JPH08242864A - コクシジウム症予防用抗原性蛋白質およびそれを含有するワクチン - Google Patents

コクシジウム症予防用抗原性蛋白質およびそれを含有するワクチン

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JPH08242864A JP7312101A JP31210195A JPH08242864A JP H08242864 A JPH08242864 A JP H08242864A JP 7312101 A JP7312101 A JP 7312101A JP 31210195 A JP31210195 A JP 31210195A JP H08242864 A JPH08242864 A JP H08242864A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 コクシジウム感染症に対して免疫応答を誘発
させることのできる抗原性ポリペプチド及びそれを含有
するワクチンを提供することを目的とする。 【解決手段】 Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘのス
ポロシスト膜蛋白質より、コクシジウム感染症に対して
ニワトリに免疫応答を誘発させることのできる抗原性ポ
リペプチドが得られ、この抗原性ポリペプチドを有効成
分とするワクチンはコクシジウム感染症の予防及び治療
に極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本明細書を通じて、多くの文
献をカッコ内の文献番号によって引用する。これらの引
用文献は、発明の詳細な説明の項の末尾に列記する。こ
れらの文献における開示すべてを、本発明の時点までの
本発明技術分野における熟練者に公知な技術状態をより
完全に記述するものとして参考に供する。Ａｐｉｃｏｍ
ｐｌｅｘａ門にはＥｕｃｏｃｃｉｄｉｏｒｉｄａ目に属
する何百もの異種生物が包含される。Ｅｉｍｅｒｉａ属
は真性球虫の目に包含される。この属に属する生物のう
ち、数種が養鶏産業上きわめて重要である。これらの種
には、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ｍａｘｉ
ｍａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉ
ｘ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、Ｅ．ｍ
ｉｔｉｓおよびＥ．ｐｒａｅｃｏｘがある。種の分類
は、宿主内の感染部位および卵母細胞の形態に基づいて
行われる。上述のそれぞれの種についての生化学的差異
は報告されているが、生化学的マーカーがその特定に用
いられたことはない。
【０００２】
【従来の技術】鳥Ｅｉｍｅｒｉａは、全ライフサイクル
を単一の宿主内で完了する。そのライフサイクルは複雑
で、無性期と有性期があり、Ｅｉｍｅｒｉａ種の間で相
違している。感染期は胞子を形成した卵母細胞である。
汚染された糞便、餌または水を摂取すると、胞子を形成
した卵母細胞は剪断力とスポロシストキャップの酵素的
加水分解の両作用が合した結果、消化管内で脱嚢する。
遊離した種虫は、小腸の特異的領域内における上皮細胞
を動き回る。発生はリーベルキーン線内で始まり、第１
世代メロントのレベルまで進む。メロントはさらに際立
った核を示し、加えてエネルギー発生と蛋白質合成能が
増大した円形化生物体からなる遷移期である。第１世代
種虫の発生がメロントの多分裂によって続く。第１世代
種虫の遊離によって宿主細胞は破壊され、寄生体は移住
して新しい宿主細胞に感染し、第２の無性サイクルが行
われる。メロントは第２世代種虫のレベルまで発生し、
それが遊離するときさらに上皮細胞を破壊する。第３世
代種虫の遊離によって、さらに宿主細胞の破壊が続く。
種虫の世代交代数はＥｉｍｅｒｉａの種によって異なっ
ている。
【０００３】有性発生は、配偶子形成過程を経過したの
ち、小配偶子および大配偶子の生成によって始まる。遊
離した小配偶子は大配偶子と融合し、接合子を形成す
る。未成熟卵母細胞の発生によって、宿主細胞の破壊が
続く。腸管内に放出された卵母細胞は糞便を介して環境
に流布され、空気中の酸素の存在下に成熟する（胞子形
成）。宿主細胞がさらに卵母細胞を摂取しない限り、寄
生体の発生は自ら制限される。しかしながら、これは鶏
がぎっしり詰め込まれた鶏舎では非現実的な期待であ
る。Ｅｉｍｅｒｉａによる疾患は、飼料効率の低下と異
常発現を伴い、重大な経済的損失を招いている。Ｅ．ｔ
ｅｎｅｌｌａおよびＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘによるコクシ
ジウム症の病変は、メロゾイトの遊離時の宿主細胞の破
壊が主な部分を占めるが、一方Ｅ．ｍａｘｉｍａの場合
はＥ．ｍａｘｉｍａ卵母細胞の遊離時の宿主細胞の破壊
が病変に重大な意味をもっている。腸内の出血は、上皮
に分布する毛細管の破壊によるものである。いったん無
性発生が確立すると、コクシジウム発育阻止剤を使用し
ても、この疾患の進行を制御することは困難である。二
次感染がＥｉｍｅｒｉａによって生じる疾患を悪化させ
る場合も多い。
【０００４】Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａまたはＥ．ｎｅｃａｔ
ｒｉｘに感染した鳥では４〜７日以内に死亡することが
ある。しかしながら、Ｅ．ｍａｘｉｍａの感染によって
死を招くことは稀である。種虫がきわめて特定の組織部
位内で感染を開始することは、コクシジウムの一定した
性質である（３９，４５，５７）。感染の部位特異性
は、Ｅｉｍｅｒｉａの種分化に共通して用いられる特性
である。たとえば、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘの無性段階に
は、中間部小腸内の上皮細胞を侵襲する性癖があるが、
一方、有性段階では主として盲腸内で発生する。コクシ
ジウム症に対する免疫の研究の多くは、体液性免疫、さ
らに特定すれば血清抗体に集中してきた。血清抗体と疾
患への抵抗性には相関がないとの報告もあった（５
９）。しかしながら、とくに有用なデータでは、分泌免
疫系の関与する局所反応もしくは細胞性免疫、またはそ
の両者が防御反応にかかわっているとの主張が支持され
ている。
【０００５】宿主細胞に対する病原体の認識、浸透およ
び／または付着の妨害により防御効果が現れることは、
ウイルス、細菌および原生動物のモデルで示されてい
る。主要宿主細胞受容体または病原体付着特性の遺伝的
欠失によって初期のコロニゼーション過程が防止できる
（１６，５４）。また、分泌抗体は、必要な受容体に結
合し、それをマスクすることによって、コロニゼーショ
ン過程の妨害も可能である（３２，７４）。１種以上の
免疫グロブリンクラスがＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌ
ａの初期コロニゼーション過程を妨害する能力をもつと
の報告もある（１３）。しかしながら、最近の報告で
は、分泌ＩｇＡの産生のみが、天然の保護免疫と相関し
たことが示されている（１２，５９）。Ｐｏｒｔｅｒ
＆ Ｄａｖｉｓ（１３）および他の研究者達（１９）
は、分泌ＩｇＡが病原体の細胞外段階で、その侵入を有
意に制限することにより、あるいは侵入しても以後の発
生の防止可能な程度に生物体を減弱させることにより中
和すると報告している。この疾患を除去し、鶏のコクシ
ジウム症による破壊作用を抑制するために、世界中の生
産者によって１年間に約５億〜１０億ドルが消費される
といわれている（３９，５２）。現在用いられている制
御手段によってもなお、鶏の損害は何百万ドルにも及ぶ
という（７７）。
【０００６】鶏に対するＥｉｍｅｒｉａ制御手段とし
て、現在もっとも広く用いられている方法は、抗原虫薬
飼料添加物の応用である。その組成は、使用するコクシ
ジウム発育阻止剤の種類によって異なるが、それぞれの
製品はコクシジウムのライフサイクルのある段階にしか
効果を示さない（３９，５１，５８）。コクシジウム発
育阻止剤の使用における欠点は多い。鳥類における保護
効果の短い持続性、時にみられる行動の低下、寄生体に
おける抵抗性の発現、またある程度安全性に関する問題
がある。薬剤抵抗性株の発生により、最近の製品寿命は
わずか数年といわれている。このため、開発費用は増大
し、たえず有効な製品の製造が続けられているのが現状
である（５１）。
【０００７】免疫感作による鳥類の保護はある程度成功
している。殺滅した生物体のプレパレーションを用い
て、限られた保護効果を引き起こすことができている
（１，４１，４３）。鶏のもっと有効な免疫感作へのア
プローチは、生存原生動物製品、たとえばＣｏｃｃｉｖ
ａｃの利用であった（１５）。低用量の生存卵母細胞を
含有する多価組成物である製品を、飲水中に投与する
と、鳥類に緩和な寄生体血症を生じる。この製品の欠点
は、投与後最初の１週間に鳥の行動の低下を生じる場合
があることであった。過剰投与や敷きわらの含水量など
の変動によって、重篤なコクシジウム症の突発を招くこ
とさえあった。鶏の免疫感作のためのＥ．ｔｅｎｅｌｌ
ａの生菌、胞子形成卵母細胞の使用に関しては米国特許
第３，１４７，１８６号（１９６４）、および同じ目的
でのＥ．ｔｅｎｅｌｌａの種虫の使用に関しては米国特
許第４，３０１，１４８号（１９８１）を参照された
い。
【０００８】ブロイラー鶏舎への生菌ワクチンの導入の
別法としては、飼料による方法がある。これについて
は、最近の英国特許（ＧＢ２，００８，４０４Ａ）に記
載されている。飼料と混合するに先立って、Ｅ．ｔｅｎ
ｅｌｌａの有毒な卵母細胞を水溶性ポリサッカライド中
に封入して乾燥から防御する。卵母細胞は無症状感染を
生じるのに十分な量のみ使用する。免疫感作能が優れて
いることは明らかにされたが、この方法の発展はフィー
ルドで受け入れられることに疑問があって期待できな
い。しかしながら、すべての重要なコクシジウムの減弱
株が開発されれば、この操作も受け入れられるようにな
るかもしれない。実際、毒性を減弱したＥｉｍｅｒｉａ
細胞系の開発の努力も行われてきた。一部の種について
は、鶏胚継代接種による減弱化に成功している（１９，
３７，４０，６６）。これらの株では、疾患を惹起する
能力は低下しているが、免疫を引き起こすだけの免疫原
性は保持されていた。しかしながら、これらの株の取扱
いにはいくつかの問題が残っている。たとえばＥ．ｎｅ
ｃａｔｒｉｘの減弱変異株には継代限界があって、胚継
代によって免疫原性の喪失または元の有毒型の保持を生
じることがある。さらに、一部の減弱化生物体は、鶏に
よる最小の戻し継代によって有毒型に復することがある
（３８，６８）。すなわち、減弱化生物体が一定の性状
を維持することに関連した問題が明白である。
【０００９】Ｅｉｍｅｒｉａ株の孵化鶏卵による継代が
容易でない場合は、早期選択による減弱化も実行されて
きた。この方法では、完全な卵母細胞の脱皮が始まる前
の感染無症候段階の後期に、脱皮した卵母細胞を収穫す
る（２８，４８，５０，６７）。このような選択により
ライフサイクルが省略された培養体が生じ、それに応じ
た毒性の減少が認められる（２８，４８，５０，６
７）。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ（２９）およびＥ．ａｃｅｒ
ｙｕｌｉｎａ（４９）の早熟の特性は遺伝的に安定なこ
とが明らかにされてはいるものの、この方法の養鶏産業
における手段としての有用性を評価するには情報が十分
ではない、鳥コクシジウムの表面抗原組成についてはほ
とんど情報がない。Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの
種虫の表面にある抗原に対してモノクロナール抗体を分
泌するハイブリドーマ細胞系が報告されている（８
２）。その分子量が１３〜１５０キロダルトンであった
ことを除き、抗原は同定されていない。また、その抗原
の生物学的重要性もその抗原によるワクチンの有効性も
述べられていない。
【００１０】ヨーロッパ特許公告第１３５，７１２号に
も、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの種虫と反応するモノクロナー
ル抗体が開示されている。この公告によってＥ．ｔｅｎ
ｅｌｌａ種虫抗原が開示された。さらに、ヨーロッパ特
許出願公告第１３５，０７３号には、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌ
ａのメロゾイトおよび種虫に対して特異的に反応するモ
ノクロナール抗体が開示され、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａから
誘導されるメロゾイト抗原が記載されている。Ｍ．Ｈ．
Ｗｉｓｈｅｒの研究室におけるこれまでの研究では、
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの脱出した種虫の表面ヨード化によ
り同定される、分子量２０，０００〜２００，０００以
上の約１６種のポリペプチドの存在が示唆されている
（８１）。さらに、ヨーロッパ特許出願公告第１６７，
４４３号には、コクシジウム症に対する防御のためのワ
クチンとして使用できる、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの種虫ま
たは胞子形成卵母細胞の抽出物が開示されている。これ
らの抽出物は複数種のポリペプチドを含有し、その１種
または２種以上がコクシジウム症を予防する抗原として
使用できる可能性がある。また、国際特許公告第ＷＯ／
００５２８号には、抗原性蛋白質をコードするＥ．ｔｅ
ｎｅｌｌａからのクローン化された遺伝子またはそのフ
ラグメントが開示される。これらの蛋白質は、鳥コクシ
ジウムの抗原性蛋白質に対するモノクロナールまたは多
価抗体と結合する。
【００１１】ワクチンの開発に対するサブユニットによ
るアプローチは、過去１年足らずの間に成功を博してき
たものである。このようなアプローチでは、保護抗原の
候補を同定し、最終的大量生産の目的で性質が調べられ
る。寄生体抗原の研究では、ひとつの研究グループが、
Ｂａｂｅｓｉａ ｂｏｖｉｓの表面上に保護抗原の可能
性が考えられる蛋白質を同定するためにモノクロナール
抗体を使用した（８３）。その結果、４４，０００ダル
トンのＢ．ｂｏｖｉｓ抗原が同定され、これを精製して
実験動物に注射したところ、初期チャレンジに対してあ
るレベルの防御が明らかにされた。Ｔｏｘｏｐｌａｓｍ
ａ ｇｏｎｄｉｉの免疫学的に重要な３０，０００ダル
トンの蛋白質もモノクロナール抗体を用いて同定されて
いる（３１）。
【００１２】１９８１年の中頃から、Ｄａｎｆｏｒｔｈ
と共同研究者は、鳥Ｅｉｍｅｒｉａ種の抗原に対するモ
ノクロナール抗体産生の可能性を示すいくつかの報告を
発表している（９，１０，１１）。同様に、Ｓｐｅｅｒ
ら（６９，７０）も、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａに対するハイ
ブリドーマの開発と、その生理学的性質を明らかにして
いる。抗体分泌ハイブリドーマは、間接的螢光抗体試験
に基づいて選択された（１０）。紫外線顕微鏡で観察さ
れた反応パターンは、使用したモノクロナール抗体によ
って変化した。そのパターンには、種虫のみとの特異的
反応と種虫およびメロゾイトとの反応、種虫の前部のみ
の染色と膜全体の染色、特定の内部小器官の染色と漠然
として内部染色等がある（１１）。モノクロナール抗体
産生げっ歯類起源のハイブリドーマの調整は、本技術に
通暁した研究者が等しく実行するところであるが、種
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌおよびＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘに対する
種虫中和ハイブリドーマまたは種Ｅ．ｍａｘｉｍａに対
するメロゾイト中和ハイブリドーマの直接的または特異
的選択で、サブユニットワクチンの開発に有用なこれら
の種の毒性決定基の同定が可能になることを示唆するよ
うな何の結果も得られていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｅ．ｔｅｎ
ｅｌｌａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥ．ｍａｘｉｍ
ａによって引き起こされるコクシジウム症に対する免疫
の発現のためのポリペプチド抗原の同定、特性づけ、製
造および使用に関するものである。融合蛋白質を含む組
換えポリペプチド抗原も包含される。抗原は、抗原の直
接含量によって正確に投与されるので疾患を惹起するこ
とはなく、したがってワクチンが種によっては疾患の突
発、先祖返りまたは免疫性の変化を生じることも回避で
きる。鶏のコクシジウム症による莫大な経済的損失か
ら、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘおよび
Ｅ．ｍａｘｉｍａに対するワクチンは望まれている。ハ
イブリドーマ技術を用いて、本発明者らは、サブユニッ
トワクチンに使用できる強力な保護抗原を同定し、精製
した。このようなサブユニットワクチンの使用によれ
ば、生菌ワクチンを使用した場合に認められるワクチン
−種に関係する疾患の突発および先祖返りまたは免疫性
の変化を回避することができる。
【００１４】生物体から製造できる寄生体抗原の量はき
わめてわずかで、きわめて高価につく。組換えＤＮＡク
ローニングおよび発現の技術は、大量の保護抗原を安価
に生産する新しい値を開くものである。簡単にいえば、
これらの方法は、抗体のすべてまたは部分をコードする
ＤＮＡ配列を、細胞内で抗原性蛋白質を産生するのに必
要な遺伝情報のコントロール下に、細胞内に位置させる
ことを要求する。遺伝情報は、合成ＤＮＡ（１７）、ゲ
ノム（たとえばウイルス）もしくは染色体ＤＮＡまたは
抗原をコードするｍＲＮＡから作られたｃＤＮＡであ
る。最後に挙げたアプローチがＥｉｍｅｒｉａ種のよう
な複雑な生物体についてはもっとも直接的な方法であ
る。しかしながら、ｃＤＮＡは抗原のアミノ酸配列に相
当する遺伝情報しか含まれないので、ｃＤＮＡ遺伝子の
発現に必要な遺伝シグナル（すなわち転写および翻訳）
を与える発現ベクター中に挿入する必要がある。抗原は
単独に合成されてもよいし、大腸菌内の他の蛋白質と融
合させた生成物として合成されてもよい。
【００１５】大腸菌内での有効なサブユニットワクチン
の製造は、ブタおよびウシの口蹄疫ウイルスの場合につ
いて報告がある（３３，６６）。口蹄疫ウイルスの表面
抗原は、大腸菌内で融合蛋白質抗原として産生された。
ウシおよびブタをこれらの抗原で免疫感作すると、有意
なレベルのウイルス中和抗体が産生された。組換えＤＮ
Ａ誘導抗原は口蹄疫ウイルスのチャレンジに対して保護
効果を示した。ゲノムおよび表面蛋白質について広範に
研究されている口蹄疫ウイルスのような単純な生物体と
異なり、Ｅｉｍｅｒｉａの分子生物学についてはほとん
ど知られていない。Ｗａｎｇ ＆ Ｓｔｏｔｉｓｈ（７
９，８０）は、胞子形成開始後６〜８時間に、Ｅ．ｔｅ
ｎｅｌｌａ内で起こる急速かつ一過性のＲＮＡおよび蛋
白質の合成を報告し、胞子形成時の全蛋白質および核酸
の合成はこの最初の１時間足らずの間に起こることを示
唆した。たとえば、Ｓｔｏｔｉｓｈら（７２）は、胞子
形成前の卵母細胞によって合成された種虫膜の糖蛋白質
の蛋白質成分は３０，０００ダルトンで、後に、胞子形
成の過程で種虫膜に導入されると述べている。最近、Ｓ
ｔｏｔｉｓｈら（７３）は、胞子形成前の卵母細胞、胞
子形成時の卵母細胞および種虫からのＲＮＡの単離とｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳について報告している。ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの翻訳生成物は１０，０００ダルトン未満
から２００，０００ダルトン以上の範囲にわたってい
る。胞子形成前および胞子形成時卵母細胞のＲＮＡ指示
蛋白質合成のパターンは異なっていて、胞子形成時に異
なるＲＮＡ集団が存在することを示唆する。
【００１６】抗原性蛋白質をコードするｃＤＮＡの製造
に際しては、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａのライフサイクルのい
つ抗原性蛋白質をコードするｍＲＮＡが生じるかを決定
する必要があった。本発明は、抗原性蛋白質をコードす
るｃＤＮＡクローンの単離および特性づけ、ならびに大
腸菌内での操作抗原性蛋白質の産生に関する。また、本
発明は、大腸菌内で産生されたこれらの蛋白質の不溶性
状態からの抽出、およびこれらの蛋白質をモノクロナー
ル抗体と免疫反応性にする方法に関する。最後に、本発
明は、細菌で産生された抗原性蛋白質の、Ｅ．ｔｅｎｅ
ｌｌａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥ．ｍａｘｉｍａ
によって惹起されるコクシジウム症に対する免疫を鶏に
産生させる目的でのプレパレーションおよび使用を提供
するものである。Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａから
誘導された抗原性蛋白質およびＥ．ｔｅｎｅｌｌａによ
って生じるコクシジウム症を予防するための上記抗原性
蛋白質含有ワクチンについては、ヨーロッパ特許公告第
１６４，１７６号に記載されている。
【００１７】
【課題を解決するための手段】図５に示した核酸配列を
有し、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａから誘導される
抗原性蛋白質をコードするゲノムＤＮＡ分子が単離され
た。天然の蛋白質は分子量約２５，０００ダルトンで、
ジスルフィド結合によって結合した２個のポリペプチド
から構成される。一方のポリペプチドは分子量約１７，
０００ダルトンで遮閉Ｎ末端アミノ酸を特徴とし、図５
に示したアミノ酸配列を有する。他方のポリペプチドは
分子量が約８，０００ダルトンであることを特徴とし、
図５に示したアミノ酸配列を有する。分子量約２５，０
００ダルトンで、図７に示した連続アミノ酸配列を有す
る抗原性ペプチドをコードするｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の核酸分子も単離された。ｃＤＮＡ分子は、２５，００
０ダルトンのポリペプチドを直接または融合ポリペプチ
ドとして発現可能な発現ベクター中に挿入された。ベク
ターｐＤＥＴ１は、分子量約２５，０００ダルトンで、
図７に示す連続アミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする。このベクターは大腸菌宿主細胞の形質転換に
使用され、この菌株はＲＥＮ３／ｐＤＥＴ１として（Ａ
ＴＣＣ登録番号第５３３１６号）寄託された。
【００１８】ベクターｐＤＥＴ２も、分子量約２５，０
００ダルトンで、図７に示す連続アミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードする。このベクターは大腸菌宿主
細胞の形質転換に使用され、この菌株はＲＥＮ３／ｐＤ
ＥＴ２として（ＡＴＣＣ登録番号第５３３１８号）寄託
された。ベクターｐＢＧＣ２３は、分子量約１３５，０
００ダルトンで、図７に示した２５，０００ダルトンの
ポリペプチドのアミノ酸配列とそのアミノ末端にβ−ガ
ラクトシダーゼのアミノ酸配列を有する融合ポリペプチ
ドをコードする。このベクターは大腸菌宿主細胞の形質
転換に使用され、この菌株はＲＥＮ３／ｐＢＧＣ２３と
して（ＡＴＣＣ登録番号第５３３１７号）寄託された。
ベクターｐＣＯＣ１２は、分子量約６５，６００ダルト
ンで、図７に示した２５，０００ダルトンポリペプチド
のアミノ酸配列とそのアミノ末端にプロキモシンのアミ
ノ酸配列を有する融合ポリペプチドをコードする。この
ベクターは大腸菌宿主細胞の形質転換に使用され、その
菌株はＲＥＮ３／ｐＣＯＣ１２として（ＡＴＣＣ登録番
号第５３３１４号）寄託された。ベクターｐＣＯＣ２０
は、分子量約５６，５００で、図７に示した２５，００
０ダルトンポリペプチドのアミノ酸配列とそのアミノ末
端に天然配列から８３個のアミノ酸が欠失したプロキモ
シンのアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドをコード
する。このベクターは大腸菌宿主細胞の形質転換に使用
され、その菌株はＲＥＮ３／ｐＣＯＣ２０として（ＡＴ
ＣＣ登録番号第５３３１３号）寄託された。抗原性ポリ
ペプチドの製造は、本発明の任意の宿主細胞をＤＮＡ発
現とポリペプチド産生を可能にする適当な条件下に生育
させ、生成したポリペプチドを適当な条件下に回収する
方法によって行われる。回収は、宿主細胞からのポリペ
プチドの分離、ポリペプチドの精製、ポリペプチドの可
溶化、ポリペプチドの再生、ついで精製、可溶化、再生
を行った抗原性ポリペプチドの回収によって実施され
る。
【００１９】Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対
する能動免疫を鶏に付与する方法は、本発明の任意のポ
リペプチドの免疫感作有効量を鶏に投与することによっ
て行われる。本明細書ではＮＡ４蛋白質またはＮＡ４抗
原とも呼ばれる精製抗原性蛋白質は、Ｅｉｍｅｒｉａ
ｎｅｃａｔｒｉｘから単離された。これはＥｉｍｅｒｉ
ａｎｅｃａｔｒｉｘまたはＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌ
ｌａ感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘
発することが可能である。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａについて
見出された相同性の抗原はＴＡ４抗原と呼ばれる。ＮＡ
４蛋白質は分子量約２６，０００ダルトンで、ジスルフ
ィド結合で結合された２個のポリペプチドから構成され
ている。このポリペプチドの一方は、分子量約１８，０
００でありＮ末端アミノ酸が遮閉されていることが特徴
的で、他方は分子量が約８，０００であることが特徴で
ある。両ポリペプチドのアミノ酸配列を図１７に示す。
【００２０】精製抗原性蛋白質は、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉ
ｘのスポロシストから別個に回収することによっても製
造できる。すなわち、抗原の回収は、ハイブリドーマ細
胞系ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８５６１によって産生される
高度に特異的なモノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／
４を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーまた
は免疫沈殿により行うことができる。別法として、蛋白
質はその蛋白質をコードするＤＮＡを適当な宿主中に導
入し、宿主内にＤＮＡを発現させ、蛋白質を回収するこ
とによっても製造できる。Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘおよび
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能動免疫は、抗原性蛋
白質の免疫感作有効量を鶏に投与することにより付与さ
れる。好ましくは、蛋白質またはそのフラグメントを適
当な担体とともにワクチンに導入し、ワクチンの適当用
量を非免疫鶏に投与する。
【００２１】Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの感染に対
する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘導でき、本明
細書においては８Ｂ５蛋白質また８Ｂ５抗原とも呼ばれ
るさらに精製された抗原性蛋白質が得られた。この蛋白
質は、還元性および非還元性の両ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対
し約５５，０００ダルトンの分子量を有する。Ｅ．ｍａ
ｘｉｍａ感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏
に誘導する能力によって特徴づけられる８Ｂ５蛋白質関
連ポリペプチドを得ることもできる。５５，０００ダル
トンの精製蛋白質抗原は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍ
ａのメロゾイトからそれを分離回収することによって製
造できる。好ましい一態様においては、回収は、ハイブ
リドーマ細胞系ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８９４６によって
産生されるモノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５を用
い、免疫吸着クロマトグラフィーまたは免疫沈殿で実施
される。Ｅ．ｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫は、５
５，０００ダルトンの蛋白質抗原またはその蛋白質抗原
の抗原性ポリペプチドフラグメントの免疫感作有効量を
鶏に投与することによって付与できる。好ましくは、蛋
白質またはポリペプチドを適当な担体とともにワクチン
に導入し、ワクチンの適当用量を鶏に投与する。
【００２２】Ｅ．ｍａｘｉｍａ感染に対する受動免疫を
付与するには、モノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５
またはこの種の任意の他の抗体を、好ましくは適当な担
体と混合して使用できる。さらに、モノクロナール抗体
に対する抗イデイオタイプ抗体を産生させ、Ｅ．ｍａｘ
ｉｍａ感染に対する能動免疫の付与に用いることもでき
る。抗イデイオタイプ抗体は、適当な担体とともに、ワ
クチンの形で投与することが好ましい。本発明はさら
に、Ｅｉｍｅｒｉａ属抗原またはエピトープに対する抗
体の産生をワクチン投与動物に誘発するのに有効な量の
任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原またはエピトープの混合物を
１回投与量としたＥｉｍｅｒｉａが原因となる疾患に対
する多成分ワクチンに関する。ワクチンにはまた、医薬
的に許容される担体を加えることもできる。Ｅｉｍｅｒ
ｉａ抗原は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、
Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘまたは他の任意のＥｉｍｅｒｉａ
種の抗原である。これらは、少なくとも１個のＥｉｍｅ
ｒｉａエピトープを包含する遺伝子操作抗原性融合ポリ
ペプチドであってもよい。
【００２３】
【発明の実施の形態】図５に示した核酸配列を有し、Ｅ
ｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａから誘導される抗原性蛋
白質をコードするゲノムＤＮＡ分子が単離された。天然
の蛋白質は分子量約２５，０００ダルトンで、ジスルフ
ィド結合によって結合された２個のポリペプチドから構
成される。ポリペプチドの一方は、分子量約１７，００
０ダルトンで、遮閉されたＮ末端アミノ酸が特徴的であ
って、図５に示すアミノ酸配列を有する。他方のポリペ
プチドは分子量約８，０００ダルトンで、図５に示すア
ミノ酸配列を有する。分子量約２５，０００ダルトン
で、図７に示す連続アミノ酸配列を有する抗原性ポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡまたはｍＲＮＡである核酸
分子も単離された。
【００２４】本明細書で使用する「抗原性ポリペプチ
ド」の語には、本明細書に述べるような非還元条件下で
製造されるプレパレーションで、そのプレパレーション
中に還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで一定の見かけの
分子量を有するポリペプチドの存在によって特徴づけら
れるプレパレーションを包含する。このようなプレパレ
ーション中に存在する場合、ポリペプチドは他の１個ま
たは２個以上の成分たとえば他のポリペプチドと１個ま
たは２個以上のジスルフィド結合で結合していてもよ
く、あるいはそのポリペプチド内の２個またはそれ以上
の領域でたがいにたとえばジスルフィド結合で結合して
いてもよい。プレパレーション内に還元条件下のＳＤＳ
−ＰＡＧＥで１８，０００またはそれ以下の見かけの分
子量をもつポリペプチドが存在するプレパレーションの
場合、このプレパレーションが完全な抗原性蛋白質内に
含有されるアミノ酸配列を包含するとの仮定で、このよ
うなプレパレーションを記述するのにも「フラグメン
ト」の語を使用する。さらに「フラグメント」の語は、
抗原性蛋白質から蛋白分解消化で誘導されるアミノ酸配
列に対しても使用される。
【００２５】約２５，０００ダルトン未満の分子量をも
つ抗原性ポリペプチドと、図５に示す核酸配列を有する
ＤＮＡによってコードされる蛋白質のアミノ酸配列内に
包含されるアミノ酸配列とをコードするＤＮＡ分子が意
図される。このＤＮＡ分子は他のアミノ酸配列をコード
する付加的ＤＮＡをもっていてもよく、この場合、ポリ
ペプチドの分子量は付加的アミノ酸配列の分子量によっ
て増大する。約２５，０００ダルトン以上の分子量をも
つ抗原性ポリペプチドをコードし、本発明のゲノムＤＮ
Ａ分子と他のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる
ＤＮＡ分子が意図される。約２５，０００ダルトン未満
の分子量をもつ抗原性ポリペプチドと図７に示す核酸配
列を有するＤＮＡによってコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列内に包含されるアミノ酸配列とをコードす
るＤＮＡ分子が意図される。このＤＮＡ分子は他のアミ
ノ酸配列をコードする付加的ＤＮＡをもっていてもよ
く、この場合、その分子量は付加的アミノ酸配列の分子
量によって増大する。本発明は、約２５，０００ダルト
ン以上の分子量をもつ抗原性ポリペプチドをコードし、
図７に示す核酸分子と他のポリペプチドのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ分子を提供する。
【００２６】組換えクローニングビークルは、クローニ
ングビークルＤＮＡと本発明のｃＤＮＡからなる。クロ
ーニングビークルは第１および第２の制限酵素部位の存
在によって特徴づけられ、ｃＤＮＡは上記部位中にクロ
ーン化される。本発明の、ｐＴＣＤ２６と命名されたｃ
ＤＮＡクローンを含有し、約２５，０００ダルトンの分
子量をもつ抗原性ポリペプチドと図７に示すアミノ酸配
列をコードするクローニングビークルが構築された。ク
ローニングビークルは細菌宿主細胞の形質転換に使用す
ることができる。大腸菌宿主細胞ＪＭ８３はこのクロー
ニングビークルで形質転換され、この菌株はＪＭ８３／
ｐＴＣＤ２６と命名された（ＡＴＣＣ登録番号第５３３
１５号）。
【００２７】本発明は、適当な宿主細胞に導入した場
合、２５，０００ダルトンの抗原性蛋白質を発現するこ
とができ、適当なキャリアーＤＮＡと図５に示すゲノム
ＤＮＡからなる発現ベクターを提供する。本発明のゲノ
ムＤＮＡを運搬する発現ベクターの場合、適当な宿主細
胞としては真核細胞すなわち酵母細胞または哺乳類細胞
がある。ほかに適当な宿主細胞は細菌宿主細胞すなわち
大腸菌がある。さらに、適当な宿主細胞中に導入した場
合、約２５，０００ダルトン未満の分子量をもつ抗原性
ポリペプチドを発現可能な発現ベクターも意図される。
このベクターは適当なキャリアーＤＮＡと約２５，００
０ダルトン未満の分子量をもつ抗原性ポリペプチドおよ
び図５または図７に示す核酸配列を有するＤＮＡによっ
てコードされる蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる。非キャリアー
ＤＮＡは他のアミノ酸配列をコードする付加的ＤＮＡを
もっていてもよく、この場合にはポリペプチドの分子量
は付加的アミノ酸配列の分子量によって増大する。
【００２８】適当なキャリアーＤＮＡとしては、真核細
胞の形質転換に使用するために本発明のゲノムＤＮＡ分
子を運搬できる任意のＤＮＡセグメントが用いられる。
適当なキャリアーＤＮＡの例としては真核生物ウイル
ス、好ましくは通常使用される鳥ウイルス、たとえばマ
レック病ウイルス、ニワトリポックスウイルスもしくは
七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、またはそれらの任
意の突然変異誘導体から導かれるキャリアーＤＮＡがあ
る。さらに、適当な宿主細胞中に導入した場合、２５，
０００ダルトン以上の分子量をもつ抗原性ポリペプチド
を発現可能な発現ベクターも意図される。このベクター
は適当なキャリアーＤＮＡと本発明のゲノムＤＮＡ分子
および他のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる。
適当な宿主細胞に導入した場合、２５，０００ダルトン
の抗原性ポリペプチドを発現できる細菌性発現ベクター
は、プラスミドＤＮＡと本発明のｃＤＮＡからなる。ｌ
ａｃ、ｌａｍｂｄａ ＰR およびｔａｃプロモーターの
コントロール下にある場合、このベクターはｐＤＥＴ１
と呼ばれる。ｌａｃおよびｔａｃプロモーターのコント
ロール下にある場合、このベクターはｐＤＥＴ２と呼ば
れる。
【００２９】適当な細菌性発現ベクターは二本鎖ＤＮＡ
分子で５′から３′への順に、プロモーターおよびオペ
レーターまたはプロモーターのみを含有するＤＮＡ配
列、所望の遺伝子のｍＲＮＡを宿主細胞内のリボソーム
へ結合可能にするためのリボソーム結合部位を含むＤＮ
Ａ配列、ＡＴＧ開始コドン、所望の遺伝子をベクター内
に、ＡＴＧ開始コドンと同位相で挿入するための制限酵
素部位、宿主細胞内での自動複製が可能な細菌性プラス
ミドからの複製オリジンを含むＤＮＡ配列、選択または
同定可能な表現型の特徴を伴う遺伝子を含有し、ベクタ
ーを宿主細胞内に置いた場合に表現されるＤＮＡ配列、
を包含する。
【００３０】本発明は、適当な細菌性宿主細胞内に導入
した場合、約２５，０００ダルトン未満の分子量を有す
る抗原性ポリペプチドを発現可能な細菌性発現ベクター
を意図する。このベクターは、プラスミドＤＮＡと、図
７に示すアミノ酸配列内に包含されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡからなる。非プラ
スミドＤＮＡはまた、他のアミノ酸配列をコードする付
加的ＤＮＡをもっていてもよく、この場合、ポリペプチ
ドの分子量は付加的アミノ酸配列の分子量によって増大
する。本発明は、適当な宿主細胞に導入した場合、約２
５，０００ダルトンのポリペプチドが他のアミノ酸配列
に融合した融合ポリペプチドの発現が可能な細菌性発現
ベクターを提供する。これは、プラスミドＤＮＡと、他
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに融合した本発明の
ｃＤＮＡから構成される。
【００３１】ベクターｐＢＧＣ２３は、分子量約１３
５，０００ダルトンで図７に示すアミノ酸配列のアミノ
末端にβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列が融合した
抗原性融合ポリペプチドをコードする。ベクターｐＣＯ
Ｃ１２は、分子量約６５，０００ダルトンで図７に示す
アミノ酸配列のアミノ末端にプロキモシンのアミノ酸配
列が融合した抗原性融合ポリペプチドをコードする。ベ
クターｐＣＯＣ２０は、分子量約５６，５００ダルトン
で図７に示すアミノ酸配列のアミノ末端にプロキモシン
の天然配列から８３個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配
列が融合した抗原性融合ポリペプチドをコードする。本
発明の細菌性発現ベクターは大腸菌宿主細胞の形質転換
に使用された。ＲＥＮ３／ｐＢＧＣ２３と命名された大
腸菌宿主細胞はベクターｐＢＧＣ２３を（ＡＴＣＣ登録
番号第５３３１４号）、ＲＥＮ３／ｐＣＯＣ２０と命名
された大腸菌宿主細胞はベクターｐＣＯＣ２０を（ＡＴ
ＣＣ登録番号第５３３１３号）、ＲＥＮ３／ｐＤＥＴ１
と命名された大腸菌宿主細胞はベクターｐＤＥＴ１を
（ＡＴＣＣ登録番号第５３３１６号）、ＲＥＮ３／ｐＤ
ＥＴ２と命名された大腸菌宿主細胞はベクターｐＤＥＴ
２を（ＡＴＣＣ登録番号第５３３１８号）含有する。
【００３２】抗原性ポリペプチドの製造は、本発明の任
意の宿主細胞をＤＮＡの発現、ポリペプチドの産生が可
能な適当な条件下に生育させ、生成したポリペプチドを
適当な条件下に回収することによって行われる。回収工
程はまず、ポリペプチドを宿主細胞から分離し、ついで
それを精製し、それを可溶化し、それを再生し、最後
に、精製、可溶化、再生された抗原性ポリペプチドを回
収することにより行われる。Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅ
ｌｌａ感染に対する能動免疫を鶏に付与する方法は、本
発明の任意のポリペプチドの免疫感作有効量を鶏に投与
するものである。ポリペプチドは２種またはそれ以上の
ポリペプチドの任意の組合せで投与することもできる。
【００３３】Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に
対する能動免疫を鶏に付与するワクチンは、本発明のポ
リペプチド任意の１種の免疫感作有効量と適当な担体を
１回用量としたものである。ワクチンは、本発明の２種
またはそれ以上のポリペプチドの組合せと適当な担体か
らなるものであってもよい。一実施態様においては、ワ
クチンに用いられるポリペプチドは分子量約１３５，０
００ダルトンで図７に示すアミノ酸配列のアミノ末端に
β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列が融合した融合ポ
リペプチドである。他の実施態様においては、ワクチン
に用いられるポリペプチドは分子量約６５，６００ダル
トンで図７に示すアミノ酸配列のアミノ末端にプロキモ
シンのアミノ酸配列が融合した融合ポリペプチドであ
る。Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染からの鶏の防
御は、本発明の任意のワクチンの適当用量を鶏に投与す
る方法で行われる。
【００３４】プラスミドｐＤＴＥ１は、２５，０００ダ
ルトンのポリペプチドをｌａｃ、ｌａｍｄａ ＰR およ
びｔａｃプロモーターのコントロール下にコードする。
プラスミドｐＤＴＥ２は、２５，０００ダルトンのポリ
ペプチドをｌａｃおよびｔａｃプロモーターのコントロ
ール下にコードする（図８）。ｐＤＥＴ１／ｐＤＥＴ２
蛋白質の最大収率は、プロテアーゼ欠損大腸菌株におい
て達成された（図９）。ｐＤＥＴ１およびｐＤＥＴ２蛋
白質は、細胞溶解物の不溶性分画に認められた。プラス
ミドｐＢＧＣ２３は大腸菌β−ガラクトシダーゼの暗号
配列の３′末端をｃＤＮＡ誘導ＴＡ４ポリペプチドの暗
号配列の５′末端に融合させることによって構築され、
約１３５，０００ダルトンの融合ペプチドをコードする
（図１０）。ｐＢＧＣ２３蛋白質は、大腸菌中で安定で
あるが、不溶性である（図１１）。プラスミドｐＣＯＣ
１２は、ウシプロキモシンの暗号配列の３′末端をｃＤ
ＮＡ誘導ＴＡ４ポリペプチドの暗号配列の５′末端に融
合することによって構築され、約６５，６００ダルトン
の融合蛋白質をコードする。プラスミドｐＣＯＣ２０
は、ｐＣＯＣ１２から、融合蛋白質のプロキモシン領域
中の欠失により構築され、約５６，５００ダルトンの融
合蛋白質をコードする（図１３）。ｐＣＯＣ１２および
ｐＣＯＣ２０蛋白質は大腸菌内で安定であるが、不溶性
である（図１４）。不溶性の、細菌産生ＴＡ４蛋白質は
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ種虫対して産生される中和モノクロ
ナール、Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と免疫反応性を示さなか
った。ｐＢＧＣ２３およびｐＣＯＣ１２からの不溶性蛋
白質をマウスに注射しても、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａから精
製されたＴＡ４抗原と交差反応する抗体は産生されなか
った。
【００３５】本発明はまた、細菌産生ＴＡ４蛋白質を不
溶性状態から抽出する方法およびその蛋白質をモノクロ
ナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と免疫反応性にする方
法を提供する。それは、蛋白質を８Ｍ尿素中に可溶化
し、ついで希釈して、アルカリ性ｐＨ（ｐＨ１１）で再
生し、ｐＨ８．３に逆滴定する方法である。別法とし
て、蛋白質を８Ｍ尿素中に可溶化し、尿素を透析で除去
してもよい。尿素−アルカリ可溶化／再生過程をｐＣＯ
Ｃ１２蛋白質に対して用いた場合、再生蛋白質は凝乳活
性とモノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４との免疫
活性の両者を示した。再生条件はｐＣＯＣ１２蛋白質を
用いて至適化した。ｐＣＯＣ２０蛋白質およびｐＢＧＣ
２３蛋白質についての至適再生条件もｐＣＯＣ１２の場
合と同じであることが明らかになった。一方、ｐＤＥＴ
２蛋白質の場合、至適再生条件はアルカリ性ｐＨでの尿
素透析であった。
【００３６】再生ｐＢＧＣ２３およびｐＣＯＣ１２蛋白
質はマウスに抗体を誘導し、これはＥ．ｔｅｎｅｌｌａ
から精製したＴＡ４抗原と反応した。鶏を再生ｐＢＧＣ
２３およびｐＣＯＣ１２蛋白質で免疫感作したところ、
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの種虫に対する血清中和抗体を誘導
し、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａをチャレンジした鶏でコクシジ
ウム症を緩和した。本発明はまた、細菌性再生ＴＡ４蛋
白質を鶏に投与することによる、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅ
ｎｅｌｌａ感染に対する能動免疫を鶏に付与する方法を
包含する。この方法により、非免疫鶏に能動免疫を付与
することができる。さらに、これらの物質の投与は、以
前にＥ．ｔｅｎｅｌｌａに曝露された鶏における比較的
低レベルの免疫を増強するのに、また追加予防接種に用
いることができる。
【００３７】細菌性ＴＡ４蛋白質は、公知の任意の方法
で鶏に投与することができる。望ましい投与方法には、
皮下、腹腔内、もしくは頚背部への筋肉内注射、または
任意の慣用の形式の経口投与がある。抗原の免疫感作有
効量は、約０．１μｇ〜約１ｍｇの任意の量である。望
ましい抗原量は約１０μｇ以上である。好ましい抗原量
は体重１ｋｇあたり約５００μｇである。また、投与は
経口でも（たとえばカプセルによる）、注射（たとえ
ば、皮下、皮内、また好ましくは筋肉内注射）でもよ
い。投与方法が注射の場合には、任意の医薬的に許容さ
れる担体が使用できる。適当な担体には０．０１〜０．
１Ｍ好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝剤、または０．８
％食塩水がある。Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染
に対する能動免疫を鶏に付与するためのワクチンは、本
発明の抗原性物質、すなわち細菌性再生ＴＡ４蛋白質の
免疫感作有効量と適当な担体からなる。ワクチン中の抗
原性物質の免疫感作有効量は、鶏の体重１ｋｇあたり約
０．１μｇ以上が好ましい。さらに、担体には防腐剤も
添加することが望ましい。とくに適当な防腐剤はチメロ
サール（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム）であ
り、これは細菌および黴の両者の発育阻止活性を有す
る。ワクチン中にチメロサールを最終濃度が１０ -4％に
なるように添加するのが好ましい。
【００３８】さらに、担体は、免疫増強剤、すなわち処
置動物のワクチンに対する免疫応答を増強する物質を含
有することが望ましい。たとえばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ＬＰＳを１用量あたり１０μｇ
加える。本技術分野で公知の各種免疫増強剤が使用であ
る。現在用いられているアジュバントとしては９４％Ｄ
ｒａｋｅｏｌ ６−ＶＲ、５％Ａｒｌａｃｅｌ Ａ、１
％Ｔｗｅｅｎ ８０がある。Ａｒｌａｃｅｌ Ａはマニ
ッドモノオレエート（Ｓａｎｄｎｉａ Ｃｏｒｐ．）で
あり、抗原と合したときに強力な免疫増強剤活性を示
す。Ｄｒａｋｅｏｌ ６−ＶＲは低アレルギー性の軽鉱
油製品（Ｐｅｎｒｅｃｏ Ｃｏｒｐ．）である。Ｔｗｅ
ｅｎ ８０はポリオキシエチレンソルビタンのモノオレ
エート誘導体で、界面活性作用を有する。その他の適当
な担体または免疫増強剤としては、硫酸カルシウム、水
酸化アルミニウム、オキシン分子のリガンド発見サブユ
ニット、バオオアドヘッシブ、リンホカインおよび水中
乳乳化液が包含される。
【００３９】このようなワクチンの適当用量を鶏に投与
することにより、鶏はＥ．ｔｅｎｅｌｌａの感染に対し
て防御される。１回あたりの抗原性物質の用量は、投与
された動物に抗原性物質に対する抗体の産生を誘発する
のに十分な量でなければならない。抗体の産生および防
御から判断して十分な免疫応答を得るためには、抗原性
物質の１回投与量は望ましくは、予防接種動物の体重１
ｋｇあたり約２０．０μｇ以上である。すなわち、１日
齢、５０ｇのヒナの場合の抗原性物質の量は約１．０μ
ｇ以上である。現時点では、抗原性物質１０μｇを含有
するワクチンが好ましい。一般的に、抗原は重量ベース
でワクチンの約０．００２％から約０．２％までとし、
用量は約０．１ｍｌとなる。本発明はまた、分子量約２
６，０００ダルトンで、ジスルフィド結合で結合した２
個のポリペプチドから構成され、一方のポリペプチドは
分子量約１８，０００でＮ末端アミノ酸が遮閉されてい
ることを特徴とし、他方のポリペプチドは分子量約８，
０００ダルトンであって、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔ
ｒｉｘの感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏
に誘発できる精製抗原性蛋白質（以下ＮＡ４と呼ぶ）を
提供する。
【００４０】２６，０００ダルトン抗原性蛋白質または
その１８，０００ダルトンおよび８，０００ダルトンポ
リペプチド成分の抗原性類縁体も本発明に包含される。
本明細書において用いられる「類縁体」の語は、アミノ
酸配列が図１７に示した２６，０００ダルトン蛋白質な
らびに１８，０００および８，０００ダルトンポリペプ
チドについて記載した配列とは、１種または２種のアミ
ノ酸の置換の結果、異なるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを意味する。このような類縁体は、それがＥ．ｎ
ｅｃａｔｒｉｘまたはＥ．ｔｅｎｅｌｌａに対する防御
を付与する免疫応答を誘発できる抗原性を保持している
限り、本発明に包含される。
【００４１】ＮＡ４蛋白質は、まずＥｉｍｅｒｉａ ｎ
ｅｃａｔｒｉｘのスポロシストを適当な非還元条件下、
プロテアーゼ阻害剤の存在下に界面活性剤と接触させ
て、スポロシスト膜蛋白質を可溶化することによって製
造される。次に、可溶化したスポロシスト膜蛋白質か
