HU212506B - Method for the preparation of recombinant vaccine against coccidiosis - Google Patents
Method for the preparation of recombinant vaccine against coccidiosis Download PDFInfo
- Publication number
- HU212506B HU212506B HU893216A HU321689A HU212506B HU 212506 B HU212506 B HU 212506B HU 893216 A HU893216 A HU 893216A HU 321689 A HU321689 A HU 321689A HU 212506 B HU212506 B HU 212506B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- produced
- polypeptide
- eimeria
- dna sequence
- cdna
- Prior art date
Links
- 208000003495 Coccidiosis Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 206010023076 Isosporiasis Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 title 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 title 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 27
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 claims abstract description 18
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 27
- 210000003250 oocyst Anatomy 0.000 claims description 19
- 241000223931 Eimeria acervulina Species 0.000 claims description 15
- 241000223932 Eimeria tenella Species 0.000 claims description 14
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 8
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 25
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 210000003936 merozoite Anatomy 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000223934 Eimeria maxima Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N avridine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CCCN(CCO)CCO)CCCCCCCCCCCCCCCCCC WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950010555 avridine Drugs 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- ZLDPNFYTUDQDMJ-UHFFFAOYSA-N n-octadecyloctadecan-1-amine;hydrobromide Chemical compound Br.CCCCCCCCCCCCCCCCCCNCCCCCCCCCCCCCCCCCC ZLDPNFYTUDQDMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- -1 Escherichia coli Chemical compound 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 232Th Chemical compound [232Th] ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000224482 Apicomplexa Species 0.000 description 1
- 229930091051 Arenine Natural products 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010071023 Bacterial Outer Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000499566 Eimeria brunetti Species 0.000 description 1
- 244000309702 Eimeria hagani Species 0.000 description 1
- 241000179199 Eimeria mitis Species 0.000 description 1
- 241000530449 Eimeria mivati Species 0.000 description 1
- 241000499563 Eimeria necatrix Species 0.000 description 1
- 241000499544 Eimeria praecox Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052776 Thorium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000003224 coccidiostatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000010485 coping Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 244000000056 intracellular parasite Species 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000021238 nutrient digestion Nutrition 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N potassium dichromate Chemical compound [K+].[K+].[O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L sodium dithionite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])=O JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/455—Eimeria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/012—Coccidia antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás coccidiosis elleni vakcina előállítására. A találmány közelebbről egy DNS fragmens és az ez által kódolt Eimeria polipeptid, rekombináns DNS, amely az illető DNS fragmenst tartalmazza, ezt a rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejt és az ezekből képzett, coccidiosis elleni vakcina előállítására vonatkozik.
A coccidiosis olyan betegség, amelyet az Apicomplexa subphylumba és Eimeria nemzetségbe tartozó intracelluláris paraziták és protozoák okoznak. Ezek a paraziták a gazdaállataik gasztrointesztinális traktusának és emésztőszerveinek sejtjeiben szaporodnak.
Az egyre fokozódó intenzív tervelés következtében a baromfiiparban az ezen paraziták által okozott kár riasztóan megnőtt az utolsó tíz évben. Hollandiában a baromfitermelők kára évente millió guilder nagyságrendű, 1986-ban a kár kb. 13 millió guilder volt. Ugyanabban az évben az amerikai egyesült államokban a kár 300 millió dollár körül volt, a coccidiostatikumok alkalmazása ellenére.
Csirkék esetén a coccidiosist okozó patogének kilenc típusába oszthatók, éspedig Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, E. mivati és E. hagani. Néhányan azonban kétségbe vonják a két utolsó típus létezését. Ezeknek a típusoknak csak a csirke a gazdaállata, és ezek magas szövet-fajlagosságot mutatnak. Az említett típusok életciklusa azonban hasonló.
A típusok csirkékre gyakorolt patogén hatásukban eltérőek, és a hatás szempontjából a csirke típusa szintén szerepet játszik. így egy rántanivaló csirkét nagyrészt károsíthat például az E. acervulina vagy E. maxima, mivel ezek a vékonybél nagy részében élősködnek, ahol a tápanyag emésztése nagy szerepet játszik.
Az Eimeria paraziták életciklusuk során számos formán mennek át. A fertőző forma (spórás oocisza) orálisan jut a csirkék gyomrába, ahol az emésztés hatására a ciszta héja felnyílik. Az oocisztában található négy darab sporociszta kiszabadul és a duodénumba jut, így ezek az epe és emésztőenzimeknek vannak kitéve. Ennek hatására a sporociszta falán egy nyílás keletkezik, így a sporocisztában található sporozoiták kiszabadulnak. Ezek a sporozoiták mozgékonyak, és alkalmas gazdasejtet, például epitéliumsejtet keresnek, ahová behatolnak és ott szaporodnak. A típustól függően ez az első reprodukciós fázis 20-48 óra hosszat tart, és néhányszor tíztől százig terjedő merozoita képződik, amelyek mindegyike új gazdasejtbe hatol be, és reprodukálódik. Kettőtől néhányszor ötig terjedő ilyen aszexuális reprodukciós ciklus után az intracelluláris merozoiták szexuális formába, hím és női gametociták formájába mennek át. Miután egy hím gaméta megtermékenyít egy női gamétát, egy zigóta képződik, amely maga körül cisztafalat képez. Ez az oociszta elhagyja a gazdasejtet, és a fekáliával kiürül. Ha a csirke testén kívül a hőmérséklet és a nedvességtartalom viszonylag magas, és ugyanakkor elegendő oxigén van a levegőben, az oociszta spórát képez, és fertőző formába megy át.
így intermedier gazdaállat nem szükséges ahhoz, hogy a parazita egyik csirkéből a másikba jusson. A területegységre jutó csirkék számával tehát a csirkefarmon a fertőzési veszély gyorsan növekszik.
A parazita különböző módokon küzdhető le.
