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Technisches Gebiet
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Der
vorliegend offenbarte Gegenstand betrifft Verfahren zum Modulieren
der Anzahl von Urkeimzellen (primordial germ cells) in einem Vogel.
Insbesondere betrifft der vorliegend offenbarte Gegenstand die Verwendung
von Antikörpern,
die an Antigene binden, die mit Urkeimzellen assoziiert sind, um
die Entwicklung von Urkeimzellen während der Embryogenese in Vögeln zu
modulieren. Donor-Urkeimzellen können
Vogelembryos verabreicht werden, die in Eiern vorhanden sind, die
von Vögeln
erzeugt wurden, die mit den vorliegend offenbarten Verfahren behandelt
wurden, um chimäre
Vögel zu
erzeugen.
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Stand der Technik
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Chimären sind
zusammengesetzte Organismen, die Zellen umfassen, die von mehr als
einer Zygote abgeleitet werden. Um die Wechselwirkungen zwischen
Zellen zu untersuchen und Analysen über das Schicksal und die Ableitung
von Zellen während
der Entwicklung durchzuführen,
wurden experimentelle Chimären verwendet
(McLaren, Mammalian Chimeras. Cambridge University Press, Cambridge,
England, Vereinigtes Königreich,
1976). Die Verwendung von Zellen, die aus sehr frühen Embryos
isoliert wurden, um Chimären
zu erzeugen, können
zu Organismen führen,
die sich mit einem vollständigen
Komplement somatischer Gewebe entwickeln, die zum Teil aus Nachkommen
der isolierten Zellen hergestellt wurden. Wenn das Ausgangsmaterial
frühe Keimzellen
oder deren Vorläufer
einschließt,
können
die resultierenden Chimären
Gameten mit Genotypen von sowohl dem Donor als auch dem Empfänger erzeugen.
Daneben können
Chimären
intraspezifisch (d. h. sie enthalten Zellen, die von zwei oder mehr
Zygoten der gleichen Spezies abgeleitet werden) oder interspezifisch
(d. h. sie enthalten Zellen, die von Zygoten aus wenigstens zwei
unterschiedlichen Spezies abgeleitet werden) sein.
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Die
Effizienz des Erzeugens von Keimbahn-Chimären durch Neubesiedeln der
Gonaden (Keimdrüsen)
mit den gewünschten
Urkeimzellen (PGCs) des Donors kann durch Verringern der Anzahl
an PGCs in dem Empfänger-Organismus
gesteigert werden. Es wurden mehrere Ansätze zum Verringern der PGCs
mit verschiedenem Grad an Erfolg eingesetzt. Das kontinuierliche
Bestrahlen mit Gammastrahlung (0,3–3,4 R/h von 60Co
für 20
Tage) führte
zu der vollständigen
Zerstörung
von Oozyten bei einem Strahlenniveau von 3,4 und 1,8 Röntgen pro
Stunde (R/h; Mraz & Woody,
Radiation Res. 54: 63–68,
1973). Die Häufigkeit
des Ausbrütens
war jedoch bei einem Niveau von 0,9 R/h oder mehr verringert. Das
Anwenden einer kontinuierlichen Gammabestrahlung mit niedrigem Niveau
zum Verringern der Anzahl endogener PGCs ist jedoch aufgrund der relativ
kleinen Anzahlen an Eiern, die zu einem beliebigen Zeitpunkt bestrahlt
werden können,
der erforderlichen langen Bestrahlungsdauer und auch aufgrund der
potentiell teratogenen Effekte der Strahlung selbst beschränkt.
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Es
wurde auch eine Kurzeitbestrahlung mit einer Gamma-Quelle versucht
(Carscience et al., Development 117: 669–75, 1993; Thoraval et al.,
Poultry Sci. 73: 1897–1905,
1994; Maeda et al., Poultry Sci. 77: 905–07, 1998). In diesen Studien
wurden nicht-inkubierte Eier gerade vor der Injektion von blastodermalen oder
Area pellucida-Zellen im Stadium X mit 500–700 rad bestrahlt. Das Auftreten
eines Chimärismus
in der Keimbahn, der einer Kurzzeit-Gammabestrahlung folgt, war hochvariabel.
Die Grundlage für
die widersprüchlichen
Ergebnisse wurden den „Donorzellen,
die an einer geeigneten Position injiziert wurden..." zugeschrieben (Carscience
et al., Development 117: 669–75,
1993).
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Es
wurden auch Versuche, Empfängerembryos
unter Verwenden von Ultraviolett-(UV-)Licht
zu sterilisieren, beschrieben (Reynaud, J. Embryol. Exp. Morphol.
21: 485–507,
1969; Reynaud, J. Roux's
Arch Devel. Biol. 179: 85–110,
1976; Aige-Gil & Simkiss,
Br. Poul. Sci. 32: 427–438,
1991). Aige-Gil & Simkiss
schlossen, dass "es
nicht möglich
ist, den „Germinal
Crescent" (sichelförmiger Bereich)
und insbesondere im Stadium 4 der Inkubation zu bestrahlen, ohne
größere Anomalitäten zu induzieren". Der Grad der Sterilität schien
positiv mit entwicklungsgemäßen Anomalitäten zu korrelieren,
wodurch die praktische Verwendung von UV-Licht als Mittel zum Verringern
endogener PGCs beschränkt
ist.
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Die
Erzeugung von Keimbahn-Chimären
bringt sowohl für
den Menschen als auch für
die verschiedenen Vogelspezies selbst mehrere potentielle Vorteile.
Keimbahn-Chimären
können
als Quelle für
Gameten mit gewünschten
Eigenschaften verwendet werden, die dann in Verbindung mit Bebrütungsprogrammen
verwendet werden, um den Genpool von Vögeln zu vergrößern. Die
Fähigkeit,
leichter Gameten bestimmter Vogelspezies zu erzeugen, wäre für einen
Vogel-Tierarzt und im Bereich der Geflügelerzeugung von Nutzen. Für bedrohte Spezies,
wie beispielsweise den Schreikranich, wäre es äußerst nützlich, eine bestehende Quelle
für männliche
Spermatozoen zu haben. Für
kommerzielle Vögel,
wie beispielsweise Truthähne,
wäre es
wünschenswert,
männliche
Spermatozoen schneller und ökonomischer
herzustellen. Für
Fleisch erzeugende Schwärme
ist gewünscht,
Möglichkeiten
zum Erhöhen
des Anteils an Männchen
in dem Schwarm zu haben. Es besteht daher ein Bedarf nach neuen
Möglichkeiten
zum Erhalten von Vogel-Spermatozoen.
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Bresler
M. et al., „Manipulations
of germ-cell populations in the gonad of the fowl", Poultry Sci., Ausg. 35,
Nr. 2, Mai 1994, Seite 241–247
offenbaren, dass das Behandeln des Embryos von heimischem Geflügel mit
Busulfan die Gonaden partiell sterilisiert. Die partielle Sterilisation
wird durch Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen,
das mit Urkeimzellen assoziiert ist, erreicht. Es wird darin jedoch
nicht offenbart, dass urkeimlinienspezifische Proteine/Peptide zu
einer Modifikation der Entwicklung der Urkeimzelle in dem Embryo
führen
könnten.
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Es
besteht entsprechend ein lang gehegter und bestehender Bedarf nach
Möglichkeiten,
die Effizienz der Erzeugung von Keimbahn-Chimären in Vögeln zu erhöhen. Der vorliegend offenbarte
Gegenstand geht dieses und andere Bedürfnisse in der Wissenschaft
an.
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Zusammenfassung
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Der
vorliegend offenbarte Gegenstand stellt Verfahren zum Modulieren
der Anzahl von Urkeimzellen in einem Vogelembryo bereit. In einer
Ausführungsform
umfasst das Verfahren das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit
einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch ein
Ei, das von dem weiblichen Vogel erzeugt wurde, eine ausreichend
hohe Konzentration an Antikörpern
umfasst, die für
das Antigen spezifisch sind, um die Anzahl an endogenen PGCs in
einem innerhalb des Eies vorhandenen Vogelembryo zu modulieren.
In einer Ausführungsform
ist der weibliche Vogel ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und
Kanadakranich. In einer weiteren Ausführungsform ist der weibliche
Vogel ein Huhn. In einer Ausführungsform
umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less,
dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform
führt der
Immunisierungsschritt zu einer Abnahme der Zahl von Urkeimzellen
in dem Vogelembryo. In einer anderen Ausführungsform führt der
Immunisierungsschritt zu einem Anstieg der Anzahl an Urkeimzellen
in dem Vogelembryo.
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Der
vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Modulieren
der Entwicklung von Urkeimzellen in einem Vogelembryo bereit. In
einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit
einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch ein
Ei, das von dem weiblichen Vogel erzeugt wurde, eine ausreichend
hohe Konzentration an Antikörpern
umfasst, die für
das Antigen spezifisch sind, um die Entwicklung von PGCs in einem
innerhalb des Eies vorhandenen Vogelembryo zu modulieren. In einer
Ausführungsform
umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less,
dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform
ist der weibliche Vogel ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und
Kanadakranich. In einer weiteren Ausführungsform ist der weibliche
Vogel ein Huhn. In einer Ausführungsform
führt der
Immunisierungsschritt zu einer Hemmung der Entwicklung der Urkeimzellen
in dem Vogelembryo. In einer anderen Ausführungsform führt der
Immunisierungsschritt zu einer Verstärkung der Entwicklung der Urkeimzellen
in dem Vogelembryo.
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Der
vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erzeugen
eines chimären
Vogels bereit. In einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels
mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist; (b) das
Erzeugen eines Eis aus einem weiblichen Vogel, wobei das Ei eine
ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen
spezifisch sind, um in einem innerhalb des Eies vorhandenen Empfängerembryo
die Entwicklung der PGCs, die Anzahl der PGCs zu modulieren oder
Kombinationen davon; und (c) das Verabreichen von Donor-PGCs an den Empfängerembryo
in ovo, um einen chimären
Vogel zu erzeugen. In einer Ausführungsform
umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less,
dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform
sind die Donor-PGCs von der gleichen Vogelspezies wie der Empfängerembryo.
In einer anderen Ausführungsform
sind die Donor-PGCs von
einer anderen Vogelspezies als der Empfängerembryo. In einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren ferner das Inkubieren des chimären Vogels,
um ihn zu bebrüten.
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In
einer Ausführungsform
des vorliegenden Verfahrens ist der weibliche Vogel ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Kanadakranich.
In einer Ausführungsform
sind die Donor-PGCs von einem Vogelembryo, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und
Schreikranich. In einer weiteren Ausführungsform tragen die Donor-PGCs
ein Paar männliche
determinative (Z) Chromosomen. In einer noch weiteren Ausführungsform
sind die Donor-PGCs ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen
sichelförmigen
PGCs.
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In
einer noch weiteren Ausführungsform
tragen die Donor-PGCs ein weibliches determinatives (w) Chromosom.
In einer Ausführungsform
erfolgt das Verabreichen mittels einer in ovo-Injektion. In einer
Ausführungsform
werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo
zwischen ungefähr
dem Stadium IX gemäß dem Einordnungssystems
nach Eyal-Giladi & Kochav
und ungefähr
dem Stadium 30 gemäß dem Einordnungssystem
nach Hamburger & Hamilton
befindet. In einer anderen Ausführungsform
werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo
nach dem Stadium 14 gemäß dem Einordnungssystem
nach Hamburger & Hamilton
befindet. In einer noch weiteren Ausführungsform wird der Verabreichungsschritt
durch Injizieren von blastodermalen Zellen in den Empfängerembryo
durchgeführt,
wobei sich die blastodermalen Zellen in dem Empfängerembryo zu Donor-PGCs differenzieren.
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Der
vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erhöhen des
Anteils an männlichen
Vögeln
in einer Vielzahl von Vogeleiern bereit. In einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels
mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist; (b) das
Erzeugen eines Eies aus dem weiblichen Vogel, wodurch das Ei eine
ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen
spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung in einem weiblichen Empfängervogel, der
innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren; (c) das Verabreichen
männlicher
ZZ) PGCs an den weiblichen Empfängervogel
in ovo; (d) Inkubieren des weiblichen Empfängervogels zum Bebrüten; (e)
Aufziehen des weiblichen Empfängervogels
bis zur Geschlechtsreife; und (f) Erzeugen einer Vielzahl von Vogeleiern
aus dem weiblichen Empfängervogel,
wobei der Anteil an männlichen
Vögeln
in der Vielzahl von Vogeleiern, die durch den weiblichen Empfängervogel
erzeugt wurde, höher
ist als er sein würde,
wenn er in Abwesenheit der Verabreichung der männlichen (ZZ) PGCs an den weiblichen
Empfängervogel
in ovo erzielt worden wäre.
In einer Ausführungsform
umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less,
dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform
ist der weibliche Vogel ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn Ente, Wachtel und Kanadakranich.
In einer Ausführungsform
sind die Donor-PGCs aus der gleichen Vogelspezies wie der Empfängerembryo.
In einer weiteren Ausführungsform
sind die Donor-PGCs aus einer anderen Vogelspezies als der Empfängerembryo.
In einer anderen Ausführungsform
sind die PGCs ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen
sichelförmigen
PGCs. In einer noch weiteren Ausführungsform sind die Donor-PGCs
aus einem Vogelembryo, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Schreikranich.
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In
einer Ausführungsform
des vorliegenden Verfahrens erfolgt das Verabreichen mittels in
ovo-Injektion. In einer weiteren Ausführungsform werden die Donor-PGCs
verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo zwischen
ungefähr
dem Stadium IX gemäß dem Einordnungssystems
nach Eyal-Giladi & Kochav
und ungefähr
dem Stadium 30 gemäß dem Einordnungssystem
nach Hamburger & Hamilton
befindet. In einer anderen Ausführungsform
werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo
nach dem Stadium 14 gemäß dem Einordnungssystem
nach Hamburger & Hamilton
befindet. In einer noch weiteren Ausführungsform wird der Verabreichungsschritt
durch Injizieren von blastodermalen Zellen in den Empfängerembryo durchgeführt, wobei
sich die blastodermalen Zellen in dem Empfängerembryo zu Donor-PGCs differenzieren.
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Der
vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erzeugen
von Vogelgameten aus einer zweiten Vogelspezies in einer ersten
Vogelspezies bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren
(a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels der ersten Vogelspezies
mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch
ein durch das weibliche Tier erzeugtes Ei eine ausreichend hohe
Konzentration an Antikörpern
umfasst, die für
das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung eines Empfängervogels der
ersten Vogelspezies, die innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren;
(b) das Einführen
von Donor-PGCs, die aus einem Vogel der zweiten Vogelspezies isoliert
wurden, in den Empfängervogel
der ersten Vogelspezies; (c) Inkubieren des Empfängervogels der ersten Vogelspezies
zum Bebrüten;
und (d) Aufziehen des Empfängervogels
der ersten Vogelspezies bis zur Geschlechtsreife wobei der Empfängervogel
der ersten Vogelspezies Gameten aus der zweiten Vogelspezies erzeugt.
In einer Ausführungsform
umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less,
dead end, nanos, stella fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform
sind die erste Vogelspezies und die zweite Vogelspezies jeweils
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel, Kanadakranich
und Schreikranich. In einer Ausführungsform
sind die erste Vogelspezies und die zweite Vogelspezies gleich.
In einer anderen Ausführungsform
sind die erste Vogelspezies und die zweite Vogelspezies verschieden.
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In
einer Ausführungsform
des vorliegenden Verfahrens erfolgt das Verabreichen mittels in
ovo-Injektion. In einer weiteren Ausführungsform werden die Donor-PGCs
verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo zwischen
ungefähr
dem Stadium IX gemäß dem Einordnungssystems
nach Eyal-Giladi & Kochav
und ungefähr
dem Stadium 30 gemäß dem Einordnungssystem
nach Hamburger & Hamilton
befindet. In einer anderen Ausführungsform
werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo
nach dem Stadium 14 gemäß dem Einordnungssystem
nach Hamburger & Hamilton
befindet. In einer noch weiteren Ausführungsform wird der Verabreichungsschritt
durch Injizieren von blastodermalen Zellen in den Empfängerembryo durchgeführt, wobei
sich die blastodermalen Zellen in dem Empfängerembryo zu Donor-PGCs differenzieren. In
einer Ausführungsform
sind die PGCs ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen
sichelförmigen
PGCs.
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Der
vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Vergrößern der
Keimbahntransmission eines Nukleinsäuremoleküls in einem Vogel bereit. In
einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels
mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch ein
durch den weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration
an Antikörpern
umfasst, die für
das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung in einem Empfängervogel,
der innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren; (b) das Verabreichen
einer Vielzahl von Donor-PGCs, die das Nukleinsäuremolekül umfassen, an den Empfängervogel
unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zumindest einer der Vielzahl
von PGCs zu ermöglichen,
eine Gonade des Empfängervogels
zu kolonisieren; (c) das Inkubieren des Empfängervogels zum Bebrüten; und
(d) Aufziehen des Empfängervogels
bis zur Geschlechtsreife, wobei der Empfängervogel Gameten erzeugt,
die aus den Donor-PGCs abgeleitet werden. In einer Ausführungsform
umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less,
dead end, nanos, stella fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform
sind der Empfängervogel
und die Donor-PGCs jeweils ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel, Kanadakranich und Schreikranich.
In einer Ausführungsform
sind die Donor-PGCs aus der gleichen Vogelspezies wie der Empfängervogel.
In einer weiteren Ausführungsform
sind die Donor-PGCs aus einer anderen Vogelspezies als der Empfängervogel.
In einer Ausführungsform
sind die PGCs ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen
sichelförmigen
PGCs.
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In
einer Ausführungsform
des vorliegenden Verfahrens werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich
der Empfängervogel
zwischen ungefähr
dem Stadium IX gemäß dem Einordnungssystems
nach Eyal-Giladi & Kochav
und ungefähr
dem Stadium 30 gemäß dem Einordnungssystem
nach Hamburger & Hamilton befindet.
In einer anderen Ausführungsform
werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo
nach dem Stadium 14 gemäß dem Einordnungssystem
nach Hamburger & Hamilton
befindet. In einer weiteren Ausführungsform
erfolgt das Verabreichen durch eine in ovo-Injektion. In einer anderen
Ausführungsform
wird der Verabreichungsschritt durch Injizieren von blastodermalen
Zellen in den Empfängerembryo durchgeführt, wobei
sich die blastodermalen Zellen in dem Empfängerembryo zu Donor-PGCs differenzieren.
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Diese
und andere Aspekte des vorliegend offenbarten Gegenstands werden
unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung und die
beigefügten
Figuren ersichtlich. Daneben wird hierin auf verschiedene Veröffentlichungen
Bezug genommen. Jede Unstimmigkeit zwischen diesen Patenten und
Veröffentlichungen
und der vorliegenden Offenbarung soll zugunsten der vorliegenden
Offenbarung beseitigt werden.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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Die 1A bis 1D zeigen
immunhistologische Analysen der gonadalen Bereiche von Embryos im
Stadium 27, die von Hennen erzeugt wurden, die mit Peptiden immunisiert worden
waren, die aus dem Huhn-VASA-Polypeptid abgeleitet wurden. Jeder
Abschnitt ist mit einem Antikörper
gefärbt,
der für
SSEA-1 spezifisch ist.
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1A zeigt Abschnitte aus einem Kontrollembryo,
das von einer Henne erzeugt wurde, die nicht immunisiert worden
war. 1B zeigt Abschnitte aus einem
Embryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die mit einem Vasa-C-Peptid
(SEQ ID NO: 4) immunisiert worden war. 1C zeigt
Abschnitte von einer Henne, die mit einem Vasa-N-Peptid (SEQ ID
NO: 3) immunisiert worden war. 1D zeigt
Abschnitte von einem Embryo, das von einer Henne erzeugt wurde,
die sowohl mit dem Vasa-N- als auch dem Vasa-C-Peptid (SEQ ID NO:
3 bzw. 4) immunisiert worden war. Die SSEA-1+-Zellen (dunkel gefärbte Zellen)
sind in dem Kontrollembryo (1A) in
viel höherem Überschuss
vorhanden als in irgendeinem der Embryos, die anti-VASA-Antikörpern ausgesetzt
wurden (1B bis 1D).
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Die 2A bis 2D zeigen
immunhistologische Analysen der gonadalen Bereiche von Embryos im
Stadium 27, die von Hennen erzeugt wurden, die mit Peptiden immunisiert
worden waren, die aus dem Huhn-DAZL-Polypeptid abgeleitet wurden.
Jeder Abschnitt ist mit einem Antikörper gefärbt, der für SSEA-1 spezifisch ist.