ら、適当な非還元条件下に、所望の蛋白質を分離回収す
る。回収は、可溶化スポロシスト膜蛋白質を、適当な非
還元条件下に、ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー
ついでプレパラティブＳＤＳゲル電気泳動によって部分
精製することにより行われる。回収はまた、モノクロナ
ール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４（ＡＴＣＣ第ＨＢ８５６
１号）を用いた免疫沈殿また免疫アフィニティークロマ
トグラフィーによっても実施できる。本発明は、Ｅｉｍ
ｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥｉｍｅｒｉａ ｔ
ｅｎｅｌｌａ感染に対する防御機構を付与する免疫応答
を鶏に誘導でき、２６，０００ダルトンＮＡ４蛋白質の
アミノ酸配列内に包含されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、ＮＡ
４蛋白質からの抗原性決定基を含有し、免疫応答を誘発
できるすべてのアミノ酸配列を包含する。このポリペプ
チドの類縁体およびそのポリペプチドに対するモノクロ
ナール抗体も、本発明に包含される。さらに、そのモノ
クロナール抗体に対する抗−イデイオタイプ抗体も、本
発明に包含される。
【００４２】ＮＡ４蛋白質中に存在するアミノ酸配列を
包含する抗原性ポリペプチドは、各種の方法によって製
造できる。たとえば、化学的にもしくは酵素的に合成、
組換えＤＮＡ法によって生産、ＮＡ４抗原から製造また
はＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘのスポロシストもしくは種虫か
ら製造できる。本発明の抗原は、ＮＡ４蛋白質のアミノ
酸配列内に包含されるアミノ酸配列のほかに、１種また
は２種以上の他の物質、すなわち、ポリサッカライドた
とえばデキストラン、または他のアミノ酸配列たとえば
図１７に示されたアミノ酸配列に含まれないアミノ酸配
列を含有することもできる。また、２６，０００ダルト
ンＮＡ４蛋白質のアミノ酸配列とさらに付加的アミノ酸
配列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘおよび
Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に対する防御機
構を付与する免疫応答を鶏に誘導可能な、融合抗原性ポ
リペプチドも本発明に包含される。このポリペプチドの
類縁体、それに対するモノクロナール抗体も本発明に包
含される。さらに、このモノクロナール抗体に対する抗
イデイオタイプ抗体も本発明に包含される。
【００４３】ＮＡ４抗原の１８，０００ダルトンポリペ
プチドは、まず、Ｅｉｍｅｒｉａｎｅｃａｔｒｉｘのス
ポロシストを適当な条件下、プロテアーゼ阻害剤の存在
下に界面活性剤と接触させて、スポロシスト膜蛋白質を
可溶化させる。ついで、可溶化したスポロシスト膜蛋白
質からポリペプチドを適当な還元性条件下に、分離回収
する。この回収工程には、可溶化スポロシスト膜蛋白質
の、適当な還元性条件下でのＤＥＡＥ−ＨＰＬＣクロマ
トグラフィーついでプレパラティブＳＤＳゲル電気泳動
による部分精製が包含されてもよい。
【００４４】本発明は、それ自体Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅ
ｃａｔｒｉｘおよびＥｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａの感
染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘導でき
るＮＡ４抗原の１８，０００ダルトンポリペプチドのア
ミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドを包含する。ま
た、１８，０００ダルトンポリペプチドのフラグメント
である抗原性ポリペプチドまたは、１８，０００ダルト
ンポリペプチドに付加的アミノ酸配列が融合した抗原性
ポリペプチドも本発明に包含される。これらのフラグメ
ントそれぞれの抗原性類縁体、ならびにそれぞれのフラ
グメントに対して産生する抗−イデイオタイプ抗体も、
本発明に包含される。ＮＡ４蛋白質の他の製造方法とし
ては、その蛋白質をコードするＤＮＡ分子の製造、その
ＤＮＡ分子の適当な発現ベクターたとえばＰＬもしくは
ｌａｃプロモーターを含むベクター中への挿入、得られ
た発現ベクターの適当な宿主細胞たとえば大腸菌への、
ＤＮＡの発現および蛋白質の産生を可能にする適当な条
件での導入、および産生蛋白質の回収による方法があ
る。ＮＡ４抗原の１８，０００ダルトンポリペプチドの
他の製造方法としては、このポリペプチドをコードする
ＤＮＡの製造、このＤＮＡ分子の適当な発現ベクター中
への挿入、得られた発現ベクターたとえばＰＬまたはｌ
ａｃプロモーター含有ベクターの、そのＤＮＡの発現お
よび蛋白質の産生を可能にする適当な条件下での適当な
宿主細胞たとえば大腸菌への導入、および産生蛋白質の
回収による方法がある。
【００４５】胞子形成過程の多くの時点で、スポロシス
トからメッセンジャーＲＮＡを単離することができる。
これらのｍＲＮＡサンプルは、ついで、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ（４４）またｉｎ ｖｉｖｏ系を用いて翻訳すること
ができる。次に、翻訳生成物を、モノクロナール抗体
（Ｐｔｎ７．２Ａ４／４）を用いて免疫沈殿させる。Ｎ
Ａ４抗原をコードするｍＲＮＡプレパレーションを用い
て、次に、二本鎖ｃＤＮＡを製造する（４４）。このｃ
ＤＮＡを適当なクローニングベクターに挿入し、これを
用いて大腸菌を形質転換し、ｃＤＮＡライブラリーを発
生させる。このｃＤＮＡライブラリーを、ＮＡ４抗原の
１８，０００ダルトンポリペプチド成分からのアミノ酸
配列情報に基づいて構築された同位元素標識オリゴヌク
レオチドプローブを用い、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法によってスクリーニングする。１８，０００ダル
トンポリペプチドに対するヌクレオチド配列を含む細菌
コロニーからベクターＤＮＡを単離し、挿入されたコク
シジウムＤＮＡの配列を決定する。
【００４６】本発明はまた、ＮＡ４抗原の８，０００ダ
ルトンポリペプチドのアミノ酸配列を有し、Ｅｉｍｅｒ
ｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘまたはＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎ
ｅｌｌａ感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏
に誘導できる抗原性ポリペプチドを提供する。また、
８，０００ダルトンポリペプチドのフラグメントである
抗原性ポリペプチドまたは８，０００ダルトンポリペプ
チドが付加的アミノ酸配列に融合した抗原性ポリペプチ
ドを提供する。これらのフラグメントそれぞれの抗原性
類縁体、ならびに各フラグメントに対するモノクロナー
ル抗体を提供する。モノクロナール抗体に対する抗イデ
イオタイプ抗体も本発明に包含される。
【００４７】Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘもしく
はＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、またはその両者に
よる感染に対する能動免疫を鶏に付与する方法は、ＮＡ
４蛋白質、１８，０００ダルトンポリペプチド、８，０
００ダルトンポリペプチド、それらのフラグメント、そ
れらの融合生成物またはそれらの類縁体の免疫感作有効
量を鶏に投与するものである。これらの各種抗原それぞ
れは、単独にまたは他の抗原１種もしくは２種以上と組
合せて使用される。これらの物質の投与は、以前にＥ．
ｔｅｎｅｌｌａまたはＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘに曝露され
たことがある鶏の比較的に低レベルの免疫を増大させる
ため、および追加予防接種のために、使用できる。
【００４８】本発明のＮＡ４抗原または任意の抗原性ポ
リペプチドは、任意の公知の方法によって鶏に投与する
ことができる。望ましい投与方法としては、背頚部の皮
下または筋肉内注射がある。抗原の免疫感作有効量は、
約０．１μｇ〜約１ｍｇの任意の量である。抗原の量は
約１０μｇ以上であることが望ましい。好ましい抗原量
は鶏の体重１ｋｇあたり約５００μｇである。また、投
与は、経口（たとえばカプセルによる）または望ましく
は注射（たとえば皮下、皮内、また好ましくは筋肉内注
射）によって行われる。投与方法が注射である場合、任
意の医薬的に許容される担体が使用できる。適当な担体
としては、０．０１〜０．１Ｍ好ましくは０．０５Ｍリ
ン酸塩緩衝液または０．８％食塩水を挙げることができ
る。Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘもしくはＥｉｍ
ｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａまたはその両者の組合による
感染に対して鶏に能動免疫を付与するためのワクチン
は、１用量あたり、ＮＡ４蛋白質、１８，０００ダルト
ンポリペプチド、８，０００ダルトンポリペプチド、そ
れらのフラグメント、それらの融合蛋白質、またはそれ
らの類縁体の免疫感作有効量と、適当な担体からなる。
各種抗原はそれぞれ、単独にまたは他の抗原１種もしく
は２種以上の組合せで使用できる。免疫感作有効量は通
常、鶏１ｋｇあたり約０．１μｇ以上である。Ｅｉｍｅ
ｒｉａｎｅｃａｔｒｉｘもしくはＥｉｍｅｒｉａ ｔｅ
ｎｅｌｌａのいずれかまたは両者の組合せによる感染に
対して鶏を防御する方法は、このワクチンの適当量を鶏
に投与することである。
【００４９】このようなワクチン適当用量を鶏に投与す
ることにより、鶏をＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘまたはＥ．ｔ
ｅｎｅｌｌａ感染に対して防御される。１用量あたりの
抗原物質量は、ワクチン投与動物に抗原性物質に対する
抗体の産生を誘導するのに十分な量でなければならな
い。抗体産生および防御効果の点からみて十分な免疫応
答を与えるには、１用量あたりの抗原性物質の量は予防
接種動物の体重１ｋｇあたり約２０．０μｇ以上が望ま
しい。すなわち、５０ｇの１日齢ヒナの場合の抗原性物
質量は約１．０μｇ以上である。現時点では、抗原性物
質１０μｇを含有するワクチンが好ましい。一般的に、
抗原はワクチン中約０．００２重量％から０．２重量％
の割合で添加され、投与容量は約０．１ｍｌとなる。
【００５０】本発明はまた、ＮＡ４蛋白質をコードし、
図１７に示した核酸配列を有する核酸分子を提供する。
さらに、ＮＡ４の少なくとも１種の蛋白質をコードする
ｃＲＮＡおよびｍＲＮＡを提供する。これらの核酸分子
はクローニングビークル中に挿入され、これが適当な宿
主細胞に中に挿入される。適当な宿主細胞は真核細胞、
たとえば酵母細胞または哺乳類細胞である。本発明はま
た、ＮＡ４蛋白質をコードするｃＤＮＡ分子の少なくと
も部分とクローニングベクターＤＮＡからなる組換えク
ローニングベクターを提供する。クローニングベクター
は第１および第２の制限酵素部位の存在を特徴とする。
ｃＤＮＡはこれらの部位の間にクローン化される。組換
えクローニングベクターＤＮＡはプラスミドＤＮＡとす
ることができる。さらに、宿主細胞は細菌性細胞とする
ことができる。
【００５１】プラスミドＤＮＡと、ＮＡ４をコードする
ｃＤＮＡ約９０％からなる組換えクローニングベクター
が構築され、ｐＳＭＡＣと命名された。このプラスミド
で形質転換された大腸菌宿主細胞はＪＭ８３／ｐＳＭＡ
Ｃと命名され、ＡＴＣＣに登録番号第６７ ２４１号で
寄託されている。同じくＮＡ４をコードするｃＤＮＡ約
９０％を包含する他の組換えクローニングベクターも構
築され、ｐＳＳ３３と命名された。このベクターで形質
転換された大腸菌宿主細胞はＪＭ８３／ｐＳＳ３３と命
名され、ＡＴＣＣに登録番号第６７ ２４２号として寄
託されている。蛋白質ＮＡ４をコードするｃＤＮＡ約１
００％を包含する組換えクローニングベクターがさらに
構築され、ｐＮＣＤと命名された。このプラスミドは大
腸菌宿主細胞の形質転換に使用され、これはＪＭ８３／
ｐＮＣＤと命名され、ＡＴＣＣに登録番号第６７２６６
号として寄託された。本発明はまた、組換え発現ベクタ
ーを提供する。その一実施態様においては、ＮＡ４蛋白
質の少なくとも部分と他のアミノ酸配列からなる融合ポ
リペプチドを可能にする組換え発現ベクターがある。こ
のような発現ベクターが構築され、ｐＴＤＳ１、ｐＴＤ
Ｓ２、ｐＤＤＳ１およびｐＤＤＳ２と命名された。これ
らのプラスミドは大腸菌細胞の形質転換に使用され、そ
れぞれＭＨ１／ｐＴＤＳ１、ＭＨ１／ｐＴＤＳ２、ＭＨ
１／ｐＤＤＳ１およびＪＭ８３／ｐＤＤＳ２と命名さ
れ、ＡＴＣＣに登録番号第６７ ２４０号、第６７ ２
６４号、第６７ ２４３号および第６７ ２６５号とし
て寄託されている。
【００５２】ＮＡ４蛋白質の製造方法は、上述のクロー
ニングベクターを、蛋白質の産生を可能にする適当な条
件下に挿入された宿主細胞を生育させ、生成した蛋白質
を回収するものである。本発明はまた、ＮＡ４蛋白質と
ほぼ同じアミノ酸配列を有するが、細菌または他の異種
宿主内での発現のために相違する蛋白質をも包含する。
さらに一態様として、ＮＡ４抗原の主たる保護的構造と
共通の空間的特徴を有する部分構造で、前述の抗原を置
換することもできる。
【００５３】このような組成物の例としては、ＮＡ４蛋
白質または本発明の抗原性ポリペプチドの１種に対する
抗体、たとえばモノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／
４で、その構造がそれぞれの抗原決定基に対する特異性
を付与する抗体の構造に対して産生する抗イデイオタイ
プの抗体が包含される。このような抗イデイオタイプ抗
体はモノクロナール抗体とすることもできるし、ポリク
ロナール抗体として産生させることもできる。前者の例
としては、抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４はハイブリドーマ
細胞系ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８５６１から回収され、精
製され、任意の適当なキャリアー蛋白質たとえばキーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共有結合で付
着させる。精製された抗体、好ましくは精製された抗体
−ＫＬＨ複合体を、好ましくはフロインド完全アジュバ
ントのようなアジュバントとともに、適当な哺乳類リン
パ球ドナー好ましくはＢａｌｂ／Ｃ系マウスに、反復注
射する。免疫処置マウスのリンパ球からハイブリドーマ
が発生する。ハイブリドーマを、モノクロナール抗体Ｐ
ｔｎ７．２Ａ４／４との反応ではＮＡ４抗原と競合する
が、ＮＡ４抗原もＰｔｎ７．２Ａ４／４以外のげっ歯類
免疫グロブリンも認識しない抗体についてスクリーニン
グした。モノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４に対
する抗−イデイオタイプ抗体を分泌するハイブリドーマ
をさらに増殖させ、クローン化する。抗−イデイオタイ
プ抗体の製造は、ハイブリドーマの生育およびモノクロ
ナール抗体の発現に適当なメジウム中での細胞培養、ま
たは好ましいビークルとしてＢａｌｂ／Ｃマウスを用い
た抗体産生ハイブリドーマの宿主動物中での生育によっ
て実施される。
【００５４】抗−イデイオタイプ抗体はまた、動物への
Ｐｔｎ７．２Ａ４／４の注射によっても製造できる。好
ましい一方法は、精製したＰｔｎ７．２Ａ４／４、５０
０μｇを適当なアジュバントたとえば完全フロインドア
ジュバント中に処方化し、適当な動物たとえばウサギに
反復注射する方法である。十分に注射したのち、適当な
期間後に動物から血清を採取する。ついで、抗イデイオ
タイプ抗体を血清から、たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅTM
のような不溶性支持体に固定化した正常マウス血清に吸
着させて回収した。得られた抗血清の特異性は、モノク
ロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と反応性を示すが正
常げっ歯類抗体に対して反応しないことで確認される。
【００５５】上述のようにして製造された抗−イデイオ
タイプ抗体をさらにＩｇＧフラクションのレベルまで精
製する。精製した抗−イデイオタイプ抗体は、抗原の場
合に記述したと同様に、任意の公知方法で投与すること
ができる。本発明の抗イデイオタイプ抗体の有効量を鶏
に投与すると、これがＥｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉ
ｘまたはＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する
能動免疫を鶏に付与する方法になる。この目的でのワク
チンは抗−イデイオタイプ抗体の免疫感作有効量と適当
な担体からなる。このワクチンの適当用量を鶏に投与す
ると、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘまたはＥｉｍ
ｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する鶏の防御方法に
なる。１用量あたりの抗イデイオタイプ抗体の量はワク
チン投与動物に抗体の産生を誘発するのに十分な量でな
ければならない。抗体の産生によって示される免疫応答
の誘発に要する１用量あたりの抗イデイオタイプ抗体量
は、予防接種する鳥の体重１ｋｇあたり５０μｇ以上で
ある。すなわち５０ｇの１日齢ヒナの場合、抗−イデイ
オタイプ抗体２．５μｇが投与される。したがって、抗
−イデイオタイプ抗体２５μｇを含むワクチンが好まし
い。一般的に、抗−イデイオタイプ抗体はワクチン中に
約０．００２重量％から０．２重量％の割合で添加さ
れ、投与容量は０．２ｃｃである。
【００５６】本発明はまた、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａ
ｔｒｉｘの卵母細胞から全ゲノムＤＮＡを単離し、単離
されたゲノムＤＮＡからＤＮＡフラグメントを調製し、
このフラグメントを適当なクローニングベクターにリゲ
ートし、得られたクローンのＤＮＡを図１７に示す核酸
配列内に存在する核酸配列を含むかまたはそれと相補性
のオリゴヌクレオチドとハーブリダイゼーションさせて
適当なクローンを同定し、適当なクローンから図１７に
示す蛋白質をコードし、その核酸配列を有するＤＮＡを
単離することによる、図１７に示す核酸配列を有するＤ
ＮＡを得る方法を提供する。
【００５７】ＮＡ４蛋白質は、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘの
スポロシストから誘導される、精製種虫膜蛋白質であ
る。この蛋白質は、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥ．ｔ
ｅｎｅｌｌａ小腸内寄生体の感染に対する防御機能を付
与する免疫応答を非免疫鶏に誘導できる抗原である。こ
の蛋白質はＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘから誘導されたが、こ
の蛋白質を他の方法、たとえば組換えＤＮＡ技術または
全有機合成によって製造することが可能である。すなわ
ち、本発明は直接Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘから製造された
蛋白質に限定されるものではなく、その製造方法とは無
関係にその蛋白質自体を包含するものである。このよう
にして製造された蛋白質も寄生体から精製された構造と
同一であるか、同一の一定のフラグメントとして存在す
る。それは相同性または非相同性配列とＮＡ４の融合体
として存在してもよい。さらにそれは類縁体としてまた
は同一の内部イメージ（イデイオタイプ）として存在し
てもよい。ＮＡ４蛋白質抗原は分子量約２６，０００で
あり、ジスルフィド結合で結合した２個のポリペプチド
から構成される。このポリペプチドの一方は、分子量約
１８，０００で遮閉されたＮ末端アミノ酸が特徴的であ
る。
【００５８】約１６，０００ダルトンのＣＮＢｒフラグ
メントは以下の部分アミノ酸配列：
【化４】 を有する。８，０００ダルトンポリペプチドのＮ末端ア
ミノ酸配列は：
【化５】 である。ＮＡ４抗原をコードする遺伝子のＤＮＡ配列か
ら推測されるＮＡ４蛋白質の全アミノ酸配列を図１７に
示す。Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘからのゲノムＤＮＡを単離
し、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで分解した。制
限フラグメントを適当なクローニングベクター、λ−ｇ
ｔ ｗｅｓ λ−Ｂにリゲートし、ゲノムライブラリー
を発生させた。
【００５９】ついで、ゲノムライブラリーを、図２の
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａゲノムクローンの７８５ｂｐＳａｃ
Ｉ−ＰｖｕＩＩフラグメントとのプラークハイブリダイ
ゼーションによってスクリーニングした。ＮＡ４抗原を
コードするゲノムクローンを単離したところ、ＤＮＡ配
列は連続ヌクレオチド配列（図１７）によってコードさ
れるＮＡ４抗原の２個のペプチドを示した。１８，００
０および８，０００ダルトンペプチドは、したがって、
１本の２６，０００ダルトンペプチドの蛋白分解処理か
ら誘導される。また、シグナル配列をコードするＤＮＡ
配列は、通常、多くの分泌または膜蛋白質のアミノ末端
に見出される。本発明はさらに、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａ
ｘｉｍａの感染に対する防御機構を付与する免疫応答を
鶏に誘導できる精製抗原性蛋白質に関する。この蛋白質
は分子量約５５，０００ダルトンで、抗原性ポリペプチ
ドからなる。
【００６０】本明細書においては８Ｂ５蛋白質または８
Ｂ５抗原とも呼ばれる５５，０００ダルトン蛋白質は、
Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａのメロゾイトから得られ
た。この蛋白質はＥ．ｍａｘｉｍａから誘導されたが、
この蛋白質は他の方法、たとえば組換えＤＮＡ技術また
は全有機合成によっても製造できる。すなわち、本発明
は直接Ｅ．ｍａｘｉｍａから製造された蛋白質に限定さ
れるものではなく、その製造方法と無関係にその蛋白質
自体を包含するものである。本発明はまた、分子量約５
５，０００ダルトン未満で、８Ｂ５蛋白質内に存在する
アミノ酸配列を包含し、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ
感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘導で
きる抗原性蛋白質を提供する。このポリペプチドは８Ｂ
５蛋白質からの抗原決定基を含有し、免疫応答を誘導可
能な全アミノ酸配列を包含する。
【００６１】８Ｂ５蛋白質中に存在するアミノ酸配列を
含有する抗原性ペプチドは各種方法により、たとえば化
学的もしくは酵素的合成により、組換えＤＮＡ技術によ
り、また８Ｂ５抗原から、またはＥ．ｍａｘｉｍａメロ
ゾイトから製造できる。本発明はまた、８Ｂ５蛋白質の
製造方法を提供する。この方法には、Ｅ．ｍａｘｉｍａ
のメロゾイトを適当な条件下、プロテアーゼ阻害剤の存
在下に界面活性剤と接触させて、メロゾイト膜蛋白質を
可溶化させる方法がある。ついでこの蛋白質を、蛋白質
の分離および精製方法を用いて、可溶化メロゾイト蛋白
質から分離回収する。このような方法は本発明の技術分
野における通常の熟練者にはよく知られていて、たとえ
ば、可溶化したメロゾイト膜のイオン交換クロマトグラ
フィーによる部分精製がある。また、８Ｂ５蛋白質は、
ＡＴＣＣに登録番号ＨＢ８９４６号で寄託されているマ
ウスハイブリドーマ細胞系によって産生され、Ｐｍｘ４
７．８Ｂ５と命名されたモノクロナール抗体のように、
８Ｂ５蛋白質に対するモノクロナール抗体を用いた免疫
沈殿または免疫吸着クロマトグラフィーによって、Ｅ．
ｍａｘｉｍａメロゾイト膜蛋白質から分離回収される
（上記寄託は、特許出願のための微生物寄託の国際認知
に関するブタペスト協定に従って行われた）。
【００６２】８Ｂ５蛋白質のポリペプチドは、８Ｂ５蛋
白質の製造の場合と同じ方法で製造できる。ついでポリ
ペプチドは、たとえばイオン交換クロマトグラフィーた
とえばＤＥＡＥ−セルロースでの部分精製により、また
ついで還元条件下におけるプレパラティブＳＤＳ−電気
泳動により、分離回収される。本発明の５５，０００ダ
ルトン８Ｂ５蛋白質または各種抗原性ポリペプチドの、
組換えＤＮＡ技術による製造方法も本発明によって提供
される。すなわち、８Ｂ５蛋白質またはポリペプチドを
コードするＤＮＡ分子を調製し、このＤＮＡ分子を適当
な発現ベクターたとえばＰL またはｌａｃプロモーター
含有ベクター中に挿入する。得られた発現ベクターを次
に適当な宿主たとえば大腸菌に、ＤＮＡの発現および蛋
白質またはポリペプチドの産生を可能にする適当な条件
下に導入し、生成した蛋白質またはポリペプチドを回収
する。
【００６３】メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、胞
子形成の任意の時点でメロゾイトから単離できる。これ
らのｍＲＮＡサンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏ（４４）また
はｉｎ ｖｉｖｏ系を用いて翻訳する。翻訳生成物は、
モノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５または抗メロゾ
イト鶏血清を用いて免疫沈殿させることができる。８Ｂ
５抗原をコードするｍＲＮＡプレパレーションを用いて
二本鎖ｃＤＮＡを調製する（４４）。このｃＤＮＡを次
に適当なクローニングベクターに挿入し、ついで大腸菌
の形質転換に用い、ｃＤＮＡライブラリーを発生させ
る。このｃＤＮＡライブラリーを、８Ｂ５抗原のポリペ
プチド成分からのアミノ酸配列情報に基づいて構築され
た同位元素標識オリゴヌクレオチドブロブを用い、コロ
ニーハイブリダイゼーション法でスクリーニングする。
ポリペプチドに対するヌクレオチド配列を含む細菌性コ
ロニーからのベクターＤＮＡを単離し、挿入されたコク
シジウムＤＮＡの配列を決定する（４６，６２）。
【００６４】プラスミドＤＮＡとモノクロナール抗体Ｐ
ｍｘ４７．８Ｂ５によって認識されるエピトープをもつ
蛋白質をコードする核酸分子からなる発現ベクターが構
築された。融合蛋白質の発現が可能なベクターはｐ５−
３、ｐ１１−２、およびｐ１３−８と命名された。これ
らのベクターで形質転換された大腸菌細胞は、それぞれ
ＳＧ９３６１ｐ５−３、ＳＧ９３６／ｐ１１−２および
ＳＧ９３６／ｐ１３−８と命名され、ＡＴＣＣに登録番
号６７ ２５３号、６７ ２５１号および６７２５２号
として寄託されている。本発明はまた、本発明の８Ｂ５
抗原、抗原性ポリペプチドまたは他の抗原の免疫感作有
効量を鶏に投与することによる、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａ
ｘｉｍａの感染に対する能動免疫を鶏に付与する方法を
包含する。この方法により、非免疫鶏に能動免疫を付与
することができる。さらに、これらの物質の投与は、以
前にＥ．ｍａｘｉｍａに曝露された鶏の比較的低レベル
の免疫を増強させるため、また追加予防接種に使用する
ことができる。
【００６５】本発明の８Ｂ５抗原または任意の抗原性ポ
リペプチドは、よく知られた任意の方法で鶏に投与する
ことができる。望ましい投与方法は、背頚部への皮下ま
たは筋肉内注射である。抗原の免疫処置有効量は、約
０．１μｇから約１ｍｇまでの任意の量である。抗原量
は約１０μｇ以上とすることが望ましい。好ましい抗原
量は、体重１ｋｇあたり約５００μｇである。また、投
与経路は、経口（たとえばカプセルによる）または望ま
しくは注射（たとえば皮下、皮内または好ましくは筋肉
内注射）によって行われる。投与方法が注射の場合は、
任意の医薬的に許容されるキャリアーが使用できる。適
当なキャリアーには、０．０１〜０．１Ｍ好ましくは
０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％食塩水がある。
本発明の抗原性物質、すなわち８Ｂ５抗原、抗原性ポリ
ペプチドまたは本発明の他の抗原の免疫感作有効量と適
当なキャリアーからなる、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍ
ａ感染に対する能動免疫を鶏に付与するワクチンを提供
する。ワクチン中の抗原性物質の好ましい免疫感作有効
量は、鶏の体重１ｋｇあたり約０．１μｇ以上である。
【００６６】このようなワクチンの適当用量を鶏に投与
することにより、Ｅ．ｍａｘｉｍａ感染に対して鶏が防
御される。１用量あたりの抗原性物質量は、ワクチン投
与動物に抗原性物質に対する抗体産生を誘発するのに十
分な量でなければならない。抗体産生および防御効果で
評価される十分な免疫応答を与えるための、１用量あた
りの抗原物質の量は、予防接種動物の体重１ｋｇあたり
約２０．０μｇ以上とすることが望ましい。すなわち、
５０ｇの１日齢ヒナに対する抗原物質の量は約１．０μ
ｇである。したがって、ワクチンは抗原性物質１０μｇ
を含有することが好ましい。一般的に、抗原はワクチン
中約０．００２重量％〜約０．２重量％添加され、１回
投与用量は約０．１ｍｌとする。本発明の他の態様とし
ては、本発明の８Ｂ５蛋白質および抗原性ポリペプチド
に対するモノクロナール抗体が包含される。特定の態様
としては、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ８９４
６号によって産生された上述のモノクロナール抗体Ｐｍ
ｘ４７．８Ｂ５を挙げることができる。
【００６７】８Ｂ５抗原またはその抗原性フラグメント
に対するモノクロナール抗体、たとえばモノクロナール
抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５の防御有効量を鶏に投与するこ
とにより、Ｅ．ｍａｘｉｍａ感染に対する受動免疫を鶏
に付与することができる。この目的に有用な組成物は、
適当なモノクロナール抗体たとえばモノクロナール抗体
Ｐｍｘ４７．８Ｂ５の保護有効量と、適当な担体からな
る。上記組成物は、経口的に投与した場合、感染を防御
するのに十分な用量のモノクロナール抗体から構成する
ことができる。抗体の通常の用量は１日１羽あたり抗体
約１００μｇであり、水溶液または凍結乾燥物として投
与できる。組成物は飲水添加用の水溶液の形とすること
が好ましい。抗体は０．１５Ｍリン酸塩緩衝食塩水ｐＨ
７に溶解し、チメロサールを最終蛋白質含量１〜１００
ｍｇ／ｍｌに対して０．０００１％含有させる。製品
は、所望の抗体レベルが維持されるようにした飲水から
連続的に投与される。このような組成物の適当用量の鶏
への投与が、Ｅ．ｍａｘｉｍａ感染に対する受動免疫の
付与方法である。
【００６８】さらに他の態様によれば、８Ｂ５抗原の主
たる保護構造の特徴と共通の空間的特徴を有する部分構
造で、前述の抗原を置換する。このような組成物の例と
しては、８Ｂ５蛋白質または本発明の抗原性ポリペプチ
ドの１種、たとえば各抗原決定基に対する特異性を付与
する構造をもつモノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５
の構造に対して産生した抗−イデイオタイプ抗体が包含
される。このような抗−イデイオタイプ抗体はそれ自体
本来モノクロナールであるが、またポリクロナール抗体
として産生することもできる。前者の例としては、抗体
Ｐｍｘ４７．８Ｂ５をハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ
Ｎｏ．ＨＢ８９４６から回収し、精製し、任意の適当な
キャリアー蛋白質、たとえばキーホールリンペットヘモ
シアニン（ＫＬＨ）に共有結合させる。精製された抗
体、好ましくは精製された抗体−ＫＬＨ複合体を、好ま
しくはフロインド完全アジュバントのようなアジュバン
トとともに、適当な哺乳類リンパ球ドナー好ましくはＢ
ａｌｂ／Ｃ系マウスに、反復注射する。免疫処置マウス
のリンパ球からハイブリドーマが発生する。
【００６９】ハイブリドーマをモノクロナール抗体Ｐｍ
ｘ４７．８Ｂ５との反応では８Ｂ５抗原と競合するが、
８Ｂ５抗原もＰｍｘ４７．８Ｂ５以外のげっ歯類免疫グ
ロブリンも認識しない抗体についてスクリーニングし
た。このようなハイブリドーマが分泌する、モノクロナ
ール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５に対する抗イデイオタイプ
抗体をさらに増殖させ、クローン化する。抗−イデイオ
タイプ抗体の製造は、ハイブリドーマの生育およびモノ
クロナール抗体の発現に適当なメジウム中での細胞培
養、または好ましいビークルとしてＢａｌｂ／Ｃマウス
を用いた抗体産生ハイブリドーマの宿主動物中での生育
によって実施される。抗−イデイオタイプ抗体はまた、
動物へのＰｍｘ４７．８Ｂ５の注射によっても製造でき
る。好ましい一方法は、精製したＰｍｘ４７．８Ｂ５、
５００μｇを適当なアジュバントたとえば完全フロイン
ドアジュバント中に処方し、適当な動物たとえばウサギ
に反復注射する方法である。十分に注射したのち、適当
な期間後に動物から血清を採取する。ついで、抗−イデ
イオタイプ抗体を血清から、たとえばＳｅｐｈａｒｏｓ
ｅTMのような不溶性支持体に固定化した正常マウス血清
に吸着させて回収した。得られた抗血清の特異性は、モ
ノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５と反応性を示す
が、正常げっ歯類抗体に対しては反応しないことで確認
された。
【００７０】上述の抗−イデイオタイプ抗体はさらに、
ＩｇＧフラクションのレベルに精製される。精製された
抗−イデイオタイプ抗体は、抗原の場合に記述したと同
様、任意の公知方法で投与することができる。本発明の
抗−イデイオタイプ抗体の有効量を鶏に投与すること、
これがＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの感染に対する能
動免疫を鶏に付与する方法になる。この目的でのワクチ
ンは、抗−イデイオタイプ抗体の免疫感作有効量と適当
な担体からなる。このワクチンの適当用量を鶏に投与す
ると、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの感染に対する鶏
の防御方法になる。
【００７１】１用量あたりの抗−イデイオタイプ抗体の
量はワクチン投与動物に抗体を産生を誘発するのに十分
な量でなければならない。抗体の産生によって示される
免疫応答の誘発に必要な１用量あたりの抗−イデイオタ
イプ抗体量は、予防接種する鳥の体重１ｋｇにつき５０
μｇ以上である。すなわち、５０ｇの１日齢ヒナの場
合、抗−イデイオタイプ抗体２．５μｇが投与される。
したがって、抗−イデイオタイプ抗体２５μｇを含むワ
クチンが好ましい。一般的には、抗−イデイオタイプ抗
体は、ワクチン中に約０．００２重量％〜０．２重量％
の割合で添加され、１回投与容量は０．２ｃｃである。
本発明の他の態様には、８Ｂ５蛋白質をコードする核酸
分子、たとえばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮ
Ａがある。その一態様は、本発明の抗原性ポリペプチド
をコードするＤＮＡ分子である。
【００７２】他の態様としては、たとえば８Ｂ５蛋白質
または前述の抗原性ポリペプチドの１種をコードする、
本発明の核酸分子からなるクローニングベクターがあ
る。クローニングベクターは宿主細胞たとえば細菌宿主
細胞に導入される。本発明の精製された抗原性蛋白質
は、８Ｂ５蛋白質をコードする核酸分子を含有するクロ
ーニングビークルを含む宿主細胞を用いて製造できる。
この方法によれば、宿主細胞を蛋白質の産生が可能にな
る適当な条件下で生育させ、生成した蛋白質を回収す
る。本発明の抗原性ポリペプチドは、そのポリペプチド
をコードする適当な核酸分子を用いて同様に製造でき
る。宿主細胞が細菌細胞である場合、生成した８Ｂ５蛋
白質は天然の８Ｂ５蛋白質と同一またはほぼ同一の配列
を有するが、細菌宿主内での発現のため、たとえばＮ末
端メチオニン分子の付加により、そのアミノ酸配列また
はアミノ末端が異なる可能性がある。
【００７３】本発明の態様としては、さらに、本発明の
精製抗原性蛋白質をコードする核酸配列を有するＤＮＡ
分子を得る方法がある。この方法には、Ｅｉｍｅｒｉａ
ｍａｘｉｍａの卵母細胞からゲノムＤＮＡを単離し、
単離されたゲノムＤＮＡからＤＮＡフラグメントを、た
とえば制限酵素を用いて調製する。ＤＮＡフラグメント
をついで適当なクローニングベクターにリゲートする。
適当なクローンは、そのＤＮＡを８Ｂ５抗原をコードす
る核酸配列を含むかまたはそれと相補性のオリゴヌクレ
オチドとハイブリダイゼーションさせて同定する。Ｐｍ
ｘ４７．８Ｂ５免疫反応性蛋白質をコードするＤＮＡを
適当なクローンから単離するか、または本技術分野にお
いて公知の免疫ブロット操作りによりＰｍｘ４７．８Ｂ
５免疫反応性蛋白質の存在をスクリーニングして適当な
クローンを同定する。本発明は、５５，０００ダルトン
以上の分子量を有し、５５，０００ダルトン抗原性蛋白
質のアミノ酸配列内に包含されるアミノ酸配列と付加的
アミノ酸をもつ抗原性ポリペプチドを提供する。このポ
リペプチドはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染に対す
る防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘導できる。付加
的アミノ酸は、他のポリペプチド、たとえばβ−ガラク
トシダーゼのアミノ酸配列であってもよく、この場合に
は、５５，０００ダルトン蛋白質−β−ガラクトシダー
ゼ融合ポリペプチドが得られる。本発明はまた、このよ
うな融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、および
そのＤＮＡを含有するクローニングベクターを提供す
る。
【００７４】本発明はまた、本発明の抗原性融合ポリペ
プチドの免疫感作有効量を鶏に投与することからなる、
Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫を
鶏に付与する方法を提供する。また、本発明の抗原性融
合ポリペプチドの免疫感作有効量と、適当な担体からな
る、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの感染に対する能動
免疫を鶏に付与するワクチンを提供する。本発明はさら
に、Ｅｉｍｅｒｉａ誘発疾患に対する多成分ワクチンを
提供する。ワクチンは１用量あたり、投与動物にＥｉｍ
ｅｒｉａ抗原に対する抗体の産生を誘発するのに有効な
量の、任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原またはエピトープの混
合物を含有する。１用量あたりの各抗原の量は、約１０
μｇ〜約２００μｇである。ワクチンはまた、医薬的に
許容される担体を含有する。
【００７５】好ましい態様においては、Ｅｉｍｅｒｉａ
抗原は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ｍａｘ
ｉｍａおよびＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘの抗原であるが、任
意のＥｉｍｅｒｉａ種の抗原は同様に有効である。好ま
しい態様のワクチンは、特異的に抗体の結合部位により
認識される少なくとも１個の特異的Ｅｉｍｅｒｉａアミ
ノ酸配列、すなわち少なくとも１個の特異的Ｅｉｍｅｒ
ｉａエピトープからなる１種または２種以上の遺伝子操
作抗原性融合ポリペプチドを含有する。本発明のワクチ
ンは、各種のＥｉｍｅｒｉａ抗原またはそのエピトープ
を１種、２種または任意の数の異なる抗原またはエピト
ープの各種組合せで含有することができる。好ましい態
様においては、ワクチンは任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原の
混合物からなる。すなわち混合物には任意のＥ．ｔｅｎ
ｅｌｌａ抗原を、任意のＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原また
はＥ．ｍａｘｉｍａ抗原を含む他の任意のＥｉｍｅｒｉ
ａ抗原と組合せて含有させることができる。好ましい抗
原は、２５キロダルトンのＥ．ｔｅｎｅｌｌａ抗原、２
６キロダルトンのＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原または５５
キロダルトンのＥ．ｍａｘｉｍａ抗原がある。
【００７６】さらに、混合物は、２５キロダルトンの
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ抗原を、任意のＥ．ｎｅｃａｔｒｉ
ｘまたはＥ．ｍａｘｉｍａ抗原を含めた任意の他のＥｉ
ｍｅｒｉａ抗原と組合せて含有することができる。好ま
しい組合せとしては、２５キロダルトンのＥ．ｔｅｎｅ
ｌｌａ抗原と２６キロダルトンＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ抗
原または５５キロダルトンＥ．ｍａｘｉｍａ抗原があ
る。本発明の態様においては、混合物は、任意のＥ．ｎ
ｅｃａｔｒｉｘ抗原の、任意のＥ．ｍａｘｉｍａ抗原を
含めた任意の他のＥｉｍｅｒｉａ抗原との組合せを包含
する。好ましい抗原は、２５キロダルトンＥ．ｎｅｃａ
ｔｒｉｘ抗原または５５キロダルトンＥ．ｍａｘｉｍａ
抗原である。混合物はまた、２６キロダルトンＥ．ｎｅ
ｃａｔｒｉｘ抗原を、任意のＥ．ｍａｘｉｍａ抗原を含
めた他の任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原との組合せでもよ
い。最後に、ワクチンには、任意のＥ．ｍａｘｉｍａ抗
原を、５５キロダルトンＥ．ｍａｘｉｍａ抗原を含めた
任意の他のＥｉｍｅｒｉａ抗原と組合せて含有させるこ
とができる。
【００７７】本発明のワクチンは、任意のＥｉｍｅｒｉ
ａ抗原と任意のトリウイルス蛋白質の混合物を含有する
ものであってもよい。好ましい態様におけるトリウイル
ス蛋白質は、感染性バーサル疾患ウイルスの蛋白質であ
る。他のトリウイルス蛋白質としては、マレック病ウイ
ルスもしくはそのエピトープ、トリポックスウイルスま
たはそのエピトープ、七面鳥のヘルペスウイルスまたは
そのエピトープを挙げることができる。本発明に用いら
れる抗原性融合ポリペプチドは、遺伝子操作技術によっ
て製造することができる。すなわち、Ｅｉｍｅｒｉａク
ローニング配列のｃＤＮＡのクローニングによって製造
できる。融合ポリペプチドは少なくとも１個のＥｉｍｅ
ｒｉａエピトープ、すなわちＥｉｍｅｒｉａ抗原に対す
る抗体によって認識されるアミノ酸配列が、少なくとも
１個の他のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも部
分と融合している。
【００７８】適当な融合ポリペプチドは、β−ガラクト
シダーゼまたはプロキモシンに融合したＥｉｍｅｒｉａ
抗原である。融合ポリペプチドには、ベクターｐＤＥＴ
１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３３１６）、ベクターｐＤＥＴ
２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３３１８）、ベクターｐＢＧＣ
２３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３３１７）、ベクターｐＣＯ
Ｃ１２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３３１４）、またはベクタ
ーｐＣＯＣ２０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３３１３）によっ
てコードされるポリペプチドを挙げることができるが、
他のベクターでコードされる融合ポリペプチドも使用で
きる。最後に、本発明のワクチンは、任意の抗原性融合
ポリペプチドの混合物であってもよい。好ましい態様に
おいては、融合ポリペプチドには少なくとも１個のＥｉ
ｍｅｒｉａエピトープが包含される。
【００７９】例 １ ＥＩＭＥＲＩＡ ＮＥＣＡＴＲＩＸ 及びＥＩＭＥＲＩＡ
ＴＥＮＥＬＬＡの調製：オオシスト、スポロシスト、
スポロゾイトＣｏｃｃｉｄｉａ 。Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ
及びＥｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａの精製された分離物
は、元来Ａｕｂｕｒｎ大学のアレン・エドガー博士から
入手したものである。各分離物の純度は、オオシストの
特徴及び感染した腸組織の組織学的観察をもって確認し
た。オオシストの大きさと形状表示はそれぞれＥ． ｎ
ｅｃａｔｒｉｘ及びＥ． ｔｅｎｅｌｌａの範囲内であ
った。病変は、ジョンソンとレイドの方法（３０）によ
って評点をつけた。感染した鳥の病変は各々それぞれの
分離物に典型的なものであった。５日間にわたる組織学
的検査で腸中央（Ｅ． ｎｅｃａｔｒｉｘ）または盲腸
（Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａ）の上皮下に広範な第２世代の
スキツオントが発見された。Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａ及び
Ｅ． ｎｅｃａｔｒｉｘによりその重症感染中に（各々
１５，０００、５０，０００オオシスト）死に至る場合
があった。単一オオシストのクローニングが各分離物の
純度を保つため、周期的に行なわれた。
【００８０】オオシストの生殖。 各分離物の純粋培養
物を４〜６週令のＳＰＦ白色レグホン系鶏に恒常的に継
代接種した。外因性のＣｏｃｃｉｄｉａ感染を避けるた
めに、鶏は生後１日目から樹脂ガラス製の隔離鶏舎で飼
育した。オオシストは感染後７日目に盲腸から、シャー
リーのトリプシン分解法（６６）を用いて採収した。胞
子の形成されたオオシストは、典型的方法により２４℃
で２％のｗ／ｖ Ｋ2 Ｃｒ2 Ｏ7 中に保存した。スポロシストの分離 。 残骸から塩浮游によって部分的
に精製された胞子形成オオシスト（１×１０8 ）は、
０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で５回洗
浄し、重クロム酸カリウム保存液を除去した。これらの
オオシストは、１．０５％の次亜塩素酸ナトリウム中で
２０分間攪拌した後にＰＢＳで５回洗浄し残留次亜塩素
酸ナトリウム及び残骸を除去することによってさらに清
浄化した。最後の洗浄にひき続き、清浄したオオシスト
をＰＢＳ１０ｍｌ中に再懸濁させた。懸濁したオオシス
トを同容量のガラスビーズ（１．０〜１．０５ｍｍ）と
一緒に振とうして機械的に分解した。遊離したスポロシ
ストは、グラスウールカラムを通過させてオオシスト壁
及び未分解オオシストから純化され、３０００ｋＰＭで
１０分間、４℃で遠心分離され、ＰＢＳ１０ｍｌ中で再
懸濁させた。
【００８１】スポロゾイトの調製。 新たに胞子形成さ
れたオオシストは、塩浮游、反復洗浄及び１．０５％の
次亜塩素酸ナトリウム処理により清浄した。スポロシス
トは、オオシストをガラスビーズ（１．０−１．０５ｍ
ｍ）を用いて機械的に分解して遊離させた。スポロゾイ
トを脱嚢させるために、スポロシストをトリプシン及び
タウロデオキシコール酸（それぞれ０．２５、０．５０
％ｗ／ｖ）と共に１時間、４１℃でインキュベートし
た。このようにして得られたスポロゾイトは遠心分離法
により洗浄して取り除き、ハンク培地に再懸濁させた。
新たなハンク培地を用いてスポロゾイトを作業濃度に希
釈した。
【００８２】例 ２ ハイブリドーマの生成、同定及び特徴づけ モノクロナール抗体 。 モノクロナール抗体はＶａｎ
ＤｅｕｓｅｎとＷｈｅｔｓｔｏｎｅの方法（７７）を用
いて発育されたハイブリドーマから誘導した。要約する
と、Ｂａｌｄ／Ｃ ＢｙＪマウスを１０6 〜１０7 のイ
ンタクトなＥ．ｔｅｎｅｌｌａスポロゾイトで繰り返し
免疫した。完全無欠なスポロゾイトの最終静注後３日し
て、任意に抽出したマウスを殺し、脾切除した。脾細胞
は、脾臓の線維組織から分離し、洗浄した脾細胞をネズ
ミ形質細胞腫の細胞株（ＳＰ２／ＯＭ）と融合させた。微量中和試験 。 微量中和試験は、Ｅ． ｔｅｎｅｌｌ
ａについては鶏の一次腎細胞培養物を、またはＥ． ｎ
ｅｃａｔｒｉｘについてはブタ胎児肺細胞を用いて行っ
た。１〜２週令の鶏を殺し、無菌法による腎切除をし
た。細胞は、９６穴の培養プレートに移され、約１０4
／ｗｅｌｌの密度で、５％熱処理犢胎児血清を添加した
Ｅａｒｌｅ’ｓ ＬＡＨ培地で平地培養した。培養は４
１℃、ＣＯ2５％の環境を維持した。細胞培養が約５０
％の交会レベルに達した時、ハイブリドーマの被検検体
またはコントロール検体５０μｌをプレートの全ての穴
に加えた。次に、Ｅａｒｌ’ｓ培地５０μｌ中に約３×
１０4 懸濁しているスポロゾイトを全てに加えた。１２
〜１６時間後、培養上清を新たな２％熱処理犢胎児血清
を含むＥａｒｌ’ｓ ＬＡＨ培地と交換した。培養は感
染後４０〜４４時間で終了させ、培養上清をプレートか
ら除去した。その結果、細胞を５％氷酢酸で酸性とした
メタノールを加えてプレートに固定化した。固定化され
た培養細胞は検査前に０．１％トルイジン・ブルーで染
色した。各培養穴は分裂生殖が阻害につきその概略パー
センテイジレベルで採点した；モノクロナール抗体によ
る寄生虫の中和は、スキツオントの成熟を完全に阻害で
きる血清の最大希釈倍率に基づいて採点された。
【００８３】間接螢光抗体スクリーニング。 ＩＦＡ
（間接螢光抗体）スライドをＥ． ｔｅｎｅｌｌａまた
はＥ． ｎｅｃａｔｒｉｘのスポロゾイト（約１×１０
6 ／ｗｅｌｌ）を用いて調製した。スライドは各穴に１
％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０μｌを加える前
に、数時間ないし一晩空気乾燥させた。ＢＳＡ添加５分
後に被検上清２０μｌを加えた。上清を３７℃で２０分
間インキュベートして、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２
０を含む０．１５ＭＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３
回洗浄した。フルオレスセイン抱合の家兎対マウス抗体
（ＰＢＳで１：４０に希釈）を標本に加え、３７℃で２
０分間インキュベートした。抱合体は封入剤の添加及び
カバーグラスの設置前に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗
浄した。
【００８４】結 果。 Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｎｅｌ
ｌａに対して発育した数千のハイブリドーマの内、２４
個がスポロゾイト段階の寄生虫に対する中和抗体を作る
ことがわかった。検査されたハイブリドーマの全てが膜
に結合した抗原を認識したが、１つのハイブリドーマか
