。 

在一个实施方案中，受体禽中PGC数由于存在卵黄中沉积的母 代抗体而降低。这些抗体通常称为IgY，当它们结合PGC相关的多肽上呈递的抗原时能影响胚胎中PGC的发育，在一个实施方案中抗原存在于与PGC迁移或发育相关的多肽上。 

PGC中的降低是通过用与PGC相关的抗原免疫雌性禽而达到的。抗原可以呈递在与PGC发育相关的多肽上(例如VASA多肽)，包括但不限于肽抗原(例如VASA多肽的4或多个氨基酸的一段序列)和碳水化合物抗原(例如翻译后加入PGC表面上的多肽的碳水化合物组分)。当雌性禽用这个抗原(或众多这种抗原)免疫时，禽可以产生对该抗原的免疫应答。当免疫的禽产卵时，抗原的抗体沉积在卵黄中。然后这些抗体能结合在卵中发育的胚胎中存在的其关连抗原，从而调节含有该抗原的发育中的胚胎内存在的大分子的生物学活性。 

IV.产生嵌合禽的方法 

本发明还提供了一种生产嵌合禽的方法。在一些实施方案中，本发明方法包括：(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫雌性禽；(b)该雌性禽产卵，其中该卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的受体胚胎中PGC发育、PGC数，或其组合；(c)将供体PGC经卵内给予受体胚胎以产生嵌合禽。 

嵌合禽通过将供体胚盘细胞移至受体禽胚盘中而产生。参见Etches et al.，Poult Sci 76：1075，1997所述。嵌合禽，特别是种系嵌合物，也已经通过将PGC移至受体胚胎中而产生，所述PGC包括衍生自生殖新月区的PGC、在血液中发现的循环PGC及在生殖嵴中发现的生殖腺PGC。参见Tajima，Avian Poult Biol Rev 13：15-30，2002所述。已经报道了胚盘细胞含有假定的PGC(Kagami et al.，MolReprodDev 48：501，1997；Ginsburg&Eyal-Giladi，J Embryol Exp Morphol95：53，1986)，如果是真的则可以解释通过胚盘细胞转移而产生种系猷合禽的能力。在本发明的一些实施方案中，胚盘细胞和/或PGC可 以通过本领域熟知的技术导入发育中的禽胚胎中，包括将细胞注射进终窦，注射进大动脉，注射进生殖新月区，注射进胚胎体腔中，等等。 

大多数禽嵌合物产生应用鸡。见例如Naito et al.，Mol Reprod Dev39：153-161，1994所述。然而嵌合禽的产生不限于鸡。嵌合物也已经在鹌鹑中通过将来自鹌鹑的早期胚盘细胞移至鹌鹑的胚胎中而产生。见Ono et al.，Jpn Poult Sci 31：119，1994所述。 

另外，种间嵌合物已经通过将鹌鹑胚盘细胞导入鸡胚盘中(Watanabe et al.，Development 114：331-338，1992)及通过将解离的火鸡生殖新月区细胞和/或PGC导入鸡胚胎中(Reynaud，J Exbryol ExpMorphol 21：485-507，1969；U.S.Patent No.6,354,242；U.S.PatentApplication Publication 20030111016)而产生。 

本领域技术人员意识到供体PGC可以遗传修饰之后给予受体禽，例如通过基因破坏和/或导入一或多个异源核苷酸序列而修饰。本领域已知将异源序列瞬时导入或稳定导入禽细胞的方法(见例如Bosselman等的美国专利NO：5,162,215所述)。在一个实施方案中，将异源核苷酸序列稳定掺入PGC中。本领域已知将感兴趣的核酸导入受体细胞中的方法，包括脂转染、转染、显微注射、转化、微粒技术，等等。可以使用任何合适的载体，包括质粒、病毒(包括逆转录病毒)、噬菌体，等等，无论是天然形式还是其衍生物形式。 

供体PGC可加以遗传修饰以在受体禽中产生希望的结果(例如表达决定性别的转基因)。或者，可以指定遗传修饰传递至嵌合禽的子代并产生希望的作用。 

导入一或多个异源核苷酸序列(例如外源序列或额外的或修饰的内源序列的拷贝)可以用于许多应用中，例如在禽中产生感兴趣的多肽(例如在这种禽的血浆或卵中以方便地收集和纯化)。根据这个实施方案，该禽可基本用作生物反应物。感兴趣的多肽包括治疗性多肽(例如兽医或医学应用)或免疫原性多肽(例如疫苗)、抗体(包括但不限于 抗体片段和单链抗体)、酶(例如工业酶)、激素和生长因子，或者任何其它感兴趣的蛋白质。 

或者，多肽可以是报道基因多肽，其作为供体细胞的标记(例如绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶、新霉素磷酸转移酶、及氯霉素乙酰转移酶)。标记可用于监测胚胎发育和/或分析细胞结局和迁移等目的(见例如Mozdziak et al.Dev Dynamics 226：439-445，2003所述)。这个参考文献论证了对于细胞命运分析的第一个成功的转基因禽品系。 

在其它实施方案中，多肽是治疗性或免疫原性多肽或者是对受体禽具有希望的或有益作用的任何其它多肽，例如具有希望的表型作用或增强生长性能(包括但不限于增加的肌肉和/或减少的脂肪沉积和/或改良的饲养/收获比率)，卵产生，疾病耐受性，等等的多肽。 

另外，感兴趣的异源核酸可编码反义核酸、核酶(例如美国专利NO：5,877,022所述)或者任何其它非翻译RNA。 

本领域技术人员理解感兴趣的异源核苷酸序列可以与合适的控制序列可操纵地连接。例如，异源核酸可以与表达控制元件可操纵地连接，所述表达控制元件包括但不限于转录/翻译控制信号、复制源点、聚腺苷酸化信号、及内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子，等等。 

进一步意识到根据希望的水平和组织特异性表达可使用多种启动子/增强子元件。根据希望的表达模式，启动子/增强子可以是组成型或可诱导的。启动子/增强子可以是天然或外源的并可以是天然或合成的序列。外源是指转录起始区域在导入该转录起始区域的野生型宿主中未发现。在特殊的实施方案中，异源核苷酸序列与卵清蛋白启动子或溶菌酶启动子可操纵地连接。 

