DE69527439T2

DE69527439T2 - Inhibin enthaltende Zusammensetzung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE69527439T2
Application number: DE69527439T
Authority: DE
Inventors: C. Fioretti; Konstantin Kousoulas; G. Satterlee
Original assignee: Agritech Technologies Ltd; Louisiana State University
Current assignee: Agritech Technologies Ltd; Louisiana State University
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 2003-02-20
Anticipated expiration: 2015-03-01
Also published as: AU2095995A; DE69527439D1; ES2181771T3; MX9603702A; FI963325A; EP0804219A1; NO963572D0; DK0804219T3; RU2170100C2; EP0804219B1; CA2184183A1; NO963572L; EP0804219A4; ATE220554T1; PL316628A1; WO1995022980A1; NZ282981A; PT804219E; JPH09510702A; CN1149258A

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein gesagt auf ein Verfahren zur Beschleunigung des Beginns der Pubertät in Vögeln, genauer gesagt in Ratitae und Psittaciformes, indem ein heterologes Protein, das die α-Untereinheit eines Vogels-Inhibinproteins, oder ein Fragment davon, und ein Trägerprotein umfasst, verabreicht wird. Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Erhöhung der Eiproduktion in Vögeln, genauer gesagt in Ratitae, indem ein heterologes Protein, das die α-Untereinheit eines Vogel-Inhibinproteins, oder ein Fragment davon, und ein Trägerprotein umfasst, verabreicht wird. Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein heterologes Protein, das die α-Untereinheit eines Vogel-Inhibinproteins, oder ein Fragment davon, und ein Trägerprotein umfasst, und ein Verfahren zur Herstellung des heterologen Proteins, wobei das Inhibin an das Trägerprotein fusioniert ist.

Hintergrund der Erfindung

Ratitae sind nicht fliegende, im Allgemeinen große, laufende Vögel, die verschiedene Ordnungen umfassen, einschließlich die Spezies Vogel Strauß, Emu, Nandu, Kasuaren und Kiwis. Ein Emu (Dromiceius novaehollandiae) ist ein australischer Ratiten-Vogel, der durch rudimentäre Flügel und einen gefiederten Kopf und Hals charakterisiert ist. Ein durchschnittlicher erwachsener Emu ist ungefähr 6 Fuß groß und wiegt ungefähr 150 Pfund. Ein Vogel Strauß (Struthio camelius) ist ein großer Laufvogel mit kleinen Flügeln und dicken kräftigen Beinen. Ein üblicher erwachsener Vogel Strauß ist ungefähr 8 Fuß hoch und wiegt ungefähr 325 bis 375 Pfund. Der Begriff "Nandu" ist der allgemeine Name für Mitglieder der Vogel-Ordnung Rheiformes. Rheiformes sind eine Ordnung von südamerikanischen Laufvögeln, genannt amerikanische Vogel Strauße, die sich von den tatsächlichen Vogel Straußen in ihrer geringeren Größe, einem gefiederten Kopf und Hals und dreizehigen Füßen unterscheiden, neben anderen Merkmalen.
Der Vogel Strauß und der Emu haben lange Zeit in ihren natürlichen Umgebungen von Südafrika, bzw. von Australien einen kommerziellen Wert gehabt. Produkte des Vogel Straußes waren für mehr als 100 Jahre sehr gefragt und ein wesentlicher, weltweiter Markt besteht für deren Häute, Fleisch und Federn. Beispielsweise wird Vogel-Strauß-Leder für Stiefel, Handtaschen, Jacken, Aktenkoffer, Brieftaschen und viele andere Artikel verwendet. Vogel-Strauß-Federn werden für die Mode, für die Kostümierung und für Staubwedel aus Federn verwendet. Beispielsweise werden Vogel- Strauß-Federn in Europa für ungefähr $ 60 bis $ 1200 je Kilogramm Federn verkauft. Außerdem werden Vogel-Strauß-Federn als "Staubmagneten" betrachtet und haben daher eine hohe Nachfrage bei der Computer- und Automobilindustrie in den Vereinigten Staaten und im Ausland.
Im Gegensatz dazu ist der Emu eine relative Neuerscheinung auf dem Markt. Er wird für dieselben Produkte verwertet, darüber hinaus für eine ölige Essenz, die in der Kosmetikindustrie verwendet wird. Emu-Öl, das aus einer dicken Schicht von unter der Haut befindlichem Fett gewonnen wird, hat tiefeindringende Eigenschaften, welche das Öl für kosmetische Cremes, wie z. B. faltenverzögernde Linderungsmittel geeignet macht. Außerdem werden derzeit mögliche medizinische Anwendungen von Emu-Öl, wie z. B. die Behandlung von Arthritis, untersucht. Ein typischer, vollständig gewachsener Emu kann eine Höhe von 1,6 bis 1,9 m oder mehr erreichen und wiegt 30 bis 45 kg oder mehr. Emus werden mit ungefähr einem Jahr geschlechtsreif und prä- und postpubertierende Emus zeigen keine geschlechtsspezifischen phänotypischen Unterschiede. Ähnlich wie bei dem Vogel Strauß hat die Emu-Population in den Vereinigten Staaten ebenfalls ein explosives Wachstum innerhalb der letzten mehreren Jahre durchgemacht. Im Jahr 1994 gab es ungefähr eine Gesamtzahl von 150.000 Emus, einschließlich 15.000 brütender Paare in den Vereinigten Staaten. Es wird vorausgesagt, dass die Anzahl von Emus 1995 weiter steigen wird, auf ungefähr 500.000 bis 750.000 Vögel, wobei erwartet wird, dass 45.000 davon brütende Paare sein werden.
Es gibt eine steigende Nachfrage für Ratita-Produkte in verschiedenen Ländern, einschließlich Australien, Belgien, Israel, Kanada und den Niederlanden, Namibia, Südafrika und Zimbabwe. Dementsprechend gab es in den letzten mehreren Jahren ein explosives Wachstum im Binnenmarkt für Vogel Strauß und Emu, und zu einem geringeren Ausmaß für Nandu. In den letzten fünf Jahren ist die Anzahl an brütenden Vogel-Strauß-Paaren und die Gesamtzahl an Vögeln in den Vereinigten Staaten auf das 7,5-, bzw. das 20-Fache angestiegen. Es wird geschätzt, dass 1995 200.000 Vogel Strauße, einschließlich 20.000 brütender Paare, in den Vereinigten Staaten bestehen werden. Das enorme Interesse für das Züchten dieser Vögel entspricht dem bedeutenden Wert der erwachsenen, ebenso wie den noch nicht reifen Vögeln, und insbesondere dem von nachweislich brütenden Paaren von Vogel Straußen, die mit einer Höhe von $ 75.000 bewertet werden, wobei ein Emu-Paar mit $ 30.000 oder mehr bewertet wird. Noch nicht geschlechtsreife Vogel Strauße mit einem Alter von 3 oder 4 Monaten werden mit ungefähr $ 7.500 bewertet und ein noch nicht geschlechtsreifer Emu wird mit ungefähr $ 5.000 bewertet. Eine Mehrzahl der Tiere wird in einem Alter zwischen 3 und 6 Monaten gekauft.
Darüber hinaus gibt es ein enormes Interesse an Ratitae als eine Alternative zu mehr traditionellen Formen der tierischen Landwirtschaft. Verschiedene Faktoren, die auf Ratitae bezogen sind, machen diese zu einer überlegenen Alternative gegenüber den mehr traditionellen Formen der tierischen Landwirtschaft (d. h. Rinder-, Schweine- und Schafhaltung). Dies Faktoren schließen die folgenden ein: überlegene Futterumsatzverhältnisse, eine größere Fähigkeit intensiv gehalten zu halten, eine große Tiergröße, eine verstärkte Reproduktivitätskapazität und einen außerordentlichen Nährwert von deren Fleisch.
Beispielsweise enthält Vogel-Strauß-Fleisch, welches ein rotes Fleisch ähnlich dem Rindfleisch ist, signifikant weniger Fett, Kalorien und Cholesterin als Hühnchen- oder Truthahnfleisch. Genauer gesagt enthält eine 85-g-Portion an Vogel-Strauß-Fleisch 2 g Fett, 58 mg Cholesterin und 97 Kalorien. Im Gegensatz dazu enthält eine 85-g-Portion an Truthahnfleisch 3 g Fett, 59 mg Cholesterin und 135 Kalorien. Eine 86-g-Portion an Hühnchenfleisch enthält 3 g Fett, 73 mg Cholesterin und 140 Kalorien. Eine 85-g-Portion an Rindfleisch (Steak) enthält 15 g Fett, 77 mg Cholesterin und 240 Kalorien. Und letztlich, eine 85-g-Portion Schweinefleisch enthält 19 g Fett, 84 mg Cholesterin und 275 Kalorien. (Die Werte für Vogel-Strauß-Fleisch wurden von AMSI Qualitäts-Laborreport # 0800100 erhalten. Die Werte für die anderen Fleischarten wurden dem U.S.D.A. Handbuch Nr. 8, "Nährwerte für Lebensmittel" entnommen.) Ähnlich dem Vogel Strauß, ist das Emufleisch ein rotes Fleisch mit niedrigem Fettgehalt. Genauer gesagt enthält eine 100-g-Portion Emufleisch 1,7 g Fett, 57 mg Cholesterin und 109 Kalorien. (Die Werte für das Emufleisch wurden von den Silliker Laboren aus Texas, Inc. erhalten.)
Außerdem liefern Ratitae, wie z. B. Vogel Strauße, ungefähr 100 Pfund an Fleisch im Alter von 12 Monaten und stellen daher eine wesentliche Menge an Fleisch in einer relativ kurzen Zeitdauer her.
Eine Veranschaulichung dafür, wie sehr Ratitae eine überlegene Alternative gegenüber den mehr traditionellen Formen der tierischen Landwirtschaft ist, ist der folgende Vergleich eines Vogel Straußes und einer Kuh. Zunächst einmal hat ein Vogel Strauß eine Befruchtungs- und Austragungsdauer von 42 Tagen, wogegen eine Kuh 280 Tage benötigt. Zweitens produziert ein mittlerer Vogel Strauß mehr als 20 Nachkommen pro Jahr, wogegen eine Kuh einen Nachkommen pro Jahr gebiert. Drittens ist die Futterumsatzrate eines Vogel Straußes weniger als 2 : 1, wogegen das Futterumsatzverhältnis einer Kuh 5 : 1 ist. Viertens betragen die Tage von der Empfängnis bis zum Schlachter für einen Vogel Strauß ungefähr 407 Tage, im Gegensatz zu 645 Tagen für eine Kuh. Letztlich produzieren Vogel Strauße zusätzlich zu ihrem Fleisch und Leder Federn, wogegen Kühe keine anderen Produkte als Fleisch und Leder herstellen.
Betrachtet man diese Attribute und den steigenden Bedarf der Weltbevölkerung an Fleisch, das nahrhaft ist und gleichzeitig einen niedrigen Fett- und Cholesteringehalt hat, und das effizient hergestellt werden kann bei gleichzeitiger minimaler negativer Belastung der Umwelt, hat die Ratita-Industrie ein hohes Potential für zukünftiges Wachstum.
Derzeit übersteigt die Nachfrage für Ratitae bei weitem das Angebot. Die Ratitae-Züchter sind jedoch durch eine suboptimale Eiproduktion der meisten Weibchen im brütenden Alter limitiert. Abhängig von der Spezies legen die meisten Ratitae in Gefangenschaft derzeit im Mittel 10-20 Eier pro Jahr, wogegen angenommen wird, dass deren genetisches Potential für die Eiproduktion mehr als 60 Eier pro Jahr übersteigen sollte. Beispielsweise kann ein hochproduktiver Vogel Strauß in der Wildnis ungefähr alle 48 Stunden während der Brutsaison ein Ei legen, und ein hochproduktiver Emu kann ungefähr alle 72 Stunden während der Brutsaison in freier Wildbahn ein Ei legen. Im Gegensatz dazu benötigt ein Vogel Strauß in Gefangenschaft häufig 5 bis 10 Tage um ein Ei zu legen, und ein Emu benötigt häufig 4 bis 8 Tage, um ein Ei zu legen.
Ein Schlachtmarkt für Ratitae wird sich nicht entwickeln, bis jährlich eine genügende Anzahl an Nachkommen produziert wird. Entsprechend einigen Abschätzungen müssen wenigstens 250.000 Tiere jährlich erhältlich sein, um einen Schlachtmarkt aufrechtzuerhalten. Daher wird ein Verfahren zur Beschleunigung der Eiproduktion das Wachstum des Marktes deutlich beschleunigen. Dementsprechend gibt es eine Notwendigkeit für eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Erhöhung der Eiproduktion in Vögeln, und insbesondere in Ratitae, wie z. B. Vogel Strauße und Emus.
Es besteht außerdem eine Notwendigkeit für eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Erhöhung der Eiproduktion in exotischen Vögeln, wie z. B den Psittaciformes. Psittaciformes schließen Papageien ein und sind eine monofamiliäre Ordnung an Vögeln, die Zygodaktylismus aufweisen und eine stark gekrümmten Schnabel haben. Ein Papagei ist definiert als irgendein Mitglied der Vogelfamilie Psittacidae (die einzelne Familie der Psittaciformes), unterschieden durch den kurzen, kräftigen, stark gebogenen Schnabel.
In letzter Zeit war das Hormon Inhibin als ein potentielles Hilfsmittel zur Verstärkung der Ovulation in Säugetieren untersucht worden. Inhibin ist ein Peptidhormon, das in erster Linie durch die Gonaden hergestellt wird, und genauer gesagt durch die wachsenden Follikel. In Säugetieren funktioniert es als ein inhibierender Feedback-Regulator der Sekretion des follikelstimulierenden Hormons ("FSH") der Hirnanhangdrüse. Während die Existenz des Inhibins vor mehr als 60 Jahren zuerst postuliert wurde, wurde seine chemische Isolierung erst vor kurzem erreicht.
Das Inhibin aus Säugetier ist ein dimeres Proteinhormon, das aus einer α-Untereinheit (Molekulargewicht 18.000) und einer β-Untereinheit (Molekulargewicht 14.000) zusammengesetzt ist. Die α-Untereinheit ist einmalig in Inhibin, wogegen Dimere der β-Untereinheit Aktivin bilden, ein Hormon, das FSH aus der Hirnanhangdrüse freisetzt. Die β-Untereinheit besteht in zwei Formen (βa und βb), die unterschiedlich, jedoch relativ ähnlich sind. Daher besteht Inhibin abhängig von der involvierten β- Untereinheit als Inhibin-A oder Inhibin-B. Beide Untereinheiten, α und β, sind, wenn sie durch Disulfidbrücken verbunden sind, für die biologische Aktivität für die Unterdrückung der Sekretion des follikelstimulierenden Hormons ("FSH") aus der Hirnanhangdrüse erforderlich. Die Aminosäuresequenz der α-Untereinheit des Inhibins zeigt ungefähr 80 bis 90% Ähnlichkeit unter den Spezies Schwein, Rind, Mensch, Maus und Haushuhn. Herausragende Überblicke über die Isolierung, Herstellung, einen Assay und die biologischen Wirkungen des Inhibins sind bei Risbridger et al., Current Perspectives of Inhibin Biology, Acta Endocrinologica (Copenh.), 122: 673-682, (1990): und Rivier, C. et al., Studies of the Inhibin Family of Hormones: A Review, Hormone Research, 28: 104-118 (1987) erhältlich.
In Säugetieren und Vögeln spielt FSH eine Rolle bei dem Follikelwachstum und der Entwicklung, wogegen von dem luteinisierenden Hormon ("LH") angenommen wird, dass es die Ovulation induziert. Verschiedene Hirn- und Gonadenfaktoren (Peptide und Steroidhormone) interagieren, um die Gonadotropin-Hormonfreisetzung zu kontrollieren. Von diesen Faktoren üben das Gonadotropin-freisetzende Hormon ("GnRH") und Inhibin gegensätzliche Kontrollen auf die FSH-Freisetzung der Hirnanhangdrüse in Säugetieren aus. Das Gonadotropin-freisetzende Hormon ist ein Decapeptid aus dem Gehirn, das in der Weise agiert, dass es die FSH- und LH-Sekretion stimuliert, während Inhibin ein Protein aus den Gonaden ist, das anscheinend in der Weise agiert, dass es selektiv die FSH-Sekretion in Säugetieren inhibiert.
Eine Grundkenntnis des Ovulationsprozesses in einem Vogel ist notwendig, um die Rolle des Inhibins für die endokrine Kontrolle der Ovulation in Vögeln zu verstehen. Die wachsenden Follikel in dem funktionell reifen Eierstock des Haushuhnes bestehen in einer klaren Größenhierarchie. Ein typischer Eierstock enthält vier bis sechs große, zwei bis vier Zentimeter im Durchmesser, mit Eigelb gefüllte Follikel (F1 bis F4, F6), begleitet von einer größeren Anzahl an kleineren, zwei bis zehn Millimeter gro0en, gelben Follikeln und einer Anzahl an sehr kleinen weißen Follikeln. Der größte Follikel vor der Ovulation (F1) ist dazu bestimmt, am nächsten Tag zu ovulieren, der zweitgrößte (F2) an dem folgenden Tag (ungefähr 26 Stunden später). usw. Die Kontrolle der follikulären Bereitstellung und Entwicklung innerhalb dieser Hierarchie ist nur geringfügig verstanden. Die Beteiligung des Gonadotropins aus der Hirnanhangdrüse ist bewiesen worden, jedoch bleibt die Rolle des Inhibins bei der Kontrolle der Gonadotropinsekretion in Vögeln und die Kontrolle der Ovulation unklar.
Eine neuere Strategie die Hyperovulation in Säugetierspezies zu induzieren war die Entwicklung von Verfahren, die die Neutralisierung der endogenen Inhibinaktivität einschließen. Z. B. wurde die aktive Immunisierung von Säugetieren gegen verschiedene Inhibin enthaltende Verbindungen untersucht. Die Immunoneutralisation von Inhibin ging mit verstärkten Ovulationsraten in Färsen, Schafen, Ziegen und Ratten einher.
Es wurde angenommen, dass beschleunigte Ovulationsraten, die in Säugetieren gefunden wurden, die mit antigenen Inhibinpräparationen geimpft wurden, eine Konsequenz aus erhöhten Plasma-FSH-Leveln seien, die zu verstärkter ovarieller Follikelentwicklung führte. Eine Vielzahl von Antigenen wurden als Impfstoffe in Studien verwendet, die eine Verstärkung hinsichtlich der Ovulationsrate von Säugetieren zeigten. Einige der Antigene, die in Säugetieren getestet wurden, schließen folgende ein: aus rekombinanter DNA erhaltene Fragmente der α-Untereinheit des Inhibins (Wrathall et al., Effects of active immunization against a synthetic peptide sequence of the inhibin α-subunit on plasma gonadotrophin concentrations, ovulation rate and lambing rate in ewes, J. Reprod. Fert., 95: 175-182, 1992; und Meyer et al., Antiserum to an Inhibin Alpha-Chain Peptide Neutralizes Inhibin Bioactivity and Increases Ovulation Rate in Sheep, Scientific Journal Series of the Minnesota Agric. Exp. Sta., Blatt Nr. 17, 103, 1991), synthetische Peptidreplikas der N-terminalen Sequenz der α-Untereinheit des Inhibins aus Rind, gekoppelt an Ovalbumin (Glencross et al., Effect of active immunization of heifers against inhibin on plasma FSH concentrations, ovarian follicular development and ovulation rate, Journal of Endocrinology, 134, 11-18, 1992), synthetische Peptidsequenzen der α-Untereinheit des Inhibins aus Rind, konjugiert an humanes Serumalbumin (Morris et al., Effect of immunization against synthetic peptide sequences of bovine inhibin α-subunit on ovulation rate and twin-calving rate in heifers, Journal of Reproduction and Fertility, 97: 255-261, 1993) und partiell gereinigtes Inhibin aus follikulärer Flüssigkeit des Rindes (Morris et al., Effect of Immunizing Prepuberal Lambs of Low and High Ovulation Rate Genotypes with Inhibin Partially Purified From Bovine Follicular Fluid, Theriogenology, Vol. 35 Nr. 2, 1991).
Ungeachtet sich widersprechender Daten darüber, wie die Level an FSH während des Ovulationszyklus schwankten, verstärkte die Immunoneutralisation an endogenem Inhibin in allen zyklischen Säugetieren, die untersucht wurden, einheitlich die follikuläre Entwicklung im Eierstock und die Ovulationsrate, unabhängig von dem verwendeten Antigen oder der behandelten Säugetierspezies.
Wie oben bereits gesagt, bleibt die Beteiligung des Inhibins an der Regulation der reproduktiven Funktion in Vogelspezies unklar. Bisher waren publizierte Berichte auf die reproduktive Funktion des Inhibins in domestiziertem Geflügel beschränkt. Der größte Teil dieser Literatur unterstützt die Theorie, dass Inhibin wahrscheinlich parallele physiologische Rollen in Geflügel spielt, wie die, die in Säugetieren dokumentiert sind: in Hennen kann Inhibin als ein Regulator der Follikelbereitstellung und/oder -entwicklung dienen. Es kann jedoch sein, oder auch nicht, dass in Vögeln die Beteiligung des Inhibins an der Kontrolle der Ovulationsrate durch die Unterdrückung der FSH-Sekretion der Hirnanhangdrüse erfolgt. Z. B., obwohl herausgefunden wurde, dass Hennen, die wenig Eier produzieren, höhere Level an Inhibin im Plasma und den Granulosa- Zellschichten der präovulären Follikel haben als Hennen, die viele Eier produzieren, konnte kein Unterschied in den Plasma-FSH-Leveln gefunden werden, die mit der Rate des Eierlegens in Zusammenhang stehen. Wang et al., Increase in Ovarian α-Inhibin Gene Expression and Plasma Immunoreactive Inhibin Level is Correlated with a Decrease in Ovulation Rate in the Domestic Hen, General and Comparative Endocrinology, 91, 52-58, (1993). Diese Referenz legt daher nahe, dass in Hennen die auf die Ovulationsrate bezogenen Unterschiede der Genexpression der α-Untereinheit des Inhibins und der immunoreaktive Inhibin-Plasmalevel die Ovulationsrate nicht direkt durch eine Modulation des Plasma-FSH-Levels beeinflusst. Außerdem wurde in Johnson, P. A., Inhibin in the Hen, Poultry Science, 72: 955-958, (1993), ein Rinder-RIA-System verwendet, um immunoreaktives Inhibin in Plasma von Hühnern erfolgreich einzuschätzen, jedoch wurde keine signifikante Spitze an immunoreaktivem Inhibin während des Ovulationszyklus detektiert, trotz einer präovulatorischen Woge an LH. Dementsprechend bleibt die Rolle des Inhibins für die Follikelentwicklung in Vögeln unklar.
In jüngerer Zeit wurde die α-Untereinheit des Huhn-Inhibins erfolgreich kloniert und sequenziert. Wang und Johnson, Complementary Desoxyribonucleic Acid Cloning and Sequence Analysis of the α-Subunit from Chicken Ovarian Granulosa Cells, Biology of Reproduction, 9, 1-6, (1993). Der Vergleich der Vogel-Inhibinsequenz mit bekannten Sequenzen der α- Untereinheit des Inhibins aus Säugern zeigte eine 86-89%-ige Homologie. Die Northern Blot Analyse, bei der zwei isolierte Proben (cINA&sub6; und cINA&sub1;&sub2;) verwendet wurden, zeigte, dass die α-Untereinheit des Inhibins in hühnerovaren Granulosa-Zellen, jedoch nicht in dem Gehirn, der Niere, der Leber oder Milzgeweben exprimiert wird.
Daher bleibt die Biologie des Inhibins in Vögeln wenig verstanden und die Antworten der Vögel auf Behandlungen mit antigenem Inhibin wurden bisher nicht untersucht oder überwacht. Dementsprechend, da der Ratita- Markt wesentlich limitiert ist durch die suboptimalen Eilegeraten vieler Vogel Strauße, Emus und Nandus, besteht eine Notwendigkeit an einer Zusammensetzung und einem Verfahren zur Verstärkung der Eiproduktion dieser Vögel. Es besteht außerdem eine Notwendigkeit für eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens bei Vögeln. Darüber hinaus besteht außerdem eine Notwendigkeit für eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Verstärkung des Eierlegens eines Vogel s während sei ner Lebenszeit. Außerdem gibt es eine beständige Notwendigkeit für ein schnelles, einfaches, verlässliches, kosteneffektives Verfahren zur Bestimmung, ob ein Vogel immunologisch auf eine Behandlung mit einer antigenen Inhibinzusammensetzung geantwortet hat. Außerdem bleibt eine Notwendigkeit für ein schnelles, einfaches, verlässliches, kosteneffektives Verfahren zur Bestimmung, ob ein Vogel hormonell dafür prädispositioniert ist, ein Eiproduzent auf hohem Niveau oder auf niedrigem Niveau zu sein.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf eine Zusammensetzung und ein Verfahren für die Herstellung eines heterologen Proteins gerichtet, das die α- Untereinheit eines Vogel-Inhibins, oder ein Fragment davon und ein Trägerprotein umfasst. Das Inhibinprotein, oder das Fragment davon, ist eine α-Untereinheit eines Vogel-Inhibins. Das Trägerprotein schließt das Maltosebindeprotein oder Rinderserumalbumin unter anderem ein, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Das bevorzugte Trägerprotein ist das Maltosebindeprotein.
Das heterologe Protein kann entweder ein Inhibin sein, das an das Trägerprotein konjugiert ist, oder ein Inhibin, das an das Trägerprotein fusioniert ist. Die Methode zur Herstellung des fusionierten heterologen Proteins umfasst das Einbringen von cDNA, die so kodiert ist, dass sie das Inhibin, oder ein Fragment davon, exprimiert, in einen Vektor, der die kodierende Information für die Herstellung des Trägerproteins enthält. Nach dem Einbringen des Vektors in eine Expressionssystem wird das fusionierte heterologe Protein durch das System exprimiert. Bevorzugt enthält das heterologe Protein eine α-Untereinheit eines Ratita- Inhibins, wie z. B. Inhibin aus Vogel Strauß, Inhibin aus Emu und Inhibin aus Nandu.
Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf ein Verfahren zur Erhöhung der Eiproduktion in Vögeln durch die Verabreichung des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung gerichtet, welches die α-Untereinheit eines Vogel-Inhibinproteins, oder ein Fragment davon und ein Trägerprotein umfasst. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer effektiven Menge des Proteins an einen Vogel, so dass die Eiproduktion in dem Vogel verstärkt wird. Bevorzugt tritt eine immunologische Antwort in dem Tier auf, die gegen das Protein gerichtet ist. Besonders bevorzugt ist die immunologische Antwort, die in dem Vogel auftritt, auch gegen das Inhibinprotein gerichtet, das durch den Vogel hergestellt wird (endogenes Inhibin). Das Verfahren verstärkt die Eiproduktion in weiblichen Vögeln, die inhibin produzieren, wie z. B. Ratitae. Insbesondere verstärkt dieses Verfahren die Eiproduktion in weiblichen Ratitae, wie z. B. Vogel Straußen, Emus und Nandus.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens in weiblichen Vögeln gerichtet, umfassend den Schritt des Verabreichens einer effektiven Menge eine heterologen Proteins, das eine α-Untereinheit eines Vogel-Inhibinproteins, oder ein Fragment davon und ein Trägerprotein umfasst, an einen weiblichen Vogel, so dass der Beginn des Eierlegens in dem Vogel beschleunigt wird. Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf ein Verfahren zur Erhöhung der Gesamteierlegerate über die Lebensdauer eines weiblichen Vogels gerichtet, umfassend den Schritt des Verabreichens einer effektiven Menge eines heterologen Proteins, das die α-Untereinheit eines Vogel-Inhibinproteins umfasst, oder eines Fragmentes davon und ein Trägerprotein, an einen weiblichen Vogel, so dass das gesamte Eierlegen des Vogels während der Lebensdauer erhöht ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern bereitgestellt, die gegen das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung gerichtet sind. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die gegen das heterologe Protein gerichtet sind, die Verabreichung einer effektiven Menge eines heterologen Proteins, das die α-Untereinheit eines Vogel- Inhibinproteins oder ein Fragment davon, und ein Trägerprotein umfasst, an ein Tier, so dass eine immunologische Antwort in dem Tier gegen das heterologe Protein erfolgt. Als nächstes wird eine Blutprobe aus dem Tier entnommen, und dann die Antikörper, die gegen das Inhibin gerichtet sind, aus dem Serum der Blutprobe isoliert. Bevorzugt wird der Antikörper aus dem Serum der Blutprobe isoliert, indem das Serum durch eine Säule laufen gelassen wird, die effektive Mengen des Trägerproteins enthält, um den Antikörper aus dem Serum zu trennen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein schnelles, einfaches, zuverlässiges und kosteneffektives Verfahren zur Bestimmung bereitgestellt, ob ein Tier hormonell dafür prädispositioniert ist, ein Eiproduzent auf hohem Niveau oder auf niedrigem Niveau zu sein. Das Verfahren umfasst das Bestimmen der Menge an Inhibin, das von dem Tier hergestellt wird, welches mit der Kapazität der Eierproduktion des Tieres korreliert. Kurz beschrieben umfasst das Verfahren zur Bestimmung der Quantität an Inhibin in dem Blut eines Tieres das Entnehmen einer Blutprobe aus einem Tier und das Inkontaktbringen der Blutprobe mit Anti-Inhibin- Antikörpern, die spezifisch gegen das endogene Inhibin des Tieres gerichtet sind. Die Blutprobe wird mit den Anti-Inhibin-Antikörpern unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die es den Antikörpern erlauben, selektiv mit irgendwelchem Inhibin, das in der Probe vorliegt, zu interagieren. Als nächstes werden nicht-interagierte Antikörper von den interagierten Antikörpern entfernt und die Menge an Antikörpern, die interagiert haben, wird bestimmt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein schnelles, einfaches, zuverlässiges und kosteneffektives Verfahren zur Bestimmung bereitgestellt, ob ein Tier immunologisch auf eine Behandlung mit einer Inhibinzusammensetzung reagiert hat. Kurz beschrieben umfasst die Methode das Binden von Inhibin oder dem heterologen Protein der vorliegenden Erfindung an eine feste Phase und das Inkontaktbringen des immobilisierten Inhibins mit einer Blutprobe aus dem Tier, das getestet werden soll. Die Probe wird mit dem immobilisierten Inhibin unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen das Inhibin selektiv mit irgendwelchen Anti-Inhibin-Antikörpern in der Probe interagiert. Nach dem Entfernen von nicht-interagierten Antikörpern aus der Probe wird eine Menge von markierten Antikörpern aus einem zweiten Tier zugegeben, die gegen eine Klasse der Antikörper des ersten Tieres gerichtet sind. Die markierten Antikörper, die gegen die Antikörper des Tieres gerichtet sind, werden dann selektiv mit den Antikörpern interagieren, die an das immobilisierte Inhibin gebunden sind. Nach dem Entfernen der nicht- interagierten markierten Antikörper wird die Anwesenheit oder die Menge der interagierten markierten Antikörper bestimmt, indem der Marker visualisiert wird. Somit detektiert dieses Verfahren die Anwesenheit und die Menge an Antikörpern, die gegen Inhibin gerichtet sind, in einem Tier und bestimmt somit, ob das Tier auf die Verabreichung einer Zusammensetzung, die Inhibin umfasst, immunologisch reagiert hat.
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Inhibinzusammensetzung bereitzustellen, die eine immunologische Antwort in einem Tier nach dessen Verabreichung an das Tier induziert.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein heterologes Protein bereitzustellen, das die α-Untereinheit eines Vogel-Inhibinproteins umfasst, oder ein Fragment davon, und ein Trägerprotein.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es eine Zusammensetzung bereitzustellen, die ein fusioniertes heterologes Protein enthält, welches die α-Untereinheit eines Vogel-Inhibins umfasst, oder ein Fragment davon.
Es ist außerdem ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins bereitzustellen, wobei eins der Proteine die α-Untereinheit eines Vogel-Inhibins umfasst, oder ein Fragment davon.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines fusionierten heterologen Proteins bereitzustellen, wobei eins der Proteine eine α-Untereinheit eines Vogel-Inhibins umfasst, oder ein Fragment davon.
Es ist außerdem ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins bereitzustellen, welches die α- Untereinheit eines Vogel-Inhibinproteins, oder ein Fragment davon, und ein Trägerprotein umfasst.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens (Pubertät) in Vögeln bereitzustellen.
Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens (Pubertät) in Ratitae, wie z. B. Vogel Strauße und Emus, bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Beschleunigung des Beginnens des Eierlegens (Pubertät) in Psittaciformes bereitzustellen.
Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Gesamteierlegerate eines Vogels während dessen Lebenszeit bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren zur Verstärkung der Eiproduktionsrate von Vögeln bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel ein Verfahren zur Erhöhung der Eiproduktionsrate von Ratitae, wie z. B. Vogel Strauße und Emus, bereitzustellen.
Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Eiproduktionsrate von Hühnern bereitzustellen.
Diese und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach der Durchsicht der folgenden detaillierten Beschreibung und den offenbarten Ausführungsformen und den anhängenden Ansprüchen offenkundig.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein SDE-PAGE-Gel, wobei A Vogel-Strauß-Anti-(Huhn-Inhibin- Maltosebindeprotein)-Antikörper ist, B ist ein Plasmid pMALTM-c- Vektorstandard, C ist ein Protein-Molekulargewichtstandard, D ist der aktuelle pMALTM-c-Vektor, der für die Herstellung des fusionierten heterologen Proteins verwendet wurde, E ist das gereinigte, fusionierte Huhn-Inhibin-Maltosebindeprotein (heterologes Protein) der vorliegenden Erfindung und F ist der Durchlauf einer Reinigung, die nicht mit dem heterologen Protein geladen war.
Fig. 2 ist eine Darstellung der Wirkung der Immunoneutralisation der α- Untereinheit von Inhibin auf die tägliche Eiproduktion einer Henne ("HDEP") in einer japanischen Wachtel, bei Verwendung des Maltosebindeproteins, fusioniert mit dem Protein, das durch cINA&sub5;&sub1;&sub5; kodiert wird. Genauer gesagt ist Fig. 2 eine graphische Darstellung der Daten aus Tabelle 2 in Beispiel 8.
Fig. 3 ist eine Darstellung der Wirkung einer Immunoneutralisation der α-Untereinheit von Inhibin auf die tägliche Eiproduktion einer Henne ("HDEP") in einer japanischen Wachtel unter Verwendung des Maltosebindeproteins, fusioniert mit dem Protein, das durch cINA&sub5;&sub1;&sub5; kodiert wird, wenn nur zwei Injektionsbehandlungen betrachtet werden: Kontrolle; und immunisiertes Inhibin. Genauer gesagt ist Fig. 3 eine graphische Darstellung der Daten aus Tabelle 3 in Beispiel 8.