ら得られた抗体だけは膜内部の抗原を認識した。Ｉｎ
ｖｉｔｒｏで、各セルラインの最初のクローニングで得
られた数検体の上清について中和能力を比較した。ある
セルラインの上清が、Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾ
イトに対して相対的に最も大きい中和力を示した。各被
検上清について含有抗体を評価した場合、ある抗体（Ｐ
ｔｎ ７．２Ａ４／４で示す）がスポロゾイトを中和す
るのに必要な量は、次に中和力の強い抗体の２０分の１
であった。詳細には、Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａの中和に必
要なＰｔｎ ７．２Ａ４／４抗体の量は約３．５×１０
5 ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅであっ
た。Ｐｔｎ７．２Ａ４／４で示されるモノクロナール抗
体を産生するハイブリドーマは、ロックビル、メリーラ
ンド、Ｕ．Ｓ．Ａ．２０８５２にあるＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ）に供託され、ＡＴＣＣ取得Ｎｏ．ＨＢ８５
６１として識別された。
【００８５】この供託は、特許申請手続を目的とした微
生物の供託に関する国際認定に関するブタベスト条約
（以下ブタベスト条約という）の規定に従って行われ
た。モノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４をＥ．
ｎｅｃａｔｒｉｘに対して評価した場合、Ｅ． ｔｅｎ
ｅｌｌａと同様のフルオレセイン染色パターンが観察さ
れた。さらにＰｔｎ７．２Ａ４／４について、Ｅ． ｎ
ｅｃａｔｒｉｘに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ中和試験を行
った結果、同数のＥ． ｔｅｎｅｌｌａで観察されたの
と同等の中和活性をＥ． ｎｅｃａｔｒｉｘに対しても
持っていることがわかった。
【００８６】例 ３ 中和モノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４により認
識されるＥ．ｔｅｎｅｌｌａ抗原の同定 Ｅｉｍｅｒｉａタンパクの 125Ｉラベリング 。 Ｅ．
ｔｅｎｅｌｌａから得た合計２×１０8 のオオシストに
ついてヨウ化を行った。各々について、スポロシストは
塩浮游及び次亜塩素酸ナトリウム処理のオオシストから
精製され、ガラスビーズで破壊した後にグラスウールカ
ラムに通した。スポロシスト膜は、半量のスポロシスト
を用い、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）１ｍｌ中でガラスビーズを
加えて機械的分解によって調製した。この調製はプロテ
アーゼ・インヒビター；０．１ｍＭフェニルメチルスル
ホニル・フルオライド（ＰＭＳＦ）、０．１ｍＭ Ｎ−
トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（Ｔ
ＰＣＫ）、１ｍＭ Ｎ−α−Ｐ−トシル−Ｌ−リジンク
ロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）及び１０ＫＩＵ／ｍｌア
プロチニンの存在下で行った。残りのスポロシストは、
トリプシンとタウロデオキシコール酸（総容量１ｍｌ）
で処理し、スポロゾイトを脱嚢させた。両方の調製物は
４５，０００ＲＰＭ、４５分間、４℃で分離し、再びＰ
ＢＳ１ｍｌに懸濁させた。超遠心を行う前にトリプシン
−デオキシコール酸残留物をスポロゾイトからＰＢＳ及
び１ｍＭ ＰＭＳＦで洗浄することにより完全に除去す
るよう注意した。
【００８７】１ｍｌのサンプルを４０μｇのＩＯＤＯＧ
ＥＮ（１，３，４，６−テトラクロロ−３−α，ｂ−α
−ジフェニルグリコウリル）固相ヨウ化試薬（２４，５
３）でコーティングされたガラスシンチレーションバイ
アルに加え、窒素ガス下で乾燥させＰＢＳで洗浄した。
各チューブに 125Ｉを０．５ｍＣｉ加え、氷中で２０分
間インキュベートした。次に１ＭＫＩ １００μｌを各
チューブに加え最終濃度を１００ｍＭとし、さらに１５
分間反応を続けさせた。スポロゾイト及びスポロシスト
の調製物は５ｍＭ Ｋｌを含むＰＢＳ７ｍｌに希釈して
４５，０００ＲＰＭ、４５分間、４℃で超遠心分離し
た。スポロシスト及びスポロゾイト膜タンパクの抽出。 上記
の超遠心で得た 125Ｉでラベルされたスポロシスト及び
スポロゾイトのペレットを、タンパク抽出緩衝液（２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；５０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 ；２５ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、１ｍＭ
ＰＭＳＦ、０．１ｍＭ ＴＰＣＫ、１ｍＭ ＴＬＣＫ及
び１０ＫＩＵ／ｍｌアプローチニン）１ｍｌ中に再懸濁
させた。懸濁液は時々攪拌しながら氷中で６０分間イン
キュベートした。不溶性物質は洗滌剤で可溶化した微酸
化状のタンパクから１５分間、４℃で分離した。上清は
−７０℃で保存した。
【００８８】 125ＩタンパクのＴＣＡによる沈澱。 各
サンプル１０μｌを５ｍＭ ＫＩ９０μｌで希釈した。
次に、各希釈サンプル１０μｌを、５％トリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）１ｍｌ、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）及び５ｍ
Ｍ ＫＩ２５μｌを含む溶液に加え、氷中で３０分間イ
ンキュベートした。沈澱したサンプルはグラスファイバ
ーフィルターでろ過して回収し、５％ＴＣＡ、５ｍＭ
ＫＩ５ｍｌで２回洗浄、９５％エタノール５ｍｌで３回
洗浄をどちらも０℃で行い、液体シンチレーションカウ
ンターでカウントした。
【００８９】モノクロナール抗体との免疫沈降反応：モ
ノクロナール抗体５０μｌをモノクロナール抗体希釈緩
衝液（ＭＡＢ−ＤＩＬ）：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．６；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ＮＰ
−４０；ＲＩＡ用０．１％ＢＳＡ；１ｍＭ ＴＬＣＫ；
１ｍＭ ＰＭＳＦ；１０ＫＩＵ／ｍｌアプロチニン２５
μｌに加えた。そこに 125Ｉでラベルされたタンパク２
μｌを加え、攪拌して４℃で一晩インキュベートした。
抗マウス家兎Ｉｇ血清（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）をＭ
ＡＢ−ＤＩＬで１：２に希釈して１０μｌを各免疫沈降
チューブに加え、４℃で１時間インキュベートした。プ
ロテインＡ−セファロース（１０％ｖ／ｖ）をモノクロ
ナール抗体洗浄緩衝液（ＭＡＢＷ）；５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；０．０５％ＮＰ−４０；０．
０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ；０．０２％ＮａＮ3 ；５ｍＭ ＫＩで１：４に希釈
し４００μｌを各チューブに加えた。チューブを緩やか
にゆらしながら４℃で１時間インキュベートした。免疫
沈降物は冷たいＭＡＢＷで２回洗浄しさらに室温のＭＡ
ＢＷで２回洗浄した。ペレットはＳＤＳ−ＰＡＧＥサン
プル緩衝液（３５）５０μｌに再懸濁させ、５分間煮沸
して微散状態にしてプロテインＡ−セファロースを除去
した。上清をカウントしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
た。
【００９０】電気泳動によるニトロセルロース紙への抗
原の移動：ヨウ化されていないスポロゾイト膜タンパク
（前述のとおり洗剤で可溶化したもの）は還元または非
還元的条件下で、一次元の硫酸ドデシルナトリウム・ポ
リアクリルアミド・スラブゲルにより分離され、電気泳
動によりニトロセルロース紙へ移動させた（７５）。電
気泳動ブロットはＳｈａｒｍａｓ（６４）の方法によっ
て処理した。但し、例外として血清、モノクロナール抗
体及び適切な抱合体〔ペルオキシダーゼ抱合の山羊抗鶏
ＩｇＧ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ及びペリー、ペルオキシ
ダーゼ抱合の家兎抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ）は還
元型ゲルのブロット用に使われ、ネズミモノクロナール
抗体は、非還元型ゲル（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、バー
リントン、ＣＡ）としてマウスＩｇＧ用のＶｅｃｔａｓ
ｔｅｉｎ、ＡＢＣキットとの関連で使用された。ブロッ
トは、還元型分離においては４−クロロ−１−ナフトー
ル（シグマ：６６０μｇ／ｍｌ）及びＨ2 Ｏ2 （０．１
７％）と反応させ、また非還元型分離においてはＶｅｃ
ｔａｓｔａｉｎ試薬と反応させて生成した。
【００９１】Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａタンパクのＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
125Ｉでラベルされたスポロシスト及びスポロゾイトの
膜タンパクの免疫吸収したもの及び免疫沈降タンパク
は、５〜２５％の指数勾配または８〜２０％の直線勾配
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて２５ｍＡで分
析した。ゲルは乾燥させコダックＸＡＲ−５Ｘ線フィル
ムを一晩−７０℃で感光させた。染色用のゲルは、Ｃｏ
ｏｍａｓｓｉｅ（２１）または製造業者のラベル添付に
よる取扱い要領にもとづいて銀染色（ピアス、ケミカ
ル）により目視された。
【００９２】Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ抗原とＰｔｎ７．２Ａ
４／４モノクロナール抗体による免疫沈降の結果。表面
がラベルされたＥ．ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾイト調製
物は、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認された６，５００
と２５，０００の分子量をもった２つのヨウ化タンパク
を含む。６，５００ダルトンのタンパクは、モノクロナ
ール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と容易にかつ特異的に免
疫沈降反応を起こす。スポロシストの膜は、分子量１
７，０００及び２７，０００の２つのヨウ化タンパクを
含むがその他にも多数な分子量をもつヨウ化タンパクも
数個存在する。 125Ｉでラベルされたスポロシスト膜タ
ンパクの免疫沈降反応で、モノクロナール抗体Ｐｔｎ
７．２Ａ４／４と反応した抗原は、還元型ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで確認されたように１７，０００ダルトンのタンパ
クだけであった。
【００９３】Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ抗原とモノクロナール
抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４のウエスタン・ブロットの結
果。上述の様にＳＤＳ−ＰＡＧＥで免疫沈降ヨウ化ポリ
ペプタイドを分析した条件下で、ジスルフィド結合で連
結されたポリペプタイドを分離した。しかしながらジス
ルフィド結合の還元により、スポロシスト及びスポロゾ
イト膜の調製物のウエスタン・ブロットにおけるＰｔｎ
７．２Ａ４／４の反応性が破壊される。ヨウ化スポロシ
スト及びスポロゾイト膜調製物について非還元型条件下
でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った場合、主要な放射性標識物
は質量数２３−２５，０００の位置に移動する。さら
に、この２３−２５，０００ダルトンの物質はモノクロ
ナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４とウエスタン・ブロッ
トによる反応性を示した。これらの結果により１７，０
００ダルトン及び８，０００ダルトンのポリペプタイド
が一緒に複合してＴＡ４抗原を形成することが示唆され
る。このＴＡ４抗原を構成する別のポリペプタイドがヨ
ウ化物の免疫沈降反応において観察されなかったという
事実は、このポリペプタイドがヨウ化することができる
チロシンを含んでいない（実例５及び６のＴＡ４抗原の
８，０００ダルトンのポリペプタイドに関する記述を参
照）ことで説明できる。
【００９４】例 ４ Ｅ．ＴＥＮＥＬＬＡのＴＡ４抗原とそれの画分を含んだ
断片の純化、同定および特性 ＴＡ４抗原の１７，０００ダルトン ペプチド成分の純
化。 Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａの胞子形成した胞嚢を１０
9 個の胞嚢に対して１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、等体
積のガラス粒と共に振盪して破壊した。膜は遠心分離
（１００，０００ｘｇ、６０分、４℃）で除去し、その
蛋白質は１％（ｖ／ｖ）のＮＰ−４０と、１０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と２５ｍＭのＮａＣｌ
と、１ｍＭのＰＭＳＦと、１ｍＭのＴＬＣＫと、０．１
ｍＭのＴＰＣＫと、１０ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン中
に可溶化した。不溶解物は更に１００，０００ｘｇの回
転（６０分、４℃）で遠沈団塊にした。その蛋白質は、
ＤＥＡＥ−セルローズ カラムに吸着させ、１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）と０．０５％のＮＰ−
４０とで平衡させ、次に５０ｍＭのＮａＣｌを含むこの
緩衝液で洗滌した。２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液
で溶出後、１７，０００ダルトンのポリペプチドはアセ
トン沈澱で濃縮し、その沈澱物は充填緩衝に再懸濁し、
煮沸し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１５％）中で電
気泳動した。
【００９５】この実験及び他の実験に使用した旧来のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液は、６２．５ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％（ｗ／ｖ）のドデシ
ル硫酸ナトリウム、１０％（ｗ／ｖ）のグリセロールお
よび０．００１％のブロムフェノールブルーを含んでい
た。非還元條件下で行うと規定した実験の場合を除い
て、この緩衝液は又５％（ｖ／ｖ）のベータメルカプト
エタノールを含んでいた。その１７，０００ダルトンの
ポリペプチド帯は染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ青又はＫＣ
ｌ）で固定した。ゲルの適切な部分を取出し、その蛋白
質を電気溶出し、アセトン沈澱で濃縮した。ここで、こ
れらの操作は、蛋白質を変性するもので、Ｓ−Ｓ結合で
互に繋がったペプチド結合はこの方法で分割される事を
銘記すべきである。この方法で純化された１７，０００
ダルトンのポリペプチドは完全に純品であった。
【００９６】ＴＡ４抗原の純化と特性 ゲル電気泳動に代る純化法として、ＤＥＡＥ−セルロー
スカラムから得たスポロシスト膜蛋白質を１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．０５％ＮＰ−４０で透
析し、この緩衝で平衡にしたＤＥＡＥ−ＨＰＬＣカラム
（Ｂｉｏ Ｒａｄ）にかけた。このカラムはＮａＣｌの
傾斜（０−３００ｍＭ）で同じ緩衝液中で溶出した。１
７，０００ダルトンのポリペプチド（ゲル電気泳動での
移動に基づいて同定）は、２００ｍＭ ＮａＣｌの所で
溶出する物質中に見出された。この蛋白質を含む諸画分
は３０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、０．０５
％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ°３−１２（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｌａｊｏｌｌａ，ＣＡ）０．
１ｍＭディチオスレイトールで平衡にした水酸化アパタ
イト カラム（ＨＰＨＴ−ＢｉｏＲａｄ）にかけた。こ
のカラムは平衡化緩衝液で洗い、０．０５％のＺｗｉｔ
ｔｅｒｇｅｎｔ°と０．１ｍＭヂチオスレイトールを含
む硫酸カリ傾斜にかけて展開した。１７，０００ダルト
ンのポリペプチド（上記のゲル電気泳動で同定した）は
約９０ｍＭのリン酸カリウムで溶出する物質中に現れ
た。
【００９７】この方法で純化された１７，０００ダルト
ンのポリペプチドを含む画分は、８，０００ダルトンの
第二のペプチドも含んでいた。このペプチドは、Ｓ−Ｓ
結合で１７，０００ダルトンのポリペプチドに結合して
いるようである。若し１７，０００ダルトンのペプチド
を含む分画をモノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４
で免疫沈澱させ、その沈澱蛋白質を上記のように、還元
条件下でゲル電気泳動分析すると、１７，０００ダルト
ンのポリペプチドも８，０００ダルトンのポリペプチド
も共に免疫沈澱することは明らかである故にスポロシス
ト膜調製液においては、８，０００ダルトンのポリペプ
チドと１７，０００ダルトンのポリペプチドは、Ｓ−Ｓ
結合（多分システイン橋）で結合していると思われる。
何故ならば、このペプチドは強い還元剤が存在しない限
り電気泳動で現れなかった。非還元条件下では、Ｐｔｎ
７．２Ａ４／４の反応性ペプチド種は見かけ上の分子量
で２１−２４，０００として移動する。
【００９８】ＴＡ４抗原の１１，５００ダルトン断片の
調製 上記の方法によりＥ． ｔｅｎｅｌｌａのスポロサイト
膜を調製し、１０ｍｌのＰＢＳ＋１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００に再懸濁した。この１０ｍｌの膜懸濁物に０．
１％の８−ヒドロキシキノリンを含む８０％フェノール
を１０ｍｌ加えた。この懸濁は次に最大速度で３分回渦
流し、１０分間４０００ＲＰＭで遠沈した。このフェノ
ールと線状沈澱界面とは、取り出し、１００ｍＭ酢酸ア
ンモニウムを含むメタノール５容で稀釈し、−２０℃で
終夜沈澱させた。アセトンで２回の洗滌後、不溶性蛋白
質を０．５％ＳＤＳ中で８時間攪拌し、不溶物は２０，
０００ＲＰＭの遠沈を４℃で１時間かけて除去した。こ
の試料はＡＧ５０１−Ｘ８混合ベッド樹脂（１ｇｍ／５
００ｍｌ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で十分に透析し
た。ＴＡ４抗原の１１，５００ダルトン断片は、次のよ
うにして上澄からＰｔｎ７．２Ａ４／４モノクロナール
抗体で下記のように免疫吸着させた。このポリペプチド
は微滴定プレートＥＬＩＳＡでＰｔｎ７．２Ａ４／４モ
ノクロナール抗体と反応する事が示された。
【００９９】微細滴定には、ＥＬＩＳＡポリスチレン９
６ウェルクラスター（Ｉｍｍａｌｏｎ ＩＩ）を１０ｍ
Ｍグリシン緩衝塩液（ｐＨ９．６）中に終夜３７℃で保
温し抗原で感応性をつけた。ウェルを０．０００５％の
Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．１５ＭのＰＢＳで洗い、Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３％のＢＳＡで反応を中止し、再
洗し、ＰＢＳで稀釈したＰｔｎ７．２Ａ４／４単クロー
ン抗体と共に保温した。井穴は前と同様に洗滌し、パー
オキシダーゼと複合した抗−マウスＩｇＧ血清をＰＢＳ
で稀釈したものと共に保温した。ウェルは再洗して、Ｈ
2 Ｏ2 存在下に基質（２，２′−アジノ−ヂ−〔３−エ
チル−ベンズ−チアゾリンスルフォン酸〕）と共に保温
した。発色は１５分後にＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ−５８
０微細滴定板ＥＬＩＳＡ読取器で決定した。ＴＡ４抗原
の１１，５００ダルトン断片は微細滴定板ＥＬＩＳＡで
Ｐｔｎ７．２Ａ４／４モノクロナール抗体と反応性があ
る事が示された。
【０１００】例 ５ Ｅ．ＴＥＮＥＬＬＡ ＴＡ４抗原の１７，０００ダルト
ンと８，０００ダルトンのペプチド成分のアミノ酸配列 ＴＡ４抗原の１７，０００ダルトンのペプチド成分のア
ミノ酸配列。 １７，０００ダルトンのペプチドのアミ
ノ酸配列決定は、そのＮ−末端アミノ酸は反応が阻止さ
れる（すなわち、Ｅｄｍａｎ崩壊は影響をうけない（１
４））事が発見されて複雑であった。この問題を避ける
ために、その蛋白質を還元し、アルキル化し、次に種々
の化学試薬や酵素で分解した。得られたペプチドは、逆
相ＨＰＬＣで純化した（２６）。１７，０００ＴＡ４抗
原のダルトンの蛋白質はＣＮＢｒ（ＣＮ）、Ｖ８プロテ
アーゼ（Ｖ）、チモトリプシン（ＣＨ）およびエンドプ
ロテアーゼＡｒｇ−Ｃ（Ｒ）で分解した。プロテアーゼ
分解の前に、純化した。ＴＡ４抗原の１８，０００ダル
トンのポリペプチドは３０ｍＭのヂチオスレイトールと
６Ｍのグアニヂン−ＨＣｌ（ｐＨ８）とで１時間室温で
の処理した。固体の沃化アセトアミドを最終濃度が１０
０ｍＭになるように加え、ｐＨを８に調整して試料を室
温で１時間保温した。還元とアルキル化の後に試料は
０．１％ＳＤＳ中で平衡化したＰ６ＤＧ（ＢｉｏＲａ
ｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＣＡ）のスピンカラムで０．１
Ｍ、ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）か逆相ＨＰＬＣを用いるか
して、試薬類を除去純化した。
【０１０１】ＣＮＢｒ分解には、蛋白質試料は７０％蟻
酸中の１％ＣＮＢｒで２０時間４℃で処理した。試料は
Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄｖａｃ遠心分離器で乾固する
迄蒸発させ、０．１％トリフロロ醋酸（ＴＦＡ）又は
０．１％ＴＦＡと２０％アセトニトリール（ＣＨ3 Ｃ
Ｎ）中に再溶解した。Ｖ８の分解は０．１％ＳＤＳと
０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）で２時間、室温で、
５０ミクログラムの１７，０００ダルトンのポリペプチ
ド対、１ミクログラムのＶ８の比で行った。この分解の
後に、試料に４倍容積のアセトンを加え終夜−２０℃で
沈澱させた。そのアセトン沈澱物は上述のように再溶解
した。キモトリプシン消化は、０．０５％Ｚｗｉｔｔｅ
ｒｇｅｎｔ°３−１２と０．１Ｍ ＮＨ4 ＨＣＯ3 （ｐ
Ｈ７．８）中で１時間３７℃で１７，０００ダルトンの
ペプチド対Ａｒｇ−Ｃの比が１５：１として行った。ア
セトン沈澱を終夜−２０℃で行った後には、当ペプチド
は主としてアセトン上澄中にあった。この上澄液を蒸発
乾固し、上述のような方法で再溶解した。ペフチドはＶ
ｙｄａｃ Ｃ４カラム（ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｓ Ｇｒｏｕｐｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，Ｃ
Ａ）で純化し、０−１００％のＣＨ 3 ＣＮ傾斜で０．１
％ＴＦＡ中で溶出した。
【０１０２】アミノ酸配列決定は、気相配列決定器（Ａ
ｐｐｌｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓ
ｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＨｕｎｋａｐｉｌｌ
ｅｒらの方法（２５）に従って行った。フェニールチオ
ヒダントイン（ＰＴＨ）誘導アミノ酸はＨＰＬＣにより
分析した（８）。Ｎ−末端アミノ酸は阻止剤を取除いて
直接に決定した。１７，０００ダルトンのペプチドは
０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ８．０）と１０ｍＭの
ＥＤＴＡと５％のグリセロールと５ｍＭのヂチオスレイ
トールと０．０５％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔTM３−１
２の中で１時間、３７℃でピログルタメート アミノペ
プチターゼ（蛋白質：ＰＡＰ＝５：１）で処理した。処
理後、アミノ酸配列は決定する事が出来たが、それはＮ
−末端アミノ酸のグルタミンは環状化して閉鎖残基のピ
ロリドン カルボキシル酸になっている事を直接示唆し
ている。ＴＡ４抗原の１７，０００ダルトンのペプチド
成分の全アミノ酸配列はＦｉｇ１に示してある。
【０１０３】ＴＡ４抗原の８，０００ダルトンのペプチ
ド成分の部分的アミノ酸配列。 ＴＡ４抗原から還元と
アルキル化で誘導した）純化８０００ダルトンのポリペ
プチドをＥｄｍａｎ配列分析にけると、Ｎ−末端部分の
アミノ酸配列が直接に決定できた。このペプチドのＮ−
末端部分の部分アミノ酸配列は下記の通りである。
【化６】
【０１０４】例 ６ ＥＩＭＥＲＩＡ ＴＥＮＥＬＡ ＴＡ４抗原をコードし
ているゲノムＤＮＡクローンの単離と特性 Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの胞子形成卵嚢からのＤＮＡ分離。
胞子形成した卵嚢（５×１０8 ）を洗滌し、上述のよ
うな方法でスポロシストを分離した。分離したスポロシ
ストは２回０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ８．
５）、と０．２ＭのＮａＣｌと１０ｍＭのＥＤＴＡとで
洗滌した。このスポロサイトは０．１ＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、（ｐＨ８．５）と０．２ＭのＮａＣｌと５０ｍＭ
のＥＤＴＡと１％のＳＤＳと１５０ミクログラム／ｍｌ
のプロティナーゼＫとで３０分間６５℃に保温して溶解
した。室温迄冷却後、そのＤＮＡは等容積の液化フェノ
ールで１時間穏かに抽出した。１０分間３，０００ｒｐ
ｍの遠心分離の後、水層を除去し、界面とフェノール部
とは１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）と１ｍＭの
ＥＤＴＡとで再抽出した。各水相は合併し、１回フェノ
ールで、２回クロロフォルム：イソアミールアルコール
（２４：１）で抽出した。ＤＮＡはエタノール沈澱で分
離した。そのＤＮＡ団塊は１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８）と１ｍＭのＥＤＴＡ中に再溶解し、０．１５
ｍｇ／ｍｌのＤＮＡアーゼを含まぬＲＮＡアーゼＡで３
７℃１時間の処置をした。ＲＮＡアーゼ分解の後、試料
は１回フェノールで、１回クロロフォルム：イソアミー
ルアルコールで抽出し、次にエタノールで沈澱させた。
アガロース ゲル上で、このＤＮＡの大きさを２０キロ
塩基対より大きいと決定した。
【０１０５】バクテリオ ファージλｇｔ ｗｅｓλＢ
中でのＥ．ｔｅｎｅｌｌａゲノム・ライブラリーの組
立。 バクテリオファージλｇｔ ｗｅｓλＢ中にＥ． ｔｅ
ｎｅｌｌａのゲノムＤＮＡライブラリー（３６）がＭａ
ｎｉａｔｉｓによって述べられた方法（４４）を用いて
組立てられた。ファージはポリエチレングリコール沈澱
とクロロフォルム抽出とＣｓＣｌ傾斜遠心分離によって
純化された。純化したファージは１％ＳＤＳと５０ｍＭ
のＥＤＴＡ＋１５０マイクログラム／ｍｌのプロティナ
ーゼＫとで解かれ、ＤＮＡは、フェノール抽出とエタノ
ール沈澱とで純化された。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａのゲノム
ＤＮＡとファージのＤＮＡとはＥｃｏＲＩで完全に断片
化した。ファージＤＮＡの左右両腕はそれらの接着末端
においてアニイルしそれら腕は蔗糖濃度傾斜遠心分離で
純化した。ＥｃｏＲＩで分断したＤＮＡ腕の３０ミクロ
グラムを６ミクログラムのＥｃｏＲＩで分断したＥ．
ｔｅｎｅｌｌａ ＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
接着した。その接着したＤＮＡの２０ミクログラムをフ
ァージ粒子中にｉｎ ｖｉｔｒｏで封入し、５×１０6
個の組換ファージ粒子のライブラリィを得た。
【０１０６】合成オリゴヌクレオチド。 ＴＡ４抗体の
１７，０００ダルトンのペプチド成分をコードした遺伝
子部位に相補的なオリゴヌクレオチドのプローブ（検
針）を、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｓａｍ Ｉ（Ｂｉｏｓｅ
ａｒｃｈ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）を用
いて合成した。適切な部位に予期されるＤＮＡ配列は１
７，０００ダルトンのペプチドの示すアミノ酸配列から
推定した。遺伝子コードの二義性の為、正確なＤＮＡ配
列は予測できない。ＤＮＡ諸配列の混合物より成る“混
合検針”を設計して合成した。そのうちの１つは１７，
０００ダルトンのペプチドに対して遺伝子完全相同適合
性があるべきである。オリゴヌクレオチドＣＯＤ９２
は、ペプチドＶ１の６から１２のアミノ酸に基づいてい
た。（例５の１７，０００ダルトンのペプチドのアミノ
酸配列を見よ）これは２５６個の異った配列を含む。オ
リゴヌクレオチドＣＯＤ９２の構造は次のようである。
【０１０７】
【化７】 オリゴヌクレオチドＣＯＤ９４は、１７，０００ダルト
ンのペプチドＶ２の３から６のアミノ酸に基づくもので
あった。それは６４種の異った配列を含んでいた：
【化８】
【０１０８】オリゴヌクレオチドＣＯＤ１０８はペプチ
ドＶ１の２５−３０のアミノ酸に基づくものであった。
これは１６種の異った配列の混合より成る。オリゴヌク
レオチドＣＯＤ−１０８の構造は：
【化９】
【０１０９】Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａゲノムＤＮＡライブラ
リィの篩別 Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａのゲノムＤＮＡライブラリィの組
換ファージは、シャーレ当り２−３×１０4 に及ぶ高密
度で１５ｃｍのシャーレにプレートした。各シャーレの
ニトロセルローズ濾紙レプリカは、ＢｅｎｔｏｎとＤａ
ｖｉｓの方法（３）に従って調製した。これら濾紙は次
に適切な合成オリゴヌクレオチドと共に保温した。すな
わち（32Ｐ）−ｄＡＴＰとＴ4 ポリヌクレオチドキナー
ゼで高比放射能にラベルしたものである。オートラヂオ
グラフィーで、ポジティブのプラークを同定した。オリ
ゴヌクレオチドのＣＯＤ−９２と１０８との両方に交雑
したプラークだけが、ポジティブと記録された。交雑Ｄ
ＮＡを含む濾紙部分に相当するシャーレの部分にある。
寒天小片を切り取った。そのファージは溶出し、低密度
（２０−１００／プレート）で再接種し、３つのオリゴ
ヌクレオチドのプローブ全部について再篩別した。純粋
な分離ポジティブのプラーク又はクローンを取上げた。
ファージ１０８−１は、オリゴヌクレオチドＣＯＤ−９
２と強く交雑し、オリゴヌクレオチドＣＯＤ−１０８と
９４とにゆるやかに交雑する。Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａイ
オサートの精製と特性判定のためファージ１０８−１は
より大規模の培養を行った。ファージ１０８−１の性能
検定の結果、５，５００塩基対がＥｃｏＲＩ挿入されて
いる事がわかった。
【０１１０】１７，０００ダルトンをコードするゲノム
のクローンの詳細な性能検定−制限地図。 クローン１
０８−１の５，５００塩基対ＥｃｏＲＩ断片挿入は、フ
ァージベクターからプラスミドｐＵＣ９にサブ−クロー
ンした（７８）。その組換プラズミドは、種々の制限エ
ンドヌクレアーゼで分断し、ゲノムＤＮＡクローン中で
かなめとなる制限位置の決定に用いた。ＤＮＡ内におけ
る制限分断位置は、１７，０００ダルトンのペプチド遺
伝子の位置と方向を決定し、ＥｃｏＲＩによるゲノムＤ
ＮＡ断片の順序づけの策を立てるに必要である。その制
限酵素分断位置地図はＦｉｇ２に示してある。１７，０
００ダルトンのペプチドの遺伝子位置と向きとはこの地
図に示してある。
【０１１１】クローン１０８−１のＤＮＡ配列分析。
クローン１０８−１のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片で、
ＴＡ４抗原の１７，０００ダルトンのペプチド成分の遺
伝子で含むものは、Ｓａｎｇｅｒのヂオキシ法（６２）
で種々の制限酵素による断片を用いて配列を決めた。Ｄ
ＮＡ合成のプライマーは、ＣＯＤ−９２，９４および１
０８のオリゴヌクレオチドにも、他のオリゴヌクレオチ
ドと同様に含有されていた。このＤＮＡ配列はＦｉｇ．
３に示す。ＴＡ４抗原をコードした遺伝子の構造 。ＤＮＡの配列
は、アミノ酸配列分析で予期したものと一致する。更
に、蛋白質配列では明確でなかった特性がこの遺伝子に
は３ツあった。蛋白質配列からの情報および分泌性蛋白
質の構造についての一般的情報を用いてＴＡ４抗原の遺
伝子の構造が解明された。スポロサイト膜の１７，００
０ダルトンのペプチドの既知のアミノ酸末端からＧｌｎ
−Ａｓｐ−Ｔｒｙ…（例５を見よ）この遺伝子が上流２
３個のアミノ酸を余分にコードしている事は明白であ
る。このＤＮＡ配列は、典型的な“シグナル”配列で、
多くの分泌蛋白質又は膜蛋白質の遺伝子にあるアミノ酸
末端で見られるものである（４，３４）。これのコード
するペプチドは、それらの合成位置（細胞質）から細胞
質膜或はここを通って蛋白質を輸送するのに必要なもの
である。
【０１１２】このシグナルペプチドは、分泌の過程で除
去されるのが常である。ＴＡ４抗体はシグナルペプチド
で作られるのは驚くに当らない。何故ならば、この蛋白
質が胞子体の外面に達するためには、細胞質膜を通過す
る可能性が最も高いからである。このシグナル配列のア
ミノ末端は、Ｍｅｔゴドンと考えられる。本質的には、
それはどの蛋白質の場合でも合成開始はメチオニンから
である為である。この遺伝子には３ヶ所で、ＤＮＡ配列
が蛋白質の配列符合しない部位がある。第１は、既知の
熟成１７，０００ダルトン蛋白質の配列のＶａｌ−７の
ためのコドン内にある１０１塩基対の部分である。第２
は、１７，０００ダルトンのペプチドのＧｌｙ−６５と
Ｇｌｙ−６６のためのコドンとの間にある１１４塩基対
の配列である。第３は８０００ダルトンのペプチドのＡ
ｓｐ−１８６コドンの中にある１２４塩基対の配列であ
る。これら三つの配列は、多くの真核生物遺伝子のコー
ド部分内に見られる典型的イントロン構造である。これ
らはｍＲＮＡの前駆体の中にあって“スプライシング”
で知られるＲＮＡ組換機構によって除去され中断されて
いないコード配列を、成熟ｍＲＮＡに作る。“スプライ
シング接点”附近のＤＮＡ配列は、他の真核生物遺伝子
（６５）に見られるものと一致している。
【０１１３】１７，０００ダルトンのペプチドの配列
は、コドン１５７と１５８とに相当する。Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ配列で終ると思われる。我々は８，０００ダルトンの
ペプチドを、Ａｌａ−１６２に始まりＧｌｕ−１８８に
及ぶ配列で同定した。コドンの１５９から１６１に当る
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕのペプチド配列は未だ見付かっ
ていない。この三連ペプチドが他の蛋白質、例えばイン
シュリン（７１）、の分割と同じ機構で除去される可能
性がある。従ってＴＡ４抗原の２つのペプチドは、連続
したヌクレオチドの配列でコードされ、少くとも１つの
蛋白質分解段階がＡｌａ−１６２点から始まる８，００
０ダルトンのペプチドを発生させる。
【０１１４】例 ７ 胞子形成中のＴＡ４抗原の出現 胞子形成のどの時期にＴＡ４抗原が発生するかを決める
ために、特定のモノクロナール抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ１２
との免疫反応によってその出現を測定した。モノクロナ
ール抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ１２は、ＴＡ４抗原と反応する
胞子体中和性のモノクロナール抗体である。還元条件下
では、ＴＡ４抗原のモノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ
４／４との反応性が破壊される。しかし、還元状態でＳ
ＤＳ ＰＡＧＥ ウエスターン ブロット上では、モノ
クロナール抗体のＰｔｎ９．９Ｄ１２はＴＡ４抗原の１
７，０００ダルトンのポリペプチド成分と反応する。最
終ＰＢＳ洗滌の直後に開始して（例１を見よ）１×１０
7 卵嚢を含む等分した部分標本を２４時間まで４時間の
間隔で取り出し、更に胞子形成開始後３６時間から４８
時間にも取り出した。胞子形成卵嚢は７−８００ｘｇで
１０分間遠沈し、上澄を取り除いた。遠沈団塊はドライ
アイス／メタノール浴で急凍結し、分析に用いる迄−７
０℃で保存した。
【０１１５】各団塊は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、５０ｍＭのＭｇＣｌ2、２５ｍＭのＮａＣ
ｌと同容積のガラス玉の中で解凍した。激しく１０分間
の振盪をした後、２００ミクロリットルの２×ＳＤＳ試
料入り緩衝液（３５）を加えた。試料は３分間沸騰さ
せ、遠沈して屑を除き、各試料の２５−５０ミクロリッ
トルをＳＤＳポリアクリルアミドのゲル（２５％傾斜）
に加え分析に供した。蛋白質はニトロセルローズのシー
トに移した（５，７５）。ニトロセルローズ上の蛋白質
吸着位置の残っているものは、３％の（ｗ／ｖ）ゼラチ
ン、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５
０ｍＭのＮａＣｌと、０．０５％（ｗ／ｖ）のＮａＮ3
とで３０分間室温でブロックした。ニトロセルローズ濾
紙は、モノクロナール抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ１２（３％
（ｗ／ｖ）の牛血清アルブミン、１０ｍＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌと０．０
５％（ｗ／ｖ）のＮａＮ3 中に約１０ミクログラム／ｍ
ｌ）と終夜４℃で保温した。
【０１１６】そのニトロセルローズ濾紙を、５０−１０
０ｍｌの抗体稀釈緩衝液で３度洗滌の後、附着したモノ
クロナール抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ１２の位置と量とをＶｅ
ｃｔａｓｔａｉｎTM ＡＢＣキットのマウスＩｇＧ用
（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて決定し
た。そのニトロセルローズ濾紙は、ビオチニー化した抗
マウスＩｇＧ（８０ミクロリットルのビオチニイル化抗
マウス抗体と８０ミクロリットルの正常馬血清とを２０
ｍｌの抗体稀釈緩衝液に入れたもの）に浸して、ゆるく
３０分間室温振盪をした。ニトロセルローズ濾紙を、５
０〜１００ｍｌのＮａＮ3 を含まない抗体稀釈緩衝液で
３回洗滌した。このニトロセルローズ濾紙は次に、Ｖｅ
ｃｔａｓｔａｉｎ TMＡＢＣ試薬で３０分間室温に保温し
た（８０ミクロリットルのＡｖｉｄｉｎＤＨ試薬Ａを８
０ミクロリットルのビオチニイル化した西洋ワサビのパ
ーオキシダーゼ試薬ＢとをＮａＨ3 を含まない抗体稀釈
緩衝液の１５ｍｌで混合し、濾紙に添加する前に３０分
間前保温を施したもの）。
【０１１７】３回の洗滌後、添着した西洋ワサビのペル
オキシダーゼを４−クロロ−１−ナフトール（Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）．で呈色し測定した。このブロットは、呈色液（３
ｍｇ４−クロロ−１−ナフトール／ｍｌメタノールと５
ミクロリットルの３０％の過酸化水素とを、１０ｍｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ中にと混ぜたもの２ｍｌ）で１０〜３０分
間保温した。Ｐｔｎ９．９Ｄ１２中の反応性物質の位置
と量を示す紫色バンドが現れた後に、そのニトロセルロ
ーズのシートを２回水洗し、風乾して、暗所貯蔵した。
ＴＡ４抗原の１７０００ダルトンのポリペプチドは、モ
ノクロナール抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ１２と免疫反応をする
が、この成分は、胞子形成開始後１６から２４時間に現
れ始め、その後経続する（図１）。この１６時間は、胞
子形成中の卵嚢内でスポロサイトになるはずの４つの構
造が伸長を始める時に相当する。
【０１１８】例 ８ ＴＡ４抗原をコードしたｍＲＮＡの分離と同定 ｃＤＮＡが合成される前に、ＴＡ４抗原をコードするｍ
ＲＮＡが胞子形成のどの時期に現われるかを決める必要
があった。２．５−５×１０8 の卵嚢を含む等分した部
分標本を４時間間隔で無菌的に取出し（時間ゼロを含
む）、胞子形成開始後３６時間後から４８時間迄も同様
に取出した。この胞子形成中の卵嚢は７−８００ｘｇで
１０分間遠沈にかけ、上澄を取除いた。その遠沈団塊は
ドライアイス／メタノール浴で急速凍結し、ＲＮＡが分
離される迄−７０℃で保存した。各団塊を、約１０倍容
積の５Ｍのグアニヂンチオシアネート、２０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０ｍＭのＥＤＴＡ、５％
（ｖ／ｖ）のベーターメルカプトエタノールとの中で解
凍し、その卵嚢を等容量の１．０ｍｍガラス玉と混ぜて
１０分間の強振して速かに破砕した。この試料を２％
（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイールサルコシンに入れた後、
約８，０００ｘｇの遠沈に室温でかけて屑を除去した。
ＲＮＡは上澄からＣｓＣｌクッションの沈降（７６）で
分離した。
【０１１９】そのＲＮＡの団塊を、２０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）、０．２％のＳＤＳと１００単位／ｍｌのＲＮ
ａｓｉｎTM（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，Ｗ１）及び１０ｍＭのベータメルカプトメタノ
ール中に再懸濁した。フェノールクロロホルム：イソア
ミイルアルコール（２４：１）とクロロホルム：イソア
ミイルアルコール（２４：１）とで交互に２回づつ抽出
した後、そのＲＮＡを沈澱させて−２０℃でエタノール
中に貯蔵した。全ＲＮＡで約１００−３００ミクログラ
ムが、２．５−５．５×１０8 の卵嚢から分離された。
【０１２０】ポリＡを含むＲＮＡはオリゴ−ｄＴセルロ
ーズクロマトグラフィ（２）で分離された。全ＲＮＡを
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭの
ＥＤＴＡと０．２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳと０．４ＭのＬ
ｉＣｌ中に入れて、オリゴｄＴセルローズ カラム（Ｔ
ｙｐｅ３、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）にかけ
た。ＲＮＡはＬｉＣｌを含まない同じ緩衝液で４０°に
おいて溶出された。約５−１５ミクログラムのＡ+ ＲＮ
Ａが２．５−５．０×１０8 の卵嚢から分離された。
【０１２１】ｃＤＮＡ合成の鋳型としてポリＡ ＲＮＡ
を使う前に、ＴＡ４抗原をコードしたｍＲＮＡの存在実
証する事が必要であった。ＴＡ４抗原のｍＲＮＡが存在
する事は、種々の胞子形成段階の卵嚢から得たポリＡ
ＲＮＡをＴＡ４蛋白質をコードするクローンから得たＤ
ＮＡと交雑する事で実証された。胞子形成中の各時点の
ポリＡ ＲＮＡの２ミクログラムをフォルムアルデヒド
を含むゲルで電気泳動した（４４）。そのＲＮＡをニト
ロセルローズ濾紙に移し、ノーザン ブロット分析にか
けた。このニトロセルローズ濾紙を、Ｅ． ｔｅｎｅｌ
ｌａのゲノムのクローンで、予め〔32Ｐ〕−ｄＡＴＰ
（４４）でニック翻訳してある１０８−１（Ｆｉｇｕｒ
ｅ５）と呼ぶ７８５塩基対のＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩ断片
で検索した。ＴＡ４抗原をコードするｍＲＮＡは胞子形
成開始後約１６−２０時間後とそれ以後に存在した（Ｆ
ｉｇｕｒｅ６）。ＴＡ４抗原のｍＲＮＡが現れる時間
は、ＴＡ４抗原の１７，０００ダルトンでウエスタン
ブロットでモノクロナール抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ１２と免
疫反応するサブユニットの出現と完全に一致する。これ
らの実験から、胞子形成卵嚢から得たｍＲＮＡは、ｃＤ
ＮＡをＴＡ４抗原でコードさせるのに使用し得る事を実
証した。
【０１２２】例 ９ ＴＡ４抗原をコードするｃＤＮＡクローンの分離と特性
検定 ｃＤＮＡ ＴＡ４抗原をコードするヌクレオチドのシーケンスは、
容易に生育する、例えば大腸菌のような細胞の遺伝子と
して用い、ある種のＥｉｍｅｒｉａで起る鶏コクシジウ
ム症の予防接種用ＴＡ４蛋白質生産に用い得る。ＴＡ４
遺伝子（Ｆｉｇｕｒｅ５）には、三ヶ所に、ＤＮＡのシ
ーケンスが蛋白質のシーケンスと合致しない部分があ
る。これらの３つのシーケンスは、多くの真核生物遺伝
子のコード部位内に典型的に見出されるイントロンであ
る。しかし、大腸菌では、イントロン付の遺伝子は本来
の蛋白質として発現されないので、ＴＡ４抗原をコード
するｃＤＮＡのクローンを分離する必要があった。この
クローンは、ＴＡ４抗原をコードするシーケンスを一つ
ながりで含んでいる。
【０１２３】ｃＤＮＡの合成 短述して、例３に述べたように分離した胞子形成卵嚢ｍ
ＲＮＡは、Ｕｌｌｒｉｃｈその他（７６）に述べられた
ようにＡＭＶ逆転写酵素の活動でｃＤＮＡに転写され
た。転写は、ＴＡ４抗体ｍＲＮＡの３′−ポリアデニン
化した末端において、オリゴ−ｄＴをプライマーとして
始まる。第二のＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ク
レノフ断片）を用いて複写した。２ミクログラムのｍＲ
ＮＡから、３４０ｎｇのｃＤＮＡを得た。詳細には、２
ミクログラムのオリゴ−ｄＴ（１２−１８ヌクレオチ
ド、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，
ＮＪ）は、２ミクログラムの純化ｍＲＮＡと５０ｍＭの
ＮａＣｌの存在下でアニーリングさせた。
【０１２４】この除冷接着反応は９０℃に熱して後、徐
々に冷却するものである。逆転写酵素の反応には、デオ
キシヌクレオシド三燐酸（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの４種）を
０．５ｍＭのと４０単位の酵素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｔａｍｐａ，Ｆ
Ｌ）に加えた。逆転写反応緩衝は、次の如くである：１
５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３と２１ｍＭのＫ
Ｃｌと８ｍＭのＭｇＣｌ 2 と０．１ｍＭのＥＤＴＡと３
０ｍＭのベータ−メルカプトエタノール。この混合物
は、４２℃で４５分間インキュベートした。このＲＮＡ
−ＤＮＡ複鎖はフェノール クロロフォルムで１回抽出
し、次に、エタノールで沈澱させた。団塊にした試料
は、次に１００ミクロリットルの、次に示す諸品による
反応混合物に再懸濁した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ７．５と５ｍＭのＭｇＣｌ2 と１００ｍＭのＫＣ
ｌとそれぞれ２５０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ。ＲＮＡ分解酵素Ｈ（１００単位／ｍｌの
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ
Ｊ）およびＤＮＡ重合酵素Ｉ…Ｋｌｅｎｏｗ断片（５０
単位／ｍｌ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）とを、合併し、
１２℃で６０分のインキュベートして反応させた。これ
ら酵素の合併活性で、そのＲＮＡ−ＤＮＡ複鎖からｍＲ
ＮＡを取り外す、それは最初のｃＤＮＡ鎖が次のｃＤＮ
Ａ鎖の合成として用いてあるためである。この反応は、
ＥＤＴＡを最終濃度を１０ｍＭに加える事で止め、次に
ＤＮＡ複鎖をフェノール：クロロフォルムで抽出しエタ
ノールで沈澱させた。ＤＮＡポリメラーゼＩとＲＮＡポ
リメラーゼＨの反応順序は、３′と５′の両端で整末端
のｃＤＮＡ分子となる事を予想された。３′末端が整末
端である事は、以後のｃＤＮＡクローニングに必要であ
る。
【０１２５】ＴＡ４のｃＤＮＡライブラリーの構築 ＤＮＡは、１００ミクロリットルの滅菌水に再懸濁し
た。ｃＤＮＡを蔵書としてクローン化するには、ゲノム
のクローン１０８−１のＤＮＡシーケンスから決定して
ある制限分断位置を用いた。１つのＳａｃＩ位置が、Ｔ
Ａ４抗原の１，７００ダルトンの成熟サブユニットのＮ
−末端グルタミンの直ぐ上流にある。ＳａｃＩ（５０単
位／ｍｌ）によって、６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）と６ｍＭのＭｇＣｌ2 と６ｍＭのベータ−メル
カプトエタノール存在下で、６０分間３７℃で約５０ｎ
ｇが消化された。この試料は、フェノール：クロロフォ
ルムで再抽出し、エタノールで沈澱した。クローン化の
段階として、ｐＵＣ１８ベクター（５６）を用いた。そ
のベクターは、ＳａｃＩとＳｍａＩとで消化を施してあ
った。ＳｍａＩは、ｃＤＮＡの３′末端のリガーゼ接着
に必須な整末端位置を提供した。そのリゲーション反応
は、４０ｎｇのベクターＤＮＡと５０ｎｇのｃＤＮＡと
を用いて行った。リゲーションは、５０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）と１０ｍＭのＭｇＣｌ2 と２０
ｍＭのヂチオスレイトールと１．０ｍＭのｒＡＴＰとの
リガーゼ緩衝液に１単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて
１夜１２℃で行った。
【０１２６】組換ＤＮＡ分子は、次に形質転換で大腸菌
Ｋ１２、系統ＭＨ１に導入した。この形質転換バクテリ
アは、抗生アムピシリンを濃度５０ミクログラム／ｍｌ
含有する寒天プレートに拡げた。プラズミドｐＵＣ１８
（５６）はアムピシリン耐性遺伝子を持つので、組換プ
ラズミドを得たバクテリアだけが生き残った。これらの
バクテリアは各々生育してバクテリアコロニーを形成す
るため分裂した。コロニー中の各細胞は最初の親細胞の
子孫であって、同一の組換プラズミドを保有する。約６
７００のクローンが組換プラズミッド作用のため５０ナ
ノグラムのｃＤＮＡから得られた。
【０１２７】ＴＡ４ ｃＤＮＡクローンの同定 このｃＤＮＡライブラリーは、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎとＨ
ｏｇｎｅｓｓ（２０）に述べてある高密度スクリーニン
グ法でコロニー交雑によりスクリーニングした。ゲノム
クローンの７５塩基対のＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩ断片は純
化して、ニック−翻訳（４４）によって32Ｐで標識し
た。ポジティブのクローンは同定し、純化して、又プラ
ズミドＤＮＡは更に分析するために分離した。ポジティ
ブのｃＤＮＡのクローンに対する制限酵素分析は、ゲノ
ムのクローンにおける地図と合致した。ｐＴＣＤ２６と
呼ぶクローンのｃＤＮＡ挿入は、ゲノムのクローン（６
２）に対応するように作ったオリゴヌクレオチドを使っ
たヂデオキシ配列決定により配列を行った。ｃＤＮＡ
ｐＴＣＤ２６クローンの塩基配列は、図表７に示す。こ
のｃＤＮＡのクローンは、大腸菌の系統ＪＭ８３に形質
転換をし、そのＪＭ８３／ｐＴＣＤ２６と指定した系統
はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，に寄託
し、ＡＴＣＣ受入番号５３３１５を付与された。この寄
託は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ条約にもとづくものである。そ
のＤＮＡ配列は、ゲノムのクローンから予測されていた
ものである。そのｃＤＮＡから予測されたアミノ酸配列
は、蛋白質の微量配列方法から得たアミノ酸配列と一致
した。
【０１２８】例 １０ 大腸菌内におけるｃＤＮＡ誘導ＴＡ４抗原遺伝子の発現 ｃＤＮＡ誘導のＴＡ４直接発現プラズミドの構築 ｃＤＮＡのクローンは、ＴＡ４蛋白質を細菌内で合成す
る遺伝子を提供する。ただし、そのｃＤＮＡは大腸菌内
で転写と翻訳をさせるに適切な信号を含まない。従っ
て、クローン化したｃＤＮＡは、大腸菌中で挿入された
ｃＤＮＡの蛋白質合成を上流ではじめるため、ＲＮＡポ
リメラーゼとリボソーム添着位置に対する強い催進要素
を含む発現ベクターに挿入された。ここで用いられると
おりＴＡ４蛋白質という用語は図表７のｃＤＮＡの発現
産生物又は組換ＴＡ４誘導物質で細菌宿主細胞内で生成
されたいかなるものをもいう。ＴＡ４抗原という用語
は、ゲノムのＴＡ４ＤＮＡにより発現された自然発生の
物質をいい、胞子小体の表面に存在するか、又は胞子小
体から分離精製されたものを指す。
【０１２９】発現ベクターのｐＷＨＡ３３とｐＷＨＡ６
３とは、諸遺伝子を挿入すれば、大腸菌でそれが発現で
きるように構築したものである。その技術に熟達してい
る者には既に知られている他の適切なプラズミドも同様
に使用できる。プラズミドｐＷＨＡ３３とｐＷＨＡ６３
とは適当なプラズミドの２例である。ｐＷＨＡ３３プラ
ズミドは、３つのプロモーター（ｌａｃ，Ｌａｍｂｄａ
ＰR およびｔｒｐ）を持ち、いずれも挿入された遺伝
子の転写を指令する。これらプロモーターと、プラズミ
ドｐＤＲ４５０からのプロモーターｔａｃ（６１）Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）とを
種々の組合せで所持するプラズミドを構築した。プラズ
ミドｐＷＨＡ３３とｐＷＨＡ６３との構造は図表８に図
示する。ＴＡ４蛋白質を大腸菌内で合成させる１つの方
策は、リボソーム添着点と、コーディングするシーケン
スの前に、メチオニンのコドン（ＡＴＧ）を単に供与す
ることである。そのような直接発現プラズミドをＴＡ４
蛋白質用に構築するには、ｃＤＮＡクローンであるｐＴ
ＣＤ２６をＳａｃＩで分断して、次にＤＮＡポリメラー
ゼＩであるＫｌｅｎｏｗ断片で処理して両端を整末端に
する。オリゴヌクレオチド連結因子であるＣＯＤ−１５
４を整えたＳａｃＩ分断末端に結紮して蛋白質合成を開
始させるＡＴＧコドン及び、ｐＷＨＡ６３のＢａｍＨＩ
位置に挿入してクローン化する時に要るＢａｍＨＩ位置
を提供する。ＣＯＤ−１５４の構造は：
【０１３０】
【化１０】
【０１３１】ＣＯＤ−１５４の開始コドンＡＴＧの直前
にＴＴを挿入すると、翻訳開始の効率を高める。リガー
ゼでオリゴヌクレオチドＣＯＤ−１５４をｐＴＣＤ２６
の整末端に接着した後、その産物をＢａｍＨＩで消化し
た。ＴＡ４遺伝子を含む１２７６塩基対の断片はポリア
クリルアミドのゲル上で純化し、次に発現ベクターｐＷ
ＨＡ６３のＢａｍＨＩ位置に結紮して、プラズミドｐＤ
ＥＴ１を製作した。ｐＤＥＴ１の構造は図表８により図
示表示する。もう一つの直接発現プラズミドｐＤＥＴ２
は、ｐＤＥＴ１から、ｐＤＥＴ１をＨｉｎｄＩＩＩで消
化してｌａｍｂｄａ ＰRとｌａｍｂｄａ ＣＩとを含
むＨｉｎｄＩＩＩ断片を取除き、残部を再びリゲース接
着して構築した。ｐＤＥＴ１とｐＤＥＴ２の直接発現ベ
クターは、大腸菌の系統ＲＥＮ３に形質転換導入した。
組換ＤＮＡおよび寄生微生物でここでＲＥＮ３／ｐＤＥ
Ｔ１およびＲＥＮ３／ｐＤＥＴ２として述べられている
ものは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに
寄託し、ＡＴＣＣ受入番号５３３１６および５３３１８
を付与されている。これらの寄託は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ
条約にもとづくものである。
【０１３２】クローン化した遺伝子産物の大腸菌内合成
と分析 ｐＤＥＴ１とｐＤＥＴ２を内蔵する細胞の溶解物は、Ｔ
Ａ４蛋白質の有無について分析した。ｐＤＥＴ１とｐＤ
ＥＴ２とによって合成された蛋白質は、細胞溶解物を、
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａＴＡ４抗原の、還元して変性させた
１７，０００ダルトンの蛋白質に対して生成したマウス
抗血清と共にウエスターンブロット検索で同定した。ｐ
ＤＥＴ１とｐＤＥＴ２の発現は、先ず大腸菌系統Ｗ３１
１０（Ｗ３１１０は、野性型Ｌｏｎ+ プロテアーゼ遺伝
子を保有する）で分析した。Ｗ３１１０／ｐＤＥＴ１お
よびＷ３１１０／ｐＤＥＴ２の培養物は、Ｌ−ブロス
（１０ｇ／ｌのトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）と５ｇ／ｌの
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）と、５ｇ／ｌのＮａＣｌとを
ＮａＯＨでｐＨ７．５としたもの）に１００ミクログラ
ム／ｍｌのアムピシリンを加えて生育させた。最適の発
現を得る為に、培養物は３０℃で細胞密度が１−５×１
０8 ／ｍｌになる迄振盪培養し、新しい培養液で１：５
に稀釈し、３７℃で２から６時間振盪培養した。遠心分
離で細胞を収穫し、Ｍ９塩（６ｇ／ｌのＮａ2 ＨＰＯ4
と３ｇ／ｌのＫＨ2 ＰＯ4 と０．５ｇ／ｌのＮａＣｌと
１ｇ／ｌのＮＨ4 Ｃｌ）中で洗い、５×１０9 ／ｍｌ密
度でＬａｅｍｍｌｉゲル資料緩衝（３５）に再懸濁し
た。１２ミクロリットルの資料を１０分間、１００度に
熱し、１２−１／２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅブルーで染めるか、又はニトロセルローズ
薄片に移して１：１０００稀釈のマウス抗血清により上
述したような還元変性した１７，０００ダルトンのＴＡ
４ポリペプチドを検索した。
【０１３３】ＴＡ４遺伝子のｐＤＥＴ１およびｐＤＥＴ
２内での発現は、大腸菌のＷ３１１０系では非常に低
い。２５，０００ダルトンのＴＡ４蛋白質は、単に稀薄
にウエスターン ブロットに現れ、全細胞溶解物のＣｏ
ｏｍａｓｓｉｅブルーで染めたポリアクリルアミドのゲ
ルではバックグラウンドの色の上には可視できず、この
蛋白質の合成量が大腸菌の全蛋白質の０．５％以下であ
ることを示唆している。見かけ上の、ｐＤＥＴ１および
ｐＤＥＴ２の低発現は、ＴＡ４蛋白質が大腸菌Ｗ３１１
０内で不安定なためであったと思われる。その他の真核
生物諸蛋白質も、大腸菌で合成されると不安定である事
が示されている（１８）。従って、プラズミドｐＤＥＴ
１とｐＤＥＴ２とがｌｏｎプロテアーゼを欠く大腸菌系
統ＭＴＭ６（７）に形質転換導入した。ＭＴＭ６はＬｏ
ｎ系ＡＢ１８９９（ＣＧＳＣ＃１８９９）の非ムコイド
誘導体である。
【０１３４】ＴＡ４遺伝子のｐＤＥＴ１およびｐＤＥＴ
２内での発現は、系統ＭＴＭ６（Ｌｏｎ- ）で大幅に増
進している。発現はＷ３１１０について上述のように分
析した。図表９では、Ｗ３１１０（Ｌｏｎ+ ）とＭＴＭ
６（Ｌｏｎ- ）でのｐＤＥＴ１の合成を比較している。
ｐＤＥＴ１からｐＤＥＴ２かいづれかのＤＮＡを内蔵す
る系統は、還元して変性したＥ．ｔｅｎｅｌｌａ ＴＡ
４抗原に対してつくられたマウス抗血清に免疫反応を示
す２５，０００ダルトンのポリペプチドを生産した。こ
れらの結果は、ＴＡ４抗原遺伝子がコードしている２
５，０００ダルトンの蛋白質が、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ内
ではジスルフィッドボンドにより結合した１７，０００
ダルトンと８，０００ダルトンのポリペプチドに分断さ
れているが、この翻訳後の処理は大腸菌内では起らない
ことを示している。溶解した材料を遠心分離法により可
溶成分と非可溶成分とに分ける場合、大部分の２５，０
００ダルトン蛋白質は不溶性の細胞溶解物の断片内に偏
在する（図表９）。この非溶解性蛋白質は胞子体膜中で
ＴＡ４抗原を認識するか、又はジスルフィッドボンドを
還元することなく胞子体膜から抽出した単クローン抗体
Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と免疫反応を示さない。
【０１３５】ｐＤＥＴ１とｐＤＥＴ２との発現度はＬｏ
ｎ+ の大腸菌で低いため並びに、Ｌｏｎ- 大腸菌は大規
模培養を行うのには非実用的であるために、ＴＡ４蛋白
質は他の蛋白質との融合によりそれを安定化した。適当
な蛋白質は如何なるものでも、この蛋白質融合に採用す
ることができる。以下の例では、適当と思われる２つの
蛋白質のみを図示することにとどめる。即ち、ベータガ
ラクトシダーゼおよびプロキモシンである。
【０１３６】例 １１ 大腸菌内におけるベータ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質
としての、ＴＡ４蛋白質の発現 ベータ−ガラクトシダーゼ−ＴＡ４発現プラズミドの構
築 プロテアーゼ欠失系統において、遺伝子工学で作るＴＡ
４蛋白質の最大収量をうる観察は、ＴＡ４蛋白質が正常
大腸菌細胞内での劣化によることを示唆している。ＴＡ
４遺伝子融合プラズミドの構築は、ＴＡ４蛋白質を大き
な蛋白質に付着させることにより、ＴＡ４を大腸菌内で
安定させるという理由によるものである。数種の真核生
物蛋白質は、融合蛋白質（１７，２８）としてバクテリ
ア内で、安定性が更に高くなる。組換プラズミドｐＢＧ
Ｃ２３は、雑種で、ベータ−ガラクトシダーゼＴＡ４抗
原の融合蛋白質の発現用に構築したものである。それは
ｌａｃ調節部位を含むプラズミッドｐＤＫ2 で、実質的
にはプラズミッドｐＢＲ３２８のＥｃｏＲＩに挿入され
たｌａｍｂｄａ ｐｌａｃ（２２，６２）からのベータ
−ガラクトシダーゼ遺伝子（１００８コードン）から、
及びｃＤＮＡクローンｐＴＣＤ２６から誘導される。ｐ
ＢＧＣ２３の構築は図式にて図表１０に示す。ｐＤＫ２
以外の安定したプラスミドも使用可能である。プラズミ
ドｐＤＫ2 は適当なプラズミドの１つの事例である。
【０１３７】ＴＡ４のｃＤＮＡシーケンスを含むｐＴＣ
Ｄ２６から得た１２７６塩基対のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片は、ｐＤＫ２２を創出するため予めＥｃｏＲＩと
ＢａｍＨＩにより消化されているプラズミッドｐＤＫ2
にクローン化されたものである。クローンｐＤＫ２２
は、予期したプラズミドを含み、その中ではＴＡ４ｃＤ
ＮＡのシーケンスがベータ−ガラクトシダーゼのコード
シーケンスのＣ末端部に、融合化されていたものであ
る。しかし、このプラズミド中では、ｃＤＮＡ誘導によ
るＴＡ４のコーディングシーケンスが、ベータ−ガラク
トシダーゼのものと同一位相にはない。従って、プラズ
ミドｐＤＫ２２は、ＥｃｏＲＩで消化され、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理し、次いでＴＡ４
のコーディングシーケンスを正当な読取り枠にはめるた
め再結紮された。このプラズミドはｐＢＧＣ２３として
指定されたもので、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ
ｚ）のｃ−末端部に融合したＴＡ４の蛋白質からなる蛋
白質をコード化する雑種遺伝子を含む。ｐＢＧＣ２３は
大腸菌の系統ＪＭ８３とＲＥＮ３とを形質転換するため
に使用された。
【０１３８】その組換ＤＮＡと、ＲＥＮ３／ｐＢＧＣ２
３としてここに述べるその宿主微生物とは、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに寄託し、ＡＴＣＣ受
入番号５３３１７を付与されている。この寄託は、Ｂｕ
ｄａｐｅｓｔ条約にもとづくものである。
【０１３９】クローン化遺伝子産物の発現と分析 ｐＢＧＣ２３にコード化された蛋白質は、事例１０によ
る記述どおり純化、還元、変性した１７，０００ダルト
ン単位のＥ．ｔｅｎｅｌｌａ ＴＡ４抗原に対し、マウ
ス血清を使用して細胞溶解物のウエスタンブロットを検
索することにより同化したものである。ＪＭ８３／ｐＢ
ＧＣ２３およびＲＥＮ３／ｐＢＧＣ２３は、０．１％の
プドー糖と１００ミクログラム／ｍｌのアムピシリンを
補足されてＬ−ブロスで培養した。培養物は３７℃で１
晩振とうし飽和状態に生育させた。細胞は遠心分離によ
り収穫し、Ｍ９塩中にて洗浄し、５×１０9 ／ｍｌの密
度でＬａｅｍｍｌｉゲル資料緩衝液に再懸濁した。この
資料の２０ミクロリットルは１０分間１００℃で加熱
し、７−１／２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてＣ
ｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色するか、又は、ウエスタ
ーンブロットにかけるかの何れかによった。
【０１４０】染色、免疫汚点付けしたゲル（図表１１）
は、予期した１３５，０００ダルトンの融合蛋白質がＪ
Ｍ８３／ｐＢＧＣ２３およびＲＥＮ３／ｐＢＧＣ２３の
培養で合成されているが、ＪＭ８３単独では合成されて
はいないことを示した。そのウエスターンブロットは、
その蛋白質がＥ．ｔｅｎｅｌｌａ ＴＡ４抗原の還元、
変性したものに対しマウス清血を使って免疫活性である
ことを示す。図表８は、その蛋白質が細胞溶解物の不溶
性断片中にある事を示す。上述のように生育された培養
物は、リソザイムとＥＤＴＡによる処理後超音波で溶解
し、次に細胞膜は２％のトリトンで１晩４℃にて溶液化
されたものである。不溶性物質は、遠心分離法により収
集され、１３５，０００ダルトンのｐＢＧＣ２３の産生
物はこの断片中にあった。
【０１４１】ｐＢＧＣ２３の蛋白質は大腸菌で高水準で
合成されているが、しかし不溶性であり、単クローン抗
体、Ｐｔｎ７．２Ａ４／４に反応しない。更に、この不
溶性ｐＢＧＣ２３蛋白質はマウスに注射した場合、天然
のＴＡ４抗原と交叉反応をする抗体を産生しない。
【０１４２】例 １２ Ｅ．ＣＯＬＩ中のプロキモシン融合タンパク質としての
ＴＡ４タンパク質の発現 ｐＤＥＴ１、ｐＤＥＴ２またはｐＢＧＣ２３を含む細胞
が生成したタンパク質は大部分または全体的に不溶性で
あり、そのため明らかにモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．
２Ａ４／４に対し活性でない。不溶性で不活性な形で
Ｅ．ｃｏｌｉ中で生成されたその他の真核タンパク質は
可溶性となり、その活性をとり戻すことが認められた。
このようなタンパク質の１つがウシのプロキモシンであ
る。ＴＡ４ｃＤＮＡ配列をプロキモシン用に開発された
方法により可溶化及び活性化された不溶性融合タンパク
質の生成のためにウシのプロキモシンと融合させた。融
合タンパク質の特有の再結合の範囲は、キモシンの活性
を追跡することによりモニターすることができた。
【０１４３】プラスミドコード化プロキモシン−ＴＡ４
融合タンパク質はＴＡ４ｃＤＮＡ配列をクローン化され
たウシのプロキモシン遺伝子ｐＷＨＡ４３に組み入れる
方法すなわちそれはＥ．ｃｏｌｉ中の安定ではあるが不
溶性型のプロキモシンの合成を指令するもので、その方
法により作成された（４７）。その他のプラスミドも利
用できるものがある。適切なプラスミドの１つはｐＷＨ
Ａ４３である。
【０１４４】プロキモシン−ＴＡ４遺伝子融合を構築す
るためｐＷＨＡ４３を図１２に示すようにｐＷＨＡ９３
に転換した。初めにｔａｃプロモーターｐＤＲ５４０
（６１）を特定制限エンドヌクレアーゼ置換によりｐＷ
ＨＡ４９を生成するためｔｒｐプロモーターに置換し
た。次にプロキモシンの正常停止コドンをｐＷＨＡ９３
を得るために、ｐＭＨ２２の修飾プロキモシンＣ末端部
位にｐＷＨＡ４９のプロキモシン遺伝子のＣ末端部位を
置換して取り除いた。ｐＭＨ２２はｃＤＮＡのクローン
Ｐ５Ｇ３の遺伝子の半分のＣ末端を含み、そのＣ末端は
プラスミドｐＵＣ１８中のポリリンカー及びβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子フラグメントのプロキモシンＢｃｌ１
位（停止コドンの欠失位）は融合されたものである。プ
ロキモシン−ＴＡ４遺伝子融合の構築では１２９４ｂｐ
のフラグメントｐＣＯＣ１２をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔ１
の酵素と消化させてｃＤＮＡクローンｐＴＣＤ２６から
取り除き、次いでＤＮＡブラント末端を形成するために
ヤエナリヌクレアーゼと消化させた。プラスミドｐＷＨ
Ａ９３をＸｂａＩと消化させ、ヤエナリヌクレアーゼと
処理し、ブラント末端ベクターを組換えプラスミドｐＣ
ＯＣ１１を生成させるためＴＡ４ｃＤＮＡ配列（ヤエナ
リヌクレアーゼ処理後の１２８６ｂｐ）を持つブラント
末端と連結した。
【０１４５】この連結後ＴＡ４誘導配列はプロキモシン
のコード配列の読み取りフレームからはずれていること
がわかった。読み取りフレームを変えるためｐＣＯＣ１
１をＳａｃ１及びヤエナリヌクレアーゼと消化し、次に
ｐＣＯＣ１２を生成させるため再連結を行った。ｐＣＯ
Ｃ１２の構造は図１３に図表として示した。プラスミド
ｐＣＯＣ１２をＮａｒＩの消化及び再連結による２つの
ＮａｒＩフラグメントの除去により、プロキモシンまた
はＴＡ４配列を欠失せずにプラスミドの量を減らして、
ｐＣＯＣ１４に修飾した。プラスミドｐＣＯＣ１４をＳ
ｐｈ１との消化及び再連結による２４９ｂｐＳｐｈＩフ
ラグメントの除去によりｐＣＯＣ２０に修飾した。ｐＣ
ＯＣ２０のプロキモシン配列中の２４９ヌクレオチドの
欠失は正しい読み取り枠を保持しており、融合タンパク
質のプロキモシン部位の８３アミノ酸の欠失を生じるこ
とになる。
【０１４６】発現研究のためｐＣＯＣ１２及びｐＣＯＣ
２０をＲＥＮ３菌株、ＣＹ１５００１のバクテリオファ
ージＴ１耐性誘導体、Ｗ３１１０のｔｒｐＲ誘導体中に
形質転換した。ＲＥＮ３／ｐＣＯＣ１２及びＲＥＮ３／
ｐＣＯＣ２０としてここで記述する組換えＤＮＡ及び宿
主微生物はメリーランド州ロックビルのアメリカン基準
培養収集社に預託され、ＡＴＣＣの受け入れ番号がそれ
ぞれ５３３１４及び１３３１３とつけられた。これらは
ブタペスト条約にもとづいて実施された。
【０１４７】クローン化した遺伝子生成物の発現及び分
析 ｐＣＯＣ１２及びｐＣＯＣ２０ＤＮＡによりコード化さ
れたタンパク質を、事例１０に記述するとおり、電気泳
動及びニトロセルロース紙への移動による分別法に従い
免疫学的に同定した。ＲＥＮ３／ｐＣＯＣ１２及びＲＥ
Ｎ３／ｐＣＯＣ２０を０．１％グルコース及び１００μ
ｇ／ｍｌアンピシリンを加えたＬ−ブイヨン中で３０℃
１晩振とうして飽和した。細胞を遠心分離により採取し
Ｍ９塩で洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液に再懸
濁した。サンプルを１００℃で１０分加熱しＳＤＳ中で
１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、記述ど
おりクーマシーブルーで染色するかまたはニトロセルロ
ース紙に移して免疫学的分析を行った。トリトンに不溶
性の物質は例１１に記述するとおり、ＲＥＮ３／ｐＣＯ
Ｃ１２及びＲＥＮ３／ｐＣＯＣ２０の培養によって調整
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。図１４
に示した染色されたゲル及びウエスタンブロットは、ｐ
ＣＯＣ１２ＤＮＡが、予想分子量約６５，６００ドルト
ンの還元及び変性を受けたＥ．ｔｅｎｅｌｌａ ＴＡ４
抗原に対するマウス血清に免疫活性であるポリペプチド
をコード化することを示している。予想どおりタンパク
質は細胞溶解質の不溶性分画中に存在している。プラス
ミドｐＣＯＣ２０ＤＮＡは予想分子量５６，５００の免
疫活性ポリペプチドをコード化する。ｐＣＯＣ２０のＴ
Ａ４タンパク質もまた細胞の不溶性分画中に存在する。
【０１４８】例 １３ 不溶性状態からのＴＡ４タンパク質の抽出及びモノクロ
ーナル抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４との免疫活性の証明 プラスミドｐＤＥＴ１、ｐＤＥＴ２、ｐＢＧＣ２３、ｐ
ＣＯＣ１２、ｐＣＯＣ２０で表わされるＥ．ｃｏｌｉの
生成物は、すべて水にわずかしか溶けないかまったく不
溶性である。このプラスミドはすべてＬａｅｍｍｌｉサ
ンプル用緩衝液中で沸騰させると溶解し、１７，０００
ドルトンのＴＡ４抗原サブユニットに対して隆起するマ
ウス抗血清と反応するようになる。しかし、この条件で
はモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４とはどれも
反応しない。そのため、モノクローナル抗体Ｐｔｎ７．
２Ａ４／４と反応する抗原を生成するためこれらのＥ．
ｃｏｌｉの合成するタンパク質を可溶化及び再生するこ
とが必要であった。その結果動物中のＥ．ｔｅｎｅｌｌ
ａに対して反応する中和及び防御抗体の隆起が可能とな
った。
【０１４９】細菌的に生成したＴＡ４タンパク質の抽出
及び再生 最初にｐＣＯＣ１２タンパク質を活性酵素生成するため
ウシのプロキモシンの可溶化及び再生法として知られる
方法により可溶化及び再生を行った（４７）。この方法
によりプロキモシン活性（キモシンに対する酸活性化後
のミルクの凝固）及びＰｔｎ７．２Ａ４／４免疫活性の
両方を持つ純粋で水溶性ｐＣＯＣ１２タンパク質が生成
された。免疫活性の回復条件が最適化されたので下記の
とおり記述する。プラスミドｐＣＯＣ１２を上記のよう
にウシのプロキモシンのコード配列の３′末端とＴＡ４
ポリペプチドのコード配列の５′末端とを融合すること
により構築した。このプラスミドは標準的な手法を用い
るＥ．ｃｏｌｉ菌株ＲＥＮ３の形質転換に使用され、ア
ンピシリン耐性コロニーは精製されて培養に使われた。
新たに溝をつけた寒天プレートのアンピシリン耐性コロ
ニーをＬ−ブイヨン及び１００μｇ／ｍｌアンピシリン
を含む液体培地５ｍｌの接種に使用した。培養物を細胞
の濁りが目で見えるようになるまで、３７℃で数時間振
とうして生育させた。培養物５ｍｌが０．１％グルコー
スを添加したＬ−ブイヨン／アンピシリン溶液１リット
ルの入ったフラスコに移された。
【０１５０】この培養物を定常期に到達するまで３０℃
で振とうして生育させた。細胞を遠心分離により収集
し、−７０℃で冷凍保存した。ｐＣＯＣ１２を含むＥ．
ｃｏｌｉ菌株ＲＥＮ３の凍った細胞ペースト１０ｇを２
５ｍＭトリス塩酸ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ
／ｍｌリゾチームを含む溶液１００ｍｌ中に懸濁させ
た。短時間インキュベートした後、溶解した細胞をさら
に音波により粉砕した。Ｅ．ｃｏｌｉ中で合成されたプ
ロキモシンは細胞膜及び膜タンパク質を溶かす非イオン
性洗浄剤が存在していても細胞溶解質中では完全な不溶
性を示してきた。ｐＣＯＣ１２によるコード化したプロ
キモシン−ＴＡ４融合タンパク質の部分的な精製を、細
胞溶解質の１０，０００ｇで１０分間の遠心分離により
行い、次いで２％トリトンＸ−１００洗浄剤（シグマ化
学社、ミズーリ州セントルイス）を含む緩衝液でペレッ
ト状の細胞の残屑の洗浄剤による抽出を１晩かけて行っ
た。不溶性のまま残った融合タンパク質を遠心分離によ
り収集した。
【０１５１】この精製法は２％トリトンＸ−１００を含
む溶液で不溶性物質を更に洗浄することにより若干改良
された。ｐＣＯＣ１２プロキモシン−ＴＡ４タンパク質
をｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液６３ｍ
ｌ或いは１２．６ｍｌ中に懸濁させた。この懸濁液に固
体尿素を最終濃度がそれぞれ１０ｍｌ或は２０ｍｌ中に
６〜８Ｍとなるように添加すると懸濁液が完全に溶解す
る。このようにして生じた透明な溶液を最終体積が１０
００ｍ／ｓとなるようｐＨ１１．０に調製したリン酸ナ
トリウム緩衝液１０ｍｌを加えて１００または５０倍に
希釈した。溶液を全て混合し１５〜２５℃で２０分放置
した。それから溶液のｐＨが８．３となるように０．２
Ｎ塩酸を３分以上にわたり添加した。
【０１５２】このようにして生じた溶液を分析または保
管前に１時間以上室温で放置した。この溶液には純度８
０〜９０％の分子量６５，６００ドルトンのタンパク質
が約１００μｇ／ｍｌ含まれていた。サンプルのキモシ
ン酵素活性またはモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４
／４に対する免疫活性を以下詳述するとおり分析した。
キモシン活性の分析は適切に再生されたタンパク質の回
復をモニターする上で便利な方法であった。酸活性化に
続くミルク凝固の測定によるｐＣＯＣ１２タンパク質の
キモシン活性の回復とＰｔｎ７．２Ａ４／４の免疫活性
の回復はよい相関がみられた。ｐＣＯＣ１２タンパク質
の免疫活性の回復については下記に記述し図１５に示
す。
【０１５３】以上記述したその他のタンパク質及びタン
パク質融合は同様または同一の方法により可溶化及び再
生された。プラスミドｐＣＯＣ２０は図１３に図示した
ようにｐＣＯＣ１４融合タンパク質のプロキモシン成分
中のＳｐｈＩ欠失により構築された。この欠失は遺伝子
融合中の正しい読み取り枠を保持しておりｐＣＯＣ２０
融合タンパク質の不溶性またはそれに続く可溶化または
再生に何の影響も与えなかった。一方ｐＣＯＣ２０融合
タンパク質はそのＴＡ４エピトープの免疫活性を保持し
ており欠失含有プロキモシン域はミルク凝固活性を持つ
形には活性化されなかった。プラスミドｐＣＯＣ２０は
上述のとおり培養されたＥ．ｃｏｌｉ菌株ＲＥＮ３の形
質転換に使用した。不溶性ｐＣＯＣ２０プロキモシンＴ
Ａ４タンパク質は上記の方法でＲＥＮ３／ｐＣＯＣ２０
の凍結細胞ペースト１０ｇから分離、再生した。
【０１５４】プラスミドｐＢＧＣ２３は、図１０に図示
したようにＥ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼのコード
配列３′末端をＴＡ４ポリペプチド誘導ｃＤＮＡのコー
ド配列５′末端に融合することによりそれを構築した。
このプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ８３（上述のと
おり培養したもの）の形質転換に用いた。β−ガラクト
シダーゼ−ＴＡ４融合ポリペプチドは、細胞溶解質中で
は不溶性であることがわかり、また上述の方法でＪＭ８
３／ｐＢＧＣ２３の凍結細胞ペースト１０ｇから、それ
を分離再生した。
【０１５５】プラスミドｐＤＥＴ２は上記に図示したと
おり、融合ポリペプチドとしてよりむしろＴＡ４タンパ
ク質を直接発現するものとして構築した。ｐＤＥＴ２の
最適収量が得られたものはプロテアーゼ欠失Ｅ．ｃｏｌ
ｉ菌株ＭＴＭ６中からであった。この菌株は次の例を除
いて上述の方法で培養された。３０℃で生育した培養細
胞１リットルが吸光度０．５（６００ｎｍにおける吸光
度）になった時、温度は１〜２時間で３７℃まで上昇し
た。細胞を採集し、−７０℃で冷凍保存した。ＭＴＭ６
／ｐＤＥＴ２の凍結細胞ペースト１０ｇを上述の方法を
用いて溶解し、トリトン不溶性タンパク質を分離して上
述のとおり尿素に溶解した。可溶性タンパク質はｐＨ
８．５のリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＭに対する過剰
透析により再生した。
【０１５６】再生サンプルの免疫検定法 モノクローナル抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４で再生された
ｐＣＯＣ１２、ｐＣＯＣ２０、ｐＤＥＴ２及びｐＢＧＣ
２３タンパク質をＥ．ｔｅｎｅｌｌａスポロシストから
精製されたＴＡ４抗原に関して測定した。ミクロタイタ
ープレートのそれぞれの井戸（イムロンＩミクロエリサ
平底井戸プレート、ダイナテック研究所（株）、アレク
サンドリアＶＩ）にｐＨ８．０、１０ｍＭリン酸水素二
ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ツ
ビッタージェントTM３−１２を含む溶液で希釈した抗原
１００μｌでコートした。再生サンプルとして１：１０
から１：１０００の割合に希釈した抗原について試験を
した。精製したＥ．ｔｅｎｅｌｌａ抗原を０．５〜１０
ｎｇ／井戸で平行して試験した。プレートに室温で１時
間次に４℃で１晩、抗原溶液とインキュベートすること
により抗原をコートした。井戸は空にしてから０．０２
％（ｖ／ｖ）トウェーン２０（ＰＢＳＴ）を含むリン酸
緩衝液でｐＨ７．２にした生理食塩水で３回洗浄した。
プレートは３％（ｗ／ｖ）ゼラチン、１０ｍＭトリス塩
酸ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％
（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む溶液で室温で３０分
処理して残っているタンパク質結合部位をブロックし
た。
【０１５７】それからプレートをモノクローナル抗体Ｐ
ｔｎ７．２Ａ４／４（３％〔ｗ／ｖ〕ウシ血清アルブミ
ン中で３０μｇ／ｍｌ）、１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．
５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）
アジ化ナトリウムを含む溶液で室温で２時間インキュベ
ートした。井戸をＰＢＳＴで３回洗浄後、結合モノクロ
ーナル抗体ＰｔｎＡ４／４は、マウスＩｇＧ用のベクタ
ステインTMＡＢＣキット（ベクター研究所（株）カリフ
ォルニア州バーリンガム）を用いて測定した。プレート
の各々の井戸はそれぞれビオチン化したウマ抗マウスＩ
ｇＧ １００μｌで満たし（ビオチン化抗マウス抗体４
０μｌ及び正常なウマ血清８０μｌを１０ｍｌ ＰＢＳ
Ｔ中に含む）、室温で３０分インキュベートした。プレ
ートをＰＢＳＴで３回洗浄した。それからプレートにベ
クタステインTMＡＢＣ試薬１００μｌ／井戸加えて室温
で３０分インキュベートした（ＰＢＳＴ中でビオチン化
西洋ワサビペルオキシダーゼ８．０μｌと混合したアビ
ジンＤＨ試薬Ａ８０μｌをプレートに加える前に３０分
間プレインキュベートした）。
【０１５８】ＰＢＳＴで５回洗浄してから結合した西洋
ワサビペルオキシダーゼを１００μｌ基質／井戸（ｐＨ
５．３の５０ｍＭクエン酸／リン酸緩衝液中に０．１ｍ
ｇ／ｍｌの２，２′−アジ）−ジ−（３−エチル−ベン
ズチアゾリン−６スルホン酸と０．０１５％（ｖ／ｖ）
過酸化水素を加えた溶液）を加えることにより測定し
た。プレートを暗室で室温でインキュベートした。４１
４ｎｍにおける吸光度を基質を加えてから１０〜６０分
後にタイターテックマルチスキャンTM自動プレート読み
取り器（フロー研究所（株）、バージニア州マックリー
ン）中で測定した。種々の再生抗原（たとえば、ｐＢＧ
Ｃ２３、ｐＣＯＣ１２、ｐＣＯＣ２０及びｐＤＥＴ２に
よりコード化されたもの）の相対的免疫活性をＥ．ｔｅ
ｎｅｌｌａオオシストから抽出したＴＡ４抗原のそれと
比較した。それぞれのタンパク質の量の増加分をミクロ
タイタープレートの井戸に加えそれぞれの井戸中の反応
のＯＤ414 を存在する抗原量に対してプロットした（図
１５）。細菌的に生成された上述の変性／再生処理に従
うタンパク質の免疫活性は、モル平衡基準でＥ．ｔｅｎ
ｅｌｌａから抽出されたタンパク質の活性の１０〜３０
％の範囲であった。
【０１５９】例 １４ 不溶な状態からの免疫反応直接表現ＴＡ４タンパク質の
抽出 大腸菌の産物である表現プラスミド、ｐＤＥＴ1 、ｐＤ
ＥＴ2 、ｐＢＧＣ23、ｐＣＯＣ12およびｐＣＯＣ20は、
全てほとんど、あるいは全く不溶性である。これらは全
て、Ｌａｅｍｍｌｉ検体緩衝液中で沸騰して可溶化で
き、１７０００ダルトンのＴＡ４抗体サブユニットに対
して生成されたマウス抗血清と反応する。しかしなが
ら、これらの条件下では、いずれも、モノクローナル抗
体、ｐｔｎ７．２Ａ４／４と反応しない。それ故、モノ
クローナル抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４と反応し、その結
果、動物で、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａに対して中和、保護作
用を有する抗体反応を生じるような形で、抗原を生成す
るために、これらの大腸菌により合成されるタンパク質
を可溶化し、復元することが必要であった。ＴＡ４抗原
−プロキモシン融合ｐＣＯＣ12の可溶化および復元化が
報告されている。
【０１６０】プラスミドｐＤＥＴ2 は、上因に示されて
いるように、融合ポリペプチドとしてよりもむしろＴＡ
４タンパク質を直接的に表現できるように構成されてい
る。ｐＤＥＴ2 の最適な収率は、プロテアーゼ欠乏症大
腸菌ＭＴＭ6 およびＳＧ936で達成された。抗原回収の
培養条件を最適化させ、下記に記す。ｐＤＥＴ2 タンパ
ク質は、ＴＡ４プロキモシン融合を可溶化し、復元し、
免疫反応抗原（例１３）を生成することが知られている
方法により、可溶化、復元した。この方法では、ｐｔｎ
７．２Ａ４／４免疫反応性を有した純粋な可溶性、ｐＤ
ＥＴ2 タンパク質を生成した。
【０１６１】プラスミドｐＤＥＴ2 は、上述のように調
製された。このプラスミドを標準的な方法を用いて大腸
菌ＳＧ936 株を変換させるために使用し、アンピシリン
耐性コロニーを精製し、培養のために用いた。新しく画
線した寒天板からのアンピシリン耐性コロニーを、Ｌ−
肉汁およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００
ｍｌの液体培養の接種に用いた。培地は、振とう下で、
３０℃、一昼夜増殖させた。１００ｍｌの培地を、１リ
ットルのＬ−肉汁／アンピシリンを入れたフラスコ中殺
した。この培地を３０℃、振とうしながら、ＯＤ600 が
１．０になるまで増殖させた。ＩＰＴＧを２ｍＭに加
え、培地を３０℃で、２〜３時間以上増殖させた。細胞
は遠心分離で集め、−７０℃で凍結貯蔵した。ｐＤＥＴ
2 を含む大腸菌ＳＧ936 の凍結細胞ペースト５ｇを２５
ｍＭのトリス−塩酸ｐＨ８、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．
５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、４０ｍｌ中に懸濁した。短
いインキュベーション後、溶解細胞はさらに音波処理に
より破壊した。大腸菌で合成されたｐＤＥＴ2 タンパク
質が、細胞溶解物中に完全に不溶性であることが明らか
にされているため、ｐＤＥＴ−２−ディング化ＴＡ４タ
ンパク質を１００，０００ｘｇで１時間、細胞溶解物質
を遠心分離し、その後、５％トリトンＸ−１００洗浄液
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，セントルイ
ス，Ｍｏ）、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中で６０
分間、２５℃、ペレット化細胞屑を抽出して精製した。
ｐＤＥＴ2 タンパク質は不溶状態にあり、１００，００
０ｘｇで遠心分離により集めた。
【０１６２】ｐＤＥＴ2 不溶物質を１２ｍｌの１０ｍＭ
燐酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中に懸濁させ、残りの洗
浄液を除くために、遠心分離により集めた。ｐＤＥＴ2
ＴＡ４タンパク質を、１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）中に、最終量が７．７ｍｌになるように
懸濁した。懸濁液は、５．８ｇの固体尿素を最終量１２
００ｍｌになるまで加えて、十分に可溶化した。懸濁液
は良く混合し、１０分間、１５℃で放置する。容量１２
ｍｌ中８Ｍの溶液濃度のｐＨは、その後、溶液を室温で
１６時間混合した。得られた透明な液は、１００容の１
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＭ１１．０に調整）
で希釈し、最終容量が１２００ｍｌになるようにした。
溶液をよく混合し、１０分間、１５℃に放置した。溶液
のｐＨは、０．５Ｎの塩酸を５分間にわたって加え、
８．５に調整した。
【０１６３】得られた液は、測定と貯蔵の前に、１時間
以上室温に放置した。この液には、５０−６０％純粋な
２５，０００ダルトンのタンパク質、約１０μｇ／ｍｌ
が含まれた。例１３で詳述したように、モノクローナル
抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４を用いて、検体の免疫反応性
を測定した。検体は、上述のｐＢＧＣ２３およびｐＣＯ
Ｃ１２からの復元抗原と同程度の活性を有した。タンパ
ク質は、後述のワクチン接種研究のために、２ｍｇ／ｍ
ｌまで濃縮した。
【０１６４】例 １５ ニワトリでＥ．ｔｅｎｅｌｌａに対する保護反応および
スポロゾイド中和血清を誘発するためのＥ．ｔｅｎｅｌ
ｌａ ＴＡ４抗原および１１５００ダルトンフラグメン
トの使用。ＴＡ４抗原を用いたＥ．ｔｅｎｅｌｌａに対するスポロ
ゾイド中和血清反応の誘発 これらの実験で使用したＴＡ４抗原は非還元性ＴＡ４抗
原の調製のために例４で記載した方法により、スポロシ
ストから調製した。タンパク質の純度と同定は、ニワト
リで使用する前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびモノクロー
ナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４を用いた免疫反応性によ
り確認した。
【０１６５】ワクチン製剤は、抗原１容に対し約５％
Ａｒｌａｃｅｌ Ａ、９４％ Ｄｒａｋｅｏｌ ６−Ｖ
Ｒ、１％ Ｔｗｅｅｎ ８０から成る油状賦形剤３容と
し、各０．１ｍｌの用量が約１５μｇのＴＡ４抗原を含
むように調製した。必要に応じて、抗原はＰＢＳ（ｐＨ
７．２）で製剤に望ましいレベルまで希釈した。ニワト
リに０．１ｍｌを頸部筋肉用に投与した。抗原は２週間
隔で同量を同一の経路により、２回以上投与した。
【０１６６】タンパク質の各投与前の３日間および最終
投与後１１日間、トリを浮血させ、血液検体を採取し
た。熱不活性代血清は、例２で報告したようにスポロゾ
イト微量中和法で独立して試験した。血清による寄生虫
の中和はミゾントの発達を５０％阻害する最大血清希釈
に基づき評価した。下記の表Ｉに記載した結果から、賦
形剤のみを投与したワクチン非接種のトリでは、Ｅ．ｔ
ｅｎｅｌｌａスポロゾイトに対する中和抗血清価が証明
されてなく、抗原の３用量を投与したトリでは、中和抗
血清価が証明されたことが明らかにされた。
【０１６７】
【表１】
【０１６８】ＴＡ４抗原を用いたニワトリにおける保護
反応の誘発 最終的なワクチン接種後６３（８２）日に数羽のトリに
１０００ケの胞子形成、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ卵母細胞を
経口接種した。この後、翌日に胞子形成Ｅ．ｔｅｎｅｌ
ｌａ卵母細胞を３０００ケ再び経口接種した。盲腸病変
は最終感染後５日に評価した。結果を下記の表ＩＩに記
載した。
【０１６９】
【表２】
【０１７０】ＴＡ４抗原を用いたＥ．ｔｅｎｅｌｌａに
対するスポロゾイト中和血清反応の誘発 これらの実験で使用した免疫原は、例４で記載したよう
に、フェノール抽出法によりスポロシストから調製し
た。タンパク質の純度と同定は、ニワトリに使用の前
に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびモノクローナル抗体Ｐｔｎ
７．２Ａ４／４との免疫反応性により確認した。
【０１７１】凍結乾燥した精製抗原は、０．１５Ｍの生
理食塩水。燐酸緩衝液中に溶解させ、約５％のＡｒｌａ
ｃｅｌ Ａ、９４％ Ｄｒａｋｅｏｌ ６−ＶＲ、１％
Ｔｗｅｅｎ ２０から成る３容の賦形剤中に懸濁させ
最終濃度を７０μｇ／ｍｌとした。ニワトリの頸部筋肉
に、約１４μｇタンパク質／０．２ｃｃを筋肉内投与し
た。その後、２週間後に等量を同じ経路で投与した。タ
ンパク質の各投与前の１日前、およびタンパク質の２回
目の投与後２週間にトリを浮血し、血清検体を集めた。
例２で記述したように、熱不活性化血清をスポロゾイト
微量中和測定法で、別個に試験した。表ＩＩＩに示した
結果から賦形剤の４の投与のワクチン非接種のトリで
は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａスポロゾイトに対する中和抗血
清価が証明されないが、抗原を２回投与したトリでは、
最大１：８１までの力価の中和抗血清の証明されること
が明らかにされた。
【０１７２】
【表３】
【０１７３】ＴＡ４抗原の１１５００ダルトンフラグメ
ントを用いたニワトリにおける保護反応の誘発 ニワトリの頸部筋肉に、前述の賦形剤中に懸濁させた約
３μｇの抗原を１回投与した。第２の群に賦形剤のみを
投与した。ワクチンを接種していないもう１つの群（見
張りｓｅｎｔｉｎｅｌ）のニワトリを前述の２群の各々
と飼育した。トリをＥ．ｔｅｎｅｌｌａにより汚染され
たケージで飼育し、コクシジウムに接触させた。約２週
間後、ニワトリを調べ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａに感染して
いることが明らかにされた。結果を、下記の表ＩＶに示
す。
【０１７４】
【表４】
【０１７５】上述の条件は、野外でのＥ．ｔｅｎｅｌｌ
ａへの自然の暴露方法と非常に良く似ているため、ここ
で示したデータは、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａによるコクシジ
オイデス症に対する保護方法が有用なことの明確な証拠
となる。
【０１７６】ニワトリの中和血清抗体がＴＡ４抗原の１
７，０００ダルトンのポリペプチド成分を認識すること
の証明 ＴＡ４抗原の１７，０００ダルトンのポリペプチド成分
に対する血清抗体の特異性の分析は、Ｗｅｓｔｅｒｎブ
ロットを用いて実施した（７．５９）。Ｅ．ｔｅｎｅｌ
ｌａスポロゾイトに対する中和価の証明された全てのニ
ワトリ抗血清は、ＴＡ４抗原の１７，０００ダルトンの
ペプチド成分へ特異性を有する免役グロブリンを含むこ
とが明らかにされた。逆に、無反応あるいは対照のトリ
の血清は、１７，０００ダルトンのポリペプチドや他の
スポロゾイトタンパク質に、特異性を示さなかった。
【０１７７】ニワトリの中和性血清抗体がモノクローナ
ル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と競合することの証明 対応する対照血清と共に、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａに対する
中和抗体価の証明された、ワクチン接種トリ血清の、ス
ポロゾイト膜上の結合部位に対して、ｐｔｎ７．２Ａ４
／４抗体と競合する能力を調べた。ポリスチレン９６ｗ
ｅｌｌ ｅｌｕｓｔｅｒｓ（Ｉｍｍｕｒｏｎ ＩＩ）
を、５０μｌのスポロゾイト膜タンパク質（１０ｍＭグ
リシン緩衝液。生理食塩水、ｐＨ９．６に溶解）で、総
タンパク質約１００μｇ １ｍｌのレベルで感作した。
血清の連続２倍希釈液を、ｐｔｎ７．２Ａ４／４に結合
させたアルカリ性ホスファターゼ１：８０希釈を含む、
０．０００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０添加の０．１５Ｍ燐
酸緩衝液−生理食塩水中で調製し、感作プレートに、最
終容量が７５μｌ／ウェルになるように移した。
【０１７８】３７℃で３０分間インキュベーション後、
プレートを、ＰＢＳ−Ｔｗを用いて洗浄し、未反応物質
を除いた。その後、１Ｍのジエタノールアミン緩衝液に
溶解させたｐ−ホスホントロフェノールナトリウム塩の
ディスクから成る基質（１ｍｇ／ｍｌの濃度）を、プレ
ートの各ウェルに加え、最終量を１００μｌとした。生
じた反応生成物を、分光光度計により測定した。研究か
ら、中和や免役斑により証明されるように、ワクチン接
種に反応したトリ血清がモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．
２Ａ４／４と競合する抗体を含むことを証明することが
可能であった。この実験は、モノクローナル抗体ｐｔｎ
７．２Ａ４／４を用いた免役親和性クロマトグラフィー
あるいは通常のクロマトグラフィーにより、スポロゾイ
ト膜から精製した抗原が、ニワトリにおいてモノクロー
ナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４により決定されるエピト
ープに対する免役反応を促進するという直接的な証拠を
供する。
【０１７９】例 １６ ニワトリにおける Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘに対するスポロ
ゾイト中和血清反応を誘発するためのＥ．ｔｅｎｅｌｌ
ａタンパク質の使用 １１，５００ダルトン成分を含むＥ．ｔｅｎｅｌｌａ
ＴＡ４抗原製剤（実例４）で免役したトリからの熱不活
性化血清をプールし、ブタ胚肺細胞に代用する中和測定
法（実例２）で試験した。結果を下記の表Ｖに示す。
【０１８０】
【表５】
【０１８１】このデータはトリに、ＴＡ４抗原の精製し
た１１，５００ダルトンフラグメントを投与時にＥ．ｎ
ｅｃａｔｒｉｘに対する血清中和価の上昇していること
を示す。これまでにＴＡ４抗原の投与が、Ｅ．ｔｅｎｅ
ｌｌａに対する血清中和価を上昇させ、またＴＡ４抗原
の投与がＥ．ｔｅｎｅｌｌａの感染に対して保護効果を
示すことが証明されており、またＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ
スポロゾイト中和価が、ＴＡ４抗原の投与により上昇す
るためこの分野の熟練者は、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘに対
する保護が、ＴＡ４抗原の投与によっても得られること
が予想できるであろう。
【０１８２】例 １７ Ｅ．ＴＥＮＥＬＬＡ ＴＡ４抗原と交差反応する血清抗
体をマウスの体内で増殖させるための細菌により産生さ
れたＴＡ４プロテインの使用 細菌から産生したＴＡ４プロテインの抗原性はＣＢ６−
Ｆ１マウスに皮下注射を行なう試験によって明らかとな
った。再形成されたｐＣＯＣ１２およびｐＢＧＣ２３プ
ロテインをこれらの構成体から得られた不溶性プロテイ
ンとともに試験した。精製したＥ．ｔｅｎｅｌｌａ Ｔ
Ａ４抗原をポジティブコントロールとして、また、再形
成されたプロキモシン（ｐＷＨＡ４９を含有するＲＥＮ
３株から得た）をネガティブコントロールとして使用し
た。一群５匹のマウスにそれぞれの抗原を注射した。３
５日の間隔をおいてそれぞれのマウスに２回ずつ注射
し、注射後１０日間に採決を行なった。
【０１８３】Ｅ．Ｔｅｎｅｌｌａ ＴＡ４抗原の場合、
抗原を含む抗原溶液３容を、完全フロインド補助液５容
と混合し、１０マイクログラムをそれぞれのマウスに皮
下注射した（最終容量は２００マイクロリットル／注
射）。再形成したｐＣＯＣ１２およびｐＢＧＣ２３プロ
テインまたはこれらのプラスミドから得られた不溶性プ
ロテインについても同様に注射を行なった。ただし細菌
から産生したＴＡ４プロテインの場合にはＥ．ｔｅｎｅ
ｌｌａ抗原の場合の約２倍モル過剰量を注射した。それ
ぞれの血清は例１３で述べたＥＬＩＳＡ法で効力検定し
た。マイクロタイタープレートは、精製したＥ．ｔｅｎ
ｅｌｌａ ＴＡ４抗原２ｎｇ／穴で皮膜をほどこしたも
のを使用した。二回目の採血で得られた血清との効力検
定の結果を下表ＶＩに示した。
【０１８４】
【表６】 これらの実験は再形成プロトコールで生成したｐＣＯＣ
１２またはｐＢＧＣ２３プロテインで免疫したマウスの
抗体レベルが向上し、この抗体が精製したＥ．ｔｅｎｅ
ｌｌａ ＴＡ４抗原と交叉反応したことを示唆する結果
を与えた。これらの血清は少なくとも１：３０００の希
釈濃度において、精製したＥ．ｔｅｎｅｌｌａ ＴＡ４
抗原の存在下で強いポジティブシグナルを示した。他
方、不溶性ｐＣＯＣ１２およびｐＢＧＣ２３プロテイン
を注射したマウスから得られた血清中には、たとえその
血清の希釈率が１：３０のように低い場合であっても交
叉反応した抗体は本質的に存在しなかった。これらの実
験結果から、精製しないプロテインまたは再形成しない
不溶性ｐＣＯＣ１２およびｐＢＧ２３プロテインは効果
的なイミュノジエンではないことが示唆された。
【０１８５】例 １８ ニワトリの体内でＥ．ｔｅｎｅｌｌａに対する胞子小体
を中和する血清の応答および防御的応答を誘発するため
の細菌により産生されたＴＡ４プロテインの使用 すでにＥ．ｔｅｎｅｌｌａ（１５マイクログラム）から
精製したＴＡ４抗原の投与により血清抗体が生成し、こ
の抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏで胞子小体を中和し、Ｅ．ｔ
ｅｎｅｌｌａの攻撃からニワトリを防御することを述べ
た。これらの性質に対して再形成したｐＣＯＣ１２およ
びｐＢＧＣ２３プロテインがテストされた。コントロー
ルとしてベーターガラクトシダーゼおよび再形成したプ
ロキモンを使用した。再形成したｐＢＧＣ２３プロテイ
ン、ｐＣＯＣ１２プロテインおよびプロキモシンは、ポ
リエチレングリコールに対してあるいは空洞状の繊維濾
過器（Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｈ１Ｐ１０〜２０，Ａｍｉ
ｃｏｎ Ｃｏｒｐ． Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）により透
析され、最終濃度を０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌとしたも
のを使用した。それぞれの抗原を濃縮されたタンパク質
１容に対し、５％Ａｒｌａｃｅｌ，９４％ Ｄｒａｋｅ
ｏｌ ６−ＶＲおよび１％ Ｔｗｅｅｎ８０を含む３容
のオイルキャリアーと混合した。使用したそれぞれの抗
原の投与量を表ＶＩＩに示した。選択した投与量中には
およそ０．５〜２倍モル量の精製Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ
ｎａｔｉｖｅ ＴＡ４抗原が含まれている。この量の抗
原が免疫応答を誘発するのに効果的な量であることは前
述したとおりである。
【０１８６】
【表７】
【０１８７】実験１では前に述べたような混合法により
調整されたワクチン０．２〜０．５５ｃｃをニワトリの
首に筋肉内注射した。更に２週間の間隔でニワトリに同
様の投与法でワクチンを２回追加注射した。実験２では
前述のように調製されたワクチン０．２〜０．４５ｃｃ
を十二指腸組織に注射した。ニワトリには更に２週間後
に同様の投与法でワクチンを１回追加注射した。それぞ
