DE602004012531T2 - Verarmung an endogenen primordialen keimzellen in vogelspezies - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand betrifft Verfahren zum Modulieren der Anzahl von Urkeimzellen (primordial germ cells) in einem Vogel. Insbesondere betrifft der vorliegend offenbarte Gegenstand die Verwendung von Antikörpern, die an Antigene binden, die mit Urkeimzellen assoziiert sind, um die Entwicklung von Urkeimzellen während der Embryogenese in Vögeln zu modulieren. Donor-Urkeimzellen können Vogelembryos verabreicht werden, die in Eiern vorhanden sind, die von Vögeln erzeugt wurden, die mit den vorliegend offenbarten Verfahren behandelt wurden, um chimäre Vögel zu erzeugen.
  • Stand der Technik
  • Chimären sind zusammengesetzte Organismen, die Zellen umfassen, die von mehr als einer Zygote abgeleitet werden. Um die Wechselwirkungen zwischen Zellen zu untersuchen und Analysen über das Schicksal und die Ableitung von Zellen während der Entwicklung durchzuführen, wurden experimentelle Chimären verwendet (McLaren, Mammalian Chimeras. Cambridge University Press, Cambridge, England, Vereinigtes Königreich, 1976). Die Verwendung von Zellen, die aus sehr frühen Embryos isoliert wurden, um Chimären zu erzeugen, können zu Organismen führen, die sich mit einem vollständigen Komplement somatischer Gewebe entwickeln, die zum Teil aus Nachkommen der isolierten Zellen hergestellt wurden. Wenn das Ausgangsmaterial frühe Keimzellen oder deren Vorläufer einschließt, können die resultierenden Chimären Gameten mit Genotypen von sowohl dem Donor als auch dem Empfänger erzeugen. Daneben können Chimären intraspezifisch (d. h. sie enthalten Zellen, die von zwei oder mehr Zygoten der gleichen Spezies abgeleitet werden) oder interspezifisch (d. h. sie enthalten Zellen, die von Zygoten aus wenigstens zwei unterschiedlichen Spezies abgeleitet werden) sein.
  • Die Effizienz des Erzeugens von Keimbahn-Chimären durch Neubesiedeln der Gonaden (Keimdrüsen) mit den gewünschten Urkeimzellen (PGCs) des Donors kann durch Verringern der Anzahl an PGCs in dem Empfänger-Organismus gesteigert werden. Es wurden mehrere Ansätze zum Verringern der PGCs mit verschiedenem Grad an Erfolg eingesetzt. Das kontinuierliche Bestrahlen mit Gammastrahlung (0,3–3,4 R/h von 60Co für 20 Tage) führte zu der vollständigen Zerstörung von Oozyten bei einem Strahlenniveau von 3,4 und 1,8 Röntgen pro Stunde (R/h; Mraz & Woody, Radiation Res. 54: 63–68, 1973). Die Häufigkeit des Ausbrütens war jedoch bei einem Niveau von 0,9 R/h oder mehr verringert. Das Anwenden einer kontinuierlichen Gammabestrahlung mit niedrigem Niveau zum Verringern der Anzahl endogener PGCs ist jedoch aufgrund der relativ kleinen Anzahlen an Eiern, die zu einem beliebigen Zeitpunkt bestrahlt werden können, der erforderlichen langen Bestrahlungsdauer und auch aufgrund der potentiell teratogenen Effekte der Strahlung selbst beschränkt.
  • Es wurde auch eine Kurzeitbestrahlung mit einer Gamma-Quelle versucht (Carscience et al., Development 117: 669–75, 1993; Thoraval et al., Poultry Sci. 73: 1897–1905, 1994; Maeda et al., Poultry Sci. 77: 905–07, 1998). In diesen Studien wurden nicht-inkubierte Eier gerade vor der Injektion von blastodermalen oder Area pellucida-Zellen im Stadium X mit 500–700 rad bestrahlt. Das Auftreten eines Chimärismus in der Keimbahn, der einer Kurzzeit-Gammabestrahlung folgt, war hochvariabel. Die Grundlage für die widersprüchlichen Ergebnisse wurden den „Donorzellen, die an einer geeigneten Position injiziert wurden..." zugeschrieben (Carscience et al., Development 117: 669–75, 1993).
  • Es wurden auch Versuche, Empfängerembryos unter Verwenden von Ultraviolett-(UV-)Licht zu sterilisieren, beschrieben (Reynaud, J. Embryol. Exp. Morphol. 21: 485–507, 1969; Reynaud, J. Roux's Arch Devel. Biol. 179: 85–110, 1976; Aige-Gil & Simkiss, Br. Poul. Sci. 32: 427–438, 1991). Aige-Gil & Simkiss schlossen, dass "es nicht möglich ist, den „Germinal Crescent" (sichelförmiger Bereich) und insbesondere im Stadium 4 der Inkubation zu bestrahlen, ohne größere Anomalitäten zu induzieren". Der Grad der Sterilität schien positiv mit entwicklungsgemäßen Anomalitäten zu korrelieren, wodurch die praktische Verwendung von UV-Licht als Mittel zum Verringern endogener PGCs beschränkt ist.
  • Die Erzeugung von Keimbahn-Chimären bringt sowohl für den Menschen als auch für die verschiedenen Vogelspezies selbst mehrere potentielle Vorteile. Keimbahn-Chimären können als Quelle für Gameten mit gewünschten Eigenschaften verwendet werden, die dann in Verbindung mit Bebrütungsprogrammen verwendet werden, um den Genpool von Vögeln zu vergrößern. Die Fähigkeit, leichter Gameten bestimmter Vogelspezies zu erzeugen, wäre für einen Vogel-Tierarzt und im Bereich der Geflügelerzeugung von Nutzen. Für bedrohte Spezies, wie beispielsweise den Schreikranich, wäre es äußerst nützlich, eine bestehende Quelle für männliche Spermatozoen zu haben. Für kommerzielle Vögel, wie beispielsweise Truthähne, wäre es wünschenswert, männliche Spermatozoen schneller und ökonomischer herzustellen. Für Fleisch erzeugende Schwärme ist gewünscht, Möglichkeiten zum Erhöhen des Anteils an Männchen in dem Schwarm zu haben. Es besteht daher ein Bedarf nach neuen Möglichkeiten zum Erhalten von Vogel-Spermatozoen.
  • Bresler M. et al., „Manipulations of germ-cell populations in the gonad of the fowl", Poultry Sci., Ausg. 35, Nr. 2, Mai 1994, Seite 241–247 offenbaren, dass das Behandeln des Embryos von heimischem Geflügel mit Busulfan die Gonaden partiell sterilisiert. Die partielle Sterilisation wird durch Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, erreicht. Es wird darin jedoch nicht offenbart, dass urkeimlinienspezifische Proteine/Peptide zu einer Modifikation der Entwicklung der Urkeimzelle in dem Embryo führen könnten.
  • Es besteht entsprechend ein lang gehegter und bestehender Bedarf nach Möglichkeiten, die Effizienz der Erzeugung von Keimbahn-Chimären in Vögeln zu erhöhen. Der vorliegend offenbarte Gegenstand geht dieses und andere Bedürfnisse in der Wissenschaft an.
  • Zusammenfassung
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand stellt Verfahren zum Modulieren der Anzahl von Urkeimzellen in einem Vogelembryo bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch ein Ei, das von dem weiblichen Vogel erzeugt wurde, eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die Anzahl an endogenen PGCs in einem innerhalb des Eies vorhandenen Vogelembryo zu modulieren. In einer Ausführungsform ist der weibliche Vogel ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Kanadakranich. In einer weiteren Ausführungsform ist der weibliche Vogel ein Huhn. In einer Ausführungsform umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform führt der Immunisierungsschritt zu einer Abnahme der Zahl von Urkeimzellen in dem Vogelembryo. In einer anderen Ausführungsform führt der Immunisierungsschritt zu einem Anstieg der Anzahl an Urkeimzellen in dem Vogelembryo.
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Modulieren der Entwicklung von Urkeimzellen in einem Vogelembryo bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch ein Ei, das von dem weiblichen Vogel erzeugt wurde, eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die Entwicklung von PGCs in einem innerhalb des Eies vorhandenen Vogelembryo zu modulieren. In einer Ausführungsform umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform ist der weibliche Vogel ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Kanadakranich. In einer weiteren Ausführungsform ist der weibliche Vogel ein Huhn. In einer Ausführungsform führt der Immunisierungsschritt zu einer Hemmung der Entwicklung der Urkeimzellen in dem Vogelembryo. In einer anderen Ausführungsform führt der Immunisierungsschritt zu einer Verstärkung der Entwicklung der Urkeimzellen in dem Vogelembryo.
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erzeugen eines chimären Vogels bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist; (b) das Erzeugen eines Eis aus einem weiblichen Vogel, wobei das Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um in einem innerhalb des Eies vorhandenen Empfängerembryo die Entwicklung der PGCs, die Anzahl der PGCs zu modulieren oder Kombinationen davon; und (c) das Verabreichen von Donor-PGCs an den Empfängerembryo in ovo, um einen chimären Vogel zu erzeugen. In einer Ausführungsform umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform sind die Donor-PGCs von der gleichen Vogelspezies wie der Empfängerembryo. In einer anderen Ausführungsform sind die Donor-PGCs von einer anderen Vogelspezies als der Empfängerembryo. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Inkubieren des chimären Vogels, um ihn zu bebrüten.
  • In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist der weibliche Vogel ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Kanadakranich. In einer Ausführungsform sind die Donor-PGCs von einem Vogelembryo, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Schreikranich. In einer weiteren Ausführungsform tragen die Donor-PGCs ein Paar männliche determinative (Z) Chromosomen. In einer noch weiteren Ausführungsform sind die Donor-PGCs ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen sichelförmigen PGCs.
  • In einer noch weiteren Ausführungsform tragen die Donor-PGCs ein weibliches determinatives (w) Chromosom. In einer Ausführungsform erfolgt das Verabreichen mittels einer in ovo-Injektion. In einer Ausführungsform werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo zwischen ungefähr dem Stadium IX gemäß dem Einordnungssystems nach Eyal-Giladi & Kochav und ungefähr dem Stadium 30 gemäß dem Einordnungssystem nach Hamburger & Hamilton befindet. In einer anderen Ausführungsform werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo nach dem Stadium 14 gemäß dem Einordnungssystem nach Hamburger & Hamilton befindet. In einer noch weiteren Ausführungsform wird der Verabreichungsschritt durch Injizieren von blastodermalen Zellen in den Empfängerembryo durchgeführt, wobei sich die blastodermalen Zellen in dem Empfängerembryo zu Donor-PGCs differenzieren.
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erhöhen des Anteils an männlichen Vögeln in einer Vielzahl von Vogeleiern bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist; (b) das Erzeugen eines Eies aus dem weiblichen Vogel, wodurch das Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung in einem weiblichen Empfängervogel, der innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren; (c) das Verabreichen männlicher ZZ) PGCs an den weiblichen Empfängervogel in ovo; (d) Inkubieren des weiblichen Empfängervogels zum Bebrüten; (e) Aufziehen des weiblichen Empfängervogels bis zur Geschlechtsreife; und (f) Erzeugen einer Vielzahl von Vogeleiern aus dem weiblichen Empfängervogel, wobei der Anteil an männlichen Vögeln in der Vielzahl von Vogeleiern, die durch den weiblichen Empfängervogel erzeugt wurde, höher ist als er sein würde, wenn er in Abwesenheit der Verabreichung der männlichen (ZZ) PGCs an den weiblichen Empfängervogel in ovo erzielt worden wäre. In einer Ausführungsform umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform ist der weibliche Vogel ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn Ente, Wachtel und Kanadakranich. In einer Ausführungsform sind die Donor-PGCs aus der gleichen Vogelspezies wie der Empfängerembryo. In einer weiteren Ausführungsform sind die Donor-PGCs aus einer anderen Vogelspezies als der Empfängerembryo. In einer anderen Ausführungsform sind die PGCs ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen sichelförmigen PGCs. In einer noch weiteren Ausführungsform sind die Donor-PGCs aus einem Vogelembryo, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Schreikranich.
  • In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens erfolgt das Verabreichen mittels in ovo-Injektion. In einer weiteren Ausführungsform werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo zwischen ungefähr dem Stadium IX gemäß dem Einordnungssystems nach Eyal-Giladi & Kochav und ungefähr dem Stadium 30 gemäß dem Einordnungssystem nach Hamburger & Hamilton befindet. In einer anderen Ausführungsform werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo nach dem Stadium 14 gemäß dem Einordnungssystem nach Hamburger & Hamilton befindet. In einer noch weiteren Ausführungsform wird der Verabreichungsschritt durch Injizieren von blastodermalen Zellen in den Empfängerembryo durchgeführt, wobei sich die blastodermalen Zellen in dem Empfängerembryo zu Donor-PGCs differenzieren.
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erzeugen von Vogelgameten aus einer zweiten Vogelspezies in einer ersten Vogelspezies bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels der ersten Vogelspezies mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch ein durch das weibliche Tier erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung eines Empfängervogels der ersten Vogelspezies, die innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren; (b) das Einführen von Donor-PGCs, die aus einem Vogel der zweiten Vogelspezies isoliert wurden, in den Empfängervogel der ersten Vogelspezies; (c) Inkubieren des Empfängervogels der ersten Vogelspezies zum Bebrüten; und (d) Aufziehen des Empfängervogels der ersten Vogelspezies bis zur Geschlechtsreife wobei der Empfängervogel der ersten Vogelspezies Gameten aus der zweiten Vogelspezies erzeugt. In einer Ausführungsform umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform sind die erste Vogelspezies und die zweite Vogelspezies jeweils ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel, Kanadakranich und Schreikranich. In einer Ausführungsform sind die erste Vogelspezies und die zweite Vogelspezies gleich. In einer anderen Ausführungsform sind die erste Vogelspezies und die zweite Vogelspezies verschieden.
  • In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens erfolgt das Verabreichen mittels in ovo-Injektion. In einer weiteren Ausführungsform werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo zwischen ungefähr dem Stadium IX gemäß dem Einordnungssystems nach Eyal-Giladi & Kochav und ungefähr dem Stadium 30 gemäß dem Einordnungssystem nach Hamburger & Hamilton befindet. In einer anderen Ausführungsform werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo nach dem Stadium 14 gemäß dem Einordnungssystem nach Hamburger & Hamilton befindet. In einer noch weiteren Ausführungsform wird der Verabreichungsschritt durch Injizieren von blastodermalen Zellen in den Empfängerembryo durchgeführt, wobei sich die blastodermalen Zellen in dem Empfängerembryo zu Donor-PGCs differenzieren. In einer Ausführungsform sind die PGCs ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen sichelförmigen PGCs.
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Vergrößern der Keimbahntransmission eines Nukleinsäuremoleküls in einem Vogel bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch ein durch den weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung in einem Empfängervogel, der innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren; (b) das Verabreichen einer Vielzahl von Donor-PGCs, die das Nukleinsäuremolekül umfassen, an den Empfängervogel unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zumindest einer der Vielzahl von PGCs zu ermöglichen, eine Gonade des Empfängervogels zu kolonisieren; (c) das Inkubieren des Empfängervogels zum Bebrüten; und (d) Aufziehen des Empfängervogels bis zur Geschlechtsreife, wobei der Empfängervogel Gameten erzeugt, die aus den Donor-PGCs abgeleitet werden. In einer Ausführungsform umfasst das Antigen ein Epitop eines Polypeptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella fragilis und DAZL. In einer Ausführungsform sind der Empfängervogel und die Donor-PGCs jeweils ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel, Kanadakranich und Schreikranich. In einer Ausführungsform sind die Donor-PGCs aus der gleichen Vogelspezies wie der Empfängervogel. In einer weiteren Ausführungsform sind die Donor-PGCs aus einer anderen Vogelspezies als der Empfängervogel. In einer Ausführungsform sind die PGCs ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen sichelförmigen PGCs.
  • In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängervogel zwischen ungefähr dem Stadium IX gemäß dem Einordnungssystems nach Eyal-Giladi & Kochav und ungefähr dem Stadium 30 gemäß dem Einordnungssystem nach Hamburger & Hamilton befindet. In einer anderen Ausführungsform werden die Donor-PGCs verabreicht, wenn sich der Empfängerembryo nach dem Stadium 14 gemäß dem Einordnungssystem nach Hamburger & Hamilton befindet. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Verabreichen durch eine in ovo-Injektion. In einer anderen Ausführungsform wird der Verabreichungsschritt durch Injizieren von blastodermalen Zellen in den Empfängerembryo durchgeführt, wobei sich die blastodermalen Zellen in dem Empfängerembryo zu Donor-PGCs differenzieren.
  • Diese und andere Aspekte des vorliegend offenbarten Gegenstands werden unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung und die beigefügten Figuren ersichtlich. Daneben wird hierin auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen. Jede Unstimmigkeit zwischen diesen Patenten und Veröffentlichungen und der vorliegenden Offenbarung soll zugunsten der vorliegenden Offenbarung beseitigt werden.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Die 1A bis 1D zeigen immunhistologische Analysen der gonadalen Bereiche von Embryos im Stadium 27, die von Hennen erzeugt wurden, die mit Peptiden immunisiert worden waren, die aus dem Huhn-VASA-Polypeptid abgeleitet wurden. Jeder Abschnitt ist mit einem Antikörper gefärbt, der für SSEA-1 spezifisch ist.
  • 1A zeigt Abschnitte aus einem Kontrollembryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die nicht immunisiert worden war. 1B zeigt Abschnitte aus einem Embryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die mit einem Vasa-C-Peptid (SEQ ID NO: 4) immunisiert worden war. 1C zeigt Abschnitte von einer Henne, die mit einem Vasa-N-Peptid (SEQ ID NO: 3) immunisiert worden war. 1D zeigt Abschnitte von einem Embryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die sowohl mit dem Vasa-N- als auch dem Vasa-C-Peptid (SEQ ID NO: 3 bzw. 4) immunisiert worden war. Die SSEA-1+-Zellen (dunkel gefärbte Zellen) sind in dem Kontrollembryo (1A) in viel höherem Überschuss vorhanden als in irgendeinem der Embryos, die anti-VASA-Antikörpern ausgesetzt wurden (1B bis 1D).
  • Die 2A bis 2D zeigen immunhistologische Analysen der gonadalen Bereiche von Embryos im Stadium 27, die von Hennen erzeugt wurden, die mit Peptiden immunisiert worden waren, die aus dem Huhn-DAZL-Polypeptid abgeleitet wurden. Jeder Abschnitt ist mit einem Antikörper gefärbt, der für SSEA-1 spezifisch ist.
  • 2A zeigt Abschnitte aus einem Kontrollembryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die nicht immunisiert worden war. 2B zeigt Abschnitte aus einem Embryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die mit einem DAZL-C-Peptid (SEQ ID NO: 8) immunisiert worden war. 2C zeigt Abschnitte von einer Henne, die mit einem DAZL-N-Peptid (SEQ ID NO: 7) immunisiert worden war. 2D zeigt Abschnitte von einem Embryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die sowohl mit dem DAZL-N- als auch dem DAZL-C-Peptid (SEQ ID NO: 7 bzw. 8) immunisiert worden war. Die SSEA-1+-Zellen (dunkel gefärbte Zellen) sind in dem Kontrollembryo (2A) in viel höherem Überschuss vorhanden als in irgendeinem der Embryos, die anti-DAZL-Antikörpern ausgesetzt wurden (2B bis 2D).
  • Die 3A und 3B zeigen immunhistologische Analysen der gonadalen Bereiche von Embryos im Stadium 27, die von Hennen erzeugt wurden, die mit Peptiden immunisiert worden waren, die sowohl aus dem Huhn-Vasa als auch dem -DAZL-Polypeptid abgeleitet wurden. Jeder Abschnitt ist mit einem Antikörper gefärbt, der für SSEA-1 spezifisch ist.
  • 3A zeigt Abschnitte aus einem Kontrollembryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die nicht immunisiert worden war. 3B zeigt Abschnitte aus einem Embryo, das von einer Henne erzeugt wurde, die mit Vasa-N-, Vasa-C-, DAZL-N- und DAZL-C-Peptiden (SEQ ID NO: 3, 4, 7 und 8) immunisiert worden war. Die SSEA-1+-Zellen (dunkel gefärbte Zellen) sind in dem Kontrollembryo (3A) in viel höherem Überschuss vorhanden als in irgendeinem der Embryos, die sowohl anti-DAZL-Antikörpern als auch anti-VASA-Antikörpern ausgesetzt wurden (3B).
