DE68914043T2

DE68914043T2 - Coccidiosis-Vakzin.

Info

Publication number: DE68914043T2
Application number: DE68914043T
Authority: DE
Inventors: Rein Dijkema; Jacobus Johannes Kok; Arno Vermeulen
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1988-06-27
Filing date: 1989-06-23
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2009-06-24
Also published as: HUT51327A; KR970007376B1; JPH0260587A; ES2053950T3; NZ229679A; US5783197A; AU3706989A; ZA894726B; JP3086227B2; TW204368B; AU621903B2; DE68914043D1; EP0349071A1; US5602033A; HU212506B; EP0349071B1; KR910001050A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein DNS-Fragment und ein Eimeria-Polypeptid, das von diesem DNS-Fragment codiert wird, rekombinante DNS, die dieses besondere DNS-Fragment enthält, Wirtszellen mit dieser rekombinanten DNS und Impfstoffe gegen Kokzidiose, die auf diesen Produkten basieren.
Kokzidiose ist eine Krankheit, die durch intrazelluläre Parasiten, Protozoen, des Unterstammes der Apicomplexa und der Gattung Eimeria, verursacht wird. Diese Parasiten vermehren sich in Zellen, die einen Teil des Gastrointestinaltraktes und der Verdauungsorgane ihres Wirtes bilden.
Aufgrund der ansteigenden, intensiven Produktion, ist der Schaden, der durch diese Parasiten in der Geflügelindustrie entsteht, in den letzten Jahrzehnten alarmierend angestiegen. Die Verluste, die die Geflügelfarmen in den Niederlanden jährlich erleiden, belaufen sich auf Millionen von Gulden, der Verlust im Jahre 1986 belief sich auf 13 Millionen Gulden. Im gleichen Jahr hatten die Vereinigten Staaten einen Verlust von 300 Millionen US$ zu verzeichnen, trotz des Gebrauchs von Kokzidiostatika.
Die pathogenen Arten der Kokzidiose in Hühnern können in 9 verschiedene Arten unterteilt werden, z.B. Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, E. mivati und E. hagani. Einige Leute zweifeln jedoch die Existenz der letzten beiden Arten an. Alle diese Arten haben nur das Huhn als Wirt und zeigen einen hohen Grad an Gewebespezifität. Die Lebenszyklen der genannten Arten sind jedoch gleich.
Die Arten unterscheiden sich in ihrem pathogenen Effekt auf Hühner, die Art Huhn spielt ebenfalls eine Rolle; Junghühner wird daher ein grosser Schaden durch Parasiten wie E. acervulina oder E. maxima zugefügt, weil diese in grossen Teilen des Dünndarms parasitieren, wo die Verdauung der Nahrung eine Hauptrolle spielt.
Während des Lebenszyklus durchlaufen die Parasiten eine Anzahl von Stufen. Die infektiöse Stufe (die sporulierende Oozyste) wird oral aufgenommen und gelangt in den Magen des Huhns, wo die Schale der Zyste als Ergebnis der mahlenden Bewegung aufplatzt. Die vier Sporozysten, die die Oozyste enthält, werden entlassen und gelangen in das Duodenum, wobei sie Galle und Verdauungsenzymen ausgesetzt sind. Als Ergebnis entsteht eine Oeffnung in der Sporozystenwand und die Sporozoiten, die sich in den Sporozyste befinden, werden frei. Diese Sporozoiten sind beweglich und suchen nach geeigneten Wirtszellen, z.B. Epithelzellen, um dort einzudringen und sich zu vermehren. Je nach Art dauert diese erste Reproduktionsphase 20 bis 48 Stunden und ein Vielfaches von zehn bis hundert Merozoiten werden gebildet, die wiederum in neue Wirtszellen eindringen und sich dort vermehren. Nach zwei bis manchmal fünf dieser asexuellen Vermehrungszyklen, wächst der intrazelluläre Merozoit in sexuelle Formen, die männlichen und weiblichen Gametozyten. Nach der Befruchtung einer weiblichen durch eine männliche Gamete, bildet sich eine Zygote, die eine Zystenwand um sich herum bildet. Diese Oozyste verlässt die Wirtszelle und wird mit der Fäzes ausgetrieben. Falls die Temperatur und Feuchtigkeit ausserhalb des Huhns relativ hoch ist und, zur gleichen Zeit sich genügend Sauerstoff in der Luft befindet, sporuliert die Oozyste in das infektiöse Stadium.
Es wird daher kein Zwischenwirt für die Uebertragung von Huhn zu Huhn benötigt.
Es ist daher verständlich, dass mit einem hohen Grad der Besetzung der zur Verfügung stehenden Oberfläche der Infektionsdruck in einer Geflügelfarm schnell ansteigt.
Der Parasit kann auf verschiedene Weisen bekämpft werden.
Neben einem guten Management kann der Kokzidiose mit bekämpfenden Mitteln entgegnet werden, die häufig dem Futter oder dem Trinkwasser beigemischt werden. Jedoch haben diese Mittel in den letzten Jahren eine Abnahme in ihrer Wirksamkeit erlitten, zum Teil wegen der hohen genetischen Kapazität der Parasiten, Resistenz gegen verschiedene Behandlungsmittel zu entwickeln. Auch hinterlassen einige dieser Mittel Rückstände in dem Fleisch, was Anlass zu Problemen bei dem Konsum geben kann.