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2A zeigt Abschnitte aus einem Kontrollembryo,
das von einer Henne erzeugt wurde, die nicht immunisiert worden
war. 2B zeigt Abschnitte aus einem
Embryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die mit einem DAZL-C-Peptid
(SEQ ID NO: 8) immunisiert worden war. 2C zeigt
Abschnitte von einer Henne, die mit einem DAZL-N-Peptid (SEQ ID
NO: 7) immunisiert worden war. 2D zeigt
Abschnitte von einem Embryo, das von einer Henne erzeugt wurde,
die sowohl mit dem DAZL-N- als auch dem DAZL-C-Peptid (SEQ ID NO:
7 bzw. 8) immunisiert worden war. Die SSEA-1+-Zellen (dunkel gefärbte Zellen)
sind in dem Kontrollembryo (2A) in
viel höherem Überschuss
vorhanden als in irgendeinem der Embryos, die anti-DAZL-Antikörpern ausgesetzt
wurden (2B bis 2D).
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Die 3A und 3B zeigen
immunhistologische Analysen der gonadalen Bereiche von Embryos im Stadium
27, die von Hennen erzeugt wurden, die mit Peptiden immunisiert
worden waren, die sowohl aus dem Huhn-Vasa als auch dem -DAZL-Polypeptid
abgeleitet wurden. Jeder Abschnitt ist mit einem Antikörper gefärbt, der
für SSEA-1
spezifisch ist.
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3A zeigt Abschnitte aus einem Kontrollembryo,
das von einer Henne erzeugt wurde, die nicht immunisiert worden
war. 3B zeigt Abschnitte aus einem
Embryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die mit Vasa-N-, Vasa-C-,
DAZL-N- und DAZL-C-Peptiden (SEQ ID NO: 3, 4, 7 und 8) immunisiert
worden war. Die SSEA-1+-Zellen (dunkel gefärbte Zellen) sind in dem Kontrollembryo
(3A) in viel höherem Überschuss vorhanden als in
irgendeinem der Embryos, die sowohl anti-DAZL-Antikörpern als
auch anti-VASA-Antikörpern ausgesetzt
wurden (3B).
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4 ist
ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse der Untersuchung der in den 1 bis 3 beschriebenen
Abschnitte zusammenfasst. Die Hennen wurden mit den entsprechenden
Peptiden immunisiert und die Eier wurden gesammelt und inkubiert,
um das Embryostadium 27 zu erreichen. Die Embryos wurden zur routinemäßigen Histologie
verarbeitet, nacheinander zerlegt und mit dem monoklonalen Antikörper MC-480
(anti-SSEA-1) immungefärbt, um
die Keimzellen in den sich entwickelnden Gonaden zu identifizieren. Die
angegebenen Daten geben die durchschnittliche Anzahl an PGCs, die
in 10 Abschnitten von der Genitalleiste von Embryos in Eiern aus
3 immunisierten Hennen für
jedes Peptid oder jede Kombination von Peptiden gezählt wurden,
wieder.
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Kurze Beschreibung des Sequenzprotokolls
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Die
SEQ ID NOs: 1 und 2 sind entsprechend eine Nukleinsäure- und
Aminosäuresequenz
des offenen Leserahmens (open reading frame) von Huhn-VASA (CVH)
(GENBANK®-Zugangsnr.
AB004836 bzw. BAB12337).
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Die
SEQ ID NOs: 3 und 4 sind die Sequenzen von Peptiden, die Epitope
eines Huhn-VASA-(CVH-)Polypeptids
umfassen, die zum Immunisieren weiblicher Hühner verwendet wurden. Die
SEQ ID NO: 3 ist ein N-terminales Peptid (Vasa-N), das den Aminosäuren 42
bis 57 mit der GENBANK®-Zugangsnr. BAB12337 entspricht,
und die SEQ ID NO: 4 ist ein C-terminales Peptid (Vasa-C), die den
Aminosäuren
645 bis 660 mit der GENBANK®-Zugangsnr. BAB12337 entspricht.
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Die
SEQ ID Nos: 5 und 6 sind entsprechend eine Nukleinsäure- und
Aminosäuresequenz
eines offenen Leserahmens von Huhn-DAZL (GENBANK-Zugangsnr. AY211387
bzw. AAO26019).
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Die
SEQ ID Nos: 7 und 8 sind die Sequenzen von Peptiden, die Epitope
eines Huhn-DAZL-Polypeptids umfassen,
die zum Immunisieren weiblicher Hühner verwendet wurden. Die
SEQ ID NO: 7 ist ein N-terminales Peptid (Dazl-N), das den Aminosäuren 2 bis
18 mit der GENBANK®-Zugangsnr. AAO26019 entspricht,
und die SEQ ID NO: 8 ist ein C-terminales
Peptid (DAZL-C), das den Aminosäuren
266 bis 282 mit der GENBANK®-Zugangsnr. AAO26019 entspricht.
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Ausführliche
Beschreibung
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I. Definitionen
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Soweit
es nicht anderweitig definiert ist, haben alle hierin verwendeten
technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung,
wie sie üblicherweise
von einem Fachmann, an den sich der vorliegend offenbarte Gegenstand
richtet, verstanden wird. Für
eine Klarheit der vorliegenden Beschreibung sind nachfolgend bestimmte
Definitionen angegeben.
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Entsprechend
langjähriger
Patentpraxis bedeuten die Begriffe „ein" und „einer, eine, eines", wenn sie hierin,
einschließlich
den Ansprüchen,
verwendet werden „eines
oder mehrere".
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Wie
er hierin verwendet wird, soll der Begriff „ungefähr", wenn er sich auf einen Wert oder eine
Größe der Masse,
des Gewichts, der Zeit des Volumens, der Konzentration oder einen
Prozentsatz bezieht, Abweichungen von ±20% oder ±10%, in einem anderen Beispiel ±5%, in
einem weiteren Beispiel ±1%
und einem noch weiteren Beispiel ±0,1% von der angegebenen
Größe umfassen,
da solche Abweichungen zum Ausführen
des vorliegend offenbarten Gegenstands geeignet sind. Soweit es
nicht anders angegeben ist, sollen alle in der Beschreibung und
den Ansprüchen
verwendeten Zahlen, die Mengen von Inhaltsstoffen, Reaktionsbedingungen
und so weiter angeben, so verstanden werden, dass sie immer um den
Begriff „ungefähr" abgeändert werden.
Soweit nicht anders ausgeführt,
sind die in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen angegebenen numerischen
Parameter Annäherungen,
die je nach den gewünschten
Eigenschaften, die man mit dem vorliegend offenbarten Gegenstand
zu erreichen wünscht,
variieren können.
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In
bestimmten Ausführungsformen
verwendet der vorliegend offenbarte Gegenstand Antikörper gegen Antigene,
die mit Urkeimzellen assoziiert sind. Der Begriff „Antikörper" und seine grammatikalischen
Variationen bezeichnen Immunoglobulin-Moleküle und immunologisch aktive
Abschnitte von Immunglobulin-Molekülen, d. h. Moleküle, die
eine Antigenbindungsstelle enthalten, die ein Antigen spezifisch
bindet. Als solche bezeichnet der Begriff Immunoglobulin-Proteine
oder funktionelle Abschnitte davon, einschließlich polyklonale Antikörper, monoklonale
Antikörper,
chimäre
Antikörper,
Hybrid-Antikörper,
Einzelketten-Antikörper
(z. B. einen Einzelketten-Antikörper,
der in einer Phagen-Genbank angegeben ist), mutagenisierte Antikörper, humanisierte
Antikörper
und Antikörper-Fragmente die eine
Antigenbindungsstelle umfassen (z. B. Fab- und Fv-Antikörper-Fragmente). „Antikörper" schließen daher
monoklonale, chimäre,
rekombinante, synthetische, halbsynthetische oder chemisch modifizierte
intakte Antikörper
mit zum Beispiel Fv-, Fab-, scFv- oder F(ab)2-Fragmenten
ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Immunoglobulin-Moleküle des vorliegend
offenbarten Gegenstands können
von jedem Typ (z. B. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA und IgY), jeder Klasse
(z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und IgA2) oder Unterklasse des
Immunoglobulin-Moleküls
sein.
-
Vögel erzeugen
Antikörper,
die sich in dem Dotter von Bier anordnen und diese Antikörper werden „IgY" (Dotter-Antikörper, die
hauptsächlich
Antikörper
des IgG-Typs umfassen) genannt. Siehe allgemein Bollen et al., J.
Immunol. Meth. 191: 113–120,
1996; Schade et al. (Hrsg.), Chicken Egg Yolk Antibodies, Production
and Application: IgY-Technology,
Springer Verlag, New York, New York, Vereinigte Staaten von Amerika, 2000.
In einer Ausführungsform
sind die Antikörper
des vorliegend offenbarten Gegenstands Vogel-IgY-Antikörper. Die
Antikörper
des vorliegend offenbarten Gegenstands können aus jedem beliebigen Ausgangsvogel abgeleitet
werden. In manchen Ausführungsformen
sind die Antikörper
Huhn-IgY-Antikörper.
-
Die
Antikörper
des vorliegend offenbarten Gegenstands binden an ein Antigen, das
mit Urkeimzellen assoziiert ist. Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet
der Begriff „mit
Urkeimzellen assoziiert" Antigene,
die ein Epitop umfassen, das entweder von einem Polypeptid exprimiert
wird oder post-translational an dieses gebunden wird, das von einer
Urkeimzelle (zum Beispiel einem Zelloberflächenmarker) oder einer Zelle,
die in der Lage ist, die Migration und/oder Entwicklung einer Urkeimzelle
zu beeinflussen (zum Beispiel Migrationsfaktoren, Wachstumsfaktoren
und Polypeptide, die von Zellen exprimiert werden, die in der Mikroumgebung, in
der PGCs vorhanden sind oder sich entwickeln, vorhanden sind) exprimiert
wird. Solche Antigene schließen Epitope,
die auf einem SSAE-1-, Ovomucin-gleichen Protein-(OLP-), Steel-Faktor-(C-Kit-Ligand-),
germ cell-less-, dead end-, VASA-(einschließlich, aber nicht beschränkt auf
das Huhn-VASA-Homologon, CVH-), DAZL-, nanos-, stella- und fragilis-Polypeptid
vorhanden sind, und die Antigene, die von den Antikörpern EMA-1,
QH-1, FC10.2, S-FC10.2, NC-1, 2C9, QCR1, AGC5, AGC7 und AGC13 erkannt
werden, ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Rückblickend zusammengefasst
in Tajima, Avian Poultry Biol. Rev. 13: 15–20, 2002. Siehe auch Buehr,
Exp. Cell Res. 232, 194–207,
1997; D'Costa & Petitte, Intl.
J. Devel. Biol. 43: 349–56, 1999;
Urven et al., Development 103: 299–304, 1988; Hay et al., Cell
55: 577–587,
1988; Lasko & Ashburner, Nature
335: 611–617,
1988; Raz, Nature Genetics 4: 690–700, 2003; Houston & King, Development
127: 447–56,
2000; Cooke et al., Hum. Mol. Genet. 5: 513–516, 1996; Kimura et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 262: 223–30, 1999; Weidinger et al.,
Curr. Biol. 13: 1429–34,
2003; und deren Rückbezüge.
-
Wie
sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „SSEA-1-Antikörper" und „anti-SSEA-1-Antikörper" gegeneinander austauschbar
verwendet und bezeichnen einen Antikörper, in einer Ausführungsform
einen IgY-Antikörper
und in einer anderen Ausführungsform
einen monoklonalen Antikörper,
der an das für
das Stadium spezifische embryonale Antigen-1 (SSEA-1; Buehr, Exp.
Cell Res. 232, 194–207,
1997) bindet. SSEA-1 ist ein Kohlenhydratepitop, das durch eine
Galactose (β1→4) Fucose
(α1→3) N-Acetylglucosaminbindung
bestimmt wird (Gooi et al., Nature 292: 156–158, 1981). Ein monoklonaler
Antikörper
gegen SSEA-1 wurde durch Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen
aus einer Maus, die mit F9-Teratokarzinomzellen immunisiert worden
war, entwickelt (Solter & Knowles,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5565–5569, 1978) Der SSEA-1-Antikörper ist
ein bekannter immunhistochemischer Marker für die Keimzellen von Vögeln (Karagenc et
al., Dev. Genet. 19: 290–301,
1996). In einer Ausführungsform
oder der anti-SSEA-1-Antikörper der
Klon MC 480, der von der Developmental Studies Hybridoma Bank, The
University of Iowa, Iowa City, Iowa, Vereinigte Staaten von Amerika
erhalten werden kann.
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Wie
sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „VASA-Antikörper" und „anti-VASA-Antikörper" gegeneinander austauschbar
verwendet und bezeichnen einen Antikörper, in einer Ausführungsform
einen IgY-Antikörper,
der an ein Vogel-VASA-Polypeptid bindet. VASA ist eine ATP-abhängige RNA-Helicase,
die ein Mitglied der DEAD-Box-(Asp-Glu-Ala-Asp) Familie ist. VASA und dessen
Orthologa werden im Keimplasma vieler Spezies, einschließlich Zebrabärbling (Danio
rerio), Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, exprimiert
und wurde in PGCs aus anderen Spezies, einschließlich Xenopus laevis, Maus
und Mensch identifiziert (rückblickend
zusammengefasst in Raz, Nature Genetics 4: 690–700, 2003). In diesen Spezies
wurden VASA und verwandte Polypeptide mit der Keimzellentwicklung,
einschließlich
der Entwicklung, Proliferation und Differenzierung von Pol-PGCs,
sowie der Gametogenese in Verbindung gebracht. Id. Die Nukleinsäure- und
Aminosäuresequenzen
von Huhn-VASA (auch CVH genannt) können entsprechend unter den
GENBANK®-Zugangsnr.
AB004836 und BAB12337 gefunden werden.
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Wie
sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „DAZL-Antikörper" und „anti-DAZL-Antikörper" gegeneinander austauschbar
verwendet und bezeichnen einen Antikörper, in einer Ausführungsform
einen IgY-Antikörper,
der an einen Vogel-DAZL-Antikörper
bindet. Orthologa von DAZL wurden aus verschiedenen Spezies, einschließlich Zebrabärbling (danio
rerio), Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, isoliert und
in PGCs aus anderen Spezies, einschließlich Xenopus laevis, Maus
und Mensch, identifiziert (rückblickend
zusammengefasst in Raz, Nature Genetics 4: 690–700, 2003). Das DAZL-Polypeptid (und dessen
Orthologa) ist ein RNA bindendes Protein, das in dem vegetativen
Pol des Zebrabärblings
und dem Keimplasma von Xenopus sowie in den Eierstöcken und/oder
den Hoden mehrerer verschiedener Organismen exprimiert wird. Id.
Bei Xenopus, Maus und Mensch wird DAZL in PGCs exprimiert und könnte für die Entwicklung
und das Überleben
von Zellen in den Gonaden von einem oder beiden Geschlechtern wichtig
sein. Siehe Raz, Nature Genetics 4: 690–700, 2003; Xu et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 98: 7414–7419,
2001; Houston & King, Development
127: 447–56,
2000; Mita & Yamashita,
Mech. Dev. 94: 251–255,
2000; Ruggiu et al., Nature 389: 73–77, 1997; Reijo et al., Nature
Genetics 10: 383–393,
195. Die Nukleinsäure-
und Aminosäuresequenzen von
Huhn-DAZL können
entsprechend mit den GENBANK®-Zugangsnr. AY211387 und
AAO26019 gefunden werden.
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Wie
sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „Vogel" und „Vogelspezies" jede Vogelspezies,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Huhn, Truthahn, Ente, Gans, Wachtel, Fasan und Strauß. Es kann
jede beliebige der zahlreichen anderen Spezies zum Ausführen des
vorliegend offenbarten Gegenstands verwendet werden, insbesondere
wenn sie für
die Bewahrung bedrohter Spezies, wie beispielsweise des Schreikranichs
(wobei der Kanadakranich die Empfänger-Spezies wäre) verwendet
wird.
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Wie
er hierin verwendet wird und solange er nicht im Besonderen abgeändert ist,
meint der Begriff „Ei" ein Vogelei, das
einen lebenden, embryonalen Vogel enthält. Der Begriff „Ei" soll daher ein befruchtetes
Vogelei, in einer Ausführungsform
ein Ei, das einen Vogelembryo enthält, der dazu in der Lage ist,
eine normale Embryogenese zu durchlaufen, bezeichnen.
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Wie
sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „nativ" und „endogen" eine Zelle oder
eine Nukleinsäure,
die natürlich
in dem Embryo vorhanden ist. Als solches ist eine „endogene
PGC" eine PGC, die in
einem Embryo vorhanden ist, der sich unter der Steuerung des befruchteten
Eies ohne das Einschleusen exogener oder Donor-PGCs entwickelt hat.
In ähnlicher
Weise ist ein „natives
Polypeptid", wenn
es in Zusammenhang mit einem Polypeptid verwendet wird, ein Polypeptid,
das von einem nativen Gen eines nicht-transformierten Vogels kodiert wird.
-
Wie
er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „natürlich vorkommend" ein Merkmal, das
in der Natur gefunden wird und sich von einem künstlich durch den Menschen
erzeugten unterscheidet. Zum Beispiel ist ein Polypeptid oder eine
Nukleotidsequenz, das/die in einem Organismus (einschließlich einem
Virus) in seinem/ihren natürlichen
Zustand, der nicht absichtlich modifiziert oder vom Menschen im
Labor isoliert wurde, vorhanden ist, natürlich vorkommend. Als solches
wird ein Polypeptid oder eine Nukleotidsequenz als „nicht natürlich vorkommend" betrachtet, wenn
von einem rekombinanten Molekül
kodiert wird oder innerhalb eines solchen vorhanden ist, selbst
wenn die Aminosäure-
oder Nukleinsäuresequenz
mit einer in der Natur gefundenen Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz
identisch ist.
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Wie
sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „Nukleinsäure" und „Nukleinsäuremolekül" irgendeines einer
Desoxyribonukleinsäure
(DNA), einer Ribonukleinsäure
(RNA), von Oligonukleotiden, Fragmenten, die durch Polymerasekettenreaktion
(PCR) erzeugt wurden und Fragmenten, die durch irgendeines einer
Ligation, Spaltung, Endonukleasewirkung und Exonukleasewirkung erzeugt
wurden.
-
Der
Begriff „funktionsfähig verknüpft" bezeichnet, wenn
die Beziehung zwischen zwei Nukleinsäurebereichen beschrieben wird,
eine Nebeneinanderstellung, wobei die Bereiche in einer Beziehung
sind, die ihnen ermöglicht,
auf ihre angestrebte Weise zu funktionieren. Zum Beispiel ist eine
mit einer Kodiersequenz „funktionsfähig verknüpfte" Kontrollsequenz
auf eine solche Weise ligiert, dass die Expression der Kodiersequenz
unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind,
wie wenn beispielsweise die geeigneten Moleküle (z. B. Induktoren und Polymerasen)
an die Kontroll- oder regulatorischen Sequenzen) gebunden werden,
erreicht wird. In einer Ausführungsform
bezeichnet der Ausdruck „funktionsfähig verknüpft" daher einen Promotor,
der mit einer Kodiersequenz auf eine solche Weise verbunden ist,
dass die Transkription der Kodiersequenz von dem Promotor gesteuert
und reguliert wird. Techniken zum funktionsfähigen Verknüpfen eines Promotors mit einer
Kodiersequenz sind in der Wissenschaft allgemein bekannt; die exakte
Ausrichtung und Position relativ zu einer Kodiersequenz von Interesse
hängt unter
anderem von der spezifischen Natur des Promotors ab.
-
Der
Begriff „funktionsfähig verknüpft" kann daher einen
Promotorbereich bezeichnen, der auf eine solche Weise mit einer
Nukleotidsequenz verknüpft
ist, dass die Transkription der Nukleotidsequenz von dem Promotorbereich
gesteuert und reguliert wird. In ähnlicher Weise gilt, dass sich
eine Nukleotidsequenz unter der „transkriptionellen Steuerung" eines Promotors
befindet, mit dem sie funktionsfähig
verknüpft
ist. Techniken zum funktionsfähigen
Verknüpfen
eines Promotorbereichs mit einer Nukleotidsequenz sind in der Wissenschaft
bekannt. Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" kann sich auch auf
eine Transkriptionsterminierungssequenz oder eine andere Nukleinsäure, die
auf eine solche Weise mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, dass
die Terminierung der Transkription der Nukleotidsequenz durch die
Transkriptionsterminierungssequenz gesteuert wird, beziehen. Daneben
kann der Begriff „funktionsfähig verknüpft" eine Enhancer-,
Silencer- oder eine andere regulatorische Nukleinsäuresequenz
bezeichnen, die, wenn sie funktionsfähig mit einem offenen Leserahmen
verknüpft
ist, die Expression des offenen Leserahmens entweder auf positive
oder negative Weise moduliert.
-
Wie
sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „Polypeptid", „Protein" und „Peptid", die hierin gegeneinander
austauschbar verwendet werden, ungeachtet seiner Größe oder
Funktion, ein Polymer aus den 20 Proteinaminosäuren oder Aminosäureanaloga.
Obwohl ein „Protein" oft unter Bezugnahme
auf relativ große
Polypeptide verwendet wird und ein „Peptid" oft unter Bezugnahme auf kleine Polypeptide
verwendet wird, überschneidet
sich die Verwendung dieser Begriffe in der Wissenschaft und variiert.