Detaillierte Beschreibung

Der Begriff "Vogel" oder "Geflügel", wie er hierin verwendet wird, ist definiert als ein Mitglied der Klasse Aves von Tieren, die als warmblütige, eierlegende Vertebraten charakterisiert sind, die in erster Linie an das Fliegen angepasst sind. Der Begriff "Ratita", wie er hierin verwendet wird, ist definiert als eine Gruppe von nichtfliegenden, meistens großen, laufenden Vögeln, die mehrere Ordnungen umfassen und die Emus, Vogel Strauße. Kiwis und Kasuaren einschließen. Der Begriff " Psittaciformes", wie er hierin verwendet wird, schließt Papageien ein, welche eine monofamiliäre Ordnung an Vögeln sind, die Zygodaktylismus aufweisen und einen stark gebogenen Schnabel haben. Ein "Papagei" ist definiert als irgendein Mitglied der Vogelfamilie Psittacidae (die einzelne der Familie der Psittaciformes), unterschieden durch den kurzen, kräftigen, stark gebogenen Schnabel.
Der Begriff "Ei" ist hierin als eine große weibliche Geschlechtszelle definiert, eingeschlossen in einer porösen, kalkigen oder lederigen Schale, hergestellt von Vögeln oder Reptilien. "Eiproduktion durch einen Vogel oder ein Reptil", wie es hierin verwendet wird, ist der Vorgang eines Vogels, der ein Ei legt, oder die "Oviposition". Der Begriff "Ovum" ist hierin als ein weiblicher Gamet definiert und ist außerdem als ein Ei bekannt. Somit ist die Eiproduktion in allen Tieren, die nicht Vögel oder Reptilien sind, so wie hier verwendet, definiert als die Herstellung und das Freisetzen eines Ovums aus dem Eierstock oder die "Ovulation". Dementsprechend soll es so verstanden werden, dass der Begriff "Ei", wie er hierin verwendet wird, als eine große weibliche Geschlechtszelle, eingeschlossen in einer porösen, kalkigen oder lederigen Schale definiert ist, wenn es von einem Vogel oder Reptil hergestellt ist, oder es ist ein Ovum, wenn es durch alle anderen Tiere hergestellt ist.
Die Begriffe "Eierlegen" und "Pubertät" werden hierin in Bezug auf Vögel miteinander austauschbar verwendet und bezeichnen, wenn ein Vogel sein erstes Ei legt. Dementsprechend bezeichnet die "Beschleunigung des Beginns" des Eierlegens oder der Pubertät in Vögeln, wie es hierin verwendet wird, das Induzieren eines früheren Datums des ersten Eierlegens als es ein Vogel normalerweise haben würde.
Es soll so verstanden werden, dass eine Methode zur "Verringerung von Cholesterinmengen" eines Eies, wie es hierin verwendet wird, ein Verfahren bezeichnet, bei dem ein Vogel dazu angeregt wird, ein oder mehrere Eier zu legen, die einen niedrigeren Cholesteringehalt haben als der durchschnittliche Cholesteringehalt von Eiern, die von Vögeln der gleichen Spezies gelegt werden.
Der Begriff "Gesamteierlegerate während der Lebenszeit" eines Vogels ist definiert als die gesamte Anzahl an Eiern, die durch einen Vogel während seiner gesamten Lebensspanne gelegt wird. Der Begriff "tägliche Eierproduktion einer Henne" oder "HDEP", wie er hierin verwendet wird, ist definiert als die Anzahl an Eiern, die durch eine bestimmte Gruppe von Hennen je Tag gelegt wird.
Im Gegensatz zu dem Begriff Vogel oder Geflügel ist der Begriff "Säugetier", wie er hierin verwendet wird, definiert als ein Mitglied der Klasse Mammalia, welches eine große Klasse an warmblütigen Vertrebraten ist, die Tiere umfasst, die durch Brustdrüsen, einen Körper, der mit Haaren bedeckt ist, drei Knöchelchen im Mittelohr, ein muskuläres Diaphragma, das die Thorax- und die abdominalen Höhlen voneinander trennt, rote Blutzellen ohne Nukleulus und embryonale Entwicklung in der Allantois und dem Amnion charakterisiert sind.
Ein heterologes Protein, wie es hierin verwendet wird, ist definiert als ein Protein, das eine α-Untereinheit eines Vogel-Inhibinproteins, oder ein Fragment davon, und ein Trägerprotein umfasst. Es soll so verstanden werden, dass die Begriffe "Inhibin" und "Fragment des Inhibins" miteinander austauschbar in der heterologen Proteinzusammensetzung, dem Verfahren zur Herstellung des heterologen Proteins und dem Verfahren zur Verwendung des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Es soll außerdem so verstanden werden, dass "cINA&sub5;&sub1;&sub5;", wie es hierin verwendet wird, eine 515 Basenpaar lange Sequenz (SEQ ID NR: 1) bezeichnet oder eine 516 Basenpaar lange Sequenz (SEQ ID NR: 3) bezeichnet, oder dass es die entsprechenden Sequenzen von cINA&sub6;, die auf Seite 3 aufgelistet sind (beginnend ungefähr bei dem Basenpaar mit der Positionsnummer 790 und endend bei ungefähr dem Basenpaar mit der Positionsnummer 1310) von Wang und Johnson, Complementary Desoxyribonucleic Acid Cloning and Sequence Analysis of the α-Subunit of Inhibin from Chicken Ovarian Granulosa Cells, Biology of Reproduction, 49, S. 1-6, 1993, die aus der genomischen DNA von Huhn erhalten wurde. cINA&sub5;&sub1;&sub5; kodiert für einen Anteil der α-Untereinheit des Inhibins von Huhn, wie z. B. SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 4. Wie es hierin verwendet wird, ist "MBP- cINA&sub5;&sub1;&sub5; das Proteinkonjugat, das von einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert wird, nach dem Klonen von cINA&sub5;&sub1;&sub5; in eine rekombinante Wirtszelle, und Exprimieren eines fusionierten heterologen Proteins, das das Maltosebindeprotein ("MBP") und das α-Untereinheit-Fragment des Inhibinproteins, das von cINA&sub5;&sub1;&sub5; kodiert wird, umfasst. Dementsprechend bezeichnet " cINA&sub5;&sub1;&sub5;" eine Nukleotidsequenz und "MBP- cINA&sub5;&sub1;&sub5;" bezeichnet ein fusioniertes heterologes Protein.
Ein fusioniertes heterologes Protein, wie es hierin verwendet wird, ist definiert als ein Protein, das die α-Untereinheit eines Vogel- Inhibinproteins, oder ein Fragment davon, umfasst, fusioniert an ein Trägerprotein. Das fusionierte heterologe Protein wird von dem Expressionssystem exprimiert, das ein fusioniertes Genprodukt umfasst, das ein Gen enthält, das für die Expression der α-Untereinheit des Vogel- Inhibinproteins, oder eines Fragmentes davon, kodiert, fusioniert an ein Gen, das für die Expression eines Trägerproteins kodiert. "Ein fusioniertes Genprodukt", wie es hierin verwendet wird, ist definiert als das Produkt, das aus der Fusion des Genes, das für die Expression der α- Untereinheit des Vogel-Inhibinproteins, oder eines Fragmentes davon, kodiert und dem Gen, das für die Expression eines Trägerproteins kodiert, resultiert.
Ein konjugiertes heterologes Protein, wie es hierin verwendet wird, ist definiert als ein Protein, das die α-Untereinheit eines Vogel- Inhibinproteins, oder eine Fragmentes davon, enthält, konjugiert an ein Trägerprotein. Das konjugierte heterologe Protein wird durch eine chemische Reaktion hergestellt, die die α-Untereinheit des Vogel- Inhibinproteins an das Trägerprotein über eine kovalente Bindung verknüpft.
Eine immunologische Antwort eines Tieres auf eine Substanz, die an das Tier verabreicht worden ist, wie es hierin verwendet wird, ist definiert als die zellvermittelte und/oder hormonelle Antwort eines Tieres, die spezifisch gegen die Substanz gerichtet ist.
Der Begriff "selektives Interagieren", wie er hierin verwendet wird, ist definiert als etwas, bei dem zwei Objekte miteinander durch eine kovalente Bindung, eine nichtkovalente Bindung, elektrostatisch, durch eine Rezeptor-Liganden-Interaktion, eine Enzym-Substrat-Interaktion oder über andere Bindungs- oder Anlagerungshilfsmittel assoziieren. Die Assoziation ist selektiv in der Weise, dass die zwei Objekte in einer spezifischen Weise miteinander interagieren, in einer spezifischen Position oder nur miteinander.
Diese Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf eine Zusammensetzung, die in einem Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens bei Vögeln verwendet wird. Die Zusammensetzung umfasst ein heterologes Protein, das die α-Untereinheit eines Vogel-Inhibinproteins, oder eines Fragmentes davon, und ein Trägerprotein umfasst. Das Inhibin ist auf Vogel-Inhibin beschränkt. Das Vogel-Inhibin kann ausgewählt sein aus Vogel-Strauß-Inhibin, Emu-Inhibin, Nandu-Inhibin, Kasuaren-Inhibin, Kiwi- Inhibin, Truthahn-Inhibin, Wachtel-Inhibin, Huhn-Inhibin und Inhibin von Mitgliedern der Ordnung der Psittaciformes, ohne auf diese beschränkt zu sein. Ein bevorzugtes Inhibin ist ein Ratita-Inhibin. Ein insbesondere bevorzugtes Inhibin ist Vogel-Strauß-Inhibin. Ein anderes bevorzugtes Inhibin ist Emu-Inhibin. Ein weiteres bevorzugtes Inhibin ist Nandu- Inhibin. Noch ein anderes bevorzugtes Inhibin ist Huhn-Inhibin. Das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung umfasst die α-Untereinheit des Inhibinproteins, oder ein Fragment davon, und ein Trägerprotein.
Das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung, das die α- Untereinheit des Vogel-Inhibinproteins oder ein Fragment davon und ein Trägerprotein umfasst, wird außerdem in einem Verfahren zur Erhöhung der Gesamteierlegerate von Vögeln während derer Lebenszeit verwendet. Diese Zusammensetzung wird außerdem für ein Verfahren zur Erhöhung der Rate der Eierproduktion in Vögeln verwendet. Diese Methoden und die Methode zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens in Vögeln wird weiter unten genauer diskutiert werden.
Die α-Untereinheit des Vogel-Inhibins oder das Fragment davon kann aus tierischen Flüssigkeiten isoliert werden, exprimiert von genetisch veränderten Zellen in einem Expressionssystem, oder synthetisch hergestellt werden aus einer Serie von chemischen Reaktionen. Genauer gesagt kann das Fragment der α-Untereinheit des Vogel-Inhibins ausgewählt sein aus den folgenden Zusammensetzungen, ohne darauf beschränkt zu sein: α- Untereinheit des Inhibins, aus rekombinanter DNA erhaltene Fragmente der α-Untereinheit des Inhibins, synthetischen Peptidreplikas von Fragmenten der α-Untereinheit des Inhibins, synthetischen Peptidreplikas der N- terminalen Sequenz der α-Untereinheit des Inhibins, Fragmenten von partiell gereinigtem Inhibin aus follikulärer Flüssigkeit, Fragmenten von der α-Untereinheit von endogenem Inhibin, und Fragmenten der α- Untereinheit von exogenem Inhibin. Wie oben bereits gesagt, ist das Fragment von Inhibin die alpha(α)-Untereinheit von Inhibin oder ein Fragment davon.
Die α-Untereinheit des Vogel-Inhibins in dem heterologen Protein ist entweder mit dem Trägerprotein, wie unten beschrieben, fusioniert oder konjugiert. Wenn das Inhibin an das Trägerprotein fusioniert ist, ist das heterologe Protein ein "fusioniertes heterologes Protein". Wenn das Inhibin an das Trägerprotein konjugiert ist, ist das heterologe Protein ein "konjugiertes heterologes Protein". Ein bevorzugtes heterologes Protein ist ein fusioniertes heterologes Protein.
Die Identität des Trägerproteins in dem heterologen Protein ist kein kritischer Aspekt der vorliegenden Erfindung. Irgendein Trägerprotein, das allgemein bekannt ist, kann für das heterologe Protein verwendet werden. Die Trägerproteine, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können ausgewählt sein aus der folgenden Gruppe, ohne darauf beschränkt zu sein: Maltosebindeprotein "MBP": Rinderserumalbumin "BSA": Schlüsselloch-Napfschnecke-Hämocyanin "KLH"; Ovalbumin; Flagellin; Serumalbumin irgendeiner Spezies; Gammaglobulin irgendeiner Spezies: und Polymere von D- und/oder L-Aminosäuren. Ein bevorzugtes Trägerprotein ist MBP. Ein anderes bevorzugtes Trägerprotein ist BSA, wenn das heterologe Protein nicht einer Kuh oder einem Pferd verabreicht werden soll. Ein weiteres bevorzugtes Trägerprotein ist Ovalbumin, wenn das heterologe Protein nicht an einen Vogel verabreicht wird. Das besonders bevorzugte Trägerprotein ist MBP. Es ist bevorzugt, dass das Trägerprotein für das Tier, dem es verabreicht wird, immunogen ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Herstellung des konjugierten heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung. Verfahren zur Herstellung von konjugierten Proteinen sind allgemein gut bekannt. Methoden zur Konjugation von Proteinen an Proteine sind vollständig beschrieben in Antibodies, A Laboratory Manual, herausgegeben von Harlow & David Lane, Coldspring Harbor Lab (1988), welches hierin durch Referenz vollständig aufgenommen sein soll.
Obwohl konjugierte Proteine in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Fusionsproteine bevorzugt. Genauer gesagt ergeben heterologe Proteine, die fusioniert sind, ein homogenes Produkt, worin die verschiedenen Segmente der Proteine immer in derselben Position fusioniert sind, und es sind immer dieselben Mengen an Segmenten der Proteine fusioniert. Außerdem können fusionierte heterologe Proteine einheitlich, günstig und in großen Mengen hergestellt werden. Im Gegensatz dazu sind konjugierte heterologe Proteine nicht so einheitlich wie fusionierte Proteine. Z. B. kann die Konjugationsreaktion, abhängig davon welche Proteine konjugiert werden, eine Mischung von Proteinen ergeben, die eine oder mehrere Konjugationen haben, Proteine, die Konjugationen an verschiedenen Orten haben, oder Proteine, die unkonjugiert bleiben. Darüber hinaus können einige der Konjugationen das heterologe Protein sterisch behindernd für die vorgesehene Verwendung machen (z. B. der immunogene Anteil des Proteins ist sterisch behindert). Außerdem können die Bedingungen für die Konjugationsreaktion und die Reagenzien die Proteine, die dabei hergestellt werden, degradieren. Z. B. wird Glutaraldehyd allgemein für Konjugationsreaktionen verwendet, und es modifiziert die Konformation von Proteinen. Außerdem sind konjugierte Proteine in großen Mengen teurer herzustellen als fusionierte Proteine.
Diese Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Herstellung des fusionierten heterologen Proteins. Das fusionierte heterologe Protein wird durch ein Fusionsgenprodukt exprimiert, das ein Gen umfasst, das für die Expression der α-Untereinheit des Vogel-Inhibinproteins, oder eines Fragmentes davon, kodiert, und ein Gen, das für die Expression eines Trägerproteins kodiert. Das Fusionsgenprodukt und das Verfahren zur Herstellung des Fusiongenprodukts sind vollständiger weiter unten beschrieben. Kurz beschrieben ist das Verfahren zur Herstellung des fusionierten heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung, so, dass es die Schritte des Einfügens des Fusiongenproduktes in einen kodierenden Bereich eines Plasmides, die Transfektion einer Wirtszelle mit dem Plasmid und die Expression des fusionierten heterologen Proteins von der Wirtszelle durch den Fachleuten allgemein bekannten Verfahren umfasst. Es sind viele Methoden zur Herstellung von fusionierten heterologen Proteinen in der Fachwelt bekannt. Daher kann irgendeine Methode, die allgemein bekannt ist, verwendet werden, um das fusionierte heterologe Protein der vorliegenden Erfindung herzustellen. Viele kommerziell erhältliche Vektorkits und Expressionssysteme können verwendet werden, um das fusionierte heterologe Protein der vorliegenden Erfindung herzustellen. Ein Beispiel für einen solchen kommerziell erhältlichen Vektorkit und ein Expressionssystem ist pMALTM-c von New England Biolabs, Beverly Massachusetts. In dem pMALTM-c-System erfolgt eine zytoplasmatische Expression des fusionierten heterologen Proteins. Die Methode zur Herstellung des fusionierten heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung durch einen pMALTM-c-Kit ist vollständig unten in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Andere Quellen für Vektorkits und Expressionssysteme, die verwendet werden können, um das fusionierte heterologe Protein der vorliegenden Erfindung herzustellen, schließen Pharmacia Biotech aus Piscataway, New Jersey und Clonetech aus Palo Alto, Kalifornien ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Fusionsgenprodukt, das ein Gen umfasst, das für die Expression der α-Untereinheit des Vogel-Inhibinproteins, oder eines Fragmentes davon, kodiert, und ein Gen, das für die Expression eines Trägerproteins kodiert. Das Vogel- Inhibingen kann ausgewählt sein aus einem Vogel-Strauß-Inhibingen, einem Emu-Inhibingen, einem Nandugen, einem Kasuar-Inhibingen, einem Kiwi- Inhibingen, einem Truthahn-Inhibingen, einem Wachtel-Inhibingen, einem Huhn-Inhibingen, einem Inhibingen von irgendeinem Mitglied aus der Ordnung Psittaciformes, einem Inhibingen aus irgendeinem Falconiformen, einem Inhibingen aus irgendeinem Piciformen, einem Inhibingen aus irgendeinem Strigiformen, einem Inhibingen aus irgendeinem Coraciiformen, einem Inhibingen von irgendeinem Ralliformen, einem Inhibingen von irgendeinem Passeriformen, einem Inhibingen von irgendeinem Cuculiformen, einem Inhibingen von irgendeinem Columbiformen, einem Inhibingen von irgendeinem Galliformen (domestiziertes Geflügel), einem Inhibingen von irgendeinem Anseriformen (Gänse, Enten, anderes Wassergeflügel), einem Inhibingen von irgendeinem Herodionen und einem Inhibingen von irgendeinem der folgenden Vögel: Falke, Adler, Habicht, Taube, Sittich, Kakadu, Ara, Papagei und hockenden Vögeln (wie z. B. Singvogel, Eichelhäher, Amsel, Fink, Grasmücke und Sperling). Ein bevorzugteres Inhibingen ist ein Ratita-Inhibingen. Ein besonders bevorzugtes Inhibingen ist ein Vogel-Strauß-Inhibingen. Ein anderes bevorzugtes Inhibingen ist ein Emu-Inhibingen. Ein weiteres bevorzugtes Inhibingen ist ein Nandu- Inhibingen. Ein weiteres bevorzugtes Inhibingen ist ein Huhn-Inhibingen.
Der die α-Untereinheit des Huhn-Inhibins enthaltende cDNA-Klon (cINA6; Wang und Johnson, Complementary deoxyribonucleic acid cloning sequence analysis of the α-subunit of inhibin from chicken ovarian granulosa cells, BIOLOGY OF REPRODUCTION, 49: 453-458, 1993), eingesetzt in die EcoR1-Schnittstelle von Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA), wurde als ein Geschenk von P. A. Johnson (Cornell Universität) erhalten. Der cI- NA6-Klon hybridisierte spezifisch an Vogel Strauß genomische DNA in Southern Assays, was eine signifikante DNA-Homologie zwischen diesen zwei Spezies anzeigte (Chouljenko et al., Expression and purification of chicken α-inhibin as a fusion protein with the E. coli maltose binding protein, POULTRY SCIENCE, 73 (Suppl. 1): 84, 1994). Ein DNA-Fragment ("cI- NA&sub5;&sub1;&sub5;") wurde aus dem cINA&sub6;-Klon unter Verwendung des Pst I-Verdaus ausgeschnitten. Das cINA&sub5;&sub1;&sub5;-DNA-Fragment umfasste das meiste der reifen Huhn-Inhibin-α-Untereinheit.
Die α-Untereinheit-Sequenz des Vogel-Strauß-Inhibins wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Verfahren erhalten, die in der Fachwelt allgemein bekannt ist. Genauer gesagt wurden die folgenden Primer konstruiert auf Basis der Sequenz, die bei Wang berichtet ist, und wurden in einer PCR-Reaktion mit Vogel Strauß genomischer DNA verwendet: 5'- TCTTTCGAGGAGCTGGGCTGG-3'; und 3'-GGGCCGTGGTACGCGAGTGACGCA-5'. Ungefähr 75% der DNA-Sequenz aus cINA&sub5;&sub1;&sub5; wurden mit der Vogel Strauß genomischen DNA verglichen. Soweit ist eine 100%-Sequenz-Homologie zwischen den Huhn- und der Vogel Strauß-DNA-Vergleichen offensichtlich, die gemacht worden waren.
Wie oben bereits gesagt, soll es so verstanden werden, dass das Trägerprotein kein kritischer Aspekt für die vorliegende Erfindung ist. Daher kann in der vorliegenden Erfindung ein Gen verwendet werden, das die Expression irgendeines Trägerproteins kodiert. Das Trägerproteingen kann ausgewählt sein aus Genen, die für die Expression der folgenden Proteine kodieren, ist jedoch nicht auf diese beschränkt: Maltosebindeprotein "MBP"; Rinderserumalbumin "BSA"; Schlüsselloch-Napfschnecke-Hämocyanin "KLH"; Ovalbumin; Flagellin; Serumalbumin irgendeiner Spezies; Gammaglobulin irgendeiner Spezies; und Polymere aus D- und/oder L-Aminosäuren. Ein bevorzugtes Trägerproteingen ist ein Gen, das für die Expression von MBP kodiert. Ein anderes bevorzugtes Trägerproteingen ist ein BSA-Gen, wenn das sich ergebende heterologe Protein nicht an eine Kuh oder ein Pferd verabreicht wird. Weiteres bevorzugtes Trägerproteingen ist ein Ovalbumingen, wenn das sich ergebende heterologe Protein nicht an einen Vogel verabreicht wird. Das besonders bevorzugte Trägerproteingen ist ein Gen, das die Expression von MBP kodiert. Die bevorzugten Trägerproteingene kodieren für Proteine, die sowohl die Intensität, wie auch die Dauer der Wirt-Immunantwort auf das Inhibinprotein verstärken.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Herstellung eines Fusiongenproduktes, umfassend den Schritt der Fusion eines Gens, das für die Expression der α-Untereinheit eines Vogel- Inhibinproteins oder eines Fragments davon kodiert, an ein Gen, das für die Expression eines Trägerproteins kodiert. Kurz beschrieben umfasst das Verfahren zur Herstellung des Fusiongens der vorliegenden Erfindung die Schritte der Isolierung der gewünschten Inhibin-komplementären DNA (cDNA), die Herstellung von doppelsträngiger Inhibin-DNA, das Erhalten von doppelsträngiger Trägerprotein-DNA und die Fusion der doppelsträngigen Inhibin-DNA an die doppelsträngige Trägerprotein-DNA in einer Weise, so dass die fusionierte DNA die Expression eines fusionierten heterologen Proteins erlaubt, welches das Inhibinprotein, oder ein Fragment davon, und das Trägerprotein umfasst.