在一个实施方案中，应用与靶细胞或处理对象是天然的启动子/增强子元件。在另一个实施方案中，应用与异源核酸序列是天然的启 动子/增强子元件。选择启动子/增强子元件以便其在感兴趣的靶细胞中起作用。在另一个实施方案中，应用禽启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型或可诱导的。 

在希望提供调节异源核酸序列过表达的那些应用中，可应用可诱导的表达控制元件。用于基因输送的可诱导的启动子/增强子元件可以是细胞或组织特异性启动子/增强子元件。其它可诱导的启动子/增强子元件包括激素可诱导的元件和金属可诱导的元件。典型的可诱导的启动子/增强子元件包括但不限于Tet on/off元件、RU486-可诱导的启动子、蜕皮激素可诱导的启动子、纳巴霉素可诱导的启动子、及金属硫蛋白启动子。 

在其中异源核酸序列在靶细胞中被转录及然后翻译的实施方案中，通常需要特异性起始信号以有效翻译插入的蛋白质编码序列。这些外源翻译控制序列，包括ATG起始密码子和相邻序列，其可以是各种来源的，天然的及合成的来源均可。 

在众多禽卵中增加雄性禽的比例的方法 

在禽中，与哺乳动物不同，雄性是同配性别(ZZ)，雌性是异配性别(Zw)。因此在禽中是雌性决定了子代的性别，因为雌性产生携带性别决定染色体的卵：即Z或w染色体。因此，如本文所述，通过将雄性原生殖细胞移至雌性胚胎宿主，则由该宿主产生的携带Z的卵的百分比增加及雄性子代的百分比增加。肉用禽的雄性子代百分比增加对于相应更高的饲养转换比率及由此获得的更有效的肉产量更有经济学价值。 

当ZZ PGC给予雄性胚胎时，在受体子代中应无性别比率改变发生，不管供体PGC在受体生殖腺建群程度如何。只有当ZZ PGC给予雌性(Zw)受体胚胎时才发生性别比率倾斜。因此，本发明的方法当将ZZ PGC给予雌性(Zw)胚胎时可产生性别比率倾斜。 

一旦达到性成熟时携带Z的卵在受体雌性胚胎中产生的程度，及因此受体产生雄性子代的程度，可依赖于供体ZZ PGC在受体胚胎的生殖腺建群的程度。可以发生一些可能的结果。在谱(spectrum)的一端，供体PGC不在胚胎生殖腺建群，并因此受体预期产生50％Z卵和50％w卵(即无性别比率倾斜发生)。在谱的另一端，供体PGC在胚胎生殖腺完全建群以排除内源性PGC，受体预期仅产生Z卵，并因此受体所有的子代均是雄性的。因此，期望受体雌性禽产生的雄性子代的百分比可以计算为50％+(ZZ PGC在胚胎生殖腺建群的百分比除以2)，假定供体PGC和内源性PGC相等地能独立地产生卵(即产生的反映胚胎生殖腺内存在的内源和供体PGC百分比的卵)。 

如此期望，最大化ZZ PGC在胚胎生殖腺的建群百分比应可以使受体雌性禽的雄性子代百分比达到最大化。可以使用一些方法达到这个目标。一种这样的方法是将足够数的供体PGC给予受体，由此供体PGC数显著超过内源性PGC。当受体胚胎处于PGC迁移至胚胎生殖腺的胚胎期之前的胚胎期时，期望这个方法是最有效的。 

另一种方法是在给予供体PGC之前除去内源性PGC或者抑制其在胚胎生殖腺建群的能力。这可以通过从胚胎中物理性的除去内源性PGC而达到，例如当内源性PGC在胚胎血液中循环时的胚胎期通过从胚胎中除去血液而达到。见Naito et al.，Mol Reprod Develop 39：153，1994；Tajima et al.，J Exp Zool 280：265，1998所述。然而，这是一种技术要求苛刻的操作，要冒对胚胎自身发生实质损害的危险。另一种方法是防止内源性PGC到达和/或在胚胎生殖腺建群。一些报道描述了应用化学制剂或放射以达到这个目标，包括使用白消安(见Aige-Gil& Simkiss，Res Vet Sci 50：139，1991；Vick et al.，J Reprod Fert 98：637；Bresler et al.，Br Poutry Sci 35：241，1994；Hallett & Wentworth，PoultrSci 70：1619，1991)，伴刀豆球蛋白-A(Lee et al.，J Embryol Exp Morph46：5，1978)，及紫外线(uv)或γ放射(Reynaud，J Embryol Exp Morphol 21：485-507，1969；Reynaud，JRoux′s Arch Devel Biol 179：85-110，1976；Aige-Gil & Simkiss，Br Poul Sci 32：427-438，1991；Reynaud，C R HebdSeances AcadSci-D：Sci Natur 282：1195，1976；Mraz & Woody，RadiationRes 54：63-68，1973；Carsience et al.，Development 117：669-75，1993；Thoraval et al.，Poultry Sci 73：1897-1905，1994；Maeda et al.，Poultry Sci77：905-07，1998所述)。然而，使用毒性化学制剂和辐射不是最理想的，特别是对于农业重要的禽物种。 

本文揭示了另一种方法，其中识别PGC相关的抗原的抗体沉积在卵黄中，其中受体胚胎由于用该抗原免疫的母鸡产卵的结果而发育。在这个实施方案中，雌性禽用PGC相关的抗原免疫。该抗原的抗体沉积在免疫的雌性禽产生的卵黄内。抗体然后可用于调节在卵内生长的胚胎中PGC的发育。在一个实施方案中，抗体使胚胎生殖腺中存在的PGC数降低，由此当供体PGC给予受体胚胎中时，供体PGC能在生殖腺建群并在此发育。然后孵育受体胚胎至孵化，使其达到性成熟。 

当用于增加从一组卵中孵化的雄性禽的数目或比率时，本发明包括经卵内给予雌性禽雄性(即ZZ)禽原生殖细胞。卵内禽的性别可预先确定或在孵化后确定。然后将该禽孵育至孵化，如果需要则确定禽的性别，饲养至性成熟，并根据已知技术将该禽与合适的雄性种禽交配而繁殖。然后收集由这个禽产生的众多受精卵，典型地孵育至孵化，饲养所得禽至少2-3周。由这个雌性禽产生的雄性与雌性禽卵(或禽)的比率高于在未经卵内将雄性原生殖细胞给予该禽的情况下获得的相应比率。这种方法典型地用于产肉禽物种，如鸡、火鸡、鸭，等等。 