  • 4 ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse der Untersuchung der in den 1 bis 3 beschriebenen Abschnitte zusammenfasst. Die Hennen wurden mit den entsprechenden Peptiden immunisiert und die Eier wurden gesammelt und inkubiert, um das Embryostadium 27 zu erreichen. Die Embryos wurden zur routinemäßigen Histologie verarbeitet, nacheinander zerlegt und mit dem monoklonalen Antikörper MC-480 (anti-SSEA-1) immungefärbt, um die Keimzellen in den sich entwickelnden Gonaden zu identifizieren. Die angegebenen Daten geben die durchschnittliche Anzahl an PGCs, die in 10 Abschnitten von der Genitalleiste von Embryos in Eiern aus 3 immunisierten Hennen für jedes Peptid oder jede Kombination von Peptiden gezählt wurden, wieder.
  • Kurze Beschreibung des Sequenzprotokolls
  • Die SEQ ID NOs: 1 und 2 sind entsprechend eine Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens (open reading frame) von Huhn-VASA (CVH) (GENBANK®-Zugangsnr. AB004836 bzw. BAB12337).
  • Die SEQ ID NOs: 3 und 4 sind die Sequenzen von Peptiden, die Epitope eines Huhn-VASA-(CVH-)Polypeptids umfassen, die zum Immunisieren weiblicher Hühner verwendet wurden. Die SEQ ID NO: 3 ist ein N-terminales Peptid (Vasa-N), das den Aminosäuren 42 bis 57 mit der GENBANK®-Zugangsnr. BAB12337 entspricht, und die SEQ ID NO: 4 ist ein C-terminales Peptid (Vasa-C), die den Aminosäuren 645 bis 660 mit der GENBANK®-Zugangsnr. BAB12337 entspricht.
  • Die SEQ ID Nos: 5 und 6 sind entsprechend eine Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens von Huhn-DAZL (GENBANK-Zugangsnr. AY211387 bzw. AAO26019).
  • Die SEQ ID Nos: 7 und 8 sind die Sequenzen von Peptiden, die Epitope eines Huhn-DAZL-Polypeptids umfassen, die zum Immunisieren weiblicher Hühner verwendet wurden. Die SEQ ID NO: 7 ist ein N-terminales Peptid (Dazl-N), das den Aminosäuren 2 bis 18 mit der GENBANK®-Zugangsnr. AAO26019 entspricht, und die SEQ ID NO: 8 ist ein C-terminales Peptid (DAZL-C), das den Aminosäuren 266 bis 282 mit der GENBANK®-Zugangsnr. AAO26019 entspricht.
  • Ausführliche Beschreibung
  • I. Definitionen
  • Soweit es nicht anderweitig definiert ist, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Fachmann, an den sich der vorliegend offenbarte Gegenstand richtet, verstanden wird. Für eine Klarheit der vorliegenden Beschreibung sind nachfolgend bestimmte Definitionen angegeben.
  • Entsprechend langjähriger Patentpraxis bedeuten die Begriffe „ein" und „einer, eine, eines", wenn sie hierin, einschließlich den Ansprüchen, verwendet werden „eines oder mehrere".
  • Wie er hierin verwendet wird, soll der Begriff „ungefähr", wenn er sich auf einen Wert oder eine Größe der Masse, des Gewichts, der Zeit des Volumens, der Konzentration oder einen Prozentsatz bezieht, Abweichungen von ±20% oder ±10%, in einem anderen Beispiel ±5%, in einem weiteren Beispiel ±1% und einem noch weiteren Beispiel ±0,1% von der angegebenen Größe umfassen, da solche Abweichungen zum Ausführen des vorliegend offenbarten Gegenstands geeignet sind. Soweit es nicht anders angegeben ist, sollen alle in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Zahlen, die Mengen von Inhaltsstoffen, Reaktionsbedingungen und so weiter angeben, so verstanden werden, dass sie immer um den Begriff „ungefähr" abgeändert werden. Soweit nicht anders ausgeführt, sind die in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen angegebenen numerischen Parameter Annäherungen, die je nach den gewünschten Eigenschaften, die man mit dem vorliegend offenbarten Gegenstand zu erreichen wünscht, variieren können.
  • In bestimmten Ausführungsformen verwendet der vorliegend offenbarte Gegenstand Antikörper gegen Antigene, die mit Urkeimzellen assoziiert sind. Der Begriff „Antikörper" und seine grammatikalischen Variationen bezeichnen Immunoglobulin-Moleküle und immunologisch aktive Abschnitte von Immunglobulin-Molekülen, d. h. Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, die ein Antigen spezifisch bindet. Als solche bezeichnet der Begriff Immunoglobulin-Proteine oder funktionelle Abschnitte davon, einschließlich polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, Hybrid-Antikörper, Einzelketten-Antikörper (z. B. einen Einzelketten-Antikörper, der in einer Phagen-Genbank angegeben ist), mutagenisierte Antikörper, humanisierte Antikörper und Antikörper-Fragmente die eine Antigenbindungsstelle umfassen (z. B. Fab- und Fv-Antikörper-Fragmente). „Antikörper" schließen daher monoklonale, chimäre, rekombinante, synthetische, halbsynthetische oder chemisch modifizierte intakte Antikörper mit zum Beispiel Fv-, Fab-, scFv- oder F(ab)2-Fragmenten ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Immunoglobulin-Moleküle des vorliegend offenbarten Gegenstands können von jedem Typ (z. B. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA und IgY), jeder Klasse (z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und IgA2) oder Unterklasse des Immunoglobulin-Moleküls sein.
  • Vögel erzeugen Antikörper, die sich in dem Dotter von Bier anordnen und diese Antikörper werden „IgY" (Dotter-Antikörper, die hauptsächlich Antikörper des IgG-Typs umfassen) genannt. Siehe allgemein Bollen et al., J. Immunol. Meth. 191: 113–120, 1996; Schade et al. (Hrsg.), Chicken Egg Yolk Antibodies, Production and Application: IgY-Technology, Springer Verlag, New York, New York, Vereinigte Staaten von Amerika, 2000. In einer Ausführungsform sind die Antikörper des vorliegend offenbarten Gegenstands Vogel-IgY-Antikörper. Die Antikörper des vorliegend offenbarten Gegenstands können aus jedem beliebigen Ausgangsvogel abgeleitet werden. In manchen Ausführungsformen sind die Antikörper Huhn-IgY-Antikörper.
  • Die Antikörper des vorliegend offenbarten Gegenstands binden an ein Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist. Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „mit Urkeimzellen assoziiert" Antigene, die ein Epitop umfassen, das entweder von einem Polypeptid exprimiert wird oder post-translational an dieses gebunden wird, das von einer Urkeimzelle (zum Beispiel einem Zelloberflächenmarker) oder einer Zelle, die in der Lage ist, die Migration und/oder Entwicklung einer Urkeimzelle zu beeinflussen (zum Beispiel Migrationsfaktoren, Wachstumsfaktoren und Polypeptide, die von Zellen exprimiert werden, die in der Mikroumgebung, in der PGCs vorhanden sind oder sich entwickeln, vorhanden sind) exprimiert wird. Solche Antigene schließen Epitope, die auf einem SSAE-1-, Ovomucin-gleichen Protein-(OLP-), Steel-Faktor-(C-Kit-Ligand-), germ cell-less-, dead end-, VASA-(einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Huhn-VASA-Homologon, CVH-), DAZL-, nanos-, stella- und fragilis-Polypeptid vorhanden sind, und die Antigene, die von den Antikörpern EMA-1, QH-1, FC10.2, S-FC10.2, NC-1, 2C9, QCR1, AGC5, AGC7 und AGC13 erkannt werden, ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Rückblickend zusammengefasst in Tajima, Avian Poultry Biol. Rev. 13: 15–20, 2002. Siehe auch Buehr, Exp. Cell Res. 232, 194–207, 1997; D'Costa & Petitte, Intl. J. Devel. Biol. 43: 349–56, 1999; Urven et al., Development 103: 299–304, 1988; Hay et al., Cell 55: 577–587, 1988; Lasko & Ashburner, Nature 335: 611–617, 1988; Raz, Nature Genetics 4: 690–700, 2003; Houston & King, Development 127: 447–56, 2000; Cooke et al., Hum. Mol. Genet. 5: 513–516, 1996; Kimura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 262: 223–30, 1999; Weidinger et al., Curr. Biol. 13: 1429–34, 2003; und deren Rückbezüge.
  • Wie sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „SSEA-1-Antikörper" und „anti-SSEA-1-Antikörper" gegeneinander austauschbar verwendet und bezeichnen einen Antikörper, in einer Ausführungsform einen IgY-Antikörper und in einer anderen Ausführungsform einen monoklonalen Antikörper, der an das für das Stadium spezifische embryonale Antigen-1 (SSEA-1; Buehr, Exp. Cell Res. 232, 194–207, 1997) bindet. SSEA-1 ist ein Kohlenhydratepitop, das durch eine Galactose (β1→4) Fucose (α1→3) N-Acetylglucosaminbindung bestimmt wird (Gooi et al., Nature 292: 156–158, 1981). Ein monoklonaler Antikörper gegen SSEA-1 wurde durch Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen aus einer Maus, die mit F9-Teratokarzinomzellen immunisiert worden war, entwickelt (Solter & Knowles, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5565–5569, 1978) Der SSEA-1-Antikörper ist ein bekannter immunhistochemischer Marker für die Keimzellen von Vögeln (Karagenc et al., Dev. Genet. 19: 290–301, 1996). In einer Ausführungsform oder der anti-SSEA-1-Antikörper der Klon MC 480, der von der Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of Iowa, Iowa City, Iowa, Vereinigte Staaten von Amerika erhalten werden kann.
  • Wie sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „VASA-Antikörper" und „anti-VASA-Antikörper" gegeneinander austauschbar verwendet und bezeichnen einen Antikörper, in einer Ausführungsform einen IgY-Antikörper, der an ein Vogel-VASA-Polypeptid bindet. VASA ist eine ATP-abhängige RNA-Helicase, die ein Mitglied der DEAD-Box-(Asp-Glu-Ala-Asp) Familie ist. VASA und dessen Orthologa werden im Keimplasma vieler Spezies, einschließlich Zebrabärbling (Danio rerio), Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, exprimiert und wurde in PGCs aus anderen Spezies, einschließlich Xenopus laevis, Maus und Mensch identifiziert (rückblickend zusammengefasst in Raz, Nature Genetics 4: 690–700, 2003). In diesen Spezies wurden VASA und verwandte Polypeptide mit der Keimzellentwicklung, einschließlich der Entwicklung, Proliferation und Differenzierung von Pol-PGCs, sowie der Gametogenese in Verbindung gebracht. Id. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen von Huhn-VASA (auch CVH genannt) können entsprechend unter den GENBANK®-Zugangsnr. AB004836 und BAB12337 gefunden werden.
  • Wie sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „DAZL-Antikörper" und „anti-DAZL-Antikörper" gegeneinander austauschbar verwendet und bezeichnen einen Antikörper, in einer Ausführungsform einen IgY-Antikörper, der an einen Vogel-DAZL-Antikörper bindet. Orthologa von DAZL wurden aus verschiedenen Spezies, einschließlich Zebrabärbling (danio rerio), Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, isoliert und in PGCs aus anderen Spezies, einschließlich Xenopus laevis, Maus und Mensch, identifiziert (rückblickend zusammengefasst in Raz, Nature Genetics 4: 690–700, 2003). Das DAZL-Polypeptid (und dessen Orthologa) ist ein RNA bindendes Protein, das in dem vegetativen Pol des Zebrabärblings und dem Keimplasma von Xenopus sowie in den Eierstöcken und/oder den Hoden mehrerer verschiedener Organismen exprimiert wird. Id. Bei Xenopus, Maus und Mensch wird DAZL in PGCs exprimiert und könnte für die Entwicklung und das Überleben von Zellen in den Gonaden von einem oder beiden Geschlechtern wichtig sein. Siehe Raz, Nature Genetics 4: 690–700, 2003; Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7414–7419, 2001; Houston & King, Development 127: 447–56, 2000; Mita & Yamashita, Mech. Dev. 94: 251–255, 2000; Ruggiu et al., Nature 389: 73–77, 1997; Reijo et al., Nature Genetics 10: 383–393, 195. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen von Huhn-DAZL können entsprechend mit den GENBANK®-Zugangsnr. AY211387 und AAO26019 gefunden werden.
  • Wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „Vogel" und „Vogelspezies" jede Vogelspezies, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Huhn, Truthahn, Ente, Gans, Wachtel, Fasan und Strauß. Es kann jede beliebige der zahlreichen anderen Spezies zum Ausführen des vorliegend offenbarten Gegenstands verwendet werden, insbesondere wenn sie für die Bewahrung bedrohter Spezies, wie beispielsweise des Schreikranichs (wobei der Kanadakranich die Empfänger-Spezies wäre) verwendet wird.
  • Wie er hierin verwendet wird und solange er nicht im Besonderen abgeändert ist, meint der Begriff „Ei" ein Vogelei, das einen lebenden, embryonalen Vogel enthält. Der Begriff „Ei" soll daher ein befruchtetes Vogelei, in einer Ausführungsform ein Ei, das einen Vogelembryo enthält, der dazu in der Lage ist, eine normale Embryogenese zu durchlaufen, bezeichnen.
  • Wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „nativ" und „endogen" eine Zelle oder eine Nukleinsäure, die natürlich in dem Embryo vorhanden ist. Als solches ist eine „endogene PGC" eine PGC, die in einem Embryo vorhanden ist, der sich unter der Steuerung des befruchteten Eies ohne das Einschleusen exogener oder Donor-PGCs entwickelt hat. In ähnlicher Weise ist ein „natives Polypeptid", wenn es in Zusammenhang mit einem Polypeptid verwendet wird, ein Polypeptid, das von einem nativen Gen eines nicht-transformierten Vogels kodiert wird.
  • Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „natürlich vorkommend" ein Merkmal, das in der Natur gefunden wird und sich von einem künstlich durch den Menschen erzeugten unterscheidet. Zum Beispiel ist ein Polypeptid oder eine Nukleotidsequenz, das/die in einem Organismus (einschließlich einem Virus) in seinem/ihren natürlichen Zustand, der nicht absichtlich modifiziert oder vom Menschen im Labor isoliert wurde, vorhanden ist, natürlich vorkommend. Als solches wird ein Polypeptid oder eine Nukleotidsequenz als „nicht natürlich vorkommend" betrachtet, wenn von einem rekombinanten Molekül kodiert wird oder innerhalb eines solchen vorhanden ist, selbst wenn die Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz mit einer in der Natur gefundenen Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz identisch ist.
  • Wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „Nukleinsäure" und „Nukleinsäuremolekül" irgendeines einer Desoxyribonukleinsäure (DNA), einer Ribonukleinsäure (RNA), von Oligonukleotiden, Fragmenten, die durch Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugt wurden und Fragmenten, die durch irgendeines einer Ligation, Spaltung, Endonukleasewirkung und Exonukleasewirkung erzeugt wurden.
  • Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" bezeichnet, wenn die Beziehung zwischen zwei Nukleinsäurebereichen beschrieben wird, eine Nebeneinanderstellung, wobei die Bereiche in einer Beziehung sind, die ihnen ermöglicht, auf ihre angestrebte Weise zu funktionieren. Zum Beispiel ist eine mit einer Kodiersequenz „funktionsfähig verknüpfte" Kontrollsequenz auf eine solche Weise ligiert, dass die Expression der Kodiersequenz unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind, wie wenn beispielsweise die geeigneten Moleküle (z. B. Induktoren und Polymerasen) an die Kontroll- oder regulatorischen Sequenzen) gebunden werden, erreicht wird. In einer Ausführungsform bezeichnet der Ausdruck „funktionsfähig verknüpft" daher einen Promotor, der mit einer Kodiersequenz auf eine solche Weise verbunden ist, dass die Transkription der Kodiersequenz von dem Promotor gesteuert und reguliert wird. Techniken zum funktionsfähigen Verknüpfen eines Promotors mit einer Kodiersequenz sind in der Wissenschaft allgemein bekannt; die exakte Ausrichtung und Position relativ zu einer Kodiersequenz von Interesse hängt unter anderem von der spezifischen Natur des Promotors ab.
  • Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" kann daher einen Promotorbereich bezeichnen, der auf eine solche Weise mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, dass die Transkription der Nukleotidsequenz von dem Promotorbereich gesteuert und reguliert wird. In ähnlicher Weise gilt, dass sich eine Nukleotidsequenz unter der „transkriptionellen Steuerung" eines Promotors befindet, mit dem sie funktionsfähig verknüpft ist. Techniken zum funktionsfähigen Verknüpfen eines Promotorbereichs mit einer Nukleotidsequenz sind in der Wissenschaft bekannt. Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" kann sich auch auf eine Transkriptionsterminierungssequenz oder eine andere Nukleinsäure, die auf eine solche Weise mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, dass die Terminierung der Transkription der Nukleotidsequenz durch die Transkriptionsterminierungssequenz gesteuert wird, beziehen. Daneben kann der Begriff „funktionsfähig verknüpft" eine Enhancer-, Silencer- oder eine andere regulatorische Nukleinsäuresequenz bezeichnen, die, wenn sie funktionsfähig mit einem offenen Leserahmen verknüpft ist, die Expression des offenen Leserahmens entweder auf positive oder negative Weise moduliert.
  • Wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „Polypeptid", „Protein" und „Peptid", die hierin gegeneinander austauschbar verwendet werden, ungeachtet seiner Größe oder Funktion, ein Polymer aus den 20 Proteinaminosäuren oder Aminosäureanaloga. Obwohl ein „Protein" oft unter Bezugnahme auf relativ große Polypeptide verwendet wird und ein „Peptid" oft unter Bezugnahme auf kleine Polypeptide verwendet wird, überschneidet sich die Verwendung dieser Begriffe in der Wissenschaft und variiert. Der Begriff „Polypeptid", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet, soweit es nicht anders angegeben ist, Peptide, Polypeptide und Proteine. Wie sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „Protein", „Polypeptid" und „Peptid", wenn sie sich auf ein Genprodukt beziehen, gegeneinander austauschbar verwendet. Der Begriff „Polypeptid" umfasst Proteine mit allen Funktionen, einschließlich Enzyme. Beispielhafte Polypeptide schließen daher Genprodukte, natürlich vorkommende Proteine, Homologa, Orthologa, Paraloga, Fragmente und andere Äquivalente, Varianten und Analoga der vorhergehenden ein.
  • Wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „Urkeimzelle (primordial germ cell) und „PGC" eine diploide Zelle, die in dem frühen Embryo vorhanden ist und sich zu haploiden Gameten (d. h. Spermatozoen und Ovi) in einem erwachsenen Vogel differenzieren/entwickeln. Urkeimzellen können aus verschiedenen Entwicklungsstadien und aus verschiedenen Orten in einem sich entwickelnden Vogelembryo, wie sie beispielsweise einem Fachmann bekannt sind und die Genitalleiste, die sich entwickelnde Gonade, das Blut und den Germinal Crescent einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind, isoliert werden. Siehe z. B. Chang et al., Cell Biol. Int. 21: 495–9, 1997; Chang et al., Cell Biol. Int. 19: 143–9, 1995; Allioli et al., Dev. Biol. 165: 30–7, 1994; Swift, Am. J. Physiol. 15: 483–516; und die Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 99/06533 . Die Genitalleiste ist ein Abschnitt eines sich entwickelnden Embryos, das einem Fachmann bekannt ist. Siehe z. B., Strelchenko, Theriogenology 45: 130–141, 1996; Lavoir, J. Reprod. Dev. 37: 413–424, 1994. Üblicherweise sind PGCs bei der Periodsäure-Leukofuchsin-Färbung (Periodic acid-Schiff stain, PAS-)Technik positiv gefärbt. In verschiedenen Spezies können PGCs unter Verwenden eines anti-SSEA-Antikörpers identifiziert werden (wobei Truthahn eine beachtenswerte Ausnahme bildet, dessen PGCs das SSEA-Antigen nicht zeigen). Verschiedene Techniken zur Isolierung und Reinigung von PGCs sind in der Wissenschaft bekannt und schließen die Konzentration von PGCs aus Blut unter Verwenden von Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation (Yasuda et al., J. Reprod. Fertil. 96: 521–528, 1992) ein.
  • Der Begriff „Promotor" oder „Promotorbereich" bezeichnet jeweils eine Nukleotidsequenz innerhalb eines Gens, die 5' zu einer Kodiersequenz angeordnet ist und zum Steuern der Transkription der Kodiersequenz fungiert. Der Promotorbereich umfasst eine Stelle für den Transkriptionsbeginn und kann daneben eines oder mehrere transkriptionelle regulatorische Elemente einschließen. In einer Ausführungsform verwendet ein Verfahren des vorliegend offenbarten Gegenstands einen RNA-Polymerase III-Promotor.
