DE69121423T2

DE69121423T2 - Rekombinante vakzine gegen coccidiose

Info

Publication number: DE69121423T2
Application number: DE69121423T
Authority: DE
Inventors: Glenda Hamby; David Harwood
Original assignee: British Technology Group USA Inc
Current assignee: BTG International Inc
Priority date: 1991-03-14
Filing date: 1991-03-26
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 2011-03-27
Also published as: WO1992016627A1; JPH07500483A; ES2090324T3; EP0575317B1; US5387414A; DE69121423D1; AU654481B2; ATE141328T1; AU7586691A; DK0575317T3; US5635181A; EP0575317A1; CA2106093A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Vakzinen gegen Kokzidiose, die rekombinante Peptid-Immunogene enthalten.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Kokzidiose ist eine weitverbreitete Krankheit mit akuten ökonomischen Sorgen für die Geflügelindustrie. Die invasive intestinale Infektion wird durch eine oder mehrere der verschiedenen Spezies von Eimeria verursacht, die in den Verdauungstrakt von Vögeln eindringen, und verringerte Gewichtszunahme, intestinale und zökale Läsionen, Depigmentierung und schlechte Futterumsetzung verursachen. Die wirtschaftlichen Verluste der Geflügelindustrie durch diese Krankheit sind auf eine Höhe von 300 Millionen Dollar jährlich geschätzt worden (Danforth, H.D., and P.C. Augustine, 1985, "Use of hybridoma antibodies and recombinant DNA technology in protozoan vaccine development", Avian Diseases, 30:37-42). Gegenwärtige kokzidiostatische und kokzidiozide Medikationen zur Bekämpfung dieser Krankheit fügen weitere 100 Millionen Dollar zu den jährlichen Produktions kosten für die Geflügelindustrie hinzu. Aufgrund von Beweisen für die zunehmende Resistenz gegen zur Zeit vertriebene kokziozide Arzneimittel werden immunologische Verfahren zum Erzeugen einer Vakzine gegen die Parasiten durch verschiedene Gruppen erforscht.
Es ist gezeigt worden, daß bestimmte Bereiche auf der Zelloberfläche des Kokzidiose-Parasiten diskrete immunogene Eigenschaften besitzen (Danforth et al., 1985a, Avian Diseases, Bd.30, S.37-42). Weil Techniken unter Verwendung von Untereinheiten sich als erfolgreiche Verfahren zum Induzieren einer partiellen oder vollständigen Immunität gegen eine Vielzahl von Antigenen herausgestellt haben, ist die molekulare Manipulation von immunogenen Eimeria-Bereichen, um eine Immunantwort in dem Wirt zu induzieren, als ein Ansatz gegen Kokzidiose getestet worden.
Aufgrund der logistischen Schwierigkeiten, die der Isolierung von nativen Eimeria-Zelloberflächenproteinen in ausreichenden Mengen innewohnen, um die Charakterisierung und das Testen auf die Wirksamkeit als Vakzine zu erlauben, haben die Forscher die biotechnische Isolierung des Gens/der Gene, die für diese antigenischen Proteine kodieren, angewendet, um große Mengen von rekombinantem antigenischem Protein in bakteriellen oder Hefe-Wirtszellen zu erzeugen. Rekombinante Vakzinen gegen Kokzidiose werden gegenwärtig von einer Vielzahl von Gruppen untersucht. In sog. "Anforderungsstudien" haben die meisten dieser Vakzinen die Fähigkeit gezeigt, intestinale Läsionen oder die Oozystenexkretion zu verringern. Während ähnliche rekombinante Techniken und Verfahren von diesen Forschern benutzt wurden, um jedes dieser Proteine zu synthetisieren, kann jede Vakzine mit statistischer Sicherheit basierend auf den Aminosäuresequenzen der verschiedenen rekombinanten Immunogene unterschieden werden.
Danforth et al., (1985a, Avian Diseases, Bd.30, S.37-42), offenbart ein rekombinantes kokzidielles Protein, das einen Teilschutz gegen eine Infektion mit Kokzidien durch eine bestimmte Eimeria-Spezies bereitstellt. Dieser Artikel lehrt nicht, daß das Protein einen Kreuz-Schutz gegen andere Kokzidien-Spezies bereitstellt.
Kim et al., 1989, Infection and Immunity, Bd. 57, S. 2434-40, berichtet über ein kloniertes p250-Oberflächen-Antigen von Eimmeria acervulina- Merozoiten. Nach Inokkulation mit transformiertem E. coli, das das klonierte Antigen trägt, wurde ein partieller Schutz erzielt. Das Plasmid, das das klonierte Antigen-Gen trägt, überlebte in der Intestinalflora, sogar nachdem die E. coli, die ursprünglich das Plasmid enthielten, nicht länger anwesend waren.
Danforth et al., (1985b), Poultry Science 64 Suppl. 1:85, zeigt, daß es möglich ist, unter Verwendung der Biotechnologie, ein rekombinantes Antigen gegen Kokzidiose zu erzeugen, das eine Antikörperantwort in Broilern hervorruft. Danforth et al., (1985b) liefert jedoch keine detaillierte Information, die es anderen erlauben würde, das gleiche Antigen zu erzeugen. Weiterhin kommt das Binden eines Antigens durch Antikörper in vitro nicht der Resistenz gegen diese Krankheit in vivo gleich. Die Rolle bei der Verteidigung des Wirts von Antikörpern, die sich in Antwort auf komplexe subzelluläre Bestandteile bilden, wie parasitische Oberflächenmembran-Proteine oder -Polysaccharide, ist unvollständig definiert. So ist die bloße Tatsache, daß ein kloniertes Antigen mit einem polyklonalen Antiserum in einem üblichen Western Blot reagiert, wie durch Danforth et al. (1985b) gezeigt wurde, nicht ausreichend dafür, daß man folgert, daß eine Resistenz gegen die Krankheit resultiert.
Wallach et al., (1990) erzielten in einer Studie zum Beurteilen der Bedeutung von Sexualstadium-Antigenen bei der schützenden Immunität "partiellen Schutz" gegen Kokzidiose von Affinitäts-gereinigten Gametozyten- Extrakten, die von E. maxima erhalten wurden. Die Parasitenoberflächen Antigene variieren jedoch bei Eimeria von einem fortpflanzungsfähigen Stadium zum anderen, und die Wahrscheinlichkeit, daß native Sexualstadium- Antigene (d.h., Gametozyt) und rekombinante Asexualstadium-Antigene (d.h Sporozoid) sich ähneln, ist statistisch gesehen unwahrscheinlich.
Miller, 1989, Infection and Immunity, Bd. 57, S. 2014-20, offenbart ein kloniertes Protein von Eimeria tenella, das identifiziert wurde unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen E. acervulina-Sporozoiten hervorgerufen wurde. Lebende rekombinante E. coli, die das Gen für das klonierte Protein enthalten, stellen einen Grad an partiellem Schutz bereit.
Clarke et al., 1989, Molecular and Biochemical Parasitology, Bd. 22 S. 79-87, berichten über die Identifizierung einer beträchtlichen Zahl von DNA-Sequenzen (24), die für Antigene von E. tenella kodieren, durch direktes Screening von genomischen Genbanken mit einem Immunserum. Es wurden keine schützenden Wirkungen für irgendeines dieser Antigene berichtet.
Die australische Patentanmeldung von Merck & Co., AU-A28542/89, offenbart rekombinante Protein-Immunogene von E. tenella. Die Sequenz mindestens eines derartigen Immunogens ist offenbart.
Die australische Patentanmeldung AU-A-65869/86 von Solvay und Cie (entspricht EP 0 231 537) offenbart ein kloniertes Antigen, das Immunität gegen Eimeria tenella, Eimeria necatrix und Eimeria maxima vermittelt. Das Antigen umfaßt zwei Polypeptide, die durch eine Disulfidbindung verbunden sind, und Molekulargewichte von ungefähr 17.000 bzw. 8.000 besitzen.
Die internationale Patentanmeldung Nr. WO 90/00403 von Genex Corporation offenbart ein kloniertes Gen, das ein antigenisches Protein kodiert, das in Kokzidien von Vögeln gefünden wurde. Sieben verschiedene Sequenzen werden offenbart, die mit Antikörpern gegen Kokzidien immunreaktiv sind.
Die europäische Offenlegungsschrift Nr. 0 349 071 von Akzo N.V. offenbart ein Polypeptid von Eimeria, das verwendet werden kann, um Geflügel zu immunisieren. Molekulare Klone wurden von sowohl E. acervulina als auch E. Tenella isoliert.
Die europäische Offenlegungsschrift Nr. 0 344 808 von F. Hoffman-La Roche AG offenbart klonierte Antigene zum Schutz gegen Kokzidiose. Es werden Sequenzen dieser Antigene offenbart.
Die europäische Offenlegungsschrift Nr. 0 324 648 von Merck & Co. offenbart klonierte Gene, die für Gruppe A-, C-, F- und H-Immunogene von Eimeria tenella kodieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, eine Vakzine gegen Kokzidiose bereitzustellen, die ein Peptid-Immunogen enthält, das neue Epitope umfaßt.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein einfaches und wirksames Verfahren zum Erzeugen des Immunogens bereitzustellen.
Es ist eine zusätzliche Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Vorbeugung von Kokzidiose in Hühnern bereitzustellen.
Diese Erfindung stellt eine Vakzine-Zusammensetzung bereit, die ein immunogenes Peptid umfaßt, das durch Expression einer rekombinanten DNA-Sequenz erzeugt wurde, die der DNA-Sequenz entspricht, die in die einzige EcoRI-Schnittstelle des Lambda gt11-Bakteriophagen insertiert wurde, der unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68450 hinterlegt wurde, oder alternativ dazu, der DNA-Sequenz, die in die einzige pBR322-EcoRI-Schnittstelle in dem rekombinanten bakteriellen Plasmid insertiert wurde, das unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68537 hinterlegt wurde, oder eines Peptids, das Epitope enthält, die durch diese Sequenzen kodiert werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren bereit zur Herstellung eines Peptid-Immunogens mit den gewünschten Epitopen, wobei das Verfahren die Schritte des Transformierens einer Wirtszelle mit einem DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein Peptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz dem Peptid entspricht, das durch die DNA-Sequenz kodiert wird, die in die einzige Lambda gt11-EcoRI-Schnittstelle in dem rekombinanten Bakteriophagen insertiert wurde, der unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68450 hinterlegt wurde, oder alternativ dazu, der DNA-Sequenz, die in die einzige pBR322- EcoRI-Schnittstelle in dem rekombinanten bakteriellen Plasmid insertiert wurde, das unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68537 hinterlegt wurde, und das Züchten der transformierten Zelle so, daß die DNA-Sequenz exprimiert wird, umfaßt.
Die Erfindung stellt weiterhin eine Intron-freie DNA-Sequenz bereit, die für ein neues Peptid kodiert, das auf spezifische Weise immunreaktiv mit Antikörpern ist, die durch Hühner erzeugt werden, die mit Spezies von Eimeria infiziert sind und das die in SEQ ID NO:1 offenbarte Amminosäuresequenz enthält.
Diese Erfindung stellt zusätzlich Verfahren zum Impfen von Hühnern gegen Kokzidiose bereit, die das Verabreichen der Vakzine der Erfindung an die Hühner umfaßt.
Eine cDNA-Sequenz ist von Eimeria maxima-Boten-RNA isoliert und kloniert worden, die für ein immunogenes Protein kodiert, das ein oder mehrere antigenische Determinanten enthält, die eine kokzidiozide und/oder kokzidiostatische Wirkung erzeugen, wenn sie zur Impfung bei dem Vogel verwendet werden. Im Vergleich zu bestehenden Vakzinen besitzt diese Vakzine eine verbesserte Wirksamkeit sowie eine Kreuzreaktivität gegen mehr als eine Spezies von Eimeria.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Ausübung der vorliegenden Erfindung, sofern nicht anders angezeigt, setzt konventionelle Molekularbiologie, Mikrobiologie, und rekombinante DNA-Techniken innerhalb des fachmännischen Könnens ein. Derartige Techniken sind vollständig in der Literatur erklärt. Siehe z.B., Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "DNA Cloning: A Practical Approach", Bd. I und II (D.N. Glover, Hrsg. 1985); "Oligonucleotide Synthesis", (M.J. Gait, Hrsg., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg., 1985); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg., 1984); "Animal Cell Culture", (R.I. Freshney, Hrsg., 1986); "Immobilized Cells and Enzymes", (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984).