れのプロテイン投与の３日前および最終投与の１１日後
に血清サンプルの収集のため採血を行なった。
【０１８８】Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａに対する胞子小体を中
和する血清応答の誘発 実験１および２ではニワトリから得られた血清を加熱に
より不活性化したものを使用してＥ．ｔｅｎｅｌｌａ胞
子小体の中和実験を行なった。一次のニワトリの腎臓細
胞培養液を使用して次に述べる方法でミクロ中和法によ
る効力検定を行なった。１〜２週齢のニワトリを殺し、
防腐処理を行なった後、腎臓を切除した。得られた腎臓
の抗トリプシン性を破壊し、腎細胞をウェル当たり１０
4 の濃度で、熱で不活性化した子牛の退治の血清５％を
添加したＥａｒｌｅｓ ＬＡＨ培地中に、９６ウェル中
に移植した。培養は５％ＣＯ2 雰囲気中で４１℃で行な
った。培養した細胞がだいたい５０％合流するレベルに
達した時、前述の方法で希釈した試験用の血清をミクロ
プレートの各穴に５０マイクロリットルずつ加えた。次
いで５０マイクロリットルにつき２〜３×１０4 コの胞
子小体を含むＥａｒｌｅｓ培養液５０マイクロリットル
をマイクロプレートの各穴に加えた。１２〜１６時間
後、培養液の上澄液を２％の加熱により不活性化した子
牛の胎児の血清を含む新しく調製したＥａｒｌｅ ＬＡ
Ｈ溶液に交換した。感染後４０〜４４時間経過した時点
で培養を停止した。この時点で培養の上澄液をプレート
から取り除いた。引き続きメタノールを加えて細胞をプ
レートに固着させ、５％氷酢酸溶液で酸性化した。固着
させた培養物を０．１％トルイジンブルーで染色した後
に観察を行なった。
【０１８９】それぞれの穴ごとに複分裂増員の抑制のお
よそのパーセントにより評価した。繁殖体の増加を完全
に抑制する事のできる血清の希釈可能な最大希釈率を基
準にして寄生虫の中和の程度を採点した。表ＶＩＩＩの
結果は次のことを示唆している。すなわちトリにベータ
ーガラクトシダーゼまたは再形成したプロキシモシンを
注射してもＥ．ｔｅｎｅｌｌａスポロゾイドを中和する
目立った抗血清力価は得られなかったが、ｐＢＧＣ２３
プロテインまたはｐＣＯＣ１２プロテインを筋肉内に３
回注射したトリはスポロゾイドを中和する顕著な抗血清
力価を示した。
【０１９０】
【表８】
【０１９１】Ｅ．ｃｏｌｉ産生ＴＡ４プロテインを免疫
されたニワトリの中和性血清とモノクローナル抗体 Ｐ
ｔｎ７．２Ａ４／４との競争についての実験 トリにワクチンを注射し、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａスポロゾ
イドに対して顕著な中和力価を有する血清を準備した。
また、これに対応するコントロール血清を準備した。こ
れらの血清につき、スポロゾイドの膜上のバインディン
グサイトと結合する能力を抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４の
結合能力と競争させて比較した。ポリスチレン製９６穴
プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ）のそれぞれの穴に１
０ｍＭグリシンで緩衝させ、ｐＨを９．６とし、約１０
０マイクログラムトータルプロテイン／ｍｌを含むスポ
ロゾイド膜プロテイン５０マイクロリットルを充てん
し、３７℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ（０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３
回洗浄した後、ＰＢＳに溶解した３％（Ｗ／Ｖ）子牛血
清アルブミン（ＲＩＡグレード，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加
し、１時間インキュベートした。０．０００５％のＴｗ
ｅｅｎ−２０を含む０．１５Ｍリン酸塩緩衝血清中で血
清を１：２から１：２００に連続して２回希釈した溶液
を調製し、プレートに添加して３７℃で３時間インキュ
ベートした。その後プレートにアルカリ性フォスファタ
ーゼで共役したｐｔｎ７．２Ａ４／４モノクローナル抗
体を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１９２】このプレートから（０．０００５％）Ｔｗ
ｅｅｎ−２０を含む０．１５Ｍリン酸塩緩衝食塩水を用
いて未反応物質を完全に洗い流した。その後、それぞれ
の穴に１Ｍジエタノールアミン緩衝液中に１ｍｇ／ｍｌ
ｐ−フォスフォニトロフェノールナトリウム塩を含有
する基質溶液１００マイクロリットルを加えた。反応後
生成した物質を分光法により検出した。非経口的にワク
チンを注射するプログラムに応答したトリの血清にはス
ポロゾイドの中和により確かめられた通り、モノクロー
ナル抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４（表ＩＸ）と競争する抗
体が含まれていた。この実験により、次の様な証拠が直
接得られた。すなわち、再形成したｐＢＧＣ２３およ
び、ｐＣＯＣ１２プロテインはニワトリの体内でＴＡ４
抗原のモノクローナル抗体ｐｔｎ７．２Ａ４／４により
認識される免疫応答の領域を刺激する作用があることが
明らかとなった。
【０１９３】
【表９】
【０１９４】種々のＴＡ４プロテインを用いてニワトリ
体内でＥ．ｔｅｎｅｌｌａにより感染の度合いを減少さ
せる免疫法 最終のワクチン注射後１１日経過後ニワト
リに低濃度のｃｏｃｃｉｄｉａ（約３００〜５００卵母
細胞）を注射して攻撃させ、床付きのオリに入れた。卵
母細胞の循環を最大とするために布団はそのままオリに
残した。最初の攻撃から１週間後に病巣の進行の均一性
を最大とするために４０００〜５０００の卵母細胞をニ
ワトリに注射して第２の攻撃を行なった。ニワトリはそ
の後６日目に殺して病巣の進行を評価した。病巣の採点
はＪｏｈｎｓｏｎおよびＲｅｉｄ（３０）により開発さ
れたパラメータによって行なわれた。
【０１９５】結果を表Ｘに示したように、再形成された
ｐＢＧＣ２３またはｐＣＯＣ１２プロテインをワクチン
注射したニワトリの病巣を攻撃観察した結果、対応する
コントロールグループの病巣ほどひどくないことが明ら
かとなった。再形成したｐＢＧＣ２３または再形成した
ｐＣＯＣ１２のいずれかのワクチン注射を行なったニワ
トリでは最も重篤な病巣（レベル＝４）への進行が全く
認められなかったばかりでなく、病巣の程度の分布が全
体的に軽度の値に移行していた。ワクチン注射を行なっ
たニワトリのおよそ５０〜７０％は病巣の程度が１〜２
のレベルと記録されたのに対し、コントロールのニワト
リの５０〜７０％は３〜４のレベルの病巣であると採点
された。
【０１９６】
【表１０】
【０１９７】
【表１１】
【０１９８】例 １９ ニワトリ体内で産生した組み換えＴＡ４（ｐＤＥＴ）抗
原への直接の表現に対する応答 ｐＤＥＴをワクチン注射したニワトリのアイメリア属ｔ
ｅｎｅｌｌａ抗原への血清学的応答。スポロシストによ
り誘導された、アイメリア属ｔｅｎｅｌｌａの膜プロテ
インに対するｐＤＥＴをワクチン注射されたニワトリの
免疫反応性を調べるための実験を実施した。１つの実験
につき、１０羽のニワトリを使用してそれぞれに５０マ
イクログラムのｐＤＥＴのワクチン注射を行ない、産生
したプロテインの直接の表現を調べた。プロテインの産
生について例１０に述べた。このプロテインの免疫反応
性を力価検定し、実験に使用する前にモノクローナル抗
体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４を用いて確認した。
【０１９９】ワクチンはｐＤＥＴに対して３：１の比の
５％ Ａｒｌａｃｅｌ−Ａ，９４％Ｄｒａｋｅｏｌ ６
−ＶＲおよび１％ Ｔｗｅｅｎ−８０を用いて調製し、
０．０４マイクログラムのＬＰＳ（３回投与の実験の場
合）または５０マイクログラムのＰＨＡ（単回投与の実
験の場合）を添加した。次いで頭部後側の首に０．５ｍ
ｌの皮下投与を行なった。初回の実験では、２週令のＬ
ｅｇｈｏｒｎを用いて開始して、ワクチン注射規定食餌
法を採用して１０日間隔で３回の投与を行なった。これ
と同じ間隔でニワトリから採血を行ない、血清を収集し
て凍結保存した。二番目の実験では４日令のｂｒｏｉｌ
ｅｒを使用し、ワクチン注射後５日目に採血を行なっ
た。両者の実験には上記のキャリアーに不活性なｐＤＥ
Ｔセメント質／アジュバント；アジュバント／キャリア
ー；およびワクチン注射しないコントロールを使用して
行なった。
【０２００】ワクチン注射した実験動物およびコントロ
ールから採血した血清の免疫反応性は例１３で述べたア
イメリア族ｔｅｎｅｌｌａスポロシストプロテインに対
するウエスタンブロット法で分析した。次表ＸＩに示す
実験結果から、ｐＤＥＴ抗原をワクチン注射する３回投
与の実験では、１０羽のトリのうち９羽が最初の攻撃か
ら１０日後に該当する分子量バンドでポジティブな反応
の応答があった。その後の２回の連続した攻撃の後は１
０羽のうち１０羽すべてが反応した。第２回目の不溶性
ｐＤＥＴの攻撃の後、数羽のトリの血清がＴＡ４抗原に
対して反応性を示した。単回投与の実験では、ｐＤＥＴ
のワクチン注射を行なった１０羽のトリのうち、１０羽
すべてが５日後に行なったウエスタンプロット分析の結
果、血清の変換を起こしたことが明らかとなった。ＬＰ
Ｓまたは攻撃コントロールとしてのトリはどちらのテス
トにおいても全くセロポジティブにならなかった。
【０２０１】
【表１２】
【０２０２】ｐＤＥＴをワクチン注射したニワトリのア
イメリア族ｔｅｎｅｌｌａ卵母細胞からの攻撃に対する
防御。概要について前述したワクチン３回投与計画にひ
きつづいて１０日目にニワトリにＥｉｍｅｒａ ｔｅｎ
ｅｌｌａの卵母細胞を接種し、寄生虫に特有な症状の病
巣を観察した。最終のワクチン注射後１０日目に前述の
４つのグループ（ｐＤＥＴ抗原、不溶性ｐＤＥＴ、アジ
ュバントコントロール、ワクチンなしコントロール）は
６，０００の胞子を形成した卵母細胞を経口投与した。
接種物は実験に先立ち希望する程度に重篤となった病巣
が得られるように力価測定を行なった。この寄生虫特有
のＣａｅｃａｌ性病巣を攻撃後５日目に例１８で述べた
方法で採点した。この結果を次表ＸＩＩに示したが、ｐ
ＤＥＴ抗原投与群はコントロールと比較して病巣の重篤
度の軽減および死亡数の減少を認めた。
【０２０３】
【表１３】
【０２０４】ｐＤＥＴ ＴＡ４抗原をワクチン注射した
ニワトリにおけるスポロゾイドを中和する血清反応。ワ
クチンを注射したトリから得られた血清の寄生虫中和能
力を検討することによりｐＤＥＴの能力を検定するため
にスポロゾイド中和効力検定法（ＳＮＡ）が適用され
た。例１８で設定されたＳＮＡプロトコールを用いて前
述の単回および３回投与実験で採血した血清を力価検定
した。次表ＸＩＩＩに示したようにｐＤＥＴワクチン注
射を行なったトリは対応するコントロールと比較して血
清のスポロゾイド中和能力を有することが明らかとなっ
た。
【０２０５】
【表１４】
【０２０６】例 ２０ モノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４により認識さ
れたＥ．ＮＥＣＡＴＲＩＸの抗原の同定 Ｅｉｍｅｒｉａプロテインの 125Ｉラベル実験。Ｅ．ｎ
ｅｃａｔｒｉｘから得られた総計２×１２8 コの卵母細
胞のヨウ素化を行なった。それぞれの場合、スポロシス
トを塩を浮かばせたハイポクロライトのナトリウム塩で
処理し、ガラス球で細胞膜を破壊し、ガラス綿を充てん
したカラムを通して精製した。スポロシスト膜を調製す
る場合、１．５倍容量のスポロシスト１ｍｌのＰＢＳお
よびガラス球とともにプロテアーゼインヒビターの存在
下で機械的に破壊した。プロテアーゼインヒビターの組
成は次のようである：０．１ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．１ｍＭ Ｎ−トシル
−Ｌ−フエニルアラニンクロルメチルケトン（ＴＰＣ
Ｋ）、１ｍＭ Ｎ−アルファ−Ｐ−トシル−Ｌ−リジン
クロルメチルケトン（ＴＬＣＫ）および１０ＫＩＵ／ｍ
ｌアプロチニン。残存するスポロシストを更にトリプシ
ンおよびタウロデオキシコリン酸（総容量＝１ｍｌ）で
処理してスポロゾイトの脱のうを行なった。両者の調製
液は４５分間４℃で超遠心分離（４５，０００ＲＰＭ）
し、得られたペレットを１ｍｌのリン酸塩で緩衝した食
塩水（ＰＢＳ）で再けん濁した。操作上の注意点として
超遠心分離を行なう前にＰＢＳおよび１ｍＭのＭＳＦで
洗浄する際、スポロゾイトからすべてのトリプシン−デ
オキシコリン酸塩を完全に除去することがあげられる。
【０２０７】１ｍｌのサンプルを４０マイクログラムの
ＩＯＤＯＧＥＮTM固相ヨウ素化試薬（２４，５４）を使
用して窒素気流下で乾燥し、ＰＢＳでリンスして得られ
た皮膜を容器内壁に形成したガラス性シンチレーション
バイアルに加えた。それぞれのバイアルに０．５ｍＣｉ
の 125Ｉを加え、サンプルを氷上で２０分間インキュベ
ートした。その後、１００マイクロリットルのＫＩ（１
Ｍ）をそれぞれのバイアルに加えて最終濃度を１００ｍ
Ｍとし、氷上で更に１５分間反応を進行させた。スポロ
ゾイドおよびスポロシスト調製液を次いで５ｍＭ ＫＩ
を含むｐＢＳで７ｍｌに希釈し、４℃で４５分間、超遠
心分離（４５，０００ＲＰＭ）によりペレットとした。
【０２０８】スポロシストおよびスポロゾイド膜プロテ
インの抽出。前記の超遠心分離により得られた 125Ｉを
標識したスポロシストおよびスポロゾイトのペレットを
１ｍｌのプロテイン抽出緩衝液中に再けん濁した。けん
濁液は氷上で時々渦状に振り混ぜながら３０分間インキ
ュベートした。不溶性の物質は４℃で１５分間ミクロ遠
心分離装置により界面活性剤に可溶な物質と分離され
た。この上澄液は−７０℃で保存した。125Ｉプロテイ
ンのＴＣＡによる沈降。それぞれのサンプルの１０マイ
クロリットルを５ｍＭ ＫＩ溶液９０マイクロリットル
で希釈した。希釈したそれぞれのサンプルを５％トリク
ロル酢酸（ＴＣＡ）、２５マイクロリットルのＢＳＡ
（１０ｍｇ／ｍｌ）および５ｍＭのＫＩを含む溶液１ｍ
ｌに加え、氷上で３０分間インキュベートした。沈殿し
たサンプルを、ガラス繊維フィルターでろ過し、０℃で
５ｍｌの５％ＴＣＡおよび５ｍＭ ＫＩで２回洗浄し、
０℃で５ｍｌの９５％エタノールで３回洗浄した後、液
体シンチレーションカウンターで１０分間計測した。
【０２０９】モノクローナル抗体との免疫沈殿。５０マ
イクロリットルのモノクローナル抗体を２５マイクロリ
ットルのＭＡＢ−ＤＩＬに加えた。２０マイクロリット
ルの 125Ｉ標識プロテインを次いで加え、かき混ぜた
後、４℃で一夜インキュベートした。ウサギの抗−マウ
スＩｇ血清（ＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＭ）をＭＡＢ−ＤＩ
Ｌ中で１：２に希釈し、その１０マイクロリットルをそ
れぞれの免疫沈殿の試験管に加え、４℃で１時間インキ
ュベートした。１：４に希釈したｐｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ（１０％ ｖ／ｖ）を加え、試験管を
ゆるやかに振り混ぜながら４℃で１時間インキュベート
した。免疫沈殿生成物を冷ＭＡＢＷで２回洗浄し、更に
室温においてＭＡＢＷで２回洗浄した。ペレットを５０
マイクロリットルのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液
（３５）で再びけん濁し、５分間沸騰させ、遠心分離に
よってｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを分離
した。上澄液を放射活性計測し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析した。
【０２１０】Ｅ．ＮｅｃａｔｒｉｘプロテインのＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）。免疫吸着された 125Ｉ標識スポロシストおよびス
ポロゾイド膜プロテイン、および免疫沈殿プロテインの
すべてを５〜２５％エキスポネンシャルまたは８〜２０
％リニア−グラジェントＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル（２５ｍＡ）で分析した。ゲルを乾燥し、Ｋｏｄａｋ
ＸＡＲ−５Ｘ線フィルム上へ−７０℃で一夜露出を行
なった。染色を目的としたゲルを製造元が添付した使用
説明書（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に従って、
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（２１）または銀染色を行なって視
覚化した。Ｅ．Ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原とＰｔｎ７．２Ａ
４／４モノクローナル抗体との免疫沈殿の結果。表面が
標識されたＥ．Ｎｅｃａｔｒｉｘスポロゾイド標本は、
２種の多重にヨウ素化されたプロテインを含んでいた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析結果から判断して、これらのプ
ロテインの分子量は約６，５００および２５，０００と
推定された。このうち６，５００ダルトンのプロテイン
はモノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４により容易
にまた特異的に免疫させることができた。スポロシスト
の膜にも多重にヨウ素化されたプロテインが存在し、そ
れらの分子量は約１８，０００および２６，０００であ
った。また、これらのプロテイン以外にも数種の少量の
ヨウ素化された種々の分子量を有するプロテインが検出
された。免疫沈殿された 125Ｉ標識スポロシスト膜プロ
テインの場合、モノクローナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／
４との反応により沈殿した抗原は、減力したＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析の結果、分子量１８，０００ダルトンのプロ
テインのみであることが確認された。
【０２１１】例 ２１ Ｅ．ＮＥＣＡＴＲＩＸ ＮＡ４抗原の精製、同定および
特性指摘。 ＮＡ４抗原の精製および特性指摘。胞子形成
したＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘの卵母細胞を１０9 コの卵母
細胞につき１０ｍｌのＰＢＳに再びけん濁し、これと等
容量のガラス球を加えて振り混ぜることによって細胞を
破壊した。膜を遠心分離（１００，０００ｘｇ、６０
分、４℃）により単離し、プロテインを１％ＮＰ−４
０、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ塩化
ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＴＬＣＫ、
０．１ｍＭ ＴＰＣＫおよび１０ＫＩＵ／ｍｌアプロチ
ニンに溶解した。不溶性物質は遠心分離（１００，００
０ｘｇスピン、６０分、４℃）によりペレットとした。
スポロシスト膜プロテインは、２０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．１）および０．０５％ Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ
TM３〜１２中で平衡化したＤＥＡＥ−ＨＰＬＣカラム
（Ｂｉｏ Ｒａｄ）に吸着させた。
【０２１２】この緩衝液に０．１ｍＭのジチオスレイト
ールを含む溶液および塩化ナトリウムグラジェント（０
−５００ｍＭ）でカラムから溶出を行なった。ゲル電気
泳動法の移動度により同定されたＮＡ４抗原が約２７５
ｍＭ塩化ナトリウムで溶出した分画に含まれていること
が明らかとなった。ＮＡ４抗原を含む分画をプールし、
ＣｅｎｔｒｉｃｏｎTM１０ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｄａｎｖｅｒ
ｓ，ＭＡ）を用いて濃縮した。濃縮物を約１０容の０．
０１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで希釈し、再び濃縮して食塩お
よびジチオスレイトールレベルを低下させたサンプルを
緩衝液を含む６２．５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）２
％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム塩、１０％（ｗ／
ｖ）グリセロールおよび０．００１％（ｗ／ｖ）ブロム
フェノールブルーを加えて希釈し、沸騰させた後、１５
％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行な
った。これらの減力しない条件では、およそ、２６，０
００ダルトンの分子量のＮＡ抗原がＫＣｌ染色２１によ
り同定された。ゲルの該当する部分を切り取り、ゲルを
１ｍｌの１０ｍＭ ＮＨ4 ＨＣＯ3 、０．０２％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳとともに室温で４時間振り混ぜ、プロテイン
を溶出した。この方法で調製したＮＡ４抗原は本質的に
純粋であった。
【０２１３】このＮＡ４抗原を、減力した条件（すなわ
ちサンプル緩衝液に５％（ｖ／ｖ）ベーターメルカプト
エタノールで溶かした条件）でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を
行なった結果、ＮＡ４抗原、分子量１８，０００および
約８，０００ダルトンの２種類のポリペプチドから成る
ことが明らかとなった。従って、スポロシスト膜の調製
液中には分子量１８，０００および８，０００ダルトン
のポリペプチドがジスルフィド結合と結合していること
が明らかとなった。
【０２１４】Ｉｎ Ｖｉｖｏでの試験における免疫吸着
技法によるＥ．Ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原の精製。Ｋａｓｐ
ｅｒらの免疫吸着技法にいくつかの変法（３１）を加え
た方法でＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ ＮＡ４抗原の免疫吸着
を行なった。要約すれば、すべてのＥ．ｎｅｃａｔｒｉ
ｘスポロシスト膜は本例初頭の部分で述べたように、Ｐ
ｔｎ７．２Ａ４／４モノクローナル抗体の存在下で４℃
で一夜インキュベートされた。その結果生成した反応混
合物をこれらと同様の条件下でＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）により山羊の抗マウス抗血清の存在下で４℃で固化
した。このけん濁液をガラスカラムに流し込み、吸光度
のベースラインが一定になるまでＰＢＳで結合していな
いプロテインを洗浄により除去した。非特異的に結合し
たプロテインをＰＢＳ（ｐＨ８．０）および酢酸塩緩衝
液（０．１Ｍ．ｐＨ４．０）で交互に洗浄することによ
り除去した。特異的に結合した抗原を２％ＳＤＳを含む
６０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）でカラムから溶出し
た。引き続いて、抗原を含むこの溶出液を同様の緩衝液
で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００カラムを通
過させ、同様の緩衝液を溶出した。ドデシル硫酸ナトリ
ウムを除去するために、Ｅｘｔｒａｃｔｉ Ｇｅｌ Ｄ
TMカラム（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を
通過させた。
【０２１５】例 ２２ Ｅ．ＮＥＣＡＴＲＩＸ ＮＡ４抗原の１８０００及び８
０００ダルトンのペプチド成分の部分アミノ酸配列ＮＡ
４抗原の１８０００ダルトンのペプチド成分のアミノ酸
配列。 １８０００ダルトンペプチドのアミノ酸配列決
定は、Ｎ末端アミノ酸をブロックする段階で複雑になっ
た（即ち、エドマン分解を受け難かった（１４））。こ
の問題を克服するために、ＮＡ４抗原をＣＮＢｒで開裂
させ、約１６０００ダルトンのＣＮＢｒ分画を逆相ＨＰ
ＬＣで精製した（２６）。ＣＮＢｒ開裂を行うために、
約１０マイクログラムの蛋白質を、４℃で一夜かけて７
０％ギ酸中２％ＣＮＢｒに溶解させた。この試料をＳａ
ｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄｖａｃ遠心分離器で蒸発乾固し、
０．１％ＴＦＡに再溶解した。大ＣＮＢｒ分画をＶｙｄ
ａｃ Ｃ４カラム（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕ
ｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）で精製し、０−１００％
の０．１％ＴＦＡ中ＣＨ3 ＣＮ：イソプロパノール２：
１グラジェントで溶出した。
【０２１６】気相配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｅ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，
ＣＡ）を用い、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら（２５）の方
法に従ってアミノ酸配列決定を行った。フェニルチオヒ
ダントイン（ＰＴＨ）を結合させたアミノ酸をＨＰＬＣ
で解析した（５Ｑ）。大ＣＮＢｒ分画の部分アミノ酸配
列を以下に示す。
【０２１７】
【化１１】 ＮＡ４抗原の８０００ダルトンのペプチド成分のアミノ
酸配列。 ＮＡ４抗原の８０００ダルトンのペプチド成
分のＮ末端アミノ酸配列は、直接ＮＡ４抗原の配列決定
を行うことにより決定できた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルか
ら溶出した精製ＮＡ４抗原を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １
０マイクロ濃縮機を用いて約６倍に濃縮した。ＳＤＳゲ
ルから溶出した試料中のグリシンを除去するために、２
０倍容量の水を濃縮物に２度添加し、この試料を再濃縮
した。濃縮した試料を、配列決定機に直接かけた。本ペ
プチドのＮ末端部位の部分アミノ酸配列を以下に示す：
【０２１８】
【化１２】
【０２１９】例 ２３ Ｅ．ＮＥＣＡＴＲＩＸ ＮＡ４抗原をエンコーディング
しているゲノミックＤＮＡクローンの単離と特性記述
Ｅ．Ｎｅｃａｔｒｉｘの胞子形成オオシストからのＤＮ
Ａの単離。 胞子形成オオシスト（５×１０8 ）を洗浄
し、例６において記述したように、スポロシストからＤ
ＮＡを単離した。バクテリオファージλｇｔ ｗｅｓ λＢにおけるＥ．
Ｎｅｃａｔｒｉｘのゲノミックライブラリーの構築。
バクテリオファージλｇｔ ｗｅｓ λＢにおけるＥ．
ＮｅｃａｔｒｉｘのゲノミックＤＮＡライブラリー（２
６）を、例６に記述したようにして構築した。１５マイ
クログラムのＥｃｏＲＩで開裂させたＤＮＡアームをＴ
４ ＤＮＡリガーゼを用いて、３マイクログラムのＥｃ
ｏＲＩで開裂させたＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ ＤＮＡに結
合させた。１マイクログラムの結合ＤＮＡをｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでファージ粒子に組み入れ、２×２０6 個の組み
替えファージ粒子のライブラリーを産生した。
【０２２０】Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘのゲノミックＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニング。 Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉ
ｘのゲノミックＤＮＡライブラリーの組み替えファージ
のニトロセルロースフィルター転写体について、
〔32Ｐ〕−ｄＡＴＰを用いてニック翻訳を行ったＥ．ｔ
ｅｎｅｌｌａのゲノミックローン１０８−１−２の７８
５塩基対Ｓａｃ Ｉ−ＰｖｕＩＩフラグメントを用いて
スクリーニングを行った。ニック翻訳された試料に混成
されたポジティブプラクを突き、精製したプラク及びＤ
ＮＡを、前述のようにして調製した。Ｅ．ｎｅｃａｔｒ
ｉｘ ＤＮＡ挿入体の精製及び特性記述のために、ポジ
ティブファージ７を大規模に培養した。
【０２２１】１８，０００ダルトンのペプチドをエンコ
ーディングしているゲノミッククローンの詳細な特性記
述−制限マップ。 クローン７の３９００ｂｐ Ｅｃｏ
ＲＩフラグメント挿入体を、ファージベクターからプラ
スミドｐＵＣ９（７８）へ細クローン化し、クローン７
−４９を産生した。組み替えプラスミドを種々の限定エ
ンドヌクレアーゼで開裂させ、ゲノミックＤＮＡクロー
ン中のキー限定部位の位置を決定した。ＤＮＡ中の限定
部位は、１８，０００ダルトンのペプチド遺伝子の位置
及び方向を決定するために必要であるし、またＥｃｏＲ
ＩゲノミックＤＮＡフラグメントの配列決定のための策
略を開発するためにも必要とされる。定マップを、図１
６に示す。１８，０００ダルトンペプチドの遺伝子の位
置及び方向はこのマップに示されている。
【０２２２】細クローン７−４９のＤＮＡ配列解析。
Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ ＮＡ４抗原の１８０００ダルト
ンペプチド成分の遺伝子を含有するクローン７−４９の
フラグメントについて、種々の制限酵素フラグメントを
用いる。Ｓａｎｇｅｒ（６２）のジデオキシ法により配
列決定を行った。ＤＮＡ合成のためのプライマーには、
他の合成オリゴヌクレオチドはもちろんのこと、オリゴ
ヌクレオチドＣＯＤ９２、９４及び１０８等がある。Ｄ
ＮＡ配列を図１７に示す。
【０２２３】Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ ＮＡ４抗原をエン
コーディングしている遺伝子の構造。ＤＮＡ配列は、ア
ミノ酸の部分解析により予想されたものと一致してい
る。非還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よると、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ及びＥ．ｔｅｎｅｌｌａ
の両抗原は、明らかに２５−２６，０００ダルトンの分
子量を有する。還元条件下の電気泳動では、両抗原がジ
スルフィド結合により結合した２種のポリペプチドで構
成されていることを証明した。Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ遺
伝子とＥ．ｔｅｎｅｌｌａ遺伝子との比較では、遺伝子
構造が前に討論した３つの特徴においてＥ．ｔｅｎｅｌ
ｌａ遺伝子に類似していることを示唆している。即ち、
（１）この遺伝子は２３個のアミノ酸シグナルのペプチ
ドをエンコードしている、（２）遺伝子内に３個のイン
トロンが存在する、および
【０２２４】（３）この遺伝子は、１８，０００及び
８，０００ダルトンペプチドを産生するための同一蛋白
分解作用部位（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ）を有する２
６，０００ダルトンペプチドをエンコードしている。
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ遺伝子と比較したＥ．ｎｅｃａｔｒ
ｉｘ遺伝子のＤＮＡ配列解析から、両ペプチド間の類似
点及び相違点が推定される。図１８は、Ｅ．ｔｅｎｅｌ
ｌａ及びＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ遺伝子と、予想されるア
ミノ酸配列との整列を示している。３個のイントロンの
入口／出口は、両遺伝子に保存されている。２個のＡ４
抗原蛋白は、それらのアミノ酸配列に８６％の類似点を
示している。
【０２２５】すべてのシステインアミノ酸残基及びおそ
らくジスルフィド結合も保存されている。Ｅ．ｎｅｃａ
ｔｒｉｘの蛋白は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの蛋白の熟成し
た１７，０００ダルトンのポリペプチドの２位と３位の
間に１個のアミノ酸が挿入されていることを示してい
る。さらに、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘの蛋白は、Ｅ．ｔｅ
ｎｅｌｌａの蛋白の４５位に存在するセリン残基を欠損
しているし、また熟成したＥ．ｔｅｎｅｌｌａの蛋白中
の２２３番から２２８番までに相応するアミノ酸も欠損
している。図１９は、遺伝子内の３個のイントロンの整
列を示している。イントロンＡは、両種内の１０１ｂｐ
であり、８９％の配列類似性を示している。イントロン
Ｂは、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａにおいては１１４ｂｐ Ｅ．
ｎｅｃａｔｒｉｘにおいては１２２ｂｐであり、７４％
の配列類似性を示している。イントロンＣは、Ｅ．ｔｅ
ｎｅｌｌａにおいては１２４ｂｐ．Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉ
ｘにおいては１１７ｂｐであり、７７％の配列類似性を
示している。このように、イントロンは、明らかに異な
っている。
【０２２６】例 ２４ ＮＡ４抗原をエンコーティングしているｍＲＮＡの単離
と同定 ＮＡ４抗原をエンコーディングするｃＤＮＡを合成する
前に、ＮＡ４抗原をエンコーディングするｍＲＮＡが、
胞子形成中のどの時期に現れるかを決定する必要があっ
た。２．５×１０8 のオーシストを４０時間軽く攪拌
し、３０℃で胞子を形成させた。胞子を形成するオーシ
ストを、７−８００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を
除去した。小球を、ドライアイス／メタノール浴中で急
速冷凍し、ＲＮＡを単離するまで−７０℃で保存した。
各々の小球は、約１０容量の５Ｍのグアニジンチオシア
ナート，ｐＨ７．５の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１
０ｍＭのＥＤＴＡ，５％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエ
タノール中で解凍し、オーシストを、同容量の１．０ｍ
ｍのガラスビーズを用いて１０分間激しく攪拌すること
により急激に破壊した。このサンプルを２％（ｗ／ｖ）
Ｎ−ラウロイルサルコシンに添加した後に、約８０００
ｘｇ、室温で遠心分離して不溶物を除去した。ＣｓＣｌ
クッションを通して沈殿させることにより上清からＲＮ
Ａを単離した（７６）。
【０２２７】ＲＮＡの小球を、ｐＨ７．５の２０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０の５０ｍＭのＥＤＴＡ，
０．２％ＳＤＳ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＲＮａｓｉ
ｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ，１０ｍＭベータメルカプトエタノール）中に再懸
濁させた。フェノール−クロロホルム：イソアミルアル
コール（２４：１）及びクロロホルム：イソアミルアル
コール（２４：１）の何れかを用いて抽出した後に、Ｒ
ＮＡを沈殿させ、−２０℃でエタノール中に保存した。
約８５−１５０マイクログラムの総ＲＮＡを、（０．５
−１．０×１０ 9 の）オーシストから単離した。オリゴ
ｄＴセルロースクロマトグラフィーにより、ポリＡを含
有するＲＮＡを単離した（２）。ｐＨ７．５の１０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳ、０．４ＭのＬｉＣｌを用い、総ＲＮＡを
オリゴｄＴセルロースカラム（Ｔｙｐｅ ３，Ｃｏｌｌ
ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．Ｌｅ
ｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）にかけた。ＬｉＣｌを含まない
同一緩衝液を用い、４℃でＲＮＡを溶出した。５．０×
１０8 のオーシストから、約１０マイクログラムのＡ+
ＲＮＡを単離した。
【０２２８】ポリＡ ＲＮＡが、ｃＤＮＡ合成の鋳型と
して使用される前に、ＮＡ４抗原をエンコーディングす
るｍＲＮＡの存在を実証する必要があった。ＮＡ４抗原
ｍＲＮＡの存在は、充分に胞子形成を行った（４０時
間）オーシストから得たポリＡＲＮＡを、ＴＡ４の蛋白
をエンコーディングするクローンから得たＤＮＡと混成
することにより証明した。胞子形成オーシストから単離
した１０マイクログラムの総ＲＮＡを、ホルムアルデヒ
ドを含むゲルを用いて電気泳動させた（４４）。ＲＮＡ
をナイロンフィルターに転移させて、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
ｂｌｏｔ解析を行った。ナイロンフィルターは、ＴＡ
４ ｃＤＮＡクローンの最初の約３００ｂｐから成る、
ＴＡ４ ｃＤＮＡフラグメントの最初の約３００ｂｐか
ら構成されている、〔32Ｐ〕でニック翻訳された（４
４）ＤＮＡフラグメントを用いて精査した。このフラグ
メントのＤＮＡ配列は、それに対応するＮＡ４遺伝子配
列中の部位と８０％以上類似しているので、適切な試料
として選択される。ＮＡ４抗原をエンコーディングする
ｍＲＮＡは、４０時間胞子形成したオーシスト中に確か
に存在した。これらの実験は、４０時間胞子形成したオ
ーシストから得られたｍＲＮＡを用いると、ＮＡ４抗原
をエンコーディングするｃＤＮＡを産生することを実証
している。
【０２２９】例 ２５ ＮＡ４抗原をエンコーディングするｃＤＮＡクローンの
単離と特性記述 ｃＤＮＡ ＮＡ４抗原をエンコーディングするヌクレオチド配列
を、大腸菌のような容易に増殖する細胞中の遺伝子とし
て使用し、ある種のアイメリア属により引き起こされる
コクシジウム症に対する鶏のワクチン接種のためのＮＡ
４蛋白を産生した。ＤＮＡ配列が蛋白配列と一致しない
部位は、ＮＡ４遺伝子（図１７）には３ケ所ある。これ
ら３個の配列は、多くの成熟核遺伝子のコーディング部
位内に典型的に見出されるイントロンである。しかしな
がら、イントロンを含む遺伝子は、大腸菌において固有
の蛋白を表わさないと思われるので、ＮＡ４抗原をエン
コーディングするｃＤＮＡクローンを単離する必要があ
った。このクローンは、ＮＡ４抗原に対して連続するコ
ーディング配列を含んでいる。
【０２３０】ｃＤＮＡの合成 簡単に、例２４に記述したようにして単離した胞子形成
オーシストのｍＲＮＡを、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏ
ｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）から購入したｃＤＮＡ合成
キットを用いてｃＤＮＡに転写し、それらの指針に従っ
て使用した。２マイクログラムのｍＲＮＡから、約４０
０ｎｇのｃＤＮＡを得た。
【０２３１】ＮＡ４ｃＤＮＡライプラリーの構築 ｃＤＮＡを、２０マイクロリッターの６ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ７．４の６ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，６ｍＭベ
ータメルカプトエタノール中に再懸濁した。ｃＤＮＡを
ライブラリーにクローン化するために、ＮＡ４ゲノミッ
ククローンＤＮＡ配列から決定された制限部位を使用し
た。ＳａｃＩ部位は、ＮＡ４抗原の熟成１８，０００ダ
ルトンのサブユニットのＮ−末端グルタミンの即上流に
あり、第２のＳａｃＩ部位は、最初のものから６０ｂｐ
下流にある。ｃＤＮＡを、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．４）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、及び６ｍＭベータメ
ルカプトエタノールの存在下、１２ユニットのＳａｃＩ
を用いて３７℃１５０分間消化させた。
【０２３２】ｃＤＮＡの主要部位、即ち第２のＳａｃＩ
部位から遺伝子の末端までをクローニングするために、
ｐＵＣｌ（５６）を使用した。ベクターをＳａｃＩ及び
ＳｍａＩを用いて開裂させた。ＳｍａＩは、ｃＤＮＡの
３′末端の結合に必要な鈍い末端部位を与えた。結合反
応は、約４０ｎｇのベクターＤＮＡと４０ｎｇのｃＤＮ
Ａを用いて行った。結合は、１ユニットのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いる５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，２０ｍＭジチオトレ
イトール、１．０ｍＭ ｒＡＴＰのリガーゼ緩衝液中
で、１２℃一夜かけて行った。
【０２３３】組み替えてＤＮＡ分子をその後、変換によ
り大腸菌Ｋ−１２株ＭＨ１に導入した。変換された菌を
５０マイクログラム／ｍｌの濃度の抗生物質アンピシリ
ンを含む寒天平板培地に塗り広げた。プラスミドｐＵＣ
ｌ ８（５６）は、アンピシリン耐性遺伝子を含有する
ので、組み替えプラスミドを獲得した菌のみが生存し
た。これらの菌は、それぞれ増殖し分裂して菌コロニー
を形成する。コロニーのそれぞれの細胞は、オリジナル
の親細胞の子孫であり、同一の組み替えプラスミドを含
有している。２０ナノグラムのＳａｃＩで開裂したｃＤ
ＮＡから約２０，０００クローンを得、組み替えプラス
ミドを作った。
【０２３４】ＮＡ４ｃＤＮＡクローンの同定 本ｃＤＮＡライブラリーを、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨ
ｏｇｎｅｓｓ（２０）により記述された高密度スクリー
ニング法を用い、コロニー混成によりスクリーニングを
行った。前に記述した、ｍＲＮＡに対して混成するため
に使用されたＴＡ４ｃＤＮＡクローンの同一３００ｂｐ
フラグメントを精製し、ニック翻訳により32Ｐで標識し
た（４４）。ポジティブクローンを同定し、精製し、さ
らに解析を行うために、プラスミドＤＮＡを単離した。
ポジティブｃＤＮＡクローンｐＳＭＡＣの限定解析は、
ＮＡ４ゲノミッククローンから予想されたマップと一致
した。ｐＳＭＡＣと表わされるクローンのｃＤＮＡ挿入
体について、ゲノミッククローンに対応させるためのオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いるジデオキシ配列決
定により配列決定を行った（６２）。ｐＳＭＡＣの構築
を図２０に示す。本ｃＤＮＡクローンを大腸菌ＪＭ８３
株に変換し、ＪＭ８３／ｐＳＭＡＣと表わされる菌株
は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに寄託
され、また、ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．６
７ ２４１と指定された。この寄託はＢｕｄａｐｅｓｔ
Ｔｒｅａｔｙに従って作製した。ＤＮＡ配列は、ゲノ
ミッククローンから予想されたものに一致した。
【０２３５】プラスミドｐＳＭＡＣは、９０％以上のＮ
Ａ４ｃＤＮＡをエンコードしているが、熟成ＮＡ４蛋白
に対するｃＤＮＡ配列の初めの６０ｂｐを欠損してい
る。簡略化するために、我々は、ＮＡ４ゲノミッククロ
ーン７から予想される配列を用いて、ｃＤＮＡのこれら
６０ｂｐを合成することを選択した。ＣＯＤ３９１とＣ
ＯＤ３９２の２種のオリゴヌクレオチドを、Ｂｉｏｓｅ
ａｒｃｈ ８，６００ＤＮＡ合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃ
ｈ，Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で
合成し、ＨＰＬＣで精製し、等量に混合し、５分間で９
０°まで加熱し、２２℃まで放冷した。これら２種のオ
リゴヌクレオチドを焼きもどすと、遺伝子の５′末端近
くの２つのＳａｃＩ部位の間のＮａ４遺伝子の配列と同
一のＳａｃＩ末端を有するＤＮＡフラグメントを形成す
る。この合成フラグメントを、ＳａｃＩで消化させたｐ
ＳＭＡＣに結合させ、得られる組み替え分子をＭＨ１に
変換し、変換体をＤＮＡ配列決定によりスクリーニング
し、何れのクローンが正しい方向にＳａｃＩ−ＳａｃＩ
６０ｂｐフラグメントを有し、正規の長さのＮＡ４ｃＤ
ＮＡをエンコードしているかを決定した。ｐＳＳ３３
が、このプラスミドである。ｐＳＳ３３の構築は図２１
に示してある。
【０２３６】ＮＡ４ｃＤＮＡ表現プラスミドの構築を促
進するために、正規の長さのＮＡ４ｃＤＮＡをエンコー
ドしている第２のプラスミドを構築した。このプラスミ
ドがｐＮＣＤである。ｐＮＣＤは、ｐＳＳ３３中のＮＡ
４ｃＤＮＡの５′末端をマークしているＳａｃＩ部位
の、ｐＵＣｌ８配列の即上流に挿入された、もう一つの
ヌクレオチド塩基対を含有している。この塩基対を加え
ると解読機構をシフトさせるので、牛プロキモシン（ｐ
ＷＨＡ９３）又は大腸菌ベータガラクトシダーゼ（ｐＤ
Ｋ２）の何れかのＥｃｏＲＩの場合には、解読機構は維
持されるであろうし、プロキモシン−ＮＡ４、又は、ベ
ータガラクトシダーゼ−ＮＡ４の縮合蛋白が産生され得
るのである。
【０２３７】ｐＳＳ３３を創出するために使用した方法
と同様にして、ｐＳＭＡＣからｐＭＣＤを誘導した。合
成オリゴヌクレオチドＣＯＤ３９５とＣＯＤ３９６を作
製し、精製し、アニーリングした。アニーリングした時
にそれらが形成するＤＮＡフラグメントはＥｃｏＲＩ末
端とＳａｃＩ末端を有する。このフラグメントを、Ｅｃ
ｏＲＩ−ＳａｃＩ開裂させたｐＳＭＡＣに結合させ、得
られる組み替えプラスミドを大腸菌Ｋ−１２株Ｍｈｌに
変換した。ｐＮＣＤの構築は、ジデオキシ配列決定によ
り証明した。ｐＮＣＤの構築を図２２に示す。ｐＮＣＤ
を大腸菌ホスト細胞ＪＭ８３に変換し、Ａｃｃｅｓｓｉ
ｏｎ Ｎｏ．６７２６６でＡＴＣＣに寄託した。
【０２３８】例 ２６ 大腸菌におけるｃＤＮＡ由来のＮＡ４抗原遺伝子の表現 ｃＤＮＡ由来ＮＡ４表現プラスミドの構築 ｃＤＮＡクローンは、菌においてＮＡ４蛋白合成のため
の遺伝子を与える。しかしながら、ｃＤＮＡは、大腸菌
において転写及び翻訳を可能にするための固有のシグナ
ルを含有していない。それゆえ、クローン化ｃＤＮＡ
を、ＲＮＡポリメラーゼに対する強いプロモーターを含
み、また大腸菌の挿入ｃＤＮＡの上流において蛋白合成
を開始するリボゾーム結合部位も含む所の表現ベクター
に挿入した。ここにおいて使用する様に、ＮＡ４蛋白と
いう語句は、ｐＳＳ３３又はｐＮＣＤの何れかの誘導
体、又は細菌ホスト細胞中で産生された何れかの組み替
えＮＡ４−誘導物質によりエンコードされたＮＡ４蛋白
の表現産物に関するものである。ＮＡ４抗原という語句
は、胞子小体の表面に存在する様な、又は胞子小体から
除去された様なゲノミックＮＡ４ ＤＮＡにより表現さ
れる天然生成物に関するものである。
【０２３９】ｐＷＨＡ９３とｐＤＫ２の表現ベクターに
遺伝子を挿入して大腸菌における表現を獲得出来るよう
に、ｐＷＨＡ９３とｐＤＫ２の表現ベクターを構築し
た。技術に熟練した人に知られている他の好適なプラス
ミドも使用され得た。ｐＷＨＡ９３とｐＤＫ２のプラス
ミドは、好適なプラスミドの２例である。ｐＷＨＡ９３
プラスミドは、ｌａｃ及びｔａｃという２つのプロモー
ターを有し（ｔａｃプロモーターは、プラスミドｐＤＲ
４５０由来のものである；３４；Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏ
ｎ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、それぞれのもの
は、押入された遺伝子の転写を方向付けることが出来
る。プラスミドｐＷＨＡ９３の構造を図１２に示す。
【０２４０】類似のＥ．ｔｅｎｅｌｌａ蛋白ＴＡ４の表
現レベルは、直接表現したものよりも縮合蛋白として表
現された時の方がはるかに高いので、ＮＡ４蛋白は、他
の蛋白に縮合することにより安定化される。何れの好適
な蛋白も本蛋白縮合に利用出来る。以下の例は、好適な
２つの蛋白のみについて、即ちベータガラクトシダーゼ
とプロキモシンについて説明する。
【０２４１】例 ２７ 大腸菌におけるベータガラクトシダーゼ縮合蛋白として
のＮＡ４蛋白の表現ベータガラクトシダーゼ−ＮＡ４表
現プラスミドの構築。 ＮＡ４蛋白を大蛋白に結合させ
ると大腸菌の中で安定化するので、ＮＡ４遺伝子縮合プ
ラスミドを構築した。数種の成熟核蛋白は、縮合蛋白と
して細菌中でより安定である（１７，２７）。組み替え
プラスミドであるｐＴＤＳ１とｐＴＤＳ２は、ベータガ
ラクトシダーゼ−ＮＡ４抗原縮合蛋白の表現のために構
築された混成体である。これらのものは、プラスミドｐ
ＤＫ２由来のものであり、ｌａｃ調節部位を含有し、ま
たプラスミドｐＢＲ３２８のＥｃｏＲＩ部位に押入され
たラムダｐｌａｃ（２２，６３）由来の、及びｃＤＮＡ
クローンｐＳＭＡＣ及びｐＮＣＤ由来の総ベータガラク
トシダーゼ遺伝子も含有している。ｐＤＫ２以外の好適
なプラスミドも使用され得る。
【０２４２】プラスミドｐＤＫ２は好適なプラスミドの
一例である。ｐＳＭＡＣ及びｐＮＣＤ由来の１．３ｋｂ
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、それぞれ９
０％あるいは全ＮＡ４ｃＤＮＡ配列を含有するが、この
フラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで開裂させ
て、それぞれプラスミドｐＴＤＳ１及びｐＴＤＳ２を産
生させた所のｐＤＫ２プラスミドＤＮＡにクローン化さ
せた。クローンｐＴＤＳ１及びｐＴＤＳ２は、９０％又
は全ＮＡ４ｃＤＮＡ配列が、解読機構においてベータガ
ラクトシダーゼのコーディング配列のＣ末端部位に縮合
している所の期待されたプラスミドを含有していた。ｐ
ＴＤＳ１及びｐＴＤＳ２の構築を図２３Ａ及び２３Ｂに
示す。ここでＭＨ１／ｐＴＤＳ１及びＭＨ１／ｐＴＤＳ
２と記述した組み替えＤＮＡとそのホスト微生物は、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｓｖｉｌｌｅ，ＭＤに寄託さ
れ、それぞれＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎナンバー６７
２４０及び６７ ２６４と指定された。これらの寄託
は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙに準じて行った。
ｐＴＤＳ１及びｐＴＤＳ３２蛋白を大腸菌で高濃度に合
合したが、不溶性でありモノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２
Ａ４／４と反応しない。
【０２４３】例 ２８ 大腸菌におけるプロキモシン縮合蛋白としてのＮＡ４蛋
白の表現 ｐＴＤＳ１及びｐＴＤＳ２を含有する細胞によって産生
された蛋白は、大いに又は全体的に不溶性であり、その
ために明らかにモノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４
との反応性はない。大腸菌において産生された、不溶性
で不活性な他の成熟核の蛋白を可溶化すると、その活性
が回復することが観察された。このような蛋白の一つは
牛プロキモシンである。ＮＡ４ｃＤＮＡ配列を牛プロキ
モシン遺伝子に縮合させて、可溶化され得る、またプロ
キモシンそのものに対して開発された方法により活性化
される所の不溶性縮合蛋白を産生した。縮合蛋白の固有