  • Ein „minimaler Promotor" ist eine Nukleotidsequenz, die die minimalen Elemente besitzt, die dazu erforderlich sind, um das Auftreten einer Transkription auf dem Grundniveau zu ermöglichen. Als solche sind minimale Promotoren keine vollständigen Promotoren, sondern eher Subsequenzen von Promotoren, die dazu in der Lage sind, ein Grundniveau der Transkription eines Reporterkonstrukts in einem Versuchssystem zu steuern. Minimale Promotoren schließen den minimalen Promotor von CMV, den minimalen Promotor von HSV-tk, den minimalen Promotor des Simian-Virus 40 (SV40), den minimalen Promotor von humanem β-Actin, den minimalen Promotor von humanem EF2, den minimalen Promotor des Adenovirus E1B und den minimalen Promotor des Hitzeschockproteins (hsp) 70 ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Minimale Promotoren werden oft um eines oder mehrere transkriptionelle regulatorische Elemente ergänzt, um die Transkription eines funktionsfähig verknüpften Gens zu beeinflussen. Zum Beispiel können zelltypspezifische oder gewebespezifische transkriptionelle regulatorische Elemente an minimale Promotoren angefügt werden, um rekombinante Promotoren zu erzeugen, die die Transkription einer funktionsfähig verknüpften Nukleotidsequenz auf zelltypspezifische oder gewebespezifische Weise steuern.
  • Verschiedene Promotoren weisen verschiedene Kombinationen transkriptioneller regulatorischer Elemente auf. Ob ein Gen in einer Zelle exprimiert wird oder nicht, hängt von einer Kombination der bestimmten transkriptionellen regulatorischen Elemente ab, die den Promotor des Gens und die verschiedenen Transkriptionsfaktoren ausmachen, die innerhalb dem Kern der Zelle vorhanden sind. Als solche werden Promotoren je nach ihrer funktionalen Aktivität in vivo oder in vitro oft als „konstitutiv", „gewebespezifisch", „zelltypspezifisch" oder „induzierbar" klassifiziert. Zum Beispiel ist ein konstitutiver Promotor einer, der dazu in der Lage ist, die Transkription eines Gens in einer Vielzahl von Zelltypen zu steuern. Beispielhafte konstitutive Promotoren schließen die Promotoren für die folgenden Gene, die bestimmte konstitutive oder „Haushalts-„ Gene kodieren, ein:
    Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT), Dihydrofolatreduktase (DHFR; Scharfmann et al., 1991), Adenosindeaminase, Phosphoglyceratkinase (PGK), Pyruvatkinase, Phosphoglyceratmutase, der β-Actin-Promotor (siehe z. B. Williams et al., 1993) und andere, in der Wissenschaft bekannte konstitutive Promotoren. Zum anderen steuern „gewebespezifische" oder „zelltypspezifische" Promotoren die Transkription in manchen Geweben und Zelltypen, sind jedoch in anderen inaktiv. Beispielhafte gewebespezifische Promotoren schließen jene Promotoren, die nachfolgend ausführlicher beschrieben sind, sowie andere gewebespezifische und zelltypspezifische Promotoren, die einem Fachmann bekannt sind, ein.
  • Wenn er in Verbindung mit einem Promotor verwendet wird, bezeichnet der Begriff „verknüpft", wie er hierin verwendet wird, eine physikalische Nähe der Promotorelemente, so dass sie zusammen ein Steuern der Transkription einer funktionsfähig verknüpften Nukleotidsequenz bewirken.
  • Der Begriff „transkriptionelle regulatorische Sequenz" oder „transkriptionelles regulatorisches Element", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jeweils eine Nukleotidsequenz innerhalb des Promotorbereichs, der das Reaktionsvermögen auf einen regulatorischen Transkriptionsfaktor ermöglicht. Das Reaktionsvermögen kann eine Abnahme oder eine Zunahme der transkriptionellen Ausgangsleistung umfassen und wird durch Binden des Transkriptionsfaktors an das DNA-Molekül, das das transkriptionelle regulatorische Element umfasst, vermittelt. In einer Ausführungsform ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eine Transkriptionsterminierungssequenz, die hierin alternativ als Transkriptionsterminierungssignal bezeichnet wird.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „Signifikanz" oder „signifikant" auf eine statistische Analyse der Wahrscheinlichkeit, dass ein nicht-zufälliger Zusammenhang zwischen zwei der mehr Resten besteht. Um zu bestimmen ob eine Beziehung „signifikant" ist oder „Signifikanz" besitzt oder nicht, können statistische Manipulationen der Daten durchgeführt werden, um eine Wahrscheinlichkeit, die als „p-Wert" ausgedrückt wird, zu berechnen. Jene p-Werte, die unter einen benutzerdefinierten Endpunkt fallen, werden als signifikant angesehen. In einem Beispiel wird ein p-Wert von weniger als oder gleich 0,05, in einem anderen Beispiel von weniger als 0,01, in einem weiteren Beispiel von weniger als 0,005 und in einem noch weiteren Beispiel von weniger als 0,001 als signifikant angesehen.
  • Der Begriff „regulatorische Sequenz" ist ein generischer Begriff, der in der gesamten Beschreibung dazu verwendet wird, Polynukleotidsequenzen, wie beispielsweise Initiierungssignale, Enhancer, Regulatoren, Promotoren und Terminierungssequenzen zu bezeichnen, die notwendig oder gewünscht sind, um die Expression kodierender und nicht-kodierender Sequenzen, mit denen sie funktionsfähig verknüpft sind, zu beeinflussen. Beispielhafte regulatorische Sequenzen sind bei Goeddel, 1990 beschrieben und schließen zum Beispiel die frühen und späten Promotoren des Simianvirus 40 (SV40), den unmittelbaren frühen Promotor von Adenovirus oder Cytomegalovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC- oder TRC-System, den T7-Promotor, dessen Expression durch die T7-RNA-Polymerase gesteuert wird, die Hauptoperator- und -promotorbereiche des Phagen Lambda, die Steuerbereiche für das fd-Hüllprotein, den Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, die Promotoren der Säurephosphatase, z. B. Pho5, die Promotoren der Hefe-A-Paarungsfaktoren, der Polyhedronpromotor des Baculovirussystems und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen oder deren Viren steuern, und verschiedene Kombinationen derselben, ein. Die Natur und Verwendung solcher Kontrollsequenzen kann in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus variieren. Bei Prokaryoten schließen solche regulatorischen Sequenzen allgemein Promotorsequenzen, Sequenzen für die Ribosomenbindungsstelle und Transkriptionsterminierungssequenzen ein. Der Begriff „regulatorische Sequenz" soll mindestens solche Bestandteile einschließen, deren Gegenwart die Expression kann und er kann auch weitere Bestandteile einschließen, deren Gegenwart von Vorteil ist, wie beispielsweise Leader-Sequenzen und Fusionspartnersequenzen.
  • In bestimmten Ausführungsformen befindet sich die Transkription einer Polynukleotidsequenz unter der Steuerung einer Promotorsequenz (oder einer anderen regulatorischen Sequenz), die die Expression des Polynukleotids in einem Zelltyp steuert, in dem die Expression erfolgen soll. Es wird auch verstanden, dass sich das Polynukleotid unter der Steuerung von regulatorischen Sequenzen befinden kann, die gleich oder anders sind als diejenigen Sequenzen, die die Expression der natürlich vorkommenden Form des Polynukleotids steuern.
  • Der Begriff „Reportergen" bezeichnet eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Protein kodiert, das entweder durch seine Gegenwart oder durch seine Aktivität leicht nachweisbar ist und Luciferase, fluoreszierendes Protein (z. B. grünes fluoreszierendes Protein), Chloramphenicolacetyltransferase, β-Galactosidase, sekretierte alkalische Phosphatase der Plazenta, β-Lactamase, humanes Wachstumshormon und andere sekretierte Enzymreporter einschließt, jedoch nicht auf diese beschränkt ist. Allgemein kodiert ein Reportergen für ein Polypeptid, das ansonsten nicht von der Wirtszelle erzeugt wird und durch eine Analyse der Zelle(n), z. B. durch direkte fluorometrische, radioisotopische oder spektrophotometrische Analyse der Zelle(n) und üblicherweise ohne die Zellen für die Analyse des Signals abtöten zu müssen, nachweisbar ist. In bestimmten Fällen kodiert ein Reportergen für ein Enzym, das eine Veränderung der fluorometrischen Eigenschaften der Wirtszelle hervorruft und durch eine qualitative, quantitative oder halbquantitative Funktion oder durch Aktivierung der Transkription nachweisbar ist. Beispielhafte Enzyme schließen Esterasen, β-Lactamase, Phosphatasen, Peroxidasen, Proteasen (Gewebeplasminogenaktivator oder Urokinase) und andere Enzyme, deren Funktion mit geeigneten chromogenen oder fluorogenen Substraten, die Fachleuten bekannt sind oder in der Zukunft entwickelt werden, nachgewiesen werden können, ein.
  • Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „Transkriptionsfaktor" ein Protein aus dem Zytoplasma oder aus dem Kern, das an ein Gen bindet oder an ein RNA-Transkript eines Gens bindet oder an eines anderes Protein bindet, das an ein Gen oder ein RNA-Transkript oder ein anderes Protein bindet, das wiederum an ein Gen oder ein RNA-Transkript bindet, um dadurch die Expression des Gens zu modulieren. Eine solche Modulation kann daneben durch andere Mechanismen erreicht werden; das Wesentliche eines „Transkriptionsfaktors für ein Gen" wird einem Faktor zugeschrieben, der das Niveau der Transkription des Gens auf irgendeine Weise ändert. Der Begriff „Transkriptionsfaktor" kann allgemein auch ein Protein bezeichnen, das die Expression des Gens durch eine Wechselwirkung mit dem transkriptionellen regulatorischen Element und zellulärer Bestandteilen für die Transkription, einschließlich RNA-Polymerase, mit der Transkription assoziierten Faktoren (TAFs), Chromatin-Remodeling-Proteinen, und irgendeinem anderen relevanten Protein, das die Transkription des Gens beeinträchtigt, moduliert.
  • Der Begriff „Vektor" bezeichnet eine Nukleinsäure, die dazu in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, mit der sie verknüpft wurde, zu transportieren. Ein Typ eines Vektors, der gemäß dem vorliegend offenbarten Gegenstand verwendet werden kann, ist ein Episom, d. h. eine Nukleinsäure, die zu extrachromosomaler Replikation in der Lage ist. Andere Vektoren schließen solche eine, die zu autonomer Replikation und Expression von Nukleinsäuren, mit denen sie verknüpft wurden, in der Lage sind. Vektoren, die dazu in der Lage sind, die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verknüpft sind, zu steuern, werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Allgemein liegen Expressionsvektoren zur Verwendung in rekombinanten DNA-Techniken oft in der Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung werden „Plasmid" und „Vektor" gegeneinander austauschbar verwendet, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Der vorliegend offenbarte Gegenstand soll jedoch solche anderen Formen von Expressionsvektoren einschließen, die äquivalenten Funktionen dienen und demnach entsprechend in der Wissenschaft bekannt werden.
  • Der Begriff „Expressionsvektor", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine DNA-Sequenz, die dazu in der Lage ist, die Expression einer bestimmten Nukleotidsequenz in einer geeigneten Wirtszelle zu steuern und einen Promotor umfasst, der funktionsfähig mit der Nukleotidsequenz von Interesse verknüpft ist, die funktionsfähig mit Transkriptionsterminierungssequenzen verknüpft ist. Üblicherweise umfasst er auch Sequenzen, die für eine korrekte Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind. Das die Nukleotidsequenz umfassende Konstrukt kann chimär sein. Das Konstrukt kann auch eines sein, das natürlich vorkommt, jedoch in rekombinanter Form erhalten wurde, die für eine heterologe Expression von Nutzen ist. Die Nukleotidsequenz von Interesse, einschließlich beliebiger weiterer Sequenzen, die dazu konstruiert wurden, eine korrekte Expression der Nukleotidsequenzen zu bewirken, kann auch als „Expressionskassette" bezeichnet werden.
  • Die Begriffe „heterologes Gen", „heterologe DNA-Sequenz", „heterologe Nukleotidsequenz", „exogenes Nukleinsäuremolekül" oder „exogenes DNA-Segment", wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen jeweils eine Sequenz, die aus einer Quelle abgeleitet wird, die für die angestrebte Wirtszelle fremd ist, oder, wenn sie aus der gleichen Quelle abgeleitet wird, von ihrer ursprünglichen Form modifiziert wurde. Daher schließt ein heterologes Gen in einer Wirtszelle ein Gen ein das für die bestimmte Wirtszelle endogen ist, jedoch zum Beispiel durch Mutagenese oder durch Isolierung aus den nativen transkriptionellen regulatorischen Sequenzen modifiziert wurde. Die Begriffe schließen auch nicht natürlich vorkommende multiple Kopien einer natürlich vorkommenden Nukleotidsequenz ein. Die Begriffe bezeichnen deshalb ein DNA-Segment, das für die Zelle fremd oder heterolog ist oder für die Zelle homolog ist, jedoch in einer Position innerhalb der Nukleinsäure der Wirtszelle, in der das Element normalerweise nicht gefunden wird.
  • Zwei Nukleinsäuren sind „rekombiniert", wenn die Sequenzen von jeder der beiden Nukleinsäuren in einer Nukleinsäure der Nachkommenschaft miteinander kombiniert sind. Zwei Sequenzen gelten als „direkt" rekombiniert, wenn beide Nukleinsäuren Substrate für die Rekombination sind. Zwei Sequenzen gelten als „indirekt rekombiniert", wenn die Sequenzen unter Verwenden eines Intermediats, wie beispielsweise eines Crossover-Oligonukleotids, rekombiniert sind. Bei einer indirekten Rekombination ist nicht mehr als eine der Sequenzen ein tatsächliches Substrat für die Rekombination und in manchen Fällen ist keine der Sequenzen ein Substrat für die Rekombination.
  • Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „regulatorische Elemente" Nukleotidsequenzen, die an der Steuerung der Expression einer Nukleotidsequenz beteiligt sind. Regulatorische Elemente können einen Promotor umfassen, der funktionsfähig mit der Nukleotidsequenz von Interesse und Terminierungssignalen verknüpft ist. Regulatorische Sequenzen schließen auch Enhancer und Silencer ein. Sie schließen üblicherweise auch Sequenzen ein, die für eine korrekte Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind.
  • Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „signifikanter Anstieg" die Erhöhung einer Menge (zum Beispiel einer Anzahl an PGCs), die größer als der der Messtechnik innewohnende Fehlerbereich ist, in einer Ausführungsform einen Anstieg um ungefähr 10% oder mehr oberhalb einer Grundmenge (zum Beispiel die durchschnittliche Anzahl an PGCs, die an einer bestimmten Position in einem bestimmten Stadium der Entwicklung in einem unbehandelten Embryo des Wildtyps vorhanden ist), in einer weiteren Ausführungsform einen Anstieg um ungefähr 25% oder mehr und in einer noch weiteren Ausführungsform einen Anstieg um ungefähr 50% oder mehr.
  • Wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „signifikant weniger" oder „signifikant verringert" eine Menge (zum Beispiel eine Anzahl von PGCs), die um mehr als dem der Messtechnik innewohnenden Fehlerbereich verringert ist, in einer Ausführungsform eine Abnahme um ungefähr 10% oder mehr in Bezug auf eine Grundmenge (zum Beispiel die durchschnittliche Anzahl an PGCs, die an einer bestimmten Position in einem bestimmten Stadium der Entwicklung in einem unbehandelten Embryo des Wildtyps vorhanden ist), in einer weiteren Ausführungsform eine Abnahme um ungefähr 25% oder mehr und in einer noch weiteren Ausführungsform eine Abnahme um ungefähr 50% oder mehr.
  • Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „spezifische Bindung" und dessen grammatikalische Varianten eine Bindungsaffinität, die ein Antikörper zu einem verwandten Epitop aufweist. Unter Bezugnahme auf die offenbarten Verfahren soll eine „spezifische Bindung" eine Bindung zwischen einem Antikörper (zu Beispiel einem IgY-Molekül) und einem Antigen unter physiologischen Bedingungen (zum Beispiel innerhalb einer Position, in der PGCs in einem Vogelembryo gefunden werden können) einschließen, die zu einer Modulation der normalen biologischen Aktivität des das Epitop umfassenden Makromoleküls führt. Anders ausgedrückt wird in einer Ausführungsform eine Wechselwirkung zwischen einem IgY-Molekül und einem Epitop als spezifisch angesehen, wenn eine biologische Aktivität des Makromoleküls, an das das IgY-Molekül in einem sich entwickelnden Embryo bindet, relativ zu der Aktivität des Makromoleküls in einem anderen sich entwickelnden Embryo in einem ähnlichen Stadium in der Abwesenheit des IgY-Moleküls verändert wird.
  • Als solches bezeichnen die Ausdrücke „bindet spezifisch (oder selektiv) an einen Antikörper" und „spezifisch immunreaktiv mit", wenn sie sich auf ein Epitop beziehen, das auf einem Polypeptid oder Peptid vorhanden ist, eine Bindungsreaktion, die für die Gegenwart des Polypeptids in der Gegenwart einer heterogenen Population von Polypeptiden und anderen biologischen Präparaten bestimmend ist. Daher binden die bestimmten Antikörper unter den vorgesehenen Bedingungen eines Immunoassays an ein bestimmtes Polypeptid und binden nicht in einer signifikanten Menge an andere, in der Probe vorhandene Polypeptide. Die spezifische Bindung an einen Antikörper unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der aufgrund seiner Spezifität für ein bestimmtes Polypeptid ausgewählt wird. Zum Beispiel können Antikörper, die gegen ein Antigen gerichtet sind, das mit PGCs assoziiert ist, ausgewählt werden, um Antikörper zu erhalten, die spezifisch mit diese Antigen und nicht mit anderen Antigenen immunreaktiv sind. Es kann eine Vielzahl von Immunoassay-Vorlagen verwendet werden, um Antikörper auszuwählen, die spezifisch mit einem bestimmten Polypeptid immunreaktiv sind. Zum Beispiel werden routinemäßig Festphasen-ELISA-Immunoassays, Western Blots oder Immunhistochemie dazu verwendet, um monoklonale Antikörper auszuwählen, die spezifisch mit einem Polypeptid immunreaktiv sind. Siehe Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, Vereinigte Staaten von Amerika, 1988, für eine Beschreibung von Immunoassay-Vorlagen und -bedingungen, die zum Bestimmen der spezifischen Immunreaktivität verwendet werden können. Üblicherweise wird eine spezifische oder selektive Reaktion wenigstens zweimal so groß wie das Untergrundsignal oder Rauschen und meistens mehr als 10- bis 100-mal so groß wie der Untergrund sein.
  • Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „Transformation" einen Vorgang zum Einschleusen von heterologer DNA in eine Vogelzelle, ein Vogelgewebe oder einen Vogel. Es wird verstanden, dass transformierte Vogelzellen, Vogelgewebe und Vögel nicht nur das Endprodukt eines Transformationsvorgangs, sondern auch deren transgene Nachkommenschaft umfassen.
  • Wie sie hierin verwendet werden, bezeichnen die Begriffe „transformiert", „transgen" und „rekombinant" einen Wirtsorganismus, wie beispielsweise eine Vogel-PGC, in die ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingeschleust wurde. Das Nukleinsäuremolekül kann stabil in das Genom des Wirts eingebaut sein oder auch als extrachromosomales Molekül vorhanden sein. Ein solches extrachromosomales Molekül kann autoreplizierend sein. Es wird verstanden, dass transformierte Zellen, Gewebe oder Zellen nicht nur das Endprodukt eines Transformationsvorgangs, sondern auch deren transgene Nachkommenschaft einschließen. Ein „nicht-transformierter", „nicht-transgener" oder „nicht-rekombinanter" Wirt bezeichnet einen Wildtyp-Organismus, z. B. eine Wildtyp-Vogel-PGC, die das heterologe Nukleinsäuremolekül nicht enthält.
  • II. Immunisieren von Vögeln und die Abscheidung von Antikörpern in Eidotter
  • Vögel und insbesondere Hühner wurden zu einer zunehmend üblichen Quelle für die Erzeugung polyklonaler Antikörper in großem Maßstab, da große Mengen der Antikörper während der Eiproduktion aus dem Serum in die Eidotter überführt werden. Siehe Rose et al., Eur. J. Immunol. 4: 521, 1974. Der vorliegend offenbarte Gegenstand macht sich dieses Phänomen zunutze, um die PGC-Entwicklung in Embryos durch Immunisieren von weiblichen Vögeln mit Antigenen, die mit PGCs assoziiert sind und sich im Dotter ansammeln, zu bewirken. Diese Antikörper können dann während der Embryogenese des Vogels an ihre verwandten Antigene binden, wodurch sie die biologischen Aktivitäten der Polypeptide, die mit der Entwicklung von PGCs assoziiert sind, beeinflussen.