Immunologische Prophylaxe würde daher eine viel bessere Behandlungsmethode darstellen. Es ist bekannt, dass Hühner, die eine genügend hohe Infektion durchlebt haben, in der Lage sind, einen nachfolgenden Kontakt mit der gleichen Art Eimeria zu widerstehen. Resistenz gegen Eimeria kann auch durch mehrmaliges Infizieren der Vögel mit niedrigen Dosen von Oozysten oder mit Oozysten abgeschwächter (nicht-pathogener) Stämme entstehen. Jedoch ist die kontrollierte Verabreichung an eine insbesonders grosse Zahl von Schlachthühnern ein in diesem Fall nahezu unüberwindbares Problem. Inaktivierte Impfstoffe scheinen daher die einzige verbleibende Lösung zu sein.
Ein inaktivierter Impfstoff kann aus einem von dem Parasiten stammenden Antigen bestehen, gegebenenfalls mit einem Adjuvans.
Als Alternative zu einem aus einem Parasiten isolierten Antigen, ist es möglich, ein Produkt zu verwenden, das mit Hilfe der rekombinanten Gentechnologie hergestellt wurde, einer Technologie die gemäss bekannter Methoden ausgeführt werden kann.
Darüberhinaus kann die Impfung durch Verabreichung eines lebenden Wirtsorganismus, wie ein Bakterium, ein Pilz oder ein Virus, durchgeführt werden, in den ein das Antigen codierendes Gen inkorporiert wurde. Dieser Organismus gewährleistet eine adäquate Langzeit-Synthese des Antigens, so dass das Immunsystem der Hühner adäquat stimuliert wird.
Zur gleichen Zeit ist es möglich, das Antigen oder Teile davon synthetisch zu reproduzieren und diese den Vögeln in einer immunologisch erkennbaren und stimulierenden Form, z.B. an ein Trägerprotein gebunden, in der Gegenwart eines Adjuvans zu verabreichen.
Gemäss der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein Polypeptid oder ein immunogenes Aequivalent oder einen Teil davon, das von einem Desoxynukleotid codiert wird, das von E. acervulina abstammt und sich als Insert in dem Plasmid pEa1A befindet, mit dem der Escherichia coli-Stamm K12JA221 transformiert worden ist, der in dem "Centraal Bureau voor Schimmelcultures", Baarns (Niederlande) unter der Hinterlegungssnummer CBS 143.88 hinterlegt worden ist, zur Immunisierung von Geflügel gegen Kokzidiose zu verwenden.
Ueberdies umfasst die vorliegende Erfindung auch den Gebrauch eines Polypeptids einer Eimeria-Spezies oder eines immunologischen Aequivalents oder Teils davon zur Immunisierung von Geflügel gegen Kokzidiose, das von einem Desoxypolynukleotid codiert wird, das von E. acervulina stammt und das mit der eingefügten Desoxypolynukleotidsequenz hybridisiert.
Das obengenannte Plasmid pEaA1 wird mit den in dem experimentellen Teil beschriebenen Methoden hergestellt, die hier mit Hilfe der Figur 1 schematisch erklärt werden.
Der Phage λgt11 (Ref. 4) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI behandelt, für das er eine einzelne Restriktionsstelle besitzt. Eine cDNS, die auf der Basis von E. acervulina-mRNS hergestellt wurde, wird in diese Restriktionsstelle eingefügt: λgt11Ea1A. Nach Behandlung mit den Restriktionsenzymen KpnI und SacI wird ein Phagenfragment von dem so erhaltenen rekombinanten Phagen isoliert, wobei das Fragment aus der genannten DNS und flankierenden DNS-Abschnitten besteht, die von der Umgebung der EcoRI-Restriktionsstelle im LacZ-Gen von λgt11 stammen. Das Plasmid pUC18 (Ref. 6) wird gleichermassen mit KpnI und SacI behandelt und dann mit dem zuvor genannten Phagenfragment cDNA:pUC18/Ea1A ligiert.
Die Nukleotidsequenz, die für den cDNS-Abschnitt dieser Insertion bestimmt wird, ist in Figur 2 gezeigt, ebenso die hiervon abgeleitete Aminosäurensequenz.
Es ist bekannt, dass eine gegebene Aminosäure häufig durch verschiedene Codone (Tripletts aus Nukleotidbasen) in der DNS codiert wird. Demgemäss ist das Codon für Glu (Glutaminsäure) ein GAT oder GAA, etc. Es ist offensichtlich, dass für die Expression des Polypeptids mit der Figur 2 entsprechenden Aminosäurensequenz (oder einem Fragment davon) auch Gebrauch von einer DNS mit einer gleichen alternativen Codonzusammensetzung gemacht werden kann.
Für die Expression des Polypeptids gemäss der Erfindung, kann auch von einem DNS-Fragment Gebrauch gemacht werden, das durch Isolation von genomischer DNS oder cDNS von Eimeria-Spezies erhalten wird, welche, gemäss den bekannten Techniken unter stringenten Bedingungen mit dem cDNS-Abschnitt des Plasmids Ea1A hybridisiert. Falls erwünscht, kann ein DNS-Fragment dieses Typs, zusätzlich zu dem gerade genannten cDNS-Abschnitt, zusätzliche flankierende DNS- Stücke enthalten, die ein Polypeptid codieren.
DNS-Fragmente dieses Typs, die durch Hybridisierung erhalten werden, und auch rekombinante DNS-Moleküle, die diese Fragmente enthalten, bilden gleichermassen einen Teil dieser Erfindung.
Polypeptide, die von diesen DNS-Fragmenten codiert werden und schützende, immunisierende Eigenschaften haben, bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Zusätzlich bilden Fragmente dieses Polypeptids, die für die Immunisierung von Geflügel gegen Kokzidiose angewendet werden können, einen Teil der Erfindung. Verschiedene Methoden, solche brauchbaren Polypeptidfragmente (genannt Epitope) in einer bekannten oder unbekannten Aminosäurensequenz zu identifizieren, sind bekannt. Auf der Grundlage einer bekannten Aminosäurensequenz kann dieses Epitop z.B. experimentell mit Hilfe von Screening-Techniken bestimmt werden, die in den Patentveröffentlichungen WO 84/03564 und WO 86/06487 beschrieben sind.