A jótartás mellett a coccidiosis különböző coccidiosis elleni szerekkel küzdhető le, amelyeket többnyire a takarmányhoz vagy az ivóvízhez kevernek. Ezek a szerek azonban az utóbbi években vesztettek hatékonyságukból, részben azért, mert a parazita nagy genetikai kapacitásánál fogva rezisztenciát tud kifejleszteni a különböző coccidiosis elleni szerekkel szemben. Emellett ezen szereknek a maradéka megjelenik a húsban, amely fogyasztási problémákat okoz.
Ezért az immunológiai profilaxis jobb leküzdési módszer lenne. Ismeretes, hogy azok a csirkék, amelyek egy kellően nagy fertőzést átéltek, ellenállóak az ugyanolyan típusú Eimeria fertőzéssel szemben. Eimeria elleni rezisztencia kifejleszthető úgy is, hogy az állatokat néhányszor kisebb dózisú oocisztával vagy gyengített (nem patogén) törzs oocisztájával fertőzzük. A kontrollált adagolás azonban különösen nagyszámú vágóállat esetén szinte leküzdhetetlen probléma. így az egyetlen megoldásnak látszik az inaktivált vakcina.
Az inaktivált vakcina a parazitából származó antigénből áll, adott esetben adjuvánst is tartalmaz. Eimeria antigéneket és az ezen antigének elleni monoklonális antitesteket ismerteti az EP-A 135 712; EP-A 167 433 és a C. A. 107, 173 833 számú dokumentum.
A parazitából izolált antigén helyett alkalmazhatunk rekombináns DNS technológiával előállított terméket, e technikák ismertek pl. az EP-A 231 537 és a WO 86/00 528 számú dokumentumból.
Ezenkívül a vakcinálást végezhetjük úgy, hogy élő gazdaszervezetet adagolunk, például baktériumot, gombát vagy vírust, amely az antigént kódoló gént tartalmazza. Ez a szervezet azután az antigén kellően hosszú ideig tartó szintézisét biztosítja, így a csirke immunrendszere kellően stimulálódik.
Ugyanakkor lehetőség van arra is, hogy az antigént vagy annak részeit szintetikusan állítsuk elő, és adagoljuk az állatoknak immunológiailag felismerhető és stimuláló formában, például egy hordozó fehérjéhez kötve, adjuváns jelenlétében.
A találmány értelmében baromfiak coccidiosis elleni immunizálására alkalmazható egy olyan polipeptid vagy annak immunogén ekvivalense vagy fragmense, amelyet egy, az E. acervulinából származó dezoxi-polinukleotid kódol, amely a pEal A plazmidban inszertként van jelen, amellyel Escherichia coli K12JA221 törzset transzformáltunk, amelyet a Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baam (Hollandia) intézetnél BBS 143.88 számon helyeztünk letétbe, 1988. február 12-én.
A találmány értelmében továbbá baromfiak coccidiosis elleni immunizálására alkalmazható egy Eimeria faj polipeptidje vagy annak immunogén ekvivalense vagy fragmense, amelyet egy Eimeria fajból származó dezoxi-polinukleotid kódol, és amely az inszertált dezoxi-polinukleotid szekvenciával hibridizál.
Az említett pEalA plazmidot a kísérleti részben ismertetett módon állítjuk elő, amelyet az 1. ábrán ábrázolunk.
HU 212 506 Β
A Xgtl 1 fágot [T. V. Huyuk és munkatársai: DNA Cloning Techniques: A Practica Approach; D. Golver, Oxford (1984)] EcoRI restrikciós enzimmel kezeltük, amelyre nézve az egyetlen restrikciós helyet tartalmaz. Erre a restrikciós helyre beiktatjuk az E. acervulina mRNS-ről készített cDNS-t: így a XgtllEalA rekombináns fágot kapjuk. KpnI és SacI restrikciós enzimekkel végzett kezelés után a kapott rekombináns fág azon fragmensét izoláljuk, amely az említett cDNS-ból és az EcoRI restrikciós helyből származó kapcsolódó DNS szekcióból áll a Xgtll LacZ génjében. ApUC18 plazmidot [Ganish Perron c.: Gene, 33, 103—119 (1985)] hasonlóképpen kezeljük KpnI és SacI enzimekkel, majd ligáljuk az előbb említett, cDNS:pUC18/EalA-t tartalmazó fágfragmenssel. Ezen inszert cDNS szekciója nukleotid szekvenciáját a 2. ábrán adjuk meg. Itt jeleztük az ebből levezetett aminosav-szekvenciát is.
Ismeretes, hogy egy adott aminosavat többször különböző kodonok (nukleotid bázis triplettek) kódolhatnak a DNS-ben. így például a Glu (glutaminsav) kodonja a GAT vagy GAA, stb. Nyilvánvaló, hogy a 2. ábrán megadott aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptid (vagy annak fragmense) hasonló alternatív kodon-összetétellel rendelkező DNS-sel is kifejezhető.
A találmány szerinti eljárásban a polipeptid kifejezésére olyan DNS fragmens is alkalmazható, amelyet Eimeria faj genom DNS-éből vagy cDNS-éből izolálunk, és amely ismert módszerekkel szigorú körülmények között az EalA plazmid cDNS-szekvenciájával hibridizál. Kívánt esetben az ilyen típusú DNS fragmens szintén tartalmazhat az említett cDNS-szekvencia mellett kapcsolódó DNS darabokat, amelyek polipeptideket kódolnak.
Az ilyen típusú, hibridizálással kapott DNS fragmensek, valamint a rekombináns DNS molekulák előállítása, amelyek ezeket a fragmenseket tartalmazzák, szintén a találmány tárgyát képezik.
Az ilyen polipeptidek előállítása, amelyeket ezek a DNS fragmensek kódolnak és védő, immunizáló tulajdonságokkal rendelkeznek, szintén a találmány tárgyát képezik. Emellett az ezen polipeptidek fragmenseinek előállításra, amelyek baromfiak coccidiosis elleni immunizálására alkalmazhatók, szintén a találmány tárgyát képezik.