  • A. Antigene und Epitope
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand schließt Polypeptide ein, die Epitope des Polypeptids, das zum Erzeugen von IgY-Antikörpern, die an die Epitope binden, verwendet werden kann, umfassen oder alternativ aus diesen bestehen. In alternativen, nicht einschränkenden Ausführungsformen umfassen die Polypeptide eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 2 oder 6 und die Epitope sind auf Peptidantigenen mit einer Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 3, 4, 7 oder 8 vorhanden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die hierin offenbarten Peptidantigene, wie Vasa-N, Vasa-C, Dazl-N und Dazl-C, lediglich beispielhaft sind und andere antigene Peptide und Polypeptide, einschließlich der vollständig langen Version eines Polypeptids, das mit der PGC-Entwicklung assoziiert ist (einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die in der SEQ ID NO: 2 oder 6 dargestellt ist) als Immungene verwendet werden können.
  • Der Begriff „Epitope", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Abschnitte eines Polypeptids mit antigener oder immunogener Aktivität in einem Vogel, in einer Ausführungsform einem Huhn. In einer Ausführungsform umfasst der vorliegend offenbarte Gegenstand ein Polypeptid, das ein Epitop sowie das Polynukleotid, das für dieses Polypeptid kodiert, umfasst. Ein „immunogenes Epitop", wie es hierin verwendet wird, ist als ein Abschnitt eines Proteins definiert, der eine Antikörperreaktion in einem Vogel auslöst, wie sie mit einem beliebigen, in der Wissenschaft bekannten Verfahren, zum Beispiel den hierin beschriebenen Verfahren zum Erzeugen von Antikörpern, bestimmt wird. Der Begriff „antigenes Epitop", wie er hierin verwendet wird, ist als ein Abschnitt eines Proteins definiert, an den ein Antikörper sein Antigen immunspezifisch binden kann, wie mit einem beliebigen, in der Wissenschaft allgemein bekannten Verfahren, zum Beispiel mit den hierin beschriebenen Immunoassays, bestimmt wird. Eine immunspezifische Bindung schließt eine nicht-spezifische Bindung, jedoch nicht notwendigerweise eine Kreuzreaktivität mit anderen Antigenen aus. Es soll verstanden werden, dass der Begriff Epitop, wie er hierin verwendet wird, jeden beliebigen Abschnitt eines Polypeptids umfasst, der eine antigene oder immunogene Aktivität in einem Vogel aufweist, und eine Untergruppe der Aminosäuren des Polypeptids selbst (hierin auch als „Peptidantigen" bezeichnet) einschließlich, aber nicht auf diese beschränkt ist und ebenso jede beliebige Modifikationen des Polypeptids einschließt, die zusätzliche Reste in das Polypeptid einbauen (zum Beispiel die post-translationale Addition von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppen).
  • Fragmente, die als Epitope fungieren, können mit jedem beliebigen herkömmlichen Ansatz erzeugt werden. Siehe z. B. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131–5135, 1985; ferner im U.S. Patent Nr. 4,631,211 beschrieben.
  • Beim vorliegend offenbarten Gegenstand enthalten antigene Epitope eine Sequenz von in einer Ausführungsform wenigstens 4, in einer anderen Ausführungsform wenigstens 5, in einer anderen Ausführungsform wenigstens 6, in einer anderen Ausführungsform wenigstens 7, in einer anderen Ausführungsform wenigstens 8, in einer anderen Ausführungsform wenigstens 9, in einer anderen Ausführungsform wenigstens 10, in einer weiteren Ausführungsform wenigstens 15, in einer weiteren Ausführungsform wenigstens 20, in einer weiteren Ausführungsform wenigstens 25 und in einer noch weiteren Ausführungsform von ungefähr 15 bis ungefähr 30 Aminosäuren. Beispielhafte Polypeptide, die immunogene oder antigene Epitope umfassen, sind wenigstens 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder 100 Aminosäurereste lang. Antigene Epitope sind zum Beispiel zum Erzeugen von Antikörpern, einschließlich IgY-Antikörpern, die spezifisch an das Epitop binden, von Nutzen. Antigene Epitop können als Zielmoleküle in Immunoassays verwendet werden. Siehe z. B. Wilson et al., Cell 37: 767–778, 1984; Sutcliffe et al, Science 219: 660–666, 1983.
  • In ähnlicher Weise können immunogene Epitope zum Beispiel zum Erzeugen von Antikörpern gemäß den in der Wissenschaft allgemein bekannten Verfahren verwendet werden. Siehe z. B. Sutcliffe et al., supra; Chow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910–914, 1985; und Bittle et al., J. Gen. Virol. 66: 2347–2354, 1985. Die Polypeptide, die eines oder mehrere immunogene Epitope umfassen, können zum Auslösen eines Antikörperreaktion zusammen mit einem Trägerprotein, wie beispielsweise einem Albumin, einem Vogelsystem (wie zum Beispiel Huhn) präsentiert werden oder, wenn das Polypeptid ausreichend lang ist (wenigstens ungefähr 25 Aminosäuren lang), kann das Polypeptid ohne einen Träger präsentiert werden. Es wurde jedoch gezeigt, dass immunogene Epitope, die so wenige wie 8 bis 10 Aminosäuren umfassen, dazu ausreichen, Antikörper zu erzeugen, die dazu in der Lage sind, an allerwenigstens lineare Epitope in einem denaturierten Polypeptid (z. B. bei Western Blotting) zu binden.
  • Epitope tragende Polypeptide des vorliegend offenbarten Gegenstands können zum Erzeugen von Antikörpern gemäß in der Wissenschaft allgemein bekannten Verfahren, die eine in vivo-Immunisierung einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind, verwendet werden. Siehe z. B. Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; und Bittle et al., supra. Wenn eine in vivo-Immunisierung verwendet wird, können Vögel mit einem freien Peptid immunisiert werden; der Titer der anti-Peptid-Antikörper kann jedoch durch Koppeln des Peptids an einen Makromolekülträger, wie beispielsweise Keyhole limpet hemocyanin (KLH), Rinderserumalbumin (BSA) oder Tetanustoxoid, erhöht werden. Zum Beispiel können Peptide, die Cyaninreste enthalten, unter Verwenden eines Linkers, wie beispielsweise Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS), an einen Träger gekoppelt werden, während andere Peptide unter Verwenden eines allgemeineren Verknüpfungsmittels, wie beispielsweise Glutaraldehyd, an Träger gekoppelt werden können. Vögel, wie zum Beispiel Hühner, werden zum Beispiel durch intramuskuläre Injektion (zum Beispiel in den Pectoralis major) von Emulsionen, die ungefähr 10 bis 1000 Mikrogramm Peptid oder Trägerprotein und Freund-Adjuvans oder irgendeinen anderen Hilfsstoff, von dem bekannt ist, dass er eine Immunreaktion stimuliert, enthält, entweder mit freien oder mit an Träger gekoppelten Peptiden immunisiert. Es können mehrere Booster-Injektionen zum Beispiel in Intervallen von ungefähr zwei Wochen verwendet werden, um einen nützlichen Titer eines anti-Peptid-Antikörpers bereitzustellen, der zum Beispiel mit Hilfe eines ELISA-Assays unter Verwenden eines an eine feste Oberfläche adsorbierten, freien Peptids nachgewiesen werden kann. Der Titer der anti-Peptid-Antikörper in Serum aus einem immunisierten Tier kann durch Auswahl von anti-Peptid-Antikörpern, zum Beispiel durch Adsorption an das Peptid auf einem festen Träger und Elution der ausgewählten Antikörper gemäß in der Wissenschaft allgemein bekannten Verfahren erhöht werden.
  • B. Konjugate und Hilfsstoffe
  • Wie in der Wissenschaft allgemein bekannt ist, kann eine gegebene Zusammensetzung bezüglich ihrer Immunogenität variieren. Es ist daher oft erforderlich, das Immunsystem des Wirtssystem zu stärken, wie es durch Konjugieren eines Peptid- oder Polypeptidimmunogens an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte Träger sind Keyhole limpet hemocyanin (KLH) und Rinderserumalbumin (BSA). Andere Albumine, wie beispielsweise Ovalbumin, Mausserumalbumin oder Kaninchenserumalbumin können ebenso als Träger verwendet werden. Verfahren zum Konjugieren eines Polypeptids an ein Trägerprotein sind in der Wissenschaft allgemein bekannt und schließen die Verwendung von Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und bis-biazotisiertem Benzidin ein.
  • Wie ebenso allgemein in der Wissenschaft bekannt ist, kann die Immunogenität einer bestimmten Immunogenzusammensetzung durch die Verwendung nicht-spezifischer Stimulatoren der Immunreaktion, die als Hilfsstoffe bekannt sind, erhöht werden. Beispielhafte Hilfsstoffe schließen vollständiges Freund-Adjuvans (einen nicht-spezifischen Stimulator der Immunreaktion, das abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält), unvollständiges Freund-Adjuvans, Aluminiumhydroxid und TITERMAX®-Adjuvans (TMA; CytRx Corp., Norcross, Georgia, Vereinigte Staaten von Amerika) ein.
  • Die Menge der bei der Erzeugung von polyklonalen Antikörpern verwendeten Immunogenzusammensetzung variiert je nach der Natur des Immunogens sowie dem für die Immunisierung verwendeten Tier. Zum Verabreichen des Immungens kann eine Vielzahl von Wegen (subcutan, intramuskulär, intravenös und intraperitoneal) verwendet werden. In einer Ausführungsform werden die Vögel durch intramuskuläre Injektion einer Antigenzubereitung in den Muskel Pectoralis major (den Großen Brustmuskel) immunisiert. Die Erzeugung polyklonaler Antikörper kann durch Abnehmen von Blut aus dem immunisierten Tier zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung überwacht werden. Anschließend können auch Booster-Injektionen gegeben werden. Der Vorgang des Boosterns und Titerbildens wird solange wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht ist. Wenn ein gewünschter Grad an Immunogenität erreicht wird, kann das immunisierte Tier ausgeblutet und das Serum isoliert und gelagert werden.
  • C. Isolierung von Antikörpern aus Dotter
  • Antikörper, die an Antigene binden, die mit PGCs assoziiert sind, werden in dem Dotter von Eiern abgeschieden, die von weiblichen Vögeln erzeugt werden die mit den Antigenen (zum Beispiel mit Peptiden, die die Antigene umfassen) immunisiert wurden. In einigen Ausführungsformen können Antikörper unter Verwenden von Fachleuten bekannten Techniken aus dem Dotter isoliert werden. Siehe z. B. Akita et al., J. Immunol. Meth. 160: 207–214, 1993; Akita et al., J. Fond Sci. 57: 629–634, 1992; U.S. Patent Nr. 4,357,272 . Wie im U.S. Patent Nr. 4,357,272 angegeben ist, kann IgY aus Dotter durch eine Fällung mit Polyethylenglykol (PEG) gereinigt werden. Kurz gesagt, können Dotter gesammelt und in destilliertem Wasser gewaschen werden, um das Eiweiß zu entfernen. Die Dotter können durch einen Glastrichter in einen Messzylinder durchlaufen gelassen werden, was ein Aufbrechen der Dottersäcke bewirkt und den Dotter freisetzt, der sich in dem Zylinder sammelt. Das Volumen der Dotter wird gemessen und es wird ein Volumen eines Puffers (zum Beispiel phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PBS), das zu zwei Volumina Dotter äquivalent ist, dazugegeben und vorsichtig gemischt. PEG (zum Beispiel PEG 6000) wird bis zu einer Endkonzentration von 3,5% (Gewicht:Volumen; w:v) dazugegeben. Die Mischung wird solange gerührt, bis das PEG vollständig aufgelöst ist. Dann wird die Mischung mit 12.000 g zehn Minuten lang zentrifugiert. Der Zentrifugationsschritt führt zur Erzeugung von drei Phasen in den Zentrifugationsröhrchen. Die oberste Schicht ist eine gelbe fettige Schicht, die mittlere Schicht ist eine klare Überstandsschicht und eine Bodenschicht besteht aus dem Hauptteil des Dotters und einem Protein-„Pellet". Der IgY enthaltende, flüssige Überstand und die fettige Schicht können in einen Trichter dekantiert werden, der einen absorbierenden Baumwollstopfen im Hals des Trichters enthält. Der Stopfen entfernt die Lipidschicht. Dann wird das Volumen des klaren Filtrats gemessen und PEG unter leichtem Rühren bis zu einer Endkonzentration von 12 g PEG pro 100 ml Dotterextrakt dazugegeben. In dieser Konzentration verursacht das PEG eine vollständige Entfernung des IgY. Dann wird das Präzipitat wie vorher zentrifugiert. Die Pellets können wieder auf das ursprüngliche Volumen in Phosphatpuffer aufgelöst werden und das IgY erneut mit 12% PEG ausgefällt und zentrifugiert werden. Das restliche PEG kann durch zwei Runden einer erneuten Zentrifugation und Absaugung jeglicher Flüssigkeit entfernt werden (wobei IgY in dem Pellet gefunden wird). Anschließend können die finalen Pellets in einem Volumen Phosphatpuffer aufgelöst werden, das zu der Hälfte des Volumens von Dotter, aus dem es abgeleitet wurde, äquivalent ist, obwohl durch Auflösen der Pellets in einem kleineren Volumen konzentriertere Lösungen erhalten werden können, wenn es gewünscht ist. Für eine Injektion in Tiere, bei der eine vollständigere Entfernung von PEG wünschenswert ist, kann das IgY von Spuren von PEG durch Ausfällen des IgY mit halbgesättigtem Ammoniumsulfat, gefolgt von einer Zentrifugation befreit werden. Das PEG bildet eine flüssige Phase in der wässrigen Ammoniumsulfatphase, während das IgY eine dritte Phase auf dem Boden des Zentrifugenröhrchens bildet.
  • Auf diese Weise oder mit irgendeinem anderen, Fachleuten bekannten Verfahren, gereinigtes IgY kann in Immunoassays, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, enzymgekoppelte Immunabsorptionstests (enzym-linked immunosorbent assays, ELISAs), Immunpräzipitation usw., unter Verwenden von Fachleuten bekannten Techniken verwendet werden. Standardisierte sekundäre Reagenzien, wie beispielsweise sekundäre anti-IgY-Antikörper, sind von einer Reihe von Herstellern, einschließlich Research Diagnostics Inc., Flanders, New Jersey, Vereinigte Staaten von Amerika und Aves Labs, Inc., Tigard, Oregon, Vereinigte Staaten von Amerika, erhältlich.
  • III. Verfahren zum Modulieren der Proliferation und Entwicklung von PGCs
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand stellt Verfahren zum Modulieren der Entwicklung der PGCs in einem Vogelembryo bereit. Die durch die offenbarten Verfahren bereitgestellte Modulation kann die Form von entweder einem qualitativen oder einem quantitativen Unterschied in den PGCs des Embryos, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, einer Verminderung oder einer Erhöhung der Anzahl an PGCs die in dem sich entwickelnden Embryo vorhanden sind, in Bezug auf eine Anzahl an PGCs, die normalerweise in einem Embryo der gleichen Spezies in dem gleichen Stadium, der nicht den hierin beschriebenen Verfahren ausgesetzt wurde, befinden, annehmen. Alternativ dazu kann die Modulation die Form einer Störung der normalen Entwicklung von PGCs in dem Embryo annehmen, so dass die PGCs sich, entweder im Hinblick auf eine Wanderung zu der Gonade oder im Hinblick auf ihre Entwicklung, wenn sie erst einmal in die Mikroumgebung der Gonade des Embryos eingedrungen sind, nicht normal entwickeln können.
  • Verschiedene Gruppen haben von der Verwendung von Chemikalien oder Bestrahlung zum Modulieren der Menge von PGCs in Vogelembryos berichtet. Eine bestimmte Chemikalie, die zum Verringern von Mengen an endogenen PGCs verwendet wurde, ist Busulfan (siehe Aige-Gil & Simkiss, Res. Vet. Sci. 50: 139, 1991; Vick et al., J. Reprod. Fert. 98: 637; Bresler et al., Br. Poultry Sci. 35: 241, 1994; Hallet & Wentworth, Poultry Sci. 70: 1619, 1991; die U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsar. 20030111016). Die Verbindung Busulfan (1,4-Butandioldimethansulfonat, BU) wurde als chemotherapeutisches Mittel bei der Behandlung von Leukämie verwendet (Bhagwatwar et al., Cancer, Chemother. Pharmacol. 37: 401–08, 1996). 1963 zeigten Hemsworth und Jackson, dass die Verabreichung von BU in Ratten in bemerkenswerter Weise die Entwicklung von PGCs beeinträchtigen konnte (Hemsworth & Jackson, J. Reprod. Dev. 6: 229–33, 1963). Die Injektion von BU in den Dottersack von Hühnerembryos führte zu multiplen Fehlbildungen (Swartz, Teratology 21: 1–8, 1980). Hallet und Wentworth (Poult. Sci. 70: 1619–23, 1991) berichteten auch von einer signifikanten Abnahme des Ausbrütungsvermögens infolge einer Injektion einer Eiweißsuspension von BU in Wachteleiern. In manchen mit BU behandelten Wachteln schien eine Abwesenheit von Keimzellen in den Gonaden aufzutreten, während andere, in ähnlicher Weise behandelte Vögel normal erschienen. Die Autoren schlugen vor, dass „Unstimmigkeiten in der Übertragung von BU in den Embryo" die beobachteten Abweichungen erklären könnten. Sie schlossen, dass das Entdecken eines nicht-toxischen Lösungsmittelsystems erforderlich wäre, um die mit der Verwendung einer Suspension verbundenen, uneinheitlichen Ergebnisse auszuschließen. Aige-Gil & Simkiss (Br. Poult. Sci 32: 427–438, 1991) verwendeten Kochsalzlösung- oder Sesamölsuspensionen von BU oder in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöstes BU in Hühnerembryos. Die Verabreichung von DMSO allein erzeugte eine Embryonensterblichkeit, Entwicklungsverzögerungen und Fehlbildungen, die diejenigen, die bei Kochsalzlösung beobachtet wurden, überstiegen. Die teratogenen Effekte wurden größtenteils minimiert, wenn BU in Sesamöl suspendiert und in Dotter injiziert wurde. Die Injektion von 100 µg BU in Sesamöl führte zu einem Sterilitätsindex von 95+%. In einem nachfolgenden Versuch berichteten Vick und seine Mitarbeiter (J. Reprod. Fertil 98: 637–41, 1993), dass die Injektion von 25, 50 und 250 µg BU die gonadalen Keimzellen in Hühnerembryos signifikant verringerte. Sie schätzten, dass eine Behandlung mit BU den Anteil eines Keimbahnchimärismus im Vergleich zu nicht mit BU behandelten Embryos um das 3,5-Fache erhöhte. Bresler et al. (Br. Poult. Sci. 35: 241–47, 1994) zeigten, dass eine Behandlung mit BU und eine anschließende Injektion der PGCs zu einer signifikanten Wiederbevölkerung der Gonade führen könnte. Eine Injektion von 50 µg in Sesamöl suspendiertem BU verringerte die PGCs in der linken und rechten Gonade von 6 Tage alten Hühnerembryos um 75 bzw. 78%. Nach der Injektion einer Suspension germinaler sichelförmiger Zellen in mit BU behandelte Embryos stiegen die Anzahlen der PGCs entsprechend auf 72 und 115% der Kontrollen für die linke und rechte Gonade an. Die Schwankungen bei der Übertragung von BU in die Gonade und die resultierende Unstimmigkeit in der Wirksamkeit bei der Verringerung der Anzahl an PGCs schränkt die Nützlichkeit dieser Technologie ein.
  • In der U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 20030111016 verwendeten die vorliegenden Miterfinder Busulfan, um die endogenen PGCs vor dem Verabreichen von Donor-PGCs zu verringern. Kurz gesagt, wurden fünfzehn mg Busulfan in einem Glasfläschchen in 5 ml Dimethylformamid (DMF) aufgelöst. Zu der Lösung wurden fünf ml Sesamöl gegeben. Die Mischung wurde vollständig auf einer Vortexeinrichtung geschüttelt, um eine Emulsion zu erzeugen. Die Konzentration von Busulfan in der Emulsion betrug 1,5 µg/ml. Für jede Charge an Injektionen wurde eine frische Busulfanemulsion zubereitet. Die befruchteten Eier wurden 22 Stunden lang bei 37,5°C und 60% relativer Feuchte inkubiert. Dann wurden die Eier 2 Stunden lang horizontal in den Inkubator eingestellt. Das stumpfe Ende jedes Eies wurde mit 70% Ethanol gereinigt. Unter Verwenden einer gebogenen Zange wurde dann ein kleines Loch in die die Luftkammer bedeckende Schale gemacht, ohne die Membran der äußeren Schale zu beschädigen. Fünfzig µl der Busulfanemulsion (die 75 µg Busulfan enthielt) wurde unter Verwenden einer Injektionsnadel (21 G × 1,5 Inch) horizontal durch die Luftkammer in den Dotter injiziert. Die Emulsion wurde vor ihrer Verwendung vollständig auf einer Vortexeinrichtung geschüttelt. Für den gesamten Injektionsvorgang wurden die Eier horizontal gehalten. Das Loch in der Schale wurde mit einem Tesafilm verschlossen. Nach der Injektion wurden die Eier vertikal inkubiert.