Definitionen

Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird die folgende Terminologie in Übereinstimmung mit den unten aufgeführten Definitionen verwendet.
"Rekombinante DNA" ist ein DNA-Molekül, das DNA-Sequenzen einschließt, die von zwei oder mehreren Spezies erhalten wurden.
Eine DNA-Sequenz "entspricht" einer anderen DNA-Sequenz, wenn die beiden Sequenzen die gleiche Aminosäuresequenz kodieren.
Eine Aminosäuresequenz "entspricht" einer anderen Aminosäuresequenz, wenn mindestens 75 % der Aminosäurepositionen in der ersten Sequenz durch die gleichen Aminosäurereste in der zweiten Sequenz besetzt sind. Vorzugsweise sind 90% der Aminosäurepositionen identisch, und auf besonders bevorzugte Weise sind 95 % der Aminosäurepositionen identisch. Alternativ dazu werden zwei Aminosäuresequenzen als einander entsprechend angesehen, wenn die Unterschiede zwischen den beiden Sequenzen nur konservative Austausche/Substitutionen betreffen.
"Konservative Aminosäureaustausche" sind Austausche von einem Aminosäurerest in einer Sequenz durch einen anderen Rest mit ähnlichen Eigenschaften, derart, daß die Sekundär- und Tertiärstruktur des resultierenden Peptides im wesentlichen die gleiche ist. Aminosäurepaare, die auf konservative Weise gegeneinander ausgetauscht werden können, sind dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt.
Peptide sind "auf spezifische Weise immunreaktiv" mit einem bestimmten Antikörper, wenn sie an die Antigen-Bindungsstelle des bestimmten Antikörpers binden.
"Immunogene Peptide", wenn in Tiere injiziert, veranlassen diese Tiere, die Fähigkeit zu entwickeln, Antikörper zu erzeugen, die auf spezifische Weise immunreaktiv mit diesen Peptiden sind.
"Kreuzreaktive Peptide" sind Peptide, die für die gleiche antigenische Bindungsstelle kompetitieren. Wenn das Binden eines Peptids an einen Antikörper das Binden durch ein zweites Peptid verhindert, dann sind die beiden Peptide kreuzreaktiv.
Ein "im wesentlichen reines Peptid" in Übereinstimmung mit der Erfindung ist eines, das nahezu frei von anderen Peptiden von Kokzidien ist.
Am einfachsten kann dies durch Expression des Kokzidien-Proteins der vorliegenden Erfindung in einer rekombinanten Wirtszelle erreicht werden. Alternativ dazu können die Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um das Kokzidien-Protein der vorliegenden Erfindung mittels Immunaffinität zu reinigen.

Die DNA-Sequenz

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vakzine gegen Kokzidiose, die ein immunogenes rekombinantes Peptid mit bisher unbekannten Epitopen enthält, die mit Epitopen auf vielen Eimeria-Spezies kreuzreaktiv sind. Die Erfindung stellt transformierte Zellen bereit, die eine DNA-Sequenz enthalten, die das rekombinante Peptid kodiert.
Eine cDNA-Sequenz, die das immunogene Peptid der Vakzine kodiert wurde zuerst erhalten durch Isolieren von Boten-RNA aus dem Sporozoid- Stadium von Eimeria-Kokzidien. Die Boten-RNA wurde als Matrize für die Reverse Transkriptase verwendet, um cDNA zu erzeugen. Die cDNA wurde mit einer Restriktionsendonuklease verdaut, EcoRI, und in einem Plasmidvektor, pBR322, Schrotschuß-kloniert (shotgun cloned). Kompetente bakterielle Zellen, E. coli HB101, wurden dann mit diesem Klonierungsvektor transformiert. Alternativ dazu wurde EcoRI-verdaute cDNA in die EcoRI-Schnittstelle des Lambda gt11-Bakteriophagen ligiert, und es wurden E. coli Y1088 oder Y1090 mit diesem Vektor transformiert. Kolonien von Transformanten wurden auf selektiven Medien platiert und solche, die die gewünschte cDNA-Sequenz enthielten, wurden mit polyklonalen Antiseren von Vögeln identifiziert, die einer Eimeria-Oozysten-Infektion ausgesetzt waren. Die positiven Klone wurden amplifiziert und auf die Gegenwart des rekombinanten Proteins durch Western Blot-Analyse hin überprüft. Ein positiver Klon, isoliert aus einer pBR322-Genbank, enthielt eine cDNA, die ein rekombinantes Peptid kodiert, das bisher unbekannte Epitope aufweist; es wurde rPV1-89 genannt und bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68537 hinterlegt. Ein anderer derartiger Klon, isoliert aus einer Lambda gt11-Genbank, wurde rBP1-2 genannt und ist unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68450 hinterlegt worden. Die DNA-Sequenzen, die die immunogenen Peptide dieser Erfindung kodieren, können von EcoRI-Restriktionsverdaus der hinterlegten Klone isoliert werden.
Klone, die die DNA-Sequenzen dieser Erfindung enthalten, können unter Verwendung wohlbekannter Verfahren durch einen Durchschnittsfachmann erhalten werden. Zum Beispiel kann eine Genbank von Eimeria-DNA- Sequenzen hergestellt werden in einem beliebigen zweckmäßigen Vektor (siehe z.B. Sambrook et al.), und dann können Klone selektiert werden, die mit der cDNA-Sequenz, die von rBP1-2 oder rPV1-89 isoliert wurden, hybridisieren. Alternativ dazu kann eine Familie von DNA-Sonden, die degenerierte Sequenzen darstellen, die die SEQ ID NO:1 kodieren, hergestellt werden, und Klone können von dieser Genbank selektiert werden auf der Grundlage einer Hybridisierung mit diesen Sonden. Bevorzugterweise sollte die DNA von diesen selektierten Klonen in einen Expressionsvektor subkloniert werden, und das Protein, das durch Zellen exprimiert wird, die mit diesem Vektor transformiert wurden, sollte auf seine Immunreaktivität mit Antikörpern gegen das rekombinante Protein dieser Erfindung getestet werden, das wie unten beschrieben hergestellt wurde, oder auf die Immunreaktivität mit Seren von Vögeln, die einer Eimeria-Infektion wie oben beschrieben ausgesetzt waren. Ein derartiges Subklonieren ist leicht innerhalb des fachmännischen Könnens des Durchschnittsfachmanns angesichts der vorliegenden Offenbarung. Klone, die immunreaktive rekombinante Peptide exprimieren, können verwendet werden, um Vakzine herzustellen, wie es oben gelehrt wird. Die Aminosäure-kodierende Region der DNA-Sequenz dieser Erfindung kann länger oder kürzer sein als die kodierende Region der hinterlegten Vektoren, solange das rekombinante Peptid das durch die DNA- Sequenz exprimiert wird, mindestens ein Epitop zurückbehält, das mit Antikörpern kreuzreaktiv ist, die auf spezifische Weise immunreaktiv mit dem Eimeria-Peptid sind, das durch die hinterlegten Stämme erzeugt wurde. Die Präparation der selektierten Klone, die DNA-Sequenzen enthalten, die der gesamten oder einem Teil der Sequenz von rBP1-2 oder rPV1-89 entsprechen, können durch einen Durchschnittsfachmann unter Verwendung konventioneller molekularbiologischer Techniken zusammen mit der Information, die in dieser Patentschrift bereitgestellt wird und, wahlweise, der transformierten Zellen, die unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68450 und der ATCC-Hinterlegungsnr. 68537 hinterlegt sind, erreicht werden