Különböző módszerek ismeretesek az ilyen alkalmazható polipeptid fragmensek (epitópok) kimutatására ismert vagy nem ismert aminosav-szekvencián belül. Egy ismert aminosav-szekvencia alapján ezek az epitópok kísérleti úton átvizsgáló módszerekkel meghatározhatók, mint ahogyan például a WO 84/03 564 és a WO 86/06 487 számú közzétett nemzetközi (PCT) szabadalmi bejelentésekből ismeretes.
Emellett a polipeptid számos, az említett aminosavszekvenciával rendelkező területen epitópként jelölhető meg elméleti megfontolások alapján és a jelenleg ismeretes epitópokkal való strukturális megegyezés alapján. Ezen területek meghatározását a J. P. Hopp és
K. R. Woods szerinti [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 78, 3824-3828 (1981)] hidrofílitási kritériumok és a P.
Y. Chou és G. D. Fasman szerinti [Advances in Enzymology, 47, 45-148 (1987)] másodlagos strukturális szempontok kombinációja alapján végeztük.
Antitestekhez kötődő valószínű epitópokat a következő területek tartalmazzák:
Leu2O-Arg37
Gly41-Met51
His232-Cys245
Glu325-Gly334
Gly335-Val346
Gly33j-Glu366
T-sejt epitópok, amelyek szükségesek lehetnek, hasonlóképpen elméleti alapon levezethetők a Berzofskyféle amfifilitási kritériumok alapján [M. F. Good és munkatársai: Science, 235, 1059-1062 (1987)].
A találmány értelmében coccidiosis elleni immunizálásra alkalmazhatók továbbá például az anti-idiotípusos antitestek vagy azok antigénmegkötő fragmensei. Az ilyen antitestek azon antitestek idiotfpusa ellen képződnek, amelyek viszont a találmány szerinti polipeptid ellen tesztelődnek. A találmány szerinti polipeptid immunogén-ekvivalensei alatt többek között az ilyen típusú anti-idiotípusos antitesteket értjük.
A kívánt immunizálás elérhető például úgy, hogy a polipeptidet vagy annak immunogén szekcióját vagy ekvivalensét adagoljuk az állatoknak; vagy elérhető úgy, hogy az immunizálandó állatoknak olyan mikroorganizmust adagolunk, amelyet rekombináns DNS-sel genetikailag módosítottunk, és amely képes a polipeptidet vagy annak immunogén szekcióját vagy ekvivalensét in situ termelni. A találmány értelmében baromfiak coccidiosis elleni immunizálása elérhető úgy, hogy egyrészt a polipeptidet vagy annak fragmensét vagy immunogén ekvivalensét adagoljuk az állatoknak, vagy másrészt úgy, hogy olyan genetikailag manipulált mikroorganizmust adagolunk az állatoknak, amely a polipeptid termelésére képes lett. Az első esetet „alegység vakcináknak”, míg a második esetet „vektor vakcináknak” nevezik [J. Tailor és munkatársai, Vaccine 6, 504-508 (1988)]. A továbbiakban mi is alkalmazzuk ezt a nómenklatúrát.
A találmány szerinti eljárással előállított alegység vakcinák általában polipeptideket tartalmaznak tisztított formában, adott esetben farmakológiailag elfogadható hordozó jelenlétében. A polipeptid adott esetben egy nemrokon proteinhez lehet kötve kovalensen, amely például a fúziós termék tisztításánál lehet előnyös. Ilyenek például a β-galaktozidáz, protein-A, prokimozin, Xa véralvadásfaktor, stb.
Az ilyen célra alkalmazott polipeptidek ismert módon állíthatók elő, például E. acervulina vagy más Eimeria fajból történő izolálással, rekombináns DNS technikával vagy peptid szintézissel.
Kívánt esetben a polipeptidek in vivő vagy in vitro módosíthatók, például glikozilezéssel, amidálással, karboxilezéssel vagy foszforilezéssel.
Vektor vakcinák esetén a találmány szerinti polipeptid terméket genetikailag manipulált szervezetek készítik, amelyeket magukat adagolunk az immunizálandó egyednek, és amelyek bizonyos ideig fenntartják magukat, sőt reprodukálódnak a testben. Ilyen célra gazdaként különböző szervezetek alkalmazhatók, mint például bak3
HU 212 506 B tóriumok, például Escherichia coli, Bacillus vagy Salmonella vagy vírusok, például szarvasmarha vagy szárnyas himlővírusok. Ilyen típusú gazdaszervezettel a polipeptid felületi antigénként fejeződik ki. Ilyen összefüggésben az adott polipeptid és OMP proteinek vagy Escherichia coli pilus proteinjei vagy a szervezet által felismert szignál és kötőhely szekvenciák szintetikus formái közötti fúzió képzelhető el. Az is lehetséges, hogy az adott immunogén polipeptid kívánt esetben egy nagyobb egésznek a részeként kerül az immunizálandó állatba. Mindezen esetekben az is lehetséges, hogy egy vagy több immunogén termék fejeződik ki, amelyek különböző patogének és/vagy az adott patogén különböző antigénjei ellen alakítanak ki védettséget.
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
E. Acervulina oociszták spóraképzése
5x1ο8 E. acervulina oociszta 60 ml 10-4 mól/l-es nátrium-ditionittel készült szuszpenzióját lecentrifugáljuk, az üledéket 100 ml steril vízzel mossuk. Ezután a sejteket 500 ml 2 tömeg/térf.%-os kálium-bikromátban szuszpendáljuk, majd erős levegőztetés közben 7 óra hosszat 30 ’C-on inkubáljuk. Ezután az oocisztákat centrifugálással összegyűjtjük, és 3x200 ml steril vízzel mossuk.