Zusätzlich kann eine Anzahl von Regionen des Polypeptids auf der dargelegten Aminosäurensequenz als Epitop auf der Grundlage theoretischer Betrachtungen und struktureller Uebereinstimmungen mit Epitopen bestimmt werden, die bereits bekannt sind. Die Bestimmung dieser Regionen basiert auf einer Kombination der Hydrophilie-Kriterien gemäss J.P. Hopp und K.R. Woods (Ref. 5) und Sekundärstrukturaspekten gemäss P.Y. Chon und G.D. Fasman (Ref. 8).
Die folgenden Regionen enthalten vermutlich Epitope für Antikörper:
Leu&sub2;&sub0; - Arg&sub3;&sub7;
Gly&sub4;&sub1; - Met&sub5;&sub1;
His&sub2;&sub3;&sub2; - Cys&sub2;&sub4;&sub5;
Glu&sub3;&sub2;&sub5; - Gly&sub3;&sub3;&sub4;
Gly&sub3;&sub3;&sub5; - Val&sub3;&sub4;&sub6;
Gly&sub3;&sub5;&sub5; - Glu&sub3;&sub6;&sub6;
T-Zellenepitope, die notwendig sein können, können gleichermassen von theoretischen Grundlagen mit der Hilfe von Berzofsky's Amphiphilie-Kriterium (Ref. 9) abgeleitet werden.
Zur Immunisierung gegen Kokzidiose-Infektion in Uebereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, z.B. Antidiotyp-Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente davon zu verwenden. Solche Antikörper richten sich gegen den Idiotypen von Antikörpern, welche sich wiederum gegen das Polypeptid dieser Erfindung richten. Die immunogenen Aequivalente der Polypeptide gemäss dieser Erfindung, auf die oben hingewiesen wurde, müssen als, inter alia, Antiidiotyp-Antikörper dieses Typs verstanden werden.
Die beabsichtigte Immunisierung kann, z.B. durch die Verabreichung des vorliegenden Polypeptids oder eines immunogenen Abschnitts oder eines Aequivalents davon als solches an die Vögel, oder es kann den zu immunisierenden Vögeln ein Mikroorganismus verabreicht werden, der durch rekombinante DNS genetisch modifiziert wurde und der in der Lage ist, die Polypeptide oder einen immunogenen Abschnitt oder ein Aequivalent davon in situ zu produzieren.
Für die Immunisierung von Geflügel gegen Kokzidiose in Uebereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist es zum einen möglich, die vorliegenden Polypeptide, Fragmente oder immunogenen Aequivalente als solche den Vögeln zu verabreichen, oder, zum anderen, falls erwünscht, Mikroorganismen zu verabreichen, die durch genetische Manipulation die Fähigkeit erlangt haben, die vorliegenden Polypeptide etc. zu produzieren. "Untereinheitsvakzine" ist die häufig gebrauchte Bezeichnung für den ersten Fall, und die Bezeichnung "Vektorvakzine" wird gewöhnlich im zweiten Fall gebraucht - auch wir werden diese Nomenklatur hier übernehmen.
Die Untereinheitsvakzine enthalten gemäss der Erfindung im Allgemeinen die Polypeptide in gereinigter Form, gegebenenfalls in der Gegenwart von pharmazeutisch geeigneten Exzipienten. Das Polypeptid kann gegebenenfalls kovalent an ein nicht-verwandtes Protein gebunden werden, das z.B. für die Reinigung des Fusionsproduktes von Vorteil sein kann. Beispiele sind β-Galactosidase, Protein A, Prochymosin, Blutgerinnungsfaktor Xa, etc.
Die Polypeptide für solche Anwendungen können mit Hilfe bekannter Methoden hergestellt werden, z.B. durch Isolierung von E. acervulina oder anderen Eimeria-Spezies mit Hilfe von rekombianten DNS-Techniken oder durch Peptidsynthese.
Falls erwünscht, können die Polypeptide auch in vivo oder in vitro durch z.B. Glykosilierung, Amidierung, Carboxylierung und Phosphorylierung modifiziert werden.
In Vektorvakzinen wird das erfindungsgemässe Polypeptidprodukt von einem genetisch manipulierten Organismus erhalten, der selbst dem Individuum verabreicht wird, und sich selbst für einige Zeit im Körper erhält oder sich dort sogar vermehrt. Verschiedene Organismen können als Wirt für diesen Zweck dienen, wie z.B. Bakterien wie Escherichia coli, Bazillus oder Salmonella oder Viren wie Kuhpocken oder aviäre Pockenviren. In Wirtsorganismen dieses Typs kann das Polypeptid als Oberflächenantigen exprimiert werden. In diesem Zusammenhang sind Fusion des genannten Polypeptids mit OMP-Proteinen oder Pilusproteinen von Escherichia coli oder synthetische Bereitstellung von Signal- und Ankersequenzen, die durch den Organismus erkannt werden, denkbar. Es ist ebenfalls möglich, dass das genannte immunogene Polypeptid, falls erwünscht, als Teil eines grösseren Ganzen, in dem zu immunisierenden Tier freigesetzt wird. In allen diesen Fällen ist es auch möglich, dass ein oder mehrere immunogene Produkte exprimiert werden, die Schutz gegen verschiedene Pathogene und/oder verschiedene Antigene eines gegebenen Pathogens bewirken.