再賦活の程度は、プレートＥＬＩＳＡにおけるモノクロ
ナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４との免疫反応性によりモ
ニターされ得た。
【０２４４】プラスミドをエンコードしたプロキモシン
−ＮＡ４縮合蛋白は、ＮＡ４ ｃＤＮＡ配列をクローン
化したｐＷＨＡ９３のプロキモシン遺伝子（例１２にお
いて記述した）に結合させることにより創出した。他の
プラスミドも利用され得る。好適なプラスミドの一つ
は、ｐＷＨＡ９３である。プロキモシン−ＮＡ４遺伝子
縮合体であるｐＤＤＳ１及びｐＤＤＳ２の構築におい
て、約１．３ｋｂフラグメントを、酵素ＥｃｏＲＩ及び
ＨｉｎｄＩＩＩを用いて開裂させることにより、それぞ
れのｃＤＮＡクローンｐＳＭＡＣ及びｐＮＣＤから取り
除いた。プラスミドｐＷＨＡ９３を同様にしてＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて開裂させ、その様にして
産生した２つのフラグメントのうちの大きい方を、ｐＳ
ＭＡＣ及びｐＮＣＤ由来のＮＡ４ｃＤＮＡ配列を含有す
るそれぞれのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント
と結合させ、それぞれの組み替えプラスミドｐＤＤＳ１
とｐＤＤＳ２を産生した。ｐＤＤＳ１とｐＤＤＳ２の構
築を図２４Ａと２４Ｂに示す。ここでＭＨ１／ｐＤＤＳ
１及びＪＭ８３／ＰＤＰＳ２と記述した組み替えＤＮＡ
及びホスト微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｓｖｉ
ｌｌｅ，ＭＤに寄託され、それぞれＡＴＣＣＡｃｃｅｓ
ｓｉｏｎナンバー６７ ２４３及び と指定
された。これらの寄託は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ条約に準じ
て行った。
【０２４５】例 ２９ 不溶性状態からのＮＡ４蛋白の抽出及びモノクロナル抗
体ＰＴＮ７．２Ａ４／４との免疫反応性の実証 表現プラスミドｐＴＤＳ１，ｐＴＤＳ２，ｐＤＤＳ１，
及びｐＤＤＳ２の大腸菌産生物は、すべて大いに、又は
全体的に不溶性である。すべてのプラスミドは、Ｌａｅ
ｍｍｌｉサンプル緩衝液中で煮沸することにより可溶化
することが出来るし、また、ＮＡ４抗原のサブユニット
部分に高度に一致する所の１７，０００ダルトンのＴＡ
４抗原のサブユニットに対して産生させたマウスの抗血
清と反応するであろう。しかしながら、これらの条件下
では何れのプラスミドも、モノクロナル抗体Ｐｔｎ７．
２Ａ４／４とは反応しない。それゆえ、これらの大腸菌
で合成した蛋白を可溶化し再賦活して、モノクロナル抗
体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４と反応できる形で、またそれゆ
え動物においてＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ及びＥ．ｔｅｎｅ
ｌｌａに対して中和し保護する抗体反応を起し得る形
で、抗原を産生することが必要である。
【０２４６】細菌により産生されたＮＡ４縮合蛋白の抽
出及び再賦活化 最初に、牛プロキモシンを可溶化し再賦活して活性酵素
を産生するための既知方法によって、ＮＡ４縮合蛋白を
可溶化し再賦活させた（４７）。この方法により、Ｐｔ
ｎ７．２Ａ４／４免疫反応性を有する純粋な可溶性のＮ
Ａ４縮合蛋白を産生した。免疫反応性を回復するための
最適な条件を設定し、以下に記述する。上述のようにし
て、プラスミドｐＴＤＳ１、ｐＴＤＳ２、ｐＤＤＳ１、
及びｐＤＤＳ２を構築した。これらのプラスミドを用い
て、標準法により大腸菌ＳＧ９３６株を変換し、アンピ
シリン耐性のコロニーを精製し、培養に供した。それぞ
れの場合、新たにしまを付けた寒天平板培地から採取し
たアンピシリン耐性コロニーを用いて、Ｌ−ブロスとア
ンピシリンを１００マイクログラム／ｍｌ含む１００ｍ
ｌの液体培地に接種した。この培地を３０℃で振とうさ
せて培養し、１．０のＯＤ600 とした。ＩＰＴＧを２ｍ
Ｍに添加し、培地を３０℃で２−３時間以上培養した。
遠心分離を行って細胞を収集し、−７０℃で冷凍して貯
蔵した。それぞれＮＡ４表現プラスミドの一つを含有す
る大腸菌ＳＧ９３６株のペースト状の冷凍細胞を、それ
ぞれ４０ｍｌのｐＨ８の２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌリゾチームに懸
濁した。少時のインキュベーションの後、溶解した細胞
を音波振動によりさらに崩壊させた。
【０２４７】大腸菌において合成されたＮＡ４縮合蛋白
は、細胞溶解質に全く不溶性であることが判っているの
で、プラスミドをエンコードしたＮＡ４蛋白は、１０
０，０００ｘｇで１時間細胞溶解質を遠心分離し、その
後５％Ｔｒｉｔｉｎ Ｘ−１００洗浄剤（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液を用いて小球に
した細胞片を２５℃６０分洗浄剤抽出することにより精
製した。ＮＡ４縮合蛋白は不溶のまま残り、２５℃であ
った。ＮＡ４縮合蛋白は不溶のままであり、１００，０
００ｘｇで遠心分離して収集した。不溶性物質を１２ｍ
ｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）にけん濁
し、遠心分離により収集し、残存する洗浄剤を除去し
た。ＮＡ４縮合蛋白をｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液中に懸濁し、最終容量を７．７ｍｌとし
た。この懸濁液に５．８ｇの固体尿素を添加することに
より充分に可溶化し、最終濃度を容量１２ｍｌ中８Ｍと
し、その後室温で１６時間混合した。
【０２４８】得られた澄明な液を、それぞれｐＨ１１．
０に調節した１００容の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液に希釈し、最終容量を１２００ｍｌとした。この溶液
を完全に混合し、１５℃で１０分放置した。この溶液の
ｐＨを、０．５Ｎ ＨＣｌを５分間にわたって添加する
ことにより滴定し、ｐＨ８．５とした。得られた溶液
は、検定又は貯蔵する前に室温で１時間以上放置した。
試料は、モノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４との免
疫反応性について検定した。この試料は、以下に記述す
るように、ｐＣＯＣ２０由来の際賦活した抗原に匹敵す
る活性を有していた。
【０２４９】再賦活化サンプルのイムノアッセイ 再賦活化したｐＴＤＳ１，ｐＴＤＳ２，ｐＤＤＳ１，及
びｐＤＤＳ２蛋白とモノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４
／４との免疫反応性を測定した。マイクロ力価プレート
（Ｉｍｍｕｌｏｎ Ｉ ｍｉｃｒｏ ＥＬＩＳＡ ｆｌ
ａｔ−ｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ，Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａ
ｌｅｘａｎｄｒｉａ ＶＡ）のそれぞれのウェルを、１
０ｍＭＮａ2 ＨＰＯ4 ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０
１％（ｗ／ｖ）Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１２，ｐ
Ｈ８．０に希釈した１００マイクロリッターの抗原で覆
った。再賦活した試料に対しては、１：１０〜１：１０
００希釈の抗原についてアッセイを行った。プレート
を、抗原溶液で室温で１時間、その後４℃で一夜インキ
ュベートすることにより抗原で被覆した。ウェルを空に
した後に、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｐ
ＢＳＴ）を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩液で３
回洗浄した。プレートを３％（ｗ／ｖ）ゼラチン、ｐＨ
７．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ 3 で室温３０分間
処理し、残余の蛋白結合部位をブロックした。
【０２５０】その後プレートを、１００マイクロリッタ
ーのモノクロナル抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４（３％〔ｗ
／ｖ〕牛血清アルブミン中３０マイクログラム／ｍ
ｌ）、ｐＨ７．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3 で、
室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回ウェ
ルを洗浄した後、結合したモノクロナル抗体Ｐｔｎ７．
２Ａ４／４を、マウスＩｇＧに対するＶｅｃｔａｓｔａ
ｔｉｎ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃ
Ａ）を用いて定量した。プレートのそれぞれのウェル
を、１００マイクロリッターのビオチニル化した馬抗マ
ウスＩｇＧ（４０マイクロリッターのビオチニル化抗マ
ウス抗体、１０ｍｌ ＰＢＳＴ中８０マイクロリッター
の正常馬血清）で充填し、室温で３０分間インキュベー
トした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、
プレートを１００マイクロリッター／ウェルのＶｅｃｔ
ａｓｔａｉｎ ＡＢＣ Ｒｅａｇｅｎｔを用い室温で３
０分インキュベートした（プレートに添加する前に３０
分間、予めインキュベートしたＰＢＳＴ中８０マイクロ
リッターのビオチニル化された西洋ワサビのパーオキシ
ダーゼＲｅａｇｅｎｔ Ｂと混合した８０マイクロリッ
ターのＡｖｉｄｉｎ ＤＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ）。
【０２５１】ＰＢＳＴで５回洗浄した後に、結合した西
洋ワサビのパーオキシダーゼについて、１００マイクロ
リッター基質／ウェル（５０ｍＭクエン酸塩／リン酸塩
緩衝液ｐＨ５．３，０．０１５％（ｖ／ｖ）過酸化水素
中０．１ｍｇ／ｍｌの２，２′−アジノ−ジ−（３−エ
チル−ベンズチアゾリン）６−スルホン酸）を添加する
ことにより測定した。プレートを室温で暗所でインキュ
ベートした。４／４ｎｍの吸光度を、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ
Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ自動プレートｒｅａｄｅｒ（Ｆｌ
ｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｃ Ｃ
ｌｅａｎ，ＶＡ）中で基質添加を行って１０−６０分後
に測定した。ＮＡ４縮合蛋白の免疫反応性は、ＴＡ４縮
合蛋白ｐＣＯＣ２０に匹敵することが判った。
【０２５２】例 ３０ ひよこにおけるＥ．ＴＥＮＥＬＬＡに対するスポロゾイ
ト中和血清反応を誘起するための精製 Ｅ．ＮＥＣＡＡ
ＴＲＩＸ ＮＡ４蛋白質の使用 これらの実験に使用した抗原は、例２１に述べたように
してスポロシストから作った。ひよこに使用する前に、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにモノクローナル抗体Ｐｔｎ
７．２Ａ４／４による免疫反応性によって、この蛋白質
の同定と純度を確認した。０．１５Ｍリン酸緩衝塩化ナ
トリウム水溶液に希釈した精製抗原１、約５％ Ａｌｒ
ａｃｅｌ Ａ、９４％ Ｄｒａｋｅｏｌ ６−ＶＲ、１
％ Ｔｗｅｅｎ ２０から成るキャリア３部に乳化させ
最終量１ｍｌとした。ひよこに、頸部へ１回量１５マイ
クログラム抗原／０．２ｃｃを投与した。１４日間隔で
更に２回、同じ投与経路で抗原を投与した。蛋白質各投
与前３日と最終投与後１１日目に、血清試料収集のため
ひよこから採血した。血清を熱により不活性化させ、例
２で述べたスホロゾイト微量中和定量法にて別々に調べ
た。下の表１４に述べてある結果によれば、ワクチン接
種せずキャリアだけを投与したひよこは、Ｅ．ｔｅｎｅ
ｌｌａスポロゾイトに対して明白な中和抗血清力価を示
さないが、この抗原の３回投与を受けたひよこは中和抗
血清を示した。
【０２５３】
【表１５】
【０２５４】例 ３１ Ｅ．ＴＥＮＥＬＬＡ攻撃に対する防御反応を誘起するた
めのＥ．ＮＥＣＡＴＲＩＸ ＮＡ４蛋白質の使用。 ４週
令白色レグホンひよこに、頸部筋肉へ筋肉内径路によ
り、免疫親和力を利用して精製したＮＡ４蛋白質１５マ
イクログラム／０．２ｃｃの一回量を１４日間隔で３回
投与した。この抗原はＰＢＳ中に調製され、前述のキャ
リア３部に乳化させて６０マイクログラム／ｍｌで最終
量とした。第２グループのひよこにはキャリア基質のみ
を投与した。第３グループはワクチン接種しなかった。
第４グループの、ＮＡ４ワクチン接種したひよこと同じ
ケージ中で飼った接種していないひよこは、前哨として
役立った。ひよこをＥ．ｔｅｎｅｌｌａで汚染させた一
群の中に無作為に入れた。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａに触れさ
せてから１０日後に、ひよこを１×１０ 4 Ｅ．ｔｅｎｅ
ｌｌａオーシスト経口投与量で攻撃した。２４時間後再
び、ひよこに３×１０4 オーシストを経口的に与えた。
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの最終経口量を与えてから５日後
に、すべてのひよこを殺し、病巣を評価した。下の表１
５にその結果を示す。
【０２５５】
【表１６】 当該分野熟知の人には、この結果は、ＮＡ４蛋白質を投
与されたひよこが、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの苛酷な攻撃に
よる疾患に対して、ある程度防御されたことを示唆して
いる。ＮＡ４蛋白質を投与されたグループの病巣評価は
各々の対照標準グループより低かった。
【０２５６】例 ３２ 組換えＥＩＭＥＲＩＡ ＮＥＣＡＴＲＩＸ（ＮＡ４）抗
原にさらされたひよこの反応およびＥ．ＴＥＮＥＬＬＡ
との交差反応性Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘとＥ．ｔｅｎｅｌｌ
ａに対する、ＮＡ４ワクチン接種雛の特異反応。 Ｅ．
ｎｅｃａｔｒｉｘとＥ．ｔｅｎｅｌｌａのスポロシスト
から誘導した膜蛋白質に対するＮＡ４ワクチン接種ひよ
この免疫反応性を証明し、又それらを同じ寄生原虫に対
するＴＡ４ワクチン接種ひよこの反応と比較する実験を
行なった。この実験では、１０羽のひよこをＰＴＤＳ１
（ベータガラクトシダーゼ／ＮＡ４融合生成物、例２７
参照）のワクチン接種を行い、１０羽には、ＰＤＤＳ１
（プロキモシン／ＮＡ４融合生成物、例２８参照）のワ
クチン接種した。これらを１０羽のｐＣＯＣ２０（プロ
キモシン／ＴＡ４融合生成物、例１２参照）のワクチン
接種したひよこと比較した。これらの蛋白質の免疫反応
性は、実験に参加する前に、モノクローナル抗体Ｐｔｎ
７．２Ａ４／４を用いて定量し確認した。
【０２５７】抗原は、５％ Ａｒｌａｃｅｌ−Ａ、９４
％ Ｄｒａｋｅｏｌ ６−Ｖｒ、１％ Ｔｗｅｅｎ ８
０から成るキャリアを、免疫強化因子としてＬＰＳ４マ
イクログラムを含む抗原５０マイクログラムに対して
３：１の比にして調製した。この処方は、１回皮下投与
量を０．５−ｍｌとして後頭部へ与えた。ワクチン接種
方式は、１０日間隔で３回投与し、各ワクチン接種時に
ひよこから採血し、血清を集め、凍結保存した。実験の
対照群は、ｐＣＯＣ２０ＴＡ４抗原／キャリア／ＬＰ
Ｓ；キャリア／ＬＰＳ；ワクチン接種しない対照群から
成り立っていた。ワクチン接種群と対照群からの血清に
対して、例１３で述べたようにウェスタンブロットによ
ってＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘとＥ．ｔｅｎｅｌｌａのスポ
ロシスト蛋白質に対する免疫反応性を定量した。下の表
１６から分かるように、ひよこへのｐＤＤＳ１、ｐＴＤ
Ｓ１、ｐＣＯＣ２０抗原のワクチン接種から均一と不均
一の寄生種に対する比血清反応性がわかる。
【０２５８】
【表１７】
【０２５９】ＮＡ４組換え蛋白質のワクチン接種したひ
よこにおける防御反応性 上記に概略したワクチン接種
方式を施行してから１０日後、ひよこにＥ．ｎｅｃａｔ
ｒｉｘまたはＥ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストを接種し、
それら寄生虫に特徴的な病巣について調べた。種々の処
置群のひよこに、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの胞子化オーシス
ト５，０００個とＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘのオーシスト６
０，０００個を接種した。接種物は、予め、望ましい病
巣重症度になるように調節し、例１８の如く、攻撃５日
後に病巣を評価した。次の表１７に示してある結果は、
対照群と比較して、ワクチン接種群における病巣重症度
の減少を示している。
【０２６０】
【表１８】
【０２６１】組換えＮＡ４抗原をワクチン接種したひよ
こにおけるスポロゾイト中和血清反応性。ならびにｐＴ
ＤＳ１の、ワクチン接種ひよこの血清へ寄生虫中和能を
付与するｐＤＤＳ１とｐＴＤＳ１の能力を判定するため
にスポロゾイト中和定量法（ＳＮＡ）を利用した。例１
８において確立させたＳＮＡプロトコールを用いて、前
述したワクチン接種群と対照群の血清について、スポロ
ゾイド中和能を定量した。下記の表１８に示すように、
ｐＴＤＳ１とｐＤＤＳ１のワクチン接種したひよこか
ら、三回目のワクチン接種後に集めた血清は、一次ｍｅ
ｒｏｎｔｓの発生阻止に有効であった。
【０２６２】
【表１９】
【０２６３】例 ３３ ＥＩＭＥＲＩＡ ＭＡＸＩＭＡのオーシスト、スポロゾ
イト、メロゾイトの作成。コクシジュウム。 Ｅｉｍｅ
ｒｉａ ｍａｘｉｍａの精製野外分野体を、最初はアウ
バーン大のアレンイガー博士から購入した。この分離体
の各々の純度はオーシストの特徴、感染腸組織の組織学
を使用して確かめられた。オーシストの大きさ・形の指
数はＥ．ｍａｘｉｍａの範囲内にあった。ジョンソンと
ライド法によって病巣を評価した。感染ひよこの病巣は
この分離体に典型的なものであった。病理学は腸中間部
に限られ、粘液様滲出物と壊死性腸炎があった。感染後
４日目の組織検査から、腸中間部上皮に小さな３代・４
代目のスキゾントが見い出された。重度感染中（１，０
００，０００オーシストまで）、Ｅ．ｍａｘｉｍａによ
って死にはいたらなかった。分離体各々の純度を確保す
るため、オーシストの一回クローニングを定期的に行な
った。
【０２６４】オーシストの増殖。 一般的には、２から
６週令ＳＰＦ白色レグホンひよこに、分離体各々の純培
養液を通過させた。外部からのコクシジウム感染を避け
るため、ひよこを生後１日からプレキシガラス製隔離室
で飼育した。感染から８日後に糞便中からオーシストを
採集した。胞子化したオーシストを、一般的には、２％
ｗ／ｖ Ｋ2 Ｃｒ2 Ｏ7 中２４℃で保存した。
【０２６５】メロゾイト調整。 ４週令ブロイラーひよ
こ５羽にＥ．ｍａｘｉｍａの胞子化オーシスト１×１０
6 個を経口的に接種した。接種してから４日後に、ひよ
こを殺した。腸中間部を取り出し、ＰＢＳを急激に流
し、切開した。上皮層をガラススライドで剥離し、１％
ヒアルロニダーゼＰＢＳの入いっているビーカーに入れ
た。室温にて１／２時間培養後、その消化物質を粗目の
布に通した。懸濁液を５０ｍｌ管に入れ、１０００ＲＰ
Ｍで１０分間遠心分離した。上澄液を取っておき、沈澱
物を２度洗浄した。上澄液を合わせ、３０００ＲＰＭで
１０分間遠心分離した。沈澱物を再懸濁し、ガラスウー
ルカラムに通した。この懸濁液を遠心分離による収集を
する前に２度洗浄した（１０００ＲＰＭ、４分間）。
【０２６６】Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅ．Ｍａｘｉｍａメロゾ
イト中和定量 Ｅ．ｍａｘｉｍａメロゾイト中和定量のため、メロゾイ
トを数え、処置群１グループ当り、ひよこ１羽当り１×
１０7 メロゾイトになるよう希釈液を調整した。各処置
群は３羽の１週令ブロイラーひよこから構成されてい
る。各処置群用のプールメロゾイトは、遠沈させてか
ら、熱で不活性にした試験上澄液または血清（５６℃、
３０分間）３ｍｌに再懸濁させた。メロゾイトを接種前
に３７℃にて３０分間培養した。接種のため十二指腸を
外科的に露出させ、メロゾイトを含む試験上澄液又は血
清１ｍｌを内腔へ注入した。切開部を閉じ、ひよこを処
置に従って隔離ケージに隔離した。攻撃後１日から４日
間、ロング等（１９７６）（４２）により記述された方
法を用いて、オーシスト産生数を数えた。
【０２６７】例 ３４ Ｅ．ＭＡＸＩＭＡに対するハイブリドーマの産生、同
定、特徴。 単一クローン性抗体。 ヴァンドイセン、ウエトストン
法（７７）を使用して開発したハイブリドーマから単一
クローン性抗体を誘導した。簡単に述べると、Ｂａｌｂ
／Ｃ ＢｙＪマウスを、１０6 −１０7 無欠Ｅ．ｍａｘ
ｉｍａメロゾイテで繰返し免疫にした。無欠メロゾイテ
の最終静脈内注射から３日後に、無差別に選んだマウス
を殺し、脾臓を摘出した。脾細胞を器官の線維組織から
分離し、洗浄してからネズミの形質細胞腫細胞系（ｓｐ
２／ＯＭ）と融合させた。
【０２６８】Ｅ．Ｍａｘｉｍａメロゾイト−特異性ひよ
こ抗血清 ＳＰＦ白色レグホン型ひよこにおいて、Ｅｉｍｅｒｉａ
ｍａｘｉｍａメロゾイトに対して免疫性のひよこ血清
を調整した。簡単に述べると、１〜２週令のひよこに、
１４日毎に、凍結／溶融したメロゾイトを四回注射し
た。各々のひよこに、一回目の注射では４×１０-5メロ
ゾイトを、次に１．４×１０7 メロゾイトを含む注射液
を更に４−５回与えた。最終接種後５日目に心蔵穿刺に
よって血液を得た。血清を集め−２０℃で保存した。
【０２６９】間接蛍光抗体スクリーニング。 Ｅ．ｍａ
ｘｉｍａのメロゾイド（約１×１０6／容器）を用いて
ＩＦＡスライドを作製した。スライドを数時間から一夜
風乾し、次に１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１０マイ
クロリットルを各々の容器に加えた。ＢＳＡ添加から５
分後に、試験上澄液２０マイクロリットルを加えた。上
澄液を３７℃、２０分間培養し、次に、０．０５％ツイ
ーン−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ツイーン）で三回洗
浄した。蛍光結合ウサギ抗体（ＰＢＳで１：４０に希
釈）を試料に加え、３７℃にて２０分間培養した。その
結合体をＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄したのち、スライ
ド液とカバーグラスを載せた。
【０２７０】結果。 Ｅ．ｍａｘｉｍａメロゾイトに対
して開発された多くのハイブリドーマのうち、８種がこ
の寄生虫のメロゾイト段階に対する中和抗体を産生する
ことが判明した。研究したハイブリドーマすべては、膜
結合抗原を認識する抗体を産生した。ハイブリドーマ細
胞系ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ ８９４６が産生し、Ｐｍ
ｘ４７．８Ｂ５と表わされる単一クローン性抗体はＥ．
ｍａｘｉｍａオーシスト産生を減少させる傾向を持つた
め選択された。
【０２７１】例 ３５ 中和モノクローナル抗体ＰＭＸ４７．８Ｂ５及びＥ．Ｍ
ＡＸＩＭＡ分裂小体特異性ニワトリ抗血清の両方により
認識されたＥ．ＭＡＸＩＭＡ抗原の同定 ニトロセルロース紙への抗原の電気泳動移動： 分裂小体
膜タンパク質（例３６の記載に従って可溶化した洗剤）
を一次元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドス
ラブゲル（３５）を用いて還元或は非還元条件で分離
し、電気泳動によりニトロセルロース紙への移動を行っ
た（５）。電気泳動ブロットはＳｈａｒｍａらの方法
（６４）で作製したが、例外として血清、モノクローナ
ル抗体及び特定の抱合体（ヤギ抗ニワトリＩｇＧと接合
したペルオキシダーゼ（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄとＰｅｒ
ｒｙによる）、ウサギ抗マウスＩｇＧと接合したペルオ
キシダーゼ（Ｃａｐｐｅｌによる））を用いた。ブロッ
トはこれらを４−クロロ−１−ナフトール（シグマ社；
６６０μｇ／ｍｌ）及びＨ2 Ｏ2 （０．１７％）と反応
させて展開した。
【０２７２】Ｐｍｘ４７．８Ｂ５ モノクローナル抗体
によるＥ．ｍａｘｉｍａ抗原の免疫ブロットの結果。
いくつかのＥ．ｍａｘｉｍａ分裂小体タンパク質と反応
させて調製したモノクローナル抗体は、１つはみかけの
分子量が５５，０００ドルトンであり、もう１つはみか
けの分子量が４２，０００ドルトンである（還元或は非
還元の条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて）。しかし、
Ｐｍｘ４７．８Ｂ５がいくつかのアイメリア抗原に共通
のエピトープを認識すると思われている。
【０２７３】例 ３６ アイメリアＭＡＸＩＭＡ８Ｂ５抗原の精製及び特性 モノクローナル抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５の精製。 アフィ
ニティークロマトグラフィー用の固相にＰｍｘ４７．８
Ｂ５モノクローナル抗体を結合させる前にＨＢ１０１無
血清培地中にみられる汚染成分及びタンパク質（すなわ
ち、ＢＳＡ、トランスフェリン、インスリン、成長因子
等）を取り除くための精製を行った。この精製機構の第
一段階は製造者の示す使用方法に基づき上澄に含まれる
Ｐｍｘ４７．８Ｂ５から過剰のＢＳＡを取り除くために
ＤＥＡＥ−Ａｆｆｉゲルブルーカラム（ＢＩＯ−ＲＡ
Ｄ）を通すことであった。この後で次に示す陰イオン或
は陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行っ
た。部分的に精製された抗体をｐＨ８．０の２０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液でＤＥＡＥ−セファデックスカラ
ムに乗せ、同じ緩衝液中で塩化ナトリウム濃度を０〜５
００ｍＭにグラジェントさせて流出させた。陽イオン交
換方法は、Ｃａｒｌｓｓｏｎらの方法（６）に基づいた
が、ＳＰ−セファデックスの代わりにリン酸セルロース
樹脂（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。流出分画中の抗体の
位置はＥＬＩＳＡにより測定し、純度はＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより決定した。
【０２７４】Ｐｍｘ４７．８Ｂ５アフィニティー樹脂の
作製。精製後、Ｐｍｘ４７．８Ｂ５モノクローナル抗体
を製造者の示す方法に基づき、ＣＮＢｒ活性化セファロ
ース４Ｂ（ファルマシア社）或はベックマンＵＬＴＲＡ
ＦＦＩＮＴＴＹTM−ＥＰカラム（ベックマン社）と連鎖
させた。
【０２７５】分子量５５，０００ドルトンの８Ｂ５抗原
の精製。 Ｅ．ＭＡＸＩＭＡ分裂小体を２０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１０
０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭＴＬＣＫ、０．１ｍＭ
ＴＰＣＫ及び１０ＫＩＵ／ｍｌアプロチニンを含む溶液
中に再懸濁させ、最終的な濃度を１０8 分裂小体／ｍｌ
とした。１時間インキュベート後、２８，０００ｇで回
転（１０分４℃）させると不溶性物質がペレット状とな
った。
【０２７６】サンプルをＡＧ５０１−Ｘ８混合ベッド樹
脂を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して広範囲の透析を
行った。分子量５５，０００ドルトンの８Ｂ５抗原をＰ
ｍｘ４７．８Ｂ５モノクローナル抗体を用いて上澄から
免疫吸着させた。非特異結合タンパク質はｐＨ７．５
（高）或はｐＨ４．０（低）の洗浄により取り除いた。
結合分画は５００ｍＭ水酸化ナトリウム１ｍｌ中にグリ
シン（ｐＨ３．０）を０から１Ｍまで増加させて１ｍｌ
ずつの分画として流出させた。精製されたポリペプチド
は、ミクロタイタープレートＥＬＩＳＡにより、Ｐｍｘ
４７．８Ｂ５モノクローナル抗体との反応性があること
を示した。
【０２７７】例 ３７ Ｅ．ＣＯＬＩ中のＥ．ＭＡＸＩＭＡ λｇｔｌｌゲノム
表記ライブラリーの構成 本研究に用いられた組換え体ＤＮＡライブラリーは脱リ
ン酸化されたλｇｔｌｌアーム中に連結された（ベクタ
ークローニングシステム）Ｅ．ｍａｘｉｍａの完全なＥ
ｃｏＲＩ消化によって作られた。アームは０〜７ｋｂｐ
の長さの部位に挿入できる。Ｅ．ｍａｘｉｍａ ＤＮＡ
は次の手法を用いて３．６×１０7 の胞子形成されたオ
オシストから精製されたものであった。胞子形成された
オオシストを洗浄し、スポロシストは前に述べた方法で
分離した。分離したスポロシストを０．１Ｍトリス塩酸
（ｐＨ８．５）、０．２Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
ＥＤＴＡを用いて２回洗浄した。スポロシストを０．１
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．５）、０．２Ｍ塩化ナトリウ
ム、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１５０μｇ／ｍ
ｌプロティナーゼＫを含む溶液中で６５℃３０分インキ
ュベートして溶解した。
【０２７８】室温まで冷却後、ＤＮＡを同体積の液化フ
ェノールを用いて１時間かけて徐々に抽出した。３００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離後、水相を取り除き、境界
面及びフェノールを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）、１
ｍＭ ＥＤＴＡを用いて再抽出した。水相を混合しフェ
ノールで１回及びクロロホルム：イソアミルアルコール
（２４：１）で２回抽出した。ＤＮＡをエタノール分画
法により分離した。ＤＮＡペレットを１０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡに再溶解し、３７℃で
１時間０．１５ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ遊離ＲＮアーゼ
Ａを用いて処理した。ＲＮアーゼの消化後、サンプルを
フェノールで１回、クロロホルム・イソアミルアルコー
ル混液で１回それぞれ抽出してからエタノールで沈澱さ
せた。
【０２７９】ＥｃｏＲＩ−切断Ｅ．ｍａｘｉｍａ ＤＮ
Ａ（０．４μｇ）をＴ４ＤＮＡ連結酵素（ＩＢＩ、０．
５ユニット）を５μｌの総体積に含むインターナショナ
ルバイオテクノロジー社（ＩＢＩ）製のＴ４ＤＮＡ連結
緩衝液中の脱リン酸化λｇｔｌｌアーム（２．０μｇ）
を用いて１２℃で１５時間インキュベートした。この反
応混合物４μｌをベクタークローニングシステム（ギガ
パックＧＰ１０）から使用方法のとおりに凍結溶解及び
音波パッケージング抽出法を用いてランダプラーク形成
単位（ｐｆｕ）中に組み合わせた。反応をＣＨＣｌ3 の
添加により停止させ、ＳＭ溶液で希釈した。ＳＭの組成
は ０．５８％塩化ナトリウム≡（０．１Ｍ） ０．２％硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ ５０ｍＭトリス７．５ ０．０１％ゼラチン
【０２８０】ライブラリー中の組換えファージの数を査
定するため組み合わせたＤＮＡの一部をＥ．Ｃｏｌｉ菌
株Ｙ１０９０．ｒ（プロメガ、バイオテク：Ｅ．Ｃｏｌ
ｉＬａｃ Ｕ１６９ ΔＬｏｎ ａｒａ Ｄ１３９ ｓ
ｔｒＡ ｓｕｐＦ〔ｔｒｐＣ２２：：Ｔｎ１０〕ｈｓｄ
Ｒ（ＰＭＣ９−−））の後期ログ培養２００μｌに吸
着させた。これらの培養物は５ｍＭ ＩＰＴＧを含むＭ
ＺＣＹＭ上層寒天（４４）の中のＸ−ガルアンピシリン
（１００μｇ／ｍｌ）のプレート上（５５）にうえつけ
た。組換え体はこの方法では無色のプラークを形成し一
方非組換え体は青いプラークを形成した。このライブラ
リーはこの方法では９５％以上の組換えを示し、１０°
ｐｆｕを含んでいることを示した（これは非拡大ライブ
ラリーである）。
【０２８１】Ｐｍｘ４７．８Ｂ５に反応性を持つ抗原を
表わすクローンのライブラリーのスクリーニング。 ラ
イブラリーはＮＺＹアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）
上層寒天（４４）中の５×１０4 ｐｆｕ／１６０ｍｍ
Ｌ−アンピシリン寒天プレートにうえつけた。プレート
を上むきにして４２℃で３．５時間インキュベートした
後、１０ｍＭのＩＰＴＧで飽和して空気乾燥させたＢＡ
８５ニトロセルロース濾紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
Ｓｃｈｎｅｌｌ）を用いて過剰に乗せた。プレートを
次にさらに４時間３８℃でインキュベートした。濾紙を
取り除きＴＢＳＴ（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１５０
ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）
溶液を用いて洗浄した。濾紙をＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏ
ｃｋｉｎｇ緩衝液（３％ゼラチン、１０ｍＭトリス
０．９％塩化ナトリウム、０．０５％アジ化物）中で１
５〜３０分間インキュベートした。ブロッキング緩衝液
を除き、濾紙を最初（一次）の抗体として１０-4パーツ
の８Ｂ５腹水液を含む最初の抗体緩衝液（３％ＢＳＡ、
１０ｍＭトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．０５％
アジ化物）中に置いた。濾紙をこの溶液中で２２℃で４
時間或は４℃で１晩インキュベートした。それから濾紙
を二次抗体としてビオチン化したウマ抗マウス、アビジ
ン共役ペルオキシダーゼ及び発色剤として４−クロロ−
１−ナフトールを用いて（ベクタステインキット試薬及
び標準手法）展開した。１０個のプレートから作成され
た５×１０5 ｐｆｕに等しい濾紙は、以上の方法でスク
リーニングされＰｍｘ４７．８Ｂ５に特異的に反応する
２３ｐｆｕが同定された。
【０２８２】例 ３８ Ｐｍｘ４７．８Ｂ５免疫活性物質を生成するλｇｔｌｌ
Ｅ．ＭＡＸＩＭＡクローンの特性 Ｐｍｘ４７．８Ｂ５と反応する２３個のクローンはそれ
ぞれプラーク精製であった。クローンを次に培養して、
ＤＮＡをＨｅｌｍｓら（２３）の方法によってこれらの
クローンから精製した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、
それぞれのクローンに挿入したＥｃｏＲ１の大きさをア
ガロース或はアクリルアミドゲル（表ＸＩＸ １行目）
による電気泳動によって同定した。それに加えて、それ
ぞれのλｇｔｌｌＥ．ｍａｘｉｍａクローンの溶原を
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｙ１０８８（Ｙ１０９０に対する溶
原、Ｙ１０８８はｈｆｌＡ及びＨｓｄ+ であることは例
外）を用いて作成した。それぞれの溶原の誘導培養物が
成長してから、凍結溶解により細胞抽出を行った。これ
らの抽出は重複還元ＳＤＳアクリルアミドゲル（１０％
或は５％のアクリルアミド）による電気泳動により分画
された。
【０２８３】次に、これらは、ファージ表現ベクトルλ
ｇｔｌｌ（表ＸＩＸ、第２段と第３段目）でコードされ
たβガラクトシダーゼを含むタンパク質融合として組換
え抗原が表現されているか否かを調べるために、最初の
抗体として８Ｂ５腹水液或はウサギ抗β−ガラクトシダ
ーゼを使用するウエスタンブロット法により分析した。
これらうち、２つのＰｍｘ４７．８Ｂ５クローンは４５
ｋｄ−２２０ｋｄのタンパク質と反応した。ブロットの
重複セットのための最初の抗体として使用されたウサギ
抗β−ガラクトシダーゼは、Ｐｍｘ４７．８Ｂ５により
同定されたものと同じタンパク質バンド或は１１６ｋｄ
タンパク質、β−ガラクトシダーゼのＭ．Ｗ．のいずれ
かと反応した。前者の反応パターンによれば、問題のク
ローンがハイブリッド或は融合タンパク質をコードする
ことを示している（Ｅ．ｍａｘｉｍａタンパク質はＣ−
末端に近いところでβ−ガラクトシダーゼと融合し
た）。後者の反応パターンによれば、分析されたクロー
ンがλｇｔｌｌのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と融合し
ないＥ．ｍａｘｉｍａタンパク質をコードすることを示
している。このようにウエスタンブロット分析により２
３個のクローンが融合及び非融合のカテゴリーにグルー
プ分けされる。
【０２８４】上述のウエスタンブロット分析によるデー
タとそれぞれのクローンに挿入されたＥｃｏＲＩ Ｅ．
ｍａｘｉｍａの大きさについての知見とを組み合わせる
ことで２３個のクローン間の同胞グループを同定するこ
とが可能になった。この分析結果より、もとの２３個の
クローン中１３個の中から独立（非同胞）クローンを同
定した。これらの１３のうち７個がβ−ガラクトシダー
ゼ−Ｅ．ｍａｘｉｍａ融合タンパク質にコードされる。
この中には、クローン５，１１及び１３が含まれている
（表ＸＩＸ ４段目）。一方、他の６個はクローン４及
び１８が含まれており非融合タンパク質にコードされ
る。ｐ１４−９と呼ばれる付加的サブクローンも、Ｐｍ
ｘ４７．４Ｂ５に免疫反応性を持つβ−ガラクトシダー
ゼ−Ｅ．ｍａｘｉｍａ融合タンパク質を生成するものと
して同定された。このサブクローンはサブクローンｐＢ
−８と同様のＥ．ｍａｘｉｍａ構造を持つ独立分離であ
ると考えられる。
【０２８５】クローン５，１１及び１３は融合タンパク
質をコードするクローンの例である。クローン５，１１
及び１３の溶原はそれぞれ約１２０，１６０及び１８０
ｋｄのＰｍｘ４７．８Ｂ５−免疫反応性を持つタンパク
質を表現している。Ｅ．ｍａｘｉｍａのＰｍｘ４７．８
Ｂ５−標的抗原を表わすβ−ガラクトシダーゼとも反応
するタンパク質はλｇｔｌｌのβ−ガラクトシダーゼに
より融合される。λｇｔｌｌクローン５，１１及び１３
（それぞれ約０．２４，０．８及び３．８ｋｂ）から挿
入されるＥｃｏＲＩは、Ｅ．Ｃｏｌｉからβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を挿入されたｐＢＲ３２２から誘導され
たプラスミドＰＤＫ２中にサブクローンされた。サブク
ローンｐ５−３、ｐ１１−２及びｐ１３−８（Ｅ．Ｃｏ
ｌｉを宿主とするＤ１２１０）はＰｍｘ４７．８Ｂ５及
びウサギ抗−β−ガラクトシダーゼの両方に免疫反応性
を持つタンパク質１２０，１６０及び１８０ｋｄをそれ
ぞれ表現していた。
【０２８６】サブクローンＤ１２１０／ｐ５−３、Ｄ１
２１０／ｐ１１−２及びＤ１２１０／ｐ１３−８からの
ミニスクリーンＤＮＡはＥ．Ｃｏｌｉを宿主とするＭＨ
Ｉ（Ｈｓｄ Ｒ- Ｍ+ ）に形質転換され、次いでラクト
ースプロモーター及びオペレーターの制御下で組換え体
抗原の表記を特に調製するリプレッサー分子をコードす
るのを助けるプラスミドボルネＬ．ａｃｉ 0 を含むＬｏ
ｎ- 及びＬｏｎ+ 宿主へと形質転換された。遺伝子の表
現はＩＰＴＧの添加によりこれらの培養物中に誘導され
た。またそれぞれの宿主により生成された組換え体抗原
のレベルは７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動
による調製及び分画されたセル抽出物によって決定され
た。
【０２８７】対照的に、λｇｔｌｌ−ｍａｘｉｍａクロ
ーン１８の溶原はβ−ガラクトシダーゼ抗体とは反応し
ない約１００ｋｄのＰｍｘ４７．８Ｂ５との反応性を持
つタンパク質を表現していた。このように、クローン１
８はλｇｔｌｌのβ−ガラクトシダーゼタンパク質と融
合しないＰｍｘ４７．８Ｂ５に反応性を持つタンパク質
をコードする。クローン１８のＤＮＡを精製し、Ｅｃｏ
ＲＩで消化しプラスミドベクトルｐＵＣ１８中にサブク
ローンさせた。Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株ＪＭ８３（ａｒａ（ａ
ｍ）--Δ--（ｌａｃ ｐｒｏ）ｓｔｒＡ ｔｈｉ（−８
０ｄ ｌａｃｉ 0 ΔＺＭ１５））の白色コロニー形成の
質転換細胞をＸ−ガル−アンピシリンプレートから取り
出し、ミニスクリーンＤＮＡを１２のこのような候補か
ら調製した。ミニスクリーンＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化
し、１％アガロースゲル上の電気泳動により分画した。
１ｍｌの培養物をλｇｔｌｌクローン１８中に存在する
ＥｃｏＲＩ−挿入（３．６ｋｂ）量と同量を含むこれら
のサブクローンから生育させた。これらの培養物の細胞
溶解質はＰｍｘ４７．８Ｂ５を用いたウエスタンブロッ
ト法で分析した。
【０２８８】分析した培養物の約半分はおよそ１００ｋ
ｄのＰｍｘ４７．４Ｂ５−反応性を持つタンパク質であ
り残りはそうではなかった。この結果は、クローン１８
中に挿入されたＥｃｏＲＩによりコードされたＥ．ｍａ
ｘｉｍａタンパク質の表現はｐｕＣ１８プラスミド内へ
の挿入の定位に依存していることを示していた。おそら
くＥ．ｍａｘｉｍａＤＮＡは翻訳開始の信号を含んでい
るが抗原の符号づけの続発の転写はλｇｔｌｌ−β−ガ
ラクトシダーゼプロモーターによる読み取り転写に依存
している。サブクローンｐ１８−３９（Ｐｍｘ４７．８
Ｂ５反応性を持つタンパク質）のミニスクリーンＤＮＡ
はＪＭ８３及びＳＧ９３６（テキスト中の他の場所の遺
伝子型を見よ）に形質転換された。組換え体抗原の表現
レベルはＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用
いた電気泳動による分画細胞抽出により測定した。この
条件の下での、表現レベルは総細胞タンパク質の１％以
下であった。
【０２８９】λｇｔｌｌＥ．ｍａｘｉｍａクローン４を
クローン１８と平行して分析を行った。この結果は検査
されたクローン４のサブクローン１８個すべてがＰｍｘ
４７．８Ｂ５−反応性を持つタンパク質（この場合は約
５０ｋｄ）を表現したという点で異っていた。サブクロ
ーンの制限マッピングによればＥｃｏＲＩ挿入の可能な
２つの定位は検査した１８の中に示されていることを示
していた。これらの結果はλｇｔｌｌクローン４中でク
ローンされたＥｃｏＲＩ−Ｅ．ｍａｘｉｍａＤＮＡは翻
訳及び転写開始の信号を備えていて、この信号はＥ．ｃ
ｏｌｉを宿主とするＪＭ８３中でも確認されること（す
なわち表現が定位に依存していないこと）を示してい
る。
【０２９０】例 ３９ サブクローンＰ５−３、Ｐ１１−２、Ｐ１３−８からの
ベーターガラクトシダーゼ−Ｅ、ＭＡＸＩＭＡ融合蛋白
質の精製 Ｐ５−３、Ｐ１１−２、Ｐ１３−８と指定されるλｇｔ
ｌｌ−Ｅ．ｍａｘｉｍａクローン５，１１，１３のプラ
スミドＰＤＫ２中のサブクローンは、Ｐｍｘ４７．８Ｂ
５及びベーターガラクトシダーゼに対するウサギの抗体
により免疫反応を起こすベータガラクトシダーゼ−Ｅ．
ｍａｘｉｍａ融合蛋白質をコード化している。この融合
蛋白質を精製するために、これら３個のサブクローンか
らなるＤＮＡを重要な濃度の融合蛋白質が発現するＥ．
ｃｏｌｉ菌株ＳＧ９３６（Ｆ - ｌａｃ（ａｍ）ｔｒｐ
（ａｍ） ｐｈｏ（ａｍ） ｓｕｐＣ（ｔｓ） ｒｐｓ
Ｌｍａｌ（ａｍ）ｈｔｐＲ（ａｍ）ｔｓｘ：：Ｔｎ １
０ ｌｏｎＲ９）に形質転換した。ＳＧ９３６中のサブ
クローンｐ５−３、ｐ１１−２、ｐ１３−８の培養液１
リットルを、Ｌ−アンピシリン肉汁中３０℃でＯ．Ｄ．
６００が約１．５まで増殖した。無効用誘導物質ＩＰＴ
Ｇを添加して１ｍＭにし培養液を３０℃でさらに２時間
培養した。４℃、６０００ｒｐｍ，１５分間遠心分離
（Ｓｏｒｖａｌｌ，ＧＳ３ローター）して細胞を集め
た。ペレットを１×Ｍ９塩（５５）中で洗浄し、−２０
℃で凍結した。
【０２９１】次にペレットを溶かし、１０ｍＭリン酸緩
衝液、ｐＨ７．５及び０．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム４０
ｍｌに再懸濁し、室温で３０分間培養した。この懸濁液
を、サンプルの粘度が有意に減少するまで超音波処理
（３０秒の破裂）した。サンプルを、ＡＨ６４１ロータ
ーで、３０，０００ｒｐｍ、４℃、６０分間、遠心分離
した。ペレットをピペットで取り、超音波処理して、１
０ｍＭリン酸緩衝液４０ｍｌ、ｐＨ５、中で再懸濁し、
次にＥＤＴＡ（２０ｍＭ）とＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
（５％）を加えた。サンプルを室温で１時間穏やかに混
合し、次にＴ８６５ローターで４℃、３０，０００ｒｐ
ｍで６０分間遠心分離した。このように調製したペレッ
トは、サブクローンｐ５−３、ｐ１１−２及びｐ１３−
８の純度がそれぞれ約７０％、２０％及び３０％である
所望の出発蛋白質の約６０％を含有していた。
【０２９２】
【表２０】
【０２９３】例 ４０ ひな鶏におけるメロゾイトを中和する血清反応とＥ．Ｍ
ＡＸＩＭＡに対する防御反応を誘発させるためのＥ．Ｍ
ＡＸＩＭＡ８Ｂ５抗原の使用 ８Ｂ５抗原を使用したＥ．ＭＡＸＩＭＡに対するメロゾ
イトを中和する血清反応の誘発 これらの実験に使用
する８Ｂ５は、実施例３６に記載されている還元されて
いないそのままの８Ｂ５抗原の調製の方法によって、メ
ロゾイトから調製した。この蛋白質の純度と同一性は、
ひな鶏で使用する前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びモノクロ
ーナル抗体Ｐｔｎ４７．８Ｂ５との免疫反応によって確
かめた。ワクチン製剤は、規定方式に従って、投与量
０．２ｍｌにつき約５０マイクログラムの８Ｂ５抗原が
含有されるように、抗原１容量に対して５％Ａｒｌａｃ
ｅｌ Ａ、９４％ Ｄｒａｋｅｏｌ ６−ＶＲ，１％Ｔ
ｗｅｅｎから成るオイルキャリアー３容量の濃度で調製
した。必要な場合は、抗原をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希
釈して規定方式に所望される濃度にした。ひな鶏の頸の
筋肉に０．２ｍｌを筋肉内投与した。抗原を同量、同じ
経路で２週間間隔でさらに２回投与した。
【０２９４】蛋白質をそれぞれ投与する３日前及び最終
投与の１１日後に、血清サンプルを採取するために鶏を
脱血した。心臓の不活性化した血清をメロゾイトマイク
ロ中和検定（実施例３３）で別々に試験した。代表的な
ものとしては、３×１０7 の新たに調製したＥ．ｍａｘ
ｉｍａのメロゾイトを試験血清１．５ｍｌ中で室温で１
５−３０分間培養した。培養後、１×１０7 のメロゾイ
ト（０．５ｍｌ）を、２週齢の焼肉用の鶏の外科的に露
出した十二指腸に接種した。鶏を個別ケージに収容し、
卵母細胞の産生量を、感染後１−４日に収集した糞便を
十分混合して、各処置群ごとに計った。ＭｃＭａｓｔｅ
ｒ血球計算板を用いて卵母細胞を数えた。下の表ＸＸに
示した結果は、キャリアーを投与されワクチン処理をさ
れていない鶏にはＥ．ｍａｘｉｍａメロゾイトに対する
はっきりとして中和抗血清力価がなかったが、抗原を３
回投与された鶏にははっきりとした中和抗血清力価があ
ったことを示している。
【０２９５】
【表２１】
【０２９６】８Ｂ５蛋白質を使用したひな鶏における防
御反応の誘発 最終ワクチン接種の６週間後に、なん匹
かの鶏に、４０，０００の胞子に変態させたＥ．ｍａｘ
ｉｍａ卵母細胞を経口試用投与した。投与の５日後から
１０日後の間に産生した卵母細胞を数えた。この結果
は、下の表ＸＸＩに示した。
【０２９７】
【表２２】
【０２９８】実施例 ４１ ひな鶏においてメロゾイトを中和する血清反応及びＥ．
ＭＡＸＩＭＡに対する防御反応を誘発させるための非−
再生組換型のＥＩＭＥＲＩＡ ＭＡＸＩＭＡ（８Ｂ５）
に抗原の使用組換型の８Ｂ５抗原５個を用いたＥ．ｍａｘｉｍａに対
するメロゾイトを中和する血清反応の誘発 これらの実
験に用いられた３個の８Ｂ５組換型の抗原は、実施例３
６に記載されている方法によって組換型の細菌から調製
した。この蛋白質の純度と同一性は、ひな鶏に用いる前
に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びモノクローナル抗体Ｐｍｘ４
７．８Ｂ５との免疫は反応性によって確認した。抗原の
調製試料は、各０．２ｍｌの投与量に約１００マイクロ
グラムの組換型の８Ｂ５抗原と０．０４ｍｇのＬＰＳが
含有されるように、抗原１容量に対して、５％Ａｒｌａ
ｃｅｌ−Ａ、９４％ Ｄｒａｋｅｏｌ ６−ＶＲ、１％
Ｔｗｅｅｎ８０から成るオイルキャリアー３容量の濃
度で規定方式に従って調製した。必要な場合は、抗原を
ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈して規定方式で調製するに
必要な濃度にした。ひな鶏に、０．５ｍｌを２週間間隔
でさらに３回同経路で同量ずつ投与した。
【０２９９】蛋白質をそれぞれ投与する１日前及び最終
投与の１４日後に血清サンプルを採取するために鶏を脱
血した。放血の群と時間との関連においてプールされた
２回目、３回目及び４回目の放血で得られた血清を、実
施例３３に記載されているようにｉｎ ｖｉｖｏのメロ
ゾイトの中和検定で試験した。２回目の放血でプールさ
れた血清を熱不活性化し、一方、３，４回目の放血で得
られた血清は熱不活性化しなかった。下の表ＸＸＩＩに
示した結果は、キャリアー及びアジュバントのみを投与
された鶏の血清はＥ．ｍａｘｉｍａメロゾイトを中和し
なかったことを示している。しかしながら、抗原を投与
されたいく羽かの鶏の血清はメロゾイトを中和した。
【０３００】２回目の放血に関しては、実施例４０に記
載されているようにＳＧ９３６／ｐ５−３組換型抗原又
は可溶化したＥ．ｍａｘｉｍａメロゾイト蛋白質をワク
チン接種した群の血清で処理したメロゾイトを投与され
た鶏にだけ、卵母細胞産生の減少が起った。３，４回目
のワクチン接種の後に、ほかのワクチン群の血清が卵母
細胞の中和を示した。これらの群の中で、卵母細胞の産
生の減少が最も一定した群はＳＧ９３６／５−３であっ
た。 ８Ｂ５組換型抗原を投与された鶏に関するｉｎ ｖｉｖ
ｏのＥｉｍｅｒｉａｍａｘｉｍａメロゾイト中和検定
【０３０１】
【表２３】
【０３０２】Ｅ．ｍａｘｉｍａメロゾイト組換型抗原
（８Ｂ５）を用いたひな鶏における防御反応の誘発。最
終ワクチン接種の１４日後に、鶏に２０，０００個の胞
子に変体させたＥ．ｍａｘｉｍａを経口投与した。糞便
を、投与の５日後と１０日後の間に収集した。各処理群
ごとの卵母細胞の全産生量を、実施例４０に記載した方
法を用いて求めた。下記の表ＸＸＩＩＩの結果は、卵母
細胞の全産生数の減少は８Ｂ５組換型の抗原をワクチン
接種した鶏に観察されたことを示している。８Ｂ５組換
型抗原のワクチン接種をした鶏のＥ．ｍａｘｉｍａにも
とづく胞子虫症に対する防御
【０３０３】
【表２４】
【０３０４】例 ４２ Ｅ ．ｔｅｎｅｌｌａ及びＥ．ｍａｘｉｍａ等の多くのＥ
ｉｍｅｒｉａ種によって引き起される胞子虫症に対して
鶏を免疫化するためのワクチンは、遺伝子工学的に処理
したＥ．ｔｅｎｅｌｌａ ＴＡ４胞子虫の膜蛋白質及び
モノクローナル抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５または任意のこ
れに類似した組成をもつものによって同定される元の分
子量が５５，０００のＥ．ｍａｘｉｍａ８Ｂ５抗原から
調製される。抗原の適当なキャリアーは、５％、Ａｒｌ