Der Begriff „Polypeptid", wie er hierin verwendet
wird, bezeichnet, soweit es nicht anders angegeben ist, Peptide,
Polypeptide und Proteine. Wie sie hierin verwendet werden, werden
die Begriffe „Protein", „Polypeptid" und „Peptid", wenn sie sich auf
ein Genprodukt beziehen, gegeneinander austauschbar verwendet. Der
Begriff „Polypeptid" umfasst Proteine
mit allen Funktionen, einschließlich
Enzyme. Beispielhafte Polypeptide schließen daher Genprodukte, natürlich vorkommende
Proteine, Homologa, Orthologa, Paraloga, Fragmente und andere Äquivalente,
Varianten und Analoga der vorhergehenden ein.
-
Wie
sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „Urkeimzelle
(primordial germ cell) und „PGC" eine diploide Zelle,
die in dem frühen
Embryo vorhanden ist und sich zu haploiden Gameten (d. h. Spermatozoen
und Ovi) in einem erwachsenen Vogel differenzieren/entwickeln. Urkeimzellen
können
aus verschiedenen Entwicklungsstadien und aus verschiedenen Orten
in einem sich entwickelnden Vogelembryo, wie sie beispielsweise
einem Fachmann bekannt sind und die Genitalleiste, die sich entwickelnde
Gonade, das Blut und den Germinal Crescent einschließen, jedoch
nicht auf diese beschränkt
sind, isoliert werden. Siehe z. B. Chang et al., Cell Biol. Int.
21: 495–9,
1997; Chang et al., Cell Biol. Int. 19: 143–9, 1995; Allioli et al., Dev.
Biol. 165: 30–7,
1994; Swift, Am. J. Physiol. 15: 483–516; und die Internationale
PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 99/06533 . Die
Genitalleiste ist ein Abschnitt eines sich entwickelnden Embryos,
das einem Fachmann bekannt ist. Siehe z. B., Strelchenko, Theriogenology
45: 130–141,
1996; Lavoir, J. Reprod. Dev. 37: 413–424, 1994. Üblicherweise
sind PGCs bei der Periodsäure-Leukofuchsin-Färbung (Periodic
acid-Schiff stain, PAS-)Technik positiv gefärbt. In verschiedenen Spezies
können
PGCs unter Verwenden eines anti-SSEA-Antikörpers identifiziert werden
(wobei Truthahn eine beachtenswerte Ausnahme bildet, dessen PGCs
das SSEA-Antigen nicht zeigen). Verschiedene Techniken zur Isolierung
und Reinigung von PGCs sind in der Wissenschaft bekannt und schließen die
Konzentration von PGCs aus Blut unter Verwenden von Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation
(Yasuda et al., J. Reprod. Fertil. 96: 521–528, 1992) ein.
-
Der
Begriff „Promotor" oder „Promotorbereich" bezeichnet jeweils
eine Nukleotidsequenz innerhalb eines Gens, die 5' zu einer Kodiersequenz
angeordnet ist und zum Steuern der Transkription der Kodiersequenz fungiert.
Der Promotorbereich umfasst eine Stelle für den Transkriptionsbeginn
und kann daneben eines oder mehrere transkriptionelle regulatorische
Elemente einschließen.
In einer Ausführungsform
verwendet ein Verfahren des vorliegend offenbarten Gegenstands einen
RNA-Polymerase III-Promotor.
-
Ein „minimaler
Promotor" ist eine
Nukleotidsequenz, die die minimalen Elemente besitzt, die dazu erforderlich
sind, um das Auftreten einer Transkription auf dem Grundniveau zu
ermöglichen.
Als solche sind minimale Promotoren keine vollständigen Promotoren, sondern
eher Subsequenzen von Promotoren, die dazu in der Lage sind, ein
Grundniveau der Transkription eines Reporterkonstrukts in einem
Versuchssystem zu steuern. Minimale Promotoren schließen den
minimalen Promotor von CMV, den minimalen Promotor von HSV-tk, den
minimalen Promotor des Simian-Virus 40 (SV40), den minimalen Promotor
von humanem β-Actin, den
minimalen Promotor von humanem EF2, den minimalen Promotor des Adenovirus
E1B und den minimalen Promotor des Hitzeschockproteins (hsp) 70
ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Minimale Promotoren werden
oft um eines oder mehrere transkriptionelle regulatorische Elemente
ergänzt,
um die Transkription eines funktionsfähig verknüpften Gens zu beeinflussen.
Zum Beispiel können
zelltypspezifische oder gewebespezifische transkriptionelle regulatorische
Elemente an minimale Promotoren angefügt werden, um rekombinante
Promotoren zu erzeugen, die die Transkription einer funktionsfähig verknüpften Nukleotidsequenz
auf zelltypspezifische oder gewebespezifische Weise steuern.
-
Verschiedene
Promotoren weisen verschiedene Kombinationen transkriptioneller
regulatorischer Elemente auf. Ob ein Gen in einer Zelle exprimiert
wird oder nicht, hängt
von einer Kombination der bestimmten transkriptionellen regulatorischen
Elemente ab, die den Promotor des Gens und die verschiedenen Transkriptionsfaktoren
ausmachen, die innerhalb dem Kern der Zelle vorhanden sind. Als
solche werden Promotoren je nach ihrer funktionalen Aktivität in vivo
oder in vitro oft als „konstitutiv", „gewebespezifisch", „zelltypspezifisch" oder „induzierbar" klassifiziert. Zum
Beispiel ist ein konstitutiver Promotor einer, der dazu in der Lage
ist, die Transkription eines Gens in einer Vielzahl von Zelltypen
zu steuern. Beispielhafte konstitutive Promotoren schließen die
Promotoren für
die folgenden Gene, die bestimmte konstitutive oder „Haushalts-„ Gene
kodieren, ein:
Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT),
Dihydrofolatreduktase (DHFR; Scharfmann et al., 1991), Adenosindeaminase,
Phosphoglyceratkinase (PGK), Pyruvatkinase, Phosphoglyceratmutase,
der β-Actin-Promotor
(siehe z. B. Williams et al., 1993) und andere, in der Wissenschaft
bekannte konstitutive Promotoren. Zum anderen steuern „gewebespezifische" oder „zelltypspezifische" Promotoren die Transkription
in manchen Geweben und Zelltypen, sind jedoch in anderen inaktiv.
Beispielhafte gewebespezifische Promotoren schließen jene
Promotoren, die nachfolgend ausführlicher
beschrieben sind, sowie andere gewebespezifische und zelltypspezifische
Promotoren, die einem Fachmann bekannt sind, ein.
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Wenn
er in Verbindung mit einem Promotor verwendet wird, bezeichnet der
Begriff „verknüpft", wie er hierin verwendet
wird, eine physikalische Nähe
der Promotorelemente, so dass sie zusammen ein Steuern der Transkription
einer funktionsfähig
verknüpften
Nukleotidsequenz bewirken.
-
Der
Begriff „transkriptionelle
regulatorische Sequenz" oder „transkriptionelles
regulatorisches Element",
wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jeweils eine Nukleotidsequenz
innerhalb des Promotorbereichs, der das Reaktionsvermögen auf
einen regulatorischen Transkriptionsfaktor ermöglicht. Das Reaktionsvermögen kann
eine Abnahme oder eine Zunahme der transkriptionellen Ausgangsleistung
umfassen und wird durch Binden des Transkriptionsfaktors an das
DNA-Molekül,
das das transkriptionelle regulatorische Element umfasst, vermittelt.
In einer Ausführungsform
ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eine Transkriptionsterminierungssequenz,
die hierin alternativ als Transkriptionsterminierungssignal bezeichnet
wird.
-
Wie
hierin verwendet, bezieht sich „Signifikanz" oder „signifikant" auf eine statistische
Analyse der Wahrscheinlichkeit, dass ein nicht-zufälliger Zusammenhang zwischen
zwei der mehr Resten besteht. Um zu bestimmen ob eine Beziehung „signifikant" ist oder „Signifikanz" besitzt oder nicht,
können
statistische Manipulationen der Daten durchgeführt werden, um eine Wahrscheinlichkeit,
die als „p-Wert" ausgedrückt wird,
zu berechnen. Jene p-Werte, die unter einen benutzerdefinierten
Endpunkt fallen, werden als signifikant angesehen. In einem Beispiel
wird ein p-Wert von weniger als oder gleich 0,05, in einem anderen
Beispiel von weniger als 0,01, in einem weiteren Beispiel von weniger
als 0,005 und in einem noch weiteren Beispiel von weniger als 0,001
als signifikant angesehen.
-
Der
Begriff „regulatorische
Sequenz" ist ein
generischer Begriff, der in der gesamten Beschreibung dazu verwendet
wird, Polynukleotidsequenzen, wie beispielsweise Initiierungssignale,
Enhancer, Regulatoren, Promotoren und Terminierungssequenzen zu
bezeichnen, die notwendig oder gewünscht sind, um die Expression
kodierender und nicht-kodierender
Sequenzen, mit denen sie funktionsfähig verknüpft sind, zu beeinflussen.
Beispielhafte regulatorische Sequenzen sind bei Goeddel, 1990 beschrieben
und schließen
zum Beispiel die frühen
und späten
Promotoren des Simianvirus 40 (SV40), den unmittelbaren frühen Promotor
von Adenovirus oder Cytomegalovirus, das lac-System, das trp-System,
das TAC- oder TRC-System, den T7-Promotor, dessen Expression durch
die T7-RNA-Polymerase
gesteuert wird, die Hauptoperator- und -promotorbereiche des Phagen
Lambda, die Steuerbereiche für
das fd-Hüllprotein,
den Promotor für
die 3-Phosphoglyceratkinase oder
andere glykolytische Enzyme, die Promotoren der Säurephosphatase,
z. B. Pho5, die Promotoren der Hefe-A-Paarungsfaktoren, der Polyhedronpromotor
des Baculovirussystems und andere Sequenzen, von denen bekannt ist,
dass sie die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer
Zellen oder deren Viren steuern, und verschiedene Kombinationen
derselben, ein. Die Natur und Verwendung solcher Kontrollsequenzen
kann in Abhängigkeit
vom Wirtsorganismus variieren. Bei Prokaryoten schließen solche
regulatorischen Sequenzen allgemein Promotorsequenzen, Sequenzen
für die
Ribosomenbindungsstelle und Transkriptionsterminierungssequenzen
ein. Der Begriff „regulatorische
Sequenz" soll mindestens
solche Bestandteile einschließen,
deren Gegenwart die Expression kann und er kann auch weitere Bestandteile
einschließen, deren
Gegenwart von Vorteil ist, wie beispielsweise Leader-Sequenzen und
Fusionspartnersequenzen.
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In
bestimmten Ausführungsformen
befindet sich die Transkription einer Polynukleotidsequenz unter der
Steuerung einer Promotorsequenz (oder einer anderen regulatorischen
Sequenz), die die Expression des Polynukleotids in einem Zelltyp
steuert, in dem die Expression erfolgen soll. Es wird auch verstanden,
dass sich das Polynukleotid unter der Steuerung von regulatorischen
Sequenzen befinden kann, die gleich oder anders sind als diejenigen
Sequenzen, die die Expression der natürlich vorkommenden Form des
Polynukleotids steuern.
-
Der
Begriff „Reportergen" bezeichnet eine
Nukleinsäure,
die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Protein kodiert, das
entweder durch seine Gegenwart oder durch seine Aktivität leicht
nachweisbar ist und Luciferase, fluoreszierendes Protein (z. B.
grünes
fluoreszierendes Protein), Chloramphenicolacetyltransferase, β-Galactosidase,
sekretierte alkalische Phosphatase der Plazenta, β-Lactamase,
humanes Wachstumshormon und andere sekretierte Enzymreporter einschließt, jedoch
nicht auf diese beschränkt
ist. Allgemein kodiert ein Reportergen für ein Polypeptid, das ansonsten
nicht von der Wirtszelle erzeugt wird und durch eine Analyse der
Zelle(n), z. B. durch direkte fluorometrische, radioisotopische
oder spektrophotometrische Analyse der Zelle(n) und üblicherweise
ohne die Zellen für
die Analyse des Signals abtöten
zu müssen,
nachweisbar ist. In bestimmten Fällen
kodiert ein Reportergen für
ein Enzym, das eine Veränderung
der fluorometrischen Eigenschaften der Wirtszelle hervorruft und
durch eine qualitative, quantitative oder halbquantitative Funktion oder
durch Aktivierung der Transkription nachweisbar ist. Beispielhafte
Enzyme schließen
Esterasen, β-Lactamase,
Phosphatasen, Peroxidasen, Proteasen (Gewebeplasminogenaktivator
oder Urokinase) und andere Enzyme, deren Funktion mit geeigneten
chromogenen oder fluorogenen Substraten, die Fachleuten bekannt sind
oder in der Zukunft entwickelt werden, nachgewiesen werden können, ein.
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Wie
er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „Transkriptionsfaktor" ein Protein aus
dem Zytoplasma oder aus dem Kern, das an ein Gen bindet oder an
ein RNA-Transkript
eines Gens bindet oder an eines anderes Protein bindet, das an ein
Gen oder ein RNA-Transkript oder ein anderes Protein bindet, das
wiederum an ein Gen oder ein RNA-Transkript
bindet, um dadurch die Expression des Gens zu modulieren. Eine solche
Modulation kann daneben durch andere Mechanismen erreicht werden;
das Wesentliche eines „Transkriptionsfaktors
für ein
Gen" wird einem
Faktor zugeschrieben, der das Niveau der Transkription des Gens
auf irgendeine Weise ändert.
Der Begriff „Transkriptionsfaktor" kann allgemein auch
ein Protein bezeichnen, das die Expression des Gens durch eine Wechselwirkung
mit dem transkriptionellen regulatorischen Element und zellulärer Bestandteilen
für die
Transkription, einschließlich
RNA-Polymerase, mit der Transkription assoziierten Faktoren (TAFs),
Chromatin-Remodeling-Proteinen, und irgendeinem anderen relevanten
Protein, das die Transkription des Gens beeinträchtigt, moduliert.
-
Der
Begriff „Vektor" bezeichnet eine
Nukleinsäure,
die dazu in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, mit der sie verknüpft wurde,
zu transportieren. Ein Typ eines Vektors, der gemäß dem vorliegend
offenbarten Gegenstand verwendet werden kann, ist ein Episom, d.
h. eine Nukleinsäure,
die zu extrachromosomaler Replikation in der Lage ist. Andere Vektoren
schließen
solche eine, die zu autonomer Replikation und Expression von Nukleinsäuren, mit
denen sie verknüpft
wurden, in der Lage sind. Vektoren, die dazu in der Lage sind, die Expression
von Genen, mit denen sie funktionsfähig verknüpft sind, zu steuern, werden
hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Allgemein
liegen Expressionsvektoren zur Verwendung in rekombinanten DNA-Techniken
oft in der Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung
werden „Plasmid" und „Vektor" gegeneinander austauschbar
verwendet, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors
ist. Der vorliegend offenbarte Gegenstand soll jedoch solche anderen
Formen von Expressionsvektoren einschließen, die äquivalenten Funktionen dienen
und demnach entsprechend in der Wissenschaft bekannt werden.
-
Der
Begriff „Expressionsvektor", wie er hierin verwendet
wird, bezeichnet eine DNA-Sequenz,
die dazu in der Lage ist, die Expression einer bestimmten Nukleotidsequenz
in einer geeigneten Wirtszelle zu steuern und einen Promotor umfasst,
der funktionsfähig
mit der Nukleotidsequenz von Interesse verknüpft ist, die funktionsfähig mit
Transkriptionsterminierungssequenzen verknüpft ist. Üblicherweise umfasst er auch
Sequenzen, die für
eine korrekte Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind.
Das die Nukleotidsequenz umfassende Konstrukt kann chimär sein.
Das Konstrukt kann auch eines sein, das natürlich vorkommt, jedoch in rekombinanter
Form erhalten wurde, die für
eine heterologe Expression von Nutzen ist. Die Nukleotidsequenz
von Interesse, einschließlich
beliebiger weiterer Sequenzen, die dazu konstruiert wurden, eine
korrekte Expression der Nukleotidsequenzen zu bewirken, kann auch
als „Expressionskassette" bezeichnet werden.
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Die
Begriffe „heterologes
Gen", „heterologe
DNA-Sequenz", „heterologe
Nukleotidsequenz", „exogenes
Nukleinsäuremolekül" oder „exogenes
DNA-Segment", wie
sie hierin verwendet werden, bezeichnen jeweils eine Sequenz, die
aus einer Quelle abgeleitet wird, die für die angestrebte Wirtszelle
fremd ist, oder, wenn sie aus der gleichen Quelle abgeleitet wird,
von ihrer ursprünglichen
Form modifiziert wurde. Daher schließt ein heterologes Gen in einer
Wirtszelle ein Gen ein das für
die bestimmte Wirtszelle endogen ist, jedoch zum Beispiel durch
Mutagenese oder durch Isolierung aus den nativen transkriptionellen
regulatorischen Sequenzen modifiziert wurde. Die Begriffe schließen auch
nicht natürlich
vorkommende multiple Kopien einer natürlich vorkommenden Nukleotidsequenz
ein. Die Begriffe bezeichnen deshalb ein DNA-Segment, das für die Zelle
fremd oder heterolog ist oder für
die Zelle homolog ist, jedoch in einer Position innerhalb der Nukleinsäure der
Wirtszelle, in der das Element normalerweise nicht gefunden wird.
-
Zwei
Nukleinsäuren
sind „rekombiniert", wenn die Sequenzen
von jeder der beiden Nukleinsäuren
in einer Nukleinsäure
der Nachkommenschaft miteinander kombiniert sind. Zwei Sequenzen
gelten als „direkt" rekombiniert, wenn
beide Nukleinsäuren
Substrate für
die Rekombination sind. Zwei Sequenzen gelten als „indirekt
rekombiniert", wenn
die Sequenzen unter Verwenden eines Intermediats, wie beispielsweise
eines Crossover-Oligonukleotids, rekombiniert sind. Bei einer indirekten
Rekombination ist nicht mehr als eine der Sequenzen ein tatsächliches
Substrat für
die Rekombination und in manchen Fällen ist keine der Sequenzen
ein Substrat für
die Rekombination.
-
Wie
er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „regulatorische
Elemente" Nukleotidsequenzen, die
an der Steuerung der Expression einer Nukleotidsequenz beteiligt
sind. Regulatorische Elemente können einen
Promotor umfassen, der funktionsfähig mit der Nukleotidsequenz
von Interesse und Terminierungssignalen verknüpft ist. Regulatorische Sequenzen
schließen
auch Enhancer und Silencer ein. Sie schließen üblicherweise auch Sequenzen
ein, die für
eine korrekte Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind.
-
Wie
er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „signifikanter
Anstieg" die Erhöhung einer
Menge (zum Beispiel einer Anzahl an PGCs), die größer als
der der Messtechnik innewohnende Fehlerbereich ist, in einer Ausführungsform
einen Anstieg um ungefähr
10% oder mehr oberhalb einer Grundmenge (zum Beispiel die durchschnittliche Anzahl
an PGCs, die an einer bestimmten Position in einem bestimmten Stadium
der Entwicklung in einem unbehandelten Embryo des Wildtyps vorhanden
ist), in einer weiteren Ausführungsform
einen Anstieg um ungefähr
25% oder mehr und in einer noch weiteren Ausführungsform einen Anstieg um
ungefähr
50% oder mehr.
-
Wie
sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „signifikant
weniger" oder „signifikant
verringert" eine
Menge (zum Beispiel eine Anzahl von PGCs), die um mehr als dem der
Messtechnik innewohnenden Fehlerbereich verringert ist, in einer
Ausführungsform
eine Abnahme um ungefähr
10% oder mehr in Bezug auf eine Grundmenge (zum Beispiel die durchschnittliche
Anzahl an PGCs, die an einer bestimmten Position in einem bestimmten
Stadium der Entwicklung in einem unbehandelten Embryo des Wildtyps
vorhanden ist), in einer weiteren Ausführungsform eine Abnahme um
ungefähr
25% oder mehr und in einer noch weiteren Ausführungsform eine Abnahme um
ungefähr
50% oder mehr.
-
Wie
er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „spezifische
Bindung" und dessen
grammatikalische Varianten eine Bindungsaffinität, die ein Antikörper zu
einem verwandten Epitop aufweist. Unter Bezugnahme auf die offenbarten
Verfahren soll eine „spezifische
Bindung" eine Bindung
zwischen einem Antikörper (zu
Beispiel einem IgY-Molekül) und einem
Antigen unter physiologischen Bedingungen (zum Beispiel innerhalb
einer Position, in der PGCs in einem Vogelembryo gefunden werden
können)
einschließen,
die zu einer Modulation der normalen biologischen Aktivität des das
Epitop umfassenden Makromoleküls
führt.