Viele Methoden zur Isolierung von Genen und zur Herstellung von Fusionsgenprodukten sind in der Fachwelt bekannt. Siehe beispielsweise Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vols. I, II, III. Daher kann irgendeine Methode, die in der Fachwelt bekannt ist, verwendet werden, um das Fusionsgenprodukt der vorliegenden Erfindung herzustellen. Viele kommerziell erhältliche Vektorkits können verwendet werden, um das Fusionsgenprodukt der vorliegenden Erfindung herzustellen. Ein Beispiel eines solchen kommerziell erhältlichen Vektorkits ist pMALTM-c von New England Biolabs, Beverly Massachusetts. Die Methode zur Herstellung des Fusiongenproduktes der vorliegenden Erfindung aus einem pMALm-c-Kit ist vollständig unten in Beispiel 1 beschrieben. Andere Quellen für Vektorkits, die zur Herstellung des Fusiongenproduktes der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Pharmacia Biotech aus Piscataway, New Jersey und Clonetech aus Palo Alto, Kalifornien, ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Wie oben beschrieben, wurde der cDNA-Klon mit der α-Untereinheit des Huhn-Inhibins (cINA6), eingesetzt in die EcoR 1-Schnittstelle des Bluescript als ein Geschenk von P. A. Johnson (Cornell Universität) erhalten. Ein DNA-Fragment ("cINA&sub5;&sub1;&sub5;") wurde aus dem cINA6-Klon unter Verwendung des Pst I-Verdaus herausgeschnitten. Dieses Fragment (cINA&sub5;&sub1;&sub5;) wurde in das Plasmid p-MALTM- im Leseraster mit dem Maltosebindeprotein ("MBP") kloniert und ein Fusionsprotein der entsprechenden Größe (Spur E; Fig. 1) wurde nach IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)- Induktion und SDS-PAGE detektiert. Das sich ergebende Proteinkonjugat ("MBP- cINA&sub5;&sub1;&sub5;") wurde als ein Antigen verwendet, um vor der Pubertät befindliche, weibliche japanische Wachteln (Coturnix coturnix japonica) gegen zirkulierende Inhibinlevel zu immunisieren, wie es vollständig in Beispiel 8 beschrieben ist.
Es wurde unerwarteterweise herausgefunden, dass die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung den Beginn des Eierlegens in Vögeln beschleunigt. Diese Erfindung bezieht sich außerdem auf eine Methode zur Beschleunigung des Beginnes des Eierlegens oder der Pubertät von weiblichen Vögeln durch die Verabreichung einer effektiven Menge des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung (enthaltend die α-Untereinheit des Vogel- Inhibins, oder ein Fragment davon, und ein Trägerprotein), so dass der Beginn des Eierlegens bei dem Vogel beschleunigt wird. Der Begriff "Beschleunigen" bezeichnet, dass das Eierlegen eines behandelten Vogels um wenigstens ungefähr 3% früher eintritt, als das Eierlegen normalerweise in einem unbehandelten Vogel eintritt. Bevorzugt tritt das Eierlegen wenigstens ungefähr 5% früher, und besonders bevorzugt tritt es wenigstens ungefähr 7% früher auf. Ganz besonders bevorzugt tritt das Eierlegen wenigstens 10% früher auf, und insbesondere bevorzugt tritt es wenigsten ungefähr 13% früher auf, als das Eierlegen normalerweise in einem unbehandelten Vogel auftritt. Es soll so verstanden werden, dass ein "behandelter" Vogel ein Vogel ist, dem das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung verabreicht worden ist. Bevorzugt tritt eine immunologische Antwort in dem Vogel gegen in das Inhibin ein. Besonders bevorzugt ist die immunologische Antwort auch gegen das endogene Inhibin, das in dem Vogel hergestellt wird, gerichtet.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um den Beginn des Eierlegens in irgendeiner Spezies von weiblichem Vogel, der Inhibin produziert, beschleunigt wird. Der weibliche Vogel kann ausgewählt sein, ist jedoch nicht beschränkt auf einen Ratita, ein Psittaciformes, ein Falconiformes, ein Piciformes, ein Strigiformes, ein Passeriformes, ein Coraciformes, ein Ralliformes, ein Cuculiformes, ein Columbiformes, ein Galliformes (domestiziertes Geflügel), ein Anseriformes (Gänse, Enten, oder anderes Wassergeflügel) und ein Herodiones. Genauer gesagt kann ein weiblicher Vogel ausgewählt sein aus einem Vogel Strauß, Emu, Nandu, Kiwi, Kasuar, Truthahn, Wachtel, Huhn, Falke, Adler, Habicht, Taube, Sittich, Kakadu, Ara, Papagei, einem Hockvogel (wie z. B einem Singvogel, Eichelhäher, Amsel, Fink, Grasmücke, Sperling) und irgendeinem Mitglied aus der Ordnung der Psittaciformes, ohne auf diese beschränkt zu sein. Ein bevorzugter Vogel ist ein Ratita. Ein besonders bevorzugter Vogel ist ein Vogel Strauß. Ein weiterer bevorzugter Ratita ist ein Emu. Ein außerdem bevorzugter Ratita ist ein Nandu. Ein weiterer bevorzugter Vogel ist irgendein Mitglied aus der Ordnung der Psittaciformes. Ein weiterer bevorzugter Vogel ist ein Huhn. Außerdem ein weiterer bevorzugter Vogel ist eine Wachtel. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um den Beginn des Eierlegens in Spezies von Vögeln zu beschleunigen, die bedroht sind. Solche bedrohten Vögel schließen Adler, Habichte, Kondoren und Eulen ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Die α-Untereinheit des Vogel-Inhibins und das Trägerprotein in der heterologen Proteinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung variieren gemäß welcher Spezies eines Vogels die Zusammensetzung verabreicht werden soll. Es ist bevorzugt, dass die α-Untereinheit des Vogel-Inhibins und Maltosebindeprotein verwendet wird, wenn die Zusammmensetzung einem Vogel verabreicht werden soll. Eine bevorzugte α-Untereinheit eines Inhibins ist das Inhibin eines Haushuhns oder eines Ratita, wenn die Zusammensetzung einem Ratita verabreicht werden soll. Besonders bevorzugt ist das bevorzugte Inhibin ein Inhibin eines Haushuhns oder Vogel Straußes, wenn die Zusammensetzung einem Vogel Strauß verabreicht werden soll.
Es soll so verstanden werden, dass die α-Untereinheit des Vogel-Inhibins in dem heterologen Protein nicht von derselben Spezies sein muss, an welche das heterologe Protein verabreicht werden wird. Z. B. kann ein heterologes Protein, das einem Vogel Strauß verabreicht wird, eine α- Untereinheit eines Huhn-Inhibins und ein Trägerprotein umfassen. Es soll außerdem so verstanden werden, dass die Zusammensetzung außerdem Adjuvantien, Konservierungsstoffe, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Stabilisatoren und andere bekannte Komponenten enthalten kann, die bekannt sind und in Impfstoffen des Standes der Technik verwendet werden. Irgendein Adjuvanssystem, das in der Fachwelt bekannt ist, kann für die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein bevorzugtes Adjuvanssystem ist das Freund'sche unvollständige Adjuvans. Ein weiteres bevorzugtes Adjuvanssystem ist das Freund'sche komplette Adjuvans. Außerdem ein weiteres bevorzugtes Adjuvanssystem ist ein polydispergiertes β-(1,4)-verknüpftes acetyliertes Mannan ("Acemannan").
Die heterologe Proteinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann an einen weiblichen Vogel durch ein, irgendein Hilfsmittel, das in der Fachwelt bekannt ist, verabreicht werden. Beispielsweise kann die Zusammensetzung subkutan, intraperitonal oder intramuskulär verabreicht werden. Bevorzugt wird die Zusammensetzung subkutan injiziert. Die Zusammensetzung kann an den Vogel in einer oder mehreren Dosen verabreicht werden. Bevorzugt wird die Zusammensetzung dem Vogel in mehreren Dosen verabreicht, wobei einer initiellen Immunisierung Booster-Immunisierungen folgen.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird einem weiblichen Vogel verabreicht, bevor der Vogel das Eierlegen oder die Pubertät erreicht. Das bevorzugte Alter, in dem die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung einem Tier zuerst verabreicht wird, hängt von der Spezies des beteiligten Tieres ab, der Paarungssaison (wenn es eine gibt) eines Tieres, von der Größe des Vogels und von der Identität der Komponenten (Inhibin und Trägerprotein) in der Zusammensetzung.
Die einem weiblichen Vogel verabreichte Menge an heterologem Protein der vorliegenden Erfindung variiert entsprechend der Spezies des Vogels, dem Alter und Gewicht des Vogels, wenn das Protein in Bezug auf die Brutsaison (wenn der Vogel eine Brutsaison hat) verabreicht wird, und wie viele Male das Protein verabreicht werden muss. Auch der Beginn des Verabreichungsplans oder des Behandlungsplans variiert entsprechend der Spezies des Vogels, dem mittleren Alter des Beginns des Eierlegens dieser Spezies des Vogels, der familiären Geschichte des Vogels (mit Rücksicht auf die Familiengeschichte des Startes des Eierlegens), die Zeit im Jahr, wann der Vogel geschlüpft ist, der Ernährungsplan des Vogels (stark gefütterte Vögel kommen in der Pubertät vor denen, die unterernährt sind), die allgemeine Gesundheit des Vogels zu der Zeit des Beginnes, die langzeitige Gesundheitshistorie des Vogels, das Vorliegen von extremen Wetterbedingungen (langanhaltendes, besonders unfreundliches Wetter, wie z. B. Regen, Hitze oder starker Wind, das der Vogel nicht gewohnt ist), die Haltungsbedingungen (Überfüllung) und ein Fehlen an Übung.
Ein üblicher geübter Fachmann sollte im Hinblick auf die Lehre der vorliegenden Erfindung in der Lage sein, durch Routinetests die Menge an heterologem Protein zu bestimmen, die notwendig ist, um eine immunologische Antwort auf das Protein bei einem Vogel hervorzurufen.
Z. B. ist das Folgende eine kurze Zusammenfassung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Beschleunigung des Beginns der Pubertät in japanischen Wachteln, wie es vollständig in Beispiel 8 diskutiert ist. Das mittlere Alter bei der Pubertät für eine unbehandelte Wachtel ist ungefähr sechs bis acht Wochen. Das Folgende würde ein Behandlungsplan für eine japanische Wachtel mit einem ungefähren Körpergewichtsbereich von 0,1 bis 0,25 Pfund sein: die primäre (erste) Injektion von 0,75 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung an ihrem 25. Lebenstag und Booster-Injektionen von 0,375 mg am 32., 39., 46., 53., 60. und 90. Lebenstag.
Genauer gesagt, wurden 100 Wachteln am 25. Lebenstag beliebig und gleichmäßig zu einer von vier Injektionsgruppen zugeordnet (25 Vögel je Gruppe), wie folgt: (1) MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5; in einem polydispergiertem β-(1,4)- verknüpften acetylierten Mannan ("Acemannan"), einem immunostimulierendem Trägerstoff, ("MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/ACE"), (2) MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5; in Freunds Adjuvans ("MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/FRN"), (3) Acemannan (Kontrolle der Immunostimulierung; "ACE"), oder (4) Freund's (Adjuvanskontrolle; "FRN"). Den Vögeln, die gegen Inhibin immunisiert wurden (Gruppen 1 und 2), wurden ungefähr 0,75 mg MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5; je Vogel in dem geeigneten Kontrollträgerstoff gegeben. Gleiche Trägerstoffinjektionsvolumina (0,2 ml) an ACE oder FRN wurden in den Gruppen 1 und 3, bzw. den Gruppen 2 und 4 verwendet. Alle Injektionen wurden subkutan unter Verwendung von Tuberkulinspritzen, die mit 25-er geeichten Nadeln bestückt waren, gegeben. Wöchentliche Booster-Inhibinimmunisierungen von ungefähr 0,375 mg MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5; je Vogel oder entsprechende Kontrollbehandlungen wurden anschließend über fünf darauffolgende Wochen verabreicht.
Beginnend mit 41 Tagen des Lebensalters (betrachtet als Tag 1 des Eierlegezyklus) wurden die tägliche Tageshühnereiproduktion ("HDEP") und die Sterblichkeitsrate ("MORT") - Messungen über 12 aufeinanderfolgende Wochen aufgezeichnet. Zusätzlich wurden das mittlere Alter des ersten Eierlegens ("FIRST") und das Alter, bei dem die Hühner eine 50%ige Eierproduktion ("FIFTY") erreichten, für jede der vier Behandlungsgruppen berechnet. Wie es vollständiger in Beispiel 8 diskutiert ist, wurden die HDEP-Daten zwei verschiedenen Analysen der Varianz unterworfen.
Zum vorliegenden Zeitpunkt ist die Information vorläufig, da nur 35 Tage Daten gesammelt worden waren. Die Gesamt-Prozent-HDEP-Raten für wöchentliche Intervalle des Eierlegens (Tage 0, 7, 14, 21 und 35) während der ersten 35 Tage der Studie sind in Fig. 2 aufgezeichnet (worin die vier Injektionsgruppen als separate Behandlungen betrachtet sind) und in Fig. 3 (worin nur Vergleiche der nichtimmunisierten (Kontrolle) gegen die inhibin-immunisierte Gruppe gemacht wurde).
Die mittleren HDEP-Raten während der Woche 1, Woche 2, Woche 3, Woche 4, Woche 5 und den Wochen 1 bis 5, kombiniert für die vier Injektionsgruppen und als unabhängige Behandlungen betrachtet, sind in Tabelle 2 dargestellt. Genauer gesagt stellen die Werte in Tabelle 2 die Prozent- Eierlegerate dar. Beispielsweise legten in Woche 1 der Studie nur 5,8% der Vögel in der ACE-Gruppe ein Ei pro Tag. In Woche 2 der Studie legten 39,56% der Vögel in der ACE-Gruppe ein Ei je Tag. (Die 39,56% der Woche 2 schließen die 5,8% aus Woche 1 ein.)
Tabelle 2 zeigt außerdem, dass in Woche 4 die MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/FRN- Injektionsgruppe eine Spitze bei einer Eilegerate von 96,57% aufweist. Daher ergibt sich aus den Werten in Tabelle 2, dass die anderen drei Injektionsgruppen nicht in Woche 4 die Spitze erreichten, da deren Prozent-Eierlegerate von Woche 4 bis Woche 5 anstieg. Die Spalte unter den Wochen 1 bis 5 repräsentiert die mittlere Prozent-Eierlegerate von jeder der Injektionsgruppen für die Wochen 1 bis 5.
Tabelle 3 zeigte die mittleren HDEP-Raten in Prozent während des gleichen Zeitrahmens wie Tabelle 2, wobei die Daten zusammengefasst sind für die Vergleiche der direkten Kontrolle gegen die immunisierte Behandlung. Die Spalte unter den Wochen 1 bis 5 repräsentiert die mittlere Prozent- Eierlegerate der kombinierten Kontrollgruppen gegen die kombinierten inhibin-immunisierten Gruppen für die Wochen 1 bis 5.
Tabelle 4 enthält die FIRST-Eierlegedaten für beide der betrachteten statistischen Szenarien (d. h. die vier Injektionsbehandlungsgruppen und die zusammengefassten Datenvergleiche). Das Alter des ersten Eierlegens in Tabelle 4 repräsentiert das statistische Mittel der ersten Tage des Eierlegens für alle Vögel in jeder Gruppe. Es ist zu beachten, dass Tabelle 5 eine Beschleunigung des Beginnens des Eierlegens um mehr als fünf Tage zwischen den Vögeln in der FRN-Gruppe und den Vögeln in der MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/FRN-Gruppe zeigt. Außerdem zeigt Tabelle 5 mehr als eine dreitägige Beschleunigung des Beginns des Eierlegens zwischen den Vögeln in der Kontrollgruppe und den Vögeln in der immunisierten Gruppe. (Siehe Beispiel 8 für Tabellen 2, 3 und 4.)
Es war ein initieller positiver Effekt der Inhibin-Immunoneutralisation auf die Produktionsperformance vorhanden. Dieser Effekt ist teilweise in den zusammengegebenen HDEP- (Tabelle 3) und FIRST- (Tabelle 4) Datensätzen ersichtlich, worin eine erhöhte Anzahl von Beobachtungen, die Hilfsmittel umfassten, die Aussagekraft von den angewendeten statistischen Tests verstärkten.
Die meisten zeitlich festgesetzten biologischen Antworten auf Behandlungen sind hinsichtlich Effekten des Beginns, der Stärke und der Dauer der Antwort untersucht. Hierin sind die Daten vorläufig (d. h. die Information eines vollständigen Legezyklus (ungefähr 12 Wochen nach dem Beginn des Eierlegens) muss noch gesammelt werden. Daher wartet ein vollständiges Verständnis des/der zugrundeliegenden Mechanismus/Mechanismen darüber, wie die Produktionsperformance in den Wachteln, die gegen Inhibin immunisiert sind, geändert wird, noch auf eine Bestimmung. Die vorliegenden Daten zeigen jedoch die Effekte der Immunoneutralisation mit Inhibin auf den initialen Teil eines Eierlegezyklus (d. h. den Beginn der Pubertät).
Die Daten zeigen, dass der Beginn der Pubertät in den mit Inhibin behandelten Gruppen beschleunigt war. Dies wurde in beiden gesammelten Datensätzen, den HDEP- und FIRST-Daten, bewiesen. Es bestand ein hoher Grad an statistischer Vertraubarkeit (P < 0.0095) in Verbindung mit der höheren mittleren HDEP-Rate, die in den mit Inhibin behandelten Wachteln während der Woche 1 der Studie gefunden wurde, und ein Unterschied, der weniger wesentlich war (P < 0,0888) während der Woche 2 (Tabelle 3). Dieser marginale Unterschied zwischen den behandelten Gruppen, der während der Woche 2 beobachtet wurde, kann darstellen, dass das Eierlegen in den mit der Kontrolle injizierten Wachteln begonnen hatte sich zu intensivieren, obwohl es verzögert war (s. Fig. 2). Konsequenterweise würde die Stärke des statistischen Unterschieds, der zwischen den beiden behandelten Gruppen (Inhibin gegen Nicht-Inhibin) während der Woche 1 gefunden wurde, erwarteterweise mit zunehmender Zeit des Legens abgeschwächt werden. Tatsächlich wurde eine signifikant höhere mittlere HDEP-Rate von mittlerer statistischer Relevanz (P < 0,0763) in den mit Inhibin behandelten Hennen gefunden, als die Daten aus den Wochen 1 bis 5 kombiniert worden waren.
Es waren japanische Wachteln für die Intensität des Eierlegens ausgewählt worden, und das Eierlegepotential wird in Coturnix sogar als höher betrachtet als in Hühnerhennen (Einzelkamm weiße Livornos), kommerziell gezüchtet für den einzigen Zweck der Produktion von Tafeleiern. Zweitens war das mittlere Alter, bei dem die immunisierten Wachteln (51,98 Lebenstage) ihr erstes Ei (FIRST) legten, um +3 Tage vorgezogen (P < 0,0373) im Vergleich zu den nichtimmunisierten Wachteln (55,33 Lebenstage) (Tabelle 4). Dieser Effekt der Immunisierung mit Inhibin auf die Beschleunigung des Eierlegens war insbesondere in den mit MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/FRN behandelten Wachteln bemerkenswert, die einen durchschnittlichen mittleren FIRST von 50,38 Lebenstagen hatten (Tabelle 4). Diese Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass sich höhere Antikörpertiter auf eine heterologe Proteinbehandlung (und somit eine größere Inhibin- Immunoneutralisation) ergaben, wenn Freund'sches Adjuvans als der Trägerstoff für MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5; verwendet wurde, als wenn Acemannan verwendet wurde.
Weitere Beweise unterstützen den Schluss, dass die Immunoneutralisation mit Inhibin den Beginn der Pubertät in Wachteln beschleunigt. Speziell haben alle (100%) der mit Inhibin behandelten Hennen bisher (d. h. am 76. Lebenstag, oder an Tag 35 des Experimentes) mit dem Eierlegen begonnen, während nur zwei der mit der Kontrolle behandelten Hennen bisher mit dem Eierlegen begonnen haben. Dies legt nahe, dass wenn die zwei verbleibenden Hennen niemals mit dem Eierlegen beginnen, dass dann die Immunoneutralisation mit Inhibin das Legen in Hennen induziert haben mag, die anderenfalls niemals gelegt hätten. Wenn diese selben beiden Vögel niemals legen, oder sogar wenn die verbleibenden beiden Hennen mit dem Eierlegen irgendwann vor dem Ende der Studie (am 124. Lebenstag) beginnen, dann wird darüber hinaus die 3+ Tage Differenz in den FIRST- Eierlegedaten, die hierin gezeigt sind, gemäß mathematischer Notwendigkeit weiter ausweiten. Außerdem ist die Mehrheit dieser späten Leger (ungefähr 57%) Mitglied der zwei Kontrollgruppen (nichtimmunisiert), wobei das statistische Testen der FIFTY-Daten so ist, dass sie kontraindiziert sind (weil ungefähr 23% der Hennen noch die 50% HDEP erreichen müssen). Dieses Ergebnis unterstützt weiter die HDEP- und FIRST-Daten, die nahelegen, dass der Beginn der Pubertät in den mit Inhibin immunoneutralisierten Wachtelhennen beschleunigt wurde.