VI.生产禽配子的方法 

本发明还提供了生产禽配子的方法。在一个实施方案中，所述方法用 于在第一种禽物种中生产来自第二种禽物种的禽配子。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫第一种禽物种雌性禽，从而雌性禽产的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的第一种禽物种的受体禽的PGC发育；(b)将分离自第二种禽物种的禽的供体PGC导入第一种禽物种的受体禽中；(c)孵育第一种禽物种的受体禽至孵化；及(d)饲养第一种禽物种的受体禽至性成熟，其中第一种禽物种的受体禽产生来自第二种禽物种的配子。 

当用于生产和收集禽配子(精子，卵)时，经卵内给予受体禽物种的原生殖细胞可以与从中获得供体PGC的供体禽物种不同。然后孵育受体至孵化并饲养至性成熟，从受体动物中收集供体禽物种的精子细胞或卵，所有这些均根据标准技术进行。例如，在濒于灭绝的物种的情况中，供体禽物种可以是鸣鹤，受体禽物种可以是沙丘鹤。在关于商业禽生产的另一个实施例中，供体禽物种可以是火鸡，受体禽物种可以是鸡。 

美国专利申请出版物NO：20030111016描述了在一种禽物种的胚胎生殖腺中由另一种禽物种的供体PGC进行种群恢复的方法。孵育Barred Plymouth Rock(BPR)鸡胚胎直至27-28期(H&H)。BarredPlymouth Rock供体胚胎用作颜色标记，因为它们在I基因座是纯合隐性的(ii)并在其羽毛中表达色素。将雄性胚胎的生殖腺收集在补加了10％FBS、谷氨酰胺、抗生素和抗真菌溶液的DMEM中。通过利用Petitte & Kegelmeyer的方法(Animal Biotechnol 6：19-30，1995)确定胚胎的性别。然后将生殖腺在PBS中漂洗两次并在37℃在0.02％EDTA中孵育15分钟。加入新鲜的培养基并破碎生殖腺。收集细胞悬浮液并在450g旋转5分钟。更换培养基并使用台盼蓝排除确定细胞存活力。取细胞悬浮液等分并用SSEA-1抗体染色以确定注射的PGC数。将含有100-500个PGC的大约2-3μl细胞悬浮液 注射进发育14-17期(H & H)的White Leghorn(WL)胚胎的血管中。WL胚胎作为受体，因为已知它们是纯合显性的(II)。这个基因型编码羽毛中无色素。在注射PGC之后，将卵回置入孵育器中至完全发育。在孵化时，表型WL鸡系上带子做标记，随后饲养至性成熟。随后进行测试交配以确定是否存在种系嵌合物：雄性BPR×雌性WL和雄性WL×雌性BPR。随后评价这些测试交配的子代以确定雄性BPR生殖腺PGC是否掺入WL中。由于仅用雄性BPR胚胎作为供体，因此衍生自雄性BPR×雌性WL测试交配的所有“黑色”鸡(BPR表型)是雄性的。 

将受精的火鸡卵在38.5℃孵育8-8.5天(27-28期，H & H)。切开胚胎以获得生殖腺。然后将含有大约150个PGC的2-3μl生殖腺细胞悬浮液注射进14期(H & H)鸡胚胎的血管中。将受体卵密封并回置于孵育器中。收集不同孵育阶段(19-25期)的受体胚胎。将胚胎在PBS中漂洗3次，然后在4％低聚甲醛中在4℃固定过夜。将样品在PBS中洗涤3次，然后置于50％乙醇中。将组织脱水，包埋于石蜡中并切片。所得切片随后通过SSEA-1和过碘酸-Schiff(PAS)染色进行免疫组织化学分析。先前的研究已经鉴别了火鸡和鸡PGC对SSEA-1表达中的物种差异。这种抗原性变化结合标准PAS测试可用于鉴别火鸡-鸡种系嵌合物。对双重染色的鸡胚胎切片的观测证实了鸡PGC是PAS和SSEA-1双阳性的。用PAS和SSEA-1对24期的火鸡切片双重染色证实通过背部肠系膜迁移并在生殖腺建群的火鸡PGC是PAS阳性的，并且不表达SSEA-1表位。因此，对鸡和火鸡胚胎的双重染色证实该双重染色可用作区分火鸡PGC对鸡PGC的标记。 

WL(II)×BPR(ii)杂交的子代可典型地表达WL表型(li)并呈现在羽毛中没有黑色素。将雄性BPR PGC导入WL受体中产生表现BPR的黑色素模式的子代。这些数据支持了这样的观点，即没有生物学屏 障阻止通过用分离自雄性胚胎生殖腺的PGC注射雌性鸡胚胎而增加的雄性子代的产生。然而，种系传递的发生率低于1％。这个系统中供体衍生的子代的低发生率可能涉及当与注射的供体PGC对比时内源性PGC呈现的显著数量优势。用BU+DMF+SO乳液处理胚胎之后注射供体PGC使内源性PGC数降低多至97％。当与单独的BU+SO处理对比时，加入DMF使内源性PGC的降低大约15％。 

在用SSEA-1和PAS双重染色后，鸡和火鸡PGC基于不同的染色模式而在鸡胚胎生殖腺中鉴别。由于糖原的存在，鸡和火鸡PGC在PAS染色之后均染成品红色。然而，火鸡PGC当位于发育中的生殖腺中时不再是SSEA-1阳性的，这将其与在这个发育阶段是SSEA-1阳性的鸡PGC区分开。这些结果提示分离自胚胎火鸡生殖腺的PGC可用于在鸡生殖腺种群恢复。 

继续参考美国专利应用出版物NO：20030111016，将白色来亨鸡(WL)胚胎在卵内用白消安乳液(BU+DMF+芝麻油)处理以耗竭内源性PGC。收集雄性Barred Plymouth Rock(BPR)胚胎的生殖腺，分离PGC，并将该分离的PGC经卵内给予白消安处理的禽和对照组未处理的禽，基本如前述实施例所述进行。在孵化后，雄性WL嵌合禽饲养至性成熟并与雌性BPR禽杂交。黑色子代的产生是衍生自BPRPGC的配子通过嵌合雄性WL亲代传递的指征。结果表明25％(4/16)WL雄性传递衍生自BPR PGC的配子。在这4个嵌合禽中，传递比率在大约2％-23％之间。在对照禽中未进行白消安处理，仅有一个禽仅有可检测的衍生自BPR PGC的配子的传递。 