RNS izolálása
Az RNS [J. Pastemak és munkatársai: Mól. & Bibi. Pár., 3, 133-142 (1981)] a sejtüledéket 2,8 ml pufferrel felvesszük, amelynek összetétele 10 mmól/1 tris-acetát (pH = 7,6), 75 mmól/1 nátrium-acetát, 1 tömeg/térf.% SDS, 2 mmól/1 EDTA, 0,2 mg/ml proteináz-K és 10 mmól/1 vanadil-ribonukleozid-komplexek. Az oocisztákat 13 g, 0,5 mm átmérőjű üveggyöngy jelenlétében 60 másodpercig végzett keveréssel szétzúzzuk. Ezután hozzáadunk 5 ml fenolt, és az elegyet további 60 másodpercig erőteljesen keverjük. Centrifugálás után a felülúszót lepipettázzuk, és újra extraháljuk fenol, kloroform és izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú, azonos térfogatú mennyiségével. Az RNS-t 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, a kapott csapadékot 800 μΐ, 10 mmól/1 Tris-t és 0,1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldattal pH = 7,6) feloldjuk, majd a terméket azonos térfogatú, fenol, kloroform és izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú elegyével kétszer, majd kloroform és izoamil-alkohol 24:1 térfogatarányú elegyével kétszer extraháljuk, végül etanollal kicsapjuk. A poliA+-RNS-t oligo (dT)-cellulóz-kromatográfiával izoláljuk [Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory), 1982] 5xl08 oocisztából kb. 100 pg poliA+-RNS-t izolálunk.
cDNS szintézise
A poliA+-RNS-t cDNS-sé alakítjuk MMLV reverz transzkriptáz segítségével. Ehhez 25 μg poliA+-RNS-t feloldunk 90 μΐ vízben, és 5 percig 20 ‘C-on merkuri-metil-hidroxid 10 mmól/1 koncentrációig történő adagolásával denaturáljuk, majd az elegyhez β-merkapto-etanolt adagolunk 45 mmól/1 koncentrációig, és az elegyet további 3 percig 20 ’C-on inkubáljuk. Az enzimreakciót 190 μ] puffer-oldatban hajtjuk végre, amelynek összetétele 4 μg oligo(dT)15, 150 egység RNSsin^, 20 mmól/1 Tris (pH = 7,6), 30 mmól/1 KC1, 4 mmól/1 ditiotreitol (DTT), 2 mmól/1 MgCl2,1-1 mmól/1 dNTP és 3000 egység MMLV reverz transzkriptáz. A reakcióelegyet 1 óra hosszat 37 ’C-on inkubáljuk, majd 10 μΐ 0,5 mól/l-es EDTA-val leállítjuk a reakciót. Ezután azonos térfogatú fenol, kloroform és izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú elegyével extraháljuk és az RNS/DNS hibridet ammónium-acetát 2 mól/1 koncentrációig történő adagolásával és 2,5-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk. A második szál szintézisét DNS-polimeráz I és RN-áz H [U. Gubbler és munkatársai: Gene, 25, 263-269 (1983)] kombinációjával végezzük. Az előbbi csapadékot 960 μΐ pufferben oldjuk, amelynek összetétele 20 mmól/1 Tris (pH = 7,6), 5 mmól/1 MgCl2, 100 mmól/1 (NH^ SO4, 0,6 mmól/1 β = ΝΑϋ, 16 egység RN-áz H, 200 egység DNS-polimeráz I és 20 egység DNS-ligáz (E. coli). Az inkubálást 12 ’C-on egy óra hosszat, majd 22 ’C-on további egy óra hosszat végezzük, ezután a reakciót azonos térfogatú fenol, kloroform és izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú elegyével leállítjuk, és etanollal kicsapjuk.
Mielőtt a cDNS-t egy alkalmas vektorba klónozzuk, 3'- és 5'-végét tompa véggé alakítjuk. 5 μg cDNS-t feloldunk 100 μΐ pufferben, amelynek összetétele 30 mmól/1 nátrium-acetát (pH = 5,6), 50 mmól/1 NaCl, 1 mmól/1 ZnSO4 és 21 egység Mung bab nukleáz. A reakcióelegyet 37 ’C-on 30 percig inkubáljuk, majd a reakciót EDTA 10 mmól/1 koncentrációig és Tris 25 mmól/1 koncentrációig történő adagolásával elállítjuk. Extrakciót végzünk fenol, kloroform és izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú elegyével, és az elegyet Sephadex G50 oszlopon sómentesítjük.
125 μΐ eluátumhoz a következő anyagokat adjuk: Tris (pH = 7,6) 50 mmól/l-ig, EDTA 2,5 mmól/l-ig, DTT 5 mmól/l-ig, S'-adenozil-metionin 0,5 mmól/l-ig és 100 egység EcoRI-metiláz. Az elegyet 37 ‘C-on 30 percig inkubáljuk, majd 15 percig 65 ’C-ra melegítve a reakciót leállítjuk, ezután 1/10 térfogatnyi következő összetételű oldatot adjuk hozzá: Tris-HCl 100 mmól/1, MgCl2 100 mmól/1 és NaCl 500 mmól/1 (pH = 7,5), ugyanakkor hozzáadunk 1-1 mmól/1 dNTP-t és 12,5 egység Klenow DNS-polimerázt. A reakciót azonos térfogatú fenol, kloroform, izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú elegy adagolásával leállítjuk, miután 22 ’C-on 60 percig inkubáltunk. A felülúszó folyadékot 350 μΐ víz, 3 mól/l-es nátrium-acetát (pH = 5,6) és 500 μΐ izopropanol adagolásával kicsapjuk. A csapadékot 100 μΐ vízben feloldjuk, és Sephadex G50 oszlopon sómentesítjük, és eluátumot etanollal kicsapjuk.