Dementsprechend zeigen die oben genannten Daten, dass die Inhibinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung den Beginn der Pubertät in japanischen Wachteln beschleunigt. Da japanische Wachteln ein annehmbares Tiermodell für Hühner in Hinsicht auf deren Reproduktivitätssysteme sind, weisen die oben genannten Daten darauf hin, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch den Beginn des Eierlegens in Hühnern beschleunigen wird. Dementsprechend ergibt das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Eierproduzenten, der in der Lage ist mehr Eier zu produzieren bei geringeren Futterkosten.
Das Folgende ist eine kurze Zusammenfassung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Beschleunigung des Beginns der Pubertät in Vogel Straußen, wie in Beispiel 9 diskutiert ist. Das durchschnittliche Alter der Pubertät für unbehandelte Vogel Strauße ist zwischen ungefähr 28 und 32 Monaten. Das Folgende wäre z. B. ein Behandlungsschema für Vogel Strauße, die ein ungefähres Körpergewicht im Bereich von 150 bis 300 Pfund haben: eine primäre (erste) Injektion von 5,0 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung in ihrem 26. Lebensmonat und Booster-Injektionen von 2,5 mg in dem 27., 28., 30.. 32., 34. und 36. Lebensmonat.
Das Folgende ist eine kurze Zusammenfassung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Beschleunigung des Beginns der Pubertät in einem Emu, wie es in Beispiel 10 diskutiert ist. Das durchschnittliche Alter der Pubertät für einen unbehandelten Emu ist ungefähr 20 Monate. Das Folgende wäre z. B. ein Behandlungsschema für einen Emu mit einem ungefähren Körpergewicht im Bereich von 50 bis 90 Pfund: eine primäre (erste) Injektion von 3,0 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung in seinem 18. Lebensmonat und Booster-Injektionen von 1,5 mg in seinem 19., 20., 22., 24., 26. und 30. Lebensmonat.
Das Folgende ist eine kurze Zusammenfassung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Beschleunigung des Beginns der Pubertät in Hühnern, wie es in Beispiel 11 diskutiert ist. Das durchschnittliche Alter der Pubertät bei einem unbehandelten Huhn ist ungefähr 20 Wochen. Das Folgende könnte ein Behandlungsschema für ein Huhn mit einem ungefähren Körpergewicht im Bereich von 2,0 bis 3,5 Pfund sein: eine primäre (erste) Injektion von 1,5 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung in seiner 15. Lebenswoche und Booster-Injektionen von 0,75 mg in seiner 17., 20., 24., 30., 40. und 50. Lebenswoche.
Das Folgende ist eine kurze Zusammenfassung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Beschleunigung des Beginns der Pubertät in Truthähnen, wie es in Beispiel 12 diskutiert ist. Das durchschnittliche Alter der Pubertät bei einem unbehandelten Truthahn ist ungefähr 30 Wochen. Das Folgende könnte ein Behandlungsschema für einen Truthahn mit einem ungefähren Körpergewicht im Bereich von 9,0 bis 12 Pfund sein: eine primäre (erste) Injektion von 2,0 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung in seiner 28. Lebenswoche und Booster-Injektionen von 1,0 mg in seiner 29., 30., 34., 38., 46. und 54. Lebenswoche.
Das Folgende ist eine kurze Zusammenfassung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Beschleunigung des Beginns der Pubertät in Papageien, wie es in Beispiel 13 diskutiert ist. Das durchschnittliche Alter der Pubertät bei einem unbehandelten Papagei ist ungefähr 30 Monate. Das Folgende könnte ein Behandlungsschema für einen Papagei mit einem ungefähren Körpergewicht im Bereich von 0,5 bis 1,25 Pfund sein: eine primäre (erste) Injektion von 0,75 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung in seinem 28. Lebensmonat und Booster-Injektionen von 0,375 mg in seinem 29., 30., 32., 34., 36. und 38. Lebensmonat.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erhöhung der Eierproduktion in Tieren durch die Verabreichung einer effektiven Menge des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung (enthaltend die α-Untereinheit eines Vogel-Inhibins, oder eines Fragmentes davon, und ein Trägerprotein), so dass die Eierproduktion in dem Vogel erhöht wird. Der Begriff " erhöht" bezeichnet, dass die Eierproduktion eines behandelten Vogels um wenigstens ungefähr 3%, bezogen auf die Menge der Eierproduktion in einem unbehandelten Vogel, ansteigt. Bevorzugt steigt die Eierproduktion um wenigsten ungefähr 7%, und besonders bevorzugt steigt sie um wenigstens ungefähr 12% an. Es soll so verstanden werden, dass ein "behandelter" Vogel ein solcher Vogel ist, dem das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung verabreicht worden ist. Bevorzugt tritt eine immunologische Antwort in dem Tier gegen das Inhibin ein. Bevorzugt ist die immunologische Antwort auch gegen das endogene Inhibin gerichtet, das durch das Tier hergestellt wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um die Eierproduktion eines Vogels zu erhöhen. Der weibliche Vogel kann ausgewählt sein aus einem Ratita, einem Psittaciformes, einem Falconiformes, einem Piciformes, einem Strigiformes, einem Passeriformes, einem Coraciiformes, einem Ralliformes, einem Cuculiformes, einem Columbiformes, einem Galliformes (domestiziertes Geflügel), einem Anseriformes (Gänse, Enten, anderes Wassergeflügel) und einem Herodiones, ohne auf diese beschränkt zu sein. Genauer gesagt, kann der weibliche Vogel ausgewählt sein aus einem Vogel Strauß, Emu, Nandu, Kiwi, Kasuar, Truthahn, Wachtel, Huhn, Falke, Adler, Habicht, Taube, Sittich, Kakadu, Ara, Papagei, einem Hockvogel (wie z. B. einem Singvogel, Eichelhäher, Amsel, Fink, Grasmücke, Sperling) und irgendeinem Mitglied der Ordnung der Psittaciformes. Ein bevorzugter Vogel ist ein Ratita. Ein besonders bevorzugter Vogel ist ein Vogel Strauß. Ein anderer bevorzugter Ratita ist ein Emu. Ein weiterer anderer bevorzugter Ratita ist ein Nandu. Noch ein anderer bevorzugter Vogel ist irgendein Mitglied der Ordnung der Psittaciformes. Ein weiterer bevorzugter Vogel ist ein Huhn. Noch ein anderer bevorzugter Vogel ist eine Wachtel. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um das Eierlegen in Spezies von Vögeln zu erhöhen, die bedroht sind. Solche bedrohte Vögel schließen Adler, Habichte, Kondoren und Eulen ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Die α-Untereinheit des Vogel-Inhibins und das Trägerprotein in der heterologen Proteinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung variieren abhängig davon, welcher Spezies von Tier die Zusammensetzung verabreicht werden soll. Das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung ist oben vollständig diskutiert worden. Es ist bevorzugt, dass die α-Untereinheit des Vogel-Inhibins und das Maltosebindeprotein verwendet wird, wenn die Zusammensetzung einem Vogel verabreicht werden soll. Ein bevorzugtes Inhibin ist ein Inhibin aus Haushuhn oder Ratita, wenn die Zusammensetzung einem Ratita verabreicht werden soll. Besonders bevorzugt ist das bevorzugte Inhibin das Inhibin aus Haushuhn oder Vogel Strauß, wenn die Zusammensetzung einem Vogel Strauß verabreicht werden soll.
Es soll so verstanden werden, dass α-Untereinheit des Vogel-Inhibins in dem heterologen Protein nicht aus derselben Spezies stammen muss, welcher das heterologe Protein verabreicht werden soll. Z. B. kann ein heterologes Protein, das einem Vogel Strauß verabreicht wird ein Huhn- Inhibin und ein Trägerprotein umfassen. Es soll auch so verstanden werden, dass die Zusammensetzung außerdem Adjuvantien, Konservierungsstoffe, Verdünner, Emulgatoren, Stabilisatoren und andere bekannte Zusammensetzungen, die für Impfstoffe des Standes der Technik bekannt sind und verwendet werden, enthalten kann. Es kann irgendein Adjuvanssystem, das in der Fachwelt bekannt ist, für die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein bevorzugtes Adjuvanssystem ist Freundsches unvollständiges Adjuvans. Ein anderes bevorzugtes Adjuvanssystem ist Freund'sches vollständiges Adjuvans.
Die heterologe Proteinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann einem Vogel mit irgendeinem Hilfsmittel, das in der Fachwelt bekannt ist, verabreicht werden. Z. B. kann die Zusammensetzung subkutan, intraperitoneal oder intramuskulär verabreicht werden. Bevorzugt wird die Zusammensetzung subkutan injiziert. Die Zusammensetzung kann dem Tier in einer oder mehreren Dosen verabreicht werden. Bevorzugt wird die Zusammensetzung dem Tier in mehreren Dosen verabreicht, wobei eine initielle Immunisierung von Booster-Immunsierungen gefolgt wird.
Die Zusammensetzung kann einem weiblichen Vogel zu jeder Zeit verabreicht werden, bevor das Tier aufgrund einer Krankheit oder aufgrund des Alters zu ovulieren beginnt. Das bevorzugte Alter, zu dem die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung einem Vogel verabreicht wird, hängt von der Spezies des Tieres ab, das beteiligt ist, von der Brutsaison (wenn eine besteht) eines Tieres und von dem Zweck der Verabreichung der Zusammensetzung.
Z. B. ist die bevorzugte Zeit zur Verabreichung der Zusammensetzung dann, wenn die Zusammensetzung verabreicht wird, um die Eierproduktion von landwirtschaftlichen Tieren, die eine Brutsaison haben, zu erhöhen, vor dem Beginn der Brutsaison. Im Gegensatz dazu, wenn die Zusammensetzung an einen reifen Vogel, der eine verminderte Eierproduktionsrate hat, verabreicht wird, dann würde die Zusammensetzung zu einem Zeitpunkt verabreicht, zu dem die Verminderung als problematisch erkannt wird.
Obwohl das heterologe Protein an einen Vogel, wie z. B einen Ratita, in jedem Alter verabreicht werden kann, ist z. B. die Immunisierung des Vogels während der sechs Monate, die vor der ersten Brutsaison des Vogels liegen, bevorzugt. Von üblich geschulten Fachleuten wird dieses so verstanden, dass durchschnittliche weibliche Vögel das Eierlegen während der ersten Brutsaison beginnen. Es ist sogar noch mehr bevorzugt, den Vogel ungefähr sechs Monate vor der ersten Brutsaison des Vogels zu immunisieren, und dann in Ein-Monatsintervallen vor der ersten Brutsaison des Vogels Booster-Immunisierungen zu verabreichen. Es ist besonders bevorzugt, den Vogel ungefähr sechs Monate vor der ersten Brutsaison des Vogels zu immunisieren, und dann über sechs Monate hin Booster- Immunisierungen mit Ein-Monatsintervallen zu verabreichen.
Die einem Vogel verabreichte Menge an heterologem Protein der vorliegenden Erfindung variiert entsprechend der Spezies des Tieres, dem Alter und dem Gewicht des Tieres, wenn das Protein im Verhältnis zu der Brutsaison (wenn das Tier eine Brutsaison hat) verabreicht wird, und wie oft das Protein verabreicht werden soll. Ein üblich geschulter Fachmann wird im Hinblick auf die Lehren der vorliegenden Erfindung in der Lage sein, durch Routinetests die Menge an heterologem Protein zu bestimmen, die notwendig sein wird, um eine immunologische Antwort auf das Protein bei einem Tier hervorzurufen.
Z. B. wird für die besten Ergebnisse bei der Verstärkung der Eierproduktion in einem weiblichen Vogel Strauß eine primäre Immunisierung an den Vogel Strauß ungefähr 6 Monate vor seiner ersten Brutsaison verabreicht, und dann werden Booster-Immunisierungen in Ein-Monatsintervallen über sechs Monate hin verabreicht. Die erste Immunisierung umfasst zwischen ungefähr 0,5 bis 4,5 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung. Die Booster-Immunisierungen umfassen zwischen ungefähr 0,30 und 3,0 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt umfasst die primäre Immunisierung zwischen ungefähr 1,5 bis 3,0 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung. Die Booster- Immunisierungen umfassen zwischen ungefähr 0,75 bis 1,5 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung. Es ist außerdem bevorzugt, dass das heterologe Protein für die primäre Immunisierung in Freund'schem komplettem Adjuvans emulgiert ist (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), und, dass das heterologe Protein für die Booster-Immunisierungen in Freund'schem unvollständigem Adjuvans (Sigma) emulgiert ist. Noch bevorzugter ist es, dass die heterologe Proteinzusammensetzung subkutan injiziert wird. Besonders bevorzugt wird die heterologe Proteinzusammensetzung subkutan an drei Stellen entlang des oberen Oberschenkelbereichs des Vogel Straußes injiziert.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verstärkung der Eierproduktion in Vögeln liefert eine stärkere Erhöhung hinsichtlich der Eierproduktion in Spezies, die nicht aufgrund der Eigenschaft des sehr produktiven Eierlegens genetisch ausgewählt wurden. Z. B. sind Hühner seit den späten 1920igern für eine maximale Eierproduktion genetisch ausgewählt worden. Siehe z. B. Jull, M. A., 1932, Poultry Breeding, John Wiley & Sons. Aufgrund der kurzen Lebensspanne eines Huhnes fand ein großer Selektionsaufwand hinsichtlich dieser Eigenschaft übe r eine Zeitdauer von ungefähr 1928 bis in die Gegenwart statt. Im Gegensatz dazu sind Ratita und Psittaciformes und die meisten der anderen exotischen Vögel nicht genetisch ausgewählt worden hinsichtlich der Eigenschaft des sehr produktiven Eierlegens. Auch Vögel, die bedroht sind, sind nicht genetisch hinsichtlich der Eigenschaft des sehr effektiven Eierlegens ausgewählt worden. Dementsprechend, da Hühner bereits genetisch exzellente Eierleger sind, ist die Verbesserung, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gesehen werden kann, begrenzt im Vergleich zu Vögeln, die genetisch schwache bis mittlere Eierleger sind. Daher wird eine sehr viel größere Verbesserungsrate bei der Eierlegerate mit dem Verfahren der vor liegenden Erfindung bei Vögeln gesehen, die nicht für das sehr effektive Eierlegen genetisch ausgewählt worden sind, wie z. B. Ratita, Psittaformes oder andere exotische Vögel und bedrohte Vögel.
Die Immunisierung eines Vogels mit dem heterologen Protein der vorliegenden Erfindung regt das Tier an Antikörper zu produzieren, die selektiv gegen das heterologe Protein gerichtet sind. Bevorzugt regt die Immunisierung das Tier auch dazu an, Antikörper zu produzieren, die selektiv gegen endogenes Inhibin gerichtet sind. Die Produktion von solchen Antikörpern durch den Vogel reduziert die Zeit bis zum Beginn der Pubertät oder des Eierlegens. Die Herstellung von solchen Antikörpern durch das Tier verstärkt auch die Kapazität des Tieres zur Eierproduktion, da die Antikörper die biologische Aktivität des Inhibins in dem Blutstrom des Tieres neutralisieren.
Ohne an die folgende Theorie gebunden werden zu wollen, wird angenommen, dass die α-Untereinheit des Inhibins an FSH-Rezeptoren bindet und damit die Bindung des FSH an solche Rezeptorenstellen kompetitiv inhibiert. Die Reduktion der Menge des Inhibins, das an die Rezeptorenstellen binden kann, verstärkt daher den biologischen Effekt des FSH in dem Tier, da eine verminderte Kompetition für die FSH-Rezeptorstellen besteht. Es wird angenommen, dass die Antikörper das Inhibin durch Interaktion mit dem zirkulierenden Inhibin neutralisieren, wodurch sie sterisch mit der Bindung des interagierten Inhibins an die FSH-Rezeptorstellen interferieren.
Überraschenderweise kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auch dafür verwendet werden, die Gesamteierlegerate der Vögel über die Lebenszeit hin zu erhöhen. Der Begriff "erhöhen" bezeichnet, dass die Gesamteierlegerate über die Lebenszeit eines behandelten Vogels um wenigstens ungefähr 3% im Vergleich zu der Gesamteierlegerate über die Lebenszeit eines unbehandelten Vogels erhöht wird. Bevorzugt steigt die Gesamteierlegerate in der Lebenszeit um wenigstens ungefähr 7%, und besonders bevorzugt steigt sie um wenigstens ungefähr 12%. Ganz besonders bevorzugt steigt die Gesamteierlegerate in der Lebenszeit um wenigstens ungefähr 15%. Es soll so verstanden werden, dass ein "behandelter" Vogel ein Vogel ist, dem das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung verabreicht worden ist. Kurz beschrieben würde die Gesamteierlegerate in der Lebenszeit von Vögeln durch das Verabreichen einer effektiven Menge des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung erhöht durch das Induzieren einer immunologischen Antwort darauf und anschließender Verabreichung einer effektiven Menge des heterologen Proteins (Booster), um ein maximales, oder höheres als normales, Eierlegen aufrechtzuerhalten. Genauer gesagt wird die gesamte Eierlegerate des Vogels in seiner Lebenszeit im Vergleich dazu, wenn die Vogel nicht mit der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt wurde, erhöht, wenn das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung einem weiblichen Vogel kontinuierlich in den ungefähren Dosen, wie in den oben beschriebenen Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens oder der Pubertät beschrieben ist, verabreicht wird.
Im Allgemeinen resultiert das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer stärkeren Verstärkung hinsichtlich der Gesamteierlegerate während der Lebenszeit in Spezies von Vögeln, die nicht genetisch für die Eigenschaft des sehr effektiven Eierlegens ausgewählt worden sind. Die Gesamteierlegerate in der Lebenszeit eines Vogels ist beschränkt durch die Anzahl von Gameten, mit der der Vogel geboren wird. Einige Spezies an Vögeln sind jedoch genetisch für eine maximale Ovulation oder ein maximales Freisetzen von Eiern ausgewählt worden. Wie bereits oben beschrieben, sind z. B. Hühner für die maximale Eierproduktion seit den späten 1920igern genetisch ausgewählt worden. Aufgrund der kurzen Lebensspanne eines Huhnes hat ein großer Aufwand für die Selektion dieser Eigenschaft über die Zeitspanne von ungefähr 1928 bis in die Gegenwart stattgefunden. Im Gegensatz dazu sind Ratita und Psittaciformes, und die meisten anderen exotischen Vögel nicht genetisch für die Eigenschaft des sehr effektiven Eierlegens ausgewählt worden. Auch sind Vögel, die bedroht sind, nicht genetisch ausgewählt worden für die Eigenschaft des sehr effektiven Eierlegens. Dementsprechend, da Hühner bereits genetisch exzellente Eierleger sind, ist der Grad der Verbesserung, der mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gesehen werden kann, im Vergleich zu Vögeln, die genetisch schwache oder mittlere Eierleger sind, beschränkt. Daher wird eine viel größere Verstärkung hinsichtlich der Gesamteierlegerate während der Lebenszeit durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung bei Vögeln gesehen, die nicht genetisch für ein sehr effektives Eierlegen ausgewählt worden sind, wie z. B. Ratita, Psittaformes, andere exotische Vögel und bedrohte Vögel. Die Erhöhung der Gesamteierlegerate über die Lebenszeit resultiert daher in der Herstellung von mehr Eiern durch dieselbe Anzahl von Vögeln, was eine höhere Gewinnspanne für den Hersteller ergibt.
Unerwarteterweise kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auch dazu verwendet werden, die Notwendigkeit einen weiblichen Vogel zu mausern zu verringern oder zu eliminieren. Genauer gesagt, wenn die Zusammensetzung, die oben beschrieben ist, dem weiblichen Vogel kontinuierlich verabreicht wird, wie es in der oben beschriebenen Methode offenbart ist, bleibt die Eierlegerate des Vogels im Vergleich dazu, wenn der Vogel nicht mit der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt ist, hoch genug, so dass der Vogel nicht gemausert werden muss, um seine Rate des Eierlegens zu verbessern. Es ist eine übliche Praxis in der Fachwelt einen weiblichen Vogel zu mausern, wie z. B. Hühnerhennen (Einzelkamm weiße Livornos, Eierproduzenten von Tischgüte), wenn ihre Eierlegeproduktion zurückgeht, so dass die ökonomischen Kosten zur Weitererhaltung des Vogels den ökonomischen Nutzen, der durch die produzierten Eier erzielt wird, übersteigen. Um eine Hühnerhenne zu "mausern", durchläuft der Vogel eine Zeit des Fastens von ungefähr vier bis vierzehn Tagen, bis sie sich zu mausern beginnt, d. h. ihre Federn verliert. Während der Mauserperiode stellt der Vogel das Eierlegen ein. Nachdem der Vogel auf einen normalen Futterlevel zurückgesetzt wird, beginnt die Eierproduktion nach einer Zeitdauer wieder. Die vollständige Mauserperiode ist ungefähr zwei Monate von dem Beginn der Fastenperiode bis zum Beginn des nächsten Eierlegezyklus. Der Effekt ist, dass die Eierproduktionsrate des Vogels wieder erneuert wird. Nach dem Mausern eines Huhnes erreicht seine Eierlegerate im nächsten Zyklus jedoch nicht die Eierproduktion während des ersten (vor der Mauser) Eierlegezyklus. M. North und D. Bell, Commercial Chicken Production Manual, 4. Edition, Kapitel 19, veröffentlicht durch Van Norstrand Reinhold aus New York.