Anders ausgedrückt
wird in einer Ausführungsform
eine Wechselwirkung zwischen einem IgY-Molekül und einem Epitop als spezifisch
angesehen, wenn eine biologische Aktivität des Makromoleküls, an das
das IgY-Molekül
in einem sich entwickelnden Embryo bindet, relativ zu der Aktivität des Makromoleküls in einem
anderen sich entwickelnden Embryo in einem ähnlichen Stadium in der Abwesenheit
des IgY-Moleküls verändert wird.
-
Als
solches bezeichnen die Ausdrücke „bindet
spezifisch (oder selektiv) an einen Antikörper" und „spezifisch immunreaktiv mit", wenn sie sich auf
ein Epitop beziehen, das auf einem Polypeptid oder Peptid vorhanden
ist, eine Bindungsreaktion, die für die Gegenwart des Polypeptids
in der Gegenwart einer heterogenen Population von Polypeptiden und
anderen biologischen Präparaten
bestimmend ist. Daher binden die bestimmten Antikörper unter
den vorgesehenen Bedingungen eines Immunoassays an ein bestimmtes
Polypeptid und binden nicht in einer signifikanten Menge an andere,
in der Probe vorhandene Polypeptide. Die spezifische Bindung an
einen Antikörper
unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der aufgrund seiner
Spezifität
für ein
bestimmtes Polypeptid ausgewählt
wird. Zum Beispiel können
Antikörper,
die gegen ein Antigen gerichtet sind, das mit PGCs assoziiert ist,
ausgewählt
werden, um Antikörper
zu erhalten, die spezifisch mit diese Antigen und nicht mit anderen
Antigenen immunreaktiv sind. Es kann eine Vielzahl von Immunoassay-Vorlagen
verwendet werden, um Antikörper
auszuwählen,
die spezifisch mit einem bestimmten Polypeptid immunreaktiv sind.
Zum Beispiel werden routinemäßig Festphasen-ELISA-Immunoassays,
Western Blots oder Immunhistochemie dazu verwendet, um monoklonale
Antikörper
auszuwählen,
die spezifisch mit einem Polypeptid immunreaktiv sind. Siehe Harlow & Lane, Antibodies:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring
Harbor, New York, Vereinigte Staaten von Amerika, 1988, für eine Beschreibung von
Immunoassay-Vorlagen und -bedingungen, die zum Bestimmen der spezifischen
Immunreaktivität
verwendet werden können. Üblicherweise
wird eine spezifische oder selektive Reaktion wenigstens zweimal
so groß wie
das Untergrundsignal oder Rauschen und meistens mehr als 10- bis
100-mal so groß wie
der Untergrund sein.
-
Wie
er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „Transformation" einen Vorgang zum
Einschleusen von heterologer DNA in eine Vogelzelle, ein Vogelgewebe
oder einen Vogel. Es wird verstanden, dass transformierte Vogelzellen,
Vogelgewebe und Vögel
nicht nur das Endprodukt eines Transformationsvorgangs, sondern
auch deren transgene Nachkommenschaft umfassen.
-
Wie
sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „transformiert", „transgen" und „rekombinant" einen Wirtsorganismus,
wie beispielsweise eine Vogel-PGC, in die ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingeschleust
wurde. Das Nukleinsäuremolekül kann stabil
in das Genom des Wirts eingebaut sein oder auch als extrachromosomales
Molekül
vorhanden sein. Ein solches extrachromosomales Molekül kann autoreplizierend
sein. Es wird verstanden, dass transformierte Zellen, Gewebe oder
Zellen nicht nur das Endprodukt eines Transformationsvorgangs, sondern
auch deren transgene Nachkommenschaft einschließen. Ein „nicht-transformierter", „nicht-transgener" oder „nicht-rekombinanter" Wirt bezeichnet einen
Wildtyp-Organismus, z. B. eine Wildtyp-Vogel-PGC, die das heterologe
Nukleinsäuremolekül nicht
enthält.
-
II. Immunisieren von Vögeln und die Abscheidung von
Antikörpern
in Eidotter
-
Vögel und
insbesondere Hühner
wurden zu einer zunehmend üblichen
Quelle für
die Erzeugung polyklonaler Antikörper
in großem
Maßstab,
da große
Mengen der Antikörper
während
der Eiproduktion aus dem Serum in die Eidotter überführt werden. Siehe Rose et al.,
Eur. J. Immunol. 4: 521, 1974. Der vorliegend offenbarte Gegenstand
macht sich dieses Phänomen
zunutze, um die PGC-Entwicklung in Embryos durch Immunisieren von
weiblichen Vögeln
mit Antigenen, die mit PGCs assoziiert sind und sich im Dotter ansammeln,
zu bewirken. Diese Antikörper
können
dann während
der Embryogenese des Vogels an ihre verwandten Antigene binden,
wodurch sie die biologischen Aktivitäten der Polypeptide, die mit
der Entwicklung von PGCs assoziiert sind, beeinflussen.
-
A. Antigene und Epitope
-
Der
vorliegend offenbarte Gegenstand schließt Polypeptide ein, die Epitope
des Polypeptids, das zum Erzeugen von IgY-Antikörpern, die an die Epitope binden,
verwendet werden kann, umfassen oder alternativ aus diesen bestehen.
In alternativen, nicht einschränkenden
Ausführungsformen
umfassen die Polypeptide eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO:
2 oder 6 und die Epitope sind auf Peptidantigenen mit einer Aminosäuresequenz
mit der SEQ ID NO: 3, 4, 7 oder 8 vorhanden. Es sollte jedoch beachtet
werden, dass die hierin offenbarten Peptidantigene, wie Vasa-N,
Vasa-C, Dazl-N und Dazl-C, lediglich beispielhaft sind und andere
antigene Peptide und Polypeptide, einschließlich der vollständig langen
Version eines Polypeptids, das mit der PGC-Entwicklung assoziiert
ist (einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die in
der SEQ ID NO: 2 oder 6 dargestellt ist) als Immungene verwendet
werden können.
-
Der
Begriff „Epitope", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf die Abschnitte eines Polypeptids mit antigener
oder immunogener Aktivität
in einem Vogel, in einer Ausführungsform
einem Huhn. In einer Ausführungsform
umfasst der vorliegend offenbarte Gegenstand ein Polypeptid, das
ein Epitop sowie das Polynukleotid, das für dieses Polypeptid kodiert,
umfasst. Ein „immunogenes
Epitop", wie es
hierin verwendet wird, ist als ein Abschnitt eines Proteins definiert,
der eine Antikörperreaktion
in einem Vogel auslöst,
wie sie mit einem beliebigen, in der Wissenschaft bekannten Verfahren,
zum Beispiel den hierin beschriebenen Verfahren zum Erzeugen von
Antikörpern,
bestimmt wird. Der Begriff „antigenes
Epitop", wie er
hierin verwendet wird, ist als ein Abschnitt eines Proteins definiert,
an den ein Antikörper
sein Antigen immunspezifisch binden kann, wie mit einem beliebigen,
in der Wissenschaft allgemein bekannten Verfahren, zum Beispiel
mit den hierin beschriebenen Immunoassays, bestimmt wird. Eine immunspezifische
Bindung schließt
eine nicht-spezifische Bindung, jedoch nicht notwendigerweise eine
Kreuzreaktivität
mit anderen Antigenen aus. Es soll verstanden werden, dass der Begriff
Epitop, wie er hierin verwendet wird, jeden beliebigen Abschnitt
eines Polypeptids umfasst, der eine antigene oder immunogene Aktivität in einem
Vogel aufweist, und eine Untergruppe der Aminosäuren des Polypeptids selbst
(hierin auch als „Peptidantigen" bezeichnet) einschließlich, aber
nicht auf diese beschränkt
ist und ebenso jede beliebige Modifikationen des Polypeptids einschließt, die
zusätzliche
Reste in das Polypeptid einbauen (zum Beispiel die post-translationale
Addition von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppen).
-
Fragmente,
die als Epitope fungieren, können
mit jedem beliebigen herkömmlichen
Ansatz erzeugt werden. Siehe z. B. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82: 5131–5135,
1985; ferner im
U.S. Patent Nr. 4,631,211 beschrieben.
-
Beim
vorliegend offenbarten Gegenstand enthalten antigene Epitope eine
Sequenz von in einer Ausführungsform
wenigstens 4, in einer anderen Ausführungsform wenigstens 5, in
einer anderen Ausführungsform
wenigstens 6, in einer anderen Ausführungsform wenigstens 7, in
einer anderen Ausführungsform
wenigstens 8, in einer anderen Ausführungsform wenigstens 9, in
einer anderen Ausführungsform
wenigstens 10, in einer weiteren Ausführungsform wenigstens 15, in
einer weiteren Ausführungsform
wenigstens 20, in einer weiteren Ausführungsform wenigstens 25 und
in einer noch weiteren Ausführungsform
von ungefähr
15 bis ungefähr
30 Aminosäuren.
Beispielhafte Polypeptide, die immunogene oder antigene Epitope
umfassen, sind wenigstens 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,
60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder 100 Aminosäurereste lang. Antigene Epitope
sind zum Beispiel zum Erzeugen von Antikörpern, einschließlich IgY-Antikörpern, die
spezifisch an das Epitop binden, von Nutzen. Antigene Epitop können als
Zielmoleküle
in Immunoassays verwendet werden. Siehe z. B. Wilson et al., Cell
37: 767–778,
1984; Sutcliffe et al, Science 219: 660–666, 1983.
-
In ähnlicher
Weise können
immunogene Epitope zum Beispiel zum Erzeugen von Antikörpern gemäß den in
der Wissenschaft allgemein bekannten Verfahren verwendet werden.
Siehe z. B. Sutcliffe et al., supra; Chow et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82: 910–914,
1985; und Bittle et al., J. Gen. Virol. 66: 2347–2354, 1985. Die Polypeptide,
die eines oder mehrere immunogene Epitope umfassen, können zum
Auslösen
eines Antikörperreaktion
zusammen mit einem Trägerprotein,
wie beispielsweise einem Albumin, einem Vogelsystem (wie zum Beispiel
Huhn) präsentiert
werden oder, wenn das Polypeptid ausreichend lang ist (wenigstens
ungefähr
25 Aminosäuren
lang), kann das Polypeptid ohne einen Träger präsentiert werden. Es wurde jedoch gezeigt,
dass immunogene Epitope, die so wenige wie 8 bis 10 Aminosäuren umfassen,
dazu ausreichen, Antikörper
zu erzeugen, die dazu in der Lage sind, an allerwenigstens lineare
Epitope in einem denaturierten Polypeptid (z. B. bei Western Blotting)
zu binden.
-
Epitope
tragende Polypeptide des vorliegend offenbarten Gegenstands können zum
Erzeugen von Antikörpern
gemäß in der
Wissenschaft allgemein bekannten Verfahren, die eine in vivo-Immunisierung
einschließen,
jedoch nicht auf diese beschränkt
sind, verwendet werden. Siehe z. B. Sutcliffe et al., supra; Wilson et
al., supra; und Bittle et al., supra. Wenn eine in vivo-Immunisierung
verwendet wird, können
Vögel mit
einem freien Peptid immunisiert werden; der Titer der anti-Peptid-Antikörper kann
jedoch durch Koppeln des Peptids an einen Makromolekülträger, wie
beispielsweise Keyhole limpet hemocyanin (KLH), Rinderserumalbumin (BSA)
oder Tetanustoxoid, erhöht
werden. Zum Beispiel können
Peptide, die Cyaninreste enthalten, unter Verwenden eines Linkers,
wie beispielsweise Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS),
an einen Träger
gekoppelt werden, während
andere Peptide unter Verwenden eines allgemeineren Verknüpfungsmittels, wie
beispielsweise Glutaraldehyd, an Träger gekoppelt werden können. Vögel, wie
zum Beispiel Hühner,
werden zum Beispiel durch intramuskuläre Injektion (zum Beispiel
in den Pectoralis major) von Emulsionen, die ungefähr 10 bis
1000 Mikrogramm Peptid oder Trägerprotein
und Freund-Adjuvans oder irgendeinen anderen Hilfsstoff, von dem
bekannt ist, dass er eine Immunreaktion stimuliert, enthält, entweder
mit freien oder mit an Träger
gekoppelten Peptiden immunisiert. Es können mehrere Booster-Injektionen
zum Beispiel in Intervallen von ungefähr zwei Wochen verwendet werden,
um einen nützlichen
Titer eines anti-Peptid-Antikörpers
bereitzustellen, der zum Beispiel mit Hilfe eines ELISA-Assays unter Verwenden
eines an eine feste Oberfläche
adsorbierten, freien Peptids nachgewiesen werden kann. Der Titer
der anti-Peptid-Antikörper
in Serum aus einem immunisierten Tier kann durch Auswahl von anti-Peptid-Antikörpern, zum
Beispiel durch Adsorption an das Peptid auf einem festen Träger und
Elution der ausgewählten
Antikörper
gemäß in der
Wissenschaft allgemein bekannten Verfahren erhöht werden.
-
B. Konjugate und Hilfsstoffe
-
Wie
in der Wissenschaft allgemein bekannt ist, kann eine gegebene Zusammensetzung
bezüglich
ihrer Immunogenität
variieren. Es ist daher oft erforderlich, das Immunsystem des Wirtssystem
zu stärken,
wie es durch Konjugieren eines Peptid- oder Polypeptidimmunogens
an einen Träger
erreicht werden kann. Beispielhafte Träger sind Keyhole limpet hemocyanin
(KLH) und Rinderserumalbumin (BSA). Andere Albumine, wie beispielsweise
Ovalbumin, Mausserumalbumin oder Kaninchenserumalbumin können ebenso
als Träger verwendet
werden. Verfahren zum Konjugieren eines Polypeptids an ein Trägerprotein
sind in der Wissenschaft allgemein bekannt und schließen die
Verwendung von Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester,
Carbodiimid und bis-biazotisiertem Benzidin ein.
-
Wie
ebenso allgemein in der Wissenschaft bekannt ist, kann die Immunogenität einer
bestimmten Immunogenzusammensetzung durch die Verwendung nicht-spezifischer
Stimulatoren der Immunreaktion, die als Hilfsstoffe bekannt sind,
erhöht
werden. Beispielhafte Hilfsstoffe schließen vollständiges Freund-Adjuvans (einen
nicht-spezifischen Stimulator der Immunreaktion, das abgetötetes Mycobacterium
tuberculosis enthält), unvollständiges Freund-Adjuvans,
Aluminiumhydroxid und TITERMAX®-Adjuvans (TMA; CytRx
Corp., Norcross, Georgia, Vereinigte Staaten von Amerika) ein.
-
Die
Menge der bei der Erzeugung von polyklonalen Antikörpern verwendeten
Immunogenzusammensetzung variiert je nach der Natur des Immunogens
sowie dem für
die Immunisierung verwendeten Tier. Zum Verabreichen des Immungens
kann eine Vielzahl von Wegen (subcutan, intramuskulär, intravenös und intraperitoneal)
verwendet werden. In einer Ausführungsform
werden die Vögel
durch intramuskuläre
Injektion einer Antigenzubereitung in den Muskel Pectoralis major
(den Großen
Brustmuskel) immunisiert. Die Erzeugung polyklonaler Antikörper kann
durch Abnehmen von Blut aus dem immunisierten Tier zu verschiedenen
Zeitpunkten nach der Immunisierung überwacht werden. Anschließend können auch
Booster-Injektionen gegeben werden. Der Vorgang des Boosterns und
Titerbildens wird solange wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht ist.
Wenn ein gewünschter
Grad an Immunogenität
erreicht wird, kann das immunisierte Tier ausgeblutet und das Serum
isoliert und gelagert werden.
-
C. Isolierung von Antikörpern aus
Dotter
-
Antikörper, die
an Antigene binden, die mit PGCs assoziiert sind, werden in dem
Dotter von Eiern abgeschieden, die von weiblichen Vögeln erzeugt
werden die mit den Antigenen (zum Beispiel mit Peptiden, die die
Antigene umfassen) immunisiert wurden. In einigen Ausführungsformen
können
Antikörper
unter Verwenden von Fachleuten bekannten Techniken aus dem Dotter
isoliert werden. Siehe z. B. Akita et al., J. Immunol. Meth. 160:
207–214,
1993; Akita et al., J. Fond Sci. 57: 629–634, 1992;
U.S. Patent Nr. 4,357,272 . Wie im
U.S. Patent Nr. 4,357,272 angegeben
ist, kann IgY aus Dotter durch eine Fällung mit Polyethylenglykol
(PEG) gereinigt werden. Kurz gesagt, können Dotter gesammelt und in
destilliertem Wasser gewaschen werden, um das Eiweiß zu entfernen.
Die Dotter können
durch einen Glastrichter in einen Messzylinder durchlaufen gelassen werden,
was ein Aufbrechen der Dottersäcke
bewirkt und den Dotter freisetzt, der sich in dem Zylinder sammelt.
Das Volumen der Dotter wird gemessen und es wird ein Volumen eines
Puffers (zum Beispiel phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PBS),
das zu zwei Volumina Dotter äquivalent
ist, dazugegeben und vorsichtig gemischt. PEG (zum Beispiel PEG
6000) wird bis zu einer Endkonzentration von 3,5% (Gewicht:Volumen;
w:v) dazugegeben. Die Mischung wird solange gerührt, bis das PEG vollständig aufgelöst ist.
Dann wird die Mischung mit 12.000 g zehn Minuten lang zentrifugiert.
Der Zentrifugationsschritt führt
zur Erzeugung von drei Phasen in den Zentrifugationsröhrchen.
Die oberste Schicht ist eine gelbe fettige Schicht, die mittlere
Schicht ist eine klare Überstandsschicht
und eine Bodenschicht besteht aus dem Hauptteil des Dotters und
einem Protein-„Pellet". Der IgY enthaltende,
flüssige Überstand
und die fettige Schicht können
in einen Trichter dekantiert werden, der einen absorbierenden Baumwollstopfen
im Hals des Trichters enthält.
Der Stopfen entfernt die Lipidschicht. Dann wird das Volumen des
klaren Filtrats gemessen und PEG unter leichtem Rühren bis
zu einer Endkonzentration von 12 g PEG pro 100 ml Dotterextrakt
dazugegeben. In dieser Konzentration verursacht das PEG eine vollständige Entfernung
des IgY. Dann wird das Präzipitat
wie vorher zentrifugiert. Die Pellets können wieder auf das ursprüngliche
Volumen in Phosphatpuffer aufgelöst
werden und das IgY erneut mit 12% PEG ausgefällt und zentrifugiert werden.
Das restliche PEG kann durch zwei Runden einer erneuten Zentrifugation
und Absaugung jeglicher Flüssigkeit
entfernt werden (wobei IgY in dem Pellet gefunden wird). Anschließend können die
finalen Pellets in einem Volumen Phosphatpuffer aufgelöst werden,
das zu der Hälfte
des Volumens von Dotter, aus dem es abgeleitet wurde, äquivalent
ist, obwohl durch Auflösen
der Pellets in einem kleineren Volumen konzentriertere Lösungen erhalten
werden können,
wenn es gewünscht
ist. Für
eine Injektion in Tiere, bei der eine vollständigere Entfernung von PEG
wünschenswert
ist, kann das IgY von Spuren von PEG durch Ausfällen des IgY mit halbgesättigtem
Ammoniumsulfat, gefolgt von einer Zentrifugation befreit werden.
Das PEG bildet eine flüssige
Phase in der wässrigen
Ammoniumsulfatphase, während
das IgY eine dritte Phase auf dem Boden des Zentrifugenröhrchens
bildet.
-
Auf
diese Weise oder mit irgendeinem anderen, Fachleuten bekannten Verfahren,
gereinigtes IgY kann in Immunoassays, einschließlich, aber nicht beschränkt auf,
enzymgekoppelte Immunabsorptionstests (enzym-linked immunosorbent
assays, ELISAs), Immunpräzipitation
usw., unter Verwenden von Fachleuten bekannten Techniken verwendet
werden. Standardisierte sekundäre
Reagenzien, wie beispielsweise sekundäre anti-IgY-Antikörper, sind von einer Reihe
von Herstellern, einschließlich
Research Diagnostics Inc., Flanders, New Jersey, Vereinigte Staaten
von Amerika und Aves Labs, Inc., Tigard, Oregon, Vereinigte Staaten
von Amerika, erhältlich.
-
III. Verfahren zum Modulieren der Proliferation
und Entwicklung von PGCs
-
Der
vorliegend offenbarte Gegenstand stellt Verfahren zum Modulieren
der Entwicklung der PGCs in einem Vogelembryo bereit. Die durch
die offenbarten Verfahren bereitgestellte Modulation kann die Form
von entweder einem qualitativen oder einem quantitativen Unterschied
in den PGCs des Embryos, einschließlich, aber nicht beschränkt auf,
einer Verminderung oder einer Erhöhung der Anzahl an PGCs die
in dem sich entwickelnden Embryo vorhanden sind, in Bezug auf eine
Anzahl an PGCs, die normalerweise in einem Embryo der gleichen Spezies
in dem gleichen Stadium, der nicht den hierin beschriebenen Verfahren
ausgesetzt wurde, befinden, annehmen. Alternativ dazu kann die Modulation
die Form einer Störung
der normalen Entwicklung von PGCs in dem Embryo annehmen, so dass
die PGCs sich, entweder im Hinblick auf eine Wanderung zu der Gonade
oder im Hinblick auf ihre Entwicklung, wenn sie erst einmal in die
Mikroumgebung der Gonade des Embryos eingedrungen sind, nicht normal
entwickeln können.