在一些实施方案中，本发明进行了在一种禽物种的胚胎生殖腺中用来自另一种禽物种的供体PGC进行种群恢复的方法，如美国专利应用出版物NO：20030111016所述。当然，在这种实施方案中，本发明还进行了用原生殖细胞相关的抗原免疫第一种禽物种的雌性禽，从而由该雌性禽产生的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调 节该卵内存在的第一种禽物种的受体禽的PGC发育。 

VII.增强核酸分子种系传递的方法 

本发明还提供了一种增强核酸分子在禽中种系传递的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫一个雌性禽，从而该雌性禽产生的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的受体禽中PGC孵育；(b)在足以使得众多PGC的至少之一在受体禽的生殖腺建群的条件下，将包含该核酸分子的众多供体PGC给予受体禽；(c)孵育该受体禽至孵化；及(d)饲养该受体禽至性成熟，其中该受体禽产生衍生自供体PGC的配子。在这个实施方案中，种系传递比本领域现有方法更有效，其中种系嵌合体的有效产生是本领域持续需要的。 

本发明的方法基于上述揭示的关于种系嵌合体产生的相同原理。然而，在这个实施方案中，供体PGC在体外通过导入一个外源核酸分子(即转基因)进行处理之后给予受体胚胎。这个方法不受核酸自身(例如与启动子可操纵地连接的一个感兴趣的开放读框)或者导入方法(例如电穿孔、脂质体介导的转染，等等)的限制。更合适地，感兴趣的核酸分子使用本领域已知的技术导入众多供体PGC中，然后该供体PGC给予在用PGC相关的抗原免疫的雌性禽产生的卵中发育的受体胚胎。然后使得供体PGC在胚胎的生殖腺建群，当其达到性成熟时可将该核酸传递至其子代。 

VIII.给予 

可以提供并配制原生殖细胞(PGC)以通过合适的技术进行本发明，并在根据需要使用之前加以贮存、冷冻、培养等。 

例如，原生殖细胞可以在合适的胚胎期从供体胚胎中收集。禽发育的时期在此由两种本领域公认的分期系统之一划分：Eyal-Giladi & Kochav系统(EG & K；见Eyal-Giladi & Kochav，Dev Biol 49：321-327，1976)，其使用罗马数字表示发育的pre-primitive streak时期，及Hamburger & Hamilton分期系统(H & H；见例如Hamburger &Hamilton，J Morphol 88：49-92，1951)，其使用阿拉伯数字表示产卵后时期。除非特别说明，本文的胚胎期是按照H&H分期系统划分的胚胎期。 

例如，PGC可以在4期、或者生殖新月区时期、一直到30期分离，从血液、生殖嵴或晚期的生殖腺中收集细胞。原生殖细胞的大小一般是体细胞的两倍，基于其大小易于从中区分并分离。雄性(或同型配子的)原生殖细胞(ZZ)可以通过任何合适的技术与异型配子的原生殖细胞(Zw)区分，如从特定的供体中收集生殖细胞并对来自该供体的其它细胞进行分型，收集的细胞与分型的细胞是相同染色体类型的。 

可以通过分离细胞(例如通过机械分离)并将该细胞与药物学可接受的载体(例如磷酸盐缓冲的盐水溶液)密切混和而配制PGC以给予动物。原生殖细胞在一个实施方案中是生殖腺原生殖细胞，在另一个实施方案中是血液原生殖细胞(“生殖腺”或“血液”是指在原始胚胎供体中其所来源的组织)。根据给予的特定目的给予的原生殖细可以是异型配子的(Zw)或同型配子的(ZZ)。PGC可以在生理学可接受的载体中给予，在一个实施方案中是在pH为大约6-8或8.5，以合适的量给予以达到希望的作用(例如，100-1000个PGC/个胚胎)。PGC可以没有其它成分或细胞而给予，或者可以与其它细胞或成分一起给予。 

将原生殖细胞在卵内给予受体动物可以在任何合适的时间(此时PGC仍可迁移至发育中的生殖腺)进行。在一个实施方案中，给予是在大约IX期(根据Eyal-Giladi & Kochav(EG & K)分期系统)至大约30期(根据Hamburger & Hamilton分期系统)进行，在另一个实 施方案中，在15期进行。对于鸡而言，给予时间因此在胚胎发育的第1、2、3或4天，在一个实施方案中在第2-2.5天。给予典型地是注射进任何合适的靶部位，如羊膜(包括胚胎)、卵黄囊，等区域。在一个实施方案中，注射是进入胚胎自身(包括胚胎体壁)，在另外的实施方案中，可以应用血管内注射或体腔内注射进胚胎中。本发明的方法可以用先前卵内绝育的受体禽进行(“绝育”是指部分或完全不能产生衍生自内源性PGC的配子)。当从这种受体中收集供体配子时，它们可以是供体和受体的配子混合物。这种混合物可以直接使用，或者该混合物可以进一步处理以富集其中供体配子的比例。 

PGC的给予可以通过给予PGC自身或者通过给予在对象中发育为PGC的前体细胞(特别是使用本文所揭示的方法以改变子代的性比率之处)进行。例如，给予可通过将胚盘细胞注射进禽而进行，其中胚盘细胞的一个亚群在该禽体内分化为原生殖细胞。 

卵内给予原生殖细胞可以通过任何合适的技术进行，以手工或自动方式进行。在一个实施方案中，卵内给予是通过注射进行。卵内给予的机械装置不是关键的，但该机械装置应不过度损害胚胎的组织和器官或者其周围的胚胎外膜，以便所述处理不过度降低孵化率。装备大约18-26号针头的皮下注射器适于这个目的。根据胚胎的精确发育时期和位置，在小鸡上方的液体或小鸡自身内进针1英寸停止。在插入针头之前在壳上打钻通壳的定位孔以防止针头损害或变钝。如果需要，卵可以用细菌基本不能透过的密封材料密封，如用蜡等密封，以防止随后不利的细菌进入。预期禽胚胎的高速注射系统特别适于实践本发明。众多这种设备是可利用的，例如EMBREX INOVOJECT^TM 系统(见Hebrank的美国专利No.4,681,063和4,903,625所述)，以及Miller的美国专利Nos.4,040,388、4,469,047和4,593,646所描述的设备。本文引用的所有美国专利的揭示在此均以其全文并入参考。适于实践本发明方法的所有这种设备包含一个含有所述原生殖细胞配制 品的注射器，将注射器定位以注射进由该设备携带的如上述卵内的适当位置。另外，可以提供与注射设备可操纵地连接的一个密封设备，以在注射后密封卵上的孔。 