A csapadékot 24 μΐ vízben feloldjuk, és a ligálást 50 μΐ térfogatban hajtjuk végre, amelyhez a következő anyagokat adjuk: 2 μg EcoRI linker, Tris-HCl (pH = 8,0) 30 mmól/l-ig, MgCl2 10 mmól/l-ig, ditiotreitol 10 mmól/I-ig, ATP 1 mmól/l-ig, zselatin 0,1 mg/ml-ig és 10 egység T4DNS-ligáz. A reakcióelegyet 16 óra hosszat 4 ’C-on inkubáljuk, majd 15 percig 70 ’C-on melegítve a reakciót leállítjuk. Ezután tapadós EcoRI végű cDNS-ffagmensek előállítására EcoRI endonuk4
HU 212 506 Β leázzal hasítunk 210 μΐ pufferben, amelynek összetétele: 100 mmól/1 Tris-HCl (pH = 7,6), 50 mmól/1 NaCl, 10 mmól/1 MgCl2, 2,5 mmól/1 DTT és 500 egység EcoRI. A reakcióelegyet 37 'C-on 90 percig inkubáljuk, majd a reakciót azonos térfogatú fenol, kloroform, izoamil-alkohol 25:24:1 térfogatarányú eleggyel történő extrakcióval leállítjuk. A felülúszó folyadékot 2,5-szörös térfogatú etanollal kicsapjuk, majd nátrium-acetátot (pH = 5,6) adunk hozzá 300 mmól/1 koncentrációig, majd a cDNS-t és a linkereket Biogel A15m oszlopon (BioRad gyártmány) elválasztjuk. A cDNS-t etanollal kicsapjuk, majd a csapadékot 10 mmól/1 Tris-HCl-ot és 0,1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldattal (pH = 7,6) feloldjuk. A cDNS molekulákat ezután Xgtl 1 fágba [T. V. Huynk és munkatársai, id.h.] klónozzuk.
A kapott cDNS állomány sporozoiták elleni antitestre történő átvizsgálása 1000 fág-kiónonként 1 pozitív reakciót mutat. Az antitestet olyan hibridómából izoláljuk, amelyet sporozoitával immunizált egerek izolált lépsejtjeinek és mielomasejteknek a fúziójával állítunk elő. A kísérletben a hibridómák felülúszóját alkalmazzuk [Vermeulen és munkatársai: J. Exp. Med., 162, 1460-1476 (1985)]. Az antitesteket előzetesen protein A Sepharose-on tisztítjuk, majd 4-szeresre hígítjuk a következő anyagokkal: lxTris-só (Tris-HCl 10 mmól/1, NaCl 150 mmól/1, pH = 8,0) + 0,05% Tween 20+10% borjú embrió szérum (FCS). A reakcióelegyet 37 ‘C-on két óra hosszat inkubáljuk a szűrővel együtt, amelyen a cDNS inszertet tartalmazó Xgtll fággal fertőzött, lizált sejtekből származó protein van.
A szűrőt ezután 4x10 percig mossuk a következő összetételű oldattal: 50 ml lxTris-só + 0,05% Tween 20. A második antitest inkubálásához kecske-anti-egér antitestek és alkálikus foszfatáz konjugátumát (Promega gyártmány) alkalmazzuk (1/7500-szoros hígítás a következő összetételű oldattal: lxTris-só + 0,05% Tween 20+10% FCS), és az inkubálást 37 °C-on 30 percig végezzük, utána a szűrőt az első antitest inkubálásánál leírt módon mossuk. A színreakciót a következő összetételű oldatban végezzük: Tris-HCl 100 mmól/1, NaCl 100 mmól/1, MgCl2 10 mmól/1, (pH = 9,6), amelyben 0,33 mg/ml nitrokék-tetrazóliumot és 0,17 mg/ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfátot oldottunk. A szűrőket 30 percig szobahőmérsékleten történő inkubálás után optikailag értékeljük ki. Egy immunpozitív kiónt plakk-tisztítással elválasztunk, Ezt a kiónt E. acervulina 1A klón (XgtllEalA) jellel látjuk el, és tovább meghatározzuk (1. ábra).
A fág DNS-t izoláljuk [T. Maniatis és munkatársai, id.h.] és EcoRI enzimmel vágjuk. Ehhez Xgtll fágot tartalmazó cDNS-t tisztítunk, és E. coliban felszaporítjuk. A fágot tisztítjuk, és a DNS-t izoláljuk. A kapott DNS-fragmensek hossza kb. 970 és 295 bp.
Az EcoRI fragmenseket M13mpl8 és pBR327 plazmidokba szubklónozzuk. Emellett a komplett cDNS fragmenseket pUC18 plazmidba szubklónozzuk. Ezeknek a szubklónoknak a restrikciós térképét pBR327 plazmidban meghatározzuk, és az Ml3 kiónok nukleotid szekvenciáját teljesen meghatározzuk (2. ábra) [T. Maniatis és munkatársai, id.h.].
A fúziós protein (β-galaktozidáz és az inszertált cDNS által kódolt protein fúziója) kifejezéséhez egy lizogén törzset alakítunk ki, E. coli Y1089 törzsben [T. V. Huynk és munkatársai, id.h.]. A proteint a csirke védő kísérlet előtt egy Proto-Sorb LacZ [Promega w] oszlopon tisztítjuk.
2. példa
E. acervulina fertőzés elleni védelem
A XgtllEalA klón által Escherichia coli Y1089” törzsben termelt fúziós proteint, melynek móltömege SDS-PAGE-val mérve kb. 160 kD, az 1. példa szerinti módon tisztítottuk. Ehhez a terméket PBS-ben avridinnel [K. E. Jensen, „Advances in carriers and adjuvants fór Veterinary Biologics” ed. R. M. Nervig, P. M. Gough, M. L. Kaeberle, C. A. Whetstone. Iowa State Univ. Press, 1986, 77-91.] hoztuk össze úgy, hogy 1 ml szuszpenzió 1 mg avridint és 0,1 mg terméket tartalmazott. Ezt az anyagot intramuszkulárisan adagoltuk négyhetes csirkéknek (fehér Leghom) csirkénként kb. 50 gg termék dózisban. Két hét múlva ezt az oltást azonos dózissal megismételtük. 10 nap múlva a csirkéket 500 000 spórázott E. acervulina oocisztával fertőztük, amelyet orálisan adagoltunk. Az oociszták számát a fekáliában naponta megszámoltuk. Kontrollként csirkéknek E. acervulina elölt sporozoiták és merozoiták, valamint β-galaktozidázt adagoltunk injekciós úton, dózisonként 500 gg avridinnel szuszpendálva. A kísérlet eredményeit az 1. táblázatban foglaltuk össze. A csirkék ötös csoportokba voltak osztva, a táblázatban a 4 nap alatt ürített oociszták számát adjuk meg (a fertőzés után 3-6. napok beleértve).