Das rekombinante Protein

Das rekombinante Eimeria-Protein, das durch RPB1-2 oder rPV1-89 kodiert wird, wurde aus bakteriellen Zellen von Kolonien der positiven Transformanten isoliert und durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt. Das rekombinante Eimeria-Protein hat ein ungefähres Molekulargewicht von 45-65 Kilodalton, wie durch Polyacrylamidgelelektrophorese in Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) bestimmt wurde. Das rekombinante Protein dieser Erfindung besitzt eine Aminoterminale Aminosäuresequenz, die der Sequenz, die als SEQ ID NO:1 aufgeführt ist, entspricht. Diese Amino-terminale Sequenz unterscheidet sich von allen anderen bekannten Eimeria-Proteinen, was andeutet, daß die DNA- Sequenz, die in den hinterlegten Klonen insertiert ist, ein im Stand der Technik unbekanntes Peptid kodiert.
Das gereinigte rekombinante Protein wurde Vögeln verabreicht, die frei von dem spezifischen Pathogen waren, und die Vögel wurden später mit verschiedenen Spezies von Eimeria herausgefordert (challenged). Diese Impfüng mit dem rekombinanten Protein schützte die Vögel vor einem weiten Bereich von Eimeria-Spezies. Das rekombinante Protein reagierte mit Antikörpern, die auf spezifische Weise immunreaktiv mit, zum Beispiel, E. tenella, E. mitis, E. maxima, E. brunetti, E. acervulina und E. praecox sind. Somit ist das Peptid der Erfindung ein neues Immunogen, das beträchtlich mit Oberflächenproteinen kreuzreaktiv ist, die auf vielen Eimeria- Spezies gefünden werden, im Gegensatz zu zuvor verfügbaren Peptid-Immunogenen, die im allgemeinen nur mit einer Spezies reagieren.
Polypeptide, die dem rekombinanten Protein dieser Erfindung entsprechen, können erhalten werden durch Transformieren von Zellen mit einem Expressionsvektor, der DNA von einem Klon enthält, der aus einer Eimeria- Genbank wie oben beschrieben selektiert wurde. Geeignete Expressionsvektoren und Wirtszell-Systeme sind dem Fachmann wohlbekannt, und werden, zum Beispiel, in Sambrook et al., 1989, gelehrt. Das Peptid kann durch Züchten der transformierten Zellen in Kultur unter Bedingungen, bei denen die klonierte DNA exprimiert wird, erhalten werden. Natürlich kann das durch den Klon exprimierte Peptid länger oder kürzer sein als das rPB1-2-Peptid oder rPV1-89-Peptid, solange die Peptide kreuzreaktiv sind. Abhängig von dem gewählten Expressionsvektor kann das Peptid als ein Fusionsprotein oder ein reifes Protein exprimiert werden, sekretiert oder intrazellulär oder als ein Einschluß-Protein (indusion protein) zurückbehalten werden. Die gewünschten Polypeptide können aus der Kultur durch wohlbekannte Verfahren, wie Zentrifugation, Filtration, Extraktion und derartige zurückgewonnen werden, mit oder ohne Aufbrechen der Zelle, abhängig davon, wie das Peptid exprimiert wurde. Die rohe wässrige Lösung oder Suspension kann für das gewünschte Peptid durch Protein-Reinigungstechniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, angereichert werden. Bevorzugte Verfahren sind in den Beispielen gezeigt.

Antikörperg die für das rekombinante Protein spezifisch sind

Antikörper, die auf spezifische Weise mit dem rekombinanten Peptid dieser Erfindung reaktiv sind, können auf verschiedenen Wegen erhalten werden, die dem Durchschnittsfachmann leicht offensichtlich sind (siehe z.B. Sambrook et al.). Seren von Hühnern, die an Kokzidiose leiden, können als eine Quelle von Antikörpern verwendet werden. Die Reinigung dieser Antikörper kann erreicht werden durch selektives Binden aus dem Serum, z.B. durch Verwendung von Zellen, die mit einer DNA-Sequenz transformiert sind, die aus der einzigen Lambda gt11-EcoRI-Schnittstelle des Bakteriophagen zurückgewonnen wurde, der durch die ATCC-Hinterlegungsnr. 68450 gekennzeichnet wurde. Alternativ dazu kann das rekombinante Protein, das wie oben beschrieben erhalten wurde, in ein Tier als ein Immunogen injiziert werden, um eine polyklonale Antikörper-Erzeugung hervorzurufen. Die resultierenden polyklonalen Antiseren können direkt verwendet werden oder wie beschrieben gereinigt werden.
In einer anderen Alternative können monoklonale Antikörper, die auf spezifische Weise immunreaktiv mit dem Protein sind, nach wohlbekannten Verfahren (siehe z.B. Köhler und Milstein, 1976, Eur.J.Immunol., 6:611) hergestellt werden, indem man das Peptid dieser Erfindung als Immunogen verwendet, indem man es zur Selektion verwendet oder indem man es für beide Funktionen verwendet. Diese und andere Verfahren zum Herstellen von Antikörpern, die auf spezifische Weise immunreaktiv mit dem rekombinanten Protein dieser Erfindung sind, sind leicht innerhalb des fachmännischen Könnens des Durchschnittsfachmanns.

Rekombinante Vakzine gegen Kokzidiose

Eine Vakzine-Zusammensetzung, die das rekombinante Peptid enthält, kann hergestellt werden zur Verwendung durch Standardverfahren, die dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt sind. In einer Ausführungsform kann das immunogene Peptid in einem rekombinanten System erzeugt werden durch Expression der DNA-Sequenz, die durch diese Erfindung bereitgestellt wird und anschließend isoliert werden. Zum Beispiel können mikrobielle Zellen, die das exogene Gen von Interesse enthalten, in Bioreaktoren mit großem Volumen gezüchtet werden, dann durch Zentrifugation gesammelt werden und anschließend aufgebrochen werden, z.B. durch Homogenisierung unter hohem Druck. Das resultierende Zellysat kann dann in einem geeigneten Verdünnungsmittel resuspendiert werden (wie solche, die in den Beispielen verwendet werden) und filtriert werden, um eine wässrige Lösung eines Immunogens zu erhalten. Das rekombinante Protein kann in roher Form, zum Beispiel, durch Verdünnen in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) auf eine Konzentration von 50-500 µg/ml und dann Hindurchlaufen durch einen sterilen 0,22 Micron-Filter verabreicht werden.
Vorzugsweise wird das Rohproteinpräparat für das rekombinante Protein vor einer Verabreichung durch präparative Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie oder eine andere präparative Extraktionstechnik für das rekombinante Protein angereichert. Zusätzliche chromatographische Reinigungs- und Konzentrationsschritte, einschließlich Säulen-Chromatographie und Gelelektrophorese, können bei Bedarf durchgeführt werden. Besonders bevorzugt ist eine Reinigung unter Verwendung einer Affinitätssäule, die immobilisierte Antikörper aus den Seren von Hühnern mit Kokzidiose aufweisen. Die Systembedingungen hinsichtlich der Temperatur, des pH- Wertes, der Sauerstoffsättigung und der Nährstofferfordemisse sind von der speziellen Vorrichtung bzw. Ausstattung und den verwendeten Zelltypen abhängig; die optimalen Bedingungen werden leicht durch routinemäßiges experimentelles Arbeiten bestimmt. Dieses Verfahren stellt große Mengen an rekombinantem Protein für eine therapeutische Bewertung und Verwendung bereit. Verfahren zur Herstellung und Verabreichung rekombinanter Peptid-Immunogene werden ebenfalls in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 344 808 gelehrt, die unter Bezugnahme hierin aufgenommen wird.
Die erfindungsgemäße Vakzine kann verwendet werden, um Hühner (Gallus domesticus) gegen Kokzidiose zu schützen. Die Vakzine kann durch wohlbekannte Verfahren verabreicht werden; z.B. können wässrige Lösungen der Vakzine mit oder ohne Adjuvans durch intramuskuläre oder subkutane Injektion oder durch intraperitoneale Injektion verabreicht werden.
Alternativ dazu kann die Vakzine eine "lebende Vakzine" sein, wobei die DNA-Sequenz, die das Peptid-Immunogen kodiert, in ein virales Genom wie dem Geflügel-Pocken-Virus (fowl pox Virus) eingesetzt wird, und das modifizierte Virus verwendet wird, um die für einen Schutz ausgewählte Hühnerpopulation zu infizieren. Die Verfahren zur Herstellung und Verabreichung einer derartigen "lebenden" Vakzine werden in der internationalen Patentanmeldung PCT/US89/02918 gelehrt, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen wird (siehe, inter alia S. 6). Andere Verfahren unter Verwendung einer "lebenden Vakzine" verwenden normale Darmflora, die mit DNA transformiert ist, die das gewünschte Peptid-Immunogen kodiert, und an die Zielpopulation verabreicht wird, wie in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 324 648 gelehrt wird, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen wird.
Die Erfindung zieht nicht Vakzine-Zusammensetzungen in Erwägung, die ganze Eimeria-Zellen, egal ob lebende oder "getötete Zellen" umfassen, weil derartige Vakzinen das Risiko der Infektion des Vogels durch verbleibende virulente Eimeria-Zellen bergen. Vielmehr enthalten die erfindungsgemäßen Vakzinen eine oder mehrere immunogene Peptide, die mit Eimeria-Proteinen kreuzreagieren, während sie im wesentlichen frei von anderen Eimeria- Proteinen sind. Weil die Proteine auf der Oberfläche von Eimeria-Zeilen für Antikörper, die durch eine Immunisierung gebildet werden, am einfachsten zugänglich sind, betrifft eine bevorzugte Ausführungsform eine Vakzine, die ein Peptid umfaßt, das mit einem Zelloberflächenprotein von Eimeria kreuzreagiert, aber im wesentlichen frei von allen Nicht-Oberflächen-Eimeria- Proteinen ist.
Die Erfindung zieht ebenfalls eine Vakzine in Erwägung, die mehr als ein Immunogen enthält. Eine derartige Vakzine enthält zwei oder mehr unterschiedliche Peptide, die jeweils mit Epitopen auf verschiedenen Proteinen, die auf der Oberfläche von Zellen von Eimeria-Spezies gefunden werden, kreuzreagieren. Vorzugsweise ist jedes der verschiedenen Peptide jeweils mit Oberflächenproteinen von mindestens einer verschiedenen Eimeria-Spezies kreuzreaktiv. Am stärksten bevorzugt ist mindestens eins der immunogenen Peptide mit dem Peptid kreuzreaktiv, das durch die rekombinante DNA-Sequenz von rBP1-2 kodiert wird, weil dieses Peptid mit Oberflächenproteinen kreuzreagiert, die auf einer Anzahl verschiedener Eimeria-Spezies gefünden werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, sind aber nicht gedacht, den Schutzbereich der Erfindung zu begrenzen, der nur durch die Ansprüche begrenzt wird.