实施例 

现在参考所附实施例对本发明加以更充分的描述，其中示出了本发明的代表性实施方案。然而，本发明可以不同形式进行，不应限于本文所述实施方案。提供这些实施方案是使得本发明的揭示更彻底和全面，本领域技术人员可充分理解本发明的范围。 

实施例1：雌性禽的免疫 

鉴别、合成鸡DAZL和鸡VASA同系物蛋白质的抗原性肽区域，并与匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)缀合。选择的肽示于表1。 

表1：所选择的用于缀合及免疫产卵母鸡使其具有对鸡VASA和DAZL抗性的肽段 

将各种缀合的肽的原液(1,000μg/ml)保持在4℃。在立即进行免疫之前，使用通过双轴(double hub)乳化针头连接的两个注射器由0.5ml缀合的肽和0.5ml的TITERMAX 

佐剂(TMA；CytRx Corp.，Norcross，Georgia，United States of America)产生稳定的乳液。TMA是聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的一种合成的非离子嵌段共聚物。 

将性成熟的雌性Leghorn肌内(胸大肌)注射100-200μg单独的缀合肽或肽组合进行免疫。在免疫后取血样，使其在4℃凝集过夜，并将所得血清样品贮存在-20℃以进行随后的抗体确定。14天后进行二次免疫(50-100μg缀合肽+TMA)。在二次攻击3天后从免疫的母鸡和未注射的对照物中获得血样。将所得血清样品贮存在-20℃以进行随后的抗体确定。 

抗肽抗体的效价使用间接ELISA技术确定。抗原(即KLH缀合的肽)溶液通过将抗原溶解在蒸馏水中而制备，浓度为20μg/ml(1mg于50ml中)。如果该抗原不立即溶解，则用1N NaOH或1N HCl调节pH直至抗原溶解。为制备ELISA平板，将抗原溶液(0.1ml)加入96孔高结合微滴定平板的每个孔中。然后将平板用胶膜覆盖并在室温保温过夜或者在37℃保温2小时。在保温之后，将平板用200μl的0.05％Tween-20/PBS(pH 7.4，vol∶vol)洗涤3次。然后将平板在纸巾上吸干以除去过量的Tween-20/PBS。然后向每个孔中加入封闭溶液(于PBS中的1％BSA，pH 7.4，在4℃贮存)(150μl)。将平板用胶膜覆盖并在室温保温至少2小时或者在37℃保温1小时或者在4-8℃不确定保温。 

然后将平板用200μl的0.05％Tween-20/PBS(pH 7.4，vol∶vol)再洗涤3次，并在纸巾上吸干以除去过量的洗涤溶液。将于1％BSA/PBS缓冲液中的测试的或天然的动物血清系列稀释(1∶100-1∶1,000,000)。一式两份加入100μl测试的或对照的(未免疫的)鸡血清稀释液。将平板覆盖并在4-8℃保温过夜或者在37℃保温2小时。

将平板用200μl的0.05％Tween-20/PBS(pH 7.4，vol∶vol)洗涤3次，并在纸巾上吸干以除去过量的洗涤溶液。向每个孔中加入于1％BSA/PBS缓冲液中的100μl山羊或驴抗鸡(IgM+IgG)HRP缀合溶液(1∶6000稀释液)。将平板用胶膜覆盖并在室温保温至少4小时或者在37℃保温2小时或者在4-8℃保温过夜。在保温后，将平板再一次用200μl的0.05％Tween-20/PBS(pH 7.4，vol∶vol)洗涤3次，并在纸巾上吸干以除去过量的洗涤溶液。 

最后，向每个孔中加入100μl底物溶液。该底物溶液是通过向10ml 0.05M柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)中加入200μl的2，2′-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)染料溶液(将15mg ABTS染料溶解于1ml去离子水中而制备)和10μl H₂O₂而制备的。在加入底物后，将平板在室温保温，然后在平板读数器上在405nm分析。在405nm产生统计学显著高于背景(即分离自未免疫的对照母鸡的血清)的信号的最后的稀释度确定为效价。来自代表性母鸡的抗体的效价示于表2。 

表2：产卵母鸡免疫后抗鸡VASA和DAZL肽缀合物的血清效价 

禽编号	抗原	免疫17天后的  效价	免疫40天后的  效价
				522	Vasa-C	1∶10,000	1∶10,000
524	Vasa-C	1∶1,000	1∶1,000
				538	Dazl-C	1∶1,000	1∶1,000
548	Vasa-C  Vasa-N	1∶1,000  1∶1,000	1∶1,000  1∶1,000

[0161] 

550	Vasa-C  Vasa-N	1∶1,000  1∶1,000	1∶1,000  1∶1,000
				552	Vasa-C  Vasa-N	1∶500  1∶1,000	1∶500  1∶1,000
554	Dazl-C  Dazl-N	1∶10,000  1∶10,000	1∶10,000  1∶10,000
				556	Dazl-C  Dazl-N	1∶100,000  1∶1,000,000	1∶100,000  1∶1,000,000
566	Vasa-C  Vasa-N  Dazl-C  Dazl-N	无反应  1∶10,000  无反应  1∶5,000	1∶10,000  1∶50,000  1∶5,000  1∶10,000