  • Die mit Busulfan behandelten Embryos wurden im Stadium 27 (H&H) gesammelt und in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Embryos wurden in Paraffin eingebettet, mit einer Dicke von 7 µm geschnitten und mit SSEA-1-Antikörpern immunhistochemisch gefärbt. Die Anzahl an PGCs in der linken und rechten Gonade in 10 zufällig ausgewählten Schnitten von jedem Embryo wurde gezählt und der Sterilitätsindex (IS) wurde unter Verwenden der Gleichung IS = (N – X)/N, wobei N die Anzahl an PGCs aus den Kontrollgonaden und X die Anzahl an PGCs aus dem mit Busulfan behandelten Embryo ist, berechnet (Reynaud, J. Embryol. Exp. Morphol. 21: 485–507, 1969). Die Effekte einer Behandlung mit Sesamöl, DMF und Busulfan auf das Überlebensvermögen von Hühnerembryos im Stadium 27 wurde bestimmt und das Ausbrütungsvermögen der behandelten Vögel nach einer Verabreichung von Busulfan wurde ebenfalls festgestellt. Es wurde gezeigt, dass Busulfan die Anzahl der PGCs, insbesondere mit einer Dosis von 75 µg, die in Sesamöl und DMF emulgiert waren, verringert, obwohl das Überlebensvermögen der behandelten Embryos ein Viertel bis einhalb mal so groß wie diejenige war, die bei nicht-injizierten Kontrollen gesehen wurde.
  • In manchen Ausführungsformen stellt der vorliegend offenbarte Gegenstand ein Verfahren zum Modulieren der Anzahl von Urkeimzellen in einem Vogelembryo bereit, wobei das Verfahren das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, umfasst, wodurch ein durch den weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration von Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die Anzahl an endogenen PGCs in einem Vogelembryo, der innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren.
  • Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „modulieren" einen Anstieg, eine Abnehmen oder eine andere Änderung von irgendeiner oder allen chemischen und biologischen Aktivitäten oder Eigenschaften eines biochemischen Einheit, z. B. einer PGC. Als solches kann der Begriff „modulieren" eine Änderung der Anzahl an PGCs, die in dem sich entwickelnden Embryo vorhanden sind, in Bezug auf nicht-chimäre Embryos der gleichen Spezies in dem gleichen Stadium bezeichnen. Zu Beispiel kann der Begriff „modulieren" „hemmen", „verringern" oder „unterdrücken" bedeuten, die Verwendung des Wortes „modulieren" ist jedoch nicht auf diese Definition beschränkt.
  • Wie sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „hemmen", „verringern", „unterdrücken", „herunterregulieren" und deren grammatikalische Varianten gegeneinander austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine Aktivität, bei der die Anzahl oder die Entwicklung der in einem Embryo vorhandenen PGCs unterhalb derjenigen verringert wird, die in Abwesenheit von Antikörpern beobachtet wird, die gegen ein Antigen gerichtet sind, das auf einem mit PGCs assoziierten Polypeptid vorhanden ist. In einer Ausführungsform führt die Hemmung mit einem Antikörpermolekül (zum Beispiel einem gegen VASA, DAZL, EMA-1 usw. gerichteten IgY) zu einer Abnahme der Anzahl an PGCs, die in dem Embryo vor der Wiederbevölkerung mit Donor-PGCs vorhanden sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Anzahl der in einem Vogelembryo vorhandenen PGCs in der Gegenwart von Antikörpern, die gegen ein Antigen gerichtet sind, das auf einem mit PGCs assoziierten Polypeptid vorhanden ist, größer als bei ihrer Abwesenheit.
  • Der Begriff „Modulation", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet sowohl eine Hochregulierung (d. h. Aktivierung, Erhöhung oder Stimulation) als auch eine Herunterregulierung (d. h. Hemmung, Verringerung oder Unterdrückung) der Anzahl an PGCs (oder deren Entwicklung) in dem Embryo vor er Wiederbevölkerung mit Donor-PGCs. Der Begriff „Modulation", wenn er unter Bezugnahme auf eine funktionelle Eigenschaft oder biologische Aktivität oder einen biologischen Vorgang (z. B. die Entwicklung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Proliferation, von PGCs) verwendet wird, bezeichnet daher das Vermögen, eine Qualität, wie beispielsweise eine Eigenschaft, Aktivität oder einen Vorgang (zu Beispiel die Entwicklung und Proliferation von PGCs) hochzuregulieren (d. h. zu aktivieren, erhöhen oder stimulieren), herunterzuregulieren (d. h. zu hemmen, verringern oder unterdrücken) oder anderweitig zu verändern.
  • In bestimmten Ausführungsformen des vorliegend offenbarten Gegenstands wird die Anzahl an endogenen PGCs in dem Empfängervogel vor dem Einbringen der Donor-PGCs verringert. Auf diese Weise können die Donor-PGCs die Gonaden des Empfängervogels wiederbevölkern und die Effizienz des Erzeugens von chimären Vögeln und den Anteil an Gameten (und der Nachkommenschaft), die von dem Donorvogel abgeleitet werden, erhöhen. Die endogenen PGCs können um mindestens ungefähr 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% oder sogar mehr verringert werden. In weiteren bestimmten Ausführungsformen ist der Empfängervogel im Wesentlichen sterilisiert, wie dieser Begriff hierin definiert ist. Die angestrebte Verringerung der Anzahl an endogenen PGCs in dem Empfängervogel kann auf einer Reihe von Überlegungen basieren, die die gewünschte Anzahl und Anteile an Gameten, die von dem Donorvogel abgeleitet werden sollen, die Minimierung jeglicher unerwünschter Effekte, die mit dem Verfahren zum Erreichen einer Verringerung der endogenen PGCs und so weiter assoziiert sind, einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
  • Alternativ dazu können die vorliegend offenbarten Verfahren so ausgeführt werden, dass das Verhältnis der Gameten (und/oder der Nachkommenschaft), die von den Donor-PGCs abgeleitet werden, im Vergleich zu den PGCs des Empfängervogels ungefähr 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20, 90/10 oder mehr betragen kann. In einigen Ausführungsformen können die Verfahren des vorliegend offenbarten Gegenstands so ausgeführt werden, dass weniger als 50% der Gameten (und/oder der Nachkommenschaft) von den Donor-PGCs abgeleitet werden. Ein relativ geringer Anteil an Gameten und oder Nachkommen, die von den Donor-PGCs abgeleitet wurden, können für solche Anwendungen geeignet sein, in denen lediglich eine relativ kleine Anzahl an Donor-Gameten und/oder – Nachkommen aus den chimären Vögeln notwendig sind und/oder die Donor-Gameten und/oder -Nachkommen aus den chimären Vögeln von kommerziellem Wert sind.
  • In einer Ausführungsform wird die Anzahl an PGCs in dem Empfängervogel infolge der Gegenwart von in dem Dotter des Eis abgeschiedenen, maternalen Antikörpern verringert. Diese Antikörper, die allgemein als IgY bezeichnet werden, sind dazu in der Lage, die Entwicklung von PGCs in dem Embryo zu beeinflussen, wenn sie Antigene, die auf den Polypeptiden vorhanden sind, die mit PGCs assoziiert sind, in einer Ausführungsform Antigene, die auf Polypeptiden vorhanden sind, die mit der Migration oder Entwicklung von PGCs assoziiert sind, binden.
  • Die Verringerung der PGCs wird durch Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem mit PGCs assoziierten Antigen erreicht. Das Antigen kann auf einem Polypeptid vorhanden sein, das mit der Entwicklung von PGCs assoziiert ist (zum Beispiel ein VASA-Polypeptid) und ein Peptidantigen (zum Beispiel ein Strang aus 4 oder mehr Aminosäuren eines VASA-Polypeptids) und ein Kohlenhydratantigen (zum Beispiel ein Kohlenhydratrest, der posttranslational an das Polypeptid auf der Oberfläche einer PGC angefügt wurde) einschließt, jedoch nicht auf diese beschränkt ist. Wenn ein weiblicher Vogel mit einem solchen Antigen (oder einer Vielzahl von Antigenen) immunisiert ist, kann der Vogel eine Immunreaktion gegen das Antigen erzeugen. Wenn ein immunisierter Vogel ein Ei erzeugt, werden Antikörper gegen das Antigen in dem Dotter des Eies abgeschieden. Diese Antikörper sind dann dazu in der Lage, an ihre verwandten Antigene, die in dem sich in dem Ei entwickelnden Embryo vorhanden sind, wodurch eine biologische Aktivität der innerhalb des sich entwickelnden Embryos vorhandenen Makromoleküle, die das Antigen enthalten, moduliert wird.
  • IV. Verfahren zum Erzeugen chimärer Vögel
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erzeugen eines chimären Vogels bereit. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist; b) das Erzeugen eines Eies aus dem weiblichen Vogel, wobei das Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung, die Anzahl an PGCs oder Kombinationen davon in einem Empfängerembryo, der innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren; und (c) das Verabreichen von Donor-PGCs an den Empfängerembryo in ovo, um einen chimären Vogel zu erzeugen.
  • Chimäre Vögel wurden durch Übertragen von blastodermalen Zellen eines Donors in den Blastoderm eines Empfängervogels erzeugt, Rückblickend zusammengefasst in Etches et al., Poult. Sci. 76: 1075, 1997. Chimäre Vögel, insbesondere Keimbahn-Chimären, wurden ebenso durch eine Übertragung von PGCs in Empfängerembryos, einschließlich PGCs, die aus dem Germinal Crescent abgeleitet wurden, zirkulierenden PGCs, die im Blut gefunden werden, und gonadalen PGCs, die in der Genitalleiste gefunden werden, erzeugt. Rückblickend zusammengefasst in Tajima, Avian Poult. Biol. Rev. 13: 15–30, 2002. Es wurde berichtet, dass blastodermale Zellen vermutliche PGCs enthalten (Kagami et al., Mol. Reprod. Dev. 48: 501, 1997; Ginsburg & Eyal-Giladi, J. Embryol. Exp. Morphol. 95: 53, 1986), was, wenn es wahr ist, die Fähigkeit erklären könnte, keimbahnchimäre Vögel durch Übertragung blastodermaler Zellen zu erzeugen. In manchen Ausführungsformen des vorliegend offenbarten Gegenstands können blastodermale Zellen und/oder PGCs mittels in der Wissenschaft bekannten Techniken, einschließlich der Injektion von Zellen in den Sinus terminalis, der Injektion in die Aorta, der Injektion in den germinalen Crescent, der Injektion in den Zölom des Embryos, usw., in die sich entwickelnden Vogelembryos eingebracht werden.
  • Der größte Teil der Produktion von Vogelchimären hat Hühner verwendet. Siehe z. B. Naito et al., Mol. Reprod. Dev. 39: 153–161, 1994. Die Produktion chimärer Vögel ist jedoch nicht auf Hühner beschränkt. Es wurden auch Chimären in Wachteln erzeugt, indem frühe blastodermale Zellen aus der Wachtel in Wachtelembryos übertragen wurden. Siehe Ono et al., Jpn Poult. Sci. 31: 119, 1994. Daneben wurden interspezifische Chimären durch Einbringen von blastodermalen Zellen der Wachtel in den Blastoderm von Hühnern (Watanabe et al., Development 114: 331–338, 1992) und durch Einbringen von dissoziierten, germinalen sichelförmigen Zellen aus Truthähnen und/oder PGCs in Hühnerembryos (Reynaud, J. Embryol. Exp. Morphol. 21: 485–507, 1969; U.S. Patent Nr. 6,354,242 ; die U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 20030111016) erzeugt.
  • Fachleute werden erkennen, dass die Donor-PGCs vor der Verabreichung an den Empfängervogel, zum Beispiel durch Genspaltung und/oder durch Einbringen von einer oder mehreren heterologen Nukleotidsequenzen genetisch modifiziert werden können. Verfahren zum vorübergehenden oder dauerhaften Einbringen einer heterologen Sequenz in Vogelzellen sind in der Wissenschaft bekannt siehe z. B. das U.S. Patent Nr. 5,162,215 von Bosselman et al.). In einer Ausführungsform wird die heterologe Nukleotidsequenz dauerhaft in die PGC eingebracht. Ansätze zum Einbringen von Nukleinsäuren von Interesse in Empfängerzellen sind bekannt und schließen Lipofektion, Transfektion, Mikroinjektion, Transformation, mikroprojizierende Techniken usw. ein. Es kann jeder geeignete Vektor, einschließlich Plasmiden, Viren (einschließlich Retroviren), Phagen und dergleichen, ob in nativer Form oder als Derivate derselben, verwendet werden.
  • Die Donor-PGCs können genetisch modifiziert werden, um so ein gewünschtes Ergebnis in dem Empfängervogel zu erzeugen (z. B. um ein Transgen zu erzeugen, das eine Geschlechtsbestimmung bewirkt). Alternativ dazu kann angestrebt werden, dass die genetische Modifikation an die Nachkommenschaft des chimären Vogels weitergegeben wird und in dieser ein gewünschter Effekt erzeugt wird.
  • Das Einbringen von einer oder mehreren heterologen Nukleotidsequenzen (z. B. einer fremden oder exogenen Sequenz oder einer zusätzlichen oder modifizierten Kopie einer endogenen Sequenz) kann in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, um zum Beispiel ein Polypeptid von Interesse in dem Vogel (z. B. in dem Plasma oder den Eiern solcher Vögel für eine praktische Sammlung und Reinigung) zu erzeugen. Gemäß dieser Ausführungsform kann der Vogel im Wesentlichen als Bioreaktor verwendet werden. Polypeptide von Interesse schließen therapeutische (z. B. für tiermedizinische oder medizinische Verwendungen) oder immunogene (z. B. für Impfstoffe) Polypeptide, Antikörper (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Antikörperfragmente und Einzelkettenantikörper), Enzyme (z. B. industrielle Enzyme), Hormone und Wachstumsfaktoren oder jedes beliebige andere Protein von Interesse ein.
  • Alternativ dazu kann das Polypeptid ein Reporter-Polypeptid sein, das als Marker für die Donorzellen dient (z. B. grünes fluoreszierendes Protein, β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, β-Lactamase, Neomycinphosphotransferase und Chloramphenicolacetyltransferase). Die Marker können, neben anderen Zwecken, zum Überwachen der Entwicklung des Embryos und/oder zum Analysieren des Schicksals und der Migration verwendet werden (siehe z. B. Mozdziak et al., Dev. Dynamics 226: 439–445, 2003). Diese Druckschrift dokumentiert die erste erfolgreiche transgene Linie von Vögeln für eine Analyse des Schicksals der Zellen.
  • In anderen Ausführungsformen ist das Polypeptid in therapeutisches oder immunogenes Polypeptid oder irgendein anderes Polypeptid, das einen gewünschten oder günstigen Effekt auf den Empfängervogel ausübt, z. B. ein Polypeptid, das einen gewünschten phänotypischen Effekt ausübt oder das Wachstumsvermögen (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, erhöhte Muskelbewegungen und/oder eine verringerte Fettabscheidung und/oder eine verbesserte Fütterung, um den Anteil zu erzielen), die Eiproduktion, das Ertragen von Erkrankungen und dergleichen erhöht.
  • Als weitere Alternative kann die heterologe Nukleinsäure von Interesse für eine antisense-Nukleinsäure, ein Ribozym (wie es z. B. in dem U.S. Patent Nr. 5,877,022 beschrieben ist) oder irgendeine andere nicht-translatierte RNA kodieren.
  • Fachleute werden verstehen, dass die heterologe Nukleotidsequenz(en) von Interesse funktionsfähig mit geeigneten Kontrollsequenzen verknüpft werden können. Zum Beispiel kann die heterologe Nukleinsäure funktionsfähig mit Elementen zur Steuerung der Expression, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Steuersignalen für die Transkription/Translation, Replikationsursprünge, Signale für eine Polyadenylierung und interne Ribosomeintrittsstellen (IHRES), Promotoren, Enhancer und dergleichen, verknüpft werden.
  • Es wird ferner erkannt werden, dass eine Vielzahl von Promotor-/Enhancer-Elementen je nach dem gewünschten Niveau und der gewünschten gewebespezifischen Expression verwendet werden kann. Der Promotor/Enhancer kann in Abhängigkeit von dem gewünschten Expressionsmuster konstitutiv oder induzierbar sein. Der Promotor/Enhancer kann nativ oder fremd und eine natürliche oder synthetische Sequenz sein. Mit fremd oder exogen soll angegeben werden, dass der Bereich des Transkriptionsbeginns nicht in dem Wildtyp-Wirt gefunden wird, in den der Bereich des Transkriptionsbeginns eingebracht wird. In bestimmten Ausführungsformen ist (sind) die heterologe Nukleotidsequenz(en) funktionsfähig mit dem Ovalbuminpromotor oder dem Lysozympromotor verknüpft.
  • In einer Ausführungsform werden Promotor-/Enhancer-Elemente, die für die Zielzelle nativ oder einer Behandlung unterzogen werden, verwendet. In einer anderen Ausführungsform werden Promotoren/Enhancer-Elemente, die für die heterologe Nukleinsäuresequenz nativ sind, verwendet. Das Promotor-/Enhancer-Element ist so ausgewählt, dass es in der (den) Zielzelle(n) von Interesse funktionieren wird. In einer noch weiteren Ausführungsform werden Promotor-/Enhancer-Elemente von Vögeln verwendet. Das Promotor-/Enhancer-Element kann konstitutiv oder induzierbar sein.
  • Induzierbare Elemente zur Steuerung der Expression können in solchen Anwendungen verwendet werden, bei denen es gewünscht ist, eine Regulierung der Überexpression der heterologen Nukleinsäuresequenz(en) bereitzustellen. Induzierbare Promotoren/Enhancer-Elemente für eine Genübertragung können zell- oder gewebespezifische Promotor-/Enhancer-Elemente sein. Andere induzierbare Promotor-/Enhancer-Elemente schließen durch Hormone induzierbare und durch Metalle induzierbare Elemente ein. Beispielhafte induzierbare Promotor-/Enhancer-Elemente schließen ein Tet-An/Aus-Element, einen durch RU486 induzierbaren Promotor, einen durch Ecdyson induzierbaren Promotor, einen durch Rapamycin induzierbaren Promotor und einen Metalothionein-Promotor ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
  • In Ausführungsformen, in denen (eine) heterologe Nukleinsäuresequenz(en) in den Zielzellen transkribiert und dann translatiert werden wird, sind allgemein spezifische Initiierungssignale für eine effiziente Translation der eingeschleusten Proteinkodierungssequenzen erforderlich. Diese exogenen Sequenzen zur Steuerung der Translation, die das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen einschließen können, können aus vielen Quellen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, stammen.
  • V. Verfahren zum Erhöhen des Anteils an männlichen Vögeln in einer Mehrzahl von Vogeleiern
  • In Vögeln ist der männliche Vogel, anders als bei Säugetieren, das homogametische Geschlecht (ZZ) und der weibliche ist das heterogematische Geschlecht (Zw). Bei Vögeln ist es daher der weibliche Vogel, der das Geschlecht der Nachkommen bestimmt, da er Ovi erzeugt, die das das Geschlecht bestimmende Chromosom: d. h. entweder das Z- oder das w-Chromosom tragen. Wie hierin angegeben ist, wird der Prozentsatz an Z-tragenden Ovi, die durch diesen Wirt erzeugt werden, daher durch Übertragen männlicher Urkeimzellen auf weibliche embryonale Wirte erhöht und der Prozentsatz an männlichen Nachkommen nimmt zu. Ein Anstieg des Prozentsatzes an männlichen Nachkommen aus den Scharen für Brathähnchen ist aufgrund des entsprechend höheren Umrechnungskurses in Nahrungsmittel und der so erhaltenen, effizienteren Fleischproduktion ökonomisch wünschenswert.
  • Wenn ZZ-PGCs an einen männlichen Embryo verabreicht werden, sollte ungeachtet des Ausmaßes, bis zu dem die Donor-PGCs die Gonade des Empfängers kolonisieren, keine Änderung des Geschlechtsverhältnisses in der Nachkommenschaft des Empfängers auftreten. Nur wenn ZZ-PGCs an weibliche (Zw) Empfängerembryos verabreicht werden, kann eine Umkehr des Geschlechtsverhältnisses auftreten. Das vorliegende Verfahren kann daher eine Umkehr des Geschlechtsverhältnisses bewirken, wenn ZZ-PGCs an weibliche (Zw) Embryos verabreicht werden.