-
Verschiedene
Gruppen haben von der Verwendung von Chemikalien oder Bestrahlung
zum Modulieren der Menge von PGCs in Vogelembryos berichtet. Eine
bestimmte Chemikalie, die zum Verringern von Mengen an endogenen
PGCs verwendet wurde, ist Busulfan (siehe Aige-Gil & Simkiss, Res.
Vet. Sci. 50: 139, 1991; Vick et al., J. Reprod. Fert. 98: 637;
Bresler et al., Br. Poultry Sci. 35: 241, 1994; Hallet & Wentworth, Poultry
Sci. 70: 1619, 1991; die U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsar.
20030111016). Die Verbindung Busulfan (1,4-Butandioldimethansulfonat,
BU) wurde als chemotherapeutisches Mittel bei der Behandlung von
Leukämie
verwendet (Bhagwatwar et al., Cancer, Chemother. Pharmacol. 37:
401–08,
1996). 1963 zeigten Hemsworth und Jackson, dass die Verabreichung
von BU in Ratten in bemerkenswerter Weise die Entwicklung von PGCs
beeinträchtigen
konnte (Hemsworth & Jackson,
J. Reprod. Dev. 6: 229–33,
1963). Die Injektion von BU in den Dottersack von Hühnerembryos
führte
zu multiplen Fehlbildungen (Swartz, Teratology 21: 1–8, 1980).
Hallet und Wentworth (Poult. Sci. 70: 1619–23, 1991) berichteten auch
von einer signifikanten Abnahme des Ausbrütungsvermögens infolge einer Injektion
einer Eiweißsuspension
von BU in Wachteleiern. In manchen mit BU behandelten Wachteln schien
eine Abwesenheit von Keimzellen in den Gonaden aufzutreten, während andere,
in ähnlicher
Weise behandelte Vögel
normal erschienen. Die Autoren schlugen vor, dass „Unstimmigkeiten
in der Übertragung
von BU in den Embryo" die
beobachteten Abweichungen erklären
könnten.
Sie schlossen, dass das Entdecken eines nicht-toxischen Lösungsmittelsystems
erforderlich wäre,
um die mit der Verwendung einer Suspension verbundenen, uneinheitlichen
Ergebnisse auszuschließen.
Aige-Gil & Simkiss
(Br. Poult. Sci 32: 427–438,
1991) verwendeten Kochsalzlösung-
oder Sesamölsuspensionen
von BU oder in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöstes BU in Hühnerembryos.
Die Verabreichung von DMSO allein erzeugte eine Embryonensterblichkeit,
Entwicklungsverzögerungen
und Fehlbildungen, die diejenigen, die bei Kochsalzlösung beobachtet
wurden, überstiegen.
Die teratogenen Effekte wurden größtenteils minimiert, wenn BU in
Sesamöl
suspendiert und in Dotter injiziert wurde. Die Injektion von 100 µg BU in
Sesamöl
führte
zu einem Sterilitätsindex
von 95+%. In einem nachfolgenden Versuch berichteten Vick und seine
Mitarbeiter (J. Reprod. Fertil 98: 637–41, 1993), dass die Injektion
von 25, 50 und 250 µg
BU die gonadalen Keimzellen in Hühnerembryos
signifikant verringerte. Sie schätzten,
dass eine Behandlung mit BU den Anteil eines Keimbahnchimärismus im
Vergleich zu nicht mit BU behandelten Embryos um das 3,5-Fache erhöhte. Bresler
et al. (Br. Poult. Sci. 35: 241–47,
1994) zeigten, dass eine Behandlung mit BU und eine anschließende Injektion
der PGCs zu einer signifikanten Wiederbevölkerung der Gonade führen könnte. Eine
Injektion von 50 µg
in Sesamöl
suspendiertem BU verringerte die PGCs in der linken und rechten
Gonade von 6 Tage alten Hühnerembryos
um 75 bzw. 78%. Nach der Injektion einer Suspension germinaler sichelförmiger Zellen
in mit BU behandelte Embryos stiegen die Anzahlen der PGCs entsprechend
auf 72 und 115% der Kontrollen für
die linke und rechte Gonade an. Die Schwankungen bei der Übertragung
von BU in die Gonade und die resultierende Unstimmigkeit in der
Wirksamkeit bei der Verringerung der Anzahl an PGCs schränkt die
Nützlichkeit
dieser Technologie ein.
-
In
der U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 20030111016
verwendeten die vorliegenden Miterfinder Busulfan, um die endogenen
PGCs vor dem Verabreichen von Donor-PGCs zu verringern. Kurz gesagt,
wurden fünfzehn
mg Busulfan in einem Glasfläschchen
in 5 ml Dimethylformamid (DMF) aufgelöst. Zu der Lösung wurden
fünf ml
Sesamöl
gegeben. Die Mischung wurde vollständig auf einer Vortexeinrichtung
geschüttelt,
um eine Emulsion zu erzeugen. Die Konzentration von Busulfan in
der Emulsion betrug 1,5 µg/ml. Für jede Charge
an Injektionen wurde eine frische Busulfanemulsion zubereitet. Die
befruchteten Eier wurden 22 Stunden lang bei 37,5°C und 60%
relativer Feuchte inkubiert. Dann wurden die Eier 2 Stunden lang
horizontal in den Inkubator eingestellt. Das stumpfe Ende jedes
Eies wurde mit 70% Ethanol gereinigt. Unter Verwenden einer gebogenen
Zange wurde dann ein kleines Loch in die die Luftkammer bedeckende
Schale gemacht, ohne die Membran der äußeren Schale zu beschädigen. Fünfzig µl der Busulfanemulsion
(die 75 µg Busulfan
enthielt) wurde unter Verwenden einer Injektionsnadel (21 G × 1,5 Inch)
horizontal durch die Luftkammer in den Dotter injiziert. Die Emulsion
wurde vor ihrer Verwendung vollständig auf einer Vortexeinrichtung geschüttelt. Für den gesamten
Injektionsvorgang wurden die Eier horizontal gehalten. Das Loch
in der Schale wurde mit einem Tesafilm verschlossen. Nach der Injektion
wurden die Eier vertikal inkubiert.
-
Die
mit Busulfan behandelten Embryos wurden im Stadium 27 (H&H) gesammelt und
in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Embryos wurden in Paraffin eingebettet,
mit einer Dicke von 7 µm
geschnitten und mit SSEA-1-Antikörpern
immunhistochemisch gefärbt.
Die Anzahl an PGCs in der linken und rechten Gonade in 10 zufällig ausgewählten Schnitten
von jedem Embryo wurde gezählt
und der Sterilitätsindex
(IS) wurde unter Verwenden der Gleichung IS = (N – X)/N,
wobei N die Anzahl an PGCs aus den Kontrollgonaden und X die Anzahl
an PGCs aus dem mit Busulfan behandelten Embryo ist, berechnet (Reynaud,
J. Embryol. Exp. Morphol. 21: 485–507, 1969). Die Effekte einer
Behandlung mit Sesamöl,
DMF und Busulfan auf das Überlebensvermögen von
Hühnerembryos
im Stadium 27 wurde bestimmt und das Ausbrütungsvermögen der behandelten Vögel nach
einer Verabreichung von Busulfan wurde ebenfalls festgestellt. Es
wurde gezeigt, dass Busulfan die Anzahl der PGCs, insbesondere mit
einer Dosis von 75 µg,
die in Sesamöl
und DMF emulgiert waren, verringert, obwohl das Überlebensvermögen der
behandelten Embryos ein Viertel bis einhalb mal so groß wie diejenige
war, die bei nicht-injizierten Kontrollen gesehen wurde.
-
In
manchen Ausführungsformen
stellt der vorliegend offenbarte Gegenstand ein Verfahren zum Modulieren
der Anzahl von Urkeimzellen in einem Vogelembryo bereit, wobei das
Verfahren das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen,
das mit Urkeimzellen assoziiert ist, umfasst, wodurch ein durch den
weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration
von Antikörpern
umfasst, die für
das Antigen spezifisch sind, um die Anzahl an endogenen PGCs in
einem Vogelembryo, der innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren.
-
Wie
er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „modulieren" einen Anstieg, eine
Abnehmen oder eine andere Änderung
von irgendeiner oder allen chemischen und biologischen Aktivitäten oder
Eigenschaften eines biochemischen Einheit, z. B. einer PGC. Als
solches kann der Begriff „modulieren" eine Änderung
der Anzahl an PGCs, die in dem sich entwickelnden Embryo vorhanden
sind, in Bezug auf nicht-chimäre
Embryos der gleichen Spezies in dem gleichen Stadium bezeichnen.
Zu Beispiel kann der Begriff „modulieren" „hemmen", „verringern" oder „unterdrücken" bedeuten, die Verwendung
des Wortes „modulieren" ist jedoch nicht auf
diese Definition beschränkt.
-
Wie
sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „hemmen", „verringern", „unterdrücken", „herunterregulieren" und deren grammatikalische
Varianten gegeneinander austauschbar verwendet und beziehen sich
auf eine Aktivität,
bei der die Anzahl oder die Entwicklung der in einem Embryo vorhandenen
PGCs unterhalb derjenigen verringert wird, die in Abwesenheit von
Antikörpern
beobachtet wird, die gegen ein Antigen gerichtet sind, das auf einem
mit PGCs assoziierten Polypeptid vorhanden ist. In einer Ausführungsform
führt die
Hemmung mit einem Antikörpermolekül (zum Beispiel
einem gegen VASA, DAZL, EMA-1 usw. gerichteten IgY) zu einer Abnahme
der Anzahl an PGCs, die in dem Embryo vor der Wiederbevölkerung
mit Donor-PGCs vorhanden sind.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
ist die Anzahl der in einem Vogelembryo vorhandenen PGCs in der Gegenwart
von Antikörpern,
die gegen ein Antigen gerichtet sind, das auf einem mit PGCs assoziierten
Polypeptid vorhanden ist, größer als
bei ihrer Abwesenheit.
-
Der
Begriff „Modulation", wie er hierin verwendet
wird, bezeichnet sowohl eine Hochregulierung (d. h. Aktivierung,
Erhöhung
oder Stimulation) als auch eine Herunterregulierung (d. h. Hemmung,
Verringerung oder Unterdrückung)
der Anzahl an PGCs (oder deren Entwicklung) in dem Embryo vor er
Wiederbevölkerung
mit Donor-PGCs. Der Begriff „Modulation", wenn er unter Bezugnahme
auf eine funktionelle Eigenschaft oder biologische Aktivität oder einen
biologischen Vorgang (z. B. die Entwicklung, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, die Proliferation, von PGCs) verwendet wird, bezeichnet daher
das Vermögen,
eine Qualität,
wie beispielsweise eine Eigenschaft, Aktivität oder einen Vorgang (zu Beispiel
die Entwicklung und Proliferation von PGCs) hochzuregulieren (d.
h. zu aktivieren, erhöhen
oder stimulieren), herunterzuregulieren (d. h. zu hemmen, verringern
oder unterdrücken)
oder anderweitig zu verändern.
-
In
bestimmten Ausführungsformen
des vorliegend offenbarten Gegenstands wird die Anzahl an endogenen
PGCs in dem Empfängervogel
vor dem Einbringen der Donor-PGCs verringert. Auf diese Weise können die
Donor-PGCs die Gonaden des Empfängervogels
wiederbevölkern
und die Effizienz des Erzeugens von chimären Vögeln und den Anteil an Gameten
(und der Nachkommenschaft), die von dem Donorvogel abgeleitet werden,
erhöhen.
Die endogenen PGCs können
um mindestens ungefähr
10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% oder sogar
mehr verringert werden. In weiteren bestimmten Ausführungsformen
ist der Empfängervogel
im Wesentlichen sterilisiert, wie dieser Begriff hierin definiert
ist. Die angestrebte Verringerung der Anzahl an endogenen PGCs in
dem Empfängervogel
kann auf einer Reihe von Überlegungen
basieren, die die gewünschte
Anzahl und Anteile an Gameten, die von dem Donorvogel abgeleitet
werden sollen, die Minimierung jeglicher unerwünschter Effekte, die mit dem
Verfahren zum Erreichen einer Verringerung der endogenen PGCs und
so weiter assoziiert sind, einschließen, jedoch nicht auf diese
beschränkt
sind.
-
Alternativ
dazu können
die vorliegend offenbarten Verfahren so ausgeführt werden, dass das Verhältnis der
Gameten (und/oder der Nachkommenschaft), die von den Donor-PGCs abgeleitet werden,
im Vergleich zu den PGCs des Empfängervogels ungefähr 10/90,
20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20, 90/10 oder mehr
betragen kann. In einigen Ausführungsformen
können
die Verfahren des vorliegend offenbarten Gegenstands so ausgeführt werden,
dass weniger als 50% der Gameten (und/oder der Nachkommenschaft)
von den Donor-PGCs abgeleitet werden. Ein relativ geringer Anteil
an Gameten und oder Nachkommen, die von den Donor-PGCs abgeleitet
wurden, können
für solche
Anwendungen geeignet sein, in denen lediglich eine relativ kleine
Anzahl an Donor-Gameten und/oder – Nachkommen aus den chimären Vögeln notwendig
sind und/oder die Donor-Gameten und/oder -Nachkommen aus den chimären Vögeln von
kommerziellem Wert sind.
-
In
einer Ausführungsform
wird die Anzahl an PGCs in dem Empfängervogel infolge der Gegenwart
von in dem Dotter des Eis abgeschiedenen, maternalen Antikörpern verringert.
Diese Antikörper,
die allgemein als IgY bezeichnet werden, sind dazu in der Lage,
die Entwicklung von PGCs in dem Embryo zu beeinflussen, wenn sie
Antigene, die auf den Polypeptiden vorhanden sind, die mit PGCs
assoziiert sind, in einer Ausführungsform
Antigene, die auf Polypeptiden vorhanden sind, die mit der Migration
oder Entwicklung von PGCs assoziiert sind, binden.
-
Die
Verringerung der PGCs wird durch Immunisieren eines weiblichen Vogels
mit einem mit PGCs assoziierten Antigen erreicht. Das Antigen kann
auf einem Polypeptid vorhanden sein, das mit der Entwicklung von
PGCs assoziiert ist (zum Beispiel ein VASA-Polypeptid) und ein Peptidantigen (zum
Beispiel ein Strang aus 4 oder mehr Aminosäuren eines VASA-Polypeptids)
und ein Kohlenhydratantigen (zum Beispiel ein Kohlenhydratrest,
der posttranslational an das Polypeptid auf der Oberfläche einer
PGC angefügt
wurde) einschließt,
jedoch nicht auf diese beschränkt
ist. Wenn ein weiblicher Vogel mit einem solchen Antigen (oder einer
Vielzahl von Antigenen) immunisiert ist, kann der Vogel eine Immunreaktion
gegen das Antigen erzeugen. Wenn ein immunisierter Vogel ein Ei
erzeugt, werden Antikörper
gegen das Antigen in dem Dotter des Eies abgeschieden. Diese Antikörper sind
dann dazu in der Lage, an ihre verwandten Antigene, die in dem sich
in dem Ei entwickelnden Embryo vorhanden sind, wodurch eine biologische
Aktivität
der innerhalb des sich entwickelnden Embryos vorhandenen Makromoleküle, die
das Antigen enthalten, moduliert wird.
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IV. Verfahren zum Erzeugen chimärer Vögel
-
Der
vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erzeugen
eines chimären
Vogels bereit. In einigen Ausführungsformen
umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels
mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist; b) das Erzeugen
eines Eies aus dem weiblichen Vogel, wobei das Ei eine ausreichend
hohe Konzentration an Antikörpern
umfasst, die für
das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung, die Anzahl an PGCs oder
Kombinationen davon in einem Empfängerembryo, der innerhalb des
Eies vorhanden ist, zu modulieren; und (c) das Verabreichen von
Donor-PGCs an den
Empfängerembryo
in ovo, um einen chimären
Vogel zu erzeugen.
-
Chimäre Vögel wurden
durch Übertragen
von blastodermalen Zellen eines Donors in den Blastoderm eines Empfängervogels
erzeugt, Rückblickend
zusammengefasst in Etches et al., Poult. Sci. 76: 1075, 1997. Chimäre Vögel, insbesondere
Keimbahn-Chimären,
wurden ebenso durch eine Übertragung
von PGCs in Empfängerembryos,
einschließlich
PGCs, die aus dem Germinal Crescent abgeleitet wurden, zirkulierenden PGCs,
die im Blut gefunden werden, und gonadalen PGCs, die in der Genitalleiste
gefunden werden, erzeugt. Rückblickend
zusammengefasst in Tajima, Avian Poult. Biol. Rev. 13: 15–30, 2002.
Es wurde berichtet, dass blastodermale Zellen vermutliche PGCs enthalten
(Kagami et al., Mol. Reprod. Dev. 48: 501, 1997; Ginsburg & Eyal-Giladi,
J. Embryol. Exp. Morphol. 95: 53, 1986), was, wenn es wahr ist,
die Fähigkeit
erklären
könnte, keimbahnchimäre Vögel durch Übertragung
blastodermaler Zellen zu erzeugen. In manchen Ausführungsformen
des vorliegend offenbarten Gegenstands können blastodermale Zellen und/oder
PGCs mittels in der Wissenschaft bekannten Techniken, einschließlich der
Injektion von Zellen in den Sinus terminalis, der Injektion in die
Aorta, der Injektion in den germinalen Crescent, der Injektion in
den Zölom
des Embryos, usw., in die sich entwickelnden Vogelembryos eingebracht
werden.
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Der
größte Teil
der Produktion von Vogelchimären
hat Hühner
verwendet. Siehe z. B. Naito et al., Mol. Reprod. Dev. 39: 153–161, 1994.
Die Produktion chimärer
Vögel ist
jedoch nicht auf Hühner
beschränkt.
Es wurden auch Chimären
in Wachteln erzeugt, indem frühe
blastodermale Zellen aus der Wachtel in Wachtelembryos übertragen
wurden. Siehe Ono et al., Jpn Poult. Sci. 31: 119, 1994. Daneben
wurden interspezifische Chimären
durch Einbringen von blastodermalen Zellen der Wachtel in den Blastoderm
von Hühnern
(Watanabe et al., Development 114: 331–338, 1992) und durch Einbringen
von dissoziierten, germinalen sichelförmigen Zellen aus Truthähnen und/oder
PGCs in Hühnerembryos
(Reynaud, J. Embryol. Exp. Morphol. 21: 485–507, 1969;
U.S. Patent Nr. 6,354,242 ; die U.S.
Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr.
20030111016) erzeugt.
-
Fachleute
werden erkennen, dass die Donor-PGCs vor der Verabreichung an den
Empfängervogel, zum
Beispiel durch Genspaltung und/oder durch Einbringen von einer oder
mehreren heterologen Nukleotidsequenzen genetisch modifiziert werden
können.
Verfahren zum vorübergehenden
oder dauerhaften Einbringen einer heterologen Sequenz in Vogelzellen
sind in der Wissenschaft bekannt siehe z. B. das
U.S. Patent Nr. 5,162,215 von Bosselman
et al.). In einer Ausführungsform
wird die heterologe Nukleotidsequenz dauerhaft in die PGC eingebracht.
Ansätze
zum Einbringen von Nukleinsäuren
von Interesse in Empfängerzellen sind
bekannt und schließen
Lipofektion, Transfektion, Mikroinjektion, Transformation, mikroprojizierende
Techniken usw. ein. Es kann jeder geeignete Vektor, einschließlich Plasmiden,
Viren (einschließlich
Retroviren), Phagen und dergleichen, ob in nativer Form oder als
Derivate derselben, verwendet werden.
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Die
Donor-PGCs können
genetisch modifiziert werden, um so ein gewünschtes Ergebnis in dem Empfängervogel
zu erzeugen (z. B. um ein Transgen zu erzeugen, das eine Geschlechtsbestimmung
bewirkt). Alternativ dazu kann angestrebt werden, dass die genetische
Modifikation an die Nachkommenschaft des chimären Vogels weitergegeben wird
und in dieser ein gewünschter
Effekt erzeugt wird.
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Das
Einbringen von einer oder mehreren heterologen Nukleotidsequenzen
(z. B. einer fremden oder exogenen Sequenz oder einer zusätzlichen
oder modifizierten Kopie einer endogenen Sequenz) kann in einer Vielzahl
von Anwendungen verwendet werden, um zum Beispiel ein Polypeptid
von Interesse in dem Vogel (z. B. in dem Plasma oder den Eiern solcher
Vögel für eine praktische
Sammlung und Reinigung) zu erzeugen. Gemäß dieser Ausführungsform
kann der Vogel im Wesentlichen als Bioreaktor verwendet werden.