ａｃｅｌ Ａ．９４％ Ｄｒａｋｅｏｌ ６−ＶＲ，１
％Ｔｗｅｅｎ−８０である。ワクチンの調製は、抗原水
溶液１部とＡｒｌａｃｅｌ Ａ／Ｄｒａｋｅｏｌ ６−
ＶＲ ３部を用いて投与量あたり各抗原が１０から２０
０マイクログラムの最終濃度に形成するごとく行なう。
各投与量には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏ
ｔａ ＬＰＳ等の免疫増強剤も１０マイクログラム／投
与量含めることができる。ワクチンは、どのような年齢
の鶏にも、またどのような経路によっても、たとえば筋
肉内経路、投与してよい。適切にワクチン接種した鶏
は、ワクチンに含まれている種を野外投与することによ
って引き起される活動の低下や死を含む病気から守られ
る。
【０３０５】例 ４３ 胞子虫症や他の病源物質に対して鶏を免疫化するための
ワクチンは、遺伝子工学的に処理したＥ．ｔｅｎｅｌｌ
ａ ＴＡ４胞子虫の膜蛋白質と鳥類のバイアル抗原、即
ち、感染性の滑液包嚢の病原ウイルス、から調製しても
よい。この組合わせの抗原の適切なキャリアーは、５％
Ａｒｌａｃｅｌ Ａ．９４％ Ｄｒａｋｅｏｌ ６−Ｖ
Ｒ．１％ Ｔｗｅｅｎ８０である。このワクチンの調製
は、抗原水溶液１部とＡｒｌａｃｅｌ Ａ／Ｄｒａｋｅ
ｏｌ ６−ＶＲ３部を用いて投与量あたり各抗原が１０
から２００マイクログラムの最終濃度に形成するごとく
行なう。ワクチンは、どのような年齢の鶏にも又どのよ
うな経路によっても、たとえば筋肉内経路で投与してよ
い。適切にワクチン接種した鶏は、少なくとも１個のＥ
ｉｍｅｒｉａ抗原エピトープがあるワクチンに含まれる
種を野外試用投与することによって引き起される病気
（活動の低下や死を含む）から守られる。下記の記述部
分は主張所見の形で提出される好ましい形体で１〜２４
９にわたるものである。
【０３０６】例 ４４ 組換えＥＩＭＲＩＡ ＴＥＮＥＬＡ （ＴＡ４）抗原及
び組換えＥＩＭＥＲＩＡＭＡＸＩＭＡ抗原のマルチ−成
分暴露に対するニワトリの応答 Ｅ．ｔｅｒｅｌｌａ （ｐＣＯＣ２０）及びＥ．ｍａｘ
ｉｍａ組換え抗原（ｐ５−３、ｐ１４−９、又はｐ１１
−２）を用いてワクチン投与したトリの免疫活性を証明
するために実験を行なった。トリは次の如くグループ分
けした。
【０３０７】
【表２５】
【０３０８】ワクチンを例４２及び４３と同様にして、
担体と抗原の比３：１（ｖ／ｖ）で製剤化した。Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ＬＰＳを加えて
終濃度８ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ／ｍｌとし、全抗原濃度
は、１ｍｌ当り、１００ｍｉｃｒｏｇｒａｍ又は２００
ｍｉｃｒｏｇｒａｍとした。この製剤は、頭の後へ０．
５ｍｌ皮下投与するのに供した。ワクチン投与を２週令
のレグホンに行ない、１０日間の間隔で３回投与を行な
い、ワクチン後、血清を採取し凍結した。コントロール
は、担体／ＬＰＳを用いた場合を使用した。ワクチン化
したニワトリ及びコントロール投与のニワトリからの血
清について、膜蛋白から得られるＥ．ｔｅｎｅｌｌａス
ポロシスト及びＥ．ｍａｘｉｍａ全メロゾイト蛋白に対
する免疫活性を、ウエスタンブロット分析及び直接蛍光
抗体染色により評価した。最後のワクチン投与１０日
後、すべてのグループについて、５００Ｅ．ｔｅｎｅｌ
ｌａ及び／又は１００Ｅ．ｍａｘｉｍａ感染オオシスト
を接種し、次いで５日後に、２回目の４０００Ｅ．ｔｅ
ｎｅｌｌａ及び４０，０００Ｅ．ｍａｘｉｍａ感染オオ
シストの接種を行なった。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａによる盲
腸の病変、Ｅ．ｍａｘｉｍａによる十二指腸の病変、そ
れぞれの病原体に対する特徴点を、２回目の接種５日後
に記録した。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ及びＥ．ｍａｘｉｍａ
の組換え抗原によりワクチン投与したトリの血清応答を
評価するため、寄生生物中和化分析を用いた。Ｅ．ｍａ
ｘｉｍａに対する活性は、例３３で記述したｉｎ ｖｉ
ｖｏ中和化分析を用いて評価した。得られた結果は、表
ＸＸＩＶ、ＸＸＶ、ＸＸＶＩ及びＸＸＶＩＩにまとめ
た。
【０３０９】
【表２６】
【０３１０】
【表２７】
【０３１１】
【表２８】 ＊：トリは、１００Ｅ．ｍａｘｉｍａオオシスト、５０
０Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａオオシストであらかじめさらし
た。あるいはまたトリを、実験４日前に、両者でさらし
た。
【０３１２】
【表２９】
【０３１３】例 ４５ ｐＣＯＣ２０でワクチン化後のニワトリの体重増加 ｐＣＯＣ２０（ＴＡ４）抗原の３つの異なるロットにつ
いて、単回投与ワクチン／チャレンジ研究にて評価し
た。ブロイラーに、ＰＨＡ（５０ｍｉｃｒｏｇｒａｍ）
とともに抗原（１００ｍｉｃｒｏｇｒａｍ）を、首の後
に皮下投与して接種した。ワクチン化は５−６日令につ
いて行なった。１４日後トリを生育し、体重をはかり、
担汁を採取し、次いで５，０００の胞子形成したＥ．ｔ
ｅｎｅｌｌａオオシストを接種した。接種材料は、あら
かじめ滴定し、重い病変が生じることを確認した。チャ
レンジ６日後、トリを育て、再び体重を測って、２，３
のトリを殺し、病変を記録した。残りのトリについて、
チャレンジ後１０日目で再び体重を計った。ワクチン投
与したトリの病変は、非ワクチン投与のトリのそれと有
意差はなかった。体重増加を表ＸＸＶＩＩＩに示した。
【０３１４】
【表３０】
【０３１５】１０日間チャレンジ後の体重増加％から、
ｐＣＯＣ２０でワクチン投与した場合に、チャレンジに
対する保護の程度が分かる。キモシン／アジュバント及
びアジュバントのみのグループは、非ワクチン投与チャ
レンジグルートと相異はなかった。以下に本発明の好ま
しい態様１〜２４７項を示す。
【０３１６】（１） 第５図に示す核酸配列を有し、Ｅ
ｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａから誘導される、分子量
約２５，０００ダルトン、ジスルフィド結合で結合した
２個のポリペプチドから構成され、一方のポリペプチド
は分子量約１７，０００でＮ末端が遮閉されていること
を特徴として図５に示すアミノ酸配列を有し、他方のポ
リペプチドは分子量約８，０００ダルトンで図５に示す
アミノ酸配列を有する抗原性蛋白質をコードする単離ゲ
ノムＤＮＡ
【０３１７】（２） 分子量約２５，０００ダルトンで
図７に示す連続アミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチ
ドをコードする核酸分子 （３） 第２項に記載のｃＤＮＡ （４） 第２項に記載のｍＲＮＡ （５） 分子量約２５，０００ダルトン未満で、第１項
に記載のＤＮＡによってコードされる蛋白質のアミノ酸
配列内に包含されるアミノ酸配列の抗原性ポリペプチド
をコードするＤＮＡ分子
【０３１８】（６） 第５項に記載のＤＮＡ分子と他の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ分子 （７） 約２５，０００ダルトン以上の分子量を有する
抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子であって、
第１項に記載のＤＮＡ分子および他のアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡからなるＤＮＡ分子 （８） 約２５，０００ダルトン未満の分子量を有する
抗原性ポリペプチドと、第２項に記載の核酸配列によっ
てコードされるポリペプチド内に包含されるアミノ酸配
列とをコードするＤＮＡ分子 （９） 第８項に記載のＤＮＡ分子と他のアミノ酸配列
をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ分子 （１０） 約２５，０００ダルトン以上の分子量を有す
る抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子であっ
て、第２項に記載の核酸分子と他のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡからなるＤＮＡ分子 （１１） クローニングビークルＤＮＡと第３項記載の
ｃＤＮＡからなり、クローニングビークルＤＮＡには第
１および第２の制限酵素部位が存在し、ｃＤＮＡはこの
部位にクローン化される組換えクローニングビークル （１２） 第１１項記載のクローニングビークルをもつ
細菌宿主細胞 （１３） 名称ＪＭ８３／ｐＴＣＤ２６，ＡＴＣＣ登録
番号第５３３１５号である第１２項記載の大腸菌宿主細
胞 （１４） 適当なキャリアーＤＮＡおよび第１項記載の
ゲノムＤＮＡからなり、適当な宿主細胞中に導入すると
２５，０００ダルトン抗原性蛋白質を発現できる発現ベ
クター
【０３１９】（１５） 適当なキャリアーＤＮＡおよび
第５項記載のＤＮＡからなり、適当な宿主細胞中に導入
すると、分子量約２５，０００未満の抗原性ポリペプチ
ドを発現できる発現ベクター （１６） 適当な宿主細胞に導入すると、適当なキャリ
アーＤＮＡおよび第６項記載のＤＮＡからなる抗原性ポ
リペプチドを発現できる発現ベクター （１７） 適当な宿主細胞に導入すると、適当なキャリ
アーＤＮＡと第７項記載のＤＮＡからなる分子量２５，
０００ダルトン以上の抗原性ポリペプチドを発現できる
発現ベクター （１８） プラスミドＤＮＡと第３項記載のｃＤＮＡか
らなり、適当な細菌性宿主細胞に導入すると分子量２
５，０００ダルトンの抗原性ポリペプチドを発現できる
細菌性発現ベクター
【０３２０】（１９） ｐＤＥＴ１と命名された第１８
項記載のベクター （２０） ｐＤＥＴ２と命名された第１８項記載のベク
ター （２１） プラスミドＤＮＡは、５′から３′の順序
に、プロモーターまたはプロモーターとオペレーターの
いずれかを含むＤＮＡ配列、所望の遺伝子のｍＲＮＡを
宿主細胞内のリボソームに結合できるようにするリボソ
ーム結合部位を含むＤＮＡ配列、ＡＴＧ 開始コドン、
所望の遺伝子をＡＴＧ開始コドンと同相に挿入できる制
限酵素部位、宿主細胞内で自動複製できる、細菌プラス
ミドからの複製オリジンを含むＤＮＡ配列、ベクターが
宿主細胞内にあると表現される、選択または同定可能な
表現型特性を伴う遺伝子を含むＤＮＡ配列、を包含する
二本鎖ＤＮＡからなる第１８項記載のベクター
【０３２１】（２２） 適当な細菌宿主細胞内に導入す
ると分子量約２５，０００ダルトン未満の抗原性ポリペ
プチドを発現できる、プラスミドＤＮＡと第８項記載の
ＤＮＡからなる細菌性発現ベクター （２３） 適当な細菌宿主細胞内に導入すると抗原性ポ
リペプチドを発現できる、プラスミドＤＮＡと第９項記
載のＤＮＡからなる細菌性発現ベクター （２４） 適当な宿主細胞内に導入すると、２５，００
０ダルトンのポリペプチドが他のアミノ酸配列に融合し
た融合ポリペプチドを発現できる、プラスミドＤＮＡと
第１０項記載のＤＮＡからなる細菌性発現ベクター
【０３２２】（２５） 他のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡはβ−ガラクトシダーゼをコードし、融合ポリペ
プチドの分子量は約１３５，０００ダルトンである第２
４項記載のベクター （２６） ｐＢＧＣ２３と命名された第２５項記載のベ
クター
【０３２３】（２７） 他のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡはプロキモシンをコードし、融合ポリペプチドの
分子量は約６５，６００ダルトンである第２４項記載の
ベクター （２８） ｐＣＯＣ１２と命名された第２７項記載のベ
クター
【０３２４】（２９） 他のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡは、ＳｐｈＩ消化によって修飾され、その結果２
４９ｂｐの欠失を生じたプロキモシンをコードし、融合
ポリペプチドの分子量は約５６，５００ダルトンである
第２４項記載のベクター （３０） ｐＣＯＣ２０と命名された第２９項記載のベ
クター （３１） 第１４項記載の発現ベクターを含む宿主細胞 （３２） 第１８項記載の発現ベクターを含む宿主細胞 （３３） 第３２項記載の大腸菌宿主細胞 （３４） ベクターｐＢＧＣ２３を含有し、ＡＴＣＣ登
録番号５３３１７号の、ＲＥＮ３／ｐＢＧＣ２３大腸菌
宿主細胞 （３５） ベクターｐＣＯＣ１２を含有し、ＡＴＣＣ登
録番号５３３１４号の、ＲＥＮ３／ｐＣＯＣ１２大腸菌
宿主細胞 （３６） ベクターｐＣＯＣ２０を含有し、ＡＴＣＣ登
録番号５３３１３号の、ＲＥＮ３／ｐＣＯＣ２０大腸菌
宿主細胞 （３７） ベクターｐＤＥＴ１を含有し、ＡＴＣＣ登録
番号５３３１６号の、ＲＥＮ３／ｐＤＥＴ１大腸菌宿主
細胞
【０３２５】（３８） ベクターｐＤＥＴ２を含有し、
ＡＴＣＣ登録番号５３３１８号の、ＲＥＮ３／ｐＤＥＴ
２大腸菌宿主細胞 （３９） 分子量約２５，０００ダルトンで、図７に示
すアミノ酸配列を有する抗原性蛋白質 （４０） 分子量約２５，０００ダルトン未満で、図７
のアミノ酸配列内に含有されるアミノ酸配列を有する抗
原性ポリペプチド （４１） 図７に示すアミノ酸配列からなり、その配列
のアミノ末端に付加的アミノ酸を有する抗原性ポリペプ
チド （４２） 図７に示すアミノ酸配列内に包含されるアミ
ノ酸配列と付加的アミノ酸からなる抗原性ポリペプチド （４３） 分子量約１３５，０００ダルトンで、図７に
示すアミノ酸配列からなり、その配列のアミノ末端にβ
−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を有する抗原性ポリ
ペプチド （４４） 分子量約６５，６００ダルトンで、図７に示
すアミノ酸配列からなり、その配列のアミノ末端にプロ
キモシンのアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチド
【０３２６】（４５） 分子量約５６，５００ダルトン
で、図７に示すアミノ酸配列からなり、その配列のアミ
ノ末端に、プロキモシンの天然配列から８３個のアミノ
酸を欠失させたアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチ
ド （４６） 第３４項から第３８項までに記載のいずれか
の宿主細胞をＤＮＡ発現およびポリペプチド産生を可能
にする適当な条件下に生育させ、生成したポリペプチド
を適当な条件下に回収する抗原性ポリペプチドの製造方
法 （４７） 回収は、 ａ） 宿主細胞からのポリペプチドの分離、 ｂ） ポリペプチドの精製、 ｃ） ポリペプチドの可溶化、 ｄ） ポリペプチドの再生、および ｅ） 精製、可溶化、再生された抗原性ポリペプチドの
回収の各工程からなる第４６項記載の方法
【０３２７】（４８） 第３９項から第４５項までのい
ずれかに記載のポリペプチドの免疫感作有効量を鶏に投
与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する
能動免疫を鶏に付与する方法 （４９） 第３９項から第４５項までのいずれかに記載
のポリペプチド２種またはそれ以上の免疫感作有効量を
鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に
対する能動免疫を鶏に付与する方法 （５０） 免疫感作有効量は約０．１μｇ〜約１．０ｍ
ｇである第４８項記載の方法 （５１） 免疫感作有効量は約０．１μｇ〜約１．０ｍ
ｇである第４９項記載の方法 （５２） 第３９項から第４５項までに記載のポリペプ
チドの１種の免疫感作有効量と医薬的に許容される担体
を１用量とした、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染
に対する能動免疫を鶏に付与するワクチン （５３） 第３９項から第４５項までに記載のポリペプ
チドの２種またはそれ以上の免疫感作有効量と医薬的に
許容される担体を１用量とした、Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎ
ｅｌｌａ感染に対する能動免疫を鶏に付与するワクチン
【０３２８】（５４） 第４３項に記載の抗原性ポリペ
プチドの免疫感作有効量と医薬的に許容される担体から
なる、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能
動免疫を鶏に付与するワクチン （５５） 第４４項に記載の抗原性ポリペプチドの免疫
感作有効量と医薬的に許容される担体からなる、Ｅｉｍ
ｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能動免疫を鶏に
付与するワクチン （５６） 免疫感作有効量は、鶏の体重１ｋｇあたり約
０．１μｇ以上とする第５２項記載のワクチン （５７） 免疫感作有効量は、鶏の体重１ｋｇあたり約
０．１μｇ以上とする第２３項記載のワクチン （５８） 第５２項記載のワクチンの適当用量を鶏に投
与する、Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａの感染に対する
防御方法 （５９） 第５３項に記載のワクチンの適当用量を鶏に
投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に対
する防御方法
【０３２９】（６０） 第５４項に記載のワクチンの適
当用量を鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌ
ａの感染に対する防御方法 （６１） 第５５項に記載のワクチンの適当用量を鶏に
投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に対
する防御方法 （６２） 投与は慣用の任意の形の経口投与である第５
８項記載の方法 （６３） 投与は注射によって行われ、ポリペプチドは
医薬的に許容される担体中に加える、第５８項記載の方
法 （６４） 分子量約２６，０００ダルトンで、ジスルフ
ィド結合で結合した２個のポリペプチドから構成され、
一方のポリペプチドは分子量約１８，０００、Ｎ末端が
遮閉されていることを特徴とし、他方のポリペプチドは
分子量約８，０００であり、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａ
ｔｒｉｘまたはＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染
に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘導でき
る、精製、抗原性蛋白質
【０３３０】（６５）（ａ） Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃ
ａｔｒｉｘのスポロシストを、適当な非還元条件下、プ
ロテアーゼ阻害剤の存在下に界面活性剤と接触させて、
スポロシスト膜蛋白質を可溶化し、（ｂ）可溶化された
スポロシスト膜蛋白質から適当な非還元性条件下に蛋白
質を分離回収する、第６４項記載の蛋白質の製造方法 （６６） 分離回収は、非還元性条件下におけるＤＥＡ
Ｅ−ＨＰＬＣついでプレパラティブＳＤＳゲル電気泳動
による、可溶化されたスポロシスト膜蛋白質の部分精製
からなる第６５項記載の方法 （６７） 分離回収は、モノクロナール抗体Ｐｔｎ７．
２Ａ４／４（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ８５６１）による免疫
沈殿または免疫アフィニティークロマトグラフィーによ
って行われる第６５項記載の方法 （６８） （ａ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘの
スポロシストをプロテアーゼ阻害剤の存在下適当な条件
で界面活性剤と接触させて、スポロシストの膜蛋白質を
可溶化し、（ｂ）可溶化したスポロシストの膜蛋白質か
ら適当な条件下にポリペプチドを分離回収する、第６４
項に記載の１８，０００ダルトンポリペプチド成分の製
造方法
【０３３１】（６９） 分離回収は、可溶化したスポロ
シストの膜蛋白質を適当な還元性条件下に、ＤＥＡＥ−
ＨＰＬＣ上クロマトグラフィー、ついでプレパラティブ
ＳＤＳゲル電気泳動により部分精製することからなる第
６８項記載の方法 （７０） 第６４項記載の蛋白質を製造するにあたり、
その蛋白質をコードするＤＮＡ分子を製造し、このＤＮ
Ａ分子を適当な発現ベクターに挿入し、得られた発現ベ
クターをＤＮＡの発現および蛋白質の産生を可能にする
適当な条件下に適当な宿主中に導入し、生成した蛋白質
を回収する方法 （７１） 第６４項記載の１８，０００ダルトンポリペ
プチド成分を製造するにあたり、そのポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ分子を製造し、このＤＮＡ分子を適当な
発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターをＤＮＡ
の発現およびポリペプチドの産生を可能にする適当な条
件下に適当な宿主中に挿入し、生成したポリペプチドを
回収する方法
【０３３２】（７２） 第６４項記載の蛋白質の免疫感
作有効量を鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔ
ｒｉｘの感染に対する能動免疫を鶏に付与する方法 （７３） 第６４項記載の蛋白質の免疫感作有効量を鶏
に付与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に
対する能動免疫を鶏に付与する方法 （７４） 第６４項記載のポリペプチドの免疫感作有効
量を鶏に付与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ
およびＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に対する
能動免疫を鶏に付与する方法 （７５） 免疫感作有効量は約０．１μｇ〜約１．０ｍ
ｇである第７２項記載の方法 （７６） 免疫感作有効量は約０．１μｇ〜約１．０ｍ
ｇである第７３項記載の方法 （７７） 免疫感作有効量は約０．１μｇ〜約１．０ｍ
ｇである第７４項記載の方法 （７８） 第６４項記載の蛋白質の免疫感作有効量と医
薬的に許容される担体を１用量としたＥｉｍｅｒｉａ
ｎｅｃａｔｒｉｘの感染に対する能動免疫を鶏に付与す
るワクチン
【０３３３】（７９） 第６４項記載の蛋白質の免疫感
作有効量と医薬的に許容される担体を１用量としたＥｉ
ｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に対する能動免疫を
鶏に付与するワクチン （８０） 第６４項記載のポリペプチドの免疫感作有効
量と医薬的に許容される担体を１用量としたＥｉｍｅｒ
ｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘまたはＥｉｍｅｒｉａｔｅｎｅ
ｌｌａの感染に対する能動免疫を鶏に付与するワクチン （８１） 免疫感作有効量は、鶏の体重１ｋｇあたり約
０．１μｇである第７８項記載のワクチン （８２） 免疫感作有効量は、鶏の体重１ｋｇあたり約
０．１μｇである第７９項記載のワクチン （８３） 免疫感作有効量は、鶏の体重１ｋｇあたり約
０．１μｇである第８０項記載のワクチン （８４） 第７８項記載のワクチン適当用量を鶏に投与
する、Ｅｉｍｅｒｉａｎｅｃａｔｒｉｘの感染から鶏を
予防する方法 （８５） 第７９項記載のワクチン適当用量を鶏に投与
する、Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａの感染から鶏を予
防する方法
【０３３４】（８６） 第８０項記載のワクチン適当用
量を鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａｎｅｃａｔｒｉｘお
よびＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染から鶏を予
防する方法 （８７） 第６４項記載の蛋白質の少なくとも部分をコ
ードする核酸分子 （８８） 第８７項記載の単離ゲノムＤＮＡ （８９） 図１７に示した核酸配列の少なくとも部分で
ある第８７項記載の核酸分子 （９０） 他のアミノ酸配列をコードする核酸配列を包
含する第８９項記載の核酸分子 （９１） 第８７項記載のｃＤＮＡ分子 （９２） 第８７項記載のｍＲＮＡ分子 （９３） クローニングベクターＤＮＡおよび第９１項
記載のｃＤＮＡからなり、クローニングベクターＤＮＡ
は第１および第２の制限酵素部位が存在し、ｃＤＮＡは
この部位にクローン化された組換えクローニングベクタ
ー （９４） クローニングベクターＤＮＡはプラスミドＤ
ＮＡからなる第９３項記載の組換えクローニングベクタ
ー
【０３３５】（９５） 第９３項記載のクローニングベ
クターを含有する宿主細胞 （９６） 第９５項記載の細菌宿主 （９７） プラスミドｐＳＭＡＣからなる第９４項記載
の組換えクローニングベクター （９８） 第９７項記載のクローニングベクターを含有
する細菌宿主細胞 （９９） 名称ＪＭ８３／ｐＳＭＡＣ、ＡＴＣＣ登録番
号６７ ２４１号である第９８項記載の大腸菌宿主細胞 （１００） プラスミドｐＳＳ３３からなる第９４項記
載の組換えクローニングベクター （１０１） 第１００項記載のクローニングベクターを
含有する細菌宿主細胞 （１０２） 名称ＪＭ８３／ｐＳＳ３３、ＡＴＣＣ登録
番号６７ ２４２号である第１０１項記載の大腸菌宿主
細胞 （１０３） プラスミドｐＮＣＤからなる第９４項記載
の組換えクローニングベクター
【０３３６】（１０４） 第１０３項記載のクローニン
グベクターを含有する細菌宿主細胞 （１０５） 名称ＪＭ８３／ｐＮＣＤ、ＡＴＣＣ登録番
号６７ ２６６号である第１０４項記載の大腸菌宿主細
胞 （１０６） クローニングベクターＤＮＡと第９０項記
載の核酸配列からなり、クローニングベクターＤＮＡは
第１および第２の制限酵素部位を有し、第９０項記載の
核酸配列はこの部位にクローン化された組換え発現ベク
ター （１０７） 適当な宿主細胞に導入すると、融合ポリペ
プチドを発現できる第１０６項記載の組換え発現ベクタ
ー （１０８） 名称はｐＴＤＳ１である第１０７項記載の
組換え発現ベクター （１０９） 第１０８項記載の発現ベクターを含有する
細菌宿主細胞 （１１０） 名称ＭＨ１／ｐＴＤＳ１、ＡＴＣＣ登録番
号６７ ２４０号である第１０９項記載の大腸菌宿主細
胞
【０３３７】（１１１） 名称はｐＴＤＳ２である第１
０７項記載の組換え発現ベクター （１１２） 第１１１項記載の発現ベクターを含有する
細菌宿主細胞 （１１３） 名称はＭＨ１／ｐＴＤＳ２、ＡＴＣＣ登録
番号６７ ２６４号である第１１２項記載の大腸菌宿主
細胞 （１１４） 名称はｐＤＤＳ２である第１０７項記載の
組換え発現ベクター （１１５） 第１１４項記載の発現ベクターを含有する
細菌宿主細胞 （１１６） 名称ＪＭ８３／ｐＤＤＳ２、ＡＴＣＣ登録
番号６７ ２６５号である第１１５項記載の大腸菌宿主
細胞 （１１７） 名称はｐＤＤＳ１である第１０７項記載の
組換え発現ベクター （１１８） 第１１７項記載の発現ベクターを含有する
細菌宿主細胞 （１１９） 名称ＭＨ１／ｐＤＤＳ１、ＡＴＣＣ登録番
号６７ ２４３号である第１１８項記載の大腸菌宿主細
胞
【０３３８】（１２０） 第９５項記載の宿主細胞を蛋
白質の産生を可能にする適当な条件下に生育させ、生成
した蛋白質を回収する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒ
ｉｘおよびＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に対
する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる蛋白
質の製造方法 （１２１） ほぼ同一の配列を有するが細菌宿主内での
発現のために異なる第６４項記載の蛋白質 （１２２） Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘから全
ゲノムＤＮＡを単離し、単離したゲノムＤＮＡからＤＮ
Ａフラグメントを調製し、得られたフラグメントを適当
なクローニングベクターにリゲートし、生成したクロー
ンのＤＮＡを図１７に示した核酸配列内に存在する核酸
配列を含むかまたはそれと相補性のオリゴヌクレオチド
とハイブリダイゼーションさせて適当なクローンを同定
し、ついで、適当なクローンから図１７に示した核酸配
列を有し、蛋白質をコードするＤＮＡを単離する、第８
９項記載のＤＮＡを得る方法
【０３３９】（１２３） 分子量約２６，０００未満
で、第６４項記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含され
るアミノ酸配列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒ
ｉｘおよびＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に対
する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる抗原
性ポリペプチド （１２４） 分子量約２６，０００以上で、第６４項記
載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるアミノ酸配列
と付加的アミノ酸配列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａｎｅｃａ
ｔｒｉｘおよびＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染
に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる
抗原性ポリペプチド （１２５） 第６４項記載の蛋白質の類縁体である抗原
性ポリペプチド （１２６） 第１２３項記載のポリペプチドの類縁体で
ある抗原性ポリペプチド （１２７） 第１２４項記載のポリペプチドの類縁体で
ある抗原性ポリペプチド （１２８） 第６４項記載の蛋白質の１８，０００ダル
トンポリペプチド成分のアミノ酸配列を有し、分子量は
１８，０００ダルトンであって、Ｅｉｍｅｒｉａｎｅｃ
ａｔｒｉｘおよびＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感
染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発でき
る抗原性ポリペプチド
【０３４０】（１２９） 第６４項記載の蛋白質の８，
０００ダルトンポリペプチド成分のアミノ酸配列を有
し、分子量は、８，０００ダルトンであって、Ｅｉｍｅ
ｒｉａｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎ
ｅｌｌａの感染に対する防御機構を付与する免疫応答を
鶏に誘発できる抗原性ポリぺプチド （１３０） 分子量約１８，０００ダルトン未満で、第
１２８項記載のポリぺプチドのアミノ酸配列内に包含さ
れるアミノ酸配列と付加的アミノ酸配列を有し、Ｅｉｍ
ｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥｉｍｅｒｉａ ｔ
ｅｎｅｌｌａ感染に対する防御機構を付与する免疫応答
を鶏に誘発できる抗原性ポリぺプチド （１３１） 分子量約１８，０００ダルトン以上で、第
１２８項記載のポリぺプチドのアミノ酸配列と付加的ア
ミノ酸配列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ
およびＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する防
御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる抗原性ポリ
ぺプチド
【０３４１】（１３２） 第１２８項記載のポリぺプチ
ドの類縁体である抗原性ポリぺプチド （１３３） 第１３０項記載のポリぺプチドの類縁体で
ある抗原性ポリぺプチド （１３４） 第１３１項記載のポリぺプチドの類縁体で
ある抗原性ポリぺプチド （１３５） 分子量約８，０００未満で、第１２９項記
載のポリぺプチドのアミノ酸配列内に包含されるアミノ
酸配列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘおよ
びＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する防御機
構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる抗原性ポリぺプ
チド （１３６） 分子量約８，０００以上で、第１２９項記
載のポリぺプチドのアミノ酸配列と付加的アミノ酸配列
を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥｉ
ｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する防御機構を付
与する免疫応答を鶏に誘発できる抗原性ポリぺプチド （１３７） 第１２９項記載のポリぺプチドの類縁体で
ある抗原性ポリぺプチド （１３８） 第１３５項記載のポリぺプチドの類縁体で
ある抗原性ポリぺプチド
【０３４２】（１３９） 第１３６項記載のポリぺプチ
ドの類縁体である抗原性ポリぺプチド （１４０） 第１２３，１２４，１２８〜１３１，１３
５または１３６項記載の任意の１種のポリぺプチドの免
疫感作有効量と医薬的に許容される担体を１用量として
Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥｉｍｅｒｉ
ａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能動免疫を鶏に付与す
るワクチン （１４１） 第１２３，１２４，１２８〜１３１，１３
５または１３６項記載のポリぺプチド２種または３種以
上の免疫感作有効量と医薬的に許容される担体を１用量
としたＥｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘおよびＥｉｍ
ｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染に対する能動免疫を鶏に
付与するワクチン （１４２） 免疫感作有効量は鶏の体重１ｋｇあたり約
０．１μｇ以上である第１４０項記載のワクチン （１４３） 免疫感作有効量は、鶏の体重１ｋｇあたり
約０．１μｇ以上である第１４１項記載のワクチン
【０３４３】（１４４） 第１４０項記載のワクチンの
適当用量を鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔ
ｒｉｘおよびＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染から
鶏を予防する方法 （１４５） 第１４１項記載のワクチンの適当用量を鶏
に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘおよび
Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ感染から鶏を予防する
方法 （１４６） 第６４項記載の蛋白質に対するモノクロナ
ール抗体 （１４７） 第１４６項記載のモノクロナール抗体に対
する抗−イデイオタイプ抗体 （１４８） 分子量は約５５，０００ダルトンで、Ｅｉ
ｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染に対する防御機構を付与
する免疫応答を鶏に誘発できる精製抗原性蛋白質 （１４９） 分子量約５５，０００ダルトン未満で、第
１４８項記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるア
ミノ酸配列を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染
に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる
抗原性ポリぺプチド （１５０） 第１４９項記載の抗原性ポリぺプチドから
なる、Ｅｉｍｅｒｉａｍａｘｉｍａ感染に対する防御機
構を付与する免疫応答を鶏に誘発できる抗原
【０３４４】（１５１） 第１４８項記載の蛋白質を製
造するにあたり、（ａ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ
のメロゾイトをプロテアーゼ阻害剤の存在下、適当な非
還元性条件で、界面活性剤と接触させて、メロゾイトの
膜蛋白質を可溶化し、（ｂ）可溶化されたメロゾイトの
膜蛋白質から適当な非還元性条件下に蛋白質を分離回収
する方法 （１５２） 分離回収は、イオン交換クロマトグラフィ
ーによる可溶化メロゾイト膜蛋白質の部分精製からなる
第１５１項記載の方法 （１５３） 分離回収は、モノクロナール抗体Ｐｍｘ４
７．８Ｂ５による免疫沈殿または免疫アフィニティーク
ロマトグラフィーからなる第１５１項記載の方法 （１５４） 第１４８項記載の蛋白質を製造するにあた
り、その蛋白質をコードするＤＮＡ分子を製造し、その
ＤＮＡ分子を適当な発現ベクターに挿入し、得られた発
現ベクターをＤＮＡの発現および蛋白質の産生を可能に
する適当な条件下に適当な宿主に導入し、生成した蛋白
質を回収する方法
【０３４５】（１５５） 第１４９項記載のポリぺプチ
ドを製造するにあたり、そのポリぺプチドをコードする
ＤＮＡ分子と製造し、そのＤＮＡ分子を適当な発現ベク
ターに挿入し、得られた発現ベクターをＤＮＡの発現お
よびポリぺプチドの産生を可能にする適当な条件下に適
当な宿主に導入し、生成したポリぺプチドを回収する方
法 （１５６） 第１４８項記載の蛋白質の免疫感作有効量
を鶏に投与するＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染に対
する能動免疫を鶏に付与する方法 （１５７） 第１４９項記載のポリぺプチドの免疫感作
有効量を鶏に投与するＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感
染に対する能動免疫を鶏に付与する方法 （１５８） 第１５０項記載のポリぺプチドの免疫感作
有効量を鶏に投与するＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感
染に対する能動免疫を鶏に付与する方法 （１５９） 免疫感作有効量は約０．１μｇ〜約１．０
ｍｇである第１５６項記載の方法 （１６０） 第１４８項記載の蛋白質の免疫感作有効量
と医薬的に許容される担体を１用量とした、Ｅｉｍｅｒ
ｉａ ｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫を鶏に付与す
るワクチン
【０３４６】（１６１） 第１４９項記載のポリぺプチ
ドの免疫感作有効量と医薬的に許容される担体を１用量
とした、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染に対する能
動免疫を鶏に付与するワクチン （１６２） 第１５０項記載のポリぺプチドの免疫感作
有効量と医薬的に許容される担体を１用量とした、Ｅｉ
ｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫を鶏に
付与するワクチン （１６３） 免疫感作有効量は鶏の体重１ｋｇあたり約
０．１μｇである第１６０項記載のワクチン （１６４） 免疫感作有効量は鶏の体重１ｋｇあたり約
０．１μｇである第１６１項記載のワクチン （１６５） 第１６１項記載のワクチン適当用量を鶏に
投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染から鶏を
予防する方法 （１６６） 第１４８項記載の蛋白質に対するモノクロ
ナール抗体 （１６７） 第１４９項記載のポリぺプチドに対するモ
ノクロナール抗体
【０３４７】（１６８） ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．ＨＢ８９４６によって産生されるモノクロナ
ール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５ （１６９） 第１６６，１６７または１６８項記載の抗
体の予防有効量を鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａ
ｘｉｍａ感染に対する受動免疫を付与する方法 （１７０） 第１６６，１６７または１６８項記載のモ
ノクロナール抗体の予防有効量と医薬的に許容される担
体からなるＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染に対する
受動免疫を鶏に付与するための組成物 （１７１） 第１７０項記載の組成物の適当用量を鶏に
投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染に対する
受動免疫を鶏に付与する方法 （１７２） 第１６８項記載のモノクロナール抗体に対
する抗−イデイオタイプ抗体
【０３４８】（１７３） （ａ）ハイブリドーマ細胞系
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８９４６）からモノクロナール
抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５を回収し、（ｂ）モノクロナー
ル抗体を精製し、（ｃ）精製モノクロナール抗体を適当
なアジュバントとともに適当な動物に注射し、（ｄ）注
射した動物から血清を採取し、（ｅ）その血清から抗−
イデイオタイプ抗体を回収する、第１７２項記載の抗−
イデイオタイプ抗体の製造方法 （１７４） 第１７２項記載の抗−イデイオタイプ抗体
の免疫感作有効量を鶏に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍ
ａｘｉｍａ感染に対する能動免疫を鶏に付与する方法 （１７５） 第１７２項記載の抗イデイオタイプ抗体の
免疫感作有効量と医薬的に許容される担体からなる、Ｅ
ｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫を鶏
に付与するためのワクチン （１７６） 第１７５項記載のワクチンの適当用量を鶏
に投与する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感染から鶏
を予防する方法 （１７７） モノクロナール抗体Ｐｍｘ４７．８Ｂ５に
よって認識されるエピトープからなる蛋白質をコードす
る核酸分子
【０３４９】（１７８） 他のアミノ酸配列をコードす
る核酸配列を包含する第１７７項記載の核酸分子 （１７９） 第１７７項記載のｃＤＮＡ分子 （１８０） 第１７７項記載のｍＲＮＡ分子 （１８１） 第１４９項または第１５０項のいずれかに
記載のポリぺプチドをコードするＤＮＡ分子 （１８２） 第１７７項記載の核酸分子を含有するクロ
ーニングベクター （１８３） 第１８２項記載のクローニングベクターを
含有する宿主細胞 （１８４） 細菌宿主である第１８３項記載の宿主細胞 （１８５） クローニングベクターＤＮＡと第１７７項
記載の核酸配列からなり、クローニングベクターＤＮＡ
には第１および第２の制限酵素部位が存在し、第１７７
項記載の核酸配列はその部位にクローン化された組換え
発現ベクター （１８６） 適当な宿主内に導入すると、融合ポリぺプ
チドを発現できる第１８５項記載の組換え発現ベクター
【０３５０】（１８７） 名称がｐ５−３である第１８
６項記載の組換え発現ベクター （１８８） 第１８７項記載の発現ベクターを含有する
細菌宿主細胞 （１８９） 名称がＳＧ９３６／ｐ５−３であり、ＡＴ
ＣＣ登録番号が６７ ２５３号である第１８８項記載の
大腸菌宿主細胞 （１９０） 名称がｐ１１−２である第１８６項記載の
組換え発現ベクター （１９１） 第１９０項記載の発現ベクターを含有する
細菌宿主細胞 （１９２） 名称がＳＧ９３６／ｐ１１−２、ＡＴＣＣ
登録番号が６７ ２５１号である第１９１項記載の大腸
菌宿主細胞 （１９３） 名称がｐ１３−８である第１８６項記載の
組換え発現ベクター （１９４） 第１９３項記載の発現ベクターを含有する
細菌宿主細胞 （１９５） 名称がＳＧ９３６／ｐ１３−８、ＡＴＣＣ
登録番号が６７ ２５２号である第１９４項記載の大腸
菌宿主細胞
【０３５１】（１９６） Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍ
ａ感染に対する防御機構を付与する免疫応答を鶏に誘発
できる抗原性蛋白質を製造するにあたり、第１８３項記
載の宿主細胞を上記蛋白質の産生を可能にする適当な条
件下に生育させ、生成した蛋白質を回収する方法 （１９７） ほぼ同一の配列を有するが、細菌宿主内で
の発現のために異なる第１４８項記載の蛋白質 （１９８） 第１７７項記載のＤＮＡを得るにあたり、
Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの卵母細胞から全ゲノム
ＤＮＡを単離し、単離されたゲノムＤＮＡからＤＮＡフ
ラグメントを製造し、得られたフラグメントを存在する
核酸配列を含有するかまたはそれと相補性を示すオリゴ
ヌクレオチドとハイブリダイゼーションによってリゲー
トして適当なクローンを同定し、適当なクローンから蛋
白質をコードするＤＮＡを単離する方法 （１９９） 分子量５５，０００ダルトン以上で、第１
４８項記載の蛋白質のアミノ酸配列内に包含されるアミ
ノ酸配列と付加的アミノ酸を有し、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍ
ａｘｉｍａ感染に対する防御機構を付与する免疫応答を
鶏に誘発できる抗原性ポリぺプチド
【０３５２】（２００） 付加的アミノ酸配列はβ−ガ
ラクトシダーゼのアミノ酸配列からなる第１９９項記載
のポリぺプチド （２０１） 第１９９項記載のポリぺプチドをコードす
るＤＮＡ分子 （２０２） 第２０１項記載のＤＮＡを含有するクロー
ニングベクター （２０３） 第１９９項記載のポリぺプチドの免疫感作
有効量を鶏に投与するＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ感
染に対する能動免疫を鶏に付与する方法 （２０４） 第１９９項記載のポリぺプチドの免疫感作
有効量と医薬的に許容される担体からなるＥｉｍｅｒｉ
ａ ｍａｘｉｍａ感染に対する能動免疫を鶏に付与する
ワクチン （２０５） ワクチン投与動物にＥｉｍｅｒｉａ抗原に
対する抗体の産生を誘発するのに有効な量のＥｉｍｅｒ
ｉａ抗原またはエピトープの混合物と医薬的に許容され
る担体を１用量とした、Ｅｉｍｅｒｉａによって惹起さ
れる疾患に対する多成分ワクチン （２０６） 疾患はコクシジウム症である第２０５項記
載のワクチン
【０３５３】（２０７） 動物は鶏である第２０５項記
載のワクチン （２０８） Ｅｉｍｅｒｉａ抗原はＥ．ｔｅｎｅｌｌ
ａ，Ｅ．ｍａｘｉｍａ，Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘまたは他
のＥｉｍｅｒｉａ種の抗原である第２０５項記載のワク
チン （２０９） Ｅｉｍｅｒｉａ抗原は、Ｅｉｍｅｒｉａエ
ピトープ少なくとも１個を含有し、遺伝子操作による抗
原性融合ポリぺプチド１種または２種以上からなる第２
０５項記載のワクチン （２１０） １用量あたりの各抗原の量は約１０μｇか
ら約２００μｇである第２０５項記載のワクチン （２１１） 医薬的に許容される担体は、約５％のＡｒ
ｌａｃｅｌ Ａ、約９４％のＤｒａｋｅｏｌ ６−ＶＲ
および約１％のＴｗｅｅｎ−８０からなる第２０５項記
載のワクチン
【０３５４】（２１２） 医薬的に許容される担体は、
約１部の抗原水溶液と、約５％のＡｒｌａｃｅｌ Ａ、
約９４％のＤｒａｋｅｏｌ ６−ＶＲおよび約１％のＴ
ｗｅｅｎ ８０を含む溶液約３部からなる第２０５項記
載のワクチン （２１３） 医薬的に許容される担体は免疫増強剤を含
有する第２０５項記載のワクチン （２１４） 免疫増強剤はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉ
ｎｎｅｓｏｔａ ＬＰＳである第２１１項記載のワクチ
ン （２１５） 医薬的に許容される担体は１用量あたりＳ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ＬＰＳ、１
０μｇを含有する第２１１項記載のワクチン （２１６） ワクチン混合物はＥ．ｔｅｎｅｌｌａ抗原
と他のＥｉｍｅｒｉａ抗原からなる第２０５項記載のワ
クチン （２１７） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は２５キロダルト
ンＥ．ｔｅｎｅｌｌａ抗原からなる第２１６項記載のワ
クチン （２１８） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は任意のＥ．ｎｅ
ｃａｔｒｉｘ抗原からなる第２１６項記載のワクチン （２１９） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は２６キロダルト
ンＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原からなる第２１６項記載の
ワクチン
【０３５５】（２２０） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は任
意のＥ．ｍａｘｉｍａ抗原からなる第２１６項記載のワ
クチン （２２１） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は５５キロダルト
ンＥ．ｍａｘｉｍａ抗原からなる第２１６項記載のワク
チン （２２２） 混合物は２５キロダルトンＥ．ｔｅｎｅｌ
ｌａ抗原と任意の他のＥｉｍｅｒｉａ抗原の組合せであ
る第２０５項記載のワクチン （２２３） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は任意のＥ．ｎｅ
ｃａｔｒｉｘ抗原からなる第２２２項記載のワクチン （２２４） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は、２６キロダル
トンＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原からなる第２２２項記載
のワクチン （２２５） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は任意のＥ．ｍａ
ｘｉｍａ抗原である第２２２項記載のワクチン （２２６） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は５５キロダルト
ンＥ．ｍａｘｉｍａ抗原である第２２２項記載のワクチ
ン （２２７） 混合物はＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原と他の
任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原との組合せである第２０５項
記載のワクチン
【０３５６】（２２８） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は２
６キロダルトンＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原からなる第２
２７項記載のワクチン （２２９） ワクチンは、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ抗原の
混合物と他の任意のＥ．ｍａｘｉｍａ抗原の組合せなる