实施例2：27胚胎期的胚胎中PGC的评价 

在免疫后，收集卵，贮存最多14天，并孵育至27期(H&H)。处死27期(H&H)的胚胎并在4℃在4％多聚甲醛中固定过夜。然后将胚胎在石蜡中包埋并以7μm厚度对生殖腺进行连续横截切片。从其它玻片中选择含有生殖腺区域的玻片，并使用识别胚胎阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)的单克隆抗体MC-480(Developmental StudiesHybridoma Bank，The University of Iowa，Iowa City，Iowa，United Statesof America)通过免疫组织学染色进行鉴别。该免疫组织化学染色使用抗生物素蛋白-生物素缀合的碱性磷酸酶(VECTASTAIN ABC-APkit，Vector Laboratories，Burlingame，California，United States ofAmerica)和BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/硝基蓝四唑)底物(Amresco，Inc.，Solon，Ohio，United States of America)进行。简而言之，在于PBS中1.5％正常山羊血清中封闭30分钟以消除非特异性染色之后，将切片相继在室温与原始抗体(1∶1000稀释的腹水)一起保温 60分钟并用PBS漂洗3次，与生物素酰化的二级抗体保温30分钟并用PBS漂洗3次，及与ABC试剂保温30分钟。在PBS中最后洗涤之后，将切片在碱性磷酸酶底物(NBT/BCIP溶液，Amresco)中染色15分钟，然后在液相封固剂中封固。代表性切片示于图1-3。 

在图1中，产生所述胚胎在其中发育的卵的母鸡用衍生自鸡VASA多肽的肽免疫。A组：对照组(未免疫)；B组：用Vasa-C肽(SEQID NO：4)免疫；C组：用Vasa-N肽(SEQID NO：3)免疫；D组：用Vasa-N和Vasa-C免疫。SSEA-1⁺细胞(染成深色的细胞)在对照胚胎中与暴露于抗VASA抗体的任何胚胎相比均更加丰富。 

在图2中，产生所述胚胎在其中发育的卵的母鸡用衍生自鸡DAZL多肽的肽免疫。A组：对照组(未免疫)；B组：用DAZL-C肽(SEQID NO：8)免疫；C组：用DAZL-N肽(SEQID NO：7)免疫；D组：用DAZL-N和DAZL-C免疫。SSEA-1⁺细胞(染成深色的细胞)在对照胚胎中与暴露于抗DAZL抗体的任何胚胎相比均更加丰富。 

在图3中，产生所述胚胎在其中发育的卵的母鸡用衍生自鸡VASA和DAZL多肽的肽免疫。A组：对照组(未免疫)；B组：用Vasa-N、Vasa-C、DAZL-N和DAZL-C肽(SEQ ID NO：3、4、7和8)免疫。SSEA-1⁺细胞(染成深色的细胞)在对照胚胎中与暴露于抗VASA和抗DAZL抗体的任何胚胎相比均更加丰富 

PGC的降低通过计数每个胚胎的左侧和右侧生殖腺的10个切片中免疫组织化学染色的PGC而确定。这个10个切片选自生殖腺的中间区域。在任两个选择的切片之间跳过至少3个切片以避免不止一次地计数各个PGC。这个分析的结果示于图4。如图4所示，每个肽抗原Vasa-N、Vasa-C、Dazl-N和Dazl-C在鸡内均能诱导免疫应答，导致由免疫的雌性禽产生的卵黄中抗抗原的抗体沉积。卵中抗体的存在降低处于发育27期的胚胎中PGC数。用各个肽免疫雌性禽导致内源性PGC数降低大约35-55％，而用两或多种肽同时免疫导致内源性 PGC降低大约55-70％。 

统计学分析：PGC/胚胎的平均数的处理差异使用SAS系统的GLM程序(SAS InstituteInc.，Cary，North Carolina，United States ofAmerica)分析。模型为PGC＝处理母鸡。处理差异是显著的，p＜0.0002。平均值使用Duncan′s Multiple Range Test计算。所有处理与对照组均显著不同，除了Vasa-N之外。 

实施例3：在处理的胚胎中生殖细胞种群恢复 

将根据实施例1和2产生的禽用作受体，并给予来自供体禽的内源性PGC。 

A.供体细胞的制备： 

将5.5天龄的鸡胚胎的生殖腺收集在PBS中。将分离的生殖腺集合在35mm培养皿的250μl的0.02％EDTA中并在37℃孵育10分钟。在平皿中用针头破碎生殖腺并在37℃孵育5分钟以上。将细胞收集在含有20％FBS的DMEM中，并在450g离心5分钟。洗涤细胞并再悬浮于DMEM中。确定细胞数和存活率。存活细胞的终浓度调节为大约1000个细胞/μl。 

B.受体胚胎的制备： 

受体鸡胚胎如实施例1和2所述制备。将胚胎置于孵化器中直至14-17期(H & H)。 

C.供体PGC注射进受体胚胎中： 

将含有大约100PGC的2-3μl的生殖腺细胞悬浮液注射进14-17期(H & H)的受体鸡胚胎的血管中。将受体卵密封并在37.5℃在60％相对湿度孵育。 

D.PGC种群恢复的评定： 

收集27期(H&H)的胚胎并在4℃在4％低聚甲醛中固定过夜。将该胚胎在石蜡中包埋，以7μm厚度切片并用SSEA-1抗体进行免 疫组织化学染色。计数从对照组和经PGC注射的胚胎中随机选择的10个切片中左侧和右侧生殖腺中的PGC数。结果通过应用t-检验进行统计学分析，测试分别是两个样品来源的群体的平均值之间的差异等于0.0的假说，及测试所述差异不等于0.0的另一个假说。如果这个测试的p-值小于0.05，则虚假说可以在95.0％信赖水平否决。还确定了群体平均值之间的95.0％可靠区间。在重复抽样中，所有这种区间的95.0％含有真正的差异。 

实施例4：在内源性PGC耗竭后种内鸡种系嵌合物的产生 

使用如下程序以生产种内种系嵌合物。 

A.种内鸡种系嵌合物的产生： 

孵育Barred Plymouth Rock(BPR)鸡胚胎直至27-28期(H &H)。Barred Plymouth Rock供体胚胎用作颜色标记，因为它们在I基因座是纯合隐性的(ii)并在其羽毛中表现颜色。将雄性胚胎的生殖腺收集在补加了10％FBS、谷氨酰胺、抗生素和抗真菌溶液的的DMEM中。胚胎的性别确定利用Petitte & Kegelmeyer的方法(AnimalBiotechnol 6：19-30，1995)完成。然后将生殖腺在PBS中漂洗两次，并在37℃在0.02％EDTA中孵育15分钟。加入新鲜培养基并破碎生殖腺。收集细胞悬浮液并在450×g旋转5分钟。 