1. táblázat
| Antigén | „Immunizálás” dózis per csirke per injekció | Oociszta ürítés csirkénként a fertőzés után | %-os gátlás a kontrolihoz viszonyítva |
| Sporozoita (kontroll) | lxlO7 | 82,8x107 | 47 |
| Merozoita (kontroll) | lxlO7 | 20,9x107 | 87 |
| LacZ-EalA (tál. szerinti) | 50 gg | 62,2x107 | 60 |
| β-galaktozidáz (kontroll) | 50 gg | 143,7xl07 | 8 |
| Kontroll fertőzés | - | 155,8xl07 | - |
Megjegyzés: kontrollfertőzés: 50 000 spórázott E. acervulina oociszta 1 ml 15%-os szacharóz-oldatban orálisan adagolva.
A táblázatból látható, hogy a találmány szerinti rekombináns antigén által kifejtett gátlás az elölt sporozita, illetve merozoita által kifejtett gátlás nagyságrendjébe esik.
3. példa
Antitestek
Az 1. példa szerinti módon kapott termék ellen kép5
HU 212 506 Β ződött antitestek csirkékben l:1600-szoros hígításig reagálnak E. tenella, E. acervulina és E. maxima inváziós állapotú formáival, sporozoitáival és merozoitáival. Ezek a komponensek főleg ezeknek a formáknak az első szekciójára lokalizálódnak, ahol a penetrációs szervecskék rhoptriumok és mikronémák szintén lokalizálódnak. Néhány csirke esetén úgy találtuk, hogy az antitestek a sporozoiták refraktil teste táján reagálnak, ez volt a helyzet különösen E. tenella esetén.
34. példa
E. tenella fertőzés elleni védelem
A tisztított fúziós proteint (LacZ-EalA) alkalmas pufferben dioktadecil-ammónium-bromiddal (DDA) elegyítjük úgy, hogy 1 ml szuszpenzió 0,5 mg DDA-t és kb. 50 gg fúziós proteint tartalmazzon.
Ezt az anyagot intramuszkulárisan injektáljuk 3-4 hetes csirkéknek (fehér Leghom) csirkénként kb. 50 gg fúziós protein dózisban. Két hét múlva a csirkéket orálisan fertőztük 7500 spórázott E. tenella oocisztával (Weybridge törzs). A fertőzés után hét nappal a csirkéket leöltük, és megszámoltuk a csirkék mindkét ceca található sebeket. A sebeket Johnson és Reid módszere szerint határoztuk meg [J. Johson és W. R. Reid: Parasitology, 28, 30-36 (1970)]. A kísérlet eredményeit a 2. táblázatban foglaltuk össze.
Úgy találtuk, hogy más Eimeria fajba tartozó protein vagy annak fragmense, amely legalább az EalA polipeptid megfelelő részét tartalmazza, szintén védelmet nyújt. A kísérletek esetén a csirkék ötös csoportokban voltak osztva.
2. táblázat
| Antigén | Immunizáló dózis | Seb pontszám ±SD |
| LacZ-EalA (tál. szerinti) | 50 gg | 2,5±1,2 |
| β-galaktozidáz | 50 gg | 3,5±O,O |
| kontroll fertőzés | - | 3,3±O,5 |
SD = standard deviáció
5. példa
EalA-nak megfelelő DNS szekvencia izolálása és azonosítása E. tenellából
E. tenella cDNS könyvtár kialakítása
E. tenella spórázott oocisztájának cDNS könyvtára kialakításához az 1. példa szerinti eljárást követjük, azzal az eltéréssel, hogy a végső cDNS-t XgtlO fágba klónozzuk Ág ti 1 fág helyett [T. V. Huyuk és munkatársai, id. h.].
E. tenella cDNS könyvtár átvizsgálása E. acervulina DNS-sel pUC18/EalA (lásd 1. példa) 296 bp EcoRI fragmensét digoxigenin-dUTP-vel jeleztük random színezéssel, pontosan követve a Boehringer, Mannheim gyártmányú DNS jelölő és detektáló készlet, nem-radioaktív (1 093 657 katalógusszám) használati utasítását. A fenti E. tenella cDNS könyvtárból származó immobilizált DNS-t tartalmazó szűrőket állítottunk elő Maniatis és munkatársai előírása szerint és a frissen denaturált (10 perc 95 ’C-on), jelzett E. acervulina fragmenssel vizsgáltuk 16 óra hosszat 42 ’C-on az előállító (Boehringer, Mannheim) instrukciói szerint. A szűrőket ezután mostuk a következő oldatokkal: kétszer 15 percig szobahőmérsékleten 2xSSC, 0,1 tömeg/térf.% SDS (lxSSC: 0,015 mól/1 nátrium-citrát, pH = 7,0,0,16 mól/1 NaCl), kétszer 15 percig 68 ’C-on lxSSC, 0,1 tömeg/térf.% SDS, kétszer 30 és egyszer 15 percig 68 ’C-on 0,lxSSC, 0,1 tömeg/térf.% SDS, és kétszer 15 percig szobahőmérsékleten PBS-Tween (7,65 g/1 NaCl, 0,91 g/1 Na2HPO4.2H2O, 0,21 gfl KH2PO4,0,05 térf.% Tween 80, pH = 7,3).