Beispiel 1

Sporulation von E. acervulina-Oozysten

Eine Suspension von 5 x 10&sup8; E. acervulina Oozysten in 60 ml 10&supmin;&sup4; M Natriumdithionit wurde zentrifugiert, danach wurde das Pellet einmal mit 100 ml sterilem Wasser gewaschen. Die Zellen wurden in 500 ml 2% Kaliumbichromat resuspendiert und dann unter dem Einfluss starker Belüftung 7 Stunden bei 30ºC inkubiert. Die Oozysten wurden dann durch Zentrifugieren gesammelt und drei Mal mit 200 ml sterilem Wasser gewaschen.

Isolierung von RNS

Für die Isolierung der RNS (Ref. 1) wurde das Zellpellet in 2,8 ml Puffer aufgenommen, der 10 mM Trisazetat (pH 7,6), 75 mM Natriumazetat, 1% SDS, 2 mM EDTA, 0,2 mg/ml Proteinase K und 10 mM Vanadylribonukleosidkomplexe enthielt. Die Oozysten wurden mit einem Vortexgerät während 60 Sekunden (maximal) in der Gegenwart von 13 g Glasperlen ( 0,5 mm) zerstört. 5 ml Phenol wurden zu dem Gesamtextrakt gegeben und die Mischung wurde während weiteren 60 Sekunden mit einem Vortexgerät behandelt. Nach dem Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit abpipettiert und nochmals mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert. Die RNS wurde nach Zugabe von 2,5 Volumen Aethanol ausgefällt und der resultierende Niederschlag in 800 ul Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM pH 7,6 (T&sub1;&sub0; E0,1) gelöst, wonach das Produkt weitere zweimal mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und zwei Mal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert und dann mit Aethanol ausgefällt wurde. PolyA&spplus;-RNS wurde mit Hilfe von Oligo(dT)-Zellulosechromatographie (Ref. 2) isoliert. Annähernd 100 ug PolyA&spplus;-RNS wurden aus 5 x 10&sup8; Oozysten isoliert.