Polypeptide von Interesse schließen therapeutische (z. B. für tiermedizinische
oder medizinische Verwendungen) oder immunogene (z. B. für Impfstoffe)
Polypeptide, Antikörper
(einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Antikörperfragmente
und Einzelkettenantikörper),
Enzyme (z. B. industrielle Enzyme), Hormone und Wachstumsfaktoren
oder jedes beliebige andere Protein von Interesse ein.
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Alternativ
dazu kann das Polypeptid ein Reporter-Polypeptid sein, das als Marker
für die
Donorzellen dient (z. B. grünes
fluoreszierendes Protein, β-Galactosidase,
alkalische Phosphatase, β-Lactamase,
Neomycinphosphotransferase und Chloramphenicolacetyltransferase).
Die Marker können,
neben anderen Zwecken, zum Überwachen
der Entwicklung des Embryos und/oder zum Analysieren des Schicksals
und der Migration verwendet werden (siehe z. B. Mozdziak et al.,
Dev. Dynamics 226: 439–445,
2003). Diese Druckschrift dokumentiert die erste erfolgreiche transgene
Linie von Vögeln
für eine
Analyse des Schicksals der Zellen.
-
In
anderen Ausführungsformen
ist das Polypeptid in therapeutisches oder immunogenes Polypeptid oder
irgendein anderes Polypeptid, das einen gewünschten oder günstigen
Effekt auf den Empfängervogel ausübt, z. B.
ein Polypeptid, das einen gewünschten
phänotypischen
Effekt ausübt
oder das Wachstumsvermögen
(einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, erhöhte
Muskelbewegungen und/oder eine verringerte Fettabscheidung und/oder
eine verbesserte Fütterung,
um den Anteil zu erzielen), die Eiproduktion, das Ertragen von Erkrankungen
und dergleichen erhöht.
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Als
weitere Alternative kann die heterologe Nukleinsäure von Interesse für eine antisense-Nukleinsäure, ein
Ribozym (wie es z. B. in dem
U.S.
Patent Nr. 5,877,022 beschrieben ist) oder irgendeine andere nicht-translatierte
RNA kodieren.
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Fachleute
werden verstehen, dass die heterologe Nukleotidsequenz(en) von Interesse
funktionsfähig mit
geeigneten Kontrollsequenzen verknüpft werden können. Zum
Beispiel kann die heterologe Nukleinsäure funktionsfähig mit
Elementen zur Steuerung der Expression, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, Steuersignalen für
die Transkription/Translation, Replikationsursprünge, Signale für eine Polyadenylierung
und interne Ribosomeintrittsstellen (IHRES), Promotoren, Enhancer
und dergleichen, verknüpft
werden.
-
Es
wird ferner erkannt werden, dass eine Vielzahl von Promotor-/Enhancer-Elementen
je nach dem gewünschten
Niveau und der gewünschten
gewebespezifischen Expression verwendet werden kann. Der Promotor/Enhancer
kann in Abhängigkeit
von dem gewünschten
Expressionsmuster konstitutiv oder induzierbar sein. Der Promotor/Enhancer
kann nativ oder fremd und eine natürliche oder synthetische Sequenz
sein. Mit fremd oder exogen soll angegeben werden, dass der Bereich
des Transkriptionsbeginns nicht in dem Wildtyp-Wirt gefunden wird,
in den der Bereich des Transkriptionsbeginns eingebracht wird. In
bestimmten Ausführungsformen
ist (sind) die heterologe Nukleotidsequenz(en) funktionsfähig mit
dem Ovalbuminpromotor oder dem Lysozympromotor verknüpft.
-
In
einer Ausführungsform
werden Promotor-/Enhancer-Elemente, die für die Zielzelle nativ oder
einer Behandlung unterzogen werden, verwendet. In einer anderen
Ausführungsform
werden Promotoren/Enhancer-Elemente, die für die heterologe Nukleinsäuresequenz
nativ sind, verwendet. Das Promotor-/Enhancer-Element ist so ausgewählt, dass
es in der (den) Zielzelle(n) von Interesse funktionieren wird. In
einer noch weiteren Ausführungsform
werden Promotor-/Enhancer-Elemente von Vögeln verwendet. Das Promotor-/Enhancer-Element
kann konstitutiv oder induzierbar sein.
-
Induzierbare
Elemente zur Steuerung der Expression können in solchen Anwendungen
verwendet werden, bei denen es gewünscht ist, eine Regulierung
der Überexpression
der heterologen Nukleinsäuresequenz(en)
bereitzustellen. Induzierbare Promotoren/Enhancer-Elemente für eine Genübertragung
können zell-
oder gewebespezifische Promotor-/Enhancer-Elemente sein. Andere induzierbare Promotor-/Enhancer-Elemente
schließen
durch Hormone induzierbare und durch Metalle induzierbare Elemente
ein. Beispielhafte induzierbare Promotor-/Enhancer-Elemente schließen ein
Tet-An/Aus-Element, einen durch RU486 induzierbaren Promotor, einen
durch Ecdyson induzierbaren Promotor, einen durch Rapamycin induzierbaren Promotor
und einen Metalothionein-Promotor ein, sind jedoch nicht auf diese
beschränkt.
-
In
Ausführungsformen,
in denen (eine) heterologe Nukleinsäuresequenz(en) in den Zielzellen
transkribiert und dann translatiert werden wird, sind allgemein
spezifische Initiierungssignale für eine effiziente Translation
der eingeschleusten Proteinkodierungssequenzen erforderlich. Diese
exogenen Sequenzen zur Steuerung der Translation, die das ATG-Startcodon
und benachbarte Sequenzen einschließen können, können aus vielen Quellen, sowohl
natürlichen
als auch synthetischen, stammen.
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V. Verfahren zum Erhöhen des Anteils an männlichen
Vögeln
in einer Mehrzahl von Vogeleiern
-
In
Vögeln
ist der männliche
Vogel, anders als bei Säugetieren,
das homogametische Geschlecht (ZZ) und der weibliche ist das heterogematische
Geschlecht (Zw). Bei Vögeln
ist es daher der weibliche Vogel, der das Geschlecht der Nachkommen
bestimmt, da er Ovi erzeugt, die das das Geschlecht bestimmende
Chromosom: d. h. entweder das Z- oder das w-Chromosom tragen. Wie hierin angegeben
ist, wird der Prozentsatz an Z-tragenden Ovi, die durch diesen Wirt
erzeugt werden, daher durch Übertragen
männlicher
Urkeimzellen auf weibliche embryonale Wirte erhöht und der Prozentsatz an männlichen
Nachkommen nimmt zu. Ein Anstieg des Prozentsatzes an männlichen
Nachkommen aus den Scharen für
Brathähnchen
ist aufgrund des entsprechend höheren
Umrechnungskurses in Nahrungsmittel und der so erhaltenen, effizienteren
Fleischproduktion ökonomisch
wünschenswert.
-
Wenn
ZZ-PGCs an einen männlichen
Embryo verabreicht werden, sollte ungeachtet des Ausmaßes, bis
zu dem die Donor-PGCs die Gonade des Empfängers kolonisieren, keine Änderung
des Geschlechtsverhältnisses
in der Nachkommenschaft des Empfängers
auftreten. Nur wenn ZZ-PGCs an weibliche (Zw) Empfängerembryos
verabreicht werden, kann eine Umkehr des Geschlechtsverhältnisses
auftreten. Das vorliegende Verfahren kann daher eine Umkehr des
Geschlechtsverhältnisses
bewirken, wenn ZZ-PGCs an weibliche (Zw) Embryos verabreicht werden.
-
Der
Grad, bis zu dem Z-tragende Ovi in dem weiblichen Empfängerembryo
erzeugt werden, wenn er die Geschlechtsreife erreicht hat, und damit
der Grad, bis zu dem der Empfänger
eine männliche
Nachkommenschaft erzeugt, kann von dem Ausmaß, bis zu dem die Donor-ZZ-PGCs
die Gonade des Empfängerembryos
kolonisieren, abhängen.
Es können
verschiedene mögliche
Ergebnisse eintreten. An einem Ende des Spektrums kolonisieren die
Donor-PGCs nicht die Gonade des Embryos und daher würde erwartet,
dass der Empfänger
50% Z-Ovi und 50% w-Ovi erzeugt (d. h. dass keine Umkehr des Geschlechtsverhältnisses
eintreten wird). An dem anderen Ende des Spektrums kolonisieren
die Donor-PGCs vollständig
die Gonade des Embryos bis zum Ausschluss der endogenen PGCs, wobei
erwartet würde,
dass der Empfänger
nur Z-Ovi erzeugt und daher die gesamte Nachkommenschaft des Empfängers männlich werden
würde.
Dementsprechend kann der erwartete Prozentsatz an männlichen
Nachkommen, der von einem weiblichen Empfänger erzeugt werden würde, unter
der Annahme, dass die Donor-PGCs und die endogenen PGCs individuell
gleichermaßen
dazu in der Lage sind, Ovi zu erzeugen (d. h. die erzeugten Ovi
spiegeln den Prozentsatz an endogenen und Donor-PGCs, die in der
Gonade des Embryos vorhanden sind) als 50% + berechnet werden (die
Prozent der Kolonisierung der Gonade des Embryos durch die ZZ-PGCs
geteilt durch 2).
-
Unter
dieser Erwartung sollte eine Maximierung der Prozent Kolonisierung
der Gonade des Embryos durch ZZ-PGCs den Prozentsatz an männlichen
Nachkommen des weiblichen Empfängers
maximieren. Es können
verschiedene Verfahren verwendet werden, um dieses Ziel zu erreichen.
Ein solches Verfahren ist, eine ausreichende Anzahl an Donor-PGCs an den Empfänger zu
verabreichen, so dass die Donor-PGCs die endogenen PGCs signifikant
zahlenmäßig übertreffen.
Es würde
erwartet werden, dass dieser Ansatz am effektivsten wäre, wenn
sich der Empfängerembryo
in einem Stadium vor dem Stadium befindet, in dem die PGCs in die
Gonade des Embryos migrieren.
-
Ein
anderes Verfahren ist, die endogenen PGCs zu entfernen oder ihre
Fähigkeit,
die Gonade des Embryos vor der Verabreichung der Donor-PGCs zu kolonisieren,
zu hemmen. Dies kann durch physikalisches Entfernen der endogenen
PGCs aus dem Embryo durch zum Beispiel Entfernen des Bluts aus dem
Embryo in einem Stadium, in dem die endogenen PGCs in dem Blut des
Embryos zirkulieren, ausgeführt
werden. Siehe Naito et al., Mol. Reprod. Develop. 39: 153, 1994;
Tajima et al., J. Exp. Zool. 280: 265, 1998. Dies ist jedoch eine technisch
anspruchsvolle Manipulation, die eine wesentliche Beschädigung des
Embryos selbst riskiert. Eine Alternative ist, zu verhindern, dass
endogene PGCs die Gonade des Embryos erreichen und/oder kolonisieren.
Verschiedene Berichte beschreiben die Verwendung von Chemikalien
oder Bestrahlung, um dieses Ziel zu erreichen, die Busulfan (siehe
Aige-Gil & Simkiss,
Res. Vet. Sci. 50: 139, 1991; Vick et al., J. Reprod. Fert. 98:
637; Bresler et al., Br. Poultry Sci. 35: 241, 1994; Hallett & Wentworth, Poultry
Sci. 70: 1619, 1991), Concanavalin-A (Lee et al., J. Embryol. Exp.
Morph. 46: 5, 1978) und UV- oder Gamma-Bestrahlung (Reynaud, J.
Embryol. Exp. Morphol. 21: 485–507,
1969; Reynaud, J. Roux's
Arch. Devel. Biol. 179: 85–110,
1976; Aige-Gil & Simkiss,
Br. Poul. Sci. 32: 427–438,
1991; Reynaud, C. R. Hebd. Seances Acad. Sci-D: Sci. Natur 282:
1195, 1976; Mraz & Woody,
Radiation Res. 54: 63–68,
1973; Carscience et al., Development 117: 669–75, 1993; Thoraval et al.,
Poultry Sci. 73: 1897–1905,
1994; Maeda et al., Poultry Sci. 77: 905–07, 1998). Die Verwendung
von toxischen Chemikalien und Bestrahlung ist jedoch, insbesondere
für landwirtschaftlich
wichtige Vogelspezies, nicht optimal.
-
Es
wird hierin ein alternativer Ansatz offenbart, bei dem Antikörper, die
Antigene erkennen die mit PGCs assoziiert sind, in dem Dotter des
Eies, in dem sich der Empfängerembryo
entwickelt, als Folge der Immunisierung der Henne, die das Ei mit
dem Antigen erzeugt, abgeschieden werden. In dieser Ausführungsform werden
weibliche Vögel
mit einem Antigen, das mit PGCs assoziiert ist, immunisiert. Antikörper, die
gegen das Antigen gerichtet sind, werden in dem Dotter von Eiern,
die von den immunisierten weiblichen Tieren erzeugt wurden, abgeschieden.
Die Antikörper
stehen dann zum Modulieren der Entwicklung von PGCs in einem innerhalb
des Eies wachsenden Embryo zur Verfügung. In einer Ausführungsform
bewirken die Antikörper
eine Verringerung der Anzahl der PGCs, die in der Gonade des Embryos
vorhanden sind, so dass die Donor-PGCs, wenn sie dem Empfängerembryo
verabreicht werden, die Gonade kolonisieren und sich darin entwickeln
können.
Der Empfängerembryo
wird dann zum Bebrüten
inkubiert und die Geschlechtsreife erreichen gelassen.
-
Wenn
er zum Erhöhen
der Anzahl oder des Anteils an aus einer Gruppe von Eiern ausgebrüteten, männlichen
Vögeln
verwendet wird, beinhaltet der vorliegend offenbarte Gegenstand
das Verabreichen von Urkeimzellen männlicher (d. h. ZZ) Vögel an einen
weiblichen Vogel in ovo. Das Geschlecht des Vogels kann in ovo vorbestimmt
oder nach der Bebrütung
bestimmt werden. Der Vogel wird dann zum Bebrüten inkubiert, wenn erforderlich,
wird das Geschlecht des Vogels bestimmt, dieser bis zur Geschlechtsreife
aufgezogen und durch Kreuzen des Vogels mit einem geeigneten männlichen
Zuchtstamm gemäß bekannten
Techniken ausgebrütet.
Dann wird eine Vielzahl der von dem Vogel gelegten, befruchteten
Eier gesammelt und üblicherweise zum
Bebrüten
inkubiert und die resultierenden Vögel für wenigstens zwei bis drei
Wochen gezüchtet.
Das Verhältnis
von männlichen
zu weiblichen Bier (oder Vögeln),
die von dem weiblichen Vogel erzeugt wurden, ist größer als
derjenige, der in Abwesenheit des Verabreichens der männlichen
Urkeimzellen an diesen Vogel in ovo erhalten wurde. Solche Verfahren
werden gewöhnlich
bei Vogelspezies verwendet, die für die Fleischproduktion aufgezogen
werden, wie beispielsweise Hühner,
Truthähne,
Enten usw.
-
VI. Verfahren zum Erzeugen von Vogelgameten
-
Der
vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erzeugen
von Vogelgameten bereit. In einer Ausführungsform wird das Verfahren
zum Erzeugen von Vogelgameten aus einer zweiten Vogelspezies in
einer ersten Vogelspezies verwendet. In einer Ausführungsform
umfasst das (a) Immunisieren eines weiblichen Tiers der ersten Vogelspezies
mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch
ein von dem weiblichen Tier erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration
an Antikörpern
umfasst, die für das
Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung eines Empfängervogels
der ersten Vogelspezies, die innerhalb des Eies vorhanden ist, zu
modulieren; (b) das Einführen
von Donor-PGCs, die aus einem Vogel der zweiten Vogelspezies isoliert
wurden, in den Empfängervogel
der ersten Vogelspezies; (c) das Inkubieren des Empfängervogels
der ersten Vogelspezies zum Bebrüten;
und (d) das Aufziehen des Empfängervogels
der ersten Vogelspezies bis zur Geschlechtsreife, wobei der Empfängervogel
der ersten Vogelspezies Gameten aus der zweiten Vogelspezies erzeugt.
-
Wenn
sie für
die Erzeugung und Sammlung von Vogelgameten (Sperma, Ovi) verwendet
werden, können
sich die Urkeimzellen, die in ovo einer Empfängerspezies verabreicht werden,
von der Donorspezies, aus der die Donor-PGCs erhalten wurden, unterscheiden.
Der Empfänger
wird dann zum Bebrüten
inkubiert und bis zur Geschlechtsreife aufgezogen und die Spermazellen
oder Ovi der Donorspezies werden aus dem Empfängertier gesammelt, wobei alles
jeweils gemäß Standardtechniken
erfolgt. Im Fall einer bedrohten Spezies kann der Donorvogelspezies
zum Beispiel ein Schreikranich sein und die Empfängervogelspezies kann ein Kanadakranich
sein. In einem weiteren Beispiel, das die kommerzielle Produktion
von Truthähnen
betrifft, kann die Donorvogelspezies ein Truthahn sein und die Empfängervogelspezies
kann ein Huhn sein.
-
Die
U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr.
20030111016 beschreibt Ansätze
der vorliegenden Miterfinder die Gonade des Embryos einer Vogelspezies
mit Donor-PGCs aus einer anderen Vogelspezies wiederzubevölkern. Embryos
von Barred Plymouth Rock-(BPR-)Hühnern
wurden bis zum Stadium 27 bis 28 (H&H) inkubiert. Die Barred Plymouth
Rock-Donorembryos wurden als Farbmarker verwendet, da sie an dem
Locus I homozygot rezessiv (ii) sind und das Pigment in ihrem Gefieder
exprimieren. Die Gonaden aus den männlichen Embryos wurden in
DMEM, das mit 10% FKS, Glutamin, einer antibiotischen und antimykotischen
Lösung
supplementiert worden war, gesammelt. Die Bestimmung des Geschlechts
des Embryos erfolgte durch Verwenden des Verfahrens von Petitte & Kegelmeyer (Animal
Biotechnol. 6: 19–30,
1995). Dann wurden die Gonaden zweimal in PBS gespült und 15
Minuten lang bei 37°C
in 0,02% EDTA inkubiert. Es wurden frische Medien dazugegeben und
die Gonaden wurden auseinander gezogen.
-
Die
Zellsuspension wurde gesammelt und 5 Minuten lang mit 450 g geschleudert.
Die Medien wurden ausgetauscht und die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwenden
eines Trypanblau-Ausschlusses bestimmt. Es wurden Aliquots der Zellsuspension
genommen und mit SSEA-1-Antikörper
gefärbt,
um die Anzahl an injizierten PGCs zu bestimmen. Annähernd 2–3 µl der Zellsuspension,
die 100 bis 500 PGCs enthielt, wurden in den Stadien 14 bis 17 (H&H) der Entwicklung
in die Blutgefäße von Weißen Leghorn-(WL-)Embryos
injiziert. Die Wal-Embryos dienten als Empfänger, da von ihnen bekannt
war, dass sie homozygot dominant (II) waren. Dieser Genotyp kodiert
für eine
Abwesenheit des Pigments im Gefieder. Nach der Injektion der PGCs
wurden die Eier wieder in den Inkubator eingebracht, um die Entwicklung
zu vollenden. Beim Bebrüten
wurden die phänotypischen
WL-Hühner
vereinigt und anschließend
bis zur Geschlechtsreife gezüchtet.
Die folgenden Testpaarungen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob Keimbahnchimären vorlagen:
männliches
BPR X weibliches WL und männliches
WL X weibliches BPR. Die Nachkommenschaft dieser Testpaarungen wurde
anschließend
beurteilt, um zu bestimmen, ob gonadale PGCs aus männlichen
BPR in die WL eingeführt
wurden. Da nur männliche
BPR- Embryos als
Donor verwendet wurden, stammten alle „schwarzen" Hühner
(BPR-Phänotyp)
aus den Testpaarungen männliches
BPR X weibliches WL.
-
Befruchtete
Truthahneier wurden 8 bis 8,5 Tage lange (Stadium 27 bis 28, H&H) bei 38,5°C inkubiert. Die
Embryos wurden seziert, um die Gonaden zu erhalten. Dann wurden
2–3 µl der gonadalen
Zellsuspension, die annähernd
150 PGCs enthielt, in die Blutgefäße von Hühnerembryos im Stadium 14 (H&H) injiziert.
Die Empfängereier
wurden verschlossen und wieder in den Inkubator eingestellt. Die
Empfängerembryos
wurden in verschiedenen Stadien der Inkubation (Stadium 19 bis Stadium
25) gesammelt. Die Embryos wurden dreimal in PBS gespült und dann über Nacht
bei 4°C
in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Proben wurden dreimal in PBS
gewaschen und dann in 50% Ethanol eingebracht. Dann wurden die Gewebe
dehydriert, in Paraffin eingebettet und geschnitten. Die resultierenden
Sektionen wurden anschließend
immunhistochemisch durch Färben
mit SSEA-1 und Periodsäure-Schiff
(PAS) analysiert. Vorhergehende Forschungen haben einen Unterschied
zwischen den Spezies bei der Expression von SSEA-1 durch PGCs von
Truthahn und Huhn identifiziert. Diese mit dem Standard-PAS-Test
gekoppelte, antigene Variation kann zum Identifizieren von Truthahn-Huhn-Keimbahnchimären verwendet
werden. Beobachtungen der doppelt gefärbten Sektionen der Hühnerembryos
bestätigten,
dass Huhn-PGCs sowohl PAS-positiv als auch SSEA-1-positiv sind.