Z. B. erreichen Hühner das Eierlegen mit ungefähr 20 Wochen und produzieren eine ökonomisch signifikante Anzahl von Eiern für ungefähr 40 bis 50 Wochen. Am Spitzenpunkt des Eierlegens produzieren Hühner 8 bis 9 Eier alle 10 Tage. Nach ungefähr 50 Wochen des Eierlegens geht jedoch die Rate der Eierproduktion auf ungefähr 60% des Spitzenwertes des Eierlegens zurück. Zu diesem Zeitpunkt sind die Kosten des Futters für die Hühner größer als der Wert der Eier, die sie produzieren. Es ist allgemeine Praxis das Huhn zu diesem Zeitpunkt zu mausern, so dass seine Eierlegerate erhöht ist, wenn das Huhn wieder mit dem Eierlegen beginnt.
Daher reduziert, bzw. eliminiert die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Notwendigkeit einen Vogel zu mausern, da sie die Rate des Eierlegens auf einem höheren Level aufrechterhält, als wenn der Vogel nicht mit der Zusammensetzung behandelt werden würde. Die Reduktion, bzw. Eliminierung der Notwendigkeit einen Vogel zu mausern resultiert in signifikanten Einsparungen. Genauer gesagt, wenn ein Vogel gemausert wird, war der Vogel in Hinsicht auf seine Futterkosten unproduktiv, bevor er gemausert wurde, und er ist dann für eine Zeitdauer unproduktiv, nachdem wieder mit dem Füttern begonnen wurde. Daher eliminiert oder reduziert das Aufrechterhalten der Eierlegerate auf einem erhöhten Level diese unproduktiven Phasen des Vogels, wodurch die Kosten des Herstellers reduziert werden, und die Gewinne des Herstellers anwachsen. Außerdem erhöht das Aufrechterhalten der Eierlegerate auf einem erhöhten Level die Gewinne des Eierherstellers, da die Eierlegerate nach dem Mausern nicht der Eierlegerate in dem ersten Zyklus des Eierlegens entspricht, wie es oben diskutiert ist.
Kurz beschrieben würde die Eierlegerate von Vögeln erhöht, wodurch die Notwendigkeit den Vogel zu mausern vermieden wird, durch die Verabreichung einer effektiven Menge des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung, indem eine immunologische Antwort darauf induziert wird, und anschließend das Verabreichen einer effektiven Menge des heterologen Proteins (als Booster-Injektionen), um eine höhere als normale Eierlegerate aufrechtzuerhalten.
Ein weiterer unerwarteter und überraschender Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auch mehr Eier herstellt, die einen verminderten Cholesteringehalt im Vergleich zu Eiern, die von einem unbehandelten Vogel gelegt werden, haben. Genauer gesagt wird der Cholesteringehalt der Eier, die von einem Vogel gelegt werden, wenn die Zusammensetzung, die oben beschrieben ist, einem weiblichen Vogel verabreicht wird, wie es in dem Verfahren oben beschrieben ist, für eine längere Zeitdauer reduziert sein im Vergleich zu, wenn der Vogel nicht mit der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt wurde. Daher erhöht oder produziert die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine größere Anzahl von Eiern mit niedrigem Cholesterin.
Die Begriffe "erhöht" oder "größere Anzahl von" bezeichnen, dass die Anzahl von Eiern mit niedrigem Cholesterin, die von einem behandelten Vogel hergestellt werden, auf wenigstens ungefähr 5% ansteigt, bezogen auf die Anzahl von Eiern mit niedrigem Cholesterin, die durch einen unbehandelten Vogel hergestellt werden. Bevorzugt steigt die Zahl von Eiern mit niedrigem Cholesterin, die hergestellt wird, auf wenigstens ungefähr 10% und besonders bevorzugt steigt sie auf wenigstens ungefähr 15%. Es soll so verstanden werden, dass ein "behandelter" Vogel ein Vogel ist, dem das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung verabreicht worden ist. Der Begriff "niedrigeres Cholesterin" oder "niedriges Cholesterin" bezeichnet, dass der Cholesteringehalt eines Eies um wenigstens ungefähr 10% niedriger ist als der mittlere Cholesteringehalt von Eiern, die durch diese Vogelspezies während der Lebensdauer eines solchen Vogels hergestellt werden. Bevorzugt ist der Cholesteringehalt eines Eies mit niedrigem Cholesterin um wenigstens ungefähr 20% niedriger als der Durchschnitt. Besonders bevorzugt ist der Cholesteringehalt eines Eies mit niedrigem Cholesterin um wenigstens ungefähr 30% niedriger als der Durchschnitt.
Es ist bekannt, dass in Hühnern die ersten fünf bis sechs Eier, die durch einen weiblichen Vogel (Henne) gelegt werden, nachdem er die Pubertät erreicht hat, niedriger im Cholesteringehalt sind als die Eier, die er später produziert. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung regt den weiblichen Vogel dazu an, über eine längere Zeitdauer Eier zu legen, die einen niedrigeren Cholesteringehalt haben. Aufgrund der Auswirkungen auf die Gesundheit, die mit hohen Cholesterinmengen im Blut zusammenhängen, bleibt eine Notwendigkeit für Eierprodukte mit niedrigem Cholesterin. Dementsprechend liefert die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung dem Hersteller von Eiern eine größere Anzahl eines Typus von Eiern, nach dem stark nachgefragt wird.
Daher werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Eierproduktion und zur Beschleunigung des Beginnes des Eierlegens in Vögeln das Wachstum der Population stark beschleunigen und somit der Markt für Ratita, wie z. B. Vogel Strauß und Emu, da durch das vorliegende Verfahren deren suboptimalen Eierlegeraten erhöht werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern bereitgestellt, die gegen das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung gerichtet sind. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die gegen das heterologe Protein gerichtet sind, die Schritte: Verabreichung einer effektiven Menge eines heterologen Proteins, umfassend das Inhibinprotein, oder ein Fragment davon, und ein Trägerprotein, an ein Tier, so dass eine immunologische Antwort in dem Tier gegen das heterologe Protein erfolgt: Abnehmen einer Blutprobe aus dem Tier; und dann Isolieren jeglicher Antikörper, die gegen Inhibin gerichtet sind, aus dem Serum der Blutprobe. Bevorzugt wird der Antikörper aus dem Serum der Blutprobe isoliert, indem das Serum durch eine Säule laufen gelassen wird, die effektive Mengen des Trägerproteins enthalten, um den Antikörper aus dem Serum abzutrennen. Die Techniken, die verwendet werden, um Antikörper, die gegen das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, herzustellen und zu reinigen, sind einem üblich ausgebildeten Fachmann gut bekannt.
Es soll auch so verstanden werden, dass das heterologe Protein der vorliegenden Erfindung irgendeinem Tier verabreicht werden kann, abhängig von dem Typ des Antikörpers, der gewünscht ist. Außerdem soll es so verstanden werden, dass das Inhibin exogen oder endogen sein kann. Daher wird der Typ des Inhibins in dem heterologen Protein der vorliegenden Erfindung und die Spezies an Tier, dem die Zusammensetzung verabreicht wird, dadurch bestimmt, welcher Typ an Antikörper gewünscht ist. Z. B. kann ein heterologes Protein, das die α-Untereinheit von Hühner-Inhibin und das Maltosebindeprotein umfasst, einem Vogel Strauß verabreicht werden, um Vogel-Strauß-Anti-Huhn-Inhibin Antikörper herzustellen. Auch kann ein heterologes Protein, das die α-Untereinheit von Vogel-Strauß- Inhibin und das Maltosebindeprotein umfasst, einem Vogel Strauß verabreicht werden, um Vogel-Strauß-Anti-Vogel-Strauß-Inhibin Antikörper herzustellen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Bestimmung der Menge an Inhibin, das durch ein Tier hergestellt wird, bereitgestellt, was somit die Bestimmung der Kapazität zur Eierherstellung des Tieres erlaubt. Kurz beschrieben umfasst das Verfahren zur Bestimmung der Quantität an Inhibin im Blut eines Tieres die Schritte: Abnehmen einer Blutprobe aus einem Tier; Inkontaktbringen der Blutprobe mit Anti-Inhibin-Antikörpern, die spezifisch gegen das endogene Inhibin des Tieres gerichtet sind, unter Bedingungen, die den Antikörpern erlauben selektiv mit irgendwelchem Inhibin, sollte es in der Probe vorliegen, zu interagieren; Entfernen irgendwelcher nicht interagierter Antikörper von jeglichen interagierten Antikörpern; und Bestimmen der Quantität von Antikörpern, die interagiert haben.
Ein üblich geschulter Fachmann wird es so verstehen, dass die Immunoassay-Techniken, die in dem obigen Verfahren verwendet werden können, allgemein bekannt sind. Daher kann jegliche Immunoassay-Technik, Markierung und Visualisierungsmethode, die in der Fachwelt bekannt ist, für die obige Methode verwendet werden. Ein bevorzugter Immmunoassay ist ein ELISA ("enzymverknüpfter immunosorbent Assay"), und ein bevorzugter Marker ist die Meerrettichperoxidase. Ein weiterer bevorzugter Marker ist ein farbiges Latexkügelchen. Das farbige Latexkügelchen kann irgendeine Farbe haben, die für die Zwecke der Visualisierung gewünscht ist. Bevorzugt ist das Latexkügelchen gelb, rot, blau oder grün. Das farbige Latexkügelchen kann hohl oder fest sein, es ist jedoch bevorzugt hohl, um sein Gewicht zu minimieren. Die Größe des Latexkügelchens variiert entsprechend seiner gedachten Verwendung in Immunoassays. Ein üblich geschulter Fachmann wird in der Lage sein, durch Routinetests die größte Kügelchengröße zu ermitteln, die sichtbar ist und gleichzeitig nicht sterisch mit den Immunoassayreaktionen interferiert. Bevorzugt ist das Latexkügelchen weniger als 0,5 um im Durchmesser, und besonders bevorzugt ist es weniger als 0,2 um im Durchmesser.
Z. B. können die im Blut eines Vogels zirkulierenden Inhibinkonzentrationen unter Verwendung von Standard-Sandwich-ELISA-Techniken bestimmt werden. Zuerst werden Anti-Inhibin-Antikörper, die gegen einen Teil des Inhibins, oder eines Fragmentes davon, gerichtet sind, an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gebunden. Nach dem Waschen und Blockieren der Platte wird eine bestimmte Menge Blutplasma, das aus dem Vogel erhalten wurde, der getestet werden soll, zugegeben. Nachdem jeglichem Inhibin in der Probe, wenn es vorliegt, erlaubt worden ist selektiv mit dem immobilisierten Anti-Inhibin-Antikörper zu interagieren, wird die Probe aus der Vertiefung der Platte herausgewaschen. Als nächstes werden markierte Anti-Inhibin-Antikörper dann in die Vertiefung zugegeben, die gegen einen anderen Anteil des Inhibins, oder eines Fragmentes davon, gerichtet sind, dann werden die Antikörper in der Vertiefung immobilisiert. Die Antikörper können mit irgendeinem Marker, der in der Fachwelt bekannt ist, markiert werden, wie z. B. mit Meerrettichperoxidase. Nachdem der markierte Anti-Inhibin-Antikörper selektiv mit irgendwelchem immobilisiertem Inhibin interagieren gelassen wurde, werden jegliche nicht interagierten markierten Anti-Inhibin-Antikörper durch Waschen entfernt. Die Menge an Inhibin, die in der Plasmaprobe vorliegt, wird durch Verwenden der geeigneten Visualisierungshilfsmittel für den Marker, der in dem ELISA verwendet wurde, bestimmt, um die Menge an immobilisiertem markierten Anti-Inhibin-Antikörper in der Vertiefung zu quantifizieren.
Positive und negative Standardkontrollen müssen gleichzeitig in benachbarten Plattenvertiefungen durchgeführt werden.
Es soll so verstanden werden, dass das reproduktive Potential jedes Tieres, das Inhibin produziert, durch das obige Verfahren bestimmt werden kann. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Menge an Inhibin, die durch ein weibliches Tier jeglicher Spezies, die Inhibin produziert, hergestellt wird, zu bestimmen. Das Tier kann ein Vogel sein, ein Säugetier oder ein Reptil, neben anderen. Spezifischer gesagt kann das Säugetier ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus einer Kuh, einem Mensch, Pferd, Katze, Hund, Schaf, Nerz, Fuchs, Otter, Frettchen, Waschbär und Schwein, ohne auf diese begrenzt zu sein. Der Vogel kann ausgewählt sein aus einem Vogel Strauß, Emu und Huhn, ohne auf diese beschränkt zu sein. Ein bevorzugtes Tier ist ein Vogel. Ein besonders bevorzugtes Tier ist ein Ratita. Ein insbesondere bevorzugtes Tier ist ein Vogel Strauß. Ein weiteres bevorzugtes Tier ist ein Emu. Noch ein weiteres bevorzugtes Tier ist ein Huhn.
Tiere, die eine hohe Menge an Inhibin haben, haben ein niedriges reproduktives Potential, und abhängig von der einbezogenen Spezies, und ob diese für landwirtschaftliche Zwecke aufgezogen werden, kann ein solches wenig Eier herstellendes Tier zum Schlachter gebracht werden, anstatt es für züchterische Zwecke zu behalten. Im Gegensatz dazu sind solche landwirtschaftlich aufgezogenen Tiere, die niedrigere Mengen an Inhibin haben, höhere Eierproduzenten und werden üblicherweise für züchterische Zwecke verwendet und werden nicht zum Schlachter gebracht.
Die Inhibinmengen in einem Tier variieren entsprechend deren Alter, Spezies und der Jahreszeit im Verhältnis zu der Brutsaison (wenn eine solche besteht). Daher ist die Bestimmung des Eierlegepotentials eines Tieres in Bezug auf diese Faktoren zu sehen und eine Messung der Inhi binmengen eines Tieres ist am aussagekräftigsten, wenn sie mit mittleren Inhibinmengen derselben Spezies des Tieres mit ungefähr demselben Alter, zur selben Jahreszeit, wenn das Tier eine Brutsaison hat, verglichen wird.
Da die Menge an Inhibin, die durch einen Vogel hergestellt wird, entsprechend zu den oben genannten Faktoren variiert, sind relative Mengen an Inhibin unten für verschiedene Alterskategorien von Vögeln ermittelt. Tabelle 1 stellt die Varianz von Ratitae, wie z. B. Emus und Vogel Straußen, bei deren Inhibinproduktion dar, abhängig davon, ob sie schwache oder gute Eierproduzenten sind, und abhängig von dem Alter des Ratita. Tabelle 1
In der obigen Tabelle ist die Inhibinmenge bezogen auf einen standardgepoolten Wert von 1 für weibliche Ratitae, die durchschnittlich 50 bis 60 Eier je Brutsaison legen, was gut ist, und einen Wert von 7 für eine Pool von funktionell nicht produzierenden weiblichen Ratitae, die weniger als 5 Eier je Saison herstellen, was schwach ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung von tierischen Antikörpern, die gegen eine Klasse von anderen tierischen Antikörpern gerichtet sind, wie z. B. IgG, bereitgestellt. Kurz beschrieben umfasst das Verfahren zur Herstellung von Antikörpern in einem Tier, die gegen IgG eines anderen Tieres gerichtet sind, die Schritte: Verabreichung einer effektiven Menge einer Klasse von Antikörpern eines ersten Tieres, wie z. B. solche, die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt wurden, an ein zweites Tier, so dass eine immunologische Antwort in dem zweiten Tier gegen die Antikörper des ersten Tieres erfolgt; Abnehmen einer Blutprobe aus dem zweiten Tier; und Isolieren der Antikörper des zweiten Tieres aus dem Serum der Blutprobe, wie oben beschrieben. Bevorzugt ist das zweite Tier eine andere Spezies als das erste Tier.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Bestimmung bereitgestellt, ob ein Tier immunologisch auf die Verabreichung einer Zusammensetzung, die Inhibin umfasst, geantwortet hat. Dieses Verfahren benutzt die Antikörper eines zweiten Tieres, die gegen eine Klasse von Antikörpern aus einem ersten Tier gerichtet sind, wie es oben beschrieben ist. Kurz beschrieben umfasst die Methode das Binden von Inhibin oder des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung an eine feste Phase und das Inkontaktbringen des immobilisierten Inhibins mit einer Blutprobe aus dem Tier, das getestet werden soll. Die Probe wird mit dem immobilisierten Inhibin unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen das Inhibin selektiv mit irgendwelchen Anti-Inhibin- Antikörpern in der Probe interagiert. Nach dem Entfernen von nicht interagierten Antikörpern aus der Probe und Waschen wird eine quantifizierte Menge von markierten Antikörpern aus einem zweiten Tier, die gegen eine Klasse von Antikörpern aus dem ersten Tier gerichtet sind, zugegeben. Die markierten Antikörper, die gegen die Antikörper des Tieres gerichtet sind, werden dann selektiv mit den Antikörpern interagieren, die an das immobilisierte Inhibin gebunden sind. Nach dem Entfernen von den nichtinteragierten markierten Antikörpern wird das Vorliegen oder die quantitative Menge von interagierten markierten Antikörpern bestimmt, indem der Marker visualisiert wird. Somit detektiert das Verfahren das Vorliegen von Antikörpern, die gegen Inhibin in dem Tier gerichtet sind, und bestimmt somit, ob das Tier immunologisch auf die Verabreichung einer Zusammensetzung, die Inhibin umfasst, reagiert hat.
Es soll so verstanden werden, dass das Verfahren zur Bestimmung, ob ein Tier immunologisch auf die Verabreichung einer Zusammensetzung, die Inhibin umfasst, geantwortet hat, an einem weiblichen Tier irgendeiner Spezies durchgeführt werden kann. Das Tier kann ein Vogel sein, ein Säugetier oder ein Reptil, neben anderen. Spezifischer gesagt kann das Säugetier ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus einer Kuh, einem Mensch, Pferd, Katze, Hund, Schaf, Nerz, Fuchs, Otter, Frettchen, Waschbär und Schwein, ohne auf diese begrenzt zu sein. Der Vogel kann ausgewählt sein aus einem Vogel Strauß, Emu, Nandu und Huhn, ohne auf diese beschränkt zu sein. Ein bevorzugtes Tier ist ein Vogel. Ein besonders bevorzugtes Tier ist ein Ratita. Ein insbesondere bevorzugtes Tier ist ein Vogel Strauß. Ein weiteres bevorzugtes Tier ist ein Emu. Noch ein weiteres bevorzugtes Tier ist ein Nandu.
Ein üblich geschulter Fachmann wird es so verstehen, dass die Immunoassay-Techniken, die für die oben genannte Methode verwendet werden können, in der Fachwelt gut bekannt sind. Somit kann jede Immunoassay- Technik, Marker und Visualisierungsmethode für das oben genannte Verfahren verwendet werden. Ein bevorzugter Immmunoassay ist ein ELISA und ein bevorzugter Marker ist die Meerrettichperoxidase. Ein weiterer bevorzugter Marker ist ein farbiges Latexkügelchen. Das farbige Latexkügelchen kann irgendeine Farbe haben, die für die Zwecke der Visualisierung gewünscht ist. Bevorzugt ist das Latexkügelchen gelb, rot, blau oder grün. Das farbige Latexkügelchen kann hohl oder fest sein, es ist jedoch bevorzugt hohl, um sein Gewicht zu minimieren. Die Größe des Latexkügelchens variiert entsprechend seiner gewünschten Verwendung in Immunoassays. Ein üblich geschulter Fachmann wird in der Lage sein die größte Kügelchengröße zu ermitteln, die sichtbar ist und gleichzeitig nicht sterisch mit den Immunoassayreaktionen interferiert. Bevorzugt ist das Latexkügelchen weniger als 0,5 um im Durchmesser, und besonders bevorzugt ist es weniger als 0,2 um im Durchmesser.
Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung, ob ein Tier immunologisch auf die Verabreichung einer Zusammensetzung, die Inhibin umfasst, reagiert, wobei die Immunoassay-Methode modifiziert ist, ist wie folgt. Kurz beschrieben umfasst das Verfahren die Abnahme einer Blutprobe aus einem Tier und das Inkontaktbringen dieser mit markiertem Tier-Inhibin, oder einem Fragment davon. Die Probe wird mit dem markierten Tier-Inhibin unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen das Tier-Inhibin selektiv mit irgendwelchen Anti-Inhibin-Antikörpern in der Probe interagieren wird. Nach dem Entfernen von nichtinteragiertem markiertem Inhibin aus der Probe wird das Vorliegen oder die quantitative Menge von interagiertem markiertem Inhibin bestimmt, indem der Marker visualisiert wird. Das Inhibin, das in diesem Verfahren verwendet wird, kann ausgewählt sein aus: dem fusionierten heterologen Inhibin-Protein der vorliegenden Erfindung; endogenem Inhibin, oder Fragmenten davon: und exogenem Inhibin, oder Fragmenten davon.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele genauer dargestellt, die nicht in irgendeiner Weise so aufgefasst werden sollen, dass sie deren Umfang Grenzen setzt. Es soll im Gegenteil klar so verstanden werden, dass ein Ausweg auf verschiedene andere Ausführungsformen, Modifikationen und Äquivalente davon verbleibt, nachdem die hiesige Beschreibung gelesen ist, die sich selbst den Fachleuten nahelegen, ohne aus dem Umfang der anhängenden Ansprüche herauszuführen.