更换培养基并使用台盼蓝排除确定细胞存活力。取等份细胞悬浮液并用SSEA-1抗体染色以确定注射的PGC数。将含有100-500个PGC的大约2-3μl的细胞悬浮液注射进发育14-17期(H & H)的White Leghorn (WL)胚胎的血管中。WL胚胎作为受体，因为已知它们是纯合显性的(II)。这个基因型编码羽毛中无色素。在注射PGC之后，将卵回置于孵育器中以完全发育。在孵化时，将WL表型的鸡系上带子，随后饲养至性成熟。进行如下测试交配以确定是否存在种系嵌合物：雄性BPR×雌性WL(BPR PGC)及雄性WL(BPR PGC)×雌 性BPR。随后评估这些测试交配的子代以确定雄性BPR生殖腺PGC是否掺入WL中。由于仅用雄性BPR胚胎作为供体，因此衍生自雄性BPR×雌性WL(BPR PGC)测试交配的所有“黑色”鸡(BPR表型)均是雄性的。 

B.受体胚胎的制备： 

如实施例1和2所述制备受体鸡胚胎。收集27期(H & H)的胚胎并在4℃在4％低聚甲醛中固定过夜。将胚胎包埋在石蜡中，以7μm厚度切片并用SSEA-1抗体进行免疫组织化学染色。计数每个胚胎的10个随机选择的切片中左侧和右侧生殖腺中的PGC数。不育指数(IS)使用等式IS＝(N-X)/N计算，其中N是对照组生殖腺的PGC数，X是处理的胚胎的PGC数(Reynaud，J Embryol Exp Morphol21：485-507，1969)。 

C.种间火鸡-鸡胚胎种系嵌合体的产生 

将受精的火鸡卵在38.5℃孵育8-8.5天(27-28期，H & H)。切开胚胎以获得生殖腺。然后将含有大约150个PGC的2-3μl生殖腺细胞悬浮液注射进14期(H & H)鸡胚胎的血管中。将受体卵密封及回送至孵化器中。在孵育的不同阶段(19-25时期)收集受体胚胎。将该胚胎在PBS中漂洗3次，然后在4℃在4％低聚甲醛中固定过夜。将样品在PBS中洗涤3次，然后置于50％乙醇中。将组织脱水，包埋于石蜡中，切片。所得切片随后通过SSEA-1及过碘酸-Schiff(PAS)染色进行免疫组织化学分析。 

D.结果 

在用SSEA-1和PAS双重染色之后，基于不同的染色模式在鸡胚胎生殖腺中鉴别鸡和火鸡PGC。由于糖原的存在，鸡和火鸡PGC在PAS染色之后均染成品红色。然而，火鸡PGC当位于发育中的生殖腺中时不再是SSEA-1阳性的，这样将其与鸡PGC区分开来，鸡PGC在此发育时期是SSEA-1阳性的。 

WL(II)×BPR(ii)交配的子代典型地表达WL表型(li)并表现在羽毛中无黑色素存在。 

实施例5：种内嵌合体的产生及测试交配 

使用与前述实施例所述相似的方案，将白色来亨鸡(WL)胚胎进行处理以耗竭内源性PGC。 

收集来自雄性Barred Plymouth Rock(BPR)胚胎的生殖腺，分离PGC，并将分离的PGC经卵内给予处理的禽和对照的未处理的禽，基本如前述实施例所述进行。在孵化后，将雄性WL(BPR PGC)嵌合禽饲养至性成熟并与雌性BPR禽交配。黑色子代的产生表示衍生自BPR PGC的配子通过嵌合的雄性WL(BPR PGC)亲代的传递。 

应理解在不偏离本发明范围的前提下可以对本发明各种具体内容加以改变。另外，前述描述只是举例示出了本发明而无限制之意。 

Claims (57)

1.一种调节禽胚胎中原生殖细胞数的方法，所述方法包括用与原生殖细胞相关的抗原免疫雌性禽类，从而该雌性禽产生的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵中存在的禽胚胎中内源性PGC数，其中所述与原生殖细胞相关的抗原是包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽、或者是包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的免疫原性亚序列。

2.根据权利要求1的方法，其中雌性禽类选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑及沙丘鹤组成的一组。

3.根据权利要求2的方法，其中所述雌性禽是鸡。

4.根据权利要求1的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO：3、4、7和8的任一序列。

5.权利要求1的方法，其中所述免疫步骤导致禽胚胎中原生殖细胞数减少。

6.权利要求1的方法，其中所述免疫步骤导致禽胚胎中原生殖细胞数增加。

7.一种调节禽胚胎中原生殖细胞发育的方法，所述方法包括用与原生殖细胞相关的抗原免疫雌性禽，从而由该雌性禽产生的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的禽胚胎中PGC的发育，其中所述与原生殖细胞相关的抗原是包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽、或者是包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽的免疫原性亚序列。

8.根据权利要求7的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO：3、4、7和8的任一序列。

9.根据权利要求7的方法，其中所述雌性禽选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹁和沙丘鹤组成的一组。

10.根据权利要求9的方法，其中所述雌性禽是鸡。

11.权利要求7的方法，其中所述免疫步骤导致对禽胚胎中原生殖细胞的发育的抑制。

12.权利要求7的方法，其中所述免疫步骤导致禽胚胎中原生殖细胞的发育增强。

13.一种产生嵌合禽的方法，所述方法包括：

(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫雌性禽；

(b)被免疫的雌性禽产卵，其中该卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的受体胚胎中PGC发育、PGC数或其组合；及

(c)将供体PGC经卵内给予受体胚胎以产生嵌合禽，

其中所述与原生殖细胞相关的抗原是包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：6所示氨基酸序列的多肽、或者是包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：6所示氨基酸序列的多肽的免疫原性亚序列。

14.根据权利要求13的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO：3、4、7和8的任一序列。

15.根据权利要求13的方法，其中所述供体PGC来自与受体胚胎相同的禽物种。

16.根据权利要求13的方法，其中所述供体PGC来自与受体胚胎不同的禽物种。

17.根据权利要求13的方法，其进一步包括孵育该嵌合禽至孵化。

18.根据权利要求13的方法，其中所述雌性禽选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑和沙丘鹤组成的一组。

19.根据权利要求13的方法，其中所述供体PGC来自选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑和鸣鹤组成的一组的禽胚胎。