Beispiel 1 - Herstellung von Antiserum

Spezifisches-Pathogen-freie Vögel erhielten jeweils ungefähr 50.000- 75.000 sporulierte E. maxima-Oozysten per os (oral). Am 14. Tag nach dieser Herausforderung wurden 5 ml (cc) Gesamtblut durch brachiale Venenpunktion von jedem Vogel erhalten. Das Blut wurde gepoolt und das Hyperimmun-Serum abgetrennt, indem das Blut bei 37 ºC für 30-45 Minuten inkubiert wurde, bei 4 ºC für 60 Minuten gekühlt wurde, und dann bei 3.000 upm x 10 Minuten zentrifügiert wurde. Die Lipide wurden aus dem Serum durch ein Vereinigen von gleichen Volumen an Serum und Lipid- Klärungslösung (lipid dearing solution) (Beckman Company, Fullerton, CA), und Vortexen für 10 Sekunden entfernt. Die Flüssigkeit wurde dann für 5 Minuten bei 3.000 upm zentrifugiert und die entfettete obere Schicht wurde durch Absaugen gesammelt und 1:1 mit Bindungspuffer verdünnt. Der Antikörper wurde dann unter Verwendung eines rekombinanten Protein A- Reinigungs-Kits (Beckman Company, Fullerton, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Das verdünnte Serum wurde auf eine Säule mit rekombinantem Protein A aufgetragen, durchlaufengelassen und dann mit 10 ml Bindungspuffer gewaschen. Die rec-Protein A-Säule wurde dann in die Tonne einer Pufferaustausch-Säule eingebracht, und 5 ml Elutionspuffer wurden zu der rec-Protein A-Säule zugegeben, was erlaubte, Elutionsmittelfraktionen von 0,5 bis 1 ml zu sammeln. Zusätzliche Mengen an Austauschpuffer (0,1 M Kochsalzlösung) wurden durch die Säulenvorrichtung geleitet um den Antikörper vollständig zu eluieren. Die Fraktionen, die den Antikörper enthielten, wurden durch spektrophotometrische Absorption bei 280 nm identifiziert. Die geeigneten Fraktionen wurden dann gepoolt und durch die in dem Kit enthaltenden Proben-Konzentrations-Säulen konzentriert. Bei diesem Schritt reichten die typischen Proteinkonzentrationen von 0,5-2,0 mg/ml.

Entfernung von Antikörpern, die für E. coli-Antigene spezifisch sind

Antikörper, die mit E. coli reagieren, wurden unter Verwendung des Verfahrens von Sambrook et al (1989), adsorbiert. Eine nichttransformierte Kolonie von E. coli Y1090 wurde in 10 ml sterilem LB-Medium inkubiert und über Nacht bei 37 ºC inkubiert. Am folgenden Morgen wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation gesammelt und in 500 µl sterilem destillierten Wasser resuspendiert. Die Zellen wurden durch 4-5 Einfrier- /Auftau-Zyklen unter Verwendung von Trockeneis und 37 ºC-warmem Wasser aufgebrochen. Sie wurden dann in nasses Eis eingetaucht und vier bis fünf Mal ultraschallbehandelt (30 Sekunden an, 30 Sekunden aus). Die 500 µl des Rohlysates wurden dann zu 1.000 µl Antikörper gegeben und bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Antikörperlösung bei 10.000 upm x 10 Minuten zentrifügiert. Der Überstand wurde dann bei 0 ºC für eine zukünftige Verwendung gelagert.

Beispiel 2 - Herstellung eines Immunogen-Oozysten-Präparats gegen Kokzidiose

Spezifisches-Pathogen-freie Vögel wurden zum Sammeln von Oozysten gemäß dem Verfahren von Norton (1989) mit einer leichten Modifizierung in eine Batterie-Brutvorrichtung eingebracht. Am Tag 1 wurde den Vögeln eine Anforderungs-Dosis der geeigneten Eimeria-Spezies (für Wirksamkeits- Anforderungen: eine Mischung von E. tenella, E. mitis, E. acervulina, E. maxima, E. praecox und E. brunetti; zur Nukleinsäure-Extraktion E. maxima), gemischt in 10 Gramm Futter pro 6 Vögel, gegeben. An den Tagen 4-6 wurde der Kot der Vögel in einer nichtrostenden Stahlpfanne, die 2%- iges Kaliumdichromat enthielt, gesammelt. Im Anschluß an die Sammlungs- Zeitspanne wurde der Kot mit einem langsamen Propellerhomogenisator für 15 Minuten gerührt, was zu der Bildung eines gießbaren Schlamms führte. Dieser wurde dann durch eine doppelte Schicht von Käse-Gewebe hindurchlaufen gelassen. Das Filtrat wurde dann bei 1.600 upm x 10 Minuten zentrifügiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 2,2 M Sukrose resuspendiert und rezentrifügiert. Die flotierende Schicht nach Zentrifugation wurde abgesaugt und aufbewahrt. Das verbleibende Pellet wurde resuspendiert und wieder zentrifugiert. Die zweite flotierende Schicht wurde abgesaugt und mit der ersten flotierenden Schicht vereinigt. Dies wurde mit Wasser verdünnt (3 Teile Oozysten-Schicht auf 7 Teile Leitungswasser) und bei 3.000 upm x 10 Minuten zentrifügiert. Das Oozysten-Pellet wurde in 100 ml Wasser resuspendiert und unter Verwendung eines McMaster-Kammerobjektträgers (Olympic Equine Products, Issaquah, WA) quantifiziert. Die 100-ml-Suspension wurde dann unter Rühren und Belüftung auf einem America-V-Rührschüttler (American Hospital Supply Corporation, Miami, FL) bei 140 upm für 64-72 Stunden sporulieren gelassen.