BEISPIEL 1

Verfahren zur Herstellung eines fusionierten Genproduktes, das ein Gen umfasst, welches für die Expression von Huhn-Inhibin kodiert, und eines Genes, das für die Expression des Maltosebindeproteins kodiert.

Das Folgende ist ein Verfahren zur Herstellung eines fusionierten Genproduktes, das ein Gen (cIN&sub5;&sub1;&sub5;) umfasst, das für die Expression eines Fragmentes der α-Untereinheit des Huhn-Inhibins (SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 4) kodiert, und ein Gen, das für die Expression des Maltosebindeproteins kodiert. Ein fusioniertes Genprodukt der vorliegenden Erfindung wird mit dem pMALTM-c-Vektorkit von New England Biolabs, Beverly Massachusetts, hergestellt.
Die pMALTM-c-Vektoren liefern ein Verfahren zur Expression eines Proteins, das von einem klonierten Gen oder einem offenen Leserahmen exprimiert wird. Das klonierte Gen wird unterhalb eines malE-Genes eingesetzt, welches für das Maltosebindeprotein ("MBP") kodiert, und bewirkt die Expression eines MBP-Fusionsproteins ("MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;"). Das Verfahren ergibt eine Expression der geklonten Sequenzen auf hohem Niveau und eine einstufige Reinigung für das Fusionsprotein, MBP-cIN&sub5;&sub1;&sub5;, unter Verwendung der Affinität des MBP für Maltose.
Das Folgende ist ein Verfahren zur Ligation des Inhibingens, cINA&sub5;&sub1;&sub5;, in einen pMALTM-c-Vektor:
1. Schneiden von 0,5 ug pMALTM-c-Plasmid-DNA in 20 ul mit dem Huhn- Inhibingen, cINA&sub5;&sub1;&sub5;.
2. Schneiden von 20 ug λ-DNA aus dem gt 11 Klon in 200 ul mit dem Huhn- Inhibingen, cINA&sub5;&sub1;&sub5;.
3. Zugabe von 0,05 Einheiten Kälber intestinaler alkalischer Phosphatase (NEB #290) zu dem Vektor-DNA-Verdau. Inkubieren bei 37ºC über 1 h.
4. Überprüfen auf vollständigen Verdau durch Laufenlassen von 4 ul der pMALTM-Reaktion und 15 ul der λ-Reaktion auf einem 0,8%igen Agarosegel. Zugabe von 1 ul, bzw. 8 ul 0,5 M EDTA zu den pMALTM- bzw. λ gt 11-Verdaus.
5. Zugabe eines gleichen Volumens einer 1 : 1-Phenol/Chloroform-Mischung zu den Restriktionsverdaus, Mischen und Entfernen der wässrigen (oberen) Phase und Überführen in ein frisches Röhrchen. Wiederholen mit Chloroform alleine.
6. Zugabe von 10 ug Glycogen oder tRNA zu dem Vektorverdau als Träger. In beide Verdaus Zugabe eines 1/10-Volumens 3 M-Natriumacetat, Mischen, dann Zugabe eines gleichen Volumens Isopropanol. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
7. Mikrozentrifugation über 15 min. Abgießen des Überstandes, Waschen des Pellets mit 70% Ethanol und Trocknenlassen.
8. Resuspendieren jeder Probe in 25 ul 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0.
9. Mischen: 2 ul Vektorverdau; 6 ul Verdau des Inserts; Zugabe von 8 ul Wasser, dann Erhitzen der DNA-Mischung auf 65ºC für 5 min. Kühlen auf Eis, dann Zugabe von 4 ml 5 · Ligasepuffer; 0,5 ul NEB T4-Ligase (# 202; ~200 Einheiten); und Inkubation bei 16ºC für 2 h bis über Nacht.
10. Erhitzen auf 65ºC für 5 min. Kühlen auf Eis.
11. Mischen mit 25 ul kompetenten TB 1 (oder irgendeinem lacZα- komplementierendem Stamm) und Inkubieren auf Eis für 5 min. Erhitzen auf 42ºC für 2 min.
12. Zugabe von 0,1 ml LB und Inkubieren bei 37ºC für 20 min. Verteilen auf einer LB-Platte, die 100 ug/ml Ampicillin enthält. Inkubieren über Nacht bei 37ºC. Picken von Kolonien mit einem sterilen Zahnstocher auf eine Master-LB-amp-Platte und eine LB-amp-Platte, die 80 ug/ml Xgal und 0,1 mM IPTG enthält. Inkubieren bei 37ºC für 8 bis 16 h. Zählen des Lac-Phenotys auf der Xgal-Platte und Gewinnen der "weißen" Klone von der Masterplatte.
13. Durchsuchen auf das Vorliegen von Inserts auf eine oder beide der folgenden Weisen:
A. Herstellen von Miniprep-DNA. Verdauen mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease, um das Vorliegen und die Richtung des Inserts zu bestimmen.
B. i) Heranziehen einer 5-ml-Kultur in LB amp-Medium bis ungefähr 2 · 10&sup8;/ml.
ii) Entnehmen einer 1-ml-Probe. Mikrozentrifugation für 2 min. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 50 ul Probenpuffer für ein Proteingel SDS-PAGE.
iii) Zugabe von IPTG zu der verbleibenden Kultur bis 0,3 mM, z. B. 15 ul einer 0,1 M Stocklösung. Inkubieren bei 37ºC mit guter Belüftung über 2 h.
iv) Entnehmen einer 0,5-ml-Probe. Mikrozentrifugation für 2 min. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 100 ul SDS-PAGE Probenpuffer.
v) Kochen der Probe für 5 min. Elektrophorese mit 15 ul jeder Probe auf einem 10%igen SDS-PAGE-Gel gleichzeitig mit einem Set von Protein-MW-Standards und 15 ul des bereitgestellten MBPs in SDS-PAGE Probenpuffer. Färben des Gels mit Coomassie Brilliant Blue. Eine induzierte Bande ist leicht an einer Position sichtbar, die dem Molekulargewicht des Fusionsproteins entspricht. Das Molekulargewicht von MBP alleine ist 42000 Daltons.