cDNS-Svnthese

PolyA&spplus;-RNS wurde mit Hilfe des Enzyms MMLV-Reverse Transkriptase in cDNS umgewandelt. Zu diesem Zweck wurden 25 ug PolyA&spplus;-RNS in 90 ul Wasser gelöst und 5 Minuten bei 20ºC durch Zugabe von Quecksilbermethylhydroxid auf 10 mM denaturiert, wonach β-Mercaptoäthanol auf 45 mM zugegeben wurde und die Mischung für weitere 3 Minuten bei 20ºC inkubiert wurde. Die Enzymreaktion wurde in 190 ul Puffer, der 4 ug Oligo(dT)&sub1;&sub5;, 150 E RNasin , 20 mM Tris (pH 7,6), 30 mM KCl, 4 mM Dithiothreitol (DTT), 2 mM MgCl&sub2;, je 1 mM dNTP und 3000 E MMLV-Reverse Transkriptase enthielt, durchgeführt. Die Reaktion wurde nach 1 Stunde Inkubation bei 37ºC gestoppt, indem 10 u1 0,5 M EDTA zugegeben wurden. Nach der Extraktion mit einem gleichen Volumen von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohl (25:24:1) wurde das RNS/DNS- Hybrid ausgefällt durch Zugabe von Ammoniumazetat auf 2 M und 2,5 Volumen Aethanol. Die gemeinsame Wirkung der Enzyme DNS-Polymerase I und RNase H (Ref. 3) resultiert in der Synthese des 2. Stranges. Das Pellet wurde in 960 ul Puffer, der aus 20 mM Tris (pH 7,6), 5 mM MgCl&sub2;, 100 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,6 mM β-NAD, 16 E RNase H, 200 E DNS-Polymerase I und 20 E DNS-Ligase (E. coli) bestand, gelöst. Die Inkubationszeit war 1 Stunde bei 12ºC und dann 1 Stunde bei 22ºC, wonach die Reaktion durch Zugabe von einem gleichen Volumen von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) gestoppt und mit Aethanol ausgefällt wurde.
Bevor die cDNS in einem geeigneten Vektor kloniert wurde, wurde sie zuerst modifiziert. cDNS (5 ug) wurde in 100 ul Puffer, der 30 mM Natriumazetat (pH 5,6), 50 mM NaCl, 1 mM ZnSO&sub4; und 21 E "Mung Bean"-Nulease enthielt, gelöst. Nach der Inkubation während 30 Minuten bei 37ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von EDTA auf 10 mM und Tris auf 25 mM gestoppt. Nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohl (25:24:1) wurde die Mischung über einer Sephadex G50-Säule entsalzt.
Das Folgende wurde dem Eluat (125 ul) zugegeben: Tris pH 7,6 auf 50 mM, EDTA auf 2,5 mM, DTT auf 5mM, S'-Adenosylmethionin auf 0,5 um und 100 E EcoRI-Methylase. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch 15 Minuten Erhitzen auf 65ºC gestoppt, wonach 1/10 Volumen einer Lösung, die 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl&sub2; und 500 mM NaCl (pH 7,5) enthielt, zugegeben wurde, und, zur gleichen Zeit, alle dNTPs auf 1 mM und 12,5 E Klenow-DNS-Polymerase. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens Phenonol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) nach 60 Minuten Inkubation bei 22ºC gestoppt. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach Zugabe von 350 ul H&sub2;O und 50 ul 3 M Natriumazetat (pH 5,6) mit 500 ul Isopropanol ausgefällt. Nach dem Lösen in 100 ul H&sub2;O wurde das Pellet über Sephadex G50 entsalzt und das Eluat mit Aethanol ausgefällt.
Nach dem Lösen des Pellets in 24 ul H&sub2;O wurde die Ligation in 50 ul durchgeführt, in dem 2 ug EcoRI-Linker, Tris-HCl (pH 8,0) auf 30 mM, MgCl&sub2; auf 10 mM, Dithiothreitol auf 10 mM, ATP auf 1 mM, Gelatine auf 0,1 mg/ml und 10 E T&sub4;-DNS- Ligase zugegeben wurden. Die Reaktion wurde nach 16 stündiger Inkubation bei 4ºC durch Erhitzen (für 15 Minuten bei 70ºC) gestoppt, wonach das Schneiden mit Restriktionsendonuklease EcoRI in 210 ul Puffer, der 100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 2,5 mM DTT und 500 E EcoRI enthielt, durchgeführt wurde. Nach 90 minütiger Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch Extraktion mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) gestoppt. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach Zugabe von Natriumazetat (pH 5,6) auf 300 mM in 2,5 Volumen Aethanol ausgefällt, cDNS und Linker wurden mit Hilfe einer Biogel A15m-Säule abgetrennt. Die cDNS wurde mit Aethanol ausgefällt, wonach der Niederschlag in 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA (pH 7,6) gelöst wurde. Die cDNS-Moleküle wurden dann im Phagen λgtll (4) kloniert.
Screening der cDNS-Banken mit gegen Sporozoiten gerichteten Antikörpern zeigte eine positive Reaktion in 1 auf 1000 Phagenklonen. Diese Antikörper wurden zuvor über Protein A- Sepharose gereinigt und dann viermal mit 1 x Tris-Salz (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0) + 0,05% Tween 20 + 10% fetales Kälberserum (FCS) verdünnt und 2 Stunden bei 37ºC mit dem Filter inkubiert.
Der Filter wurde dann vier Mal, jedesmal während 10 Minuten, mit 50 ml 1 x Tris-Salz + 0,05 % Tween 20 gewaschen. Zur zweiten Antikörperinkubation wurde ein Konjugat aus Ziegen-anti-Maus-Antikörpern und alkalischer Phosphatase (verdünnt auf 1:7500 in 1 x Tris-Salz + 0,05 % Tween 20 + 10 % FCS) verwendet und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, wonach die Filter wie nach der ersten Antikörperinkubation beschrieben, gewaschen wurden. Die Farbreaktion wurde in 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; (pH 9,6) durchgeführt, in dem 0,33 mg/ml Nitroblau-Tetrazolium und 0,17 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat gelöst waren. Die Filter wurden nach 30 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur ausgewertet.
Ein immunopositiver Klon wurde Plaque-gereinigt und dieser Klon, als E. acervulina 1A-Klon ( λgt11 Ea1A) bezeichnet, wurde weiter charakterisiert (Figur 1).
Die Phagen-DNS wurde isoliert (Ref. 2) und mit dem Enzym EcoRI geschnitten.
Die EcoRI-Fragmente wurden subkloniert in M13mp18 und pBR327. Zusätzlich wurde das vollständige DNS-Fragment in pUC18 subkloniert. Restriktionskarten wurden von diesen Subklonen in pBR327 angefertigt und die Nukleotidsequenz in M13-Klonen vollständig bestimmt (Figur 2).
Zur Expression des Fusionsproteins wurde ein lysogener Stamm in E. coli Y1089&supmin; (Ref. 4) hergestellt. Das Protein wurde über eine Proto-Sorb LacZ-Säule (Promega ) gereinigt, bevor es in einem Impfschutzexperiment im Huhn verwendet wurde.