mRNA-Extraktion und -reinigung

RNA wurde gemäß dem Verfahren nach Sambrook et al., (1989), extrahiert und gereinigt. Die sporulierten E. maxima-Oozysten wurden durch Zentrifugation gesammelt, zweimal in kalter Salzlösung gewaschen und dann resuspendiert, indem sie in 200 µl RNA-Extraktionspuffer (0,14 M NaCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl (pH 8,6), 0,5% Nonidet-40, 1 mM Dithiothreitol, 20 mM Vanadylribonukleosid-Komplexe) gevortext wurden. Die Oozysten wurden dann disaggregiert durch Vortexen über drei unterbrochene Minuten mit Säure-gewaschenen Glasperlen, gefolgt durch abwechselnde Einfrier/Auftau-Zyklen, um das Cytosol freizusetzen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation in einem Mikrozentrifugen-Röhrchen bei 5.000 upm x 2-3 Minuten entfernt. Zu dem Überstand wurden 200 µl Proteinaseverdauungspuffer (0,3 M Tris-HCl, pH 8,0, 25 mM EDTA, pH 8,0, 0,3 M NaCl und 2% SDS) und Proteinase K (Endkonzentration 50 µg/ml) gegeben. Das Röhrchen wurde zum Mischen sanft gevortext und dann für 30 Minuten bei 37 ºC inkubiert. Die Proteine wurden durch einmaliges Extrahieren mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform entfernt und die wässrige Phase wurde durch Zentrifugation bei 5.000 g x 10 Minuten gesammelt. Die wässrige Phase wurde dann in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und dann mit 400 µl eiskaltem Isopropanol vereinigt, gut vermischt und auf feuchtem Eis für 30 Minuten inkubiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation bei 15.000 upm x 10 Minuten gesammelt. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet wurde mit 1 ml Ethanol gewaschen und dann rezentrifügiert. Das Pellet wurde dann in dem offenen Röhrchen bei Raumtemperatur getrocknet bis das gesamte Ethanol verdampft war. Das Pellet wurde in 200 µl 50 mM Tris- HCl und 1 mM EDTA (pH 8,0) resuspendiert, das 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM Dithiothreitol und 2 µg/ml RNase-freie Pankreas-Dnase enthielt. Nach einer Inkubation von 60 Minuten bei 37 ºC wurden EDTA und SDS auf Endkonzentrationen von 10 mM bzw. 0,2% zugesetzt. Die Lösung wurde einmal mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform extrahiert. Die wässrige Schicht wurde durch Zentrifugation bei 15.000 upm x 5 Minuten abgetrennt, in ein neues Röhrchen überführt und mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (Endkonzentration 0,3 M) und 2,5 Volumen eiskaltem Ethanol vereinigt und für 30 Minuten auf nassem. Eis verbleiben gelassen. Die RNA wurde wiederum durch Zentrifugation bei 15.000 upm x 5 Minuten gesammelt und dann in einem offenen Röhrchen lufttrocknen gelassen bis das Ethanol verdampft war. Das Pellet wurde in 200 µl TE (pH 7,6) resuspendiert, mit 500 µl Ethanol vereinigt und dann bei -70 ºC bis zur weiteren Reinigung gelagert.
Durch die Verwendung einer Oligo-(dT)-Zellulose-Säule wurde aus dem Rohnukleinsäure-Extrakt mRNA isoliert. Die Säule wurde hergestellt, indem 2 ml Schlamm aus Oligo-(dT)-Zellulose und Ladungspuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) gemischt wurde und in ein steriles 5-ml-Spritzengehäuse gegossen wurde, das 1,27 cm (0,5 Inches) Glaswollfüllung enthielt. Der Schlamm wurde dann mit 3 ml 0,1 M NaOH und 5 mM EDTA gewaschen. Die Säule wurde als nächstes mit sterilem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert des Elutionsmittels niedriger als 8, war, und schließlich mit 5 ml Äquilibrierungspuffer (40 mM Tris, pH 7,4, 1 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) äquilibriert Die gelöste RNA wurde dann für 5 Minuten auf 65 ºC erhitzt, dann mit vorgewärmtem (65 ºC) Ladungspuffer (40 mM Tris, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) vereinigt, gemischt und für 2 Minuten abkühlen gelassen. Die Probe wurde dann auf die Oligo-(dT)-Säule aufgetragen. Das Eluat wurde gesammelt und auf 65 ºC für weitere 5 Minuten erhitzt und dann für 2 Minuten abkühlen gelassen. Das Eluat wurde dann wieder auf die Säule aufgetragen und 5 ml Ladungspuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) wurden folgen gelassen. Das resultierende Eluat, das nicht-Poly(A&spplus;)-RNA enthielt, wurde verworfen. Der Elutionspuffer (1,5 ml, 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% SDS) wurde als nächstes auf die Säule gegeben und Fraktionen von 10 Tropfen wurden gesammelt. Die RNA enthaltenden Fraktionen wurden durch Auftropfen von Tropfen von 2 µl von jeder Säulen-Probe auf Ethidiumbromid/Agarose-Platten und einem Beleuchten nach 20 Minuten mit kurzwelligem ultraviolettem Licht identifiziert. Die geeigneten Probe-Fraktionen wurden gereinigt und konzentriert, indem alle positiven Fraktionen vereinigt wurden und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 6,0) und 2,5 Volumen Ethanol zugegeben wurden. Die Lösung wurde dann auf Trockeneis für 30 Minuten inkubiert und bei 10.000 upm x 10 Minuten zentrifügiert. Das resultierende Pellet wurde mit 80% Ethanol gewaschen, unter Vakuum für 15 Minuten getrocknet, und in sterilem, autoklaviertem Wasser mit einer Konzentration von ungefähr 1 µg/µl resuspendiert. Die MRNA wurde bei -70 ºC gelagert, bis sie für die cDNA-Synthese verwendet wurde.

cDNA-Synthese

Die cDNA wurde unter Verwendung eines cDNA-Synthesesystems (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) gemäß dem Protokoll des Herstellers synthetisiert. In einem sterilen Diethylpyrocarbonat (DEPC)- behandelten Mikrozentrifugen-Röhrchen wurden 10 µl Reaktionspuffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl&sub2;, 50 mM Dithiothreitol) mit 2,5 µl 10 mM DNTP (500 µmol jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 5 µl Oligo (dT), 10 µl MRNA, 20 µl DEPC-behandeltem Wasser und 2,5 µl M-MLV-Reverse Transkriptase vereinigt und für 1 Stunde in einen 37 ºC-Inkubator gestellt und dann in Eiswasser gestellt. Diesem Reaktionsgemisch wurden 288,25 µl DEPC-behandeltes Wasser, 10 mM dNTP-Mix, 40 µl Gegenstrang-Puffer (188 mM Tris-HCl, pH 8,3, 906 mM KCl, 100 mM Ammoniumsulfat, 46 mM MgCl&sub2;, 37,5 mM Dithiothreitol und 1,5 mM NAD), 10 µl E. coli DNA-Polymerase 1, 1,75 µl RNAse H. und 1,25 µl E. coli DNA Ligase zugesetzt. Das Mikrozentrifugenröhrchen wurde dann zum Mischen sanft gevortext und dann bei 16 ºC für einen Zeitraum von 2 Stunden inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurde das Reaktionsgemisch auf Eiswasser gehalten, dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol aus Ammoniumacetat rückgefällt. Die cDNA wurde dann leicht mit EcoRI verdaut, um kohäsive Enden zu erhalten durch Versetzen von 1 µl 10 x Puffer (0,5 M NaCl, 1 M Tris, pH 7,4, 0,1 M MgCl&sub2;), 1 µl cDNA (0,5 µg), 1 µl EcoRI, und 7µl sterilem Wasser und Inkubieren für 20-30 Minuten bei 37ºC.

Ligation und Verpacken in Lambda gt11-Arme

Ein Mikrogramm kommerziell erhältlicher Lambda gt11-DNA (Lambda gt11 Cloning System, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD), die zuvor mit EcoRI verdaut und dephosphoryliert worden war, wurde mit 0,2 µg cDNA in einem 10 µl Reaktionsgemisch vereinigt, das 50 mM Tris- HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1,5 mM ATP enthielt, entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Dann wurde eine Einheit T4- DNA-Ligase zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht bei 4 ºC inkubiert. Die ligierte DNA wurde dann verpackt durch Vereinigen mit Lambda-Lysogen DNA-Verpackungsextrakt bei 20 ºC für 2 Stunden und anschließendes Zusetzen von 0,5 ml Phagen-Verdünnungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 0,01% Gelatine) und 20 µl Chloroform für 10 Minuten. Der verpackte Phage wurde dann bei 4 ºC gelagert.

Plattieren der Zellen

Steriles Luria Bertani-Medium (100 ml), das 2 ml Maltoselösung (20% Gew./Vol.) enthielt, wurde mit einer frischen Kolonie von E. coli Y1088 Plattierungszellen in einem sterilen 500 ml fassenden Kolben inokkuliert und über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation bei 2.500 g x 10 Minuten in sterilen Röhrchen gesammelt. Der Überstand wurde dekantiert und jedes Pellet wurde in 25 ml sterilem 10 mM MgSO&sub4; resuspendiert.
Die oben beschriebenen in vitro-Verpackungsreaktionen wurden auf niedrige (10 µl Phage, 90 µl Phagenverdünnungspuffer, phage dilution buffer, PDB), mittlere (50 µl Phage und 50 µl PDB) und hohe (75 µl Phage, 25 µl PDB) Titer verdünnt und getrennt mit 200 µl Y1088-Zellen für 30 Minuten bei 37 ºC koinkubiert. Die Zellen und der Phage wurden dann vereinigt mit 3 ml geschmolzenem Top-Agar, gewirbelt und auf LB/Ampicillin-Platten gegossen. Sobald sich der Top-Agar verfestigt hatte, wurden die Platten umgedreht und über Nacht bei 42 ºC inkubiert. Am nächsten Morgen wurde der rekombinante Phage aus den klaren Plaques selektiert und als Blöckchen aus dem Agar entfernt durch Einstechen der Spitze einer stumpfen, sterilen 14 Gauge-Nadel. Die Blöckchen wurden dann in 100 µl Wasser und 1 Tropfen Chloroform resuspendiert, kurz gevortext und bei Raumtemperatur unter intermittierendem Vortexen für 30 Minuten inkubiert. Der freigesetzte Phage wurde dann zu 200 µl Y1090- Zellen gegeben und bei 37 ºC für 30 Minuten inkubieren gelassen. Der Y1090-Phagen-Komplex wurde dann zu 3 ml geschmolzenem Top-Agar, der 10 mM MgCl&sub2;, 9 µl 100 mM IPTG und 9 µl 10%-iges X-Gal enthielt, zugesetzt und auf LB-Agar plattiert, der Ampicillin (50 µg/ml) enthielt. Man ließ den Top-Agar dann für 15 Minuten hart werden, dann drehte man ihn um und inkubierte ihn über Nacht bei 42 ºC. Die rekombinanten Kolonien wurden durch klare oder weiße Plaques auf dem Bakterienrasen nachgewiesen. Die nichtrekombinanten Plaques besaßen eine bläulich-grüne Farbe.