A szűrőket ezután 30 percig szobahőmérsékleten alkálikus foszfatázzal kapcsolt poliklonális birka anti-digoxigenin fragmensek PBS-Tween-nel készült 1:5000-szeres hígításával reagáltattuk. Ezután a szűrőket négyszer 15 percig szobahőmérsékleten PBS-Tween-nel és 15 percig a következő oldattal mostuk: 0,01 mól/1 Tris-HCl (pH = 8,0) + 0,15 mól/1 nátrium-klorid. Az alkálikus foszfatáz szűrőkhöz való kapcsolódását a következő oldatban történt inkubálás után detektáltuk: 0,33 g/1 nitrokék-tetrazólium és 0,17 g/15-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát 0,1 mól/1 Tris-HCl (pH = 9,6), 0,1 mól/1 nátrium-klorid, 0,01 mól/1 magnézium-klorid tartalmú oldatban. Minden 400 ÁgtlO E. tenella klórból egy reagált az E. acervulina próbával, vagyis E. acervulinával rokon szekvenciák jelen vannak E. tenellában. A klónokból tízet, amelyeket a következő jellel láttunk el: E. tenella 1A1-10 (XgtlOEtlAl-lO), plakk-tisztításnak vetettünk alá. A ÁgtlOEtl Al-t az Escherichia coli BNN102 törzzsel együtt a Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baam (Hollandia) intézetnél helyeztük letétbe, CBS 286. 89 számon, 1989. június 21-én.
Claims (11)
1. Eljárás egy antigén tulajdonságú Eimeria polipeptidet vagy fragmensét vagy immunológiai ekvivalensét kódoló DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) valamely Eimeria faj oocisztáiból mRNS-t izolálunk, az mRNS-ről cDNS-t készítünk, a cDNS-t fágvektorba klónozzuk, az így kapott cDNS-könyvtárat sporozoiták elleni antitesttel átvizsgáljuk és az immunpozitív kiónokat elválasztjuk, vagy
b) a megfelelő DNS-szekvenciát ismert módon szintetizáljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az mRNS-t E. acervulina vagy E. tenella oocisztából izoláljuk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. ábra szerinti dezoxinukleotid-szekvenciának vagy legalább egy részének megfelelő vagy azzal hibridizáló DNS-szekvenciát állítjuk elő.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. ábra szerinti dezoxinukleotid-szekvencia egy részének megfelelő vagy azzal hibridizáló DNS-szekvenciát állítjuk elő.
HU 212 506 Β
5. Eljárás az 1. igénypont szerinti DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-szekvenciát egy alkalmas hordozóvektorba iktatjuk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 5 ve, hogy a pEalAplazmidvektort állítjuk elő.
7. Eljárás transzformált mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett mikroorganizmust egy, az 5. igénypont szerinti eljárással előállított plazmidvektorral transzformáljuk. 10
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a CBS 286.89 számon deponált E. coli törzset állítjuk elő.
9. Eljárás egy, a 2. ábrán bemutatott aminosavszekvenciával rendelkező Eimeria polipeptidnek vagy fragmensének vagy immunológiai ekvivalensének előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 7. igénypont szerinti eljárással előállított mikroorganizmust alkalmas tápközegben tenyésztünk, és a termelt polipeptidet elválasztjuk.
10. Eljárás baromfiaknak Eimeria paraziták által okozott coccidiosis elleni védelmére szolgáló vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 7. igénypont szerinti eljárással előállított mikroorganizmust alkalmas fiziológiásán elfogadható vivőanyaggal elegyítjük.
11. Eljárás baromfiaknak Eimeria paraziták által okozott coccidiosis elleni védelmére szolgáló vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely a 9. igénypont szerinti eljárással előállított polipeptidet vagy immunológiailag azonos fragmensét vagy ekvi15 valensét fiziológiásán elfogadható vivőanyaggal elegyítjük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8801627 | 1988-06-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT51327A HUT51327A (en) | 1990-04-28 |
| HU212506B true HU212506B (en) | 1996-07-29 |
Family
ID=19852528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU893216A HU212506B (en) | 1988-06-27 | 1989-06-26 | Method for the preparation of recombinant vaccine against coccidiosis |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5602033A (hu) |
| EP (1) | EP0349071B1 (hu) |
| JP (1) | JP3086227B2 (hu) |
| KR (1) | KR970007376B1 (hu) |
| AU (1) | AU621903B2 (hu) |
| DE (1) | DE68914043T2 (hu) |
| ES (1) | ES2053950T3 (hu) |
| HU (1) | HU212506B (hu) |
| NZ (1) | NZ229679A (hu) |
| TW (1) | TW204368B (hu) |
| ZA (1) | ZA894726B (hu) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02502784A (ja) * | 1987-03-06 | 1990-09-06 | サイナーゲン，インコーポレーテッド | コクシジウム感染の診断用ポリペプチドとその組換えｄｎａ法による製造法 |
| NZ227597A (en) * | 1988-01-15 | 1991-11-26 | Merck & Co Inc | Eimeria tenella group b immunogens and their production |
| ATE94208T1 (de) * | 1989-06-21 | 1993-09-15 | Akzo Nv | Eimeria tenella-vakzin. |
| AU654481B2 (en) * | 1991-03-14 | 1994-11-10 | British Technology Group Usa, Inc. | Recombinant anticoccidial vaccine |
| US6008342A (en) * | 1991-07-12 | 1999-12-28 | Roche Vitamins Inc. | DNA encoding eimeria antigen |
| US5403581A (en) * | 1991-07-12 | 1995-04-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Coccidiosis vaccines |
| IL116026A (en) * | 1994-11-22 | 2005-08-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Peptides capable of linking to the sh3 domain of gap, nucleotide sequences encoding the same, their preparation and uses |
| DK0775746T3 (da) * | 1995-07-03 | 2006-04-03 | Akzo Nobel Nv | Vaccine mod fjerkræcoccidiose |
| US7354593B2 (en) | 2002-12-09 | 2008-04-08 | Merial Limited | Coccidial vaccine and methods of making and using same |
| BR0317144A (pt) * | 2002-12-09 | 2005-10-25 | Univ Georgia Res Found | Vacina coccìdica e métodos de preparar e empregar a mesma |