第２２７項記載のワクチン （２３０） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は５５キロダルト
ンＥ．ｍａｘｉｍａ抗原からなる第２２７項記載のワク
チン （２３１） 混合物は２６キロダルトンＥ．ｎｅｃａｔ
ｒｉｘ抗原と他の任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原の組合せで
ある第２０５項記載のワクチン （２３２） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は任意のＥ．ｍａ
ｘｉｍａ抗原からなる第２３１項記載のワクチン （２３３） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は５５キロダルト
ンＥ．ｍａｘｉｍａ抗原からなる第２３１項記載のワク
チン （２３４） ワクチンは任意のＥ．ｍａｘｉｍａ抗原の
混合物と他の任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原の組合せからな
る第２０５項記載のワクチン
【０３５７】（２３５） 他のＥｉｍｅｒｉａ抗原は５
５キロダルトンＥ．ｍａｘｉｍａ抗原からなる第２３４
項記載のワクチン （２３６） ワクチンは任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原の混
合物と任意のトリウイルス蛋白質の組合せからなる第２
０５項記載のワクチン （２３７） トリウイルス蛋白質はマレック病ウイルス
またはそのエピトープである第２３６項記載のワクチン （２３８） トリウイルス蛋白質は感染性バーサル疾患
ウイルスまたはそのエピトープである第２３６項記載の
ワクチン （２３９） トリウイルス蛋白質は七面鳥ヘルペスウイ
ルスまたはそのエピトープである第２３６項記載のワク
チン （２４０） 混合物は任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原と抗原
性融合ポリぺプチドの組合せであり、ポリぺプチドは少
なくとも１個のＥｉｍｅｒｉａエピトープが少なくとも
１個の他のポリぺプチドのアミノ酸配列の少なくとも部
分と融合してなる、第２０５項記載のワクチン
【０３５８】（２４１） 他のポリぺプチドはβ−ガラ
クトシダーゼである第２４０項記載のワクチン （２４２） ポリぺプチドはプロキモシンである第２４
０項記載のワクチン （２４３） 抗原性融合ポリぺプチドはベクターｐＢＧ
Ｃ２３によってコードされるポリぺプチドである第２４
０項記載の方法 （２４４） 抗原性融合ポリぺプチドはベクターｐＣＯ
Ｃ１２によってコードされるポリぺプチドである第２４
０項記載の方法 （２４５） 抗原性融合ポリぺプチドはベクターｐＣＯ
Ｃ２０によってコードされるポリぺプチドである第２４
０項記載の方法 （２４６） ワクチンは任意の抗原性融合ポリぺプチド
であり、ポリぺプチドは少なくとも１個のＥｉｍｅｒｉ
ａエピトープが少なくとも１個の他のポリぺプチドのア
ミノ酸配列の少なくとも部分と融合してなる第２０５項
記載のワクチン （２４７） ワクチンは、少なくとも１個のＥｉｍｅｒ
ｉａエピトープを包含する任意の抗原性融合ポリぺプチ
ドの混合物である第２４８項記載のワクチン
【０３５９】文献 １．Ａｌｉ，Ｎ，Ｓ．，Ｂｉｎｎｅｒｔｓ，Ｗ．Ｔ．ａ
ｎｄ Ｋｌｉｍｅｓ，Ｂ．（１９７２）．Ｉｍｍｕｎｉ
ｚａｔｉｏｎ ｂｙ（ｓｉｃ）ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ
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ｔ．１９，１７７． ２．Ａｖｉｖ，Ｈ．ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ，Ｐ．（１９７
２）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｇｌｏｂｉｎｍｅｓｓｅ
ｎｇｅｒ ＲＮＡ ｂｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ ｏｎ ｏｌｉｇｏｔｈｙｍｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ
ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．６９，１４０８． ３．Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．
Ｗ．（１９７７）．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ λ ｇｔ ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｌｏｎｅｓ ｂｙｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｉｎｇｌｅ ｐｌａｑｕｅ
ｓ ｉｎ ｓｉｔｕ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６，１８０
−１８２． ４．Ｂｌｏｂｅｌ，Ｇ．ａｎｄ Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉ
ｎ，Ｂ．（１９７５）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ａｃｒｏｓｓ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ
Ｉ．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ
ａｌｌｙｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｕｎｐｒｏｃｅ
ｓｓｅｄ ｎａｓｃｅｎｔｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉ
ｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎ
ｅ−ｂｏｕｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｏｆ ｍｕｒｉｎ
ｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６７，
８３５−８５１． ５．Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，Ｗ．Ｍ．（１９８１）．“Ｗｅ
ｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ”：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ ｆｒｏｍ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕ
ｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ
ｔｏ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｉｔｒｏ−ｃｅｌｌ
ｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃｄｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ
ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ．
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２，１９５．
【０３６０】６．Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｍ．；Ｈｅｄｉ
ｎ，Ａ．；Ｉｎｇａｎａｅｓ，Ｍ．；Ｈａｅｒｆａｓ
ｔ，Ｂ．；ａｎｄ Ｂｌｏｍｂｅｒｇ，Ｆ．（１９８
５）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ ｔｗｏｓｔｅｐ
ｐｒｐｏｃｅｄｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ｃａｔｉｏｎ ｅ
ｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎ
ｄ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７９（１）８９−９８ ７．Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，
Ａ．Ｌ．（１９８１）．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ
ｔｈｅ ｌｏｎ（ｃａｐＲ）ｇｅｎｅ ｉｎ Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｓ ｔｈｅ ＡＴＰ
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｐｒｏｔｅａ
ｓｅ Ｌａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８，４９３１． ８．Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ａ．，Ｔａｒｖｉｎ，Ｔ．Ｌ．ａ
ｎｄ Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ，Ｂ．Ａ．（１９８
４）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ
ｕｓｉｎｇ ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ ｄｅｒｉｖａｔｉ
ｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｔｈｉｏ
ｃｙａｎａｔｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１６，４８−５９． ９．Ｄａｎｆｏｒｔｈ，Ｈ．Ｄ．（１９８２）．Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆｈｙｂｒｉｄｏｍａｐｒｏｄｕ
ｃｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａ
ｇａｉｎｓｔ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ａｎ
ｄ Ｅ．ｍｉｔｉｓ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６８，
３９２． 10. Ｄａｎｆｏｒｔｈ，Ｈ．Ｄ．（１９８２）．Ｕｓｅ
ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｉｍｅｒｉａ
ｔｅｎｅｌｌａ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ ｔｏ ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎｅ ｓｔａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔ
ｙ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ
ｐａｒａｓｉｔｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｍ Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ
４４，１７２２．
【０３６１】11. Ｄａｎｆｏｒｔｈ，Ｈ．Ｄ．ａｎｄ
Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ Ｐ．Ｃ．（１９８３）．Ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖ
ｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｖａ
ｒｉｏｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ａｖｉａｎ ｃｏ
ｃｃｉｃｉａ．Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６
２，２１４５． 12. Ｄａｖｉｓ，Ｐ，Ｊ．，Ｐａｒｒｙ，Ｓ．Ｈ．ａｎ
ｄ Ｐｏｒｔｅｒ，Ｐ．（１９７８）．Ｔｈｅ ｒｏｌ
ｅ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ＩｇＡ ｉｎ ａｎｔ
ｉ−ｃｏｃｃｉｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｔ
ｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３４，
８７９． 13. Ｄａｖｉｓ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｐｏｒｔｅｒ，Ｐ．
（１９７９）．Ａｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｓｅｃ
ｒｅｔｏｒｙ ＩｇＡ ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｈｉｂｉ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔ
ｉｏｎａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌ
ａ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３６，４７１． 14. Ｅｄｍａｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｇｇ，Ｇ．（１９６
７）．Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ．Ａ
ｕｔｏｍａｔｅｄ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｅｕｒ．
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ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ． 45. Ｍａｒｇｕａｒｄｔ，Ｗ．Ｃ．（１９８０）．Ｈｏ
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ｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６５，
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Ｙｏｒｋ，ｐｐ．４９９−５９９． 47. ＭｃＣａｍａｎ，Ｍ．Ｔ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｗ．
Ｈ．ａｎｄ Ｆｉｌｅｓ，Ｊ．Ｇ．（１９８５）．Ｅｎ
ｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｓａｎｄ ｐｒ
ｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｐｒｏｃｈｙ
ｍｏｓｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２，
１７７． 48. ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｖ．ａｎｄ Ｂａｌｌｉｎｇａ
ｌｌ，Ｓ．（１９８２）．Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｖａｔｉ（：ｍｉｔｉｓ）ｂ
ｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｅｃｏｃｉｏｕ
ｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇ
ｙ ８６，３７１． 49. ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｖ．ａｎｄ Ｂａｌｌｉｎｇａ
ｌｌ，Ｓ．（１９８２）．Ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｓ
ｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉ
ｃｉｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓ
ｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ Ｅｉ
ｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ．Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌｏｇｙ ８６，３６１．
【０３６８】50. ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｖ．ａｎｄ Ｂａ
ｌｌｉｎｇａｌｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｈｉｒｌｅｙ，Ｍ．
Ｗ．（１９８２）．Ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔ
ｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｎ ａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｃｈｉｃ
ｋｅｎｓ ｇｉｖｅｎ ａｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ
ｌｉｎｅ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎ
ａ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ８４，２１． 51. ＭｃＤｏｕｇａｌｄ，Ｌ．Ｒ．Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ
ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ：Ｎｅｗ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｏｎ ｗａｙ．Ｐｏｕｌｔ．Ｄｉｇｅｓｔ．Ｏｃ
ｔ．，１９８１． 52. ＭｃＤｏｕｇａｌｄ，Ｌ．Ｒ．Ｎｅｗ ａｎｔｉｃ
ｏｃｃｉｄｉａｌ ｄｒｕｇｓ：Ｂｅｔｔｅｒ ｔｈｉ
ｎｇｓ ｔｏ ｃｏｍｅ ｏｒ“ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ
ｓｐｅｃｉｅｓ？”Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ Ａｕｇ．
１５，１９８３． 53. Ｍｉｌｌａｒ，Ｗ．Ｔ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．
Ｆ．Ｂ．（１９８３）．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｏｄｉｎａ
ｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＩＯＤＯ−ＧＥＮTM．Ｉｎｔ．
Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｒａｄｉｏｔ．Ｉｓｏｌ．３４，６３
９． 54. Ｍｉｌｌａｒ，Ｌ．Ｈ．，Ｍａｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，
Ｄｖｏｒａｋ，Ｊ．Ａ．，ＭｃＧｉｎｎｉｓｓ，Ｍ．
Ｈ．，ａｎｄ Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｉ．Ｋ．（１９７５）
Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｆ
（Ｐｌａｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）Ｍａｌａｒ
ｉａ：Ｄｕｆｆｙ ｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐ ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９，５６１． 55. Ｍｉｌｌａｒ，Ｊ．Ｈ．ｅｄ．（１９７２）．Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ ５４ ａ
ｎｄ ４３１． 56. Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ，Ｊ．，Ｋｅｍｐｅ，Ｔ．ａｎ
ｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８３）．Ｃｏｎｓｔｒ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍ１３ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ．Ｇｅｎｅ ２６，１０１．
【０３６９】57. Ｒｅｉｄ，Ｗ．Ｍ．（１９７８）．ｐ
ｒｏｔｏｚｏａ．Ｉｎ：Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｏ
ｕｌｔｒｙ．７ｔｈ ｅｄ．Ｍ．Ｓ．Ｈｏｆｓｔａｄ，
ｅｄ．Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ．
ｐｐ．９４２−１０５４． 58. Ｒｉｌｅｙ，Ｊ．Ｆ．（１９８０）．Ｓｃｒｅｅｎ
ｉｎｇ ｆｏｒ ａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｎｔｉｃｏｃｃｉｄｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｄ
ｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｃｈｅｍｏ．１７，１． 59. Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｅ．（１９７４）．Ｉｍｍｕｎｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｉｍｅｒｉａ：
Ｒｅｃｅｎｔ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ．Ｓｙｍｐ
ｏ．Ｃｏｃｃｉｄｉａ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｏｒ
ｇａｎｉｓｍｓ．ｐｐ．９２−１１８．Ｕｎｉｖ．Ｇｕ
ｅｌｐｈ，Ｏｎｔａｒｉｏ． 60. Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ Ｈｅｓｋｅｔｈ（１９
７６）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓ
ｉｓ：Ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｃｙｃ
ｌｅ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ ｗｈｉｃ
ｈ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｄ ａｒｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ
ｂｙ ｔｈｅ ｈｏｓｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ
２７：２５−３７． 61. Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔ
ｔ，Ｇ．Ｎ．（１９８２）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒ ｈｙｂｒｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍ
ｕｔａｎｔｓ ｔｈａｔ ａｌｔｅｒ ｔｈｅ−３５
ｔｏ−１０ ｓｐａｃｉｎｇ．Ｇｅｎｅ ２０，２３１
−２４３．
【０３７０】62. Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ａｎｄ Ｃｏｕｌ
ｓｏｎ，Ａ．Ｒ．（１９７８）．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ
ｔｈｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ
ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ．８７，１０７−１１０． 63. Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｊ．，ＭａｃＨａｔｔｉｅ，
Ｌ．，Ｅｒｏｎ，Ｌ．，Ｉｈｌｅｒ，Ｇ．，Ｉｐｐｅ
ｎ，Ｋ．Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ｊ．，Ａｒｄｉｔｔｉ，
Ｒ．，Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｗ．，ａｎｄ ＭａｃＧｉ
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Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ８１，５２５． 68. Ｓｈｉｒｌｅｙ，Ｍ．Ｗ．，Ｂｅｌｌａｔｔｉ，
Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｍｉｌｌａｒｄ，Ｂ．Ｊ．（１９８
２）．Ａｎ ｅｇｇ−ｓｈａｐｅｄ（ａｔｔｅｎｕａｔ
ｅｄ）ｌｉｎｅ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒ
ｉｘ：ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｉｔｓ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉ
ｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｐａｒ
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Ｓｃｈｅｎｋｅｌ，Ｒ．Ｈ．（１９８３）．Ｅｆｆｅ
ｃｔｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＩｇＧ ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌ
ａ（ｃｏｃｃｉｄｉａ）ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ．Ｊ．
Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６９，７７５． 70. Ｓｐｅｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｗｏｎｇ，Ｒ．Ｂ．ａｎｄ
Ｓｃｈｅｎｋｅｌ，Ｒ．Ｈ．（１９８３）．Ｕｌｔｒ
ａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓｆｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｔｅｓ ｏｆ
Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ｏｏｃｙｓｔｓ，
ｓｐｏｒｏｃｙｓｔｓ ａｎｄ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ
ｓ．Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏａｌ．３０，５４８． 71. Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｆ．，Ｑｕｉｎｎ，Ｐ．
Ｓ．，Ｃｈａｎ，Ｓ，Ｊ．，Ｍａｒｓｈ，Ｊ．ａｎｄ
Ｔａｇｅｒ，Ｈ．Ｓ．（１９８０）．Ｐｒｏｃｅｓｓｉ
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【０３７２】72. Ｓｔｏｔｉｓｈ，Ｒ．Ｌ．，Ｗａｎ
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ｈｅｍ．２５１，３０２． 73. Ｓｔｏｔｉｓｈ，Ｒ．Ｌ．，Ｐｒｏｆｏｕｓ−Ｊｕ
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Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４１，２４４．
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、微小配列決定により決定したＥ．ｔｅ
ｎｅｌｌａ（ＴＡ４）抗原の１７，０００ダルトンポリ
ぺプチドのアミノ酸配列である。図１はまた種々の化学
的および酵素的消化により生成した重複ぺプチドも示し
ている。図中、＞はぺプチド配列は連続しているかもし
れないが、追跡するには弱すぎることを、｝はぺプチド
のＣ末端を示している。（ ）はＤＮＡ配列によって確
認された考えられるアミノ酸である。′は二次配列を示
す。ＣＮはシアノゲンブロミドフラグメント、ＣＨはカ
イモトリプシンフラグメント、ＲはＡｒｇ−Ｃフラグメ
ント、ＶはＶ８フラグメント、ＰＡＲはピログルタメー
トアミノぺプチダーゼ処理１７ｋｄ蛋白質である。
【図２】図２は、ＴＡ４抗原をコードするＥ．ｔｅｎｅ
ｌｌａゲノムクローン１０８−１の制限酵素地図であ
る。図２はまた、５，５００ｂｐ Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ
ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメント内のＴＡ４抗原遺伝子
の位置および方向性も示している。示されたＰｓｔＩお
よびＢａｌＩ部位は最も右側の部位であるが、唯一の部
位ではない。ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｒｕＩ、Ｓａ
ｌＩ、ＳｍａＩおよびＰｖｕＩの部位はない。
【図３Ａ】図３Ａは、図２に示したゲノムクローン１０
８−１のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントの
ＤＮＡヌクレオチド配列である。さらに図３には、シグ
ナルぺプチドならびにＴＡ４抗原の１７，０００ダルト
ンおよび８，０００ダルトンポリぺプチドのアミノ酸配
列も示す。図３には、遺伝子内のイントロンも示す。図
中、＊は１７，０００ダルトンぺプチドの最先アミノ酸
を、＊＊は１７，０００ダルトンぺプチドの最終アミノ
酸を、＋は８，０００ダルトンぺプチドの最先アミノ酸
を、＋＋は８，０００ダルトンぺプチドの最終アミノ酸
を示す。不明確な塩基については、３，４，５，６はそ
れぞれＣ，Ｔ，Ａ，Ｇと考えられる；７，８，９，０は
それぞれ多分Ｃ，Ｔ，Ａ，Ｇ；ＲはＡまたはＧ，ＹはＣ
またはＴ，ＪはＣまたはＡ，ＫまたはＴまたはＧ，Ｌは
ＴまたはＡ，ＭはＣまたはＧを意味する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図２に示したゲノムクローン１０
８−１のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントの
ＤＮＡヌクレオチド配列である。さらに図３には、シグ
ナルぺプチドならびにＴＡ４抗原の１７，０００ダルト
ンおよび８，０００ダルトンポリぺプチドのアミノ酸配
列も示す。図３には、遺伝子内のイントロンも示す。図
中、＊は１７，０００ダルトンぺプチドの最先アミノ酸
を、＊＊は１７，０００ダルトンぺプチドの最終アミノ
酸を、＋は８，０００ダルトンぺプチドの最先アミノ酸
を、＋＋は８，０００ダルトンぺプチドの最終アミノ酸
を示す。不明確な塩基については、３，４，５，６はそ
れぞれＣ，Ｔ，Ａ，Ｇと考えられる；７，８，９，０は
それぞれ多分Ｃ，Ｔ，Ａ，Ｇ；ＲはＡまたはＧ，ＹはＣ
またはＴ，ＪはＣまたはＡ，ＫまたはＴまたはＧ，Ｌは
ＴまたはＡ，ＭはＣまたはＧを意味する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図２に示したゲノムクローン１０
８−１のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントの
ＤＮＡヌクレオチド配列である。さらに図３には、シグ
ナルぺプチドならびにＴＡ４抗原の１７，０００ダルト
ンおよび８，０００ダルトンポリぺプチドのアミノ酸配
列も示す。図３には、遺伝子内のイントロンも示す。図
中、＊は１７，０００ダルトンぺプチドの最先アミノ酸
を、＊＊は１７，０００ダルトンぺプチドの最終アミノ
酸を、＋は８，０００ダルトンぺプチドの最先アミノ酸
を、＋＋は８，０００ダルトンぺプチドの最終アミノ酸
を示す。不明確な塩基については、３，４，５，６はそ
れぞれＣ，Ｔ，Ａ，Ｇと考えられる；７，８，９，０は
それぞれ多分Ｃ，Ｔ，Ａ，Ｇ；ＲはＡまたはＧ，ＹはＣ
またはＴ，ＪはＣまたはＡ，ＫまたはＴまたはＧ，Ｌは
ＴまたはＡ，ＭはＣまたはＧを意味する。
【図４】図４は、モノクロナール抗体Ｐｔｎ９．９Ｄ１
２と免疫反応性を示す１７，０００ダルトンサブユニッ
トの出現によって測定した、胞子形成時のＴＡ４抗原の
出現を示している。
【図５Ａ】図５Ａは、ＴＡ４蛋白質をコードするＥ．ｔ
ｅｎｅｌｌａゲノムクローン１０８−１のＢｇｌＩＩ−
ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントのＤＮＡヌクレオチド
配列である。シグナルぺプチドならびに胞子小体の膜中
に生じるＴＡ４抗原の１７，０００および８，０００ダ
ルトンポリぺプチド成分のアミノ酸配列も示す。また、
遺伝子内のイントロンならびにハイブリダイゼーション
によりｍＲＮＡを同定するために用いられるＳａｃＩ−
ＰｖｕＩＩ ＤＮＡおよびＴＡ４蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡクローンも示す。図中の記号および不明確な塩基
の表示は図３の場合と同じである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＴＡ４蛋白質をコードするＥ．ｔ
ｅｎｅｌｌａゲノムクローン１０８−１のＢｇｌＩＩ−
ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントのＤＮＡヌクレオチド
配列である。シグナルぺプチドならびに胞子小体の膜中
に生じるＴＡ４抗原の１７，０００および８，０００ダ
ルトンポリぺプチド成分のアミノ酸配列も示す。また、
遺伝子内のイントロンならびにハイブリダイゼーション
によりｍＲＮＡを同定するために用いられるＳａｃＩ−
ＰｖｕＩＩ ＤＮＡおよびＴＡ４蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡクローンも示す。図中の記号および不明確な塩基
の表示は図３の場合と同じである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＴＡ４蛋白質をコードするＥ．ｔ
ｅｎｅｌｌａゲノムクローン１０８−１のＢｇｌＩＩ−
ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントのＤＮＡヌクレオチド
配列である。シグナルぺプチドならびに胞子小体の膜中
に生じるＴＡ４抗原の１７，０００および８，０００ダ
ルトンポリぺプチド成分のアミノ酸配列も示す。また、
遺伝子内のイントロンならびにハイブリダイゼーション
によりｍＲＮＡを同定するために用いられるＳａｃＩ−
ＰｖｕＩＩ ＤＮＡおよびＴＡ４蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡクローンも示す。図中の記号および不明確な塩基
の表示は図３の場合と同じである。
【図６】図６は、ＴＡ４遺伝子のゲノムクローンからの
内部制限フラグメントのハイブリダイゼーションにより
測定した、胞子形成時におけるＴＡ４抗原ｍＲＮＡの出
現を示す。
【図７】図７は、ＴＡ４抗原をコードするｃＤＮＡクロ
ーンｐＴＣＤ２６のＤＮＡ配列を示す。
【図８】図８は、発現ベクターｐＷＨＡ６３の構築、な
らびに発現ベクターｐＤＥＴ１およびｐＤＥＴ２を生成
するためのｃＤＮＡクローンｐＴＣＤ２６からのＤＮＡ
の発現ベクターｐＷＨＡ６３への挿入を図式的に示した
ものである。
【図９】図９は、大腸菌のＬｏｎ+ 対Ｌｏｎ- プロテア
ーゼ欠損株内でのｐＤＥＴ１／ｐＤＥＴ２蛋白質の産生
を示す、ｐＤＥＴ１およびｐＤＥＴ２蛋白質の分析図で
ある。ＡはｐＤＥＴ１の染色ゲル法、ＢはｐＤＥＴ１の
免疫ブロット法、ＣはｐＤＥＴ２の染色ゲル法により分
析結果である。
【図１０】図１０は、ｃＤＮＡ誘導抗原性ポリぺプチド
をコードする配列の５′末端にｌａｃＺ遺伝子の３′末
端を融合した発現ベクターｐＢＧＣ２３の構築を図式的
に示したものである。
【図１１】図１１は、大腸菌内でのｐＢＧＣ２３蛋白質
の産生を示す図である。ｐＢＧＣ２３蛋白質のＡは染色
ゲル法、Ｂは免疫ブロット法による分析結果を示す。
【図１２】図１２は、ウシ プロキモシン発現ベクター
ｐＷＨＡ９３の構築を図式的に示したものである。
【図１３】図１３は、ｃＤＮＡ誘導抗原性ポリぺプチド
をコードする配列の５′末端に、ウシプロキモシンをコ
ードする配列の３′末端を融合させることによるｐＣＯ
Ｃ１２の構築を図式的に示したものである。図１３に
は、ｐＣＯＣ１２からのｐＣＯＣ２０の誘導も示す。
【図１４】図１４は、大腸菌内でのＥＣＯＣ１２および
ｐＣＯＣ２０蛋白質の産生を示す。Ａは染色ゲル法、Ｂ
は免疫ブロット法によるＰＣＯＣ１２蛋白質の、Ｃは染
色ゲル法によるＰＣＯＣ２０蛋白質の分析結果を示す。
【図１５】図１５は、ＴＡ４抗原および再正常化細菌Ｔ
Ａ４蛋白質のモノクロナール抗体Ｐｔｎ７．２Ａ４／４
との免疫反応性をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図１６】図１６は、ＮＡ４抗原をコードするＥ．ｎｅ
ｃａｔｒｉｘゲノムクローン７−４９の制限酵素地図、
ならびにＮＡ４抗原の遺伝子の３９００ｂｐ Ｅ．ｎｅ
ｃａｔｒｉｘ ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメント内にお
ける位置および方向性を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、図１６に示したゲノムクロー
ン７−４９の２４４０塩基のＤＮＡヌクレオチド配列を
示す。この配列は、図１６に示した全ＨｉｎｄＩＩＩ−
ＢａｌＩ領域を包含する。また、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ
ＮＡ４抗原について推測されるアミノ酸配列も示す。
図中、シトシン、チミン、アデニン、グアニンは、それ
ぞれ確定的なものをＣ，Ｔ，Ａ，Ｇで、考えられるもの
を３，４，５，６で、不明のものはＮで、ＣまたはＡは
Ｊで、ＴまたはＡはＬで表示した。＊は１８，０００ダ
ルトンぺプチドの最先アミノ酸と考えられるものを、＊
＊は１８，０００ダルトンぺプチドの最終アミノ酸と考
えられるものを、＋は８，０００ダルトンぺプチドの最
先アミノ酸と考えられるものを表示している。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、図１６に示したゲノムクロー
ン７−４９の２４４０塩基のＤＮＡヌクレオチド配列を
示す。この配列は、図１６に示した全ＨｉｎｄＩＩＩ−
ＢａｌＩ領域を包含する。また、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ
ＮＡ４抗原について推測されるアミノ酸配列も示す。
図中、シトシン、チミン、アデニン、グアニンは、それ
ぞれ確定的なものをＣ，Ｔ，Ａ，Ｇで、考えられるもの
を３，４，５，６で、不明のものはＮで、ＣまたはＡは
Ｊで、ＴまたはＡはＬで表示した。＊は１８，０００ダ
ルトンぺプチドの最先アミノ酸と考えられるものを、＊
＊は１８，０００ダルトンぺプチドの最終アミノ酸と考
えられるものを、＋は８，０００ダルトンぺプチドの最
先アミノ酸と考えられるものを表示している。
【図１８】図１８は、ＴＡ４およびＮＡ４抗原間のアミ
ノ配列の相同性を示す図である。図中、＊は相同のアミ
ノ酸を、＋はＥ．ｔｅｎｅｌｌａ Ａ４抗原の１７，０
００ダルトンポリぺプチド成分の最初を、§はＥ．ｔｅ
ｎｅｌｌａ Ａ４抗原の８，０００ダルトンポリぺプチ
ド成分の最初を表示している。Ｃ＝Ｃｙｓ，Ｈ＝Ｈｉ
ｓ，Ｉ＝Ｉｌｅ，Ｍ＝Ｍｅｔ，Ｓ＝Ｓｅｒ，Ｖ＝Ｖａ
ｌ，Ａ＝Ａｌａ，Ｇ＝Ｇｌｙ，Ｌ＝Ｌｅｕ，Ｐ＝Ｐｒ
ｏ，Ｔ＝Ｔｈｒ，Ｆ＝Ｐｈｅ，Ｒ＝Ａｒｇ，Ｙ＝Ｔｙ
ｒ，Ｗ＝Ｔｒｐ，Ｄ＝Ａｓｐ，Ｎ＝Ａｓｎ，Ｂ＝Ａｓ
ｘ，Ｅ＝Ｇｌｕ，Ｑ＝Ｇｌｎ，Ｚ＝Ｇｌｘ，Ｋ＝Ｌｙｓ
である。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａアミノ酸配列中のスペース
はＥ．ｔｅｎｅｌｌａ配列に比べてＥ．ｎｅｃａｔｒｉ
ｘ配列中に付加的アミノ酸があることを、Ｅ．ｎｅｃａ
ｔｒｉｘアミノ酸配列中のスペースは、Ｅ．ｔｅｎｅｌ
ｌａ配列に比べてＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ配列中にはその
アミノ酸がないことを示す。
【図１９】図１９は、それぞれＴＡ４およびＮＡ４抗原
をコードするＥ．ｔｅｎｅｌｌａおよびＥ．ｎｅｃａｔ
ｒｉｘ遺伝子内の３個のイントロンの相同性を示す図で
ある。図中、＊は相同の塩基を示す。Ｅ．ｔｅｎｅｌｌ
ａ ＤＮＡ配列中のスペースはＥ．ｔｅｎｅｌｌａ配列
に比べてＥ．ｎｅｃａｔｒｉｘ配列中に付加的塩基があ
ることを、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ ＤＮＡ配列中のスペ
ースはＥ．ｔｅｎｅｌｌａ配列に比べてＥ．ｎｅｃａｔ
ｒｉｘ配列中にそのアミノ酸がないことを示す。不明確
な塩基について、４はＴと考えられる、７は多分Ｃ，Ｌ
はＴまたはＡを表示する。
【図２０】図２０は、組換えベクターｐＳＭＡＣの構築
を図式的に示している。
【図２１】図２１は、組換えベクターｐＳＳ３３の構築
を図式的に示している。
【図２２】図２２は、組換えベクターｐＮＣＤの構築を
図式的に示している。
【図２３Ａ】図２３Ａは、発現ベクターｐＴＤＳ１
（Ａ）およびｐＴＤＳ２（Ｂ）の構築を図式的に示して
いる。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、発現ベクターｐＴＤＳ１
（Ａ）およびｐＴＤＳ２（Ｂ）の構築を図式的に示して
いる。
【図２４Ａ】図２４Ａは、発現ベクターｐＤＤＳ１
（Ａ）およびｐＤＤＳ２（Ｂ）の構築を図式的に示して
いる。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、発現ベクターｐＤＤＳ１
（Ａ）およびｐＤＤＳ２（Ｂ）の構築を図式的に示して
いる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:90） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ８０７４９７ (32)優先日 1985年12月11日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 トーマス シー．ゴアー アメリカ合衆国アイオワ州チヤールズ シ イテイ，ヒルドレス ストリート 1106 (72)発明者 レイ − ジエン チヤング アメリカ合衆国カリフオルニア州フオスタ ー シイテイ，セント クロイツクス レ ーン 602 (72)発明者 ジヨン エル．テデスコ アメリカ合衆国ミズーリ州セント ピータ ーズ，ノベラ ドライブ ５ (72)発明者 ウイリアム エツチ．アンドリユーズ アメリカ合衆国カリフオルニア州ベルモン ト，ジエラルダイン ウエイ 1210，アパ ートメント 201 (72)発明者 ゲイリイ アール．ピーターセン アメリカ合衆国アイオワ州チヤールズ シ イテイ，セカンド アベニユー 210 (72)発明者 アイリーン クーン アメリカ合衆国カリフオルニア州サンフラ ンシスコ，アツシユベリイ 625，アパー トメント 12 (72)発明者 バージニア エム．ブラザーズ アメリカ合衆国カリフオルニア州アルバニ イ，ペラルタ アベニユー 988 (72)発明者 マイクル テイー．マツキヤマン アメリカ合衆国カリフオルニア州サン ブ ルノ，チエリイ アベニユー 746 (72)発明者 ジエームス ジー．フイルズ アメリカ合衆国カリフオルニア州ベルモン ト，リヨン アベニユー 1911 (72)発明者 ステイシイ アール．シアス アメリカ合衆国カリフオルニア州サン ア ンセルモ，カールソン コート 37 (72)発明者 アール．エム．ノードグレン アメリカ合衆国アイオワ州チヤールズ シ テイ，ルーラル ルート １ (72)発明者 イー．エイ．ドラゴン アメリカ合衆国カリフオルニア州オリン ダ，パーク レーン ドライブ 42

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａから誘
    導される抗原性蛋白質、すなわち分子量約２５，０００
    ダルトンであって、ジスルフィド結合により結合した２
    個のポリペプチドから構成され、その一方のポリペプチ
    ドは分子量約１７，０００ダルトンでＮ末端アミノ酸が
    遮閉されていることを特徴として以下に示すアミノ酸配
    列を有し、他方のポリペプチドは分子量約８，０００ダ
    ルトンで以下に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコー
    ドし、以下に示す核酸配列を有する単離ゲノムＤＮＡ。 【化１】
  2. 【請求項２】 分子量約２５，０００ダルトンで、以下
    に示す連続アミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドを
    コードするｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子のような核
    酸分子。 【化２】
  3. 【請求項３】 分子量約２６，０００ダルトンで、ジス
    ルフィド結合により結合した２個のポリペプチドから構
    成され、その一方のポリペプチドは分子量約１８，００
    ０ダルトンでＮ末端アミノ酸が遮閉されていることを特
    徴とし、他方のポリペプチドは分子量約８，０００ダル
    トンであり、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘまたは
    Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に対する防御機
    構を付与する免疫応答を鶏に誘導することができ、以下
    に示すアミノ酸配列を有する精製抗原性蛋白質。 【化３】
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の蛋白質の少なくとも一
    部をコードするｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子のよう
    な核酸分子、あるいは分子量約２６，０００ダルトンで
    ジスルフィド結合により結合した２個のポリペプチドか
    ら構成され請求項３に記載のアミノ酸配列を有する抗原
    性蛋白質をコードするｍＲＮＡ分子。
  5. 【請求項５】 請求項３に記載の抗原性蛋白質、 またはＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの感染に対する
    防御機構を付与する免疫応答を付与することができる抗
    原性ポリペプチドであって、 分子量約２５，０００ダルトンであって請求項２に記載
    のアミノ酸配列を有するポリペプチド；分子量約１３
    ５，０００ダルトンのポリペプチドであって、分子量約
    ２５，０００ダルトンで請求項２に記載のアミノ酸配列
    を有する上記ポリペプチド及びその配列のアミノ末端に
    おけるβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列から構成さ
    れるポリペプチド；分子量約６５，６００ダルトンのポ
    リペプチドであって、分子量約２５，０００ダルトンで
    請求項２に記載のアミノ酸配列を有する上記ポリペプチ
    ド及びその配列のアミノ末端におけるプロキモシンのア
    ミノ酸配列から構成されるポリペプチド；及び、 分子量約５６，５００ダルトンのポリペプチドであっ
    て、分子量約２５，０００ダルトンで請求項２に記載の
    アミノ酸配列を有する上記ポリペプチド及びその配列の
    アミノ末端におけるプロキモシンのアミノ酸配列であっ
    てプロキモシンの天然配列から８３個のアミノ酸が欠失
    しているアミノ酸配列から構成されるポリペプチド；か
    らなる群より選ばれる抗原性ポリペプチド、 をコードするＤＮＡ分子。
  6. 【請求項６】 請求項３に記載の抗原性ポリペプチドの
    １種または２種以上の免疫感作有効量と医薬的に許容さ
    れる担体を１回用量として含有するＥｉｍｅｒｉａ ｎ
    ｅｃａｔｒｉｘの感染に対する能動免疫を鶏に付与する
    ワクチン。
  7. 【請求項７】 請求項３に記載の抗原性ポリペプチドの
    １種または２種以上に加えて、更に投与動物にＥｉｍｅ
    ｒｉａ抗原に対する抗体の産生を誘発するのに有効な量
    の任意のＥｉｍｅｒｉａ抗原またはエピトープを１回用
    量として含有する、Ｅｉｍｅｒｉａが原因となる疾患に
    対する多価ワクチンである請求項６のワクチン。
  8. 【請求項８】 コクシジウム症の治療のための請求項６
    又は７のワクチン。
  9. 【請求項９】 Ｅｉｍｅｒｉａ抗原は、Ｅ．ｔｅｎｅｌ
    ｌａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘまたは
    他の任意のＥｉｍｅｒｉａの種の抗原である請求項７の
    ワクチン。
  10. 【請求項１０】 Ｅｉｍｅｒｉａ抗原は、少なくとも１
    種のＥｉｍｅｒｉａエピトープからなる１種または２種
    以上の遺伝子操作抗原性融合ポリペプチドである請求項
    ７のワクチン。
  11. 【請求項１１】 医薬的に許容される担体は免疫増強剤
    を含有する請求項６から１０のいずれかのワクチン。
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