Screening der plattierten Bank auf positive Klone

Positive Klone wurden gemäß der Technik von Davis et al. (1986) und Sambrook et al. (1989) gescreent und identifiziert. Die Deckel der Agar- Platten wurden entfernt, und die Platten wurden mit der Agar-Seite nach unten auf eine sterile Oberfläche gelegt und für 30 Minuten lufttrocknen gelassen. Nitrozellulose-Filter wurden auf die Agar-Platten gelegt und die Deckel wurden wieder aufgesetzt. Die Filter verblieben an diesem Platz ungefähr 16 Stunden. Sie wurden dann sanft mit einer breiten Pinzette entfernt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die Filter wurden dann für 10 bis 15 Minuten Chloroformdampf ausgesetzt und wiederum für 30 Minuten trocknen gelassen. Als nächstes wurde der Filter zweimal in TBST (Tris-buffered sahne, mit 0,005% Tween-20), 10 Minuten pro Waschschritt, gewaschen. Der Filter wurde dann in einer Blocking- Lösung (3 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin, Fraktion 5 in 0,1 M Tris- HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl) für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln inkubiert. Ein 100-µl-Aliquot eines Antikörpers gegen Kokzidien, der wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt war, wurde jeweils zu den 10 ml Blocking-Bad gegeben, und die Inkubation wurde für weitere 60 Minuten fortgesetzt. Der Filter wurde dann viermal in TBST mit Waschschritten von 5 Minuten gewaschen. Als nächstes wurde der Filter in Blocking- Lösung, die Alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-Huhn IgG (10 µl IgG in 10 ml Blocking-Lösung) enthielt, für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dem folgte ein Waschschritt in Tris-gepufferter Salzlösung für 5 Minuten und ein Lufttrocknen auf einem sauberen Filterpapier. Die Farbentwicklungs-Lösung wurde hergestellt, indem 40 µl Nitroblautetrazolium (nitroblue tetrazolium, NBT) und 30 µl 5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat (BCIP) zu der Farbentwicklungs-Stocklösung (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5, 0,1 M Natriumchlorid, 50 mM MgCl&sub2;) zugegeben wurden. Der Filter wurde dann 30 Minuten im Dunkeln in diese Lösung gelegt, dann in TBS gewaschen und für 60 Sekunden in eine Stopp-Lösung gelegt und lufttrocknen gelassen. Die rekombinanten Bakterienkolonien, die das anti-kokzidielle Protein synthetisierten, wurden durch die Entwicklung von lilafarbenen Punkten auf der Nitrozellulose-Membran festgestellt.

Kolonieselektion und Amplifikation

Klare Plaques, die die Farbentwicklung bei dem Immunoblot-Screening- Verfahren anzeigen, wurden für die weitere Studie selektiert. Die entsprechenden Plaque-Bereiche auf den Originalplatten wurden herausgefunden, und Proben wurden aus jedem selektierten Plaque durch Absaugen mit einer sterilen Nadel entfernt. Diese Blöckchen wurden gelöst, mit 1 Tropfen Chloroform lysiert und verwendet, um Kulturen von E. coli Y1090 wie vorstehend beschrieben zu infizieren. Jede nachfolgende Zellinie wurde entsprechend der Nummer des ursprünglichen experimentellen Versuchs und der Plaque-Nummer bezeichnet. Ausgewählte Kolonien wurden in LB- Nährmedium, das Ampicillin enthielt, amplifiziert. Nach der Erstellung dieser Rohbibliothek wurden die transformierten Zellen in LB-Nährmedium und 40%-igem Glycerol (1:1) bei -20 ºC aufbewahrt.
Alternativ dazu kann die cDNA zu Beginn in ein Plasmid wie pBR322 eingesetzt werden, um die Selektionsmarker Amp oder Tet mit der DNA zu verbinden, und dann an die Lambda gt11-Arme wie vorstehend beschrieben anzuhängen, wenn dabei darauf geachtet wird, daß die Verpackungskapazität des Phagen nicht überschritten wird.
Es wurden separate Klone aus einer Lambda gt11-Genbank, einer pBR322-Genbank und einer pTRP56-Genbank, die in S. cerivisae gezüchtet wurde, isoliert. Ein Klon, der aus der rekombinanten Lambda-Bakteriophagen gt11-Genbank erhalten worden war, und als rBP1-2 bezeichnet wurde, wurde als ATCC 68450 hinterlegt. Ein Klon, der rPV1-89 bezeichnet wurde, wurde aus der pBR322-Genbank selektiert und als ATCC Nr. 68537 hinterlegt.
Das klonierte cDNA-Gen besitzt drei EcoRI-Restriktionsschnittstellen und ist ungefähr 4-7 Kilobasen lang. Während diese Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform immunogene Peptide, die durch die gesamte, aus Eimeria isolierte, Sequenz kodiert werden, vorsieht, werden auch immunogene Peptide, die durch Fragmente der Sequenz kodiert werden, in Erwägung gezogen, z.B. ein oder mehrere der EcoRI-Fragmente von rBP1-2. Insbesondere werden DNA-Sequenzen, die die Sequenz des 2 Kilobasen umfassenden EcoRI-Fragments aus der Mitte der rBP1-2-Sequenz einschließen, in Erwägung gezogen.

ATCC-Patenthinterlegung von rekombinanten Zellen

Ein 100 µl fassendes Aliquot von rekombinanten E. coli Y1090/rBP1-2- Zellen wurde über Nacht in 500 ml frischem Luria Bertani-Medium, das 50 µg/ml Ampicillin enthielt, bei 37 ºC wachsen gelassen. Am folgenden Morgen wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in 200 ml sterilem Lyophilisation-Resuspensions-Medium mit 5 % Magermilch (Difco Laboratories, Detroit, MI) und 0,25% Bactopepton (Difco Laboratories, Detroit, MI) resuspendiert und lyophilisiert (Engler, 1990). Die Kultur wurde dann bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, USA, mit Wirkung vom 26. Oktober 1990, hinterlegt. Die zugewiesene Hinterlegungsnummer ist die ATCC-Annahmenr. 68450. E. coli HB101/rPV1-89-Zellen wurden auf ähnliche Weise gezüchtet und am 1 März 1991 hinterlegt. Dieser Hinterlegung wurde die ATCC-Annahmenr. 68537 zugewiesen.

Beispiel 3: Isolierung des rekombinanten Proteins

Rekombinante Proteine wurden gemäß dem Verfahren nach Becker et al. (1990) mit leichten Modifikationen isoliert. Die rekombinanten E. coli Y1090/rPB1-2-Zellen wurden über Nacht bei 37 ºC in einem sterilen, verschlossenen 1000 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben, der 500 ml Luria Bertani-Nährmedium und Ampicillin (50 µg/ml) enthielt, wachsen gelassen. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und in 5-10 ml Z-Puffer (0,12 M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,4 M Na&sub2;H&sub2;PO&sub4;, 0,01 M KCl, 1 mM MgSO&sub4; und 0,3 (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol, pH 7,0), zu dem 0,174 mg Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)/ml zugesetzt worden waren, resuspendiert. Eine äquivalente Menge an mit Säure gewaschenen Glaskugeln wurde dem Röhrchen zugesetzt. Die Zellen wurden dann bei hoher Geschwindigkeit für 30 Sekunden gevortext, worauf eine Immersion in Eiswasser für 30 Sekunden folgte, um ein Überhitzen zu verhindern. Dieses Verfahren wurde insgesamt in 6 Zyklen wiederholt. Die Glaskugeln wurden am Boden des Röhrchens absetzen gelassen und die Flüssigkeit wurde abgezogen und in ein sauberes Gefäß überführt. Unter Verwendung eines Vibra-Zell-Ultraschallgerätes (Sonics and Materials Incorporated, Danbury, CT) wurde das Lysat dann für 30 Sekunden x 50 Watt auffeuchtem Eis ultraschallbehandelt, für Sekunden ruhen gelassen und dann wurde dies zweimal wiederholt. Dies wurde dann bei 5000 upm x 5 Minuten zentrifügiert, und das Pellet wurde verworfen. Der Überstand wurde dann mit 100 ml frischem Z-Puffer in einem sauberen 250 ml fassenden Glasbecher versetzt, der in einem Eisbad über einem Magnetrührer ruhte. Der Flüssigkeit wurden weitere 17,4 mg PMSF zugesetzt und bei langsamer bis mittlerer Geschwindigkeit gerührt. Das rekombinante Protein wurde dann durch Zugabe von Ammoniumsulfat auf eine Endkonzentration von 70% Sättigung aus dem Rohlysat ausgefällt. Das Lysat und Ammoniumsulfat wurden für 1-2 Stunden in feuchtem Eis rühren gelassen. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt und in einem kleinen Volumen von 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, resuspendiert. In dieser Stufe betrugen typische Resuspensions- Proteinkonzentrationen 500-700 µg/ml, wie unter Verwendung eines colorimetrischen Protein-Micro-Assays von Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) bestimmt wurde. Ein ähnliches Verfahren kann angewendet werden, um rekombinantes Peptid aus Zellen, die mit rPV1-89 transformiert wurden, zu erhalten.
Es wurden spezifische immunogene Fraktionen durch Standard-Ionenaustauscher- oder Gelpermeation-Flüssigchromatographieverfahren erhalten. Die Fraktionen wurden, wie beschrieben, durch ihre Immunreaktivität mit einem Serum von Hühnern, die durch E. maxima herausgefordert worden waren, identifiziert. Die rekombinanten Proteine, die durch sowohl rPB1-2 und rPV1-89 kodiert wurden, zeigten die gleichen Immunreaktivitäts-Muster mit Seren von verschiedenen Hühnern.

Beispiel 4: Charakterisierung des rekombinanten Proteins

Das Molekulargewicht der rekombinanten Proteine wurde durch SDS- PAGE (11-23 %-Exponential-Gradientengel, 6%-Sammelgel, Anolyt-Puffer: 1,2 M Ammediolsulfat, pH 9,5; Katholyt-Puffer: 0,75 M Ammediol, 0,75 M Glycin, pH 9,5 plus 0,5% Natriumdodecylsulfat; Laufbedingungen: 50 Volt x 15 Minuten, dann 100 Volt x 6 Stunden) bestimmt. Die Gele mit dem Rohproteinextrakt von Zellen, die mit rPV1-89 transformiert waren, enthielten eine Bande bei 45-65 kD, die in Gelen mit dem untransformierten Wirtsstamm fehlte. Die Gele mit dem Rohproteinextrakt von Zellen, die mit rPB1-2 transformiert waren, besaßen eine ähnliche Bande, die ein Fusionsprotein von 140 kD darstellte; durch Subtrahieren des Gewichts, das auf dem Anteil des Fusionsproteins beruhte, der durch das beta-Galactosidase-Gen beigesteuert wurde, konnte das Molekulargewicht des Eimeria-Peptids als ungefähr 50-65 Kilodalton errechnet werden. Das Protein selbst besitzt eine hohe Stabilität von bis zu 60 Tagen in Z-Puffer (vorstehend beschrieben) bei 4 ºC, verliert aber infolge von einer Dialyse gegen 0,1 M Natriumchlorid beträchtlich an Aktivität (fast 100%).
Die Proteinkonzentrationen der Fraktionen wurden aus den Gesamtproteinkonzentrationen durch Hochdruckflüssigchromatographie bestimmt (Bedingungen: Diethylaminoethyl (DEAE)-Säule; Puffer 1: 20 mM Tris, pH 8,5; Puffer 2: 20 mM Tris, pH 7,0 und 0,3 M Natriumchlorid; linearer Gradient: 0-100% Puffer 2, 30 Minuten; Flußrate 1,0 ml/min bei 280 nm, 0,5 AUFS). Die Hauptbakterienproteine eluierten im allgemeinen bei Laufzeiten von 2,5-3,5 Minuten. Die rekombinanten Fusionsproteine eluierten in 2 Hauptpeaks bei Laufzeiten von 14,4 und 16,8 Minuten. Der rekombinante Doppelpeak machte typischerweise ungefähr 24% der Gesamtproteinkonzentration der rPB1-2-Proteinproben und ungefähr 10% der rPV1- 89-Proteinproben aus. In Rohproteinfraktionen von Zellen, die mit einem anderen pBR322-Vektor, als rPV1-12 bezeichnet, transformiert worden waren, stellte das rekombinante Protein ungefähr 5 % der Gesamtsumme dar.

Beispiel 5: Sequenz des rekombinanten Proteins

Das Peptid, das von dem Expressionsvektor rPV1-89 exprimiert wurde, ist kein Fusionsprotein, und deshalb kodieren Eimeria-Sequenzen anstatt von E. coli-Sequenzen für den aminoterminalen Anteil. Das rPV1-89-Peptid wurde durch Transformieren von E. coli-Zellen mit rPV1-89 und Selektieren einer Transformante erhalten, die mit dem partiell gereinigten Antiserum aus Beispiel 1 reagierte. Die ausgewählte Transformante wurde gezüchtet und der Rohproteinextrakt aus der Kultur wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Bande, die in Extrakten der Transformante, aber nicht in Extrakten des untransformierten Wirts auftauchte, wurde aus dem Gel ausgeschnitten, und das Protein wurde elektroeluiert, um ein gereinigtes Präparat des rekombinanten Proteins zu erhalten. Die Sequenzanalyse des N-terminalen Endes des rekombinanten Proteins wurde unter Verwendung eines Protein-Sequenziergerätes der Firma Applied Biosystems Incorporated Modell 477A durchgeführt. Die Ergebnisse der Sequenzanalysen sind in Tabelle I gezeigt und die Aminosäuresequenz, die bestimmt wurde, wird in SEQ ID NO:1 bereitgestellt. Tabelle 1. N-terminale Sequenz
Die in Tabelle 1 offenbarte Sequenz kommt nicht in der beta-Galactosidase von E. coli vor. Die Sequenz wurde mit den ersten 20 Aminosäuren von Proteinen verglichen, die durch die verschiedenen Autoren offenbart wurden, die über Vakzine-Präparate gegen Kokzidien berichtet haben (Tabelle 2). Der Vergleich zeigt eine maximale Homologie von 3 von 20 Resten. Folglich ist das erfindungsgemaße Peptid einzigartig unter den Peptiden, die aus Klonen von Eimeria-DNA isoliert wurden. Tabelle 2. Vergleich der Sequenzhomologie der N-terminalen Enden von ausgewählten rekombinanten Proteinen mit dem rPV1-89-Protein

Beispiel 6: Anfängliche In Vivo-Wirksamkeitsversuche

Als eine anfängliche Studie wurde eine kleine Probengröße (n=27) verwendet, um die potentiellen Toxizitäten der Vallzine zu studieren, und die Fähigkeit des rekombinanten Proteins zu bestimmen, die Oozysten-Proliferation zu inhibieren und die intestinalen Läsionen gegen eine leichte Herausforderung (10.000 Oozysten/Vogel) zu verringern. Die Vögel waren spezifisches-Pathogen-freie Leghorns gemischten Geschlechts, die bis zu einem Alter von 4 Wochen isoliert aufgezogen worden waren. Die Vögel wurden willkürlich den beiden Behandlungsgruppen zugeordnet. Der Vakzine-Gruppe wurden 150 µg rekombinantes Protein in einem Gemisch von Phosphatgepufferter Salzlösung und unvollständigem Freund'schem Adjuvans (5:1) (Gesamtinjektionsvolumen 1,0 ml/Vogel) intramuskulär an eine einzige Stelle verabreicht. Die Injektion wurde nach 7 Tagen an einer passenden kontralateralen Stelle wiederholt. Weitere 7 Tage später wurde den Vögeln eine orale Dosis von E. maxima-Oozysten (10.000/Vogel) verabreicht. 7 Tage nach dieser Herausforderung wurden die Vögel einer Autopsie unterzogen) und die Därme wurde auf Läsionen untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Tabelle 3 Ergebnisse des anfänglichen Wirksamkeitsversuches
aOozysten x 10&sup6; pro Gramm Kot, der aus dem Darm und dem Zökum entnommen wurde.

Beispiel 7: In Vivo-Wirksamkeitsversuch 2

In einem zweiten Versuch wurde die Probengröße auf n = 300 ausgedehnt und die Bedingungen wurden eingestellt, um eine tatsächliche Produktionsumgebung zu simulieren. Der Test wurde in einem kommerziellen Geflügelhaus mit individuellen Bodenverschlägen, mit Betonböden und Reishülseneinstreu durchgeführt. Ross x Arbor Acres-Broiler-Hühner wurden von einer industriellen Brutstätte mit einem Alter von einem Tag (von gemischtem Geschlecht, Zufallsverteilung), und mit zufälliger Verteilung auf eine der sechs Bodenverschläge mit einer Stelldichte von 929,03 cm² (ein Quadratfüß) pro Vogel zugeordnet. Alle Vögel wurden mit nichtarzneihaltigem Broilerfütter (Prestarter, Starter, Grower und Finisher) und Wasser ad libitum ausgestattet. Zwei Replikas von jeder Behandlung wurden unter Zufällsverteilung unter den sechs Verschlägen zugeteilt (siehe Tabelle 4). Die Impfüng wurde durchgeführt gemäß dem in Tabelle 5 gezeigten Schema. Tabelle 4 Verschlag und Behandlungszuweisungen: Versuch 2 Tabelle 5 Impfungsschema und Dosierung: Versuch 2
Am Tag 28 wurde jede Replika von Vögeln mit einer gemischten Kultur (E. tenella, E. mitis, E. acervulina, E. maxima, E. praecox und E. brunetti) von 50.000 Oozysten/Vogel, verdünnt in zerbröseltem Futter (83,3 Gramm Futter pro 50 Vögel), herausgefordert. Am Tag 7 nach der Herausforderung (Tag 35) wurden die Vögel euthanisiert und auf das Vorkommen von Intestinalläsionen gemäß dem Verfahren von Johnson und Reid (1970) hin untersucht. Die Werte der Läsionen, die Futterumwandlung, die Körpergewichte und die Zahl der Oozysten pro Gramm Kot wurden ermittelt und sind in Tabelle 6 wiedergegeben. Tabelle 6 Ergebnisse des Wirksamkeitsversuchs 2
¹ Werte innerhalb der Reihen mit verschiedenen Buchstaben variieren signifikant bei einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 0,05
² Eingestellt auf mittleres Kontroll-Lebendgewicht
³ Oozysten x 10&sup6; pro Gramm Kot

Beispiel 8: In Vivo-Wirksamkeitsversuch 3

Bei dem dritten Versuch wurde die Wirksamkeit der rekombinanten Vakzine gegen Kokzidien mit verschiedenen handelsüblichen kokzidiostatischen "Shuttle"-Programmen in einer definierten Herausforderung bestehend aus gemischten Arkansas-Feldisolaten von sechs pathogenen Stämmen von Eimeria verglichen. Einen Tag alte, im Handel erhältliche Broilerhühner wurden auf statistische Weise unter den sieben Behandlungen aufgeteilt, mit vier Replikas pro Behandlung (n = 160/Replika), und in Bodenverschläge in ein herkömmliches Broilerhaus eingebracht. Die Behandlungen sind in Tabelle 7 beschrieben; die Impfüng für Gruppe 5 wurde gemäß dem in Tabelle 8 gezeigten Schema durchgeführt. Tabelle 7 Behandlungsbeschreibung: Versuch 3
¹ rBP1-2 und Rehydralgel 20% (Vol./Vol.) Aluminiumhydroxid-Adjuvans Tabelle 8 Rekombinante Vakzine-Dosierungsschema: Versuch 3
Am Tag 28 wurde jede Vogel-Replika mit einer gemischten Kultur von E. tenella E mitis E acervulina, E. maxima, E. praecox und E. brunetti in einer Konzentration von 90.000 Oozysten/Vogel, verteilt in zermahlenem Futter, herausgefordert. Am Tag sieben nach der Herausforderung (Tag 35) wurde eine Zufallsprobe von 8 Vögeln/Replika (32 Vögel/Behandlung) zur Bewertung erhalten. Die durchschnittlichen Daten für diese Vögel sind in Tabelle 9 wiedergegeben. Tabelle 9 Antikokzidielle Wirksamkeit-Eimeria
¹ Abkürzungen: NC - Nicarb, Coban; RC - Robenz, Coban; NB - Nicarb, BioCox; INC - infiziert, nichtmedikamentierte Kontrolle; VAC - rBP1-2 rekombinante Vakzine; NCZ - Nicarb, Coban, Zeolyte; NCM - Nicarb, Coban, Microacid.
² Oozysten x 10&sup6; pro Gramm Intestinalinhalt
³ in bezug auf die infizierte, nichtmedikamentierte Kontrolle (INC).

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER; HARWOOD, David E.
HAMBY, Glenda
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: REKOMBINANTE VAKZINE GEGEN KOKZIDIOSE
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: Banner, Birch, McKie & Beckett
(B) STRASSE: 1001 G Street, N.W., Eleventh Floor
(C) ORT: Washington
(D) STAAT: D.C.
(E) LAND: United States of America
(F) Postleitzahl: 20001-4597
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRAGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.24
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANGABEN ÜBER DEN ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: TATE, Rodger L.
(B) REGISTRIERUNGSNR: 27,399
(C) REFERENZNR: 0165.032202
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: (202) 508-9100
(B) TELEFAX: (202) 508-9299
(C) TELEX: 97430 BBMB UT
(2) ANGABEN ZUR SEQ ID NO:1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) TYPE: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: N
(v) ART DES FRAGEMENTS: N-terminal
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Eimeria maxima
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) KLON: rPV1-89
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:1: Formblatt für die Hinterlegung von Mikroorganismen International Aktenzeichen: PCT/ MIKROORGANISMEN Angaben über den auf Seite Zeile der Beschreibung genannten Mikroorganismus¹ A. KENNZEICHNUNG DER HINTERLEGUNG² Weitere Hinterlegungen sind auf einem zusatzlichen Blatt angegeben ³ Name der Hinterlegungsstelle&sup4; AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION Anschrift der Hinterlegungsstelle (einschlieblich Postleitzahl und Land)&sup4; 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 USA Datum der Hinterlegung&sup5; Eingangsnummer&sup6; B. WEITERE ANGABEN (die Angaben werden auf einem gesonderten Blatt fortgesetzt Escherichia Coli Y1090/rBP1-2 Für die Benennung von Dänemark hat der Anmelder beantragt, daß die Probe des Mikroorganismus bis zu dem Tag, an dein die Anmeldung akzeptiert worden ist oder abschließend entschieden worden ist, ohne akzeptiert worden zu sein (Abschnitt 22(7)), nur an einen Sachverständigen herausgegeben wird. C. BESTIMMUNGSSTAATEN, FUR DIE ANGABEN GEMACHT WERDEN³ (falls die Angaben nicht alle Bestimmungsstaaten betreffen D. NACHREICHUNG VON ANGABEN&sup8; Folgende Angaben werden später beim Internationalen Büro eingereicht (allgemeine Bezeichnung der Angaben, z.B. "Eingangsnummer der Hinterlegung") E. Dieses Blatt wurde zusammen mit der internationalen Anmeldung eingereicht (vom Anmeldeamt nachzuprufen) (Bevollmächtigter Beamter) Datum des Eingangs dieses (vom Anmelder nachgereichren) Blattes beim Internationalen Buro¹&sup0;

MIKROORGANISMEN

FORTSETZUNG B. WEITERE ANGABEN

Escherichia coli Y1090/rBP1-2

In bezug auf die Benennungen, für die um ein europäisches Patent ersucht wird, wird eine Probe des hinterlegten Organismus bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des europäischen Patents bekannt gemacht wird oder an dem die Patentanmeldung zurückgewiesen oder zurückgenommen wird oder als zurückgenommen gilt, nur durch die Herausgabe einer Probe an einen vom Antragsteller benannten Sachverständigen zugänglich gemacht (Regel 28(4) EPÜ). Formblatt für die Hinterlegung von Mikroorganismen Internationales Aktenzeichen: PCT/ MIKROORGANISMEN Angaben über den auf Seite Zeile der Beschreibung genanntan Mikroorganismus¹ A. KENNZEICHNUNG DER HINTERLEGUNG² Weitere Hinterlegungen sind auf einem zusatzlichen Blatt angegehan ³ Name der Hinterlagungsstelle&sup4; AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION Anschrift der Hinterlegungsstelle (einschließlich Postleitzahl und Land)&sup4; 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 USA Datum der Hinterlegung&sup5; Eingangsnummer&sup6; B. WEITERE ANGABEN&sup7; (die Angaben werden auf einem gesonderten Blatt fortgesetzt ) Escherichia Coli HB101, rPV1-89 Für die Benennung von Dänemark hat der Anmelder beantragt, daß die Probe des Mikroorganismus bis zu dem Tag, an dein die Anmeldung akzeptiert worden ist oder abschließend entschieden worden ist, ohne akzeptiert worden zu sein (Abschnitt 22(7)), nur an einen Sachverständigen herausgegeben wird. C. BESTIMMUNGSSTAATEN. FÜR DIE ANGABEN GEMACHT WERDEN³ (falls die Angeben nicht alle Bestimmungssteaten betreffen) D. NACHREICHUNG VON ANGABEN&sup8; Folgende Angeben werden später beim Internationalen Büro eingereicht (allgemeine Bezeichnung der Angaben, z.B. "Eingangsnummer der Hinterlegung") E. Dieses Blatt wurde zusammen mit der internationalen Anmeldung eingereicht (vom Anmeldeamt nachzuprüfen) (Bevollmächtigtar Beamtar) Datum des Eingangs dieses (vom Anmelder nachgereichten) Blattes beim Internationalen Büro¹

MIKROORGANISMEN

FORTSETZUNG B. WEITERE ANGABEN

Escherichia coli HB101, rPV1-89

In bezug auf die Benennungen, für die um ein europäisches Patent ersucht wird, wird eine Probe des hinterlegten Organismus bis zu dem Tag, an dem der Hinweis auf die Erteilung des europäischen Patents bekannt gemacht wird oder an dem die Patentanmeldung zurückgewiesen oder zurückgenommen wird oder als zurückgenommen gilt, nur durch die Herausgabe einer Probe an einen vom Antragsteller benannten Sachverständigen zugänglich gemacht (Regel 28(4) EPÜ).

Claims

1. Intron-freies DNA-Molekül kodierend ein Peptid, das auf spezifische Weise immunreaktiv mit Antikörpern in den Seren von Hühnern ist, die mit Eimeria-Spezies infiziert sind, wobei das Peptid das gesamte oder ein Anteil eines Eimeria-Proteins ist, das die folgende Aminosäuresequenz enthält:

2. Rekombinantes DNA-Molekül kodierend ein Peptid, das dem Peptid entspricht, das durch die DNA-Sequenz kodiert wird, die in die einzige pBR322-EcoRI-Schnittstelle in dem rekombinanten bakteriellen Plasmid insertiert ist, das unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68537 hinterlegt ist.

3. Rekombinantes bakterielles Plasmid, das unter der ATCC-Hinter legungsnr. 68537 hinterlegt ist.

4. Rekombinantes DNA-Molekül kodierend ein Peptid, das dem Peptid entspricht, das durch die DNA-Sequenz kodiert wird, die in die einzige Lambda gt11-EcoRI-Schnittstelle des rekombinanten Bakteriophagen mit der ATCC-Hinterlegungsnr. 68450 insertiert ist.

5. Rekombinantes DNA-Molekül umfassend eine DNA-Sequenz, die der DNA-Sequenz entspricht, die in die einzige Lambda gt11-EcoRI- Schnittstelle in dem rekombinanten Bakteriophagen insertiert ist, der unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68450 hinterlegt ist.

6. Rekombinanter Bakteriophage, der unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68450 hinterlegt ist.

7. Transformierte Zelle, die ein DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 5 umfaßt.

8. Transformierte Zelle, die ein rekombinantes Plasmid gemäß Anspruch 3 umfaßt.

9. Transformierte Zelle, die einen rekombinanten Bakteriophagen gemäß Anspruch 6 umfaßt.

10. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 7-9, wobei die Zelle eine E.coli-Zelle ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Peptids, das das Züchten der transformierten Zelle nach Anspruch 7 unter Bedingungen umfaßt, bei denen das DNA-Molekül exprimiert wird, um ein immunogenes Peptid zu bilden.

12. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Peptids, das das Züchten der transformierten Zelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen umfaßt, bei denen die DNA-Sequenz exprimiert wird, die in die einzige pBR322-EcoRI-Schnittstelle in dem rekombinanten bakteriellen Plasmid insertiert ist, das unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68537 hinterlegt ist, um ein immunogenes Peptid zu bilden.

13. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Peptids, das das Züchten der transformierten Zelle nach Anspruch 9 unter Bedingungen umfaßt, bei denen die DNA-Sequenz exprimiert wird, die in die einzige Lambda gt11-EcoRI-Schnittstelle in dem rekombinanten Bakteriophagen insertiert ist, der unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 68450 hinterlegt ist, um ein immunogenes Peptid zu bilden.

14. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Peptids nach einem der Ansprüche 11-13, weiterhin umfassend:

Isolieren des immunogenen Peptids aus dem Wachstumsmedium.

15. Im wesentlichen reines Peptid, das durch das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 5 kodiert wird.

16. Im wesentlichen reines Peptid, das durch die DNA-Sequenz kodiert wird, die in die einzige pBR322-EcoRI-Schnittstelle in dem rekombinanten bakteriellen Plasmid nach Anspruch 3 insertiert ist.

17. Im wesentlichen reines Peptid, das durch die DNA-Sequenz kodiert wird, die in die einzige Lambda gt11-EcoRI-Schnittstelle in dem rekombinanten Bakteriophagen nach Anspruch 6 insertiert ist.

18. Monoklonaler Antikörper, der mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 15-17 auf spezifische Weise immunreaktiv ist.

19. Vakzine-Zusammensetzung umfassend ein immunogenes Peptid nach einem der Ansprüche 15-17, wobei die Vakzine-Zusammensetzung im wesentlichen frei von Eimeria-Proteinen außer Eimeria-Zelloberflächenproteinen ist.

20. Vakzine-Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei die Vakzine- Zusammensetzung zur Injektion in Hühner geeignet ist.