BEISPIEL 2

Verfahren zur Herstellung eines fusionierten heterologen Proteins, "MBP- cINA&sub5;&sub1;&sub5;", enthaltend Huhn-Inhibin und Maltosebindeprotein.

Das Folgende ist ein Verfahren zur Herstellung eines fusionierten heterologen Proteins, das ein Huhn-Inhibin und das Maltosebindeprotein enthält, "MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;". Das fusionierte Genprodukt des Beispiels 1 exprimiert das fusionierte heterologe Maltosebindeprotein-Inhibinprotein, "MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;", wie folgt:
1. Animpfen von 80 ml reichem Medium + Glukose und Ampicillin (siehe Medien und Lösungen unten) mit 0,8 ml einer Über-Nacht-Kultur, die das Fusionsplasmid des Beispiel 1 enthält.
2. Wachsen lassen bei 37ºC mit guter Belüftung auf 2 · 10&sup8; Zellen/ml (A&sub6;&sub0;&sub0; von ~0,5). Entnehmen einer Probe von 1 ml und Mikrozentrifugieren für 2 min (nichtinduzierte Zellen). Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 50 ul SDS-PAGE Probenpuffer. Vortexen und auf Eis stellen.
3. Zugabe von IPTG (Isopropylthiogalactosid) zu der verbleibenden Kultur, um eine Endkonzentration von 0,3 mM herzustellen, d. h. 0,24 ml einer 0,1 M Stocklösung in H&sub2;O (siehe Medien und Lösungen). Weitere Inkubation bei 37ºC über 2 h. Entnehmen einer 0,5 ml Probe und Mikrozentrifugation für 2 min (induzierte Zellen). Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 100 ul SDS-PAGE Probenpuffer. Vortexen, um die Zellen zu resuspendieren, und auf Eis stellen.
4. Teilen der Kulturen in zwei Aliquots. Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 4000 · g für 10 min. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren eines Pellets (Probe A) in 5 ml Lysepuffer (siehe Medien und Lösungen). Resuspendieren des anderen Pellets (Probe B) in 10 ml 30 mM Tris-Cl, 20% Sucrose, pH 8,0 (8 ml für jedes 0,1 g an Zellen im Nassgewicht).
5. Einfrieren der Proben in einem Trockeneis-Ethanol-Bad (oder über Nacht bei -28ºC). Auftauen in kaltem Wasser (20ºC ist effektiver als 70ºC, dauert aber länger).
6. Beschallen mit Ultraschall, Überwachen des Zellaufbrechens durch Messen der Freisetzung von Protein unter Verwendung des Bradford-Assays oder des Freisetzens von Nukleinsäure bei A&sub2;&sub6;&sub0;, bis es ein Maximum erreicht. Zugabe von 0,6 ml 5M NaCl.
7. Zentrifugieren bei 9000 · g für 20 min. Abgießen des Überstandes (Rohextrakt 1) und Bewahren auf Eis. Resuspendieren des Pellets in 5 ml Lysepuffer. Dies ist eine Suspension der unlöslichen Materie (Rohextrakt 2).

Die Säulenreinigung des heterologen fusionierten Maltosebindeprotein- Inhibinproteins, "MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;", wie oben hergestellt, ist wie folgt:

1. Quellen lassen von Amyloseharz (1,5 g) über 30 min in 50 ml- Säulenpuffer (siehe Medien und Lösungen) in einer 250-ml- Filterflasche. Entgasen mit einen Aspirator. Eingießen in eine 2,5 · 10 cm -Säule. Waschen der Säule mit 3 Säulenvolumen desselben Puffers mit 0,25% Tween 20. Die Menge des benötigten Harzes hängt von der Menge des hergestellten Fusionsproteins ab. Das Harz bindet ungefähr 3 mg/ml Bettvolumen, so dass eine Säule von ungefähr 15 ml ausreichen sollte für eine Ausbeute von bis 45 mg Fusionsprotein/Liter Kultur. Eine 50-ml- Spritze, gestopft mit silanisierter Glaswolle, kann die 2,5-cm-Säule ersetzen. Das Verhältnis der Säulenhöhe zum Durchmesser sollte weniger als oder gleich 4 sein.
2. Verdünnen des Rohextraktes 1 : 5 mit Säulenpuffer + 0,25% Tween 20. Laden des verdünnten Rohextraktes mit einer Flussrate von [10 · (Durchmesser der Säule in cm)²]ml/h. Dies ist ungefähr 1 ml/min für eine 2,5-cm-Säule. Die Verdünnung des Rohextraktes zielt darauf ab, die Proteinkonzentration auf ungefähr 2,5 mg/ml zu reduzieren. Wenn der Rohextrakt weniger konzentriert ist, soll er nicht so stark verdünnt werden. Eine gute Daumenregel ist, dass 1 g Nassgewicht der Zellen ungefähr 120 mg Protein ergeben.
3. Waschen mit 2 Säulenvolumen Säulenpuffer + 0,25% Tween 20.
4. Waschen mit 3 Säulenvolumen Säulenpuffer ohne Tween 20.
5. Eluieren des Fusionsproteins, "MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;", mit Säulenpuffer + 10 mM Maltose + 0,1% SDS (optional 10 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EGTA). Sammeln von 10-20 3-ml-Fraktionen. Analysieren der Fraktionen auf Protein, d. h. durch einen Bradford-Assay oder A&sub2;&sub6;&sub0;; die Fraktionen, die das Fusionsprotein enthalten, haben ein einfach detektierbares Protein. Das Fusionsprotein eluiert schnell nach dem Leervolumen der Säule.

Medien und Lösungen

- Reiches Medium + Glukose und Ampicillin = je Liter: 10 g Tryplon, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 2 g Glukose. Autoklavieren; Zugabe von sterilem Ampicillin bis 100 ug/ml.
- 0,1 M IPGT Stocklösung = 1,41 g IPTG (Isopropyl-β-o-thiogalactosid); Zugabe von H&sub2;O auf 50 ml. Filtrieren und sterilisieren.
- 0,5 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2 (Stocklösung) =
(A) 69,0 g NaH&sub2;PO&sub4;H&sub2;O auf 1 Liter mit H&sub2;O
(B) 70,9 g Na&sub2;HPO&sub4; auf 1 Liter mit H&sub2;O.
Mischen von 117 ml (A) mit 383 ml (B). Der pH dieser Stocklösung sollte ~7,2 sein. Verdünnen auf 10 mM in Säulenpuffer, der pH sollte 7,0 sein.

Lysepuffer

Pro Liter Endkonzentration
20ml 0,5 M Na&sub2;HPO&sub4; 10 mM Phosphat
1,75 g NaCl 30 mM NaCl
10 ml 25% Tween 20 0,25% Tween j20
0,7 ml β-Mercaptoethanol 10 mM β-ME ("β-ME") (optional)
20 ml 0,5 M EDTA (pH 8) 10 mM EDTA
10 ml 1 M EGTA (pH 7) 10 mM EGTA
Einstellen auf pH 7,0 mit HCl oder NaOH

Säulenpuffer

Pro Liter Endkonzentration
20 ml 0,5 M Natriumphosphat, pH 7,2 10 mM Phosphat
29,2 NaCl 0,5 M NaCl
1 ml 1 M Natriumazid 1 mM Azid
0,7 mM β-ME (optional) 10 mM β-ME
1 ml 1 M EGTA (pH 7) (optional) 1 mM EGTA
Einstellen auf pH 7,0, wenn nötig .

Säulenpuffer mit niedrigem Salzgehalt

Pro Liter Endkonzentration
20 ml 0,5 M Natriumphosphat, pH 7,2 10 mM Phosphat
1,75 g NaCl 30 mM NaCl
1 ml 1 M Natriumazid 1 mM Azid
0,7 mM β-Mercaptoethanol (optional)10 mM β-ME
1 ml 1 M EGTA (pH 7) (optional) 1 mM EGTA
Einstellen auf pH 7,0, wenn nötig.
Die Reinheit des fusionierten Huhn-Inhibin-MBP heterologen Proteins, "MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;", nachdem es durch die Säule gelaufen ist, ist in Fig. 1 dargestellt, Bahn "E". Die Bahn, die mit "F" markiert ist, ist das Eluat aus der Säule, wenn kein heterologes Protein auf die Säule geladen wurde (die Negativkontrolle). Die Bahnen, die mit "B" markiert sind, repräsentieren die Plasmid pMALTM-c-Vektorstandards. Die Bahnen, die mit C" markiert sind, sind die Molekulargewichsstandards. Die Bahnen, die mit "D" markiert sind, sind der aktuelle pMALTM-c-Vektor, der für die Herstellung des fusionierten Huhn-Inhibin-MBP heterologen Proteins, "MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;", verwendet wurde, vor dem Einsetzen des Inhibingens, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die oben genannten Proteine wurden auf einem SDS-PAGE- Gel in SDS-PAGE-Probenpuffer elektrophoretisch getrennt und mit Coomassie Brillian Blue - Farbstoff gefärbt.

BEISPIEL 3

Methode zur Immunisierung eines Vogel Straußes gegen Inhibin.

Das Folgende ist ein Verfahren zur Immunisierung eines Vogel Straußes gegen Inhibin. Eine primäre Immunisierung wird dem Vogel Strauß ungefähr 6 Monate vor der ersten Brutsaison des Vogels verabreicht, und dann werden Booster-Immunisierungen mit Ein-Monatsintervallen über sechs Monate verabreicht. Dementsprechend ist es bevorzugt, die primäre Immunisierung dem Vogel Strauß zu verabreichen, wenn er zwischen ungefähr 18 und 24 Monaten alt ist. Die primäre Immunisierung umfasst zwischen ungefähr 1,5 bis 3,0 mg eines fusionierten heterologen Proteins, das ein Huhn-Inhibin (ein Fragment der α-Untereinheit) und ein Maltosebindeprotein umfasst, wie es durch die Verfahren, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben sind, hergestellt wurde. Die Booster-Immunisierungen enthalten zwischen ungefähr 0,75 bis 1,5 mg des fusionierten heterologen Proteins. Das fusionierte heterologe Protein ist in Freund'schem komplettem Adjuvans (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei der primären Immunisierung emulgiert, und das fusionierte heterologe Protein ist in Freund'schem nicht- vervollständigtem Adjuvans (Sigma) bei den Booster-Immunisierungen emulgiert. Die Zusammensetzung des fusionierten heterologen Proteins wird subkutan an drei Stellen entlang des oberen Oberschenkelbereiches des Vogel Straußes injiziert.

BEISPTEL 4

Verfahren zur Herstellung von Vogel-Strauß-Antikörpern, die selektiv gegen Inhibin gerichtet sind.

Das Folgende ist ein Verfahren zur Herstellung von Vogel-Strauß- Antikörpern ("Vogel-Strauß-Anti-Huhn-Inhibin-Antikörper"), die selektiv gegen ein heterologes Protein der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, welches Huhn-Inhibin und das Maltosebindeprotein umfasst. Genauer gesagt sind die Vogel-Strauß-Antikörper IgG-Antikörper. Das verwendete heterologe Protein ist ein Fusionsprotein, das Huhn-Inhibin und Maltosebindeprotein umfasst, wie es durch die Verfahren, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben sind, hergestellt ist. Um die Antikörper herzustellen, wird ein Vogel Strauß mit dem Huhn-Inhibin-MBP heterologen Protein entsprechend dem Verfahren, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, immunisiert. Die Menge, die dem Vogel Strauß verabreicht wird, muss ausreichen, um eine immunologische Antwort in dem Vogel Strauß gegen das heterologe Protein hervorzurufen. Man entnehme ungefähr 5 ml Blut von einem Vogel Strauß und isoliere dann die Antikörper, die gegen das Inhibin gerichtet sind, aus dem Rest der Probe. Es kann irgendeine allgemein bekannte Trennungsmethode verwendet werden, um die Antikörper zu isolieren. Bevorzugt werden Standard-ELISA-Techniken angewendet.

BEISPIEL 5

Verfahren zur Herstellung von Ziege-Antikörpern, die selektiv gegen Vogel-Strauß-Antikörper gerichtet sind.

Das Folgende ist ein Verfahren zur Herstellung von Ziege-Antikörpern, die selektiv gegen eine Klasse von Vogel-Strauß-Antikörpern gerichtet sind, einschließlich die Antikörper, die in Beispiel 4 hergestellt wurden, genauer gesagt, IgG-Vogel-Strauß-Antikörper. In diesem Verfahren wird eine Ziege mit 0,5 bis 3,0 mg Vogel-Strauß-IgG immunisiert, so dass eine immunologische Antwort in der Ziege gegen das Vogel-Strauß-IgG erfolgt. Das Vogel-Strauß-IgG wird aus einem Pool von Seren von verschiedenen Vogel Straußen erhalten. Das Blut wird der Ziege entnommen und das Ziege-Anti-Vogel-Strauß-IgG wird dann aus der Probe unter Verwendung von Standardtechniken, die in der Fachwelt gut bekannt sind, isoliert.
Der Pool von Seren wird unter Verwendung von Standardmethoden gereinigt, die die Ausfällung unter Verwendung von 50% Ammoniumsulfat und die darauffolgende Fraktionierung unter Verwendung einer Protein-A-Sepharose- Säule einschließen. Bevorzugt wird die IgG-Ausfällung wie folgt durchgeführt. 12 ml des Seren, die IgG enthalten, werden 1 : 1 mit 50 mM-Tris (pH 8,0) verdünnt. Als nächstes werden 24 ml des gesättigten Ammoniumsulfates langsam unter Rühren zugegeben (alles bei 4ºC), und die Mischung wird für weitere 2 h gerührt. Die Mischung wird bei 10000 UpM für 10 min zentrifugiert, um das Präzipitat zu sammeln. Das Präzipitat wird in 50 mM-Tris/Salzlösung (auf 12 ml) resuspendiert und über Nacht gegen 2 l 50 mM-Tris bei 4ºC dialysiert, wobei das Endvolumen bei 20 ml ist.
Bevorzugt ist die darauffolgende Fraktionierung unter Verwendung einer Protein-A-Sepharose-Säule wie folgt. Die Säule enthält Protein-A- Sepharose CL-4B (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Die Säule wird mit ungefähr 5 ml des Ammoniumsulfat/Serum-Präzipitates beladen. Der Probe wird erlaubt an die Protein-A-Sepharose für ungefähr 30 min zu binden. Als nächstes wird die Säule mit 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und das adsorbierte IgG mit 0,1 M Glycin (pH 2,8) eluiert. Letztlich werden die eluierten Fraktionen durch die Zugabe von wenigen Tropfen 1 M Tris-HCL (pH 9) neutralisiert. Die Qualität des gereinigten Vogel-Strauß-IgG wird getestet, indem sie nach einer SDS-Polyacrylamid- Gel-Elektrophorese visualisiert wird, bevor es der Ziege verabreicht wird.
Das Verfahren zur Immunisierung und die Adjuvantien, die verwendet werden, sind nicht kritisch für die Erfindung, so dass irgendeine Methode, die in der Fachwelt bekannt ist, verwendet werden kann und irgendein Adjuvanssystem, das in der Fachwelt bekannt ist, kann verwendet werden. Bevorzugt wird das gereinigte Vogel-Strauß-IgG der Ziege subkutan injiziert. Es ist auch bevorzugt, die Booster-Injektionen mit Vier-Wochen- Intervallen unter Verwendung des Freund'schen unvollständigen Adjuvans zu verabreichen. Bevorzugt wird das gereinigte IgG mit Freund'schem komplettem Adjuvans oder Hunter's Titermax (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) verabreicht. Eine Ziege entwickelt eine befriedigende Immunantwort nach drei bis vier Injektionen.
Als nächstes werden 5-10 ml Blut aus der Ziege entnommen und die Ziegen- Antikörper, die gegen das Vogel-Strauß-IgG gerichtet sind, werden aus der Blutprobe isoliert. Es kann irgendeine in der Fachwelt bekannte Methode verwendet werden, um die Ziege-Antikörper aus der Blutprobe abzutrennen. Eine bevorzugte Methode zur Trennung der Ziege-Antikörper aus der Probe ist es, die Blutprobe durch eine Vogel-Strauß-IgG-Säule laufen zu lassen. Die Ziege-Antikörper werden dann aus der Säule durch Waschen der Säule mit Glycinpuffer pH 8,0 gesammelt.

BEISPIEL 6

Verfahren zur Überwachung der immunologischen Antwort eines Vogel Straußes nach seiner Impfung mit einem fusionierten heterologen Protein.

Das Folgende ist ein Verfahren zur Überwachung der immunologischen Antwort eines Vogel Straußes, nachdem er mit einem fusionierten heterologen Protein, das Huhn-Inhibin und Maltosebindeprotein umfasst, wie es durch das Verfahren der Beispiele 1 und 2 hergestellt ist, geimpft wurde, wobei die immunologische Antwort unter Verwendung der Ziege-Antikörper überwacht wird, die in Beispiel 5 hergestellt wurden. Um zu bestimmen, ob ein Vogel Strauß immunologisch auf das fusionierte Inhibin-MBP heterologe Protein reagiert hat, wird zunächst das heterologe Protein an eine feste Phase gebunden. Als nächstes werden 5-10 ml Blut aus einem Vogel Strauß entnommen, der mit dem heterologen Protein immunisiert worden ist, und das Serum aus dem Blut isoliert. Das immobilisierte heterologe Protein wird mit dem Serum unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen das heterologe Protein selektiv mit irgendwelchen Anti-Inhibin- Antikörpern in dem Serum interagiert. Nach einem Waschen werden die Ziege-Antikörper, die in Beispiel 5 hergestellt wurden, zugegeben, welche mit Merrettichperoxidase markiert wurden. Die markierten Ziege- Antikörper werden dann selektiv mit den Vogel-Strauß-Antikörpern interagieren, die an das immobilisierte heterologe Protein gebunden sind. Nach dem Entfernen der nichtinteragierten markierten Antikörper wird die Anwesenheit oder die quantitative Menge an interagierten, mit Meerrettichperoxidase markierten Ziege-Antikörpern bestimmt, indem der Marker visualisiert wird. Bevorzugt wird der Marker durch die Zugabe von Nitro- Blau-Tetrazolium ("NBT"), einem Substrat für die Meerrettichperoxidase, visualisiert.
Ein üblich geschulter Fachmann wird es so verstehen, dass die Immunoassay-Techniken, die in der oben genannten Methode verwendet sind, in der Fachwelt gut bekannt sind. Daher kann jede Immunoassay-Technik, jeglicher Marker und jegliche Visualisierungsmethode für das oben genannte Verfahren verwendet werden. Ein bevorzugter Immunoassay ist ein ELISA, und ein bevorzugter Marker ist die Meerrettichperoxidase. Ein anderer bevorzugter Marker ist ein farbiges Latexkügelchen.

BEISPIEL 7

Verfahren zur Bestimmung des reproduktiven Potentials eines Vogel Straußes.

Das Folgende ist ein Verfahren zur Bestimmung des reproduktiven Potentials eines Vogel Straußes durch die Quantifizierung der Menge an Inhibin in dem Blut des Vogel Straußes. Die zirkulierenden Konzentrationen von Inhibin im Blut eines Vogel Straußes können unter Verwendung von Standard-Sandwich-ELISA-Techniken bestimmt werden. Zunächst werden die Anti- Inhibin-Antikörper, die in Beispiel 4 hergestellt wurden, an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gebunden. Nach dem Waschen und Blockieren der Platte wird dann eine quantifizierte Menge an Blutplasma oder Serum in eine Vertiefung der Mikrotiterplatte zugegeben, die einem Vogel Strauß abgenommen wurde. Nachdem irgendwelchem Inhibin in der Probe, sollte es vorliegen, erlaubt wurde, selektiv mit den immobilisierten Anti-Inhibin-Antikörpern zu interagieren, wird die Probe aus der Vertiefung der Platte herausgewaschen. Als nächstes wird ein anderer Anti- Inhibin-Antikörper in die Vertiefung zugegeben als der, der in Beispiel 4 hergestellt wurde, welcher mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist. Der mit Meerrettichperoxidase konjugierte Anti-Inhibin-Antikörper unterscheidet sich von dem immobilisierten Anti-Inhibin-Antikörper darin, dass diese selektiv gegen unterschiedliche Teile des Inhibins gerichtet sind. Nachdem dem markierten Anti-Inhibin-Antikörper erlaubt wurde, selektiv mit irgendwelchem immobilisierten Inhibin zu interagieren, werden jegliche nicht interagierte markierte Anti-Inhibin-Antikörper durch Waschen entfernt. Die Menge an Inhibin, die in der Plasmaprobe vorliegt, wird durch Zugabe von NBT zu der Vertiefung und die Visualisierung der Menge an immobilisiertem markiertem Anti-Inhibin-Antikörper in der Vertiefung bestimmt. Positive und negative Standardkontrollen werden gleichzeitig in benachbarten Plattenvertiefungen durchgeführt. Positive und negative Standardkontrollen sollen gleichzeitig in Plattenvertiefungen durchgeführt werden. Es sind viele Immunoassay-Techniken, Marker und Visualisierungsmethoden in der Fachwelt gut bekannt. Dementsprechend kann irgendeine Immunoassay-Methode, irgendein Marker und Visualisierungstechnik für die vorliegende Erfindung verwendet werden.

BEISPIEL 8

Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens in einer Wachtel.

Wie oben gesagt wurde der Huhn-Inhibin-α-Untereinheit cDNA-Klon (cINA6), eingesetzt in die EcoR 1-Schnittstelle von Bluescript als ein Geschenk von P. A. Johnson (Cornell Universität) erhalten. Ein DNA-Fragment ("cINA&sub5;&sub1;&sub5;") wurde aus dem cINA6-Klon durch Anwenden des Pst I-Verdaus herausgeschnitten. Das cINA&sub5;&sub1;&sub5;-DNA-Fragment umfasste das meiste der reifen α-Untereinheit des Huhn-Inhibins. Dieses Fragment (cINA&sub5;&sub1;&sub5;) wurde in das Plasmid p-MALTM-c im Leseraster mit dem Maltosebindeprotein ("MBP") kloniert, und ein Fusionsprotein der entsprechenden Größe (Bahn E: Fig. 1) wurde nach IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)-Induktion und SDS- PAGE detektiert. Das resultierende Proteinkonjugat ("MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;") wurde als ein Antigen verwendet, um sich vor der Pubertät befindende, weibliche, japanische Wachteln (Coturnix coturnix japonica) gegen zirkulierende Inhibinmengen zu immunisieren, wie es unten beschrieben ist.
Brutwachteln wurden in einer Modell 2S-D Petersime Brutbatterie, die für Wachteln modifiziert war, ausgebrütet. Die initiale Brütetemperatur war ungefähr 37,8ºC, mit einem wöchentlichen Abfall von ungefähr 2,8ºC, bis Umgebungstemperatur erreicht war. Während der Wachstumsperiode (d. h. bis ungefähr zur 6. Lebenswoche) wurde eine Wachtel-Starterration (28% CP, 2800 kcal ME/kg an Futter) und Wasser bereitgestellt für eine ad libitum Konsumierung und es wurde ein kontinuierliches Dämmerlicht (22 Lux) mit einem 14-Stunden Licht (280-300 Lux) : 10 h Dunkelheit Übergang angewendet. Am 25. Lebenstag wurden 100 Wachteln beliebig und gleichmäßig auf eine von vier Injektionsgruppen (25 Vögel je Gruppe) wie folgt verteilt: (1) MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5; in einem polydispergierten β-(1,4)-verknüpften acetylierten Mannan ("Acemannan"), ein immunostimulierender Trägerstoff (Chinnah et al., Antigen dependent adjuvant activity of a polydispersed β-(1,4)-linked acectylated mannan (acemannan), Vaccine, Vol. 10, Ausgabe 8, 1992, S. 551-557) ("MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/ACE"), (2) MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5; in Freund'schem Adjuvans ("MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/FRN"), (3) Acemannan (immunostimulierende Kontrolle; "ACE"), oder (4) Freund s (Adjuvanskontrolle; "FRN"). Den Vögeln, die gegen Inhibin immunisiert wurden (Gruppen 1 und 2), wurden ungefähr 0,75 mg MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5; je Vogel in dem entsprechenden Kontrollträgerstoff gegeben. Gleiche Injektionsvolumina (0,2 ml) der Trägerstoff- ACE oder FRN wurden in den Gruppen 1 und 3, bzw. den Gruppen 2 und 4 verwendet. Alle Injektionen wurden subkutan unter Verwendung von Tuberkulinspritzen, die mit 25iger geeichten Nadeln bestückt waren, gegeben. Nach den initialen Injektionen wurden die Wachteln an den Flügeln markiert, um sie durch die Behandlung zu identifizieren, bevor sie (individuell) in Legekäfigen einquartiert wurden. Wöchentliche Booster-Inhibin- Immunisierungen von ungefähr 0,375 mg MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5; je Vogel, oder die Kontrollgaben wurden nachfolgend über 5 aufeinanderfolgende Wochen (d. h. am 32., 39., 46., 53. und 60. Lebenstag) verabreicht. Beginnend mit der 6. Lebenswoche wurde eine Wachtelbrutration (21% CP, 2750 kcal ME/kg an Futter) und Wasser für eine ad libitum Konsumierung bereitgestellt.
Beginnend am 41. Lebenstag (betrachtet als Tag 1 des Eierlegezyklus) wurden Messungen der täglichen Hennen-Eierproduktion ("HDEP") und der Mortalität ("MORT") über 12 aufeinanderfolgende Wochen aufgezeichnet. Außerdem wurden das mittlere Alter beim ersten Eierlegen ("FIRST") und das Alter, mit dem die Hennen 50% Eierproduktion erreichten ("FIFTY"), für jede der vier Behandlungsgruppen berechnet.
Die täglichen Hennen-Eierproduktionsdaten wurden zwei unterschiedlichen Analysen hinsichtlich der Varianz ("ANOVAs") unterworfen, von denen jede ein vollständig beliebiges Design mit einem "Split-Plot-Arrangement" der Behandlungen einbezog. In dem ersten ANOVA bestand der Hauptplan in den vier Injektionsbehandlungen (MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/ACE, MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/FRN, ACE oder FRN) und die zwölf Legeperioden von jeweils 7 Tagen umfassten das Aufteilen. In dem zweiten ANOVA wurden die Daten aus den zwei Inhibinbehandlungen gepoolt und die Daten aus den zwei Kontrollbehandlungen wurden ebenfalls gepoolt, um den Effekt der Inhibin-Immunoneutralisation auf die Antwort auf die Kontrolle stärker zu testen. Daher bestand der Hauptplan in zwei Injektionsbehandlungen (gepoolte MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/ACE und MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/FRN - Daten gegen die gepoolten ACE und FRN - Daten), wobei die 12 Legeperioden von jeweils 7 Tagen die Aufteilung enthielten.
Bisher ist die Information vorläufig, da nur 35 Tage Daten gesammelt worden sind. Die kumulativen Prozent-HDEP-Raten für die wöchentlichen Intervalle des Eierlegens (Tage 0, 7, 14, 21 und 35) während der ersten 35 Tage der Studie sind in Fig. 2 aufgezeichnet (worin die vier Injektionsgruppen als separate Behandlungen betrachtet wurden) und Fig. 3 (worin nur Vergleiche zwischen nichtimmunisierter Gruppe (Kontrolle) gegen Inhibin-immunisierte Gruppe gemacht wurden). Die mittleren HDEP- Raten während der Woche 1, Woche 2, Woche 3, Woche 4, Woche 5 und der Wochen 1 bis 5, kombiniert für die vier Injektionsgruppen, betrachtet als unabhängige Behandlungen, sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 3 gibt die mittleren HDEP-Raten während der gesamten Zeitrahmen wieder, wenn die Daten für die Vergleiche der direkten Kontrolle gegen die immunisierte Behandlung gepoolt wurden. Tabelle 4 enthält die FIRST- Eierlegedaten für beide der betrachteten statischen Szenarien (d. h. die vier Injektionsbehandlungsgruppen und die gepoolten Datenvergleiche). Tabelle 2 Effekt einer Inhibin-Immunoneutralisation unter Verwendung eines Maltosebindeprotein-Huhn-Inhibin-α-Untereinheit- Fusionsproduktes (MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;) auf die mittlere (±SE) tägliche Eierproduktion von Hennen (%) in japanischen Wachteln
a, b die Bedeutungen innerhalb einer Spalte mit unterschiedlichen hochgestellten Markierungen sind unterschiedlich
(P < 0,05)
±SE = Standardabweichung Tabelle 3 Effekt einer Inhibin-Immunoneutralisation unter Verwendung eines Maltosebindeprotein-Nuhn-Inhibin-α-Untereinheit- Fusionsproduktes (MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;) auf die mittlere (±SE) tägliche Eierproduktion von Hennen (%) in japanischen Wachteln: gepoolte Daten
*a, b (P < , 0095); j, k (p < , 0888); x, y(P < , 0763)
±SE = Standardabweichung

Tabelle 4

Effekt einer Inhibin-Immunoneutralisation unter Verwendung eines Maltosebindeprotein-Huhn-Inhibin-α-Untereinheit-Fusionsproduktes (MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;) auf das mittlere (±SE) Alter beim ersten Eierlegen (FIRST) in japanischen Wachteln

Behandlung* FIRST (Lebenstage)
Acemannnan (ACE) 54,92 ± 1,77a,b
Freund's (FRN) 55,73 ± 1,58a
MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/ACE 53,38 ± 1,81a,b
MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/FRN 50,38 ± 1,08b
Kontrolle 55,33 ± 1,17x
immunisiert 51,98 ± 1,07y
* Kontrolle = gepoolte Acemannan (ACE) und Freund's (FRN) Daten;
immunisiert = gepoolte MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/ACE und MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;/FRN Daten
a,b (p < , 05); x,y(p < , 0373),
SE = Standardabweichung
Bisher war die Mortalität kein Faktor, da nur vier Vögel gestorben sind (drei Kontrollen, ein behandelter). Solch eine Mortalität (4%) ist durchaus innerhalb der erwarteten Grenzen für Wachteln, die 76 Lebenstage erreicht haben. Außerdem waren die Ereignisse von schalenlosen, dünnschaligen und missgebildeten Eiern niedrig, durchaus innerhalb der normalen Frequenz des Auftretens und gleichmäßig unter den vier Injektionsbehandlungsgruppen verteilt (d. h., die Inhibin-Immunisierung hat die Anzahl von defekten gelegten Eiern nicht verändert).
Ein initialer positiver Effekt der Inhibin-Immunoneutralisation auf die Produktionsperformance war deutlich. Dieser Effekt war insbesondere in den gepoolten HDEP (Tabelle 3) und den FIRST (Tabelle 4) Datensätzen deutlich, worin die erhöhte Zahl von Beobachtungen, die Hilfsmittel umfassten, die Aussagekraft der angewendeten statistischen Tests verstärkte.
Die Daten zeigten, dass der Beginn der Pubertät in den Inhibin- Behandlungsgruppen beschleunigt war. Dies wurde in beiden gesammelten Datensätzen, HDEP und FIRST, bewiesen. Es gab einen hohen Grad an statistischer Übereinstimmung (P < 0.0095), verbunden mit der höheren mittleren HDEP-Rate, die in den Inhibin behandelten Wachteln während der Woche 1 der Studie gefunden wurde, und eine Differenz, die weniger evident war (P < 0,0888) während der Woche 2 (Tabelle 3). Dieser marginale Unterschied in der Behandlungsgruppe, der während der Woche 2 beobachtet wurde, mag repräsentieren, dass das Eierlegen, obwohl verzögert, begonnen hatte sich in den mit den Kontrollen injizierten Wachteln zu intensivieren (s. Fig. 2). Konsequenterweise würde die Stärke des statistischen Unterschiedes, der zwischen den zwei Behandlungsgruppen (Inhibin gegen Nicht- Inhibin) während der Woche 1 gefunden wurde, voraussichtlich mit zunehmender Legezeit abgeschwächt werden. Tatsächlich wurde eine signifikant höhere mittlere HDEP-Rate von mittlerer statistischer Relevanz (P < 0,0763) in mit Inhibin behandelten Nennen gefunden, wenn die Daten aus den Wochen 1 bis 5 kombiniert wurden.
Außerdem war das mittlere Alter, mit dem eine immunisierte Wachtel (51,98 Lebenstage) ihr erstes Ei legte (FIRST) um 3+ Tage vorgezogen (P < 0,0373) im Vergleich zu nichtimmunisierten Wachteln (55,33 Lebenstage) (Tabelle 4). Dieser Effekt der Inhibin-Immunisierung auf die Beschleunigung des Eierlegens war insbesondere wahrnehmbar in mit MBP- cINA&sub5;&sub1;&sub5;/FRN behandelten Wachteln, die einen durchschnittlichen mittleren FIRST von 50,38 Lebenstagen hatten (Tabelle 4).

BEISPIEL 9

Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens in Vogel Straußen.

Das Proteinkonjugat (MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;) wird als ein Antigen verwendet, um vor der Pubertät befindliche, weibliche Vogel Strauße gegen zirkulierende Inhibinmengen zu immunisieren, und um damit den Beginn des Eierlegens in den behandelten Vogel Straußen zu beschleunigen. Dem Verfahren, das in Beispiel 8 beschrieben ist, wird gefolgt, mit den folgenden Ausnahmen. Das durchschnittliche Alter der Pubertät für unbehandelte Vogel Strauße ist zwischen ungefähr 28 und 32 Monaten. Das Folgende ist der Behandlungsplan für Vogel Strauße mit einem ungefähren Körpergewicht im Bereich von 150 bis 300 Pfund: eine primäre (erste) Injektion von 5,0 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung in ihrem 26. Lebensmonat und Booster-Injektionen von 2,5 mg in ihrem 27., 28., 30., 32., 34. und 36. Lebensmonat.

BEISPIEL 10

Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens in einem Emu.

Das Proteinkonjugat (MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;) wird als ein Anti gen verwendet, um einen vor der Pubertät befindlichen, weibliche Emu gegen zirkulierende Inhibinmengen zu immunisieren, und um damit den Beginn des Eierlegens in dem behandelten Emu zu beschleunigen. Dem Verfahren, das in Beispiel 8 beschrieben ist, wird gefolgt, mit den folgenden Ausnahmen. Das durchschnittliche Alter bis zur Pubertät ist für einen unbehandelten Emu ungefähr 20 Monate. Das Folgende ist der Behandlungsplan für einen Emu mit einem ungefähren Körpergewicht im Bereich von 50 bis 90 Pfund: eine primäre (erste) Injektion von 3,0 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung in seinem 18. Lebensmonat und Booster-Injektionen von 1,5 mg in seinem 19., 20., 22., 24., 26. und 30. Lebensmonat.

BEISPIEL 11

Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens in Hühnern.

Das Proteinkonjugat (MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;) wird als ein Anti gen verwendet, um vor der Pubertät befindliche, weibliche Hühner gegen zirkulierende Inhibinmengen zu immunisieren, und um damit den Beginn des Eierlegens in den behandelten Hühnern zu beschleunigen. Dem Verfahren, das in Beispiel 8 beschrieben ist, wird gefolgt, mit den folgenden Ausnahmen. Das durchschnittliche Alter bis zur Pubertät für ein unbehandeltes Huhn ist ungefähr 20 Wochen. Das Folgende ist der Behandlungsplan für ein Huhn mit einem ungefähren Körpergewicht im Bereich von 2,0 bis 3,5 Pfund: eine primäre (erste) Injektion von 1,5 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung in seiner 15. Lebenswoche und Booster-Injektionen von 0,75 mg in seiner 17., 20., 24., 30., 40. und 50. Lebenswoche.

BEISPIEL 12

Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens in Truthähnen.

Das Proteinkonjugat (MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;) wird als ein Anti gen verwendet, um vor der Pubertät befindliche, weibliche Truthähne gegen zirkulierende Inhibinmengen zu immunisieren, und um damit den Beginn des Eierlegens in den behandelten Truthähnen zu beschleunigen. Dem Verfahren, das in Beispiel 8 beschrieben ist, wird gefolgt, mit den folgenden Ausnahmen. Das durchschnittliche Alter bis zur Pubertät für einen unbehandelten Truthahn ist ungefähr 30 Wochen. Das Folgende ist der Behandlungsplan für einen Truthahn mit einem ungefähren Körpergewicht im Bereich von 9,0 bis 12 Pfund: eine primäre (erste) Injektion von 2,0 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung in seiner 28. Lebenswoche und Booster-Injektionen von 1,0 mg in seiner 29., 30., 34., 38., 46. und 54. Lebenswoche.

BEISPIEL 13

Verfahren zur Beschleunigung des Beginns des Eierlegens in Papageien.

Das Proteinkonjugat (MBP-cINA&sub5;&sub1;&sub5;) wird als ein Anti gen verwendet, um vor der Pubertät befindliche, weibliche Papageien gegen zirkulierende Inhibinmengen zu immunisieren, und um damit den Beginn des Eierlegens in den behandelten Papageien zu beschleunigen. Dem Verfahren, das in Beispiel 8 beschrieben ist, wird gefolgt, mit den folgenden Ausnahmen. Das durchschnittliche Alter bis zur Pubertät für einen unbehandelten Papagei ist ungefähr 30 Monate. Das Folgende ist der Behandlungsplan für einen Papagei mit einem ungefähren Körpergewicht im Bereich von 0,5 bis 1,25 Pfund: eine primäre (erste) Injektion von 0,75 mg des heterologen Proteins der vorliegenden Erfindung in seinem 28. Lebensmonat und Booster- Injektionen mit 0,375 mg in sei nem 29., 30., 32., 34., 36. und 38. Lebensmonat.
Es soll natürlich so verstanden werden, dass sich das zuvor Beschriebene nur auf bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bezieht, und dass viele Modifikationen oder Änderungen darin gemacht werden können, ohne aus dem Umfang der Erfindung, wie sie in den anhängenden Ansprüchen festgesetzt ist, herauszuführen.

Sequenzprotokoll

(1) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 515 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear SEQUENZBESCHREIBUNG:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 99 Reste
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear SEQUENZBESCHREIBUNG:
(3) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3:
SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 516 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
(D) TOPOEOGIE: linear SEQUENZBESCHREIBUNG:
(4) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 4:
SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 77
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear SEQUENZBESCHREIBUNG:

Claims

1. Ein Verfahren, das die Eiproduktion eines Vogels erhöht, umfassend ein Verabreichen einer effektiven Menge eines Proteins an den Vogel, wobei das Protein die α-Untereinheit eines Vogel- Inhibinproteins, oder ein Fragment davon und ein Trägerprotein umfasst.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vogel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ratitae, Psittaciformes, Falconiformes, Piciformes, Strigiformes, Passeriformes, Coraciiformes, Ralliformes, Cuculiformes, Columbiformes, Galliformes, Anseriformes und Herodiones.

3. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Ratita ein Vogel Strauß, Emu, Nandu, Kiwi oder Kasuar ist.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vogel ein Huhn, Truthahn, Papagei, Sittich, Ara, Falke, Adler, Wachtel, Habicht, Taube, Kakadu, Singvogel, Eichelhäher, Amsel, Fink, Grasmücke, Gans, Ente oder Sperling ist.

5. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Vogel ein Huhn oder Truthahn ist.

6. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Trägerprotein Maltosebindeprotein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Flagellin, Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke, Serumalbumin, Gammaglobulin oder Polymere aus Aminosäuren ist.

7. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das α- Untereinheit-Vogel-Inhibinprotein, oder ein Fragment davon die Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargelegt ist.

8. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Erhöhung der Eiproduktion die Beschleunigung des Beginns des Eierlegens, die Erhöhung des Gesamteierlegens während der Lebenszeit, die Erhöhung der Rate der Eierproduktion oder die Beschleunigung des Beginns der Pubertät einschließt.

9. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Verabreichen einer effektiven Menge des Proteins eine initiale Immunisierung, gefolgt von einer oder mehreren Verstärkungsinjektionen umfasst.

10. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verabreichen des Proteins vor, während und/oder nach der Pubertät erfolgt.

11. Ein Fusionsprotein, enthaltend ein α-Untereinheit-Vogel-Inhibinprotein oder ein Fragment davon, fusioniert an ein Trägerprotein.

12. Das Fusionsprotein gemäß Anspruch 11, wobei das α-Untereinheit- Uogel-Inhibinprotein oder das Fragment davon die Aminosäuresequenz enthält, die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargelegt ist.

13. Das Fusionsprotein der Ansprüche 11 oder 12, wobei das Trägerprotein Maltosebindeprotein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Flagellin, Hämocyanin aus der Schlüsselloch-Napfschnecke, Serumalbumin, Gammaglobulin oder Polymere aus Aminosäuren ist.

14. Ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, enthaltend die Schritte:

a) Bereitstellen doppelsträngiger cDNA, die für ein α- Untereinheit-Vogel-Inhibinprotein oder ein Fragment davon kodiert.

b) Bereitstellen eines Vektors, der kodierende Informationen für die Herstellung eines Trägerproteins enthält,

c) Ligieren der α-Untereinheit-Vogel-Inhibin-cDNA in den Vektor,

d) Einbringen des ligierten Vektors in Expressionssystem, und

e) Expremieren eines Fusionsproteins, enthaltend ein α-Untereinheit-Vogel-Inhibinprotein oder ein Fragment davon und ein Trägerprotein.

15. Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei die α-Untereinheit-Vogel- Inhibin-cDNA die Sequenzen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 enthält.

16. Ein Fusionsgenprodukt, das ein Gen für die Expression von α- Untereinheit-Vogel-Inhibinprotein oder ein Fragment davon kodiert, fusioniert an ein Gen, das die Expression eines Trägerproteins kodiert.

17. Das Fusionsgenprodukt nach Anspruch 16, wobei das Gen, das für Expression des α-Untereinheit-Vogel-Inhibinproteins oder dem Fragment davon kodiert für die Produktion eines Inhibinproteins oder eines Fragments davon kodiert, das die Aminosäuresequenz enthält, die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 dargelegt ist.

18. Das Fusionsgenprodukt gemäß Anspruch 16, enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3.

19. Das Fusionsgenprodukt gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei das Gen, das für die Expression des Trägerproteins kodiert, für die Produktion eines Proteins kodiert, das ausgewählt ist aus Maltosebindeprotein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Flagellin, Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke, Serumalbumin, Gammaglobulin oder Polymeren aus Aminosäuren.

20. Ein Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz entsprechend dem Fusionsgen aus einem der Ansprüche 16 bis 19.

21. Eine Zelle, enthaltend den Vektor aus Anspruch 20.