| US6924135B2 (en) * | 2003-08-29 | 2005-08-02 | Zeon Corporation | DNA encoding Eimeria glyceroaldehyde-3-phosphate dehydrogenase and uses thereof |
| DE602005021873D1 (de) | 2004-03-12 | 2010-07-29 | Univ Georgia | Neues impfstoffadjuvans und dessen herstellung und verwendung |
| EP1666489B1 (en) * | 2004-12-01 | 2007-11-21 | Zeon Corporation | DNA encoding an antigenic protein of eimeria apical membrane antigen 1 and use thereof |
| CN107904247A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-04-13 | 吉林大学 | 一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗及制备方法 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4710377A (en) * | 1983-08-19 | 1987-12-01 | American Cyanamid Company | Antigens and monoclonal antibodies reactive against sporozoites of Eimeria spp. |
| EP0135073A3 (en) * | 1983-08-19 | 1987-05-27 | American Cyanamid Company | Antigens and monoclonal antibodies reactive against merozites of eimeria spp. |
| US5187080A (en) * | 1984-06-05 | 1993-02-16 | Solvay & Cie S.A. | DNA encoding an antigenic protein derived from Eimeria tenella and vaccines for prevention of coccidiosis caused by Eimeria tenella |
| US4874705A (en) * | 1985-05-16 | 1989-10-17 | Solvay & Cie, S.A. | DNA encoding an antigenic protein derived from Eimeria tenella and vaccines for prevention of coccidiosis caused by Eimeria tenella |
| US4639372A (en) * | 1984-06-29 | 1987-01-27 | Merck & Co., Inc. | Coccidiosis vaccine |
| WO1986000528A1 (en) * | 1984-07-05 | 1986-01-30 | Genex Corporation | Cloned gene and method for making and using the same |
| US5273901A (en) * | 1984-07-05 | 1993-12-28 | Enzon Corp. | Genetically engineered coccidiosis sporozoite 21.5 Kb antigen, ac-6b |
| US5279960A (en) * | 1984-07-05 | 1994-01-18 | Enzon Corp. | 25 KD coccidial antigen of eimeria tenella |
| US4724145A (en) * | 1985-11-18 | 1988-02-09 | Merck & Co., Inc. | Eimeria acervulina immunogens |
| US5028694A (en) * | 1985-12-03 | 1991-07-02 | Solvay & Cie, S.A. | Antigenic proteins and vaccines containing them for prevention of coccidiosis caused by eimeria Eimeria necatrix and Eimeria tenella |
| EP0453054B1 (en) * | 1985-12-03 | 1996-07-03 | SOLVAY (Société Anonyme) | Antigenic proteins and vaccines containing them for prevention of coccidiosis |
| JPS62262994A (ja) * | 1986-05-12 | 1987-11-16 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 |
| US5496550A (en) * | 1986-08-14 | 1996-03-05 | Chilwalner | Method of reducing the output of Eimeria oocysts from a newborn chick |
| IL83523A (en) * | 1986-08-14 | 1994-10-21 | Chilwalner Partnership | Method of purification of eimeria gametocytes and coccidiosis vaccine containing them |
| US4973551A (en) * | 1988-01-15 | 1990-11-27 | Merck & Co., Inc. | Vector for the expression of fusion proteins and protein immunogens |
| NZ227597A (en) * | 1988-01-15 | 1991-11-26 | Merck & Co Inc | Eimeria tenella group b immunogens and their production |
| ZA924203B (en) * | 1991-06-18 | 1993-03-31 | Akzo Nv | Coccidiosis poultry vaccine |
| US5403581A (en) * | 1991-07-12 | 1995-04-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Coccidiosis vaccines |
-
1989
- 1989-06-21 ZA ZA894726A patent/ZA894726B/xx unknown
- 1989-06-23 NZ NZ229679A patent/NZ229679A/xx unknown
- 1989-06-23 EP EP89201659A patent/EP0349071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-23 DE DE68914043T patent/DE68914043T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-23 ES ES89201659T patent/ES2053950T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-26 HU HU893216A patent/HU212506B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-06-26 KR KR89008862A patent/KR970007376B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-06-27 AU AU37069/89A patent/AU621903B2/en not_active Ceased
- 1989-06-27 JP JP01165162A patent/JP3086227B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-27 US US07/371,947 patent/US5602033A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-23 TW TW078109982A patent/TW204368B/zh active
-
1995
- 1995-06-07 US US08/473,466 patent/US5783197A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2053950T3 (es) | 1994-08-01 |
| US5783197A (en) | 1998-07-21 |
| KR910001050A (ko) | 1991-01-30 |
| ZA894726B (en) | 1990-03-28 |
| JPH0260587A (ja) | 1990-03-01 |
| TW204368B (hu) | 1993-04-21 |
| EP0349071B1 (en) | 1994-03-23 |
| US5602033A (en) | 1997-02-11 |
| AU3706989A (en) | 1990-01-04 |
| DE68914043D1 (de) | 1994-04-28 |
| DE68914043T2 (de) | 1994-07-07 |
| JP3086227B2 (ja) | 2000-09-11 |
| HUT51327A (en) | 1990-04-28 |
| KR970007376B1 (en) | 1997-05-08 |
| AU621903B2 (en) | 1992-03-26 |
| NZ229679A (en) | 1991-11-26 |
| EP0349071A1 (en) | 1990-01-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2907813B2 (ja) | コクシジウム症予防用抗原性蛋白質およびそれを含有するワクチン | |
| EP0134799B1 (en) | Expression of plasmodium falciparum polypeptides from cloned cdna | |
| HU212506B (en) | Method for the preparation of recombinant vaccine against coccidiosis | |
| EP0519547B1 (en) | Coccidiosis poultry vaccine | |
| KR0165115B1 (ko) | 콕시듐증 백신 | |
| JP4116680B2 (ja) | 家禽コクシジウム症ワクチン | |
| KR100244828B1 (ko) | 콕시디아증 백신 | |
| JP2006512926A (ja) | マラリア・ワクチン | |
| KR0152245B1 (ko) | 에이메리아 테넬라 왁찐 | |
| US7335759B2 (en) | Recombinant immunogens for the generation of antivenoms to the venom of scorpions of the genus Centruroides | |
| US5670362A (en) | DNA encoding an Eimeria 100kD antigen | |
| WO1992005193A1 (en) | Plasmodium liver stage antigens | |
| JPH05271293A (ja) | コクシジオーシス鶏ワクチン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |