DE3650540T2

DE3650540T2 - Antigene Proteine und diese enthaltende Impfstoffe zur Verhütung von Kokzidiose

Info

Publication number: DE3650540T2
Application number: DE3650540T
Authority: DE
Inventors: William H Andrews; Virginia M Brothers; Ray-Jen Chang; Elizabeth A Dragon; James G Files; Thomas C Gore; Irene Kuhn; Michael Mccaman; Karel Z Newman; Robert M Nordgren; Leland S Paul; Gary R Petersen; Stacey R Sias; John L Tedesco
Original assignee: Solvay SA
Current assignee: Dimminaco AG
Priority date: 1985-12-03
Filing date: 1986-11-24
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2006-11-25
Also published as: IL97566A0; JPH10323195A; EP0453055A2; JPS62224293A; EP0453054A3; JP2548148B2; JPH08242864A; IL80826A; EP0231537A2; DE3650540D1; AU6586986A; EP0453055A3; EP0231537B1; IL97567A; JP2837119B2; IL97567A0; EP0453054B1; EP0231537A3; ATE140030T1; DE3650645D1

Description

Hintergrund der Erfindung

In dieser Anmeldung wird auf verschiedene Publikationen durch arabische Zahlen in Klammern verwiesen. Vollständige Zitate dieser Referenzen sind am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen zu finden. Die Offenbarungen dieser Publikationen in ihrer Gesamtheit sind durch die Bezugnahme in diese Anmeldung eingeschlossen, um den Stand der Technik, wie er Fachleuten zum Zeitpunkt der hier beschriebenen und beanspruchten Erfindung bekannt war, detaillierter zu beschreiben.
Der Stamm Apicomplexa umfaßt Hunderte von verschiedenen Organismen, die zur Ordnung Eucoccidiorida gehören. Die Gattung Eimeria wird von der Ordnung echter Coccidien-Agentien umfaßt. Von den Organismen, die zu dieser Gattung gehören, sind verschiedene Spezies von anerkannter Bedeutung für die Hühnchenindustrie. Diese Spezies umfassen Eimeria tenella, E. maxima, E. acervulina, E. necatrix, E. brunetti, E. mivati, E. mitis und E. praecox.
Eine Differenzierung der Spezies basiert auf der Infektionsstelle innerhalb des Wirts und der Oocysten-Morphologie. Bisher sind biochemische Marker nicht zur Speziation eingesetzt worden, obwohl Unterschiede für jede der obigen Spezies festgestellt wurden.
Bei Vogel-Eimeria wird der gesamte Lebenszyklus innerhalb eines einzigen Wirts abgeschlossen. Der Lebenszyklus ist komplex und besteht aus mehreren asexuellen und sexuellen Stadien, in Abhängigkeit von der beteiligten Eimeria-Spezies.
Das infektiöse Stadium ist die sporulierte Oocyste. Nach der Aufnahme mit kontaminiertem Kot, Nahrung und Wasser, entkapseln sich ("excyst") die sporulierten Oocysten innerhalb des Verdauungstrakts als Ergebnis der kombinierten Wirkung mechanischer Scherung und enzymatischer Hydrolyse der Sporocysten-Kappe. Die befreiten Sporozoiten durchqueren Epithelzellen innerhalb spezifischer Bereiche des Darms.
Die Entwicklung beginnt in der Lieberkuhn-Crypte bis zum Niveau von Meronten der ersten Generation; der Meront ist ein Übergangsstadium, bestehend aus abgerundeten Organismen mit einem ausgeprägteren Kern, plus erhöhter Kapazität zur Energieerzeugung und Proteinsynthese. Es folgt die Entwicklung von Merozoiten erster Generation aufgrund mehrfacher Spaltung von Meronten. Die Freisetzung von Merozoiten erster Generation zerstört die Wiirtszelle und die Parasiten wandern, um neue Wirtszellen zu infizieren, und erfahren einen zweiten asexuellen Zyklus. Meronten entwickeln sich zum Niveau von Merozoiten zweiter Generation, die bei ihrer Freisetzung weitere Epithelzellen zerstören. Eine weitere Zerstörung von Wirtszellen erfolgt mit der Freisetzung der Merozoiten dritter Generation. Die Anzahl an Merozoiten-Generationen variiert von einer Eimeria-Spezies zur anderen.
Die sexuelle Entwicklung beginnt mit der Produktion von Mikrogameten und Makrogameten durch den Prozeß der Gametogenese. Freigesetzte Mikrogameten befruchten Makrogameten, um Zygoten zu bilden. Der Entwicklung unreifer Oocysten folgt das Aufbrechen der Wirtszelle. In den Hohlraum des Darms freigesetzte Oocysten werden durch den Kot an die Umwelt abgegeben und reifen (sporulieren) in Gegenwart von Sauerstoff der Atmosphäre.
Der Prozeß der Parasitenentwicklung ist selbstbeschränkend, falls der Wirt keine weiteren Oocysten aufnimmt. Dies erweist sich jedoch in übervölkerten Geflügelhäusern als unrealistische Erwartung.
Krankheit aufgrund von Eimeria kann zu schweren wirtschaftlichen Verlusten führen, die mit verringerter Fütterungseffizienz und pathologischen Erscheinungsbildern in Verbindung stehen.
Die Pathologie von Coccidiose aufgrund von E. tenella und E. necatrix ist großenteils mit dem Aufbrechen der Wirtszellen während der Freisetzung von Merozoiten verbunden, wohingegen das Aufbrechen der Wirtszellen während der Freisetzung von E. maxima-Oocysten signifikant zu der bei dieser Spezies sichtbaren Pathologie beiträgt. Eine Blutung innerhalb des Darms ist auf die Ruptur kleiner Kapillargefäße, die das Epithel versorgen, zurückzuführen. Es kann schwierig sein das Fortschreiten der Krankheit mit Hilfe von Coccidiostatika zu kontrollieren, sobald die asexuelle Entwicklung etabliert ist. Oft kompliziert eine Sekundärinfektion die durch Eimeria verursachte Krankheit. Bei infizierten Vögeln, die mit E. tenella oder E. necatrix infiziert sind, kann der Tod innerhalb von 4-7 Tagen eintreten. Als Ergebnis der Infektion durch E. maxima tritt der Tod jedoch selten ein.
Es ist eine durchwegs vorhandene Eigenschaft der Coccidien, daß die Sporozoiten den Infektionsprozeß innerhalb sehr spezifischer Gewebestellen initiieren (39, 45, 57). Die Stellenspezifität der Infektion ist ein charakteristisches Merkmal, das allgemein zur Speziation von Eimeria verwendet wird. Beispielsweise zeigen die asexuellen Stadien von E. necatrix eine Neigung zur Invasion von Epithelzellen, die sich innerhalb des Mitteldarms befinden, während sich die sexuellen Stadien vorwiegend in den Ausstülpungen des Blinddarms entwickeln.
Ein großer Teil der Arbeit bezüglich Immunität gegen Coccidiose beschränkte sich auf humorale Immunität, konkreter auf Serum-Antikörper. Studien haben eine fehlende Korrelation zwischen Serum-Antikörper und Widerstandsfähigkeit gegen die Krankheit gezeigt (59). Die meisten verfügbaren Daten unterstützen jedoch die Annahme, daß eine lokale Antwort unter Beteiligung des sekretorischen Immunsystems oder zellvermittelte Immunität (CMI) oder beide bei der schützenden Antwort beteiligt sind.
Die Störung der Erkennung, des Eindringens und/oder des Anheftens von Pathogenen an Wirtszellen hat eine erwiesene Schutzwirkung, wie bei viralen, bakteriellen und Protozoen-Modellen gezeigt. Eine genetische Deletion von Schlüsselrezeptoren der Wirtszelle oder Pathogenanheftungsmerkmalen kann den anfänglichen Kolonisationsprozeß verhindern (16, 54). Alternativ können sekretorische Antikörper den Kolonisationsprozeß stören, indem sie erforderliche Rezeptoren binden und als Folge maskieren (32, 74). Von mehr als einer Immunglobulin-Klasse wurde berichtet, daß sie die Kapazität zur Störung des anfänglichen Kolonisationsprozesses von Eimeria tenella besitzt (13). Jedoch zeigen kürzliche Berichte an, daß nur die Produktion von sekretorischem IgA mit natürlicher schützender Immunität korreliert worden ist (12, 59). Porter und Davis (13) und andere (59) berichteten, daß sekretorisches IgA die extrazellulären Stadien des Parasiten neutralisiert, indem entweder das Eindringen erheblich eingeschränkt wird oder die eingedrungenen Organismen so geschwächt werden, daß die nachfolgende Entwicklung verhindert wird.
Es wurde geschätzt, daß ein Betrag, der 0,5-1,0 Milliarden Dollar nahekommt, jährlich weltweit von Herstellern ausgegeben wird, um Krankheit zu bekämpfen oder die verheerende Wirkung von Coccidiose bei Hühnchen im Zaum zu halten (39, 52). Sogar mit den gegenwärtig eingesetzten Kontrollmaßnahmen sind die Geflügelverluste erheblich, mit Schätzungen im Bereich von mehreren Millionen Dollar (77).
Gegenwärtig besteht das am häufigsten eingesetzte Mittel zur Kontrolle von Eimeria bei Hühnchen in der Anwendung von chemischen Nahrungszusätzen, die gegen Protozoen gerichtet sind. Die spezielle Zusammensetzung variiert mit den eingesetzten Coccidiostatika und jedes Produkt beeinflußt nur bestimmte Stadien des Lebenszyklus von Coccidien (39, 15, 58). Die Nachteile des Einsatzes von Coccidiostatika sind vielfältig, einschließlich kurzzeitiger Restschutz bei Vögeln, gelegentlich herabgesetzte Leistung, Hervorrufen von Resistenz gegen das Arzneimittel bei Parasiten, und bis zu einem gewissen Grad Sicherheit. Gegenwärtig bleiben die Produkte aufgrund der Entwicklung von arzneimittelresistenten Stämmen nur einige wenige Jahre auf dem Markt. Dies bringt erheblichen zusätzlichen Druck auf die Kosten der Entwicklung und fortgesetzten Herstellung wirksamer Produkte mit sich (51).
Der Schutz von Vögeln durch Immunisierung zeitigte einigen Erfolg. Forscher waren in der Lage, durch Verwendung von Präparationen abgetöteter Organismen einen begrenzten Schutz hervorzurufen (1, 41, 43). Ein wirksamerer Weg zur Immunisierung von Hühnchen bestand in der Verwendung eines Lebendprotozoen-Produkts -- z.B. Coccivac (15). Das Produkt, welches eine multivalente Zusammensetzung darstellt, die niedrige Dosen an lebensfähigen Oocysten enthält, wird in Trinkwasser verabreicht, um bei Vögeln eine milde Parasitemie hervorzurufen. Ein Nachteil dieses Produkts war eine gelegentlich herabgesetzte Leistung von Vögeln während der ersten Wochen nach der Verabreichung. Variable wie eine übermäßige Dosierung oder der Feuchtigkeitsgehalt von Streu haben sogar zu schweren Ausbrüchen von Coccidiose geführt. Siehe auch U.S. Patent Nr. 3 147 186 (1964), welches die Verwendung lebensfähiger, sporulierter Oocysten von E. tenella zur Immunisierung von Hühnchen betrifft, und U.S. Patent Nr.4 301 148 (1981), welches die Verwendung von Sporozoiten von E. tenella für denselben Zweck betrifft.
Ein alternatives Mittel zur Einführung des Lebendimpfstoffes in Hühnerhäusern besteht über die Nahrung. Dies wurde in einem jüngeren britischen Patent (GB 2 008 404A) in Betracht gezogen. Vor der Mischung mit der Nahrung werden vollständig virulente Oocysten von E. tenella als Schutz gegen Austrocknung in einem wasserlöslichen Polysaccharid verkapselt. Die Oocysten sind nur in ausreichenden Mengen vorhanden, um eine subklinische Infektion zu induzieren. Obwohl das Immunisierungsvermögen als ausgezeichnet befunden wurde, ist aufgrund der fraglichen Akzeptanz der Außenwelt keine Entwicklung dieses Verfahrens vorhersehbar. Falls jedoch abgeschwächte Stämme aller wichtigen Coccidien entwickelt werden könnten, mag das Verfahren akzeptabler sein.
Es gab in der Tat Versuche, um Eimeria-Linien mit verringerter Virulenz zu entwickeln. Einige Spezies wurden erfolgreich durch Hühnchenembryo-Passage abgeschwächt (19, 37, 40, 66). Diese Stämme besitzen ein verringertes Vermögen zur Krankheitsverursachung, haben jedoch ausreichend Immunogenizität behalten, um Immunität hervorzurufen. Es bleiben jedoch einige Probleme mit der Handhabung dieser Stämme. Beispielsweise haben die abgeschwächten Varianten von E. necatrix ein kritisches Passagelimit, wodurch mehr oder weniger Embryo- Passage im Verlust von Immunogenizität oder in der Beibehaltung der ursprünglichen virulenten Form resultieren kann. Ferner kehren einige abgeschwächte Organismen nach minimaler Rück-Passage durch Hühnchen zur virulenten Form zurück (38, 68). So bestehen offensichtlich Probleme, die mit der Aufrechterhaltung konsistenter Eigenschaften bei abgeschwächten Organismen verbunden sind.
Eine Abschwächung durch frühzeitige Selektion ist ebenfalls praktiziert worden, wenn Eimeria-Stämme nicht ohne weiteres durch Embryo-enthaltende Eier passiert werden können. Bei diesem Verfahren werden ausgestreute Oocysten spät in der Latenzzeit vor dem Beginn von massiver Oocysten-Ausstreuung geerntet (28, 48, 50, 67). Eine solche Selektion ergibt Kulturen mit kürzeren Lebenszyklen und eine entsprechende Verringerung an Virulenzeigenschaften (28, 48, 50, 67). Obwohl das Merkmal der Frühzeitigkeit für E. tenella (29) und E. aceryulina (49) als genetisch stabil erwiesen wurde, sind nicht genügend Informationen über dieses Verfahren bekannt, um dessen Eignung als Maßnahme in der Geflügelindustrie zu bewerten
Über die Oberflächenantigen-Zusammensetzung von Vogel-Coccidien ist wenig Information verfügbar. Es wurde über Hybridom-Zellinien berichtet, die monoklonale Antikörper sekretieren, welche gegen Antigene auf der Oberfläche von Sporozoiten von Eimeria tenella gerichtet sind (82). Die Antigene wurden nicht identifiziert, mit Ausnahme, daß ihre Molekulargewichte zwischen 13 und 150 Kilodalton lagen. Darüber hinaus wurde den Antigenen keinerlei biologische Bedeutung oder beschriebene Wirksamkeit in einem Impfstoff zugeschrieben. Die europäische Patentpublikation Nr.135 712 offenbart auch monoklonale Antikörper, die mit Sporozoiten von E. tenella reagieren. In dieser Publikation werden E. tenella-Sporozoiten Antigene offenbart. Ferner offenbart die europäische Patentpublikation Nr. 135 073 monoklonale Antikörper, die spezifisch mit Merozoiten und Sporozoiten von E. tenella reagieren. Es werden von E. tenella abgeleitete Merozoiten-Antigene beschrieben.
Frühere Arbeiten im Labor von M.H. Wisher legen die Anwesenheit von etwa 16 Polypeptiden, identifiziert durch Oberflächeniodierung von entkapselten Sporozoiten von E. tenella und mit Molekulargewichten von 20.000 bis mehr als 200.000, nahe (81). Ferner offenbart die europäische Patentpublikation Nr.167 443 Extrakte von Sporozoiten oder sporulierten Oocysten von E. tenella, die als Impfstoffe zum Schutz gegen Coccidiose eingesetzt werden können. Diese Extrakte enthalten eine Vielzahl von Polypeptiden, von denen eines oder mehrere als Antigen zum Schutz gegen Coccidiose eingesetzt werden könnte(n). Ferner offenbart die internationale Publikation Nr. WO/00528 ein kloniertes Gen oder Fragment davon aus E. tenella, welches für antigene Proteine kodiert. Diese Proteine binden an einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, der gegen ein antigenes Protein von Vogel- Coccidien gerichtet ist.
Auf Untereinheiten gerichtete Wege zur Impfstoffentwicklung haben sich in den letzten Jahren als erfolgreich erwiesen. Bei solchen Vorgehensweisen werden mutmaßliche Schutzantigene identifiziert und zum Zwecke einer eventuellen Herstellung in großem Maßstab charakterisiert. Bei der Untersuchung von Parasiten-Antigenen verwendete eine Forschungsgruppe monoklonale Antikörper, um ein potentielles Schutzantigen auf der Oberfläche von Babesia bovis (83) zu identifizieren. Es wurde ein B. bovis-Antigen von 44.000 Dalton identifiziert, das, gereinigt und in Versuchstiere injiziert, ein gewisses Schutzniveau gegen eine primäre Herausforderung ("challenge") ergab. Ein immunologisch bedeutsames 30.000 Dalton-Protein von Toxoplasma gondii wurde ebenfalls unter Verwendung monoklonaler Antikörper identifiziert (31).
Seit Mitte des Jahres 1981 haben Danforth und Mitarbeiter verschiedene Publikationen veröffentlicht, in denen sie auf die Möglichkeit zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Antigene von Vogel Eimeria-Spezies hinwiesen (9, 10, 11). Gleichermaßen demonstrierten Speer et al. (69, 70) die Entwicklung von Hybridomen gegen E. tenella und einige physiologische Eigenschaften davon. Antikörper-sekretierende Hybridome sind auf Basis eines indirekten Fluoreszenz Antikörpertests ausgewählt worden (10). Die Reaktionsmuster, wie mit UV- Mikroskopie beobachtet, variierten in Abhängigkeit von dem eingesetzten monoklonalen Antikörper. Die Muster umfassten eine ausschließliche Reaktion mit nur Sporozoiten gegenüber einer Reaktion mit Sporozoiten und Merozoiten; Anfärbung des vorderen Teils des Sporozoiten gegenüber der gesamten Membran; und Anfärbung bestimmter innerer Organellen gegenüber unspezifischer innerer Anfärbung (11).
Obwohl die Herstellung von Hybridomen mit Mausursprung, die monoklonale Antikörper produzieren, von Fachleuten allgemein praktiziert wird, legt nichts nahe, daß die direkte und spezifische Selektion von Sporozoiten-neutralisierenden Hybridomen gegen die Spezies E. tenella und E. necatrix oder Merozoitenneutralisierenden Hybridomen gegen die Spezies E. maxima anschließend Virulenz-Determinanten dieser Spezies identifizieren wird, die zur Entwicklung eines Untereinheits-Vakzins geeignet sein können.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung, Charakterisierung, Herstellung und Verwendung von Polypeptid-Antigenen zur Entwicklung von Immunität gegen Coccidiose, die von E. tenella und E. necatrix verursacht wird. Es werden auch rekombinante Polypeptid-Antigene, einschließlich Fusionsproteine, beschrieben.
Die Antigene können hinsichtlich des direkten antigenen Gehalts präzise abgegeben zu werden und können keine Krankheit verursachen, wodurch auf den Vakzin-Stamm zurückzuführende Krankheitsausbrüche und Reversionen oder Änderungen der immunologischen Eigenschaften vermieden werden.
Aufgrund der großen wirtschaftlichen Verluste, die durch Coccidiose bei Hühnchen verursacht werden, sind Impfstoffe (Vakzine) gegen E. tenella und/oder E. necatrix wünschenswert. Die Anmelder haben mit Hilfe von Hybridom-Techniken potentielle Schutzantigene zur Verwendung bei Untereinheits-Vakzinen identifiziert und gereinigt. Die Verwendung eines derartigen Untereinheits-Vakzins vermeidet Krankheitsausbrüche, die auf den Vakzin-Stamm zurückzuführen sind und Reversionen oder Änderungen der immunologischen Eigenschaften, die mit der Verwendung eines Lebendimpfstoffes verbunden sind.
Die Menge an Parasiten-Antigenen, die aus dem Organismus hergestellt werden kann, ist ziemlich gering und sehr kostenaufwendig. Rekombinante DNA- Klonierungs- und Expressionstechniken haben einen neuen Weg eröffnet, um große Mengen an Schutzantigenen preiswert herzustellen. In einfachsten Worten erfordern diese Techniken, daß DNA-Sequenzen, die für das gesamte Antigen oder einen Teil davon kodieren, unter der Kontrolle der erforderlichen genetischen Information in eine Zelle eingebracht werden, um das antigene Protein in dieser Zelle zu erzeugen. Die genetische Information kann darstellen synthetische DNA (17), genomische (z.B. virale) oder chromosomale DNA oder aus der mRNA, welche für das Antigen kodiert, hergestellte cDNA. Der letztere Weg ist die direkteste Methode für komplexe Organismen wie Eimeria sp.
Da die cDNA jedoch nur die genetische Information enthält, die der Aminosäuresequenz des Antigens entspricht, muß sie in Expressionsvektoren inseriert werden, welche die für die Expression des cDNA-Gens (d.h. Transkription und Translation) erforderlichen genetischen Signale zur Verfügung stellen. Die Antigene können entweder allein oder als Produkte, die mit einem anderen Protein in E. coli fusioniert sind, synthetisiert werden.
Die Produktion eines wirksamen Untereinheits-Vakzins in E. coli ist für den "Maul- und Klauenseuche"-Virus von Schwein und Rind berichtet worden (33, 66). Oberflächenantigene des "Maul- und Klauenseuche"-Virus wurden als Fusionsprotein-Antigene in E. coli hergestellt. Es wurden erhebliche Niveaus an Virusneutralisierendem Antikörper induziert, wenn Rinder und Schweine mit diesen Antigenen immunisiert wurden. Die rekombinanten DNA-abgeleiteten Antigene boten Schutz gegen eine Herausforderung mit dem "Maul- und Klauenseuche"- Virus.
Im Gegensatz zu einfachen Organismen wie dem "Maul- und Klauenseuche"-Virus bei dem das Genom und die Oberflächenproteine umfassend untersucht wurden, ist sehr wenig über die Molekularbiologie von Eimeria bekannt. Wang und Stotish (79, 80) berichteten über eine schnelle, aber vorübergehende RNA- und Proteinsynthese in E. tenella während der ersten 6-8 Stunden nach der Initiierung von Sporulation und vertraten die These, daß die gesamte Protein- und Nukleinsäure synthese während der Sporulation in diesen ersten wenigen Stunden geschieht. Beispielsweise berichteten Stotish et al. (72) über eine 30.000 Dalton-Glykoprotein Proteinkomponente von Sporozoiten-Membranen, die von unsporulierten Oocysten synthetisiert wurde und später während des Sporulationsprozesses in Sporozoiten- Membranen inkorporiert wurde. Kürzlich berichteten Stotish et al. (73) über die Isolierung und in vitro-Translation von RNA aus unsporulierten Oocysten, Oocysten während der Sporulation und aus Sporozoiten. Die in vitro-Translationsprodukte lagen im Bereich von weniger als 10.000 Dalton bis mehr als 200.000 Dalton. Die Muster der Proteinsynthese, die durch RNA aus unsporulierten bzw. sporulierenden Oocysten gesteuert wurde, waren verschieden, was nahelegt, daß verschiedene RNA-Populationen während der Sporulation existieren könnten.
Um cDNA herzustellen, welche für die antigenen Proteine kodiert, war es erforderlich festzustellen, wann die mRNA, welche für die antigenen Proteine kodiert, während des Lebenszyklus von E. necatrix auftrat. Diese Erfindung betrifft die Isolierung und Charakterisierung von cDNA-Klonen, welche für antigene Proteine kodieren, und die Produktion von gentechnisch manipulierten antigenen Proteinen in E. coli. Sie betrifft auch die Extraktion dieser in E. coli produzierten Proteine aus dem unlöslichen Zustand und das Verfahren, um die Proteine gegen monoklonale Antikörper immunreaktiv zu machen. Schließlich zeigt diese Erfindung die Herstellung und Verwendung der bakteriell erzeugten antigenen Proteine, um Immunität bei Hühnchen gegen Coccidiose, welche von E. tenella und/oder E. necatrix verursacht wird, zu erzeugen.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein gereinigtes antigenes Protein, hier auch als das NA4-Protein oder NA4-Antigen bezeichnet, wurde aus Eimeria necatrix isoliert. Es ist imstande, in einem Hühnchen eine Immunantwort zu induzieren, welche Schutz gegen eine Infektion durch Eimeria necatrix oder Eimeria tenella verleiht. Ein homologes Antigen, das auf E. tenella gefunden wurde, wird als das TA4-Antigen bezeichnet. Das NA4-Protein weist ein Molekulargewicht von etwa 26.000 Dalton auf und ist aus zwei Poiypeptiden zusammengesetzt, die durch eine Disulfidbindung verknüpft sind. Eines der Polypeptide ist durch ein Molekulargewicht von etwa 18.000 und durch eine blockierte N-terminale Aminosäure charakterisiert; das andere Polypeptid ist durch ein Molekulargewicht von etwa 8.000 charakterisiert. Die Aminosäuresequenzen beider Polypeptide sind in Figur 17 angegeben.
Das gereinigte antigene Protein kann hergestellt werden, indem es separat aus den Sporocysten von E. necatrix gewonnen wird. So kann die Antigen-Gewinnung durch Immunaffinitätschromatographie oder Immunpräzipitation unter Verwendung des hochspezifischen monoklonalen Antikörpers Ptn 7.2A4/4, produziert von der Hybridom-Zellinie ATCC Nr. H88561, bewirkt werden. Alternativ kann das Protein hergestellt werden durch Einführung von DNA, welche für das Protein kodiert, in einen geeigneten Wirt, in dem die DNA exprimiert wird und aus dem das Protein gewonnen werden kann.
Aktive Immunität gegen Infektion durch E. necatrix und E. tenella kann einem Hühnchen verliehen werden, indem dem Hühnchen eine effektiv immunisierende Menge des antigenen Proteins verabreicht wird. Vorzugsweise wird das Protein oder ein Fragment davon in einen Impfstoff mit einem geeigneten Träger inkorporiert und geeignete Dosen des Impfstoffs dem nicht-immunen Hühnchen verabreicht.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die Aminosäuresequenz der 17.000 Dalton-Polypeptid komponente des durch Mikrosequenzierung bestimmten E. tenella (TA4)-Antigens. Figur 1 zeigt auch die überlappenden Peptide, welche durch verschiedene chemische und enzymatische Verdauungen erzeugt werden.
Figur 2 zeigt die Restriktionsenzymkarte des genomischen E. tenella-Klons 108-1, der für das TA4-Antigen kodiert. Figur 2 zeigt auch die Position und Orientierung des Gens für das TA4-Antigen innerhalb des 5500 bp langen E. tenella-EcoRI- DNA-Fragments.
Figur 3 zeigt die DNA-Nukleotidsequenz des BgIII-EcoRI-DNA-Fragments des in Figur 2 dargestellten genomischen Klons 108-1. Ferner zeigt Figur 3 die Aminosäuresequenz für das Signalpeptid und die 17.000 Dalton- und 8.000 Dalton- Polypeptidkomponenten des TA4-Antigens. Figur 3 zeigt auch die Introns innerhalb des Gens.
Figur 16 zeigt die Restriktionsenzymkarte des genomischen E. necatrix- Klons 7-49, der für das NA4-Antigen kodiert, und die Position und Orientierung des Gens für das NA4-Antigen innerhalb des 3900 bp langen E. necatrix-EcoRI-DNA- Fragments
Figur 17 zeigt die DNA-Nukleotidsequenz von 2440 Basen des in Figur 16 dargestellten genomischen Klons 7-49. Diese Sequenz umfaßt den gesamten in Figur 16 dargestellten HindIII-BalI-Bereich. Ebenso gezeigt ist die abgeleitete Aminosäuresequenz für das E. necatrix-NA4-Antigen.
Figur 18 zeigt die Aminosäuresequenzhomologie zwischen TA4- und NA4- Antigenen.
Figur 19 zeigt die Homologie der drei Introns innerhalb der E. tenella- und E. necatrix-Gene, welche für die TA4- bzw. NA4-Antigene kodieren.
Figur 20 zeigt schematisch die Konstruktion des rekombinanten Vektors pSMAC.
Figur 21 zeigt schematisch die Konstruktion des rekombinanten Vektors pSS33.
Figur 22 zeigt schematisch die Konstruktion des rekombinanten Vektors pNCD.
Figur 23 zeigt schematisch die Konstruktion der Expressionsvektoren pTDS1(A) und pTDS2(B).
Figur 24 zeigt schematisch die Konstruktion der Expressionsvektoren pDDS1(A) und pDDS2(B).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es ist zu betonen, daß der Ausdruck "antigenes Polypeptid", wie hier verwendet, Präparationen einschließt, die unter nicht-reduzierenden Bedingungen, wie hier beschrieben, hergestellt wurden und gekennzeichnet sind durch die Anwesenheit eines Polypeptids in der Präparation mit einem definierten scheinbaren Molekulargewicht bei SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen. Ist das Polypeptid in solchen Präparationen anwesend, kann das Polypeptid an eine andere Komponente oder an andere Komponenten gebunden sein, z.B. an ein anderes Polypeptid durch eine oder mehrere Disulfidbindung(en), oder es können zwei oder mehr Bereiche innerhalb des Polypeptids aneinander gebunden sein, z.B. durch eine Disulfidbindung. Für diejenigen Präparationen, welche durch die Anwesenheit von Polypeptiden mit scheinbaren Molekulargewichten von 18.000 oder weniger bei SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen gekennzeichnet sind, wird auch der Begriff "Fragment" verwendet, um solche Präparationen unter der Annahme zu beschreiben, daß die Präparationen Aminosäuresequenzen einschließen, die innerhalb des intakten antigenen Proteins enthalten sind. Ferner wird der Begriff "Fragment" verwendet, um Aminosäuresequenzen zu beschreiben, die von dem antigenen Protein durch proteolytische Verdauung abgeleitet sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein gereinigtes antigenes Protein (im folgenden als NA4 bezeichnet) bereit, das imstande ist, in einem Hühnchen eine Immunantwort zu induzieren, die Schutz gegen Infektion durch Eimeria necatrix oder Eimeria tenella verleiht, wobei das Protein ein Molekulargewicht von etwa 26.000 Dalton aufweist und aus zwei Polypeptiden zusammengesetzt ist, die durch eine Disulfidbindung verknüpft sind, wobei eines der Polypeptide durch ein Molekulargewicht von etwa 18.000 Dalton und durch eine blockierte N-terminale Aminosäure und das andere Polypeptid durch ein Molekulargewicht von etwa 8.000 Dalton gekennzeichnet ist.
Antigene Analoga des antigenen 26.000 Dalton-Proteins oder dessen Polypeptidkomponenten von 18.000 Dalton und 8.000 Dalton sind ebenfalls in Betracht gezogen. Der Ausdruck "Analogon", wie hier verwendet, bedeutet jedes Polypeptid welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die von der für das 26.000 Dalton Protein und die 18.000- und 8.000-Dalton-Polypeptide in Figur 17 angegebenen als Ergebnis der Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren abweicht. Ein solches Analogon wird als antigene Eigenschaften beibehaltend betrachtet, soweit es imstande ist, eine Immunantwort zu induzieren, die Schutz gegen E. necatrix oder E. tenella verleiht.
Das NA4-Protein wird hergestellt, indem zuerst Sporocysten von Eimeria necatrix mit einem Detergens unter geeigneten nicht-reduzierenden Bedingungen in Gegenwart von Proteaseinhibitoren in Kontakt gebracht wird, um die Sporocysten- Membranproteine zu solubilisieren. Als nächstes wird das Protein separat aus den solubilisierten Sporocysten-Membranproteinen unter geeigneten nicht-reduzierenden Bedingungen gewonnen. Die Gewinnung kann ausgeführt werden, indem die solubilisierten Sporocysten-Membranproteine durch Chromatographie auf DEAE- HPLC, gefolgt von präparativer SDS-Gelelektrophorese unter geeigneten nicht- reduzierenden Bedingungen partiell gereinigt werden. Die Gewinnung kann auch durch Immunpräzipitation oder Immunaffinitätschromatographie mit monoklonalem Antikörper Ptn 7.2A4/4 (ATCC Nr HB8561) ausgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ein antigenes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die in der Aminosäuresequenz des 26.000 Dalton-NA4-Proteins eingeschlossen ist, welches imstande ist, in einem Hühnchen eine Immunantwort zu induzieren, die Schutz gegen Infektion durch Eimeria necatrix und Eimeria tenella verleiht. Solche Polypeptide umfassen alle Aminosäuresequenzen, die eine antigene Determinante des NA4-Proteins enthalten und imstande sind, eine Immunantwort zu induzieren. Analoga dieses Polypeptids und dagegen genchtete monoklonale Antikörper werden betrachtet. Anti-idiotypische Antikörper gegen die monoklonalen Antikörper werden ebenfalls betrachtet.
Antigene Polypeptide, die eine im NA4-Protein vorhandene Aminosäuresequenz umfassen, können nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden, sie können z.B. chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden, durch rekombinante DNA- Verfahren erzeugt werden, aus dem NA4-Antigen oder aus den Sporocysten oder Sporozoiten von E. necatrix hergestellt werden.
Die Antigene dieser Erfindung können neben einer Aminosäuresequenz, die in der Aminosäuresequenz des NA4-Proteins enthalten ist, ferner eine oder mehrere andere Substanz(en) enthalten, z.B. Polysaccharide wie Dextran, oder andere Aminosäuresequenzen, d.h., Aminosäuresequenzen, die nicht in der in Figur 17 dargestellten Aminosäuresequenz enthalten sind.
Ebenfalls betrachtet wird ein fusioniertes antigenes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche die Aminosäuresequenz des 26.000 Dalton NA4-Proteins und eine zusätzliche Aminosäuresequenz umfaßt, das imstande ist, in einem Hühnchen eine Immunantwort zu induzieren, welche Schutz gegen Infektion durch Eimeria necatrix und Eimeria tenella verleiht. Analoga dieses Polypeptids und dagegen gerichtete monoklonale Antikörper werden betrachtet. Anti-idiotypische Antikörper gegen die monoklonalen Antikörper werden ebenfalls betrachtet.
Das 18.000 Dalton-Polypeptid des NA4-Antigens kann hergestellt werden, indem zuerst Sporocysten von Eimeria necatrix mit einem Detergens unter geeigneten Bedingungen in Gegenwart von Proteaseinhibitoren in Kontakt gebracht wird, um die Sporocysten-Membranproteine zu solubilisieren. Dann wird das Polypeptid separat aus den solubilisierten Sporocysten-Membranproteinen unter geeigneten reduzierenden Bedingungen gewonnen. Dieser Gewinnungsschritt kann beinhalten eine teilweise Reinigung der solubilisierten Sporocysten-Membranproteine durch Chromatographie mit DEAE-HPLC-Chromatographie, gefolgt von präparativer SDS- Gelelektrophorese unter geeigneten reduzierenden Bedingungen.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ein antigenes Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz des 18.000 Dalton-Polypeptids des NA4-Antigens aufweist, das selbst imstande ist, in einem Hühnchen eine Immunantwort zu induzieren, die Schutz gegen Infektion durch Eimeria necatrix und Eimeria tenella verleiht. Ebenfalls betrachtet werden antigene Polypeptide, die Fragmente des 18.000 Dalton-Polypeptids darstellen, oder diejenigen, welche aus dem mit einer zusätzlichen Aminosäuresequenz fusionierten 18.000 Dalton-Polypeptid bestehen. Antigene Analoga jedes dieser Fragmente sowie anti-idiotypische Antikörper, die gegen jedes Fragment entwickelt wurden, werden ebenfalls betrachtet.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung des NA4-Proteins umfaßt die Herstellung eines DNA-Moleküls, welches für das Protein kodiert, die Insertion des DNA- Moleküls in einen geeigneten Expressionsvektor, z.B. einen Vektor, der den PL- oder lac-Promotor enthält, die Einführung des resultierenden Expressionsvektors in einen geeigneten Wirt, z.B. E. coli, unter geeigneten Bedingungen, welche die Expression der DNA und die Produktion des Proteins erlauben, und die Gewinnung des so produzierten Proteins.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung des 18.000 Dalton-Polypeptids des NA4- Antigens umfaßt die Herstellung eines DNA-Moleküls, welches für das Polypeptid kodiert, die Insertion des DNA-Moleküls in einen geeigneten Expressionsvektor, die Einführung des resultierenden Expressionsvektors, z.B. ein Vektor, der den PL- oder lac-Promotor enthält, in einen geeigneten Wirt, z.B. E. coli, unter geeigneten Bedingungen, welche die Expression der DNA und die Produktion des Polypeptids erlauben, und die Gewinnung des so produzierten Polypeptids.
"Messenger"-RNA kann aus Sporocysten zu vielen Zeitpunkten während des Sporulationsprozesses isoliert werden. Diese mRNA-Proben können dann unter Verwendung von in vitro- (44) oder in vivo-Systemen translatiert werden. Die Translationsprodukte können dann unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers (Ptn 7.2A4/4) immunpräzipitiert werden. Die mRNA-Präparation, welche für das NA4-Antigen kodiert, kann dann zur Herstellung doppelsträngiger cDNA eingesetzt werden (44). Diese cDNA kann dann in einen geeigneten Klonierungsvektor inseriert werden, der dann zur Transformation von E. coli eingesetzt werden kann, um eine cDNA-Bank herzustellen. Diese cDNA-Bank kann dann gescreent werden durch Kolonie-Hybridisierungstechniken unter Verwendung von Isotopenmarkierten Oligonukleotidsonden, deren Konstruktion auf der Aminosäuresequenz information der 18.000 Dalton-Polypeptidkomponente des NA4-Antigens beruht Vektor-DNA aus Bakterienkolonien, die Nukleotidsequenzen für das 18.000 Dalton- Polypeptid enthalten, kann dann isoliert und die inserierte Coccidien-DNA sequenziert werden (62).
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein antigenes Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz der 8,000 Dalton-Polypeptidkomponente des NA4-Antigens aufweist und imstande ist, in einem Hühnchen eine Immunantwort zu induzieren, die Schutz gegen Infektion durch Eimeria necatrix oder Eimeria tenella verleiht. Ebenfalls betrachtet werden antigene Polypeptide, die Fragmente des 8.000 Dalton-Polypeptids darstellen, oder diejenigen, welche aus dem mit einer zusätzlichen Aminosäuresequenz fusionierten 18.000 Dalton-Polypeptid bestehen Antigene Analoga jedes dieser Fragmente sowie monoklonale Antikörper gegen jedes Fragment werden betrachtet. Anti-idiotypische Antikörper gegen die monoklonalen Antikörper werden ebenfalls betrachtet.
Ein Verfahren, um einem Hühnchen aktive Immunität gegen Infektion durch Eimeria necatrix oder Eimeria tenella oder eine Kombination beider zu verleihen, umfaßt, daß einem Hühnchen eine effektiv immunisierende Menge des NA4-Proteins, des 18.000 Dalton-Polypeptids, des 8.000 Dalton-Polypeptids, von Fragmenten davon, Fusionsprodukten davon, oder Analoga davon verabreicht werden. Jedes dieser verschiedenen Antigene kann allein oder in Kombination mit einem oder mehreren der anderen Antigene eingesetzt werden. Die Verabreichung dieser Materialien kann dazu verwendet werden, um ein relativ niedriges Immunitätsniveau in einem Hühnchen, das vorher E. tenella oder E. necatrix ausgesetzt war, zu erhöhen, und kann in Wiederholungs ("booster")-Impfungen eingesetzt werden.
Das NA4-Antigen oder irgendeines der antigenen Polypeptide dieser Erfindung kann Hühnchen durch irgendeines von einer Anzahl wohlbekannter Verfahren verabreicht werden. Wünschenswerterweise kann die Verabreichung subkutane oder intramuskuläre Injektion am Nackenrücken beinhalten. Die Antigenmenge, welche eine effektiv immunisierende Menge umfaßt, kann jede Menge von etwa 0,1 Mikrogramm bis etwa 1 mg sein. Die Antigenmenge beträgt vorzugsweise mehr als etwa 10 Mikrogramm. Die bevorzugte Menge an Antigen beträgt etwa 500 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht. Alternativ kann die Verabreichung oral (z.B. mit einer Kapsel) oder wünschenswerterweise durch Injektion (z.B. subkutane intradermale oder vorzugsweise intramuskuläre Injektion) erfolgen. Falls der Verabreichungsmodus eine Injektion beinhaltet, kann jeder pharmazeutisch annehmbare Träger eingesetzt werden. Geeignete Träger umfassen 0,01 bis 0,1 M, vorzugsweise 0,05 M, Phosphatpuffer oder 0,8 Prozent Salzlösung.
Ein Impfstoff, um einem Hühnchen aktive Immunität gegen Infektion durch Eimeria necatrix oder Eimeria tenella oder eine Kombination beider zu verleihen, umfaßt pro Dosis eine effektiv immunisierende Menge des NA4-Proteins, des 18.000 Dalton-Polypeptids, des 8.000 Dalton-Polypeptids, von Fragmenten davon, Fusionsprodukten davon, oder Analoga davon und einen geeigneten Träger. Jedes unterschiedliche Antigen kann allein oder in Kombination mit einem oder mehreren der anderen Antigene eingesetzt werden. Eine effektiv immunisierende Menge liegt typischerweise über etwa 0,1 Mikrogramm/kg Körpergewicht des Hühnchens. Ein Verfahren zum Schutz eines Hühnchens gegen Infektion durch Eimeria necatrix oder Eimeria tenella oder eine Kombination beider umfaßt die Verabreichung einer geeigneten Dosis dieses Impfstoffes an das Hühnchen.
Durch Verabreichung einer geeigneten Dosis eines derartigen Impfstoffes an ein Hühnchen wird das Hühnchen gegen Infektion durch E. necatrix oder E. tenella geschützt. Die Menge an antigenem Material pro Dosis sollte ausreichend sein, um die Produktion von Antikörpern gegen das antigene Material in einem Tier zu induzieren, dem der Impfstoff verabreicht wird. Um einen ausreichenden Grad an immunologischer Antwort, gemessen durch Antikörperproduktion und Schutz, zu ergeben, beträgt die Menge des antigenen Materials pro Dosis wünschenswerterweise mehr als etwa 20,0 Mikrogramm/kg Körpergewicht des geimpften Tieres. So würde die Menge an antigenem Material bezogen auf ein 1-Tag altes Hühnchen von 50 g mehr als etwa 1,0 Mikrogramm betragen. Gegenwärtig bevorzugt ist ein Impfstoff, der 10 Mikrogramm antigenes Material enthält. Im allgemeinen wird das Antigen auf Gewichtsbasis etwa 0,002 Prozent bis etwa 0,2 Prozent des Impfstoffes umfassen und das Dosisvolumen wird etwa 0,1 ml betragen.
Diese Erfindung stellt auch das Nukleinsäuremolekül bereit, welches für das NA4- Protein kodiert und die in Figur 17 angegebene Nukleinsäuresequenz aufweist. Ferner werden cDNA- und mRNA-Moleküle bereitgestellt, die für mindestens einen Teil von NA4 kodieren. Diese Nukleinsäuremoleküle können in ein Klonierungsvehikel inseriert werden, das dann in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden kann. Eine geeignete Wirtszelle würde eine eukaryotische Zelle, z.B. eine Hefezelle oder eine Säugerzelle, sein.
Es werden rekombinante Klonierungsvektoren bereitgestellt, die mindestens einen Teil des cDNA-Moleküls, das für das Protein NA4 kodiert, und Klonierungsvektor- DNA umfassen. Die Klonierungsvektor-DNA ist gekennzeichnet durch die Anwesenheit einer ersten und einer zweiten Restriktionsenzym-Stelle. Die cDNA wird zwischen diese Stellen kloniert.
Die rekombinante Klonierungsvektor-DNA kann Plasmid-DNA sein. Ferner kann die Wirtszelle eine Bakterienzelle sein.
Ein rekombinanter Klonierungsvektor, der Plasmid-DNA und etwa 90 % der cDNA umfaßt, welche für NA4 kodiert, ist konstruiert und als pSMAC bezeichnet worden. Eine E. coli-Wirtszelle, die mit diesem Plasmid transformiert wurde, hat die Bezeichnung JM83/pSMAC erhalten und wurde bei ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. 67241 hinterlegt. Ein weiteres rekombinantes Klonierungsvehikel, das ebenfalls etwa 90 % der für NA4 kodierenden cDNA umfaßt, ist konstruiert und als pSS33 bezeichnet worden. Eine mit diesem Vektor transformierte E. coli-Wirtszelle mit der Bezeichnung JM83/pSS33 ist bei ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. 67242 hinterlegt worden. Ein weiteres rekombinantes Klonierungsvehikel, das etwa 100 % der für das Protein NA4 kodierenden cDNA umfaßt, ist konstruiert und als pNCD bezeichnet worden. Dieses Plasmid wurde dazu eingesetzt, um eine E. coli- Wirtszelle zu transformieren, die als JM83/pNCD bezeichnet und bei ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. 67266 hinterlegt wurde.
Durch die Erfindung werden auch rekombinante Expressionsvektoren bereitgestellt. In einer Ausführungsform sind die rekombinanten Expressionsvektoren imstande, ein fusioniertes Polypeptid zu exprimieren, das mindestens einen Teil des NA4- Proteins und eine weitere Aminosäuresequenz umfaßt. Solche Expressionsvektoren sind konstruiert und als pTDS1, pTDS2, pDDS1 und pDDS2 bezeichnet worden. Diese Plasmide wurden zur Transformation von E. coli-Zellen eingesetzt, welche die Bezeichnung MH1/pTDS1, MH1/pTDS2, MH1/pDDS1 und JM83/pDDS2 erhielten und denen die ATCC-Hinterlegungs-Nrn. 67240, 67264, 67243 bzw. 67265 zugeteilt wurden.
Ein Verfahren zur Herstellung des NA4-Proteins umfaßt die Züchtung von Wirtszellen, welche das oben genannte Klonierungsvehikel inseriert enthalten, unter geeigneten Bedingungen, um die Produktion des Proteins und die Gewinnung des so produzierten Proteins zu erlauben.
Ebenfalls betrachtet wird ein Protein, das im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie das NA4-Protein aufweist, aber aufgrund der Expression in einem bakteriellen oder anderen fremden Wirt Unterschiede aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform ersetzt eine Kompositstruktur, welche räumliche Merkmale aufweist, die mit denjenigen der prinzipiellen Schutzstrukturen des NA4- Antigens übereinstimmen, die oben beschriebenen Antigene. Eine solche Zusammensetzung umfaßt einen anti-idiotypischen Antikörper, der gegen die Strukturen eines Antikörpers gegen das NA4-Protein oder eines der antigenen Polypeptide dieser Erfindung, z.B. des monoklonalen Antikörpers Ptn 7.2A4/4, dessen Strukturen Spezifität für die betreffende Antigen-Determinante verleihen, entwickelt wurde. Solche anti-idiotypische Antikörper können selbst monoklonaler Natur sein oder können als polyklonale Antikörper induziert werden. Im vorherigen Beispiel kann der Antikörper Ptn 7.2A4/4 aus der Hybridom-Zellinie ATCC Nr. HB8561 gewonnen, gereinigt und kovalent mit irgendeinem geeigneten Trägerprotein, z.B. das Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin (KLH), verknüpft werden. Der gereinigte Antikörper, vorzugsweise der gereinigte Antikörper-KLH-Komplex, wird, vorzugsweise mit einem Adjuvans wie Freund'sches vollständiges Adjuvans, wiederholt in einen geeigneten Säuger-Lymphozytendonor injiziert, wobei Mäuse des Balb/C-Stammes die bevorzugten Donoren sind. Hybridome werden aus Lymphozyten der immunisierten Mäuse entwickelt. Die Hybridome werden auf Antikörper gescreent, welche mit dem NA4-Antigen hinsichtlich einer Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 konkurrieren, jedoch weder das NA4- Antigen noch ein anderes Maus-Immunglobulin als Ptn 7.2A4/4 erkennen. Solche Hybridome, die anti-idiotypische Antikörper gegen den monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 sekretieren, werden erweitert und kloniert. Die Produktion von anti- idiotypischem Antikörper kann erzielt werden durch Zellkulturen in jedem Medium, das für die Züchtung von Hybridomen und die Expression von monoklonalen Antikörpern geeignet ist, oder durch das Wachstum von Antikörper-produzierenden Hybridomen in Wirtstieren, wobei Balb/C-Mäuse das bevorzugte Vehikel sind.
Anti-idiotypische Antikörper können auch durch Injektion von Ptn 7.2A4/4 in Tiere produziert werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist die wiederholte Injektion von 500 Mikrogramm Ptn 7.2A4/4, gereinigt und in einem geeigneten Adjuvans, z.B. vollständiges Freund'sches Adjuvans, formuliert, in ein geeignetes Tier, z.B. ein Kaninchen. Nach ausreichenden Injektionen wird solchen Tieren nach einer geeigneten Zeitspanne Blutserum entnommen. Die Anti-idiotypischen Antikörper werden dann aus dem Blutserum gewonnen, z.B. durch Adsorption gegen normale Maus-Serumproteine, die auf einem unlöslichen Träger wie Sepharose mobilisiert sind. Die Spezifität des resultierenden Antiserums wird bestätigt durch den Nachweis von Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4, aber keiner Reaktivität mit normalem Maus-Antikörper.
Die wie oben hergestellten anti-idiotypischen Antikörper werden ferner auf das Niveau von IgG-Fraktionen gereinigt. Gereinigtes anti-idiotypisches Antikörper- Protein kann durch irgendeines von einer Anzahl wohlbekannter Verfahren, wie oben für das Antigen beschrieben, in geeigneter Weise verabreicht werden.
Die Verabreichung einer effektiven Menge des anti-idiotypischen Antikörpers dieser Erfindung an ein Hühnchen stellt ein Verfahren bereit, um dem Hühnchen aktive Immunität gegen Infektion durch Eimeria necatrix oder Eimeria tenella zu verleihen Ein Impfstoff für diesen Zweck umfaßt eine effektiv immunisierende Menge des anti-idiotypischen Antikörpers und einen geeigneten Träger. So stellt die Verabreichung einer geeigneten Dosis eines solchen Impfstoffes an ein Hühnchen ein Verfahren bereit, um das Hühnchen gegen Infektion durch Eimeria necatrix oder Eimeria tenella zu schützen.
Die Menge an anti-idiotypischem Antikörper pro Dosis muß ausreichend sein, um die Produktion eines Antikörpers in einem Tier, dem der Impfstoff verabreicht wird, hervorzurufen. Zur Induktion einer immunologischen Antwort, wie durch Antikörperproduktion gemessen, beträgt die Menge an anti-idiotypischem Antikörper pro Dosis mehr als 50 Mikrogramm/kg Körpergewicht der geimpften Vögel. So würde die Menge an anti-idiotypischem Antikörper, die einem 1-Tag alten Hühnchen von 50 g verabreicht wird, 2,5 Mikrogramm betragen. Gegenwärtig bevorzugt ist ein Impfstoff, der 25 Mikrogramm an anti-idiotypischem Antikörper enthält. Im allgemeinen wird der anti-idiotypische Antikörper auf Gewichtsbasis 0,002 Prozent bis zu 0,2 Prozent des Impfstoffes umfassen und das Dosisvolumen wird 0,2 ml (cc) betragen.
Ein Verfahren, um die DNA zu erhalten, welche die in Figur 17 angegebene Nukleinsäuresequenz aufweist, umfaßt die Isolierung von genomischer Gesamt- DNA aus Eimeria necatrix-Oocysten; die Präparation von DNA-Fragmenten aus der so isolierten genomischen DNA; die Ligierung der so hergestellten Fragmente in einen geeigneten Klonierungsvektor; das Unterwerfen der DNA der so hergestellten Klone einer Hybridisierung mit Oligonukotiden, welche Nukleinsäuresequenzen, die innerhalb der in Figur 17 angegebenen Nukleinsäuresequenz vorhanden sind, enthalten oder dazu komplementär sind, um geeignete Klone zu identifizieren; und die Isolierung von DNA, welche für das Protein kodiert und die in Figur 17 angegebene Nukleinsäuresequenz aufweist, aus den geeigneten Klonen.
Das NA4-Protein ist ein gereinigtes Sporozoiten-Membranprotein, das aus den Sporocysten von E. necatrix stammt. Dieses Protein ist ein Antigen, welches imstande ist, in einem nicht-immunen Hühnchen eine Immunantwort zu induzieren, die Schutz gegen Infektion durch die Darmparasiten E. necatrix und E. tenella verleiht. Obwohl das Protein aus E. necatrix erhalten wurde, wird in Betracht gezogen, daß das Protein nach anderen Verfahren hergestellt werden kann, z.B. rekombinante DNA-Technologie oder organische Totalsynthese, und dementsprechend ist die Erfindung nicht auf Protein beschränkt, welches direkt aus E. necatrix hergestellt wird, sondern umfaßt das Protein an sich, unabhängig von dessen Hersteungsverfahren. Das so hergestellte Protein kann mit der aus Parasiten gereinigten Struktur identisch sein oder es kann als diskrete Fragmente derselben existieren. Es kann auch als Fusion von NA4 mit homologen oder heterologen Sequenzen existieren. Ferner kann es als Analogon oder als inneres Bild (Idiotyp) derselben vorhanden sein.
Das NA4-Protein-Antigen weist ein Molekulargewicht von etwa 26.000 auf und ist aus zwei Polypeptiden zusammengesetzt, die durch eine Disulfidbindung verknüpft sind. Eines der Polypeptide ist gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 18.000 und weist eine blockierte N-terminale Aminosäure auf. Ein CNBr- Fragment von etwa 16.000 Dalton weist die folgende partielle Aminosäuresequenz auf: NH&sub2;-? ? Leu? Lys Ala Ala Gly Leu Pro Glu Phe Gly Asn Ala Val Gly ? Ala Val Val Leu Pro Ala Tyr Ser. Die N-terminale Aminosäuresequenz des 8.000 Dalton-Polypeptids ist: NH&sub2;- Ala Ala ? Thr? Asp Ala Val Ile Cys Leu Thr Asn Pro Ala Pro Leu Ala Ala Gly Ser Pro Pro ? Phe ? Asp Glu ? Trp. Die vollständige Aminosäuresequenz des NA4-Proteins, abgeleitet aus der DNA-Sequenz des für das NA4-Antigen kodierenden Gens, ist in Figur 17 dargestellt. Genomische DNA aus E. necatrix wurde isoliert und mit der Restriktionsendonuklease EcoRI gespalten. Die Restriktionsfragmente wurden in einen geeigneten Kionierungsvektor, λ-gt wes λ-B, ligiert, wodurch eine genomische Genbank erzeugt wurde. Die genomische Genbank wurde dann durch Plaque-Hybridisierung mit einem 785bp SacI-PvuII-Fragment des genomischen E. tenella-Klons von Figur 2 gescreent. Ein genomischer Klon, der für das NA4-Antigen kodiert, wurde isoliert und die DNA-Sequenz zeigte, daß die beiden Peptide des NA4-Antigens durch eine zusammenhängende Nukleotidsequenz kodiert werden (Figur 17). Somit werden die 18.000- und 8.000-Dalton-Peptide durch die proteolytische Prozessierung eines einzigen 26.000 Dalton-Peptids erhalten. Ferner kodiert die DNA-Sequenz für eine "Signal"-Sequenz, die typischerweise am Aminoterminus vieler sekretorischer oder Membranproteine gefunden wird.
Die bakteriellen NA4-Proteine können Hühnchen durch irgendeines einer Anzahl wohlbekannter Verfahren verabreicht werden. Wünschenswerterweise kann die Verabreichung eine subkutane intraperitonale oder intramuskuläre Injektion am Nackenrücken oder irgendeine günstige Form oraler Verabreichung beinhalten. Die Menge an Antigen, welche eine effektiv immunisierende Menge umfaßt, kann jede Menge von etwa 0,1 Mikrogramm bis etwa 1 mg sein. Die Antigenmenge beträgt wünschenswerterweise mehr als etwa 10 Mikrogramm. Die bevorzugte Menge an Antigen beträgt etwa 500 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht. Alternativ kann die Verabreichung oral (z.B. mit einer Kapsel) oder wünschenswerterweise durch Injektion (z.B. subkutane, intradermale oder vorzugsweise intramuskuläre Injektionen) erfolgen.
Falls der Verabreichungsmodus eine Injektion beinhaltet, kann jeder pharmazeutisch annehmbare Träger eingesetzt werden. Geeignete Träger umfassen 0,01 bis 0,1 M, vorzugsweise 0,05 M, Phosphatpuffer oder 0,8-prozentige Salzlösung.
Ein Impfstoff, um einem Hühnchen aktive Immunität gegen Infektion durch Eimeria zu verleihen, wird bereitgestellt, welcher eine effektiv immunisierende Menge eines antigenen Materials dieser Erfindung, d.h., die renaturierten bakteriellen NA4- Proteine, und einen geeigneten Träger umfaßt. Vorzugsweise beträgt die effektiv immunisierende Menge des antigenen Materials in dem Impfstoff mehr als etwa 0,1 Mikrogramm/kg Körpergewicht des Hühnchens.
Ferner enthält der Träger wünschenswerterweise auch ein Konservierungsmittel. Ein besonders geeignetes Konservierungsmittel ist Thimerosal (Natriummethylquecksilberthiosalicylat), das sowohl Aktivität als Bakteriostatikum als auch als Fungistatikum aufweist. Wünschenswerterweise ist Thimerosal in dem Impfstoff in einer Endkonzentration von 10&supmin;&sup4; Prozent vorhanden.
Ferner enthält der Träger wünschenswerterweise auch einen Immunverstärker, d.h., eine Substranz, welche die Immunantwort des behandelten Tieres auf den Impfstoff erhöht, einschließlich Salmonella minnesota-LPS bei 10 Mikrogramm/Dosis. Es können verschiedene auf dem Gebiet bekannte Immunverstärker eingesetzt werden. Das gegenwärtig eingesetzte Adjuvans ist 94 % Drakeol 6-VR, 5 % Arlacel A, 1 % Tween-80. Arlacel A ist ein Mannid-Monoleat (Sandria Corp.). Es ist ein Reizmittel, das in Kombination mit Antigenen eine starke immunverstärkende Aktivität aufweist. Drakeol 6-VR ist ein hypoallergenes Leichtmineralölprodukt (Penreco Corp.). Tween-80 ist ein Monoleat-Derivat von Polyoxyethylsorbit und besitzt Detergens-Eigenschaften. Andere geeignete Träger oder Immunverstärker umfassen Aluminium-Kaliumsulfat, Aluminiumhydroxid, Liganden-findende Untereinheiten von Toxin-Molekülen, Bioadhäsive, Lymphokine und Wasser-in-Öl- Emulsionen.
Durch Verabreichung einer geeigneten Dosis eines derartigen Impfstoffs an ein Hühnchen wird das Hühnchen gegen Infektion durch E. tenella und/oder necatrix geschützt. Die Menge an antigenem Material pro Dosis sollte ausreichen, um die Produktion von Antikörpern gegen das antigene Material in einem Tier zu induzieren, dem der Impfstoff verabreicht wird. Um einen ausreichenden Grad an immunologischer Antwort, gemessen durch Antikörperproduktion und Schutz, zu ergeben, beträgt die Menge des antigenen Materials pro Dosis wünschenswerterweise mehr als etwa 20,0 Mikrogramm/kg Körpergewicht des geimpften Tieres. So würde die Menge an antigenem Material bezogen auf ein 1-Tag altes Hühnchen von 50 g mehr als etwa 1,0 Mikrogramm betragen. Gegenwärtig wird ein Impfstoff bevorzugt, der 10 Mikrogramm antigenes Material enthält. Im allgemeinen wird das Antigen auf Gewichtsbasis etwa 0,002 Prozent bis etwa 0,2 Prozent des Impfstoffes umfassen und das Dosisvolumen wird etwa 0,1 ml betragen.

BEISPIEL 1

PRÄPARATION VON EIMERIA NECATRIX- UND EIMERIA TENELLA- OOCYSTEN, SPOROCYSTEN UND SPOROZOITEN

Coccidien.

Die gereinigten Freiland-Isolate von Eimeria necatrix und Eimeria tenella wurden ursprünglich von Dr. Allen Edgar der University of Auburn bezogen. Die Reinheit eines jeden Isolates wurde durch charakteristische Oocysten-Merkmale und eine Histologie infizierter Darmgewebe bestätigt. Oocystengröße und Form- Index lagen innerhalb des Bereichs von E. necatrix bzw. E. tenella.
Läsionen wurden nach dem Verfahren von Johnson und Reid (30) bewertet. Die Läsionen bei infizierten Vögeln waren für das jeweilige Isolat typisch. Eine histologische Überprüfung fünf Tage nach der Infektion zeigte größere Schizonten der zweiten Generation im Subepithel des Mitteldarms (E. necatrix) oder des Blinddarms (E. tenella). Bei E. tenella und E. necatrix traten während schwerer Infektionen (15.000 bzw. 50.000 Oocysten) Todesfälle auf. Periodisch wurde eine Klonierung einzelner Oocysten durchgeführt, um die Reinheit eines jeden Isolats sicherzustellen.

Vermehrung von Oocysten.

Reine Kulturen eines jedes Isolats wurden routinemäßig in 4-6 Wochen alten SPF-Weiße-Leghorn-Hühnchen passiert. Um externe Coccidien-Infektionen zu vermeiden, wurden die Hühnchen vom ersten Lebenstag in Plexiglas-Isolationseinheiten aufgezogen. Oocysten wurden am Tag 7 nach der Infektion unter Verwendung eines von Shirley (66) beschriebenen Trypsin-Verdauungsverfahrens aus dem Blinddarm geerntet. Sporulierte Oocysten wurden typischerweise bei 24ºC in 2 % w/v K&sub2;Cr&sub2;0&sub7; gelagert.

Isolierung von Sporocysten.

Sporulierte Oocysten (1 x 10&sup8;), die durch Salz- Flotierung teilweise von Debris gereinigt worden waren, wurden 5 mal in 0,1 M phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (PBS) gewaschen, um das Kaliumdichromat-Konservierungsmittel zu entfernen. Diese Oocysten wurden weiter gereinigt durch 20-minütiges Rühren in einer 1,05 % Natriumhypochlorit-Lösung, gefolgt von 5 Waschschritten in PBS, um restliches Natriumhypochlorit und Debris zu entfernen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die gereinigten Oocysten in 10 ml PBS resuspendiert. Die suspendierten Oocysten wurden dann durch Schütteln mit einem gleichen Volumen an Glasperlen (1,0-1,05 mm) mechanisch aufgebrochen. Die freigesetzten Sporocysten wurden von den Oocystenwänden und von nicht aufgebrochenen Oocysten durch Passage über eine Glaswolle-Säule gereinigt bei 3000 UpM 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert und in 10 ml PBS resuspendiert.

Herstellung von Sporozoiten.

Frisch sporulierte Oocysten wurden durch Salz- Flotierung, wiederholtes Waschen und Behandlung mit 1,05 % Natriumhypochlorit- Lösung gereinigt. Die Sporocysten wurden durch mechanisches Aufbrechen von Oocysten mit Glasperlen (1,0-1,05 mm) freigesetzt. Um die Sporozoiten zu entkapseln ("excyst"), wurden die Sporocysten mit Trypsin und Taurodesoxycholsäure (0,25 bzw. 0,50 % w/v) für einen Zeitraum von 1 Stunde bei 41ºC inkubiert. Die so erhaltenen Sporozoiten wurden von der Entkapselungs-Flüssigkeit durch Zentrifugation freigespült und in Hank's Medium resuspendiert. Frisches Hank's Medium wurde zur Verdünnung von Sporozoiten auf die Arbeitskonzentration eingesetzt.

BEISPIEL 2

HERSTELLUNG, IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON HYBRIDOMEN

Monoklonale Antikörper.

Monoklonale Antikörper wurden aus entwickelten Hybridomen unter Verwendung des Verfahrens von VanDeusen und Whetstone (77) erhalten. Kurz gesagt, wurden Balb/C ByJ-Mäuse wiederholt mit 10&sup6;-10&sup7; intakten E. tenella-Sporozoiten immunisiert. Drei Tage nach einer letzten intravenösen Injektion mit intakten Sporozoiten wurde eine willkürlich ausgewählte Maus getötet und einer Splenektomie unterworfen. Die Splenozyten wurden von Fasergewebe im Organ abgetrennt und die gewaschenen Zellen mit der Plasmazytom-Maus-Zellinie (SP2/0M) fusioniert.

Mikroneutralisations-Assay.

Der Mikroneutralisations-Assay wurde mit primären Hühnchennieren-Zellkulturen für E. tenella oder embryonischen Schweinelungenzeilen für E. necatrix durchgeführt. 1-2 Wochen alte Hühnchen wurden getötet und steril einer Nephrektomie unterworfen. Die Zeilen wurden bei einer Dichte von etwa 10&sup4;/Vertiefung in Earle's LAH-Medium, das mit 5 % hitze-inaktiviertem fötalem Kalbsserum ergänzt war, in Kulturen mit 96 Vertiefungen plattiert. Die Kulturen wurden bei 41ºC in einer Atmosphäre von 5 % C0&sub2; gehalten. Als die Zellkulturen ein Niveau von etwa 50% Konfluenz erreichten, wurden 50 Mikroliter Hybridom- Test- oder Kontrollprobe zu allen Vertiefungen der Platte zugegeben. Als nächstes wurden etwa 3 x 10&sup4; Sporozoiten, suspendiert in 50 Mikroliter Earle's Kulturmedium, zu allen Vertiefungen der Platte zugegeben. Zwölf bis sechzehn Stunden später wurde der Kulturüberstand durch frisches Earle's LAH mit 2 % hitze-inaktiviertem fötalem Kalbsserum ersetzt. Die Kulturen wurden 40-44 Stunden nach der Infektion beendet. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Kulturüberstand von den Platten entfernt. Anschließend wurden die Zellen durch die Zugabe von Methanol, der mit 5 % Eisessig angesäuert war, an die Platten fixiert. Die fixierten Kulturen wurden vor der Prüfung mit 0,1 % Toluidinblau gefärbt. Die Vertiefungen wurden hinsichtlich des annähernden prozentualen Niveaus an Schizogonie-Inhibierung bewertet; die Neutralisation von Parasiten durch monoklonale Antikörper wurde bewertet auf der Basis derjenigen maximalen Serumverdünnung, die noch eine vollständige Inhibierung der Schizonten-Entwicklung ergab.

Indirektes Fluoreszenz-Antikörper-Screening.

IFA-Objektträger wurden mit Sporozoiten von E. tenella oder E. necatrix (etwa 1 x 10&sup6;/Vertiefung) präpariert. Die Objektträger wurden mehrere Stunden bis über Nacht an Luft getrocknet bevor 10 Mikroliter 1 % iges Rinderserumalbumin (BSA) zu jeder Vertiefung zugegeben wurden. Fünf Minuten nach der Zugabe von BSA wurden 20 Mikroliter Testüberstand zugegeben. Die Überstände wurden 20 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, gefolgt von drei Spülungen mit 0,15 M PBS mit 0,0005 % Tween-20 (PBS-Tween) Mit Fluoreszein konjugierter Anti-Maus-Kaninchen-Antikörper (1:40 in PBS verdünnt) wurde den Proben zugegeben und 20 Minuten lang bei 37ºC inkubieren gelassen. Das Konjugat wurde dreimal mit PBS-Tween abgespült, bevor Einfassungs-Medium und Deckblättchen hinzukam.

Ergebnis.

Von den mehreren tausend entwickelten Hybridomen gegen Eimeria tenella wurden 24 befunden, neutralisierende Antikörper gegen das Sporozoitenstadium des Parasiten zu produzieren. Alle untersuchten Hybidome produzierten Antikörper, welche membrangebundene Antigene erkannten, obwohl nur der von einem einzigem Hybridom erzeugte Antikörper ein internes Membranantigen erkannte.
Das Neutralisierungsvermögen in vitro wurde für mehrere Überstände nach der anfänglichen Klonierung der jeweiligen Zel linien verglichen. Der Überstand von bestimmten Linien zeigte die größte relative Neigung zur Neutralisation von Sporozoiten von E. tenella. Bei der Bewertung des Antikörpergehalts für jeden der getesteten Überstände wurde festgestellt, daß 20-fach weniger eines Antikörpers (mit der Bezeichnung Ptn 7.2A4/4) zur Neutralisation von Sporozoiten erforderlich war als des zweiteffektivsten neutralisierenden Antikörpers. Konkret beträgt die erforderliche Menge an Ptn 7.2A4/4-Antikörper zur Neutralisation von E. tenella etwa 3,5 x 10&sup5; Moleküle/Sporozoit.
Das Hybridom, welches den monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung Ptn 7.2A4/4 produziert, ist bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, U.S.A. 20852, hinterlegt worden und durch die ATCC-Hinterlegungs-Nr. HB 8561 identifiziert worden. Diese Hinterlegung wurde nach den Vorschriften des Budapester Vertrags für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke eines Patenterteilungsverfahrens (im folgenden "Budapester Vertrag") durchgeführt.
Bei der Bewertung des monoklonalen Antikörpers Ptn 7.2A/4 mit E. necatrix wurde festgestellt, daß sich ein Fluoreszenzfärbungsmuster ähnlich dem bei E. tenella entwickelt hatte. Der monoklonale Antikörper wurde deshalb in dem in vitro Neutralisationsassay gegen E. necatrix untersucht. Es wurde festgestellt, daß dieser monoklonale Antikörper neutralisierende Aktivität gegen E. necatrix bei Niveaus in einem vergleichbaren Bereich besaß wie mit einer ähnlichen Zahl an E. tenella-Sprozoiten beobachtet.

BEISPIEL 3

IDENTIFIZIERUNG DER ANTIGENE VON E. TENELLA, DIE VON DEM NEUTRALISIERENDEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPER pTN 7.2A4/4 ERKANNT WURDEN

I-Markierung von Eimeria-Proteinen.

Eine Gesamtzahl von 2 x 10&sup8; Oocysten aus E. tenella wurden für die Iodierung präpariert. In jedem Fall wurden die Sporocysten aus Salz-flotierten, Natriumhypochlorit-behandelten Oocysten gereinigt, die mit Glasperlen aufgebrochen und dann durch eine Glaswolle-Säule passiert worden waren. Sporocysten-Membranen wurden aus einer Hälfte der Sporocysten präpariert durch mechanisches Aufbrechen in 1 ml 10 mM Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7.2 (PBS) mit Glasperlen in Gegenwart von Proteaseinhibitoren: 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,1 mM N-Tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (TPCK), 1 mM N-alpha-p-Tosyl-L-lysinchlormethylketon (TLCK) und 10 KIE/ml Aprotinin. Die verbleibenden Sporocysten wurden mit Trypsin und Taurodesoxycholsäure (Gesamtvolumen = 1 ml) behandelt, um Sporozoiten zu entkapseln. Beide Präparationen wurden bei 45.000 UpM 45 Minuten lang bei 4ºC pelletiert und in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert. Es wurde darauf geachtet, den gesamten Trypsin-Desoxycholat-Rückstand von den Sporozoiten durch Waschen mit PBS und 1 mM PMSF vor der Ultrazentrifugation zu entfernen.
Die 1ml-Proben wurden in gläserne Szintillationsgefäße eingebracht, die mit 40 Mikrogramm IODOGEN (1,3,4,6-Tetrachlor-3-alpha,6-alpha-diphenylglycouril) als Festphaseniodierungsreagenz beschichtet (24, 53), unter Stickstoffgas getrocknet und mit PBS gespült worden waren. Zu jedem Röhrchen wurden 0,5 mCi an ¹²&sup5;I zugegeben und die Proben 20 Minuten lang auf Eis inkubieren gelassen. Anschließend wurden 100 Mikroliter Kl (1 M) zu jedem Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben, und die Reaktion weitere 15 Minuten auf Eis fortschreiten gelassen. Sporozoiten- und Sporocystenpräparationen wurden dann auf 7 ml mit PBS verdünnt, der 5 mM Kl enthielt, und 45 Minuten lang bei 45.000 UpM bei 4ºC pelletiert.

Extraktion von Sporocysten- und Sporozoiten-Membranproteinen.

¹²&sup5;I-markierte Sporocysten- und Sporozoiten-Pellets aus der obigen Hochgeschwindigkeitszentrifugation wurden in 1 ml Proteinextraktionspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl&sub2;, 25 mM NaCl, 1 % NP40, 1 mM PMSF, 0,1 mM TPCK, 1 mM TLCK und 10 KIE/ml Aprotinin) suspendiert. Die Suspensionen wurden 60 Minuten lang auf Eis unter gelegentlichem mechanischem Aufwirbeln ("vortexing") inkubiert Unlösches Material wurden von dem Detergens-solubilisierten Protein in einer Mikrozentrifuge 15 Minuten lang bei 4ºC abgetrennt. Die Überstände wurden bei -70ºC gelagert.

TCA-Fällung von ¹²&sup5;I-Proteinen.

Zehn Mikroliter jeder Probe wurden in 90 Mikroliter 5 mM Kl verdünnt. Zehn Mikroliter jeder verdünnten Probe wurden dann zu einer Lösung zugegeben, die 1 ml 5 % Trichloressigsäure (TCA), 25 Mikroliter BSA (10 mg/ml) und 5 mM Kl enthielt, und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die gefällten Proben wurden mittels Filtration durch Glasfaserfilter gewonnen, zweimal mit 5 ml 5 % TCA, 5 mM Kl und dreimal mit 5 ml 95 % Ethanol, beides bei 0ºC, gewaschen und in einem Flüssigszintillationszähler gezählt.

Immunpräzipitation mit monoklonalen Antikörpern:

Fünzig Mikroliter monoklonaler Antikörper wurden zugegeben zu 25 Mikroliter Verdünnungspuffer für monoklonalen Antikörper (MAB-DIL): 50 mM Tris-HCl, pH 8,6; 150 mM NaCl; 0,1 % NP-40; 0,1 % BSA, RIA-Grad; 1 mM TLCK; 1 mM PMSF; 10 KIE/ml Aprotinin. Dann wurden 20 Mikroliter an 1-markiertem Protein zugegeben und das Röhrchen mechanisch aufgewirbelt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Anti-Maus-Ig-Kaninchenserum (IgA, IgG, IgM) wurde 1:2 in MAB-DIL verdünnt und 10 Mikroliter zu jedem Immunpräzipitationsröhrchen zugegeben und 1 Stunde lang bei 4ºC inkubiert. Protein A-Sepharose (10 % v/v) wurde 1:4 in Waschpuffer für monoklonalen Antikörper (MABW) verdünnt: 50 mM Tris-HCl, pH 8,3; 0,05 % NP-40; 0,05 % Triton X-100; 150 mM NaCl; 0,02 % NaN&sub3;; 5 mM Kl, und 400 Mikroliter zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden 1 Stunde lang bei 4ºC unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Produkte der Immunpräzipitation wurden zweimal mit kaltem MABW gewaschen, gefolgt von zwei Waschschritten mit MABW bei Raumtemperatur. Das Pellet wurde in 50 Mikroliter SDS-PAGE-Probenpuffer (35) resuspendiert, 5 Minuten lang gekocht und mikrozentrifugiert, um die Protein A- Sepharose zu entfernen. Die Überstände wurden gezählt und mittels SDS-PAGE analysiert.

Elektrophoretischer Transfer von Antigenen auf Nitrocellulosedapier:

Nicht-iodierte Sporozoiten-Membranproteine (wie bereits beschrieben Detergens-solubilisiert) wurden entweder unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen durch eindimensionale Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Plattengele aufgetrennt und elektrophoretisch auf Nitrocellulosepapier überführt (75). Die Elektrophorese-Blots wurden nach dem Verfahren von Sharma et al (64) weiterbehandelt, mit den Ausnahmen, daß Seren, monoklonale Antikörper und die geeigneten Konjugate (Peroxidase-konjugiertes Anti-Hühnchen-Ziegen-IgG, Kirkegaard und Perry, Peroxidase-konjugiertes Anti-Maus-Kaninchen-IgG, Cappel) für Blots reduzierender Gele eingesetzt wurden, und monoklonale Maus-Antikörper in Verbindung mit dem Vectastain-ABC-Kit für Maus-IgG für nicht-reduzierende Gele (Vector Labs, Burlington, CA) eingesetzt wurden. Die Blots wurden entwickelt, indem sie mit 4-Chlor-1-napthol (Sigma; 660 Mikrogramm/ml) und H&sub2;0&sub2; (0,17 %) für reduzierte Auftrennung oder Vectastain-Reagenzien für nicht-reduzierende Auftrennungen umgesetzt wurden.

SDS - Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE) von E .tenella-Proteinen.

Gesamte ¹²&sup5;I-markierte, immunadsorbierte Sporocysten- und Sporozoiten- Membranproteine und immunpräzipitierte Proteine wurden auf exponentiellen 5-25 % igen oder linearen 8-20 % igen SDS-Polyacrylamid-Gradientengelen bei 25 mA analysiert. Die Geie wurden getrocknet und damit über Nacht bei -70ºC ein Kodak XAR-5 X-Röntgenfilm belichtet. Die zum Färben verwendeten Gele wurden durch Coomassie (21) oder durch "silver staining" nach Anweisungen des Herstellers (Pierce Chemical) sichtbar gemacht.
Ergebnisse der Immunpräzipitation von E. tenella-Antigen mit monoklonalem Antikörper Ptn 7.2A4/4. Die oberflächenmarkierte E. tenella-Sporozoiten-Präparation enthält zwei stark iodierte Proteine mit scheinbaren Molekulargewichten von 6.500 und 25.000, wie mit reduzierender SDS-PAGE bestimmt. Das 6.500 Dalton- Protein wird leicht und spezifisch durch den monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 immunpräzipitiert. Die Membranen aus Sporozoiten enthalten zwei stark iodierte Proteine mit scheinbaren Molekulargewichten von 17.000 und 27.000, obwohl mehrere andere weniger iodierte Proteine mit verschiedenen Molekulargewichten ebenfalls vorhanden sind. Nach der Immunpräzipitation von ¹²&sup5;I-markiertem Sporocysten-Membranprotein war das einzige Antigen, welches nach der Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 präzipitierte, das 17.000 Dalton- Protein, wie mit reduzierender SDS-PAGE bestimmt.

Ergebnisse der Western-Blots von E. tenella-Antigenen mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4.

Unter den Bedingungen, unter denen die immunpräzipitierten iodierten Polypeptide mit SDS-PAGE wie oben beschrieben analysiert worden waren, wurden durch Disulfidbindungen verknüpfte Polypeptide getrennt. Jedoch zerstört die Reduktion von Disulfidbindungen die Ptn 7.2A4/4-Reaktivität auf Western-Blots sowohl bei Sporocysten- als auch Sporozoiten-Membranpräparationen. Läßt man iodierte Sporocysten- und Sporozoiten-Membranpräparationen auf SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen laufen, so wandert die radioaktiv markierte Haupt-Spezies mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 23-25.000. Ferner war diese Spezies von scheinbar 23-25.000 Dalton mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 im Western-Blot reaktiv. Diese Ergebnisse legen nahe, daß das 17.000 Dalton-Polypeptid und das 8.000 Dalton-Polypeptid miteinander komplexiert sind, um das TA4-Antigen zu bilden. Die Tatsache, daß diese andere Polypeptidkomponente des TA4-Antigens in Immunpräzipitations- Experimenten von iodiertem Material nicht beobachtet wurde, kann durch die Beobachtung erklärt werden, daß dieses andere Polypeptid keine Tyrosine enthält, die iodiert werden könnten (siehe Beschreibung der 8.000 Dalton-Polypeptid komponente des TA4-Antigens in den Beispielen 5 und 6).

BEISPIEL 4

REINIGUNG, IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES E. TENELLA-TA4-ANTIGENS UND FRAGMENTE-ENTHALTENDER FRAKTIONEN DAVON

Reinigung der 17.000 Dalton-Pedtidkomponente des TA4-Antigens.

Sporulierte E. tenella-Oocysten wurden in 10 ml PBS auf 10&sup9; Oocysten resuspendiert und durch Schütteln mit einem gleichen Volumen an Glasperlen aufgebrochen. Die Membranen wurden durch Zentrifugation (100.000 x g, 60 Min., 4ºC) isoliert und die Proteine in 1 % (v/v) NP-40, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM TLCK, 0,1 mM TPCK und 10 KIE/Ml Aprotinin solubilisiert. Unlösliches Material wurde durch eine weitere Zentrifugation bei 100.000 x g (60 Min., 4ºC) pelletiert. Das Protein wurde an eine DEAE-Cellulose-Säule adsorbiert, die mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,7), 0,05 % NP-40 äquilibriert war, und dann mit diesem Puffer, der 50 mM NaCl enthielt, gewaschen. Nach der Elution mit Puffer, der 200 mM NaCl enthielt, wurde das 17.000 Dalton-Polypeptid durch Acetonfällung konzentriert und der Niederschlag in Auftragspuffer resuspendiert, gekocht und einer Elektrophorese in SDS-Polyacrylamid (15 %) unterworfen. Der bei diesem und anderen Experiment(en) verwendete übliche SDS-PAGE-Probenpuffer enthielt 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 % (w/v) Natriumdodecylsulfat, 10 % (w/v) Glycerin und 0,001 % (w/v) Bromphenolblau. Der Puffer enthielt auch 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol, außer bei Experimenten, in denen nicht-reduzierende Bedingungen angeben sind. Die Bande des 17.000 Dalton-Polypeptids wurde durch Färbung (Coomassieblau oder KCl) identifiziert. Der entsprechende Gelbereich wurde ausgeschnitten, das Protein elektroeluiert und durch Acetonfällung konzentriert. Es ist zu beachten, daß diese Prozeduren Proteine denaturieren und Peptide, welche aneinander durch Disulfidbindungen gebunden sind, durch dieses Verfahren getrennt werden. Das 17.000 Dalton-Polypeptid, welches nach diesem Verfahren gereinigt wurde, war im wesentlichen rein.

Reinigung und Charakterisierung des TA4-Antigens.

Als Alternative zur Reinigung durch Gelelektrophorese wurden die Sporocysten- Membranproteine aus der DEAE-Cellulose-Säule gegen 10 mM Tris-HCl, pH 8 0,05 % NP-40 dialysiert und auf eine DEAE-HPLC-Säule (Biorad) aufgebracht, die in diesem Puffer äquilibriert war. Die Säule wurde mit einem NaCl-Gradienten (0-300 mM) im selben Puffer eluiert. Das 17.000 Dalton-Polypeptid (identifiziert durch seine Wanderung bei Gelelektrophorese) wurde in dem Material gefunden, welches bei 200 mM NaCl eluierte. Fraktionen, welche dieses Protein enthielten, wurden auf eine Hydroxyapatit-Säule (HPHT-BioRad) aufgebracht, die mit 30 mM Kaliumphosphat, pH 6,5, 0,05 % Zwittergent 3-12 (Calbiochem-Behring, LaJolla, CA) 0,1 mM Dithiothreit äquilibriert war. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspuffer gewaschen und mit einem Kaliumphosphat-Gradienten (0-300 mM), der 0.05 % Zwittergent und 0,1 mM Dithiothreit enthielt, entwickelt. Das 17.000 Dalton- Polypeptid (identifiziert durch Gelelektrophorese wie oben beschrieben) erschien in dem Material, welches bei etwa 90 mM Kaliumphosphat eluierte.
Fraktionen, welche das nach diesem Verfahren gereinigte 17.000 Dalton-Polypeptid enthielten, enthielten auch ein zweites Peptid von 8.000 Dalton. Dieses Peptid scheint durch eine Disulfidbrücke mit dem 17.000 Dalton-Polypeptid verknüpft zu sein. Wurden die Fraktionen, welche das 17.000 Dalton-Polypeptid enthielten, mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 immunpräzipitiert und die präzipitierten Proteine durch Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen (wie oben) analysiert, scheinen sowohl das 17.000- als auch das 8.000 Dalton-Polypeptid immunpräzipitiert zu werden. Somit scheinen bei Sporocysten-Membranpräparationen die 8.000 Dalton- und 17.000 Dalton-Polypeptide durch eine Disulfidbindung (mutmaßlich durch eine Cysteinbrücke) verknüpft zu sein, da die beiden Peptide bei der Elektrophorese nicht erschienen, wenn kein starkes Reduktionsmittel anwesend war. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen wandert die mit Ptn 7.2A4/4 reaktive Spezies mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 21-24.000.

Präparation des 11.500 Dalton-Fragments des TA4- Antigens.

E. tenella-Sporocysten-Membranen wurden wie oben beschrieben präpariert und in 10 ml PBS + 1 % Triton X-100 resuspendiert. Zu dieser Membran-Suspension von 10 ml wurden 10 ml 80 % iges Phenol, das 0,1 % 8-Hydroxychinolin enthielt, zugegeben. Die Suspension wurde dann 3 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit mechanisch aufgewirbelt ("gevortext") und zehn Minuten lang bei 4.000 UpM zentrifugiert. Das Phenol und die flockige Grenzfläche wurden entfernt und in 5 Volumina an 100 mM Ammoniumacetat in Methanol verdünnt und über Nacht bei -20ºC ausfällen gelassen. Nach zwei Waschschritten in Aceton wurden die unlöslichen Proteine 8 Stunden lang in 0,5 % SDS gerührt und unlösliche Materialien durch einstündige Zentrifugation bei 20.000 UpM und 4ºC entfernt. Die Probe wurde extensiv gegen PBS (pH 7,2), der AG 501-X8 Mischbettharz enthielt (1 g/500 ml), dialysiert. Das 11.500 Dalton-Fragment des TA4-Antigens wurde dann unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers Ptn 7.2A4/4 wie folgt aus dem Überstand immunadsorbiert. Durch Mikrotiterplatten-ELISA wurde gezeigt, daß dieses Polypeptid mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 reagieren konnte.
Für den Mikrotiterplatten-ELISA wurden Polystyrol-Cluster von 96 Vertiefungen (Immulon II) mit Antigen in 10 mM Glycin-gepufferter Salzlösung, pH 9.6 sensibilisiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit 0,15 M PBS mit 0,0005 % Tween-20 gewaschen, mit 3 % BSA in PBS-Tween blockiert, erneut gewaschen und mit monoklonalem Antikörper Ptn 7.2A4/4, der mit PBS verdünnt war, inkubiert. Die Vertiefungen wurden wie zuvor gewaschen und dann mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus-IgG-Kaninchenserum, das mit PBS verdünnt war, inkubiert. Die Vertiefungen wurden erneut gewaschen und dann mit Substrat (2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfonat]) in Gegenwart von H&sub2;0&sub2; inkubiert. Die Farbentwickung wurde mit einem Dynatech MR-580 Mikrotiterplatten- ELISA-Ablesegerät nach 15 Minuten bestimmt. Durch Mikrotiterplatten-ELISA wurde gezeigt, daß das 11.500 Dalton-Fragment des TA4-Antigens mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 reagieren konnte.

BEISPIEL 5

AMINOSÄURESEQUENZ DER 17.000- UND 8.000 DALTON- PEPTIDKOMPONENTEN DES E. TENELLA-TA4-ANTIGENS

Aminsäuresequenz der 17.000 Dalton-Peptidkomponente des TA4-Antigens.

Die Aminosäuresequenzierung des 17.000 Dalton-Peptids wurde durch den Befund kompliziert, daß die N-terminale Aminosäure blockiert war (d.h. für Edman-Abbau nicht zugänglich (14)). Um dieses Problem zu umgehen, wurde das Protein reduziert und alkyliert und dann mit verschiedenen Chemikalien und Enzymen verdaut. Die resultierenden Peptide wurden durch "reversed phase"-HPLC gereinigt (26). Das 17.000 Dalton-Polypeptid oder das TA4-Antigen wurde mit CNBr (CN), V8 Protease (V), Chymotrypsin (CH) und Endoprotease Arg-C (R) verdaut.
Vor der Protease-Verdauung wurde das gereinigte 18.000 Dalton-Polypeptid oder das TA4-Antigen mit 30 mM Dithiothreit, 6 M Guanidin-HCl (pH 8) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur behandelt. Festes Iodacetamid wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben, der pH erneut auf auf 8 eingestellt und die Probe 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Reduktion und Alkylierung wurde die Proben entweder durch P6DG- (BioRad, Richmond, CA) Schleuder-Säulen, die in 0,1 M MOPS, pH 7,5, 0,1 % SDS äquilibriert waren, oder durch "reversed phase"-HPLC von Reagenzien gereinigt.
Zur CNBr-Verdauung wurde die Proteinprobe mit 1 % CNBr in 70 % Ameisensäure 20 Stunden lang bei 4ºC behandelt. Die Probe wurde bis zur Trockne in einer Savant-Speedvac-Zentrifuge eingedampft und in 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) oder 0.1 % TFA, 20 % Acetonitril (CH&sub3;CN) erneut gelöst. Die VB-Verdauung wurde in 0.1 % SDS, 0,1 M MOPS pH 7.5, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur bei einem Verhältnis von 50 Mikrogramm 17.000 Dalton-Polypeptid : 1 Mikrogramm V8 durchgeführt. Nach der Verdauung wurden die Proben mit 4 Volumina Aceton bei -20ºC über Nacht gefällt. Die Aceton-Niederschläge wurden wie oben beschrieben erneut gelöst. Die Chymotrypsin-Verdauung wurde in 0.05 % Zwittergent 3-12, 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 7,8 eine Stunde lang bei 37ºC bei einem Verhältnis von 50:1 von 17.000 Dalton-Peptid: Chymotrypsin durchgeführt. Die Proben wurden zur Peptidreinigung mit TFA angesäuert. Die Arg-C-Verdauung wurde in 0,05 % Zwittergent 3-12, 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; pH 7,8, zwei Stunden lang bei 37ºC bei einem Verhältnis von 15:117.000 Dalton-Peptid : Arg-C durchgeführt. Nach Acetonfällung über Nacht bei -20ºC befanden sich die Peptide hauptsächlich im Acetonüberstand. Der Überstand wurde verdampft und die Proben wie oben beschrieben erneut gelöst. Die Peptide wurden auf einer Vydac C4-Säule (the Separations Groups, Inc., Hesperia, CA) gereinigt und mit einem 0-100 % CH&sub3;CN-Gradienten in 0,1 % TFA eluiert.
Die Aminosäuresequenzierung wurde unter Verwendung eines Gasphasensequenators (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) nach dem Verfahren von Hunkapiller et al (25) durchgeführt. Phenylthiohydantoin (PTH)-derivatisierte Aminosäuren wurden durch HPLC analysiert (8).
Die N-terminale Aminosäure wurde direkt durch Entfernung des Blockierungsmittels bestimmt. Das 17.000 Dalton-Peptid wurde mit Pyroglutamataminopeptidase (5:1 Protein:PAP) in 0.1 M Kaliumphosphat (pH 8,0), 10 mM EDTA, 5 % Glycerin, 5 mM Dithiothreit, 0,05 % Zwittergent 3-12 1 Stunde lang bei 37ºC behandelt. Nach der Behandlung konnte die Aminosäuresequenz direkt bestimmt werden, was nahelegt, daß die N-terminale Aminosäure Glutamin cyclisiert ist, um den blockierten Rest Pyrrolidoncarbonsäure zu bilden.
Die vollständige Aminosäuresequenz für die 17.000 Dalton-Peptidkomponente des TA4-Antigens ist in Figur 1 dargestellt.
Partielle Aminosäuresequenz der 8.000 Dalton-Peptidkomponente des TA4- Antigens. Als das gereinigte 8.000 Dalton-Peptid (aus dem TA4-Antigen durch Reduktion und Alkylierung erhalten) einer Edman-Sequenzierung unterworfen wurde, konnte die N-terminale Aminosäuresequenz direkt bestimmt werden. Eine partielle Aminosäuresequenz des N-terminalen Bereichs des Peptids ist unten gezeigt.
NH&sub2; - Ala Ala Gly Thr Thr Asp Ala Val Ile Cys Leu Thr Asn Pro Ala Pro Leu Glu Ala Arg Ser Gln Pro Phe Asp Asp Glu

BEISPIEL 15

VERWENDUNG DES E. TENELLA-TA4-ANTIGENS UND EINES 11.500 DALTON-FRAGMENTS DAVON, UM EINE SPOROZOITEN- NEUTRALISIERENDE SERUMANTWORT UND SCHUTZANTWORT GEGEN E. TENELLA IN HÜHNCHEN HERVORZURUFEN

Hervorrufen einer Sporozoiten-neutralisierenden Serumantwort gegen E. tenella unter Verwendung des TA4-Antigens.

Das bei diesen Experimenten verwendete TA4-Antigen wurde aus Sporocysten nach den in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren für die Präparation des nicht-reduzierten intakten TA4-Antigens präpariert. Die Reinheit und Identität des Proteins wurde durch SDS-PAGE und Immunreaktivität mit monoklonalem Antikörper Ptn 7.2A4/4 vor der Verwendung in Hühnchen bestätigt.
Impfstoffpräparationen wurden bei einem Niveau von einem Volumen Antigen zu drei Volumina Öl-Träger, bestehend aus etwa 5 % Arlacel A, 94 % Drakeol 6-VR, 1 % Tween 80, formuliert, so daß jede 0,1 ml-Dosis etwa 15 Mikrogramm TA4- Antigen enthielt. Erforderlichenfalls wurde das Antigen mit PBS (pH 7,2) auf das für die Formulierung gewünschte Niveau verdünnt. Hühnchen erhielten eine 0,1 ml- Dosis auf intramuskulärem Wege in den Nackenmuskel. Das Antigen wurde zwei weitere Male auf demselben Wege unter Verwendung derselben Menge in zweiwöchigen Intervallen verabreicht.
Drei Tage vor jeder Proteinverabreichung und 11 Tage nach der letzten Verabreichung wurde den Vögeln zur Gewinnung von Serumproben Blut abgenommen. Hitze-inaktivierte Seren wurden in dem Sporozoiten-Mikroneutralisations-Assay, wie in Beispiel 2 beschrieben, unabhängig getestet. Die Neutralisation von Parasiten durch Serum wurde bewertet auf der Basis der maximalen Serumverdünnung, die 50 % Inhibierung der Schizonten-Entwicklung ergab.
Die in Tabelle I unten angegebenen Ergebnisse zeigen, daß Vögel, die drei Dosen des Antigens erhielten, nachweisbar neutralisierende Antiserum-Titer besaßen, während nicht-geimpfte Vögel, die nur Träger erhielten, keine nachweisbaren neutralisierenden Antiserum-Titer gegen E. tenella-Sporozoiten aufwiesen. Tabelle I TA4-Antigen-induzierte Sporozoiten-Neutralisations-Assay-Daten Sporozoiten-Neutralisations-Titer (ND 50 %)d
a Seren aus Vögeln innerhalb jeder Behandlungsgruppe wurden vereinigt und getestet
b N.D. = Keine nachweisbare Neutralisation
c Vereinigtes Serum von mehreren Vögeln
d 50 % Neutralisierungsdosis
Hervorrufen einer Schutzantwort in Hühnchen unter Verwendung des TA4- Antigens. Dreiundsechzig (63) Tage nach der letzten Impfung wurden einige Vögel oral mit 1.000 sporulierten E. tenella-Oocysten herausgefordert. Dem folgten am nächsten Tag 3.000 sporulierte E. tenella-Oocysten, die ebenfalls oral verabreicht wurden. Blinddarmläsionen wurden 5 Tage nach der letzten Herausforderung bewertet. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle II aufgelistet. Tabelle II Schutz von mit TA4-Antigen-geimpften Vögeln gegen E. tenella-Coccidiose

Hervorrufen einer Sporozoiten-neutralisierenden Serumantwort gegen E. tenella unter Verwendung des 11.500 Dalton-Fragments des TA4-Antigens.

Das bei diesen Experimenten eingesetzte Immunogen wurde aus Sporocysten durch Phenolextraktion wie in Beispiel 4 beschrieben präpariert. Reinheit und Identität des Proteins wurde durch SDS-PAGE und Immunreaktivität mit monoklonalem Antikörper Ptn 7.2A4/4 vor der Verwendung in Hühnchen bestätigt.
Lyophilisiertes gereinigtes Antigen wurde in 0,15 M phosphatgepufferter Salzlösung gelöst und emulgiert in drei Teilen Träger, bestehend aus etwa 5 % Arlacel A, 94 % Drakeol 6-VR, 1 % Tween-20, bei einer Antigen-Endkonzentration von 70 Mikrogramm/ml. Die Hühnchen erhielten eine Dosis von etwa 14 Mikrogramm Protein/0,2 ml (cc) auf intramuskulärem Wege in den Nackenmuskel. Das Antigen wurde zwei Wochen später erneut auf demselben Wege unter Verwendung derselben Menge verabreicht.
Einen Tag vor jeder Proteinverabreichung und 2 Wochen nach der zweiten Verabreichung von Protein, wurde den Vögeln zur Gewinnung von Serumproben Blut abgenommen. Hitze-inaktivierte Seren wurden in dem Sporozoiten-Mikroneutralisations-Assay, wie in Beispiel 2 beschrieben, unabhängig getestet.
Die unten in Tabelle III angegebenen Ergebnisse zeigen, daß Vögel, die zwei Dosen Antigen erhielten, nachweisbare neutralisierende Antiserum-Titer von bis zu 1:81 besaßen, während nicht-geimpfte Vögel, die nur Träger erhielten, keine nachweisbaren neutralisierenden Antiserum-Titer gegen E. tenella-Sporozoiten aufwiesen. Tabelle III Sporozoiten-Neutralisations-Assay-Daten Sporozoiten-Neutralisations-Titer (N D 50%)a
* 5 Vögel pro Gruppe
** Vereinigtes Serum von mehreren Vögeln
a 50 %-Neutralisierungsdosis

Hervorrufen einer Schutzantwort in Hühnchen unter Verwendung des 11.500 Dalton-Fragments des TA4-Antigens.

Die Vögel erhielten etwa 3 Mikrogramm Antigen in dem obigen Träger einmal in den Nackenmuskel. Eine zweite Gruppe von Vögeln erhielt nur die Trägersubstanz. Eine letzte Gruppe nicht-geimpfter (Kontroll-) Vögel wurde mit jeder der beiden vorgenannten Gruppen zusammen gehalten. Die Vögel wurden Coccidien ausgesetzt, indem sie in mit E. tenella kontaminierten Käfigen gehalten wurden. Etwa zwei Wochen später wurden die Vögel überprüft und festgestellt, daß sie durch E. tenella infiziert worden waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV unten dargestellt. Tabelle IV Schutz geimpfter Vögel gegen Coccidiose durch E. tenella
Da die oben beschriebenen Bedingungen die natürliche Expositionsweise durch E. tenella im Freiland sehr weitgehend nachahmen, zeigen die präsentierten Daten einen klaren Beweis für die Eignung der Erfindung zum Schutz gegen auf E. tenella zurückzuführende Coccidiose.

Nachweis, daß neutralisierende Serumantikörper von Hühnchen die 17.000 Dalton Polypeptidkomponente des TA4-Antigens erkennen.

Eine Analyse der Serumantikörper-Spezifität für die 17.000 Dalton-Polypeptidkomponente des TA4-Antigens wurde unter Verwendung von Western-Blots durchgeführt (7, 59). Es zeigte sich, daß alle Hühnchenseren mit nachweisbaren Neutralisations-Titern gegen E. tenella-Sporozoiten Immunglobuline mit Spezifität für die 17.000-Dalton- Peptidkomponente des TA4-Antigens besaßen; umgekehrt besaßen keine Seren von nicht-antwortenden oder Kontroll-Vögeln Spezifität für das 17.000 Dalton- Polypeptid oder irgend ein anderer Sporozoiten-Protein.

Nachweis, daß neutralisierende Serumantikörper von Hühnchen mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 konkurrieren.

Seren von geimpften Vögeln mit nachweisbaren Neutralisations-Titern gegen E. tenella-Sporozoiten sowie entsprechende Kontrollseren wurden auf das Vermögen getestet, mit dem Antikörper Ptn 7.2A4/4 um Bindungsstellen auf Sporozoiten-Membranen zu konkurrieren. Polystyrol-Cluster von 96 Vertiefungen (Immulon II) wurden mit 50 Mikroliter von Sporozoiten-Membranproteinen in 10 mM Glycin-gepufferter Salzlösung, pH 9,6, bei einem Niveau von etwa 100 Mikrogramm Gesamtprotein/ml sensibilisiert. Zweifache Reihenverdünnungen von Seren wurden in 0,15 M phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,0005 % Tween-20, die eine 1:80-Verdünnung von alkalischer Phosphatase in Konjugation an Ptn 7,2A4/4 enthielt, hergestellt und dann auf die sensibilisierten Platten in einem Endvolumen von 75 Mikroliter/Vertiefung überführt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC wurden die Platten mit PBS-Tw von nicht umgesetzten Materialien freigespült. Anschließend wurde Substrat, bestehend aus dem Natriumsalz von P-Phosphonitrophenol, das in 1 M Diethanolamin-Puffer bei einem Niveau von 1 mg/ml gelöst war, zu jeder Vertiefung der Platte bis zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern zugegeben. Das resultierende Reaktionsprodukt wurde spektralphotometrisch überwacht. Mit der Untersuchung konnte sichergestellt werden, daß Seren aus Vögeln, welche auf die Impfung antworteten, wie durch Neutralisation und Immunoblots nachgewiesen, auch Antikörper enthielten, der mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 konkurrierte. Dieses Experiment bietet einen direkten Beweis, daß ein Antigen, welches aus Sporozoiten-Membranen durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von monoklonalem Ptn 7.2A4/4 oder durch übliche Chromatographie gereinigt wurde, imstande ist, in Hühnchen eine Immunantwort gegen das Epitop zu stimulieren, welches durch den monoklonalen Ptn 7.2A4/4 definiert ist.

BEISPIEL 16

VERWENDUNG VON E. TENELLA-PROTEIN, UM EINE SPOROZOITEN- NEUTRALISIERENDE SERUMANTWORT GEGEN E. NECATRIX IN HÜHNCHEN HERVORZURUFEN

Hitze-inaktivierte Seren aus Vögeln, die mit der 11.500 Dalton enthaltenden Präparation des E. tenella-TA4-Antigens (Beispiel 4) geimpft worden waren, wurden vereinigt und in dem Neutralisations-Assay (Beispiel 2) getestet, wobei embryonische Schweinelungen-Zellen ersetzt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle V unten aufgeführt. Tabelle V
Die Daten demonstrieren die Entwicklung eines erhöhten Serum-Neutralisations- Titers gegen E. necatrix, wenn Vögel das gereinigte 11.500 Dalton-Fragment des TA4-Antigens erhalten. Da vorher gezeigt wurde, daß die Verabreichung des TA4- Antigens zur Erhöhung von Serum-Neutralisations-Titern gegen E. tenella führt, und daß die Verabreichung des TA4-Antigens Schutz vor einer E. tenella-Heraus forderung ergibt, und da E. necatrix-Sporozoiten-Neutralisations-Titer durch die Verabreichung von TA4-Antigen erhöht werden, würde ein Fachmann voraussagen, daß die Verabreichung des TA4-Antigens auch Schutz gegen eine E. necatrix- Herausforderung ergeben wird.

BEISPIEL 20

IDENTIFIZIERUNG DER ANTIGENE VON E. NECATRIX, DIE VON DEM MONOKLONALEN ANTIKÖRPER PTN 7.2A4/4 ERKANNT WERDEN

¹²&sup5;I-Markierung von Eimeria-Proteinen. Eine Gesamtzahl von 2x10&sup8; Oocysten aus E. necatrix wurden für die Iodierung vorbereitet. In jedem Fall wurden Sporocysten aus salzflotierten, Natriumhypochlorit-behandelten Oocysten gereinigt, die mit Glasperlen aufgebrochen und dann durch eine Glaswolle-Säule passiert worden waren. Sporocysten-Membranen wurden hergestellt aus einer Hälfte der Sporocysten durch mechanisches Aufbrechen in 1 ml PBS mit Glasperlen in Gegenwart von Proteaseinhibitoren 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,1 mM N-Tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (TPCK), 1 mM N-alpha-p-Tosyl-L-Lysinchlormethylketon (TLCK) und 10 KIE/ml Aprotinin. Die verbleibenden Sporocysten wurden mit Trypsin und Taurodesoxycholsäure (Gesamtvolumen = 1 ml) behandelt, um die Sporocysten zu entkapseln. Beide Präparationen wurden 45 Minuten lang bei 45.000 UpM und 4ºC pelletiert und in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert. Es wurde darauf geachtet, den gesamten Trypsin - Desoxycholat-Rückstand durch Waschen mit PBS und 1 mM PMSF vor der Ultrazentrifugation von den Sporozoiten zu entfernen.
Die 1 ml-Proben wurden in gläserne Szintillationsgefäße eingebracht, die mit 40 Mikrogramm IODOGEN -Festphaseniodierungsreagenz beschichtet (24, 53), unter Stickstoffgas getrocknet und mit PBS gespült worden waren. Zu jedem Röhrchen wurden 0,5 mCi an ¹²&sup5;I zugegeben und die Proben 20 Minuten lang auf Eis inkubieren gelassen. Danach wurden 100 ml Kl (1 M) zu jedem Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben und die Reaktion weitere 15 Minuten auf Eis fortschreiten gelassen. Die Sporozoiten- und Sporocysten- Präparationen wurden dann mit PBS, der 5 mM Kl enthielt, auf 7 ml verdünnt und 45 Minuten lang bei 4ºC und 45.000 UpM pelletiert.

Extraktion von Sporocysten- und Sporozoiten-Membranproteinen

¹²&sup5;I-markierte Sporocysten- und Sporozoiten-Pellets aus der obigen Hochgeschwindigkeitszentrifugation wurden in 1 ml Proteinextraktionspuffer resuspendiert. Die Suspensionen wurden 30 Minuten lang auf Eis unter gelegentlichem mechanischem Aufwirbeln ("vortexing") inkubiert. Unlösliches Material wurde aus dem Detergens-solubilisierten Protein in einer Mikrozentrifuge 15 Minuten lang bei 4ºC abgetrennt. Die Überstände wurden bei -70ºC gelagert.

TCA-Fällung von ¹²&sup5;I-Proteinen.

10 Mikroliter einer jeden Probe wurden in 90 Mikroliter 5mM Kl vedünnt. 10 Mikroliter jeder verdünnten Probe wurden dann einer Lösung zugegeben, die 1 ml 5 % Trichloressigsäure (TCA), 25 Mikroliter BSA (10 mg/ml) und 5 mM Kl enthielt, und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die gefällten Proben wurden mittels Filtration durch Glasfaser-Filter gewonnen, zweimal mit 5 ml 5 % TCA, 5 mM Kl gewaschen und dreimal mit 5 ml 95 % Ethanol gewaschen, beides bei 0ºC, und 10 Minuten lang in einem Flüssigszintillationszähler gezählt.

Immunpräzipitation mit monoklonalen Antikörpern:

Fünfzig Mikroliter monoklonaler Antikörper wurden zu 25 Mikrolitern MAB-DIL zugegeben. Dann wurden 20 Mikroliter von mit ¹²&sup5;I-markiertem Protein zugegeben und das Röhrchen "gevortext" und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Anti-Maus-Ig-Kaninchenserum (IgA, IgG, IgM) wurde 1:2 in MAB-DIL verdünnt und 10 Mikroliter zu jedem Immunpräzipitations-röhrchen zugegeben und 1 Stunde bei 4ºC inkubiert. Es wurde Protein A-Sepha-rose (10% v/v), 1:4 verdünnt, zugegeben und die Röhrchen 1 Stunde lang bei 4ºC unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Produkte der Immunpräzipitation wurden zweimal mit kaltem MABW gewaschen, gefolgt von 2 Waschschritten mit MABW bei Raumtemperatur. Das Pellet wurde in 50 Mikroliter SDS-PAGE-Probenpuffer (35) resuspendiert, 5 Minuten lang gekocht und einer Mikrozentrifugation unter-worfen, um die Protein A-Sepharose zu entfernen. Die Überstände wurden auf radioaktive Zählimpulse untersucht und durch SDS-PAGE analysiert.

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von E. Necatrix-Proteinen.

Gesamte ¹²&sup5;I-markierte, immunadsorbierte Sporocysten- und Sporozoiten- Membranproteine, und immunpräzipitierte Proteine wurden auf exponentiellen 5-25 % igen oder linearen 8-20 % igen SDS-Polyacrylamid-Gradientengelen bei 25 mA analysiert. Die Gele wurden getrocknet und damit über Nacht bei -70ºC ein Kodak XAR-5-Röntgenfilm belichtet. Die zur Färbung verwendeten Gele wurden mit Coomassie (21) oder "silver staining" nach Anweisungen des Herstellers (Pierce Chemical) sichtbar gemacht.

Ergebnisse der Immunpräzipitation von E. Necatrix-Antigen mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4.

Die oberflächenmarkierte E. necatrix-Sporozoiten-Präparation enthält zwei stark iodierte Proteine mit scheinbaren Molekuargewichten von etwa 6.500 und 25.000, wie durch reduzierende SDS-PAGE bestimmt. Das 6.500 Dalton-Protein wird leicht und spezifisch mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 immunpräzipitiert. Membranen aus Sporocysten enthalten zwei stark iodierte Proteine mit scheinbaren Molekulargewichten von etwa 18.000 und 26.000, obwohl mehrere andere weniger iodierte Proteine mit verschiedenen Molekulargewichten ebenfalls anwesend sind. Nach der Immunpräzipitation des ¹²&sup5;I-markierten Sporocysten-Membranproteins war das einzige Antigen, welches nach der Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 präzipitierte, das 18.000 Dalton-Protein, wie mit reduzierender SDS-PAGE bestimmt.

BEISPIEL 21

REINIGUNG, IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES E. NECATRIX-NA4-ANTIGENS

Reinigung und Charakterisierung des NA4-Antigens

Sporulierte E. necatrix-Oocysten wurden in 10 ml PBS auf 10&sup9; Oocysten resuspendiert und durch Schütteln mit einem gleichen Volumen an Glasperlen aufgebrochen. Die Membranen wurden durch Zentrifugation (100.000 x g, 60 Min., 4ºC) isoliert und die Proteine in 1 % NP-40, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM TLCK, 0,1 mM TPCK und 10 KIE/ml Aprotinin solubilisiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation (100.000 x g, 60 Min., 4ºC) pelletiert. Die Sporocysten-Membranproteine wurden an eine DEAE-HPLC-Säule (BioRad) adsorbiert, die in 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,05 % Zwittergent 3-12 äquilibriert war. Die Säule wurde eluiert mit einem NaCl-Gradienten (0 - 500 mM) in diesem Puffer, der 0,1 mM Dithiothreit enthielt. Das NA4, identifiziert durch seine Wanderung bei der Gelelektrophorese, wurde in dem bei etwa 275 mM NaCl eluierenden Material gefunden.
Fraktionen, die das NA4-Antigen enthielten, wurden vereinigt und unter Verwendung eines Centricon 10 Mikrokonzentrators (Amicon Corp., Danvers, MA) konzentriert. Das Konzentrat wurde mit etwa 10 Volumina an 0,01 % (w/v) SDS verdünnt und auf niedrigere Salz- und Dithiothreit-Niveaus erneut konzentriert. Die Probe wurde mit Auftragspuffer verdünnt, der 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 % (w/v) Natriumdodecylsulfat, 10 % (w/v) Glycerin und 0,001 % (w/v) Bromphenolblau enthielt, gekocht und einer Elektrophorese in 15 % igen SDS-Polyacrylamid-Gelen unterworfen. Unter diesen nicht-reduzierenden Bedingungen wurde ein etwa 26.000 Dalton-NA4-Antigen durch KCl-Färbung (21) identifiziert. Der entsprechende Bereich des Gels wurde ausgeschnitten und das Protein eluiert, indem das Gel 4 Stunden bei Raumtemperatur in 1 ml von 10 mM NH&sub4;HCO&sub3;, 0,02 % (w/v) SDS geschüttelt wurde. Das nach diesem Verfahren präparierte NA4-Antigen war im wesentlichen rein.
Wurde das NA4-Antigen durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (d.h. 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol in dem Probenpuffer) analysiert, schien das NA4-Antigen zwei Polypeptide von 18.000 und etwa 8.000 Dalton zu enthalten. Bei Sporocysten-Membranpräparationen scheinen die 18.000- und 8.000-Dalton- Polypeptide deshalb durch eine Disulfidbindung verknüpft zu sein.
Reinigung des E. Necatrix-Antigens durch Immunadsorptionstechniken für in vivo-Tests. Die Immunadsorption des E. necatrix-NA4-Antigens wurde nach dem Verfahren von Kasper etal. mit einigen Modifikationen (31) durchgeführt. Kurz gesagt, wurde gesamte E. necatrix-Sporocysten-Membran wie vorher in diesem Beispiel beschrieben über Nacht bei 4ºC in Gegenwart von monoklonalem Antikörper Ptn 7.2A4/4 inkubiert. Die resultierende Mischung wurde dann bei 4ºC in Gegenwart von Anti-Maus-Ziegen-Antiseren zwei Stunden lang geschüttelt, gefolgt von einer Reaktion mit Protein A-Sepharose (Sigma; St. Louis, MO) unter denselben Bedingungen. Diese Suspension wurde in eine Glassäule gegossen und mit PBS gewaschen, bis eine Basislinienadsorption erhalten wurde, um ungebundenes Protein zu entfernen. Nicht-spezifisch gebundenes Protein wurde mit abwechselnden Waschschritten von PBS (pH 8,0) und Acetatpuffer (0,1 M, pH 4,0) entfernt. Spezifisch gebundenes Antigen wurde mit 60 mM Tris-HCl, pH 6,8 mit 2 % SDS eluiert. Dem folgte eine anschließende Antigen-Passage über eine Sephadex-G-200-Säule, die mit demselben Puffer äquilibriert war und damit eluiert wurde. Natriumdodecylsulfat wurde durch Passage über eine ExtractiGel D -Säule (Pierce; Rockford, IL) entfernt.

BEISPIEL 22

PARTIELLE AMINOSÄURESEQUENZ DER 18.000- UND 8.000 DALTON- PEPTIDKOMPONENTEN DES E. NECATRIX-NA4-ANTIGENS

Aminosäuresequenz der 18.000 Dalton-Peptidkomponente des NA4- Antigens.

Die Aminosäuresequenzierung des 18.000 Dalton-Peptids wurde kompliziert durch den Befund, daß die N-terminale Aminosäure blockiert war (d.h., einem Edman-Abbau nicht zugänglich (14)). Um dieses Problem zu umgehen, wurde das NA4-Antigen mit CNBr verdaut und ein etwa 16.000 Dalton langes CNBr-Fragment durch "reversed phase"-HPLC gereinigt (26). Für die CNBr-Verdauung wurden etwa 10 Mikrogramm Protein in 2 % CNBr in 70 % Ameisensäure über Nacht bei 4ºC gelöst. Die Probe wurde bis zur Trockne in einer Savant Speedvac-Zentrifuge eingedampft und in 0,1 % TFA erneut gelöst. Das große CNBr-Fragment wurde auf einer Vydac-C4-Säule (the Separations Group, Hesperia, CA) gereinigt und mit einem 0-100 % CH&sub3;CN:Isopropanol 2:1-Gradienten in 0,1 % TFA eluiert.
Die Aminosäuresequenzierung wurde unter Verwendung eines Gasphasen sequenators (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) nach dem Verfahren von Hunkapiller et al. (25) durchgeführt. Phenylthiohydantoin (PTH)-derivatisierte Aminosäuren wurden durch HPLC (8) analysiert. Die partielle Aminosäuresequenz für das große CNBr-Fragment ist unten gezeigt.
NH&sub2; - ? ? Leu ? Lys Ala Ala Gly Leu Pro Glu Phe Gly Asn Ala Val Gly ? Ala Val Val Leu Pro Ala Tyr Ser.

Partielle Aminosäuresequenz der 8.000 Dalton-Peptidkomponente des NA4- Antigens.

Die N-terminale Aminosäuresequenz der 8.000 Dalton-Peptidkomponente des NA4-Antigens konnte direkt durch Sequenzierung des NA4-Antigens bestimmt werden. Das gereinigte, aus dem SDS-PAGE-Gel eluierte NA4-Antigen wurde unter Verwendung eines Centricon 10 Mikrokonzentrators etwa 6-fach konzentriert. Um Glycin in der aus dem SDS-Gel eluierten Probe zu entfernen, wurden zweimal 20 Volumina Wasser zu dem Konzentrat zugegeben und die Probe dann erneut konzentriert. Die konzentrierte Probe wurde direkt auf den Sequenator aufgebracht. Eine partielle Aminosäuresequenz des N-terminalen Bereichs des Peptids ist unten dargestellt:
NH&sub2; - Ala Ala ? Thr Thr ? Asp Ala Val Ile Cys Leu Thr Asn Pro Ala Pro Leu Ala Ala Gly Ser Pro Pro? Phe ? Asp Glu ? Trp.

BEISPIEL 23

ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES GENOMISCHEN DNA-KLONS, DER FÜR DAS E. NECATRIX-NA4-ANTIGEN KODIERT

Isolierung von DNA aus sporulierten E. necatrix-Oocysten.

Sporulierte Oocysten (5 x 10&sup8;) wurden gewaschen und DNA aus Sporocysten isoliert wie in Beispiel 6 beschrieben.

Konstruktion der genomischen E. necatrix-Bank im Bakteriophagen λgt wes λB.

Die genomische E. necatrix DNA-Bank im Bakteriophagen λgt wes λB (26) wurde konstruiert wie im Beispiel 6 beschrieben. 15 Mikrogramm an EcoRI-verdauten DNA-Armen wurden mit 3 Mikrogramm EcoRI-verdauter E. necatrix-DNA unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert. 1 Mikrogramm der ligierten DNA wurde in vitro in Phagenpartikel verpackt, wodurch eine Bank von 2 x 10&sup6; rekombinanten Phagenpartikeln erzeugt wurde.

Screenen der genomischen E. necatrix-DNA-Bank.

Nitrocellulosefilter-Replikate von rekombinanten Phagen der genomischen E. necatrix-DNA-Bank wurden mit dem 785 Basenpaare langen SacI - PvuII-Fragment des genomischen E. tenella-Klons 108-1-2 gescreent, der mit [³²P]-dATP "nicktranslatiert" worden war. Positive Plaques, die mit der nicktranslatierten Sonde hybridisierten, wurden gepickt, plaque-gereinigt und DNA wurde hergestellt wie oben beschrieben. Der positive Phage 7 wurde in größerem Maßstab zur Reinigung und Charakterisierung des E. necatrix-DNA-Inserts gezüchtet.

Detaillierte Charakterisierung des genomischen Klons, der für das 18.000 Dalton- Peptid kodiert - Restriktionskarte.

Das 3.900 bp EcoRI-Fragment-Insert des Klons 7 wurde aus dem Phagenvektor in das Plasmid pUC9 (78) subkloniert, um den Klon 7-49 zu erzeugen. Dieses rekombinante Plasmid wurde mit einer Vielfalt von Restriktionsendonukleasen verdaut, um die Position von Schlüsseestriktionsstellen in dem genomischen DNA-Klon zu bestimmen. Die Position der Restriktionsstellen innerhalb der DNA wurde benötigt, um den Ort und die Orientierung des 18.000 Dalton-Peptid-Gens zu bestimmen und eine Strategie zur Sequenzierung des EcoRI-Fragments genomischer DNA zu entwickeln. Die Restriktionskarte ist in Figur 16 dargestellt. Der Ort und die Orientierung des Gens für das 18.000 Dalton- Peptid ist auf dieser Karte dargestellt.

DNA-Sequenz-Analyse des Subklons 7-49.

Das Fragment des Klons 7-49, welches das Gen für die 18.000 Dalton-Peptidkomponente des E. necatrix-NA4-Antigens enthält, wurde nach dem Didesoxy-Verfahren von Sanger (62) unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzymfragmente sequenziert. Primer für die DNA- Synthese umfaßten die Oligonukotide COD 92, 94 und 108 sowie andere synthetische Oligonukotide. Die DNA-Sequenz ist in Figur 17 dargestellt.

Struktur des Gens, welches für das E. necatrix-NA4-Antigen kodiert.

Die DNA-Sequenz stimmt mit der durch die partielle Aminosäuresequenzanalyse vorausgesagten überein.
Auf der Basis von Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen weisen sowohl das E. necatrix- als auch das E. tenella-Antigen ein scheinbares Molekulargewicht von 25-26.000 Dalton auf. Eine Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen hat gezeigt, daß beide Antigene aus zwei Polypeptiden, die durch eine Disulfidbindung verknüpft sind, zusammengesetzt sind. Ein Vergleich des E. necatrix-Gens mit dem E. tenelia-Gen legt nahe, daß die Genstruktur dem E. tenella-Gen in den drei oben erörterten Merkmalen ähnlich ist, nämlich (1) das Gen kodiert für ein 23 Aminosäuren-Signalpeptid; (2) es gibt drei Introns innerhalb des Gens, und (3) das Gen kodiert für ein 26.000 Dalton-Peptid, welches dieselbe proteolytische Prozessierungsstelle (Arg-Arg-Leu) aufweist, um Peptide von 18.000- und 8.000-Dalton zu erzeugen.
Aus der Analyse der DNA-Sequenz des E. necatrix-Gens im Vergleich mit dem E. tenella-Gen, können Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den beiden Proteinen hergeleitet werden. Figur 18 zeigt die Zuordnung der E. tenella- und E. necatrix-Gene und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen. Die 3 Intron- Eingangslausgangs-Stellen sind in beiden Genen konserviert. Die beiden A4- Antigen-Proteine zeigen 86 % Homologie in ihren Aminosäuresequenzen. Alle Cystein-Aminosäurereste und mutmaßlichen Disulfidbindungen sind konserviert Das E. necatrix-Protein zeigt eine Insertion von einer Aminosäure zwischen den Positionen 2 und 3 des reifen 17.000 Dalton-Polypeptids des E. tenella-Proteins. Ferner fehlt dem E. necatrix-Protein der Serinrest, der sich an Position 45 in dem E. tenella-Protein befindet, und die Aminosäuren, welche den Positionen 223 bis 228 im reifen E. tenella-Protein entsprechen.
Figur 19 zeigt die Zuordnung der drei introns innerhalb der Gene. Intron A beträgt 101 bp in beiden Spezies und zeigt eine 89 %-ige Sequenzhomologie. Intron B beträgt 114 bp in E. tenella und 122 bp in E. necatrix mit 74 % Homologie. Intron C beträgt 124 bp in E. tenella und 117 bp in E. necatrix mit 77 % Sequenzhomologie; somit sind die Introns deutlich verschieden.

BEISPIEL 24

ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON mRNA, DIE FÜR DAS NA4-ANTIGEN KODIERT

Bevor die cDNA, welche für das NA4-Antigen kodiert, synthetisiert werden konnte, war es notwendig zu bestimmen, wann die mRNA, welche für das NA4-Antigen kodiert, während der Sporulierung vorhanden war. 2,5 x 10&sup8; Oocysten wurden bei 30 ºC unter sanftem Mischen 40 Stunden lang sporuliert. Die sporulierenden Oocysten wurden bei 7-800 x g 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Pellets wurden in einem Trockeneis/Methanol-Bad schnell eingefroren und dann bei -70ºC gelagert, bis RNA isoliert wurde.
Jedes Pellet wurde in etwa 10 Volumina 5 M Guanidinthiocyanat, 20 mM Tris-HCl pH 7,5,10 mM EDTA, 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol aufgetaut, und die Oocysten schnell durch heftiges Schütteln mit einem gleichen Volumen an Glasperlen von 1,0 mm für 10 Minuten aufgebrochen. Nachdem die Proben auf 2 % (w/v) N-Lauroylsarcosin gebracht worden waren, wurden sie bei etwa 8.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert, um Debris zu entfernen. RNA wurde aus dem Überstand mittels Sedimentation durch ein CsCl-Kissen isoliert (76).
Das RNA-Pellet wurde in 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,2 % SDS, 100 Einheiten/ml RNasin (Promega Biotec, Madison, WI, 10 mM β-Mercaptoethanol) resuspendiert. Nach zweimaliger alternativer Extraktion mit Phenol- Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) und Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) wurde die RNA gefällt und bei -20ºC in Ethanol gelagert. Etwa 85-150 Mikrogramm Gesamt- RNA wurden aus (0,5-1,0 x 10&sup9;) Oocysten isoliert.
PolyA-enthaltende RNA wurde durch Oligo-dT-Cellulose-Chromatographie isoliert (2). Gesamt-RNA wurde auf eine Oligo-dT-Cellulose-Säule aufgetragen (Typ 3, Collaborative Research, Inc; Lexington, MA) in 10 mM Tris-HCl pH 7,5,1 mM EDTA, 0,2 % (w/v) SDS, 0,4 M LiCl. RNA wurde bei 40ºC im selben Puffer ohne LiCl eluiert. Etwa 10 Mikrogramm A&spplus;-RNA wurden aus 5,0 x 10&sup8; Oocysten isoliert.
Bevor PolyA-RNA als Matrize für die cDNA-Synthese eingesetzt werden konnte, war es nötig, die Anwesenheit der für das NA4-Antigen kodierenden mRNA zu demonstrieren. Die Anwesenheit der mRNA für das NA4-Antigen wurde demonstriert, indem PolyA-RNA aus vollständig sporulierten (40 Stunden) Oocysten mit DNA aus dem Klon, der für das TA4-Protein kodiert, hybridisiert wurde. Zehn Mikrogramm Gesamt-RNA, isoliert aus den sporulierten Oocysten, wurden durch Formaldehyd-enthaltende Gele elektrophoresiert (44). Die RNA wurde für eine Northern-Blot-Analyse auf Nylonfilter überführt. Die Nylonfilter wurden mit einem [³²p] nick-translatierten (44) DNA-Fragment sondiert, das aus den ersten etwa 300 bp des TA4-cDNA-Fragments, bestehend aus den ersten etwa 300 bp des TA4- cDNA-Klons, bestand. Die DNA-Sequenz dieses Fragments ist zu über 80 % homolog mit dessen korrespondierenden Bereichen in der NA4-Gensequenz und wird deshalb als geeignete Sonde gewählt. Die für das NA4-Antigen kodierende mRNA war in der Tat in den Oocysten vorhanden, die 40 Stunden lang sporuliert hatten. Diese Experimente zeigen, daß mRNA aus Oocysten, die 40 Stunden lang sporuliert hatten, zur Herstellung von cDNA, die für das NA4-Antigen kodiert, verwendet werden konnte.

BEISPIEL 25

ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES FÜR DAS NA4-ANTIGEN KODIERENDEN cDNA-KLONS

cDNA

Die Nukleotidsequenz, welche für das NA4-Antigen kodiert, wurde als Gen in einer leicht zu züchtenden Zelle wie E. coli verwendet, um ein NA4-Protein zur Impfung von Hühnchen gegen Coccidiose, die durch bestimmte Eimeria verursacht wird, zu produzieren. Es gibt drei Bereiche des NA4-Gens (Figur 17), in denen die DNA- Sequenz nicht mit der Proteinsequenz übereinstimmt. Diese drei Sequenzen sind Introns, die typischerweise innerhalb der kodierenden Bereiche vieler eukaryotischer Gene gefunden werden. Da jedoch Gene mit Introns das entsprechende Protein in E. coli nicht exprimieren würden, war es erforderlich, einen cDNA-Klon zu isolieren, der für das NA4-Antigen kodiert. Dieser Klon enthält eine zusammenhängende kodierende Sequenz für das NA4-Antigen.

Synthese von cDNA

In Kürze, es wurde die mRNA sporulierter Oocysten, die wie in Beispiel 24 isoliert worden war, unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Kits, der von Amersham (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) bezogen und nach deren Anweisungen verwendet wurde, in cDNA transkribiert. Aus 2 Mikrogramm mRNA erhielten wir etwa 400 ng cDNA.

Konstruktion der NA4-cDNA-Bank

Die cDNA wurde in 20 Mikroliter 6 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl&sub2; pH 7,4, 6 mM β-Mercaptoethanol, resuspendiert. Zur Klonierung der cDNA in eine Genbank wurden Restriktionsstellen verwendet, die aus der DNA-Sequenz des genomischen NA4-Klons bestimmt worden waren. Eine SacI-Stelle befindet sich unmittelbar stromaufwärts des N-terminalen Glutamins der reifen 18.000 Dalton-Untereinheit des NA4-Antigens und eine zweite SacI-Stelle liegt 60 bp stromabwärts der ersten. Die cDNA wurde mit 12 Einheiten SacI in Anwesenheit von 6 mM Tris-HCl (pH 7,4), 6 mM MgCl&sub2; und 6 mM β-Mercaptoethanol 150 Minuten lang bei 37ºC verdaut.
Zur Klonierung des Hauptteils der cDNA, d.h. von der zweiten SacI-Stelle bis zum Ende des Gens, wurde ein pUC18 (56) verwendet. Der Vektor war mit SacI und SmaI verdaut worden. SmaI ergab die für die Ligierung des 3'-Endes der cDNA erforderliche glattendige Stelle. Die Ligierungsreaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von etwa 40 ng Vektor-DNA und 40 ng cDNA. Die Ligierungen wurden über Nacht bei 12ºC in einem Ligasepuffer von 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM Dithiothreit, 1,0 mM rATP unter Verwendung einer Einheit T4-DNA-Ligase durchgeführt.
Die rekombinanten DNA-Moleküle wurden dann durch Transformation in den Escherichia coli K-12-Stamm MH1 eingeführt. Die transformierten Bakterien wurden auf Agarplatten ausgebreitet, die das Antibiotikum Ampicillin in einer Konzentration von 50 Mikrogramm/ml enthielten. Da das Plasmid pUC18 (56) das Gen für Ampicillinresistenz enthält, überlebten nur diejenigen Bakterien, welche ein rekombinantes Plasmid erworben hatten. Diese Bakterien wuchsen jeweils und teilten sich, um eine Bakterienkolonie zu bilden. Jede Zelle in der Kolonie ist ein Abkömmling der ursprünglichen Elternzelle und enthält dasselbe rekombinante Plasmid. Es wurden von 20 ng der SacI-verdauten cDNA, die zur Herstellung rekombinanter Plasmide eingesetzt worden war, etwa 20.000 Klone erhalten.

Identifizierung von NA4-cDNA-Klonen

Diese cDNA-Bank wurde durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung des "high density screening"-Verfahrens, das von Grunstein und Hogness (20) beschrieben wurde, gescreent. Dasselbe 300 bp-Fragment des TA4-cDNA-Klons, das zur Hybridisierung mit der oben beschriebenen mRNA eingesetzt worden war, wurde gereinigt und mit P durch Nicktranslation markiert (44). Positive Klone wurden identifiziert, gereinigt und Plasmid-DNA für die weitere Analyse isoliert. Eine Restriktionsanalyse des positiven cDNA-Klons pSMAC stimmte mit der Karte überein, die aus dem genomischen NA4-Klon vorausgesagt wurde. Das cDNA- insert des Klons mit der Bezeichnung pSMAC wurde durch Didesoxysequenzierung unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die als Entsprechung des genomischen Klons hergestellt worden waren, sequenziert (62). Die Konstruktion von pSMAC ist in Figur 20 erläutert. Dieser cDNA-Klon wurde in einen E. coli Stamm JM83 transformiert und der Stamm mit der Bezeichnung JM83/pSMAC wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt und erhielt die ATCC-Hinterlegungs-Nr. 67 241. Diese Hinterlegung wurde nach dem Budapester Vertrag durchgeführt.
Die DNA-Sequenz stimmte mit der aus dem genomischen Klon vorausgesagten überein.
Das Plasmid pSMAC kodiert für über 90 % der cDNA, es fehlen ihm jedoch die ersten 60 bp der cDNA-Sequenz für das reife NA4-Protein. Aus Gründen der Einfachheit entschlossen wir uns, diese 60 bp von cDNA unter Verwendung der aus dem genomischen NA4-Klon 7 vorausgesagten Sequenz zu synthetisieren. Zwei. Oligonukleotide, COD 391 und COD 392, wurden auf einem Biosearch 8600 DNA-Synthesizer (Biosearch, San Rafael, Kalifornien) synthetisiert, durch HPLC gereinigt, in äquimolaren Mengen gemischt, 5 Minuten lang auf 90ºC erwärmt und auf 22ºC abkühlen gelassen. Die Verschmelzung dieser beiden Oligonukleotide bildet ein DNA-Fragment mit SacI-Enden, dessen Sequenz identisch ist mit der Sequenz des NA4-Gens zwischen den beiden SacI-Stellen nahe des 5'-Endes des Gens. Dieses synthetische Fragment wurde dann in SacI-verdautes pSMAC ligiert die resultierenden rekombinanten Moleküle in MH1 transformiert, und die Transformanten durch DNA-Sequenzierung gescreent, um zu bestimmen, welcher Klon das SacI-SacI-60 bp-Fragment in der korrekten Orientierung aufwies, um für die NA4-cDNA vollständiger Länge zu kodieren. Dieses Plasmid ist pSS33. Die Konstruktion von pSS33 ist in Figur 21 erläutert.
Um die Konstruktion von NA4-cDNA-Expressionsplasmiden zu erleichtern, wurde ein zweites Plasmid konstruiert, welches ebenfalls für die NA4-cDNA vollständiger Länge kodiert. Dieses Plasmid ist pNCD. pNCD enthält ein zusätzliches Nukleotidbasenpaar, inseriert in die pUC18-Sequenz unmittelbar stromaufwärts der SacI- Stelle, welche das 5'-Ende der NA4-cDNA in pSS33 markiert. Die Addition dieses Basenpaares verschiebt den Leserahmen, so daß, wenn die EcoRI-Stelle von Rinderprochymosin (pWHA93) oder E. coli-β-Galactosidase (pDK2) der Leserahmen aufrechterhalten wird und ein Fusionsprotein von Prochymosin-NA4 oder β-Galactosidase-NA4 erzeugt werden kann.
pNCD wurde aus pSMAC auf analoge Weise wie zur Erzeugung von pSS33 abgeleitet. Es wurden synthetische Oligonukleotide COD395 und COD396 hergestellt, gereinigt und verschmolzen. Das DNA-Fragment, welches sie bei Verschmelzung bilden, weist ein EcoRI-Ende und ein SacI-Ende auf. Dieses Fragment wurde in EcoRI-SacI-verdauten pSMAC ligiert und die resultierenden rekombinanten Plasmide in den E. coli K-12-Stamm MH1 transformiert. Die Konstruktion von pNCD wurde durch Didesoxysequenzierung überprüft. Die Konstruktion von pNCD ist in Figur 22 erläutert. pNCD wurde in die E. coli- Wirtszelle JM83 transformiert und bei ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. 67 226 hinterlegt.

BEISPIEL 26

EXPRESSION DES cDNA-ABGELEITETEN NA4-ANTIGENS IN E. COLI

Konstruktion von cDNA-abgeleiteten NA4-Expressionsplasmiden

Der cDNA-Klon stellt das Gen zur Synthese des NA4-Proteins in Bakterien zur Verfügung. Die cDNA enthält jedoch nicht die richtigen Signale, um eine Transkription und Translation in E. coli zu erlauben. Deshalb wurde die klonierte cDNA in Expressionsvektoren inseriert, die (einen) starke(n) Promoter(en) für die RNA- Polymerase und eine ribosomale Bindungsstelle zur Inituerung von Proteinsynthese in E. coli stromaufwärts der inserierten cDNA enthalten. Der Ausdruck NA4-Protein, wie hier verwendet, bezieht sich auf das Expressionsprodukt der NA4-cDNA, kodiert von jedem Derivat von pSS33 oder pNCD, oder jedes rekombinante NA4- abgeleitete Material, das in einer bakteriellen Wirtszelle produziert wird. Der Ausdruck NA4-Antigen bezieht sich auf das in der Natur vorkommende Material wie es durch die genomische NA4-DNA exprimiert wird, wie es auf der Oberfläche der Sporozoiten vorhanden ist oder von Sporozoiten gereinigt ist.
Es wurden Expressionsvektoren pWHA93 und pDK2 konstruiert, so daß Gene in diese inseriert werden konnten, um eine Expression in E. coli zu erhalten. Andere geeignete Plasmide, die dem Fachmann bekannt sind, könnten ebenfalls verwendet werden. Die Plasmide pWHA93 und pDK2 sind zwei Beispiele geeigneter Plasmide. Das Plasmid pWHA93 enthält zwei Promotoren, lac und tac (der tac Promoter stammt aus dem Plasmid pDR450; 34; Pharmacia Molecular Biology Division, Piscataway, NJ), von denen jeder die Transkription eines inserierten Gens steuern könnte. Die Struktur des Plasmids pWHA93 ist als Diagramm in Figur 12 dargestellt
Da die Expressionsniveaus des analogen E. tenella-Proteins TA4 viel höher waren, wenn es als Fusionsproteine exprimiert wurde, statt direkt exprimiert zu werden, wurde das NA4-Protein durch Fusion mit anderen Proteinen stabilisiert. Für diese Proteinfusion konnte jedes geeignete Protein eingesetzt werden. Die folgenden Beispiele erläutern nur zwei der möglichen Proteine, die geeignet sind, nämlich β-Galactosidase und Prochymosin.

BEISPIEL 27

EXPRESSION DES NA4-PROTEINS ALS β-GALACTOSIDASE FUSIONSPROTEIN IN E. COLI

Konstruktion von β-Galactosidase - NA4-Expressionsplasmiden

NA4-Gen-Fusionsplasmide wurden konstruiert, da die Verknüpfung des NA4- Proteins mit einem großen Protein dieses in E. coli stabilisieren kann. Mehrere eukaryotische Proteine sind in Bakterien als fusionierte Proteine stabiler (17, 27). Die rekombinanten Plasmide pTDS1 und pTDS2 sind Hybride, welche für die Expression eines β-Galactosidase-NA4-Antigen-Fusionsproteins konstruiert wurden. Diese waren abgeleitet von einem Plasmid pDK2, welches den regulatorischen lac- Bereich und das gesamte β-Galactosidase-Gen aus Lambda plac (22, 63) in die EcoRI-Stelle des Plasmids pBR328 inseriert enthält, und von den cDNA-Klonen pSMAC und pNCD. Es können auch andere geeignete Plasmide als pDK2 verwendet werden. Das Plasmid pDK2 ist ein Beispiel eines geeigneten Plasmids. Die 1,3 kb EcoRI-BamHI-Fragmente von pSMAC und pNCD, die 90 % bzw. die gesamte NA4-cDNA-Sequenz enthielten, wurden in pDK2-Plasmid-DNA kloniert, die mit EcoRI und BamHI verdaut worden war, um die Plasmide pTDS1 bzw. pTDS2 zu erzeugen. Die Klone pTDS1 und pTDS2 enthielten die erwarteten Plasmide, in denen 90 % der oder die gesamte NA4-cDNA Sequenz im Leserahmen mit dem C-terminalen Bereich der kodierenden β-Galactosidase- Sequenz fusioniert war. Die Konstruktionen von pTDS1 und pTDS2 sind in den Figuren 23A und 23B erläutert.
Die rekombinanten DNAs und deren Wirtsmikroorganismen, hier als MH1/pTDS1 und MH1/pTDS2 beschrieben, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt und erhielten die ATCC-Hinterlegungsnummern 67 240 bzw. 67 264. Diese Hinterlegungen wurden nach dem Budapester Vertrag durchgeführt. Die pTDS1- und pTDS2-Proteine werden in E. coli auf hohen Niveaus synthetisiert, sind jedoch unlöslich und reagieren nicht mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4.

BEISPIEL 28

EXPRESSION DES NA4-PROTEINS ALS PROCHYMOSIN-FUSIONSPROTEIN IN E. COLI

Die Proteine, welche von Zellen, die pTDS1 und pTDS2 enthalten, hergestellt werden, sind weitgehend oder vollständig unlöslich und dadurch anscheinend nicht fähig, mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4 zu reagieren. Es wurde festgestellt, daß andere eukaryotische Proteine, die in E. coli in unlöslicher, inaktiver Form hergestellt werden, solubilisiert werden können und deren Aktivität zurückerhalten werden kann. Ein solches Protein ist Rinderprochymosin. Die NA4-cDNA-Sequenz wurde mit dem Rinderprochymosin-Gen fusioniert, um ein unlösliches Fusionsprotein zu erzeugen, welches solubilisiert und durch Verfahren die für Prochymosin allein entwickelt worden waren, aktiv gemacht werden konnte Der Grad an geeigneter Renaturierung des Fusionsproteins konnte dann durch Immunreaktivität mit monoklonalem Antikörper Ptn 7.2 A4/4 in einem Platten-ELISA überwacht werden.
Ein Plasmid-kodiertes Prochymosin-NA4-Fusionsprotein wurde erzeugt durch Verknüpfung der NA4-cDNA-Sequenz mit dem klonierten Rinderprochymosin-Gen von pWHA93 (in Beispiel 12 beschrieben). Andere Plasmide können ebenfalls eingesetzt werden. Ein geeignetes Plasmid ist pWHA93.
Bei der Konstruktion der Prochymosin-NA4-Genfusion, pDDS1 und pDDS2, wurde ein etwa 1,3 kb langes Fragment aus jedem der cDNA-Klone pSMAC und pNCD durch Verdauung mit den Enzymen EcoRI und HindIII entfernt. Das Plasmid pWHA93 wurde gleichermaßen mit EcoRI und HindIII verdaut, das größere der beiden so erzeugten Fragmente wurde gelgereinigt und mit jedem der EcoRI- HindIII-Fragente, welche die NA4-cDNA-Sequenzen aus pSMAC und pNCD enthielten, ligiert, um die rekombinanten Plasmide pDDS1 bzw. pDDS2 zu erzeugen. Die Konstruktion von pDDS1 und pDSS2 ist als Diagramm in den Figuren 24A und 24B dargestellt.
Die rekombinanten DNAS und Wirtsmikroorganismen, hier als MH1/pDDS1 und JM83/pDDS2 beschrieben, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt und erhielten die ATCC-Hinterlegungsnummern 67 243 bzw. 67 265. Diese Hinterlegungen wurden nach dem Budapester Vertrag durchgeführt.

BEISPIEL 29

EXTRAKTION DES NA4-PROTEINS AUS DEM UNLÖSLICHEN ZUSTAND UND NACHWEIS VON IMMUNREAKTIVITÄT MIT DEM MONOKLONALEN ANTIKÖRPER PTN 7.2 A4/4

Die E. coli-Produkte der Expressionsplasmide pTDS1, pTDS2, pDDS1 und pDDS2 sind alle weitgehend oder vollständig unlöslich. Alle können durch Kochen in Laemmli-Probenpuffer solubilisiert werden und werden mit Maus-Antiserum reagieren, das gegen die 17.000 Dalton-TA4-Antigen-Untereinheit gebildet wurde, die zu diesem Teil des NA4-Antigens in hohem Maße homolog ist. Unter diesen Begungen reagiert jedoch keines mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4. Deshalb war es erforderlich, diese E. coli-synthetisierten Proteine zu renaturieren, um Antigene in einer Form herzustellen, die mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4 reagieren würde und deshalb möglicherweise neutralisierende und schützende Antikörper-Antworten gegen E. necatrix und E. tenella in Tieren induzieren könnte.

Extraktion und Renaturierung von bakteriell hergestellten NA4-Fusionsproteinen

Zuerst wurden die NA4-Fusionsproteine solubilisiert und renaturiert nach Verfahren, die bekannterweise Rinderprochymosin solubilisieren und renaturieren, um aktives Enzym zu produzieren (47). Dieses Verfahren erzeugte reine lösliche NA4-Fusionsproteine, die Immunreaktivität mit Ptn 7.2 A4/4 besaßen. Die Bedingungen wurden hinsichtlich des Erhalts von Immunreaktivität optimiert und sind im folgenden beschrieben.
Die Plasmide pTDS1, pTDS2, pDDS1 und pDDS2 wurden wie oben beschrieben konstruiert. Diese Plasmide wurden dazu verwendet, um den E. coli-Stamm SG936 mittels Standardtechniken zu transformieren und Ampicillin-resistente Kolonien wurden gereinigt und zur Kulturzüchtung eingesetzt. In jedem Fall wurde eine Ampicillin-resistente Kolonie von einer frisch ausgestrichenen Agarplatte dazu verwendet, eine 100 ml-Flüssigkultur anzuimpfen, die L-Brühe und Ampicillin bei 100 Mikrogramm/ml enthielt. Die Kultur wurde über Nacht bei 30ºC unter Schütteln gezüchtet. Die 100 ml-Kultur wurde in einen Kolben überführt, der 1 Liter L-Brühe/- Ampicillin enthielt. Diese Kultur wurde bei 30ºC unter Schütteln bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 1,0 gezüchtet. IPTG wurde auf 2 mM zugegeben und die Kultur weitere 2-3 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und eingefroren bei -70ºC gelagert. Die gefrorenen Zelipasten des E. coli-Stammes SG936, jeweils eines der NA4-Expressionsplasmide enthaltend, wurden jeweils in 40 ml 25 mM Tris-HCl pH 8,10 mM EDTA, 0,5 mg/ml Lysozym suspendiert. Nach kurzer inkubation wurden die lysierten Zellen durch Ultraschallbehandlung weiter aufgebrochen. Da sich die in E. coli synthetisierten NA4-Fusionsproteine in Zell- Lysaten als vollständig unlöslich gezeigt hatten, wurden die Plasmid-kodierten NA4- Proteine gereinigt durch einstündige Zentrifugation der Zeli-Lysate bei 100.000 x g, gefolgt von einer Detergens-Extraktion der pelletierten Zelitrümmer mit einer Pufferlösung, die 5 % Triton X-100-Detergens (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 20 mM EDTA enthielt, für 60 Minuten lang bei 25ºC. Die NA4-Fusionsproteine blieben unlöslich und bei 25ºC. Die NA4-Fusionsproteine blieben unlöslich und wurden durch Zentrifugation bei 100.000 x g gewonnen.
Das unlösliche Material wurde in 12 ml 10 mM Na-Phosphat (pH 7,5) suspendiert und durch Zentrifugation gewonnen, um verbleibendes Detergens zu entfernen. Die NA4-Fusionsproteine wurden in 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,.5 in einem Endvolumen von 7,7 ml suspendiert. Die Suspensionen wurden durch die Zugabe von 5,8 g festen Harnstoff bis zu einer Endkonzentration von 8 M in einem Volumen von 12 ml vollständig solubilisiert und dann 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gemischt.
Die resultierenden klaren Lösungen wurden jeweils in 100 Volumina von 10 mM Natriumphosphatpuffer, auf pH 11,0 eingestellt, verdünnt, um Endvolumina von 1200 ml zu erreichen. Die Lösungen wurden sorgfältig gemischt und 10 Minuten lang bei 15ºC stehen gelassen. Der pH-Wert der Lösungen wurde dann auf pH 8,5 durch Zugabe von 0,5 N HCl über einen Zeitraum von 5 Minuten titriert. Die resultierenden Lösungen wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde oder länger vor dem Assay oder der Lagerung stehen gelassen. Die Probe wurde auf Immunreaktivität mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4 untersucht. Die Präparation besaß eine vergleichbare Aktivität wie renaturierte Antigene aus pCOC20, wie unten beschrieben.

Immunassay renaturierter Proben

Die Immunreaktivität der renaturierten pTDS1-, pTDS2-, pDDS1- und pDDS2- Proteine mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4 wurde gemessen. Jede Vertiefung der Mikrotiterpatte (Immulon 1 microELISA Flachbodenvertiefungsplatten, Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria VA) wurde beschichtet mit 100 Mikroliter Antigen, verdünnt in 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 150 mM NaCl, 0,01 % (w/v) Zwittergent 3-12, pH 8,0. Für renaturierte Proben wurden Verdünnungen des Antigens von 1:10 bis 1:1000 untersucht. Die Platten wurden durch Inkubation mit den Antigen- Lösungen für 1 Stunde bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4ºC mit den Antigenen beschichtet. Die Vertiefungen wurden geleert und dann dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,2, die 0,02 % (v/v) Tween-20 (PBST) enthielt, gewaschen. Die Platten wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3 % (w/v) Gelatine, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05 % (v/w) NaN&sub3; behandelt, um etwaige verbleibende Proteinbindungsstellen zu blockieren. Die Platten wurden dann mit 100 Mikroliter monoklonalem Antikörper Ptn 7.2 A4/4 (30 Mikrogramm/ml in 3 % [w/v] Rinderserumalbumin), 10 mM Tris-HCl pH 7,5,150 mM NaCl, 0,05 % (w/v) NaN&sub3;) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Spülen der Vertiefungen mit PBST wurde der gebundene monoklonale Antikörper Ptn 7.2 A4/4 unter Verwendung des Vectastain -ABC-Kits für Maus-IgG (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) bestimmt. Jede Vertiefung der Platte wurde mit 100 Mikroliter biotinyliertem Anti-Maus-Pferde-IgG (40 Mikroliter biotinylierter Anti- Maus-Antikörper, 80 Mikroliter normales Pferdeserum in 10 ml PBST) gefüllt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBST gespült. Die Platten wurden dann mit 100 Mikroliter/Vertiefung Vectastain -ABCReagenz 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert (80 Mikroliter Avidin DH- Reagenz A gemischt mit 80 Mikroliter biotinyliertes Meerrettichperoxidase-Reagenz B in PBST, 30-minütige Vorinkubation vor der Zugabe zu den Platten). Nach fünf Waschschritten mit PBST wurde die gebundene Meerrettichperoxidase gemessen durch die Zugabe von 100 Mikroliter Substrat/Vertiefung (0,1 mg/ml 2,2'-Azino-di- (3-ethylbenzthiazolin)-6-Sulfonsäure in 50 mM Citrat/Phosphat-Puffer pH 5,3, 0,015 % (v/v) Wasserstoffperoxid). Die Platten wurden im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion bei 414 nm wurde 10-60 Minuten nach der Substratzugabe mit einem automatischen Titertek-Multiscan Plattenablesegerät (Flow Laboratories, Inc. McClean, VA) gemessen.
Die Immunreaktivität der NA4-Fusionsproteine wurde als vergleichbar mit dem TA4-Fusionsprotein pCOC20 befunden.

BEISPIEL 30

VERWENDUNG VON GEREINIGTEM E. NECATRIX-NA4-PROTEIN, UM EINE SPOROZOITEN-NEUTRALISIERENDE SERUMANTWORT GEGEN E. TENELLA IN HÜHNCHEN HERVORZURUFEN

Das bei diesen Experimenten verwendete Antigen wurde aus Sporocysten wie in Beispiel 21 beschrieben präpariert. Vor der Verwendung in Hühnchen wurde die Identität und Reinheit des Proteins durch SDS-PAGE und Immunreaktivität mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4 bestätigt.
Ein Teil gereinigtes Antigen, verdünnt in 0,15 M phosphatgepufferter Salzlösung, wurde auf ein Endvolumen von 1 ml in drei Teilen Träger, bestehend aus etwa 5 % Arlacel A, 94 % Drakeol 6-VR, 1 % Tween-20, emulgiert. Die Hühnchen erhielten eine Dosis von 15 Mikrogramm Antigen/0,2 ml (cc) in den Nacken. Das Antigen wurde in 14-tägigen Intervallen zwei weitere Male auf demselben Wege verabreicht.
Drei Tage vor jeder Proteinverabreichung und 11 Tage nach der letzten Verabreichung wurde den Vögeln zur Gewinnung von Serumproben Blut abgenommen. Hitze-inaktivierte Seren wurden in dem Sporozoiten-Mikroneutralisations-Assay wie in Beispiel 2 beschrieben unabhängig getestet.
Die in Tabelle XIV unten aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß Vögel, die drei Dosen des Antigens erhielten, nachweisbare neutralisierende Antiserum-Titer besaßen, während nicht-geimpfte Vögel, die nur Träger erhielten, keine nachweisbaren neutralisierenden Antiserum-Titer gegen E. tenella-Sporozoiten aufwiesen. Tabelle XIV NA4-Antigen-induzierte Sporozoiten- Neutralisations-Assay-Daten Sporozoiten-Neutralisations-Titer (ND50 %)c
a Seren von Vögeln innerhalb jeder Behandlungsgruppe wurden vereinigt und getestet
b Vereinigtes Serum von mehreren Vögeln
c 50 %-Neutralisationsdosis.
N.D. nicht nachweisbar

BEISPIEL 31

VERWENDUNG VON GEREINIGTEM E. NECATRIX-NA4-PROTEIN, UM EINE SCHUTZANTWORT GEGEN EINE E. TENELLA-HERAUSFORDERUNG HERVORZURUFEN

Vier Wochen alte Weiße-Leghorn-Hühnchen erhielten dreimal in 14-tägigen Intervallen eine Dosis von 15 Mikrogramm immunaffinitätsgereinigtem NA4-Protein/0,2 ml (cc) auf intramuskulärem Wege in den Nackenmuskel. Das Antigen war in PBS formuliert und auf 60 Mikrogramm/ml Endvolumen in drei Teilen des oben genannten Trägers emulgiert. Eine zweite Gruppe von Vögeln erhielt nur das Trägersubstrat. Eine dritte Gruppe wurde nicht geimpft. Eine letzte Gruppe von nicht-geimpften Vögeln, die mit den NA4-geimpften Vögeln zusammen gehalten wurden, dienten als Kontrollen. Die Vögel wurden statistisch in eine E. tenella kontaminierte Batterie plaziert. Zehn Tage nachdem sie E. tenella ausgesetzt worden waren, wurden die Vögel mit einer oralen Dosis von 1x10&sup4; E. tenella Oocysten herausgefordert. Vierundzwanzig Stunden später erhielten die Vögel weitere 3x10&sup4; Oocysten oral. Alle Vögel wurden getötet und die Läsionen 5 Tage nach dem Erhalt der letzten oralen Dosis von E. tenella bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XV unten dargestellt. Tabelle XV
Diese Ergebnisse würden einem Fachmann nahelegen, daß die Vögel, welche NA4-Protein erhielten, gegen Krankheit aufgrund einer starken Herausforderung durch E. tenella meßbar geschützt waren. Die Läsionsbewertungen für Gruppen, die das Na4-Protein erhielten, waren niedriger als bei den jeweiligen Kontrollgruppen.

BEISPIEL 32

ANTWORT IN HÜHNCHEN, DIE REKOMBINANTEM EIMERIA NECATRIX (NA4)-ANTIGEN AUSGESETZT WAREN, UND DEREN KREUZREAKTIVITÄT MIT E. TENELLA

Spezifische Antwort von NA4-geimpften Hühnchen auf Eimeria necatrix und E. tenella. Es wurde ein Experiment durchgeführt, um die Immunreaktivität von NA4-geimpften Hühnchen mit dem Sporocysten-abgeleiteten Membranprotein von E. necatrix und E. tenella zu demonstrieren und um diese mit der Reaktion von TA4-geimpften Hühnchen gegen dieselben Spezies zu vergleichen. In diesem Experiment wurden zehn Hühnchen mit pTDS1 (ein β-Galactosidase/NA4-Fusionsprodukt, siehe Beispiel 27) geimpft, zehn wurden mit pDDS1 (ein Prochymosin/NA4-Fusionsprodukt, siehe Beispiel 28) geimpft. Diese wurden mit zehn pCOC20 (ein Prochymosin/TA4-Fusionsprodukt, siehe Beispiel 12) -geimpften Vögeln verglichen. Die Immunreaktivität der Proteine wurden untersucht und mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4 vor deren Inkorporierung in das Experiment bestätigt.
Antigen wurde hergestellt in einem 3:1 Verhältnis von 5% Arlacel-A, 94 % Drakeol 6-Vr und 1 % Tween 80-Träger auf 50 Mikrogramm Antigen mit 4 Mikrogramm LPS als Immunverstärker. Diese Formulierung wurde subkutan als 0,5-ml-Dosis hinter den Kopf gegeben. Der Impfplan bestand aus drei Dosen in 10-tägigen Intervallen wobei den Vögeln bei jeder Impfung Blut entnommen und das Serum gewonnen und eingefroren gelagert wurde. Die Kontrollen für das Experiment bestanden aus pCOC20-TA4-Antigen/Träger/LPS; Träger/LPS; und nicht-geimpften Kontrollen.
Seren von den Vakzinaten und Kontrollen wurden auf Immunreaktivität gegen Sporocysten-Protein von E. necatrix und E. tenella durch einen Western-Blot wie in Beispiel 13 beschrieben analysiert. Wie in Tabelle XVI unten zu sehen, verleiht die Impfung von Hühnchen mit pDDS1-, pTDS1- und PCOC20-Antigenen eine spezifische serologische Antwort auf die homologe und heterologe Parasitenspezies. Tabelle XVI NA4-Vakzinat-Immunreaktivitäts-Assay

Schutzantwort in Hühnchen die mit dem rekombinanten NA4-Protein geimpft wurden.

10 Tage nach dem obigen Impfplan wurden Hühnchen mit E. necatrix- oder E. tenella-Oocysten geimpft und auf pathognomone Läsionen durch Parasiten überprüft. Vögel der verschiedenen Behandlungsgruppen wurden mit 5.000 sporulierten Oocysten von E. tenella und 60.000 Oocysten von E. necatrix geimpft. Das Impfgut war vorher tritriert worden, um den erwünschten Schweregrad der Läsionen zu ergeben, welche 5 Tage nach der Herausforderung wie in Beispiel 18 bewertet wurden.
Die unten in Tabelle XVII gezeigten Ergebnisse demonstrieren bei den geimpften Gruppen im Vergleich zu den Kontrollen einen verringerten Schweregrad der Läsionen. Tabelle XVII Läsionsbewertungen von mit rekombinantem NA4-geimpften Hühnchen bei einer Herausforderung mit E. necatrix- und E. tenella-Oocysten Läsionsbewertung +St.-Ab.

Sporozoiten-neutralisierende Serumantwort in mit rekombinanten NA4-Antigenen geimpften Hühnchen.

Ein Sporozoiten-Neutralisations-Assay (SNA) wurde eingesetzt zur Bewertung der Fähigkeit von pDDS1 und pTDS1, dem Serum von geimpften Vögeln eine Parasiten-neutralisierende Kapazität zu verleihen. Unter Verwendung des im Beispiel 18 etablierten SNA-Versuchsprotokolls wurden Seren der oben genannten Vakzinat- und Kontrollgruppen auf Sporozoitenneutralisierende Kapazität untersucht.
Wie in Tabelle XVIII unten beschrieben, waren Seren aus den pTDS1- und pDDS1-geimpften Vögeln, die nach der dritten Impfung gewonnen wurden, bei der Inhibierung der Entwicklung von primären Meronten wirksam. Tabelle XVIII E. tenella-Sporozoiten-Neutralisations-Assay für mit rekombinantem NA4 geimpfte Hühnchen

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Claims

1. Gereinigtes antigenes Protein, welches imstande ist, in einem Hühnchen eine Immunantwort zu induzieren, die Schutz gegen eine Infektion durch Eimeria necatrix oder Eimeria tenella verleiht, wobei das Protein ein Molekulargewicht von etwa 26 000 Dalton aufweist und aus zwei Polypeptiden zusammengesetzt ist, die durch eine Disulfidbindung verknüpft sind, wobei eines der Polypeptide durch ein Molekulargewicht von etwa 18 000 Dalton und durch eine blockierte N-terminale Aminosäure und dadurch, daß es die in Figur 17 angegebene Aminosäuresequenz besitzt, gekennzeichnet ist und das andere Polypeptid durch ein Molekulargewicht von etwa 8 000 Dalton und dadurch, daß es die in Figur 17 angegebene Aminosäuresequenz besitzt, gekennzeichnet ist.

2. Verfahren zur Herstellung des Proteins oder des 15 000 Dalton-Polypeptids nach Anspruch 1, welches umfaßt:

a) das Kontaktieren von Sporocysten von Eimeria necatrix mit einem Detergens unter geeigneten nicht-reduzierenden Bedingungen in Gegenwart von Proteaseinhibitoren, um die Sporocysten- Membranproteine zu solubilisieren; und

b) die separate Gewinnung des Proteins oder des Polypeptids aus den solubilisierten Sporocysten-Membranproteinen unter geeigneten nicht- reduzierenden Bedingungen.

3. Verfahren zur Herstellung des Proteins oder des 18 000 Dalton-Polypeptids nach Anspruch 1, welches umfaßt die Herstellung eines DNA-Moleküls, das für das Protein oder das Polypeptid kodiert, die Insertion des DNA-Moleküls in einen geeigneten Expressionsvektor, die Einführung des resultierenden Expressionsvektors in einen geeigneten Wirt unter geeigneten Bedingungen, welche die Expression der DNA und die Produktion des Proteins erlauben, und die Gewinnung des so produzierten Proteins oder Polypeptids.

4. Nukleinsäuremolekül, welches für das Protein nach Anspruch 1 kodiert.

5. Rekombinanter Klonierungsvektor, weicher Klonierungsvektor-DNA und das cDNA-Molekül nach Anspruch 4 umfaßt, wobei die Klonierungsvektor-DNA durch die Anwesenheit einer ersten und einer zweiten Restriktionsenzymstelle gekennzeichnet ist und die cDNA in diese Stellen kioniert ist.

6. Wirtszelle, weiche den Klonierungsvektor nach Anspruch 5 umfaßt.

7. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das imstande ist, in einem Hühnchen eine immunantwort zu induzieren, die Schutz gegen eine Infektion durch Eimeria necatrix oder Eimena tenella verleiht, welches umfaßt die Zichtung von Wirtszellen nach Anspruch 6 unter geeigneten Bedingungen, welche die Produktion des Proteins erlauben, und die Gewinnung des so produzierten Proteins.

8. Verfahren zur Gewinnung der DNA nach Anspruch 4, welches umfaßt die Isolierung von genomischer Gesamt-DNA aus Eimeria necatrix-Oocysten; die Herstellung von DNA-Fragmenten aus der so isolierten genomischen DNA; die Ligierung der so hergestellten Fragmente in einen geeigneten Klonierungsvektor; das Unterwerfen der DNA der so hergestellten Klone einer Hybridisierung mit Oligonukleotiden, welche Nukleinsäuresequenzen die innerhalb der in Figur 17 angegebenen Nukleinsäuresequenz vorhanden sind, enthalten oder dazu komplementär sind, um geeignete klone zu identifizieren; und die Isolierung von DNA, die für das Protein kodiert und die in Figur 17 angegebene Nukleinsäuresequenz aufweist, aus den geeigneten Klonen.

9. Antigenes Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz der 18 000 Dalton- Polypeptid-Komponente des antigenen Proteins nach Anspruch 1 und ein Molekulargewicht von 18 000 Dalton aufweist und imstande ist, in einem Hühnchen eine Immunantwort zu induzieren, die Schutz gegen eine Infektion durch Eimeria necatrix und Eimeria tenella verleiht.

10. Antigenes Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz der 8 000 Dalton- Polypeptid-Komponente des antigenen Proteins nach Anspruch 1 und ein Molekulargewicht von 8 000 Dalton aufweist und imstande ist, in einem Hühnchen eine Immunantwort zu induzieren, die Schutz gegen eine Infektion durch Eimeria necatrix und Eimeria tenella verleiht.

11. Impfstoff, um einem Hühnchen aktive Immunität gegen Eimeria necatrix oder Eimeria tenella zu verleihen, welcher pro Dosis eine effektiv immunisierende Menge irgendeines der Polypeptide der Ansprüche 1, 9 oder 10 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.