  • Der Grad, bis zu dem Z-tragende Ovi in dem weiblichen Empfängerembryo erzeugt werden, wenn er die Geschlechtsreife erreicht hat, und damit der Grad, bis zu dem der Empfänger eine männliche Nachkommenschaft erzeugt, kann von dem Ausmaß, bis zu dem die Donor-ZZ-PGCs die Gonade des Empfängerembryos kolonisieren, abhängen. Es können verschiedene mögliche Ergebnisse eintreten. An einem Ende des Spektrums kolonisieren die Donor-PGCs nicht die Gonade des Embryos und daher würde erwartet, dass der Empfänger 50% Z-Ovi und 50% w-Ovi erzeugt (d. h. dass keine Umkehr des Geschlechtsverhältnisses eintreten wird). An dem anderen Ende des Spektrums kolonisieren die Donor-PGCs vollständig die Gonade des Embryos bis zum Ausschluss der endogenen PGCs, wobei erwartet würde, dass der Empfänger nur Z-Ovi erzeugt und daher die gesamte Nachkommenschaft des Empfängers männlich werden würde. Dementsprechend kann der erwartete Prozentsatz an männlichen Nachkommen, der von einem weiblichen Empfänger erzeugt werden würde, unter der Annahme, dass die Donor-PGCs und die endogenen PGCs individuell gleichermaßen dazu in der Lage sind, Ovi zu erzeugen (d. h. die erzeugten Ovi spiegeln den Prozentsatz an endogenen und Donor-PGCs, die in der Gonade des Embryos vorhanden sind) als 50% + berechnet werden (die Prozent der Kolonisierung der Gonade des Embryos durch die ZZ-PGCs geteilt durch 2).
  • Unter dieser Erwartung sollte eine Maximierung der Prozent Kolonisierung der Gonade des Embryos durch ZZ-PGCs den Prozentsatz an männlichen Nachkommen des weiblichen Empfängers maximieren. Es können verschiedene Verfahren verwendet werden, um dieses Ziel zu erreichen. Ein solches Verfahren ist, eine ausreichende Anzahl an Donor-PGCs an den Empfänger zu verabreichen, so dass die Donor-PGCs die endogenen PGCs signifikant zahlenmäßig übertreffen. Es würde erwartet werden, dass dieser Ansatz am effektivsten wäre, wenn sich der Empfängerembryo in einem Stadium vor dem Stadium befindet, in dem die PGCs in die Gonade des Embryos migrieren.
  • Ein anderes Verfahren ist, die endogenen PGCs zu entfernen oder ihre Fähigkeit, die Gonade des Embryos vor der Verabreichung der Donor-PGCs zu kolonisieren, zu hemmen. Dies kann durch physikalisches Entfernen der endogenen PGCs aus dem Embryo durch zum Beispiel Entfernen des Bluts aus dem Embryo in einem Stadium, in dem die endogenen PGCs in dem Blut des Embryos zirkulieren, ausgeführt werden. Siehe Naito et al., Mol. Reprod. Develop. 39: 153, 1994; Tajima et al., J. Exp. Zool. 280: 265, 1998. Dies ist jedoch eine technisch anspruchsvolle Manipulation, die eine wesentliche Beschädigung des Embryos selbst riskiert. Eine Alternative ist, zu verhindern, dass endogene PGCs die Gonade des Embryos erreichen und/oder kolonisieren. Verschiedene Berichte beschreiben die Verwendung von Chemikalien oder Bestrahlung, um dieses Ziel zu erreichen, die Busulfan (siehe Aige-Gil & Simkiss, Res. Vet. Sci. 50: 139, 1991; Vick et al., J. Reprod. Fert. 98: 637; Bresler et al., Br. Poultry Sci. 35: 241, 1994; Hallett & Wentworth, Poultry Sci. 70: 1619, 1991), Concanavalin-A (Lee et al., J. Embryol. Exp. Morph. 46: 5, 1978) und UV- oder Gamma-Bestrahlung (Reynaud, J. Embryol. Exp. Morphol. 21: 485–507, 1969; Reynaud, J. Roux's Arch. Devel. Biol. 179: 85–110, 1976; Aige-Gil & Simkiss, Br. Poul. Sci. 32: 427–438, 1991; Reynaud, C. R. Hebd. Seances Acad. Sci-D: Sci. Natur 282: 1195, 1976; Mraz & Woody, Radiation Res. 54: 63–68, 1973; Carscience et al., Development 117: 669–75, 1993; Thoraval et al., Poultry Sci. 73: 1897–1905, 1994; Maeda et al., Poultry Sci. 77: 905–07, 1998). Die Verwendung von toxischen Chemikalien und Bestrahlung ist jedoch, insbesondere für landwirtschaftlich wichtige Vogelspezies, nicht optimal.
  • Es wird hierin ein alternativer Ansatz offenbart, bei dem Antikörper, die Antigene erkennen die mit PGCs assoziiert sind, in dem Dotter des Eies, in dem sich der Empfängerembryo entwickelt, als Folge der Immunisierung der Henne, die das Ei mit dem Antigen erzeugt, abgeschieden werden. In dieser Ausführungsform werden weibliche Vögel mit einem Antigen, das mit PGCs assoziiert ist, immunisiert. Antikörper, die gegen das Antigen gerichtet sind, werden in dem Dotter von Eiern, die von den immunisierten weiblichen Tieren erzeugt wurden, abgeschieden. Die Antikörper stehen dann zum Modulieren der Entwicklung von PGCs in einem innerhalb des Eies wachsenden Embryo zur Verfügung. In einer Ausführungsform bewirken die Antikörper eine Verringerung der Anzahl der PGCs, die in der Gonade des Embryos vorhanden sind, so dass die Donor-PGCs, wenn sie dem Empfängerembryo verabreicht werden, die Gonade kolonisieren und sich darin entwickeln können. Der Empfängerembryo wird dann zum Bebrüten inkubiert und die Geschlechtsreife erreichen gelassen.
  • Wenn er zum Erhöhen der Anzahl oder des Anteils an aus einer Gruppe von Eiern ausgebrüteten, männlichen Vögeln verwendet wird, beinhaltet der vorliegend offenbarte Gegenstand das Verabreichen von Urkeimzellen männlicher (d. h. ZZ) Vögel an einen weiblichen Vogel in ovo. Das Geschlecht des Vogels kann in ovo vorbestimmt oder nach der Bebrütung bestimmt werden. Der Vogel wird dann zum Bebrüten inkubiert, wenn erforderlich, wird das Geschlecht des Vogels bestimmt, dieser bis zur Geschlechtsreife aufgezogen und durch Kreuzen des Vogels mit einem geeigneten männlichen Zuchtstamm gemäß bekannten Techniken ausgebrütet. Dann wird eine Vielzahl der von dem Vogel gelegten, befruchteten Eier gesammelt und üblicherweise zum Bebrüten inkubiert und die resultierenden Vögel für wenigstens zwei bis drei Wochen gezüchtet. Das Verhältnis von männlichen zu weiblichen Bier (oder Vögeln), die von dem weiblichen Vogel erzeugt wurden, ist größer als derjenige, der in Abwesenheit des Verabreichens der männlichen Urkeimzellen an diesen Vogel in ovo erhalten wurde. Solche Verfahren werden gewöhnlich bei Vogelspezies verwendet, die für die Fleischproduktion aufgezogen werden, wie beispielsweise Hühner, Truthähne, Enten usw.
  • VI. Verfahren zum Erzeugen von Vogelgameten
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erzeugen von Vogelgameten bereit. In einer Ausführungsform wird das Verfahren zum Erzeugen von Vogelgameten aus einer zweiten Vogelspezies in einer ersten Vogelspezies verwendet. In einer Ausführungsform umfasst das (a) Immunisieren eines weiblichen Tiers der ersten Vogelspezies mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch ein von dem weiblichen Tier erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung eines Empfängervogels der ersten Vogelspezies, die innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren; (b) das Einführen von Donor-PGCs, die aus einem Vogel der zweiten Vogelspezies isoliert wurden, in den Empfängervogel der ersten Vogelspezies; (c) das Inkubieren des Empfängervogels der ersten Vogelspezies zum Bebrüten; und (d) das Aufziehen des Empfängervogels der ersten Vogelspezies bis zur Geschlechtsreife, wobei der Empfängervogel der ersten Vogelspezies Gameten aus der zweiten Vogelspezies erzeugt.
  • Wenn sie für die Erzeugung und Sammlung von Vogelgameten (Sperma, Ovi) verwendet werden, können sich die Urkeimzellen, die in ovo einer Empfängerspezies verabreicht werden, von der Donorspezies, aus der die Donor-PGCs erhalten wurden, unterscheiden. Der Empfänger wird dann zum Bebrüten inkubiert und bis zur Geschlechtsreife aufgezogen und die Spermazellen oder Ovi der Donorspezies werden aus dem Empfängertier gesammelt, wobei alles jeweils gemäß Standardtechniken erfolgt. Im Fall einer bedrohten Spezies kann der Donorvogelspezies zum Beispiel ein Schreikranich sein und die Empfängervogelspezies kann ein Kanadakranich sein. In einem weiteren Beispiel, das die kommerzielle Produktion von Truthähnen betrifft, kann die Donorvogelspezies ein Truthahn sein und die Empfängervogelspezies kann ein Huhn sein.
  • Die U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 20030111016 beschreibt Ansätze der vorliegenden Miterfinder die Gonade des Embryos einer Vogelspezies mit Donor-PGCs aus einer anderen Vogelspezies wiederzubevölkern. Embryos von Barred Plymouth Rock-(BPR-)Hühnern wurden bis zum Stadium 27 bis 28 (H&H) inkubiert. Die Barred Plymouth Rock-Donorembryos wurden als Farbmarker verwendet, da sie an dem Locus I homozygot rezessiv (ii) sind und das Pigment in ihrem Gefieder exprimieren. Die Gonaden aus den männlichen Embryos wurden in DMEM, das mit 10% FKS, Glutamin, einer antibiotischen und antimykotischen Lösung supplementiert worden war, gesammelt. Die Bestimmung des Geschlechts des Embryos erfolgte durch Verwenden des Verfahrens von Petitte & Kegelmeyer (Animal Biotechnol. 6: 19–30, 1995). Dann wurden die Gonaden zweimal in PBS gespült und 15 Minuten lang bei 37°C in 0,02% EDTA inkubiert. Es wurden frische Medien dazugegeben und die Gonaden wurden auseinander gezogen.
  • Die Zellsuspension wurde gesammelt und 5 Minuten lang mit 450 g geschleudert. Die Medien wurden ausgetauscht und die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwenden eines Trypanblau-Ausschlusses bestimmt. Es wurden Aliquots der Zellsuspension genommen und mit SSEA-1-Antikörper gefärbt, um die Anzahl an injizierten PGCs zu bestimmen. Annähernd 2–3 µl der Zellsuspension, die 100 bis 500 PGCs enthielt, wurden in den Stadien 14 bis 17 (H&H) der Entwicklung in die Blutgefäße von Weißen Leghorn-(WL-)Embryos injiziert. Die Wal-Embryos dienten als Empfänger, da von ihnen bekannt war, dass sie homozygot dominant (II) waren. Dieser Genotyp kodiert für eine Abwesenheit des Pigments im Gefieder. Nach der Injektion der PGCs wurden die Eier wieder in den Inkubator eingebracht, um die Entwicklung zu vollenden. Beim Bebrüten wurden die phänotypischen WL-Hühner vereinigt und anschließend bis zur Geschlechtsreife gezüchtet. Die folgenden Testpaarungen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob Keimbahnchimären vorlagen: männliches BPR X weibliches WL und männliches WL X weibliches BPR. Die Nachkommenschaft dieser Testpaarungen wurde anschließend beurteilt, um zu bestimmen, ob gonadale PGCs aus männlichen BPR in die WL eingeführt wurden. Da nur männliche BPR- Embryos als Donor verwendet wurden, stammten alle „schwarzen" Hühner (BPR-Phänotyp) aus den Testpaarungen männliches BPR X weibliches WL.
  • Befruchtete Truthahneier wurden 8 bis 8,5 Tage lange (Stadium 27 bis 28, H&H) bei 38,5°C inkubiert. Die Embryos wurden seziert, um die Gonaden zu erhalten. Dann wurden 2–3 µl der gonadalen Zellsuspension, die annähernd 150 PGCs enthielt, in die Blutgefäße von Hühnerembryos im Stadium 14 (H&H) injiziert. Die Empfängereier wurden verschlossen und wieder in den Inkubator eingestellt. Die Empfängerembryos wurden in verschiedenen Stadien der Inkubation (Stadium 19 bis Stadium 25) gesammelt. Die Embryos wurden dreimal in PBS gespült und dann über Nacht bei 4°C in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Proben wurden dreimal in PBS gewaschen und dann in 50% Ethanol eingebracht. Dann wurden die Gewebe dehydriert, in Paraffin eingebettet und geschnitten. Die resultierenden Sektionen wurden anschließend immunhistochemisch durch Färben mit SSEA-1 und Periodsäure-Schiff (PAS) analysiert. Vorhergehende Forschungen haben einen Unterschied zwischen den Spezies bei der Expression von SSEA-1 durch PGCs von Truthahn und Huhn identifiziert. Diese mit dem Standard-PAS-Test gekoppelte, antigene Variation kann zum Identifizieren von Truthahn-Huhn-Keimbahnchimären verwendet werden. Beobachtungen der doppelt gefärbten Sektionen der Hühnerembryos bestätigten, dass Huhn-PGCs sowohl PAS-positiv als auch SSEA-1-positiv sind. Eine Doppelfärbung der Sektionen von Truthähnen im Stadium 24 mit PAS und SSEA-1 bestätigten, dass Truthahn-PGCs, die durch das dorsale Gekröse migrieren und die Gonade kolonisieren, PAS-positiv sind und kein SSEA-1-Epitop exprimieren. Die Doppelfärbung von Hühner- und Truthahnembryos bestätigte daher, dass die Technik des doppelten Färbens als Marker zum Unterscheiden der PGCs von Truthahn gegenüber PGCs von Huhn verwendet werden könnte.
  • Die Nachkommenschaft einer WL (II) X BPR (ii)-Kreuzung würde üblicherweise die WL-Phänotyp (Ii) exprimieren und eine Abwesenheit des Melaninpigments in dem Gefieder zeigen. Das Einbringen von männlichen BPR-PGCs in WL-Empfänger führte zu Nachkommen, die das schwarze Pigmentmuster des BPR zeigten. Diese Daten bestätigen das Konzept, dass es keine biologischen Barrieren gibt, die die Erzeugung einer erhöhten männlichen Nachkommenschaft durch Injizieren von PGCs, die aus den Gonaden von männlichen Embryos isoliert wurden, in weibliche Hühnerembryos verhindern würde. Die Häufigkeit einer Keimbahntransmission betrug jedoch weniger als 1%. Die geringe Häufigkeit einer vom Donor anstammenden Nachkommenschaft in diesem System stand möglicherweise mit dem signifikanten numerischen Vorteil in Verbindung, den endogene PGCs im Vergleich zu der Anzahl an injizierten Donor-PGCs zeigten. Die Behandlung von Embryos mit einer BU + DMF + SO-Emulsion vor der Injektion von Donor-PGCs verringerte die Anzahl an endogenen PGCs um so viel wie 97%. Im Vergleich zu BU + SO allein erhöhte die Zugabe von DMF die Verringerung der endogenen PGCs um annähernd 15%.
  • Nach der Doppelfärbung mit SSA-1 und PAS wurden auf Basis der verschiedenen Färbemuster Huhn- und Truthahn-PGCs in der Gonade des Hühnerembryos identifiziert. Aufgrund der Gegenwart von Glykogen zeigen sowohl die Hühner- als auch die Truthahn-PGCs nach der PAS-Färbung die Farbe Magenta. Die Truthahn-PGCs sind jedoch nicht länger SSEA-1-positiv, wenn sie sich in der sich entwickelnden Gonade niederlassen, wodurch sie sich von den PGCs des Huhns unterscheiden, die in diesem Entwicklungsstadium SSEA-1-positiv sind. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass aus der Gonade von embryonalen Truthähnen isolierte PGCs zum Wiederbevölkern der Hühner-Gonade verwendet werden können.
  • In der U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 20030111016 wurden Weiße Leghorn-(WL-)Embryos in ovo mit einer Busulfanemulsion (BU + DMF + Sesamöl) behandelt, um die endogenen PGCs zu erschöpfen. Die Gonaden aus männlichen Barred Plymouth Rock-(BPR-)Embryos wurden gesammelt, die PGCs isoliert und die isolierten PGCs in ovo den mit der Busulfanemulsion behandelten Vögeln und den unbehandelten Kontrollvögeln verabreicht, wie es im Wesentlichen in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben wurde. Nach dem Bebrüten wurden die männlichen chimären WL-Vögel bis zur Geschlechtsreife aufgezogen und mit weiblichen BPR-Vögeln gekreuzt. Die Erzeugung einer schwarzen Nachkommenschaft zeigt eine Transmission der aus den PR-PGCs stammenden Gameten durch den chimären männlichen WL-Elter an. Die Ergebnisse gaben an, dass 25 (4/16) der WL-Männchen die aus den BPR-PGCs stammenden Gameten übertragen. Bei diesen 4 chimären Vögeln beträgt die Transmissionsrate von 2% bis 23%. Bei den Kontrollvögeln, die keiner Behandlung mit Busulfan unterzogen wurden, wies nur ein Vogel eine nachweisbare Transmission der aus den BPR-PGCs stammenden Gameten auf.
  • In manchen Ausführungsformen wendet der vorliegend offenbarte Gegenstand Verfahren zum Wiederbevölkern der Gonade des Embryos einer Vogelspezies mit Donor-PGCs aus der anderen Vogelspezies an, wie in der U.S. Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 20030111016 offenbart ist. Natürlich wendet der vorliegend offenbarte Gegenstand in solchen Ausführungsformen auch das Immunisieren eines weiblichen Tiers der ersten Vogelspezies mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, an, wodurch ein durch den weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung eines Empfängervogels der ersten Vogelspezies, die innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren.
  • VII. Verfahren zum Erhöhen der Keimbahntransmission eines Nukleinsäuremoleküls
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand stellt auch ein Verfahren zum Erhöhen der Keimbahntransmission eines Nukleinsäuremoleküls in einem Vogel bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren (a) das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wodurch ein durch den weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung in einem Empfängervogel, der innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren; (b) das Verabreichen einer Vielzahl von Donor-PGCs, die das Nukleinsäuremolekül umfassen an den Empfängervogel unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zumindest einer der Vielzahl von PGCs zu ermöglichen, eine Gonade des Empfängervogels zu kolonisieren; (c) das Inkubieren des Empfängervogels zum Bebrüten; und (d) das Aufziehen des Empfängervogels bis zur Geschlechtsreife, wobei der Empfängervogel Gameten erzeugt, die aus den Donor-PGCs abgeleitet sind. In dieser Ausführungsform ist die Keimbahntransmission effizienter gestaltet als bei derzeitigen Verfahren des Standes des Technik, wobei eine effiziente Erzeugung von Keimbahnchimären weiterhin einen Bedarf in der Wissenschaft bildet.
  • Das vorliegende Verfahren basiert auf den gleichen Prinzipien, die vorstehend erörtert wurden und sich allgemein auf die Erzeugung von Keimbahnchimären beziehen. In dieser Ausführungsform werden die Donor-PGCs jedoch vor der Verabreichung in den Empfängerembryo in vitro manipuliert, indem ein exogenes Nukleinsäuremolekül (d. h. ein Transgen) in die PGCs eingebracht wird. Das Verfahren ist weder durch die Nukleinsäure selbst (zum Beispiel ein mit einem Promotor funktionsfähig verknüpfter offener Leserahmen von Interesse) noch durch das Verfahren zur Einbringung (zum Beispiel Elektroporation, Liposom-vermittelte Transfektion usw.) begrenzt. Vielmehr wird eine Nukleinsäure von Interesse unter Verwenden von in der Wissenschaft bekanntere Techniken in eine Vielzahl von Donor-PGCs eingebracht, die dann einem Empfängerembryo verabreicht werden, der sich in einem Ei entwickelt, das durch einen weiblichen Vogel erzeugt wurde, der mit einem Antigen, das mit PGCs assoziiert ist, immunisiert wurde. Dann wird eine Kolonisierung der Gonade des Embryos durch die Donor-PGCs zugelassen, wobei dieser, wenn er die Geschlechtsreife erreicht, die Nukleinsäure auf seine Nachkommen übertragen kann.
  • VIII. Verabreichung
  • Es können Urkeimzellen (PGCs) bereitgestellt und zum Durchführen des vorliegend offenbarten Gegenstands vor der Verwendung nach Wunsch mit einer beliebigen geeigneten Technik formuliert, gelagert, eingefroren, kultiviert oder dergleichen werden. Zum Beispiel können Urkeimzellen in einem geeigneten Stadium des Embryos aus den Donorembryos gesammelt werden. Die Stadien der Vogelentwicklung werden hierin auf eines der beiden in der Wissenschaft bekannten Einordnungssysteme: das System von Eyal-Giladi & Kochav (EG&K; siehe Eyal-Giladi & Kochav, Dev. Biol. 49: 321–327, 1976), das Römische Ziffern verwendet, um die Phasen der Entwicklung des Pre-primitive Streak (des Vor-Steißbeins) zu bezeichnen, und das Einordnungssystem nach Hamburger & Hamilton (H&H; siehe z. B. Hamburger & Hamilton, J. Morphol. 88: 49–92, 1951), das Arabische Ziffern verwendet, um Stadien nach dem Legen zu bezeichnen, bezogen. Soweit nicht anders angegeben ist, sind die hierin angegeben Stadien Stadien nach dem H&H-Einordnungssystem.
  • Zum Beispiel können PGCs im Stadium 4 oder dem germinalen sichelförmigen Stadium bis zum Stadium 30 isoliert werden, wobei die Zellen aus Blut, der Genitalleiste oder der Gonade in den späteren Stadien gesammelt werden. Die Urkeimzellen sind allgemein zweimal so groß wie somatische Zellen und werden basierend auf der Größe leicht von diesen unterschieden und getrennt. Männliche (oder homogametische) Urkeimzellen (ZZ) können mit einer beliebigen geeigneten Technik, wie beispielsweise dem Sammeln von Keimzellen aus einem bestimmten Donor und Typisieren von anderen Zellen aus diesem Donor, wobei die gesammelten Zellen aus dem gleichen Chromosomentyp wie die typisierten Zellen stammen, von heterogametischen Urkeimzellen (Zw) unterschieden werden.
  • Die PGCs können für eine Verabreichung an Tiere formuliert werden, indem die Zellen (z. B. durch mechanische Dissoziierung) verteilt und die Zellen eng mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger (z. B. einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung) vermischt werden. Die Urkeimzellen sind in einer Ausführungsform gonadale Urkeimzellen und in einer anderen Ausführungsform Urkeimzellen aus dem Blut (wobei „Gonade" und „Blut" das Ursprungsgewebe derselben in dem ursprünglichen Donorembryo bezeichnen). Die verabreichten Urkeimzellen können je nach dem bestimmten Ziel der Verabreichung heterogametisch (Zw) oder homogametisch (ZZ) sein. Die PGCs können in einem physiologisch annehmbaren Träger, in einer Ausführungsform bei einem pH von ungefähr 6 bis ungefähr 8 oder 8,5, in einer zum Erreichen des gewünschten Effekts geeigneten Menge (z. B. 100 bis 1000 PGCs pro Embryo) verabreicht werden. Die PGCs können frei von anderen Bestandteilen oder Zellen verabreicht werden oder es können andere Zellen und Bestandteile zusammen mit den PGCs verabreicht werden.
  • Die Verabreichung von Urkeimzellen an das Empfängertier in ovo kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt durchgeführt werden, an dem die PGCs noch zu den sich entwickelnden Gonaden migrieren können. In einer Ausführungsform wird die Verabreichung von ungefähr dem Stadium IX gemäß dem Einordnungssystem nach Eyal-Giladi & Kochav (EG&K) bis ungefähr dem Stadium 30 gemäß dem Einordnungssystem der embryonalen Entwicklung nach Hamburger & Hamilton und in einer weiteren Ausführungsform im Stadium 15 durchgeführt. Bei Hühnern liegt der Zeitpunkt der Verabreichung daher während der Tage 1, 2, 3 oder 4 der embryonalen Entwicklung: in einer Ausführungsform Tag 2 bis Tag 2,5. Die Verabreichung erfolgt üblicherweise durch Injektion an irgendeine geeignete Zielstelle, wie beispielsweise den Bereich, der durch das Amnion (einschließlich dem Embryo), den Dottersack usw., definiert ist. In einer Ausführungsform erfolgt die Injektion in den Embryo selbst (einschließlich der Körperwand des Embryos) und in alternativen Ausführungsformen kann eine intravaskuläre oder intrazölome Injektion in den Embryo verwendet werden. Die Verfahren des vorliegend offenbarten Gegenstands können nach vorhergehender Sterilisation des Empfängervogels in ovo ausgeführt werden (wobei eine „Sterilisation" meint, den Vogel partiell oder vollständig unfähig zu machen, von endogenen PGCs stammende Gameten zu erzeugen). Wenn aus einem solchen Empfänger Donor-Gameten gesammelt werden, können sie als Mischung mit Gameten des Donors und des Empfängers gesammelt werden. Diese Mischung kann dann direkt verwendet werden oder die Mischung kann weiter verarbeitet werden, um den Anteil der Donor-Gameten darin zu erhöhen.
  • Die Verabreichung von PGCs kann durch Verabreichen von PGCs an sich oder durch Verabreichen von Vorläuferzellen, die sich zu PGCs entwickeln, an das Testtier ausgeführt werden (insbesondere, wenn die hierin offenbarten Verfahren dazu verwendet werden, das Geschlechtsverhältnis der Nachkommenschaft zu verändern). Zum Beispiel kann die Verabreichung durch Injizieren von blastodermalen Zellen in den Vogel ausgeführt werden, wobei eine Untergruppe der blastodermalen Zellen in dem Vogel in vivo zu Urkeimzellen differenziert.
  • Die in ovo-Verabreichung der Urkeimzellen kann mit jeder geeigneten Technik, entweder auf manuelle oder auf automatisierte Weise, durchgeführt werden. In einer Ausführungsform wird die in ovo-Verabreichung mittels Injektion durchgeführt. Der Mechanismus der in ovo-Verabreichung ist nicht entscheidend, es ist jedoch der Mechanismus, der die Gewebe und Organe des Embryos oder die extraembryonalen Membran, die diesen umgeben, nicht übermäßig schädigen sollte, so dass die Behandlung die Ausbrütungsrate nicht übermäßig verringern wird. Eine Injektionsspritze, die mit einer Nadel von ungefähr 18 bis 26 Gauge ausgestattet ist, ist für den Zweck geeignet. In Abhängigkeit von dem genauen Entwicklungsstadium und der Position des Embryos wird eine 1-Inch-Nadel entweder in der Flüssigkeit oberhalb des Huhns oder in dem Huhn selbst eindringen. Vor Einführen der Nadel kann eine Vorbohrung durch die Schale gestanzt oder gebohrt werden, um eine Beschädigung oder Abstumpfung der Nadel zu verhindern. Nach Wunsch kann das Ei mit einem im Wesentlichen für Bakterien undurchlässigen Versigelungsmaterial, wie beispielsweise Wachs oder dergleichen verschlossen werden, um ein späteres Eindringen unerwünschter Bakterien zu verhindern. Es wird ins Auge gefasst, dass ein Hochgeschwindigkeitsinjektionssystem für Vogelembryos zum Ausführen des vorliegend offenbarten Gegenstands besonders geeignet sein wird. Es sind viele solcher Einrichtungen verfügbar, wobei beispielhafte Einrichtungen das EMBREX INOVOJECTTM-System (das in den U.S. Patenten Nr. 4,681,063 und 4,903,625 von Hebrank) sowie die in den U.S. Patenten Nr. 4,040,388 ; 4,469,047 ; und 4,593,646 von Miller beschriebenen Einrichtungen sind. Alle diese Einrichtungen umfassen, nachdem sie zum Ausführen der hierin offenbarten Verfahren angepasst wurden, einen Injektor, der eine Formulierung der Urkeimzellen, wie sie hierin beschrieben sind, enthält, wobei der Injektor so angeordnet ist, dass er ein von der Vorrichtung getragenes Ei an der geeigneten Position innerhalb des Eies, wie es oben erörtert ist, injiziert. Daneben kann eine funktionsfähig mit der Injektionsvorrichtung verbundene Verschlussvorrichtung zum Verschließen des Lochs in dem Ei nach der Injektion bereitgestellt werden.
  • Beispiele
  • Der vorliegend offenbarte Gegenstand wird nun im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Beispiele ausführlicher beschrieben werden, in denen beispielhafte Ausführungsformen des vorliegend offenbarten Gegenstands gezeigt sind.
  • Beispiel 1
  • Immunisierung weiblicher Vögel
  • Es wurden antigene Peptidbereiche von homologen Huhn-DAZL- und Huhn-VASA-Proteinen identifiziert, synthetisiert und mit Keyhole limpet hemocyanin (KLH) konjugiert.
  • Die ausgewählten Peptide sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Ausgewählte Peptide zur Konjugation und Immunisierung von Legehennen gegen Huhn-VASA und -DAZL
    Bezeichnung Aminosäuresequenzen Position des Peptids
    VASA-N SRP SSP LSG FPG RPN S (SEQ ID NO: 3) Aminosäure 42 bis 57 des Huhn-VASA-Homologons (CVH; GENBANK®-Zugangsnr. BAB12337)
    VASA-C NPR EMR MSY SET TFK S (SEQ ID NO: 4) Aminosäure 645 bis 660 des Huhn-VASA-Homologons (CVH; GENBANK®-Zugangsnr. BAB12337)
    DAZL-N SAN AEA QCG SIS EDN TH (SEQ ID NO: 7) Aminosäure 2 bis 17 des Huhn-DAZL-Polypeptids (GENBANK®-Zugangsnr. AAO26019)
    DAZL-C SQE DYF RER AHH FRK G (SEQ ID NO: 8) Aminosäure 266 bis 281 des Huhn-DAZL-Polypeptids (GENBANK®-Zugangsnr. AAO26019)
  • Die Stammlösungen (1.000 µg/ml) der verschiedenen konjugierten Peptide wurden auf 4°C gehalten. Unmittelbar vor der Immunisierung wurde eine stabile Emulsion aus 0,5 ml konjugiertem Peptid uns 0,5 ml TITERMAX®-Adjuvans (TMA; CytRx Corp., Norcross, Georgia, Vereinigte Staaten von Amerika) unter Verwenden von zwei Spritzen, die durch eine Emulsionsnadel mit doppeltem Lauf verbunden sind, erzeugt. TMA ist ein synthetisches, nichtionisches Blockcopolymer aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen.
  • Geschlechtsreife Leghorn-Weibchen wurden intramuskulär (Pectoralis major) mit 100–200 µg eines einfach konjugierten Peptids oder einer Kombination von Peptiden immunisiert. Nach der Immunisierung wurden Blutproben entnommen, über Nacht bei 4°C verklumpen gelassen und dann wurden die resultierenden Serumproben für eine spätere Antikörperbestimmung bei –20°C gelagert. Eine zweite Immunisierung (50–100 µg konjugiertes Peptid + TMA) wurde 14 Tage später verabreicht. Drei Tage nach der zweiten Aufgabe wurden ebenso Blutproben aus sowohl den immunisierten Hennen als auch den nicht-injizierten Kontrollen erhalten. Die resultierenden Serumproben wurden für eine spätere Antikörperbestimmung gelagert.
  • Die Titer der anti-Peptid-Antikörper wurden unter Verwenden einer indirekten ELISA-Technik bestimmt. Die Antigen-(d. h. mit KLH konjugiertes Peptid)Lösungen wurden durch Auflösen des Antigens in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 20 µg/ml (1 mg auf 50 ml) zubereitet. Wenn das Antigen nicht unmittelbar löslich war, wurde der pH solange mit 1N NaOH oder 1N HCl mit eingestellt bis sich das Antigen auflöste. Um ELISA-Platten herzustellen, wurde die Antigenlösung (0,1 ml) in jede Vertiefung einer hochbindenden Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Dann wurde die Platte mit einer adhäsiven Folie abgedeckt und über Nacht bei Raumtemperatur oder zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten dreimal mit 200 µl 0,05% Tween-20/PBS (pH 7,4, vol:vol) gewaschen. Dann wurden die Platten auf ein Papiertuch geblottet, um das überschüssige Tween-20/PBS zu entfernen. Anschließend wurde die Blockierlösung (1% BSA in PBS, pH 7,4, gelagert bei 4°C) in jede Vertiefung gegeben (150 μl). Die Platten wurden mit einer adhäsiven Folie abgedeckt und wenigstens 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder 1 Stunde lang bei 37°C oder unbegrenzt bei 4–8°C inkubiert.
  • Dann wurden die Platten weitere dreimal mit 200 µl 0,05% Tween-20/PBS (pH 7,4, vol:vol) gewaschen und auf ein Papiertuch geblottet, um die überschüssige Waschlösung zu entfernen. Das Test- oder native Tierserum in 1% BSA/PBS-Puffer wurde seriell verdünnt (1:100 bis 1:1.000.000). Es wurden doppelte Proben von 100 µl der Verdünnungen des Test- oder Kontroll-(d. h. nicht-immunisierten)serums der Hühner dazugegeben. Die Platten wurden abgedeckt und über Nacht bei 4–8°C oder 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
  • Die Platten wurden dreimal mit 200 µl 0,05% Tween-20/PBS (pH 7,4, vol:vol) gewaschen und auf ein Papiertuch geblottet, um die überschüssige Waschlösung zu entfernen. 100 µl einer Ziege- oder Esel-anti-Huhn-(IgM + IgG)HRP-Konjugat-Lösung (1:6000 verdünnt) in 1% BSA/PBS-Puffer wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden mit einer adhäsiven Folie abgedeckt und wenigstens 4 Stunden lang bei Raumtemperatur oder 2 Sunden lang bei 37°C oder über Nacht bei 4–8°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten erneut dreimal mit 200 μl 0,05% Tween-20/PBS (pH 7,4, vol:vol) gewaschen und auf ein Papiertuch geblottet, um die überschüssige Waschlösung zu entfernen.
  • Schließlich wurden 100 µl Substratlösung in jede Vertiefung gegeben. Die Substratlösung wurde durch Zugeben von 200 µl einer 2,2'-Azino-bis-(3-benzthiazolin-6-sulfonsäure-(ABTS-)Farbstofflösung (die durch Auflösen von 15 mg ABTS-Farbstoff in 1 ml deionisiertem Wasser hergestellt wurde) und 10 µl H2O2 auf 10 ml 0,05 M Citratpuffer, pH 4,0 zubereitet. Nach der Zugabe des Substrats wurden die Platten bei Raumtemperatur inkubieren gelassen und dann auf einem Plattenlesegerät bei 405 nm analysiert. Die Titer wurden als letzte Verdünnung bestimmt, die zu einem Signal führte, das statistisch gesehen signifikant höher als der Untergrund (d. h. das aus einer nicht-immunisierten Kontrollhenne isolierte Serum) bei 405 nm war. Die Titer von Antikörpern aus beispielhaften Hennen sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Serumtiter gegen Huhn-VASA- und -DAZL-Peptidkonjugate nach der Immunisierung von Legehennen
    Nummer des Vogels Antigen Titer 17 Tage nach der Immunisierung Titer 40 Tage nach der Immunisierung
    522 Vasa-C 1:10.000 1:10.000
    524 Vasa-C 1:1.000 1:5.000
    538 Dazl-C 1:1.000 1:5.000
    548 Vasa-C 1:1.000 1:5.000
    Vasa-N 1:1.000 1:10.000
    550 Vasa-C 1:1.000 1:5.000
    Vasa-N 1:1.000 1:5.000
    552 Vasa-C 1:500 1:1.000
    Vasa-N 1:1.000 1:1.000
    554 Dazl-C 1:10.000 1:5.000
    Dazl-N 1:10.000 1:5.000
    556 Dazl-C 1:100.000 1:100.000
    Dazl-N 1:1.000.000 1:1.000.000
    566 Vasa-C Keine Reaktion 1:10.000
    Vasa-N 1:10.000 1:50.000
    Dazl-C Keine Reaktion 1:5.000
    Dazl-N 1:5.000 1:10.000
  • Beispiel 2
  • Bewertung der PGCs in Embryos im Stadium 27
  • Nach der Immunisierung wurden die Eier gesammelt, für maximal 14 Tage gelagert und bis zum Erreichen des Stadiums 27 (H&H) inkubiert. Embryos aus dem Stadium 27 (H&H) wurden getötet und über Nacht bei 4°C in 4% Paraformaldehyd fixiert. Dann wurden die Embryos in Paraffin eingebettet und seriell entlang der Genitalleiste mit einer Dicke von 7 µm geschnitten. Die Scheiben, die den gonadalen Bereich enthielten, wurden von den anderen Scheiben gesammelt und die PGCs in den Gonaden wurden durch immunhistologische Färbung unter Verwenden von monoklonalem Antikörper MC-480 (Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of Iowa, Iowa City, Iowa, Vereinigte Staaten von Amerika), der das für das Stadium spezifische embryonale Antigen-1 (SSEA-1) erkennt, identifiziert. Die immunhistologische Färbung wurde unter Verwenden von mit Avidin-Biotin konjugierter alkalischer Phosphatase (VECTASTAIN® ABC-AP-Kit, Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien, Vereinigte Staaten von Amerika) und BCIP/NBT-(5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblautetrazolium-)Substrat (Amresco, Inc., Solon, Ohio, Vereinigte Staaten von Amerika) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Sektionen nach dem Blockieren in 1,5%-igem normalen Ziegenserum in PBS für 30 Minuten, um eine nicht-spezifische Färbung auszuschließen, nacheinander 60 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem primären Antikörper (1:1000 verdünnte Aszites) inkubiert und 3-mal mit PBS gespült, 30 Minuten lang mit dem biotinylierten zweiten Antikörper inkubiert und 3-mal mit PBS gespült und 30 Minuten lang mit dem ABC-Reagens inkubiert. Nach einem finalen Waschschritt in PBS wurden die Sektionen 15 Minuten lang in dem alkalischen Phsophatasesubstrat (NBT/BCIP-Lösung, Amresco) gefärbt und dann in einem wässrigen Lagermedium gelagert. Beispielhafte Sektionen sind in den 1 bis 3 gezeigt.
  • In 1 wurde die Henne, die das Ei erzeugte, in dem sich der gezeigte Embryo entwickelt, mit Peptiden immunisiert, die aus dem Huhn-VASA-Polypeptid abgeleitet worden waren. Feld A: Kontrolle (keine Immunisierung); Feld B: Immunisierung mit dem Vasa-C-Peptid (SEQ ID NO: 4); Feld C: Immunisierung mit dem Vasa-N-Peptid (SEQ ID NO: 3); Feld D: Immunisierung mit sowohl Vasa-N- als auch Vasa-C. Die SSEA-1+-Zellen (dunkel gefärbte Zellen) sind in dem Kontrollembryo viel übermäßiger vorhanden als in irgendeinem der Embryos, die anti-VASA-Antikörpern ausgesetzt wurden.
  • In 2 wurde die Henne, die das Ei erzeugte, in dem sich der gezeigte Embryo entwickelt, mit Peptiden immunisiert, die aus dem Huhn-DAZL-Polypeptid abgeleitet worden waren. Feld A: Kontrolle (keine Immunisierung); Feld B: Immunisierung mit den DAZL-C-Peptid (SEQ ID NO: 8); Feld C: Immunisierung mit dem DAZL-N-Peptid (SEQ ID NO: 7); Feld D: Immunisierung mit sowohl DAZL-N als auch mit DAZL-C. Die SSEA-1+-Zellen (dunkel gefärbte Zellen) sind in dem Kontrollembryo viel übermäßiger vorhanden als in irgendeinem der Embryos, die den anti-DAZL-Antikörpern ausgesetzt wurden.
  • In 3 wurde die Henne, die das Ei erzeugte, in dem sich der gezeigte Embryo entwickelt, mit Peptiden immunisiert, die sowohl aus dem Huhn-VASA- als auch dem -DAZL-Polypeptid abgeleitet worden waren. Feld A: Kontrolle (keine Immunisierung); Feld B: Immunisierung mit Vasa-N-, Vasa-C-, DAZL-N- und DAZL-C-Peptid (SEQ ID NO: 3, 4, 7 und 8). Die SSEA-1+-Zellen (dunkel gefärbte Zellen) sind in dem Kontrollembryo viel übermäßiger vorhanden als in irgendeinem der Embryos, die sowohl den anti-VASA- als auch den anti-DAZL-Antikörpern ausgesetzt wurden.
  • Eine Verringerung der PGCs wurde durch Zählen der immunhistochemisch gefärbten PGCs in 10 Sektionen von sowohl der linken als auch er rechten Gonade von jedem Embryo bestimmt. Die 10 Sektionen wurden aus dem mittleren Bereich der Gonaden ausgewählt. Zwischen zwei beliebigen ausgewählten Sektionen wurden mindestens drei Sektionen übersprungen, um zu verhindern, dass einzelne PGCs mehr als einmal gezählt wurden. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 4 angegeben. Wie in 4 gezeigt ist, konnte jedes der Peptidantigene Vasa-N, Vasa-C, Dazl-N und Dazl-C eine Immunreaktion in Hühnern hervorrufen, was zu der Abscheidung von anti-Antigen-Antikörpern in dem Dotter von Eiern, die von den immunisierten weiblichen Vögel erzeugt worden waren, führte. Die Gegenwart der Antikörper in den Eiern verringerte die Anzahl an PGCs in den Embryos im Entwicklungsstadium 27. Das Immunisieren von weiblichen Tieren mit den einzelnen Peptiden führte zu einer annähernd 35–55%-igen Verringerung der Anzahl an endogenen PGCs, während eine Immunisierung mit zwei oder mehr Peptiden gleichzeitig zu einer annähernd 55–70%-igen Verringerung der endogenen PGCs führte.
  • Statistische Analyse. Die Unterschiedene in der Behandlung bei der durchschnittlichen Anzahl an PGCs/Embryo wurde unter Verwenden der GLM-Vorgehensweise des SAS-Systems (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, Vereinigte Staaten von Amerika) analysiert. Das Modell war PGC = behandelte Henne. Die Unterschiede in der Behandlung waren bei p < 0,0002 signifikant. Die Mittelwerte wurden unter Verwenden des Multiple Range Tests von Duncan getrennt. Außer Vasa-N waren alle Behandlungen signifikant von der Kontrolle verschieden.
  • Beispiel 3
  • Wiederbevölkern der behandelten Embryos mit Keimzellen
  • Vögel, die gemäß den Beispielen 1 und 2 erzeugt worden waren, wurden als Empfänger verwendet und ihnen wurden exogene PGCs von Donorvögeln verabreicht.
  • A. Herstellung der Donorzellen:
  • Die Gonaden von 5,5 Tage alten Hühnerembryos werden in PBS gesammelt. Die isolierten Gonaden werden in 250 µl 0,02% EDTA in einer 35 mm-Petrischale gesammelt und 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Gonaden werden mit einer Nadel in der Petrischale auseinander gezogen und weitere 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden in 20% FKS enthaltendem DMEM gesammelt und 5 Minuten lang mit 450 g zentrifugiert. Die Zellen werden gewaschen und in DMEM resuspendiert. Die Anzahl der Zellen und deren Lebensfähigkeit werden bestimmt. Die Endkonzentration der lebensfähigen Zellen wird auf ungefähr 1000 Zellen/µl eingestellt.
  • B. Herstellung der Empfängerembryos:
  • Die Empfängerhühnerembryos werden so, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist, hergestellt. Die Embryos werden bis zum Stadium 14 bis 17 (H&H) in den Inkubator eingestellt.
  • C. Injektion von Donor-PGCs in Empfängerembryos:
  • Annähernd 2 bis 3 μl der gonadalen Zellsuspension, die annähernd 100 PGCs enthält, wird in das Blutgefäß von Empfängerhühnerembryos im Stadium 14 bis 17 (H&H) injiziert. Die Empfängereier werden verschlossen und bei 37,5°C, 60% relative Feuchte inkubiert.
  • D. Bewertung der Wiederbevölkerung mit PGCs
  • Die Embryos werden im Stadium 27 (H&H) gesammelt und über Nacht bei 4°C in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Embryos werden in Paraffin eingebettet, mit einer Dicke von 7 um geschnitten und immunhistochemisch mit SSEA-1-Antikörper gefärbt. Die Anzahl an PGCs in der linken und rechten Gonade in 10 zufällig ausgewählten Sektionen von der Kontrolle und den Embryos, denen PGCs injiziert wurden, wird gezählt. Die Ergebnisse werden statistisch unter Verwenden eines t-Tests analysiert, der durchgeführt wird, um die Nullhypothese, nach der die Differenz zwischen den Mittelwerten der Populationen, aus denen die beiden Proben stammen, gleich 0,0 ist, gegenüber der alternativen Hypothese, nach der die Differenz nicht gleich 0,0 ist, zu testen. Wenn der p-Wert für diesen Test kleiner als 0,05 ist, kann die Nullhypothese am 95% Vertrauensintervall zurückgewiesen werden. Es wird ebenso ein 95%-Vertrauensintervall für die Differenz zwischen den Mittelwerten der Populationen bestimmt. Bei wiederholter Probennahme werden 95,0% aller dieser Intervalle die wahre Differenz enthalten.
  • Beispiel 4
  • Erzeugung von intraspezifischen Huhn-Keimbahnchirnären nach Erschöpfen der endogenen PGCs
  • Zum Erzeugen intraspezifischer Keimbahnchimären wird die folgende Vorgehensweise verwendet:
  • A. Erzeugung intraspezifischer Huhn-Keimbahnchimären
  • Barred Plymouth Rock(BPR)-Hühnerembryos werden bis zum Stadium 27 bis 28 (H&H) inkubiert. Die Donorembryos von Barred Plymouth Rock werden als Farbmarker verwendet, da sie an dem Locus I homozygot rezessiv (ii) sind und ein Pigment in ihrem Gefieder erzeugen. Die Gonaden aus den männlichen Embryos werden in DMEM, das mit 10% FKS, Glutamin, antibiotischer und antimykotischer Lösung supplementiert worden war, gesammelt. Die Bestimmung des Geschlechts der Embryos erfolgt durch Verwenden des Verfahrens nach Petitte & Kegelmeyer (Animal Biotechnol. 6: 19–30, 1995). Dann werden die Gonaden zweimal in PBS gewaschen und 15 Minuten lang bei 37% in 0,02% EDTA inkubiert. Es werden frische Medien dazugegeben und die Gonaden werden auseinander gezogen.
  • Die Zellsuspension wird gesammelt und 5 Minuten lang mit 450 × g geschleudert. Die Medien werden ausgetauscht und die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwenden des Trypanblauausschlusses bestimmt. Es werden Aliquots der Zellsuspension genommen und mit SSEA-1-Antikörper gefärbt, um die Anzahl an injizierten PGCs zu bestimmen. Annähernd 2–3 µl der Zellsuspension, die 100 bis 500 PGCs enthielt, wurden in die Blutgefäße von Weißen Lenghorn-(WL-)Embryos in den Entwicklungsstadien 14 bis 17 (H&H) injiziert. Die Wal-Embryos dienten als Empfänger, da bekannt war, dass sie homozygot dominant (II) waren. Dieser Genotyp kodiert für eine Abwesenheit des Pigments in dem Gefieder. Nach der Injektion der PGCs wurden die Eier wieder in den Inkubator eingestellt, um die Entwicklung zu beenden. Beim Bebrüten wurden die phänotypischen WL-Hühner vereinigt und anschließend bis zur Geschlechtsreife gezüchtet. Es wurden die folgenden Testpaarungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob Keimbahnchimären vorhanden waren: männliches BPR X weibliches WL (BPR-PGC) und männliches WL (BPR-PGC) X weibliches BPR. Die Nachkommenschaft dieser Testpaarungen wurden anschließend beurteilt, um zu bestimmen, ob die gonadalen PGCs aus männlichen BPR in das WL, eingebracht wurden. Da nur männliche BPR-Embryos als Donor verwendet wurden, wären alle „schwarzen" Hühner (BPR-Phänotyp), die aus den Testpaarungen männliches BPR X weibliches WL (BPR-PGC) stammten, männlich.
  • B. Herstellung der Empfängerembryos
  • Die Empfängerhühnerembryos werden so, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist, hergestellt. Die Embryos werden im Stadium 27 (H&H) gesammelt und über Nacht bei 4°C in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Embryos werden in Paraffin eingebettet, mit einer Dicke von 7 µm geschnitten und immunhistochemisch mit SSEA-1-Antikörper gefärbt. Die Anzahl an PGCs in der linken und der rechten Gonade wird in 10 zufällig ausgewählten Sektionen von jedem Embryo gezählt. Der Sterilitätsindex (IS) wird unter Verwenden der Gleichung IS = (N – X)/N, wobei N die Anzahl an PGCs aus den Kontrollgonaden und X die Anzahl an PGCs aus dem behandelten Embryo ist, berechnet. (Reynaud, J. Embryol. Morphol. 21: 485–507, 1969).
  • C. Herstellung von interspezifischen embryonalen Truthahn-Huhn-Keimbahnchimären
  • Befruchtete Truthahneier werden 8 bis 8,5 Tage (Stadium 27 bis 28, H&H) bei 38,5°C inkubiert. Die Embryos werden seziert, um die Gonaden zu erhalten. Dann werden 2–3 µl der gonadalen Zellsuspension, die annähernd 150 PGCs enthält, in die Blutgefäße von Hühnerembryos im Stadium 14 (H&H) injiziert. Die Empfängereier werden verschlossen und wieder in den Inkubator eingestellt. Die Empfängerembryos werden an verschiedenen Stadien der Inkubation (Stadium 19 bis Stadium 25) gesammelt. Die Embryos werden dreimal in PBS gespült und dann über Nacht bei 4°C in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Proben werden dreimal in PBS gewaschen und dann in 50% Ethanol angeordnet. Dann werden die Gewebe dehydriert, in Paraffin eingebettet und geschnitten. Die resultierenden Sektionen werden anschließend immunhistochemisch durch Färben mit SSEA-1 und Periodsäure-Schiff (PAS) analysiert.
  • D. Ergebnisse
  • Nach der Doppelfärbung mit SSEA-1 und PAS werden die Hühner- und Truthahn-PGCs in der Gonade des Hühnerembryos auf Basis der unterschiedlichen Färbemuster identifiziert. Aufgrund der Gegenwart von Glykogen weisen sowohl die Hühner- als auch die Truthahn-PGCs nach der Färbung eine Magentafarbe auf. Die Truthahn-PGCs sind jedoch nicht länger SSEA-1-positiv, wenn sie sich in der sich entwickelnden Gonade niederlassen wodurch sie sich von den PGCs der Hühner unterscheiden, die in diesem Entwicklungsstadium SSEA-1-positiv sind.
  • Die Nachkommenschaft aus einer WL (II) X BPR (ii)-Kreuzung würde üblicherweise den WL-Phänotyp (Ii) exprimieren und eine Abwesenheit des Melaninpigments in dem Gefieder zeigen.
  • Beispiel 5
  • Erzeugung von intraspezifischen Chimären und Testpaarung
  • Unter Verwenden ähnlicher Protokolle wie denjenigen, die in den vorhergehenden Beispielen beschrieben wurden werden Weiße Leghorn-(WL-)Embryos behandelt, um endogene PGCs zu erschöpfen. Die Gonaden aus den männlichen Barred Plymouth Rock-(BPR-)Embryos werden gesammelt, die PGCs isoliert und die isolierten PGCs werden den behandelten Vögeln und den unbehandelten Kontrollvögeln in ovo verabreicht, wie es im Wesentlichen in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben ist. Nach dem Bebrüten werden die männlichen chimären WL-(BPR-PGC)Vögel bis zur Geschlechtsreife aufgezogen und mit weiblichen BPR-Vögeln gekreuzt. Die Erzeugung einer schwarzen Nachkommenschaft zeugt eine Transmission der aus den BPR-PGCs stammenden Gameten durch den chimären männlichen WL-(BPR-PGC)Elter an. Sequenzprotokoll
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Claims (16)

  1. Verfahren zur Modulierung der Anzahl von Urkeimzellen, PGCs (primordial germ cells), in einem Vogel-Embryo, wobei das Verfahren ein Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, umfasst, wobei ein durch den weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die Anzahl von endogenen PGCs in einem Vogel-Embryo, der in dem Ei vorhanden ist, zu modulieren.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der weibliche Vogel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Kanadakranich ausgewählt ist, wobei der weibliche Vogel bevorzugt ein Huhn ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein Epitop eines Polypeptids umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL besteht.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Immunisierungsschritt eine Abnahme der Zahl der Urkeimzellen in dem Vogel-Embryo zur Folge hat, oder wobei der Immunisierungsschritt eine Zunahme der Urkeimzellzahlen in dem Vogel-Embryo zur Folge hat.
  5. Verfahren zum Modulieren der Entwicklung einer Urkeimzelle in einem Vogel-Embryo, wobei das Verfahren das Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen umfasst, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wobei ein durch den weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die Entwicklung von PGCs in einem Vogel-Embryo, der in dem Ei vorhanden ist, zu modulieren.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Antigen ein Epitop eines Polypeptids umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL besteht, oder wobei der weibliche Vogel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Kanadakranich besteht, wobei vorzugsweise der Vogel ein Huhn ist, oder wobei der Immunisierungsschritt eine Hemmung der Entwicklung von Urkeimzellen im Vogel-Embryo zur Folge hat, oder wobei der Immunisierungsschritt eine Verbesserung der Entwicklung der Urkeimzellen im Vogel-Embryo zur Folge hat.
  7. Verfahren zur Erzeugung eines chimären Vogels, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist; (b) Erzeugen eines Eies aus dem weiblichen Vogel, wobei das Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung, die PGC-Zahl oder Kombinationen hiervon zu modulieren, in einem Empfänger-Embryo, der im Ei vorhanden ist; und (c) Verabreichen von Spender-PGCs an den Empfänger-Embryo in ovo, um einen chimären Vogel zu erzeugen.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Antigen ein Epitop eines Polypeptids umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL besteht.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Spender-PGCs von derselben Vogelspezies wie der Empfänger-Embryo stammen, oder wobei die Spender-PGCs von einer anderen Vogelspezies als der Empfänger-Embryo stammen, oder das vorzugsweise weiterhin das Inkubieren des chimären Vogels zum Ausbrüten umfasst, oder vorzugsweise, wobei weiterhin der weibliche Vogel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Kanadakranich besteht.
  10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Spender-PGCs von einem Vogel-Embryo stammen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Schreikranich besteht, oder wobei die Spender-PGCs zwei männliche determinative (Z) Chromosomen trägt, oder wobei die Spender-PGCs ein weibliches determinatives (W) Chromosom trägt, oder wobei die Verabreichung durch in ovo Injektion stattfindet, oder wobei die Spender-PGCs verabreicht werden, wenn der Empfänger-Embryo zwischen Stadium IX gemäß des Eyal-Giladi & Kochav Einordnungssystems und Stadium 30 gemäß Hamburger & Hamilton Einstufungssystem ist, oder wobei die Spender-PGCs verabreicht werden, wenn der Empfänger-Embryo sich in Stadium 14 gemäß dem Hamburger & Hamilton Einstufungssystem befindet, oder wobei die Spender-PGCs aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen sichelförmigen PGCs besteht, oder wobei der Verabreichungsschritt durch Injizieren des Empfänger-Embryos mit blastodermalen Zellen durchgeführt wird, und wobei sich die blastodermalen Zellen im Empfänger-Embryo zu Spender-PGCs differenzieren.
  11. Verfahren zur Erhöhung des Anteils männlicher Vögel in einer Vielzahl von Vogeleiern, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist; (b) Erzeugen eines Eies aus dem weiblichen Vogel, wobei das Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung in einem weiblichen Empfängervogel zu modulieren, der innerhalb des Eies vorhanden ist; (c) Verabreichen von männlichen (ZZ) PGCs in ovo an den weiblichen Empfängervogel; (d) Inkubieren des weiblichen Empfängervogels zum Bebrüten; (e) Aufziehen des weiblichen Empfängervogels bis zur Geschlechtsreife; und (f) Erzeugen einer Vielzahl von Vogeleiern aus dem weiblichen Empfängervogel, wobei der Anteil an männlichen Vögeln in der Vielzahl von Vogeleiern, die durch den weiblichen Empfängervogel erzeugt wird, höher ist als er sein würde, wenn er in Abwesenheit der Verabreichung der männlichen (ZZ) PGCs zum weiblichen Empfängervogel in ovo erzielt worden wären.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Antigen ein Epitop eines Polypeptides umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL besteht, oder wobei die Spender-PGCs aus derselben Vogelspezies wie der Empfänger-Embryo stammen, oder wobei die Spender-PGCs aus anderen Vogelspezies als der Empfänger-Embryo ausgewählt sind, oder wobei der weibliche Vogel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Kanadakranich besteht, oder wobei die Spender-PGCs aus einem Vogel-Embryo stammen, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel und Schreikranich besteht, oder wobei die Verabreichung durch in ovo Injektion durchgeführt wird, oder wobei die Spender-PGCs verabreicht werden, wenn der Empfänger-Embryo zwischen Stadium IX gemäß dem Eyal-Giladi & Kochav Einstufungssystem und Stadium 30 gemäß dem Hamburger & Hamilton Einstufungssystem befindlich ist, oder wobei die Spender-PGCs verabreicht werden, wenn der Empfänger-Embryo sich gemäß des Hamburger & Hamilton Einstufungssystems nach Stadium 14 befindet, oder wobei die PGCs aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen sichelförmigen PGCs besteht, oder, wobei der Verabreichungsschritt durch Injizieren des Empfänger-Embryos mit blastodermalen Zellen durchgeführt wird, und wobei die blastodermalen Zellen sich im weiblichen Empfängervogel zu Donor-PGCs differenzieren.
  13. Verfahren zur Erzeugung von Vogelgameten aus einer zweiten Vogelspezies in einer ersten Vogelspezies, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Immunisieren eines weiblichen Tieres der ersten Vogelspezies mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wobei ein durch das weibliche Tier erzeugte Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung eines Empfängervogels der ersten Vogelspezies, die innerhalb des Eies vorhanden ist, zu modulieren; (b) Einführen von Donor-PGCs, die aus einem Vogel der zweiten Vogelspezies isoliert wurde, in den Empfängervogel der ersten Vogelspezies; (c) Inkubieren des Empfängervogels der ersten Vogelspezies zur Bebrütung; und (d) Aufziehen des Empfängervogels der ersten Vogelspezies bis zur Geschlechtsreife, wobei der Empfängervogel der ersten Vogelspezies Gameten aus der zweiten Vogelspezies erzeugt.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Antigen ein Epitop eines Polypeptides umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL besteht, oder wobei die erste Vogelspezies und die zweite Vogelspezies jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel, Kanadakranich und Schreikranich besteht, oder wobei die erste Vogelspezies und die zweite Vogelspezies dieselbe sind, oder wobei die erste Vogelspezies und die zweite Vogelspezies verschieden sind, oder wobei die Verabreichung durch in ovo Injektion stattfindet, oder wobei die Spender-PGCs verabreicht werden, wenn der Empfängervogel der ersten Vogelspezies sich zwischen Stadium IX gemäß dem Eyal-Giladi & Kochav Einstufungssystem und Stadium 30 gemäß dem Hamburger & Hamilton Einstufungssystem befindet, oder wobei die Donor-PGCs verabreicht werden, wenn der Empfängervogel der ersten Vogelspezies sich nach Stadium 14 gemäß dem Hamburger & Hamilton Einstufungssystem befindet, oder wobei die PGCs aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen sichelförmigen PGCs besteht, oder wobei der Verabreichungsschritt durch Injizieren des Empfängervogels der ersten Vogelspezies mit blastodermalen Zellen durchgeführt wird, und wobei die blastodermalen Zellen sich in den Spender-PGCs im Empfängervogel der ersten Vogelspezies differenzieren.
  15. Verfahren zur Vergrößerung der Keimlinientransmission eines Nukleinsäuremoleküls in einem Vogel, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Immunisieren eines weiblichen Vogels mit einem Antigen, das mit Urkeimzellen assoziiert ist, wobei ein durch den weiblichen Vogel erzeugtes Ei eine ausreichend hohe Konzentration an Antikörpern umfasst, die für das Antigen spezifisch sind, um die PGC-Entwicklung in einem Empfängervogel, der im Ei vorhanden ist, zu modulieren; (b) Verabreichen einer Vielzahl von Spender-PGCs, die das Nukleinsäuremolekül umfassen an den Empfängervogel unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zumindest einer der Vielzahl von PGCs zu ermöglichen, eine Gonade des Empfängervogels zu kolonisieren; (c) Inkubieren des Empfängervogels zum Bebrüten; (d) Aufziehen des Empfängervogels bis zur Geschlechtsreife, wobei der Empfängervogel Gameten erzeugt, die aus den Donor-PGCs abgeleitet sind.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Antigen ein Epitop eines Polypeptides umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis und DAZL besteht, oder wobei der Empfängervogel und die Donor-PGCs jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Huhn, Truthahn, Ente, Wachtel, Kanadakranich und Schreikranich besteht, oder wobei die Donor-PGCs aus derselben Vogelspezies wie der Empfängervogel stammen oder wobei die Donor-PGCs aus unterschiedlichen Vogelspezies wie der Empfängervogel stammen, oder wobei die Verabreichung durch in ovo Injektion stattfindet, oder wobei die Donor-PGCs verabreicht werden, wenn der Empfängervogel zwischen Stadium IX gemäß des Eyal-Giladi & Kochav Einstufungssystem und Stadium 30 gemäß dem Hamburger & Hamilton Einstufungssystem befindet, oder wobei die Donor-PGCs verabreicht werden, wenn der Empfängervogel sich nach Stadium 14 gemäß des Hamburger & Hamilton Einstufungssystems befindet, oder wobei die PGCs aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gonadalen PGCs, Blut-PGCs und germinalen sichelförmigen PGCs besteht, oder wobei der Verabreichungsschritt durch Injizieren des Empfängervogels mit blastodermalen Zellen durchgeführt wird und wobei die blastodermalen Zellen sich in Donor-PGCs im Empfängervogel differenzieren.
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