Eine Doppelfärbung
der Sektionen von Truthähnen
im Stadium 24 mit PAS und SSEA-1 bestätigten, dass Truthahn-PGCs, die
durch das dorsale Gekröse
migrieren und die Gonade kolonisieren, PAS-positiv sind und kein
SSEA-1-Epitop exprimieren. Die Doppelfärbung von Hühner- und Truthahnembryos bestätigte daher,
dass die Technik des doppelten Färbens
als Marker zum Unterscheiden der PGCs von Truthahn gegenüber PGCs
von Huhn verwendet werden könnte.
-
Die
Nachkommenschaft einer WL (II) X BPR (ii)-Kreuzung würde üblicherweise
die WL-Phänotyp
(Ii) exprimieren und eine Abwesenheit des Melaninpigments in dem
Gefieder zeigen. Das Einbringen von männlichen BPR-PGCs in WL-Empfänger führte zu
Nachkommen, die das schwarze Pigmentmuster des BPR zeigten. Diese
Daten bestätigen
das Konzept, dass es keine biologischen Barrieren gibt, die die
Erzeugung einer erhöhten
männlichen
Nachkommenschaft durch Injizieren von PGCs, die aus den Gonaden
von männlichen Embryos
isoliert wurden, in weibliche Hühnerembryos
verhindern würde.
Die Häufigkeit
einer Keimbahntransmission betrug jedoch weniger als 1%. Die geringe Häufigkeit
einer vom Donor anstammenden Nachkommenschaft in diesem System stand
möglicherweise
mit dem signifikanten numerischen Vorteil in Verbindung, den endogene
PGCs im Vergleich zu der Anzahl an injizierten Donor-PGCs zeigten.
Die Behandlung von Embryos mit einer BU + DMF + SO-Emulsion vor
der Injektion von Donor-PGCs verringerte die Anzahl an endogenen PGCs
um so viel wie 97%. Im Vergleich zu BU + SO allein erhöhte die
Zugabe von DMF die Verringerung der endogenen PGCs um annähernd 15%.
-
Nach
der Doppelfärbung
mit SSA-1 und PAS wurden auf Basis der verschiedenen Färbemuster
Huhn- und Truthahn-PGCs in der Gonade des Hühnerembryos identifiziert.
Aufgrund der Gegenwart von Glykogen zeigen sowohl die Hühner- als
auch die Truthahn-PGCs
nach der PAS-Färbung
die Farbe Magenta. Die Truthahn-PGCs sind jedoch nicht länger SSEA-1-positiv,
wenn sie sich in der sich entwickelnden Gonade niederlassen, wodurch
sie sich von den PGCs des Huhns unterscheiden, die in diesem Entwicklungsstadium SSEA-1-positiv
sind. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass aus der Gonade von
embryonalen Truthähnen isolierte
PGCs zum Wiederbevölkern
der Hühner-Gonade
verwendet werden können.
-
In
der U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 20030111016
wurden Weiße
Leghorn-(WL-)Embryos in ovo mit einer Busulfanemulsion (BU + DMF
+ Sesamöl)
behandelt, um die endogenen PGCs zu erschöpfen. Die Gonaden aus männlichen
Barred Plymouth Rock-(BPR-)Embryos wurden gesammelt, die PGCs isoliert
und die isolierten PGCs in ovo den mit der Busulfanemulsion behandelten
Vögeln
und den unbehandelten Kontrollvögeln
verabreicht, wie es im Wesentlichen in dem vorhergehenden Beispiel
beschrieben wurde. Nach dem Bebrüten
wurden die männlichen
chimären
WL-Vögel
bis zur Geschlechtsreife aufgezogen und mit weiblichen BPR-Vögeln gekreuzt.
Die Erzeugung einer schwarzen Nachkommenschaft zeigt eine Transmission
der aus den PR-PGCs stammenden Gameten durch den chimären männlichen
WL-Elter an. Die Ergebnisse gaben an, dass 25 (4/16) der WL-Männchen die
aus den BPR-PGCs stammenden Gameten übertragen. Bei diesen 4 chimären Vögeln beträgt die Transmissionsrate
von 2% bis 23%. Bei den Kontrollvögeln, die keiner Behandlung
mit Busulfan unterzogen wurden, wies nur ein Vogel eine nachweisbare Transmission
der aus den BPR-PGCs stammenden Gameten auf.
-
In
manchen Ausführungsformen
wendet der vorliegend offenbarte Gegenstand Verfahren zum Wiederbevölkern der
Gonade des Embryos einer Vogelspezies mit Donor-PGCs aus der anderen Vogelspezies an,
wie in der U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 20030111016
offenbart ist. Natürlich
wendet der vorliegend offenbarte Gegenstand in solchen Ausführungsformen
auch das Immunisieren eines weiblichen Tiers der ersten Vogelspezies
mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, an, wodurch
ein durch den weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe
Konzentration an Antikörpern
umfasst, die für
das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung eines Empfängervogels
der ersten Vogelspezies, die innerhalb des Eies vorhanden ist, zu
modulieren.
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VII. Verfahren zum Erhöhen der Keimbahntransmission
eines Nukleinsäuremoleküls
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Der
vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erhöhen der
Keimbahntransmission eines Nukleinsäuremoleküls in einem Vogel bereit. In
einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels
mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch
ein durch den weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe
Konzentration an Antikörpern
umfasst, die für das
Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung in einem Empfängervogel,
der innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren; (b) das Verabreichen
einer Vielzahl von Donor-PGCs, die das Nukleinsäuremolekül umfassen an den Empfängervogel
unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zumindest einer der
Vielzahl von PGCs zu ermöglichen,
eine Gonade des Empfängervogels
zu kolonisieren; (c) das Inkubieren des Empfängervogels zum Bebrüten; und
(d) das Aufziehen des Empfängervogels
bis zur Geschlechtsreife, wobei der Empfängervogel Gameten erzeugt,
die aus den Donor-PGCs abgeleitet sind. In dieser Ausführungsform
ist die Keimbahntransmission effizienter gestaltet als bei derzeitigen
Verfahren des Standes des Technik, wobei eine effiziente Erzeugung
von Keimbahnchimären
weiterhin einen Bedarf in der Wissenschaft bildet.
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Das
vorliegende Verfahren basiert auf den gleichen Prinzipien, die vorstehend
erörtert
wurden und sich allgemein auf die Erzeugung von Keimbahnchimären beziehen.
In dieser Ausführungsform
werden die Donor-PGCs jedoch vor der Verabreichung in den Empfängerembryo
in vitro manipuliert, indem ein exogenes Nukleinsäuremolekül (d. h.
ein Transgen) in die PGCs eingebracht wird. Das Verfahren ist weder
durch die Nukleinsäure
selbst (zum Beispiel ein mit einem Promotor funktionsfähig verknüpfter offener
Leserahmen von Interesse) noch durch das Verfahren zur Einbringung
(zum Beispiel Elektroporation, Liposom-vermittelte Transfektion
usw.) begrenzt. Vielmehr wird eine Nukleinsäure von Interesse unter Verwenden
von in der Wissenschaft bekanntere Techniken in eine Vielzahl von
Donor-PGCs eingebracht, die dann einem Empfängerembryo verabreicht werden,
der sich in einem Ei entwickelt, das durch einen weiblichen Vogel
erzeugt wurde, der mit einem Antigen, das mit PGCs assoziiert ist,
immunisiert wurde. Dann wird eine Kolonisierung der Gonade des Embryos
durch die Donor-PGCs zugelassen, wobei dieser, wenn er die Geschlechtsreife
erreicht, die Nukleinsäure
auf seine Nachkommen übertragen
kann.
-
VIII. Verabreichung
-
Es
können
Urkeimzellen (PGCs) bereitgestellt und zum Durchführen des
vorliegend offenbarten Gegenstands vor der Verwendung nach Wunsch
mit einer beliebigen geeigneten Technik formuliert, gelagert, eingefroren,
kultiviert oder dergleichen werden. Zum Beispiel können Urkeimzellen
in einem geeigneten Stadium des Embryos aus den Donorembryos gesammelt
werden. Die Stadien der Vogelentwicklung werden hierin auf eines
der beiden in der Wissenschaft bekannten Einordnungssysteme: das
System von Eyal-Giladi & Kochav (EG&K; siehe Eyal-Giladi & Kochav, Dev.
Biol. 49: 321–327,
1976), das Römische
Ziffern verwendet, um die Phasen der Entwicklung des Pre-primitive
Streak (des Vor-Steißbeins)
zu bezeichnen, und das Einordnungssystem nach Hamburger & Hamilton (H&H; siehe z. B.
Hamburger & Hamilton,
J. Morphol. 88: 49–92,
1951), das Arabische Ziffern verwendet, um Stadien nach dem Legen
zu bezeichnen, bezogen. Soweit nicht anders angegeben ist, sind
die hierin angegeben Stadien Stadien nach dem H&H-Einordnungssystem.
-
Zum
Beispiel können
PGCs im Stadium 4 oder dem germinalen sichelförmigen Stadium bis zum Stadium
30 isoliert werden, wobei die Zellen aus Blut, der Genitalleiste
oder der Gonade in den späteren
Stadien gesammelt werden. Die Urkeimzellen sind allgemein zweimal
so groß wie
somatische Zellen und werden basierend auf der Größe leicht
von diesen unterschieden und getrennt. Männliche (oder homogametische)
Urkeimzellen (ZZ) können
mit einer beliebigen geeigneten Technik, wie beispielsweise dem
Sammeln von Keimzellen aus einem bestimmten Donor und Typisieren
von anderen Zellen aus diesem Donor, wobei die gesammelten Zellen
aus dem gleichen Chromosomentyp wie die typisierten Zellen stammen,
von heterogametischen Urkeimzellen (Zw) unterschieden werden.
-
Die
PGCs können
für eine
Verabreichung an Tiere formuliert werden, indem die Zellen (z. B.
durch mechanische Dissoziierung) verteilt und die Zellen eng mit
einem pharmazeutisch annehmbaren Träger (z. B. einer phosphatgepufferten
Kochsalzlösung)
vermischt werden. Die Urkeimzellen sind in einer Ausführungsform gonadale
Urkeimzellen und in einer anderen Ausführungsform Urkeimzellen aus
dem Blut (wobei „Gonade" und „Blut" das Ursprungsgewebe
derselben in dem ursprünglichen
Donorembryo bezeichnen). Die verabreichten Urkeimzellen können je
nach dem bestimmten Ziel der Verabreichung heterogametisch (Zw)
oder homogametisch (ZZ) sein. Die PGCs können in einem physiologisch
annehmbaren Träger,
in einer Ausführungsform bei
einem pH von ungefähr
6 bis ungefähr
8 oder 8,5, in einer zum Erreichen des gewünschten Effekts geeigneten
Menge (z. B. 100 bis 1000 PGCs pro Embryo) verabreicht werden. Die
PGCs können
frei von anderen Bestandteilen oder Zellen verabreicht werden oder
es können
andere Zellen und Bestandteile zusammen mit den PGCs verabreicht
werden.
-
Die
Verabreichung von Urkeimzellen an das Empfängertier in ovo kann zu jedem
beliebigen Zeitpunkt durchgeführt
werden, an dem die PGCs noch zu den sich entwickelnden Gonaden migrieren
können.
In einer Ausführungsform
wird die Verabreichung von ungefähr
dem Stadium IX gemäß dem Einordnungssystem
nach Eyal-Giladi & Kochav
(EG&K) bis ungefähr dem Stadium
30 gemäß dem Einordnungssystem
der embryonalen Entwicklung nach Hamburger & Hamilton und in einer weiteren Ausführungsform
im Stadium 15 durchgeführt. Bei
Hühnern
liegt der Zeitpunkt der Verabreichung daher während der Tage 1, 2, 3 oder
4 der embryonalen Entwicklung: in einer Ausführungsform Tag 2 bis Tag 2,5.
Die Verabreichung erfolgt üblicherweise
durch Injektion an irgendeine geeignete Zielstelle, wie beispielsweise
den Bereich, der durch das Amnion (einschließlich dem Embryo), den Dottersack
usw., definiert ist. In einer Ausführungsform erfolgt die Injektion
in den Embryo selbst (einschließlich
der Körperwand
des Embryos) und in alternativen Ausführungsformen kann eine intravaskuläre oder
intrazölome
Injektion in den Embryo verwendet werden. Die Verfahren des vorliegend
offenbarten Gegenstands können
nach vorhergehender Sterilisation des Empfängervogels in ovo ausgeführt werden (wobei
eine „Sterilisation" meint, den Vogel
partiell oder vollständig
unfähig
zu machen, von endogenen PGCs stammende Gameten zu erzeugen). Wenn
aus einem solchen Empfänger
Donor-Gameten gesammelt werden, können sie als Mischung mit Gameten
des Donors und des Empfängers
gesammelt werden. Diese Mischung kann dann direkt verwendet werden
oder die Mischung kann weiter verarbeitet werden, um den Anteil der
Donor-Gameten darin zu erhöhen.
-
Die
Verabreichung von PGCs kann durch Verabreichen von PGCs an sich
oder durch Verabreichen von Vorläuferzellen,
die sich zu PGCs entwickeln, an das Testtier ausgeführt werden
(insbesondere, wenn die hierin offenbarten Verfahren dazu verwendet
werden, das Geschlechtsverhältnis
der Nachkommenschaft zu verändern).
Zum Beispiel kann die Verabreichung durch Injizieren von blastodermalen
Zellen in den Vogel ausgeführt
werden, wobei eine Untergruppe der blastodermalen Zellen in dem
Vogel in vivo zu Urkeimzellen differenziert.
-
Die
in ovo-Verabreichung der Urkeimzellen kann mit jeder geeigneten
Technik, entweder auf manuelle oder auf automatisierte Weise, durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform
wird die in ovo-Verabreichung mittels Injektion durchgeführt. Der
Mechanismus der in ovo-Verabreichung ist nicht entscheidend, es
ist jedoch der Mechanismus, der die Gewebe und Organe des Embryos
oder die extraembryonalen Membran, die diesen umgeben, nicht übermäßig schädigen sollte,
so dass die Behandlung die Ausbrütungsrate
nicht übermäßig verringern
wird. Eine Injektionsspritze, die mit einer Nadel von ungefähr 18 bis
26 Gauge ausgestattet ist, ist für
den Zweck geeignet. In Abhängigkeit
von dem genauen Entwicklungsstadium und der Position des Embryos
wird eine 1-Inch-Nadel
entweder in der Flüssigkeit
oberhalb des Huhns oder in dem Huhn selbst eindringen. Vor Einführen der
Nadel kann eine Vorbohrung durch die Schale gestanzt oder gebohrt
werden, um eine Beschädigung
oder Abstumpfung der Nadel zu verhindern. Nach Wunsch kann das Ei
mit einem im Wesentlichen für
Bakterien undurchlässigen
Versigelungsmaterial, wie beispielsweise Wachs oder dergleichen
verschlossen werden, um ein späteres
Eindringen unerwünschter
Bakterien zu verhindern. Es wird ins Auge gefasst, dass ein Hochgeschwindigkeitsinjektionssystem
für Vogelembryos
zum Ausführen
des vorliegend offenbarten Gegenstands besonders geeignet sein wird.
Es sind viele solcher Einrichtungen verfügbar, wobei beispielhafte Einrichtungen
das EMBREX INOVOJECT
TM-System (das in den
U.S. Patenten Nr. 4,681,063 und
4,903,625 von Hebrank) sowie
die in den
U.S. Patenten Nr.
4,040,388 ;
4,469,047 ;
und
4,593,646 von Miller
beschriebenen Einrichtungen sind. Alle diese Einrichtungen umfassen,
nachdem sie zum Ausführen
der hierin offenbarten Verfahren angepasst wurden, einen Injektor,
der eine Formulierung der Urkeimzellen, wie sie hierin beschrieben
sind, enthält,
wobei der Injektor so angeordnet ist, dass er ein von der Vorrichtung
getragenes Ei an der geeigneten Position innerhalb des Eies, wie
es oben erörtert
ist, injiziert. Daneben kann eine funktionsfähig mit der Injektionsvorrichtung
verbundene Verschlussvorrichtung zum Verschließen des Lochs in dem Ei nach
der Injektion bereitgestellt werden.
-
Beispiele
-
Der
vorliegend offenbarte Gegenstand wird nun im Folgenden unter Bezugnahme
auf die beigefügten Beispiele
ausführlicher
beschrieben werden, in denen beispielhafte Ausführungsformen des vorliegend
offenbarten Gegenstands gezeigt sind.
-
Beispiel 1
-
Immunisierung weiblicher Vögel
-
Es
wurden antigene Peptidbereiche von homologen Huhn-DAZL- und Huhn-VASA-Proteinen identifiziert,
synthetisiert und mit Keyhole limpet hemocyanin (KLH) konjugiert.
-
Die
ausgewählten
Peptide sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Ausgewählte
Peptide zur Konjugation und Immunisierung von Legehennen gegen Huhn-VASA und -DAZL
Bezeichnung | Aminosäuresequenzen | Position
des Peptids |
VASA-N | SRP
SSP LSG FPG RPN S (SEQ ID NO: 3) | Aminosäure 42 bis
57 des Huhn-VASA-Homologons (CVH; GENBANK®-Zugangsnr. BAB12337) |
VASA-C | NPR
EMR MSY SET TFK S (SEQ ID NO: 4) | Aminosäure 645
bis 660 des Huhn-VASA-Homologons (CVH; GENBANK®-Zugangsnr. BAB12337) |
DAZL-N | SAN
AEA QCG SIS EDN TH (SEQ ID NO: 7) | Aminosäure 2 bis
17 des Huhn-DAZL-Polypeptids (GENBANK®-Zugangsnr.
AAO26019) |
DAZL-C | SQE
DYF RER AHH FRK G (SEQ ID NO: 8) | Aminosäure 266
bis 281 des Huhn-DAZL-Polypeptids (GENBANK®-Zugangsnr.
AAO26019) |
-
Die
Stammlösungen
(1.000 µg/ml)
der verschiedenen konjugierten Peptide wurden auf 4°C gehalten. Unmittelbar
vor der Immunisierung wurde eine stabile Emulsion aus 0,5 ml konjugiertem
Peptid uns 0,5 ml TITERMAX®-Adjuvans (TMA; CytRx
Corp., Norcross, Georgia, Vereinigte Staaten von Amerika) unter
Verwenden von zwei Spritzen, die durch eine Emulsionsnadel mit doppeltem
Lauf verbunden sind, erzeugt. TMA ist ein synthetisches, nichtionisches
Blockcopolymer aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen.
-
Geschlechtsreife
Leghorn-Weibchen wurden intramuskulär (Pectoralis major) mit 100–200 µg eines einfach
konjugierten Peptids oder einer Kombination von Peptiden immunisiert.
Nach der Immunisierung wurden Blutproben entnommen, über Nacht
bei 4°C
verklumpen gelassen und dann wurden die resultierenden Serumproben
für eine
spätere
Antikörperbestimmung
bei –20°C gelagert.
Eine zweite Immunisierung (50–100 µg konjugiertes
Peptid + TMA) wurde 14 Tage später
verabreicht. Drei Tage nach der zweiten Aufgabe wurden ebenso Blutproben
aus sowohl den immunisierten Hennen als auch den nicht-injizierten
Kontrollen erhalten. Die resultierenden Serumproben wurden für eine spätere Antikörperbestimmung
gelagert.
-
Die
Titer der anti-Peptid-Antikörper
wurden unter Verwenden einer indirekten ELISA-Technik bestimmt.
Die Antigen-(d. h. mit KLH konjugiertes Peptid)Lösungen wurden durch Auflösen des
Antigens in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 20 µg/ml (1
mg auf 50 ml) zubereitet. Wenn das Antigen nicht unmittelbar löslich war,
wurde der pH solange mit 1N NaOH oder 1N HCl mit eingestellt bis
sich das Antigen auflöste.
Um ELISA-Platten herzustellen, wurde die Antigenlösung (0,1
ml) in jede Vertiefung einer hochbindenden Mikrotiterplatte mit
96 Vertiefungen gegeben. Dann wurde die Platte mit einer adhäsiven Folie
abgedeckt und über
Nacht bei Raumtemperatur oder zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Platten dreimal mit 200 µl 0,05%
Tween-20/PBS (pH 7,4, vol:vol) gewaschen. Dann wurden die Platten
auf ein Papiertuch geblottet, um das überschüssige Tween-20/PBS zu entfernen.
Anschließend
wurde die Blockierlösung
(1% BSA in PBS, pH 7,4, gelagert bei 4°C) in jede Vertiefung gegeben
(150 μl).
Die Platten wurden mit einer adhäsiven
Folie abgedeckt und wenigstens 2 Stunden lang bei Raumtemperatur
oder 1 Stunde lang bei 37°C
oder unbegrenzt bei 4–8°C inkubiert.
-
Dann
wurden die Platten weitere dreimal mit 200 µl 0,05% Tween-20/PBS (pH 7,4,
vol:vol) gewaschen und auf ein Papiertuch geblottet, um die überschüssige Waschlösung zu
entfernen. Das Test- oder native Tierserum in 1% BSA/PBS-Puffer
wurde seriell verdünnt
(1:100 bis 1:1.000.000). Es wurden doppelte Proben von 100 µl der Verdünnungen
des Test- oder Kontroll-(d.
h. nicht-immunisierten)serums der Hühner dazugegeben. Die Platten
wurden abgedeckt und über
Nacht bei 4–8°C oder 2
Stunden lang bei 37°C
inkubiert.
-
Die
Platten wurden dreimal mit 200 µl
0,05% Tween-20/PBS (pH 7,4, vol:vol) gewaschen und auf ein Papiertuch
geblottet, um die überschüssige Waschlösung zu
entfernen. 100 µl
einer Ziege- oder Esel-anti-Huhn-(IgM + IgG)HRP-Konjugat-Lösung (1:6000
verdünnt)
in 1% BSA/PBS-Puffer wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Platten
wurden mit einer adhäsiven
Folie abgedeckt und wenigstens 4 Stunden lang bei Raumtemperatur
oder 2 Sunden lang bei 37°C
oder über
Nacht bei 4–8°C inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Platten erneut dreimal mit 200 μl 0,05% Tween-20/PBS
(pH 7,4, vol:vol) gewaschen und auf ein Papiertuch geblottet, um
die überschüssige Waschlösung zu
entfernen.
-
Schließlich wurden
100 µl
Substratlösung
in jede Vertiefung gegeben. Die Substratlösung wurde durch Zugeben von
200 µl
einer 2,2'-Azino-bis-(3-benzthiazolin-6-sulfonsäure-(ABTS-)Farbstofflösung (die
durch Auflösen
von 15 mg ABTS-Farbstoff in 1 ml deionisiertem Wasser hergestellt
wurde) und 10 µl
H
2O
2 auf 10 ml 0,05
M Citratpuffer, pH 4,0 zubereitet. Nach der Zugabe des Substrats
wurden die Platten bei Raumtemperatur inkubieren gelassen und dann
auf einem Plattenlesegerät
bei 405 nm analysiert. Die Titer wurden als letzte Verdünnung bestimmt,
die zu einem Signal führte,
das statistisch gesehen signifikant höher als der Untergrund (d.
h. das aus einer nicht-immunisierten Kontrollhenne isolierte Serum)
bei 405 nm war. Die Titer von Antikörpern aus beispielhaften Hennen
sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Serumtiter gegen Huhn-VASA- und -DAZL-Peptidkonjugate
nach der Immunisierung von Legehennen
Nummer
des Vogels | Antigen | Titer
17 Tage nach der Immunisierung | Titer
40 Tage nach der Immunisierung |
522 | Vasa-C | 1:10.000 | 1:10.000 |
524 | Vasa-C | 1:1.000 | 1:5.000 |
538 | Dazl-C | 1:1.000 | 1:5.000 |
548 | Vasa-C | 1:1.000 | 1:5.000 |
| Vasa-N | 1:1.000 | 1:10.000 |
550 | Vasa-C | 1:1.000 | 1:5.000 |
| Vasa-N | 1:1.000 | 1:5.000 |
552 | Vasa-C | 1:500 | 1:1.000 |
| Vasa-N | 1:1.000 | 1:1.000 |
554 | Dazl-C | 1:10.000 | 1:5.000 |
| Dazl-N | 1:10.000 | 1:5.000 |
556 | Dazl-C | 1:100.000 | 1:100.000 |
| Dazl-N | 1:1.000.000 | 1:1.000.000 |
566 | Vasa-C | Keine
Reaktion | 1:10.000 |
| Vasa-N | 1:10.000 | 1:50.000 |
| Dazl-C | Keine
Reaktion | 1:5.000 |
| Dazl-N | 1:5.000 | 1:10.000 |
-
Beispiel 2
-
Bewertung der PGCs in Embryos im Stadium
27
-
Nach
der Immunisierung wurden die Eier gesammelt, für maximal 14 Tage gelagert
und bis zum Erreichen des Stadiums 27 (H&H) inkubiert. Embryos aus dem Stadium
27 (H&H) wurden
getötet
und über
Nacht bei 4°C
in 4% Paraformaldehyd fixiert. Dann wurden die Embryos in Paraffin
eingebettet und seriell entlang der Genitalleiste mit einer Dicke
von 7 µm
geschnitten. Die Scheiben, die den gonadalen Bereich enthielten,
wurden von den anderen Scheiben gesammelt und die PGCs in den Gonaden
wurden durch immunhistologische Färbung unter Verwenden von monoklonalem
Antikörper
MC-480 (Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of
Iowa, Iowa City, Iowa, Vereinigte Staaten von Amerika), der das
für das
Stadium spezifische embryonale Antigen-1 (SSEA-1) erkennt, identifiziert.
Die immunhistologische Färbung
wurde unter Verwenden von mit Avidin-Biotin konjugierter alkalischer
Phosphatase (VECTASTAIN® ABC-AP-Kit, Vector Laboratories,
Burlingame, Kalifornien, Vereinigte Staaten von Amerika) und BCIP/NBT-(5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblautetrazolium-)Substrat
(Amresco, Inc., Solon, Ohio, Vereinigte Staaten von Amerika) durchgeführt. Kurz
gesagt, wurden die Sektionen nach dem Blockieren in 1,5%-igem normalen
Ziegenserum in PBS für
30 Minuten, um eine nicht-spezifische Färbung auszuschließen, nacheinander
60 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem primären Antikörper (1:1000 verdünnte Aszites)
inkubiert und 3-mal
mit PBS gespült,
30 Minuten lang mit dem biotinylierten zweiten Antikörper inkubiert
und 3-mal mit PBS gespült
und 30 Minuten lang mit dem ABC-Reagens inkubiert. Nach einem finalen
Waschschritt in PBS wurden die Sektionen 15 Minuten lang in dem
alkalischen Phsophatasesubstrat (NBT/BCIP-Lösung, Amresco) gefärbt und
dann in einem wässrigen
Lagermedium gelagert. Beispielhafte Sektionen sind in den 1 bis 3 gezeigt.
-
In 1 wurde
die Henne, die das Ei erzeugte, in dem sich der gezeigte Embryo
entwickelt, mit Peptiden immunisiert, die aus dem Huhn-VASA-Polypeptid
abgeleitet worden waren. Feld A: Kontrolle (keine Immunisierung);
Feld B: Immunisierung mit dem Vasa-C-Peptid (SEQ ID NO: 4); Feld C: Immunisierung
mit dem Vasa-N-Peptid (SEQ ID NO: 3); Feld D: Immunisierung mit
sowohl Vasa-N- als auch Vasa-C. Die SSEA-1+-Zellen
(dunkel gefärbte
Zellen) sind in dem Kontrollembryo viel übermäßiger vorhanden als in irgendeinem
der Embryos, die anti-VASA-Antikörpern
ausgesetzt wurden.
-
In 2 wurde
die Henne, die das Ei erzeugte, in dem sich der gezeigte Embryo
entwickelt, mit Peptiden immunisiert, die aus dem Huhn-DAZL-Polypeptid
abgeleitet worden waren. Feld A: Kontrolle (keine Immunisierung);
Feld B: Immunisierung mit den DAZL-C-Peptid (SEQ ID NO: 8); Feld C: Immunisierung
mit dem DAZL-N-Peptid (SEQ ID NO: 7); Feld D: Immunisierung mit
sowohl DAZL-N als auch mit DAZL-C. Die SSEA-1+-Zellen (dunkel
gefärbte
Zellen) sind in dem Kontrollembryo viel übermäßiger vorhanden als in irgendeinem
der Embryos, die den anti-DAZL-Antikörpern ausgesetzt wurden.
-
In 3 wurde
die Henne, die das Ei erzeugte, in dem sich der gezeigte Embryo
entwickelt, mit Peptiden immunisiert, die sowohl aus dem Huhn-VASA-
als auch dem -DAZL-Polypeptid abgeleitet worden waren. Feld A: Kontrolle
(keine Immunisierung); Feld B: Immunisierung mit Vasa-N-, Vasa-C-,
DAZL-N- und DAZL-C-Peptid (SEQ ID NO: 3, 4, 7 und 8). Die SSEA-1+-Zellen (dunkel gefärbte Zellen) sind in dem Kontrollembryo
viel übermäßiger vorhanden
als in irgendeinem der Embryos, die sowohl den anti-VASA- als auch
den anti-DAZL-Antikörpern
ausgesetzt wurden.
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Eine
Verringerung der PGCs wurde durch Zählen der immunhistochemisch
gefärbten
PGCs in 10 Sektionen von sowohl der linken als auch er rechten Gonade
von jedem Embryo bestimmt. Die 10 Sektionen wurden aus dem mittleren
Bereich der Gonaden ausgewählt.
Zwischen zwei beliebigen ausgewählten
Sektionen wurden mindestens drei Sektionen übersprungen, um zu verhindern,
dass einzelne PGCs mehr als einmal gezählt wurden. Die Ergebnisse
dieser Analyse sind in 4 angegeben. Wie in 4 gezeigt
ist, konnte jedes der Peptidantigene Vasa-N, Vasa-C, Dazl-N und
Dazl-C eine Immunreaktion in Hühnern
hervorrufen, was zu der Abscheidung von anti-Antigen-Antikörpern in
dem Dotter von Eiern, die von den immunisierten weiblichen Vögel erzeugt
worden waren, führte.
Die Gegenwart der Antikörper
in den Eiern verringerte die Anzahl an PGCs in den Embryos im Entwicklungsstadium
27. Das Immunisieren von weiblichen Tieren mit den einzelnen Peptiden
führte
zu einer annähernd
35–55%-igen
Verringerung der Anzahl an endogenen PGCs, während eine Immunisierung mit
zwei oder mehr Peptiden gleichzeitig zu einer annähernd 55–70%-igen
Verringerung der endogenen PGCs führte.
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Statistische
Analyse. Die Unterschiedene in der Behandlung bei der durchschnittlichen
Anzahl an PGCs/Embryo wurde unter Verwenden der GLM-Vorgehensweise
des SAS-Systems
(SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, Vereinigte Staaten von
Amerika) analysiert. Das Modell war PGC = behandelte Henne. Die
Unterschiede in der Behandlung waren bei p < 0,0002 signifikant. Die Mittelwerte
wurden unter Verwenden des Multiple Range Tests von Duncan getrennt.
Außer
Vasa-N waren alle Behandlungen signifikant von der Kontrolle verschieden.
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Beispiel 3
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Wiederbevölkern der behandelten Embryos
mit Keimzellen
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Vögel, die
gemäß den Beispielen
1 und 2 erzeugt worden waren, wurden als Empfänger verwendet und ihnen wurden
exogene PGCs von Donorvögeln
verabreicht.
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A. Herstellung der Donorzellen:
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Die
Gonaden von 5,5 Tage alten Hühnerembryos
werden in PBS gesammelt. Die isolierten Gonaden werden in 250 µl 0,02%
EDTA in einer 35 mm-Petrischale gesammelt und 10 Minuten lang bei
37°C inkubiert. Die
Gonaden werden mit einer Nadel in der Petrischale auseinander gezogen
und weitere 5 Minuten lang bei 37°C
inkubiert. Die Zellen werden in 20% FKS enthaltendem DMEM gesammelt
und 5 Minuten lang mit 450 g zentrifugiert. Die Zellen werden gewaschen
und in DMEM resuspendiert. Die Anzahl der Zellen und deren Lebensfähigkeit
werden bestimmt. Die Endkonzentration der lebensfähigen Zellen
wird auf ungefähr
1000 Zellen/µl
eingestellt.
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B. Herstellung der Empfängerembryos:
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Die
Empfängerhühnerembryos
werden so, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist, hergestellt. Die
Embryos werden bis zum Stadium 14 bis 17 (H&H) in den Inkubator eingestellt.
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C. Injektion von Donor-PGCs in Empfängerembryos:
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Annähernd 2
bis 3 μl
der gonadalen Zellsuspension, die annähernd 100 PGCs enthält, wird
in das Blutgefäß von Empfängerhühnerembryos
im Stadium 14 bis 17 (H&H)
injiziert. Die Empfängereier
werden verschlossen und bei 37,5°C,
60% relative Feuchte inkubiert.
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D. Bewertung der Wiederbevölkerung
mit PGCs
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Die
Embryos werden im Stadium 27 (H&H)
gesammelt und über
Nacht bei 4°C
in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Embryos werden in Paraffin eingebettet,
mit einer Dicke von 7 um geschnitten und immunhistochemisch mit
SSEA-1-Antikörper
gefärbt.
Die Anzahl an PGCs in der linken und rechten Gonade in 10 zufällig ausgewählten Sektionen
von der Kontrolle und den Embryos, denen PGCs injiziert wurden,
wird gezählt.
Die Ergebnisse werden statistisch unter Verwenden eines t-Tests
analysiert, der durchgeführt
wird, um die Nullhypothese, nach der die Differenz zwischen den
Mittelwerten der Populationen, aus denen die beiden Proben stammen,
gleich 0,0 ist, gegenüber
der alternativen Hypothese, nach der die Differenz nicht gleich
0,0 ist, zu testen. Wenn der p-Wert für diesen Test kleiner als 0,05
ist, kann die Nullhypothese am 95% Vertrauensintervall zurückgewiesen
werden. Es wird ebenso ein 95%-Vertrauensintervall für die Differenz
zwischen den Mittelwerten der Populationen bestimmt. Bei wiederholter
Probennahme werden 95,0% aller dieser Intervalle die wahre Differenz
enthalten.
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Beispiel 4
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Erzeugung von intraspezifischen Huhn-Keimbahnchirnären nach
Erschöpfen
der endogenen PGCs
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Zum
Erzeugen intraspezifischer Keimbahnchimären wird die folgende Vorgehensweise
verwendet:
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A. Erzeugung intraspezifischer Huhn-Keimbahnchimären
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Barred
Plymouth Rock(BPR)-Hühnerembryos
werden bis zum Stadium 27 bis 28 (H&H) inkubiert. Die Donorembryos von
Barred Plymouth Rock werden als Farbmarker verwendet, da sie an
dem Locus I homozygot rezessiv (ii) sind und ein Pigment in ihrem
Gefieder erzeugen. Die Gonaden aus den männlichen Embryos werden in
DMEM, das mit 10% FKS, Glutamin, antibiotischer und antimykotischer
Lösung
supplementiert worden war, gesammelt. Die Bestimmung des Geschlechts
der Embryos erfolgt durch Verwenden des Verfahrens nach Petitte & Kegelmeyer (Animal
Biotechnol. 6: 19–30,
1995). Dann werden die Gonaden zweimal in PBS gewaschen und 15 Minuten
lang bei 37% in 0,02% EDTA inkubiert. Es werden frische Medien dazugegeben und
die Gonaden werden auseinander gezogen.
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Die
Zellsuspension wird gesammelt und 5 Minuten lang mit 450 × g geschleudert.
Die Medien werden ausgetauscht und die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwenden
des Trypanblauausschlusses bestimmt. Es werden Aliquots der Zellsuspension
genommen und mit SSEA-1-Antikörper
gefärbt,
um die Anzahl an injizierten PGCs zu bestimmen. Annähernd 2–3 µl der Zellsuspension,
die 100 bis 500 PGCs enthielt, wurden in die Blutgefäße von Weißen Lenghorn-(WL-)Embryos
in den Entwicklungsstadien 14 bis 17 (H&H) injiziert. Die Wal-Embryos dienten
als Empfänger,
da bekannt war, dass sie homozygot dominant (II) waren. Dieser Genotyp
kodiert für
eine Abwesenheit des Pigments in dem Gefieder. Nach der Injektion
der PGCs wurden die Eier wieder in den Inkubator eingestellt, um
die Entwicklung zu beenden. Beim Bebrüten wurden die phänotypischen
WL-Hühner vereinigt
und anschließend
bis zur Geschlechtsreife gezüchtet.
Es wurden die folgenden Testpaarungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob Keimbahnchimären vorhanden
waren: männliches
BPR X weibliches WL (BPR-PGC) und männliches WL (BPR-PGC) X weibliches
BPR. Die Nachkommenschaft dieser Testpaarungen wurden anschließend beurteilt,
um zu bestimmen, ob die gonadalen PGCs aus männlichen BPR in das WL, eingebracht
wurden. Da nur männliche
BPR-Embryos als Donor verwendet wurden, wären alle „schwarzen" Hühner
(BPR-Phänotyp),
die aus den Testpaarungen männliches
BPR X weibliches WL (BPR-PGC) stammten, männlich.
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B. Herstellung der Empfängerembryos
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Die
Empfängerhühnerembryos
werden so, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist, hergestellt. Die
Embryos werden im Stadium 27 (H&H)
gesammelt und über
Nacht bei 4°C
in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Embryos werden in Paraffin eingebettet,
mit einer Dicke von 7 µm
geschnitten und immunhistochemisch mit SSEA-1-Antikörper gefärbt. Die
Anzahl an PGCs in der linken und der rechten Gonade wird in 10 zufällig ausgewählten Sektionen
von jedem Embryo gezählt.
Der Sterilitätsindex
(IS) wird unter Verwenden der Gleichung IS = (N – X)/N, wobei N die Anzahl
an PGCs aus den Kontrollgonaden und X die Anzahl an PGCs aus dem
behandelten Embryo ist, berechnet. (Reynaud, J. Embryol. Morphol.
21: 485–507,
1969).
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C. Herstellung von interspezifischen embryonalen
Truthahn-Huhn-Keimbahnchimären
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Befruchtete
Truthahneier werden 8 bis 8,5 Tage (Stadium 27 bis 28, H&H) bei 38,5°C inkubiert.
Die Embryos werden seziert, um die Gonaden zu erhalten. Dann werden
2–3 µl der gonadalen
Zellsuspension, die annähernd
150 PGCs enthält,
in die Blutgefäße von Hühnerembryos
im Stadium 14 (H&H)
injiziert. Die Empfängereier
werden verschlossen und wieder in den Inkubator eingestellt. Die
Empfängerembryos
werden an verschiedenen Stadien der Inkubation (Stadium 19 bis Stadium
25) gesammelt. Die Embryos werden dreimal in PBS gespült und dann über Nacht
bei 4°C
in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Proben werden dreimal in PBS gewaschen
und dann in 50% Ethanol angeordnet. Dann werden die Gewebe dehydriert,
in Paraffin eingebettet und geschnitten. Die resultierenden Sektionen
werden anschließend
immunhistochemisch durch Färben
mit SSEA-1 und Periodsäure-Schiff
(PAS) analysiert.
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D. Ergebnisse
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Nach
der Doppelfärbung
mit SSEA-1 und PAS werden die Hühner-
und Truthahn-PGCs
in der Gonade des Hühnerembryos
auf Basis der unterschiedlichen Färbemuster identifiziert. Aufgrund
der Gegenwart von Glykogen weisen sowohl die Hühner- als auch die Truthahn-PGCs
nach der Färbung
eine Magentafarbe auf. Die Truthahn-PGCs sind jedoch nicht länger SSEA-1-positiv,
wenn sie sich in der sich entwickelnden Gonade niederlassen wodurch
sie sich von den PGCs der Hühner
unterscheiden, die in diesem Entwicklungsstadium SSEA-1-positiv
sind.
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Die
Nachkommenschaft aus einer WL (II) X BPR (ii)-Kreuzung würde üblicherweise
den WL-Phänotyp (Ii)
exprimieren und eine Abwesenheit des Melaninpigments in dem Gefieder
zeigen.
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Beispiel 5
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Erzeugung von intraspezifischen Chimären und
Testpaarung
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Unter
Verwenden ähnlicher
Protokolle wie denjenigen, die in den vorhergehenden Beispielen
beschrieben wurden werden Weiße
Leghorn-(WL-)Embryos behandelt, um endogene PGCs zu erschöpfen. Die Gonaden
aus den männlichen
Barred Plymouth Rock-(BPR-)Embryos
werden gesammelt, die PGCs isoliert und die isolierten PGCs werden
den behandelten Vögeln
und den unbehandelten Kontrollvögeln
in ovo verabreicht, wie es im Wesentlichen in dem vorhergehenden
Beispiel beschrieben ist. Nach dem Bebrüten werden die männlichen
chimären
WL-(BPR-PGC)Vögel
bis zur Geschlechtsreife aufgezogen und mit weiblichen BPR-Vögeln gekreuzt.
Die Erzeugung einer schwarzen Nachkommenschaft zeugt eine Transmission
der aus den BPR-PGCs stammenden Gameten durch den chimären männlichen
WL-(BPR-PGC)Elter an. Sequenzprotokoll