Beispiel 2

Schutz gegen E. acevulina-Infektion

Das Fusionsprotein, das von dem Klon λgt11Ea1A in Escherichia coli Y1089&supmin; produziert wurde, wurde gemäss Beispiel 1 gereinigt. Zu diesem Zweck wurde das Produkt mit Avridin (Ref. 7) in einem geeigneten Puffer zusammengebracht, so dass 1 ml der Suspensioin 1 mg Avridin und 0,1 mg Produkt enthielt. Dieses Material wurde intramuskulär in 4 Wochen alte Hühner (weisse Leghorn) in einer Dosierung von 50 ug Produkt pro Huhn injiziert. Nach 2 Wochen wurde diese Inokulation mit einer identischen Dosierung wiederholt. 10 Tage später wurden die Hühner mit 50'000 sporulierten E. acervulina-Oozysten injiziert, die oral verabreicht wurden (Immunitätstest). Die Anzahl der Oozysten in den Fäzes wurde täglich gezählt. Als Kontrolle wurden Hühnern auch abgetötete Sporozoiten und Merozoiten von E. acervulina und β-Galaktoidase injiziert, die alle in 500 ug Avridin pro Dosis suspendiert waren. Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in Tabelle 1 gezeigt. Jede Gruppe enthielt fünf Hühner und die Anzahl der Oozysten ist pro Huhn aufgeführt und stellt die Gesamtzahl von 4 Tagen Exkretion (Tag 3 bis Tag 6 post-infectionem einschliesslich) dar. Tabelle 1 Antigen Immunisierungs-Dosis pro Huhn pro Injektion Oozysten-Exkretion pro Huhn nach Immunitätstest Inhibierung in Bezug zur Kontrolle Sporozoiten Merozoiten LacZ-Ea1A β-Galaktosidase Immunitätstestkontrolle
Immunitätstest: enthielt 50'000 sporulierte Oozysten von E. acervulina in 1 ml 15% Saccharose-Lösung und wurde oral verabreicht.