20.根据权利要求13的方法，其中所述供体PGC携带一对雄性决定(Z)染色体。

21.根据权利要求13的方法，其中所述供体PGC携带一个雌性决定(w)染色体。

22.根据权利要求13的方法，其中所述给予是通过卵内注射进行的。

23.根据权利要求13的方法，其中当受体胚胎在根据Eyal-Giladi& Kochav分期系统为IX期及根据Hamburger & Hamilton分期系统为30期之间时给予供体PGC。

24.根据权利要求13的方法，其中当受体胚胎在根据Hamburger& Hamilton分期系统为14期之后时给予供体PGC。

25.根据权利要求13的方法，其中供体PGC选自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月区PGC组成的一组。

26.根据权利要求13的方法，其中所述给予步骤是通过将胚盘细胞注射到受体胚胎进行的，并且其中胚盘细胞在受体胚胎中分化为供体PGC。

27.一种增加众多禽卵中雄性禽比例的方法，所述方法包括：

(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫一个雌性禽；

(b)从该雌性禽产卵，从而该卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的受体雌性禽中PGC发育；

(c)将雄性(ZZ)PGC经卵内给予受体雌性禽；

(d)孵育该受体雌性禽至孵化；

(e)饲养该受体雌性禽至性成熟；及

(f)从该受体雌性禽产生大量卵，其中由该受体雌性禽产生的大量禽卵中雄性禽的比例高于不将雄性(ZZ)PGC经卵内给予受体雌性禽的情况中获得的比例，

其中所述与原生殖细胞相关的抗原是包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：6所示氨基酸序列的多肽、或者是包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：6所示氨基酸序列的多肽的免疫原性亚序列。

28.根据权利要求27的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO：3、4、7和8的任一序列。

29.根据权利要求27的方法，其中所述供体PGC来自与受体胚胎相同的禽物种。

30.根据权利要求27的方法，其中所述供体PGC来自与受体胚胎不同的禽物种。

31.根据权利要求27的方法，其中所述雌性禽选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑和沙丘鹤组成的一组。

32.根据权利要求27的方法，其中所述供体PGC来自选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑和鸣鹤组成的一组的禽胚胎。

33.根据权利要求27的方法，其中所述给予是通过卵内注射进行的。

34.根据权利要求27的方法，其中当受体胚胎在根据Eyal-Giladi& Kochav分期系统为IX期及根据Hamburger & Hamilton分期系统为30期之间时给予供体PGC。

35.根据权利要求27的方法，其中当受体胚胎在根据Hamburger& Hamilton分期系统为14期之后时给予供体PGC。

36.根据权利要求27的方法，其中PGC选自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月区PGC组成的一组。

37.根据权利要求27的方法，其中所述给予步骤是通过将胚盘细胞注射到受体胚胎进行的，并且其中胚盘细胞在受体雌性禽中分化为供体PGC。

38.一种在第一种禽物种中产生来自第二种禽物种的禽配子的方法，所述方法包括：

(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫第一种禽物种，从而雌性禽产的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的第一种禽物种的受体禽的PGC发育；

(b)将分离自第二种禽物种的禽的供体PGC导入第一种禽物种的受体禽中；

(c)孵育第一种禽物种的受体禽至孵化；及

(d)饲养第一种禽物种的受体禽至性成熟，其中第一种禽物种的受体禽产生来自第二种禽物种的配子，

其中所述与原生殖细胞相关的抗原是包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：6所示氨基酸序列的多肽、或者是包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：6所示氨基酸序列的多肽的免疫原性亚序列。

39.权利要求38的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO：3、4、7和8的任一序列。

40.根据权利要求38的方法，其中第一种禽物种与第二种禽物种均选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、沙丘鹤及鸣鹤组成的一组。

41.根据权利要求38的方法，其中第一种禽物种和第二种禽物种是相同的。

42.根据权利要求38的方法，其中第一种禽物种和第二种禽物种是不同的。

43.根据权利要求38的方法，其中所述给予是通过卵内注射进行的。

44.根据权利要求38的方法，其中当第一种禽物种的受体禽在根据Eyal-Giladi & Kochav分期系统为IX期及根据Hamburger &Hamilton分期系统为30期之间时给予供体PGC。

45.根据权利要求38的方法，其中当第一种禽物种的受体禽在根据Hamburger & Hamilton分期系统为14期之后时给予供体PGC。

46.根据权利要求38的方法，其中PGC选自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月区PGC组成的一组。

47.根据权利要求38的方法，其中所述给予步骤是通过将胚盘细胞注射到第一种禽物种的受体禽进行的，并且其中胚盘细胞在第一种禽物种的受体禽中分化为供体PGC。

48.一种增强核酸分子在禽中种系传递的方法，所述方法包括：

(a)用与原生殖细胞相关的抗原免疫一个雌性禽，从而该雌性禽产生的卵包含足够高浓度的特异于该抗原的抗体，以调节该卵内存在的受体禽中PGC发育；

(b)在足以使得众多PGC的至少之一在受体禽的生殖腺建群的条件下，将包含所述核酸分子的众多供体PGC给予受体禽；

(c)孵育该受体禽至孵化；及

(d)饲养该受体禽至性成熟，其中该受体禽产生衍生自供体PGC的配子，

其中所述与原生殖细胞相关的抗原是包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：6所示氨基酸序列的多肽、或者是包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：6所示氨基酸序列的多肽的免疫原性亚序列。

49.权利要求48的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO：3、4、7和8的任一序列。

50.根据权利要求48的方法，其中所述受体禽和供体PGC均选自由鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、沙丘鹤和鸣鹤组成的一组。

51.根据权利要求48的方法，其中所述供体PGC来自与受体禽相同的禽物种。

52.根据权利要求48的方法，其中所述供体PGC来自与受体禽不同的禽物种。

53.根据权利要求48的方法，其中所述给予是通过卵内注射进行的。

54.根据权利要求48的方法，其中当受体禽在根据Eyal-Giladi &Kochav分期系统为IX期及根据Hamburger & Hamilton分期系统为30期之间时给予供体PGC。

55.根据权利要求48的方法，其中当受体禽在根据Hamburger &Hamilton分期系统为14期之后时给予供体PGC。

56.根据权利要求48的方法，其中PGC选自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月区PGC组成的一组。

57.根据权利要求48的方法，其中所述给予步骤是通过将胚盘细胞注射到受体禽进行的，并且其中所述胚盘细胞在受体禽中分化为供体PGC。

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