Beispiel 3

Antikörper

Antikörper, die in Hühnern mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Produkt hervorgerufen wurden, reagierten, in Verdünnungen bis zu 1:1600, gegen Komponenten des invasiven Stadiums, Sporozoiten und Merozoiten von Arten wie E. tenella, E. acervulina und E. maxima. Diese Komponenten waren hauptsächlich an dem vorderen Abschnitt dieser Stadien lokalisiert, wo die Penetrationsorganellen, Rhoptrien und Mikronemen, ebenfalls lokalisiert sind. In einigen Hühnern wurde gefunden, dass die Antikörper um den refraktilen Körper der Sporozoiten herum reagieren, insbesondere bei E. tenella.

Beispiel 4

Schutz gegen E. tenella Infektion

Das gereinigte Fusionsprotein wurde zusammen mit Dioctadecylammoniumbromid (DDA) in einen geeigneten Puffer gebracht, so dass 1 ml der Suspension 0,5 mg DDA und ungefähr 50 ug Fusionsprotein enthielt. Dieses Material wurde intramuskulär in 3-4 Wochen alte Hühner (weisse Leghorn) in einer Dosis von 50 ug Fusionsprotein pro Huhn injiziert. Nach 2 Wochen wurden die Hühner oral mit 7500 sporulierten E. tenella-Oozysten (Weybridge Stamm) auf ihre Immunität getestet. Sieben Tage nach der Immunitätstestinjektion wurden die Hühner getötet und Läsionen wurden an beiden Zäki jedes Huhns gezählt. Die Läsionen wurden gemäss den Richtlinien von Johnson und Reid gezählt (Ref. 10). Die Resultate dieses Experimentes zeigt Tabelle 2. Von dieser wird deutlich, dass ein Protein oder ein Fragment davon, das mindestens einen Teil der mit dem Ea1A-Polypeptid korrespondiert, umfasst, von anderen Eimeria-Spezies erhalten werden kann. Jede Gruppe enthielt 5 Hühner. Tabelle 2 Antigen Immunisierungs-dosis Anzahl der Läsionen LacZ-Ea1A β-Galaktosidase Immunitätstestkontrolle
SA = Standardabweichung

Beispiel 5

Isolierung und Identifizierung von Ea1A-verwandten DNS-Sequenzen von E. tenella

Konstruktion einer cDNS-Bibliothek aus E. tenella

Für die Konstruktion einer cDNS-Bibliothek aus sporulierten Oozysten von E. tenella wurde das genau gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben, angewendet, ausser dass die letzte cDNS-Präparation im Phagen λgt10 anstatt im Phagen λgt11 (4) kloniert wurde.

Screening der E. tenella cDNS-Bibloithek mit E. acervulina- DNS

Das 296 bp EcoRI-Fragment von pUC18/Ea1A wurde mit Digoxigenin-dUTP durch Zufalls-Primen markiert, in dem dem Protokoll des "DNA labelling and detection kit, non radioactive", von Boehringer, Mannheim (Kat. No. 1093657) genau gefolgt wurde.
Filter, die immobilisierte DNS der oben beschriebenen cDNS- Bibliothek enthielten, wurden, wie in Maniatis et. al. (2) beschrieben, hergestellt und mit frisch denaturiertem (10 Minuten, 95ºC), markiertem E. acervulina-Fragment für 16 Stunden bei 42ºC gemäss der Anleitung des Herstellers hybridisiert. Die Filter wurden wie folgt gewaschen: zwei Mal 15 Minuten mit 2 x SSC, 0,1% (GV) SDS (1 x SSC ist 0,015 mol/l Natriumzitrat pH 7,0 plus 0,15 mol/l NaCl) bei Raumteperatur, zweimal 15 Minuten mit 1 x SSC, 0,1% (GV) SDS bei 68ºC, zweimal während 30 und einmal während 15 Minuten mit 0,1 x SSC, 0,1% (GV) SDS bei 68ºC und zwei mal mit PBS- Tween (7,65 g/l NaCl, 0,91 g/l Na&sub2;HPO&sub4;.2H&sub2;O, 0,21 g/l KH&sub2; PO&sub4;, 0,05% (V/V) Tween 80, pH 7,3) während 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Die Filter wurden dann mit einer 1:5000 Verdünnung polyklonaler Schaf-Antidigoxigenin-Fab-Fragmente in PBS-Tween 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem viermaligen Waschen der Filter bei Raumtemperatur in PBS-Tween und einmal fünfzehn Minuten mit 0,01 M Tris-HCl pH 8,0, 0,15 M NaCl, wurde die Bindung der alkalischen Phoshatase an die Filter nach Inkubation mit einer Lösung aus 0,33 g/l Nitroblau-Tetrazolium und 0,17 g/l 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat in 0,1 M Tris-HCl pH 9,6, 0,1 M NaCl, 0,01 M MgCl&sub2; nachgewiesen. Einer von jeweils 400 λgt10 E. tenella- Klonen reagierte mit der E. acervulina-Probe; zehn von diesen, E. tenella 1A1 bis 10 ( λgt10EtA1 bis 10) wurden Plaque-gereinigt. λ gt10Et1A1 wurde zusammen mit dem Escherichia coli-Stamm BNN102 beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn (Niederlande) hinterlegt.

Referenzen

1) J. Pasternak et al.: Mol. & Bioch. Part. 3 (1981), 133-142.
2) T. Maniatis et al.: Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory) 1982.
3) U. Gubbler et al.: Gene 25 (1983), 263-269.
4) T.V. Huynk et al.: DNA Cloning Techniques: A Practical Approach; D. Glover Oxford (1984).
5) J.P. Hopp et al.: Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 78 (1981), 3824-3828.
6) Ganish-Perron C.: Gene 33 (1985) 103-119.
7) K.E. Jensen in "Advances in carriers and adjuvants for Veterinary Biologics" et. R.M. Nervig, P.N. Gough, M.L. Kaeberle, C.A. Whetstone. Iowa State Univ. Press. 1986, S. 77-91.
8) P.Y. Chou et al.: Advances in Enzymology 47 (1987), 45-148.
9) M.F. Good et al.: Science 235 (1987), 1059-1062.
10) J. Johnson and W.M. Reid; Exp. Parasitology 28 (1970), 30-36.

Claims

1. Rekombinante Nukleinsäure enthaltend ein Vektornukleinsäurenmolekül mit einem DNS-Abschnitt darin, dadurch gekennzeichnet, dass dieser DNS-Abschnitt ein Protein von Eimeria oder eine Subsequenz, die ein Epitop umfasst, codiert, wobei ein Teil dieses Proteins durch das Insert codiert wird, das von dem Plasmid pEa1A erhältlich ist, mit dem der Escherichia coli-Stamm K12 JA 221 transformiert wurde, welcher unter der Nr. CBS 143.88 hinterlegt ist, oder ein DNS-Fragment ist, das ein Protein von Eimeria oder eine Subsequenz, die ein Epitop davon umfasst, codiert, welches DNS-Fragment unter stringenten Bedingungen mit der DNS des Inserts hybridisiert.

2. Rekombinante Nukleinsäure gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Abschnitt für mindestens eine Subsequenz codiert, die ein Epitop des Proteins von Eimeria acervulina oder Eimeria tenella enthält.

3. Rekombinantes DNS-Molekül gemäss Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Abschnitt für das Protein von Eimeria oder eine ein Epitop umfassende Subsequenz codiert, wobei Teile des Proteins die Aminosäuresequenz des in Figur 2 gezeigten Polypeptids aufweisen.

4. Rekombinantes DNS-Molekül gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Abschnitt mindestens einem Teil der in Figur 2 gezeigten Desoxynukleotidsequenz entspricht, wobei dieser Teil für ein Eimeria- Protein oder eine ein Epitop umfassende Subsequenz davon codiert.

5. DNS-Fragment mit einer Sequenz, die dem in den Ansprüchen 1 bis 4 definierten DNS-Abschnitt entspricht.

6. DNS-Fragment gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein gemäss Anspruch 3 definiertes Protein oder eine Subsequenz davon codiert.

7. DNS-Fragment gemäss Anspruch 5, welches mindestens einen Teil der in Figur 2 gezeigten Desoxynukleotidsequenz umfasst.

8. Polypeptid mit einer von dem DNS-Fragment gemäss den Ansprüchen 5 bis 7 kodierten Aminosäuresequenz.

9. Polypeptid gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine oder mehrere posttranslationale Modifikationen enthält.

10. Impfstoff zum Schutz von Geflügel gegen durch Eimeria-Parasiten verursachte Kokzidiose, der ein Polypeptid gemäss Anspruch 8 oder 9 enthält.

11. Impfstoff zum Schutz von Geflügel gegen durch Eimeria-Parasiten verursachte Kokzidiose, der aus einem Mikroorganismus besteht, welcher eine rekombinante DNS mit einem DNS-Fragment gemäss den Ansprüchen 5 bis 7 enthält.