DE69101646T2

DE69101646T2 - Vakzine gegen Coccidiose.

Info

Publication number: DE69101646T2
Application number: DE69101646T
Authority: DE
Inventors: Mary-Helen Binger
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: Alpharma Luxembourg SARL
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1991-01-17
Publication date: 1994-07-28
Anticipated expiration: 2011-01-18
Also published as: NO910279D0; IL97013A; DK0439056T3; FI910398A; YU48525B; CA2034768A1; JP3215692B2; NZ236864A; ES2063383T3; EP0439056A3; DE69101646D1; AU6995291A; IL97013A0; KR100197455B1; IE65363B1; IE910276A1; EP0439056B1; ZA9010461B; MC2227A1; JPH06172396A

Description

Die Anmeldung betrifft Antigene von protozoischen Eimeria- Parasiten. Diese Antigene können auf verschiedenenen Verabreichungswegen verwendet werden, um Geflügel gegen Kokzidiose zu schützen.
Kokzidiose ist eine Geflügelkrankheit, die durch intrazelluläre protozoische Parasiten der Gattung Eimeria verursacht wird. Die Krankheit ist endemisch in großen Geflügelintensivzuchtanstalten. Die geschätzten Kosten der Kontrolle der Krankheit durch Chemotherapie überschreiten 100 Millionen Dollar jedes Jahr allein in den Vereinigten Staaten von Amerika. Die Entwicklung einer Resistenz gegen die bekannten Antikokzidiose-Arzneimittel erfordert es, die Entwicklung neuer Mittel fortzusetzen zu einer Zeit, wo die Arzneimittel-Entwicklung immer teurer wird und die Verbraucher-Akzeptanz von Arzneimittel-Rückständen bei Tieren, die als Nahrung dienen, abnimmt.
Eine schützende Immunität gegenüber natürlichen Kokzidiose- Infektionen ist gut belegt. Es wurde gezeigt, daß eine kontrollierte tägliche Verabreichung einer geringen Anzahl lebensfähiger Oozysten mehrere Wochen lang zu einer vollständigen Immunität gegenüber einer Kontaktinfektion mit einer normalerweise virulenten Dosis führt [Rose et al., Parasitology 73:25 (1976); Rose et al., Parasitology 88:199 (1984)]. Die Demonstration der erworbenen Resistenz gegenüber der Infektion weist auf die Möglichkeit der Entwicklung eines Impfstoffs hin, um bei jungen Hühnern eine Immunität zu induzieren, wodurch der Bedarf für chemische Kokzidiostatika umgangen wird. Tatsächlich wurde ein derartiger Plan getestet bei der Coccivac -Formulierung von Sterwin Laboratories, Opelika, AL.
Im Hinblick auf eine Herstellung eines Kokzidiose-Impfstoffs stellten Murray et al., Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 167,443, Extrakte aus Sporozoiten oder sporulierten Oozysten von Eimeria tenella her, die mindestens 15 Polypeptide enthielten, von denen viele mit der Oberfläche des Sporozoiten in Verbindung gebracht wurden. Die Injektion dieser Extrakte in Hühner verminderte zäkale Schädigungen nach einer oralen Impfung mit virulenten sporolierten E. tenella Oozysten.
Kürzlich offenbarten Schenkel et al., US-Patent Nr. 4,650,676 die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen E. tenella-Merozoiten. Unter Verwendung dieser Antikörper identifizierten Schenkel et al. eine Anzahl von Antigenen, gegen die die Antikörper gerichtet waren. Durch Vorinkubieren von E. tenella-Sporozoiten mit diesen Antikörpern und Einführen der behandelten Sporozoiten in die Zäka von Hühnchen, konnten Schenkel et al. eine gewisse Verminderung der zäkalen Schädigungsraten zeigen, verglichen mit unbehandelten Sporozoiten-Kontrollen.
Unter Verwendung der rekombinanten DNS-Methodik klonierten Newman et al. (Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 164 176) ein Gen aus dem Sporozoiten-Stadium, das ein Antigen aus Eimeria tenella mit 25.000 Dalton kodiert. Seren von durch wiederholte Immunisierung mit abgetöteten E. tenella-Sporozoiten immunisierten Hühnchen fällten dieses Antigen immunologisch aus iodierten Sporocysten- und Sporozoit-Membran-Präparaten. Kürzlich beschrieb Jenkins [Nucleic Acids Res. 16:9863 (1988)] eine cDNS, die einen Teil eines Merozoiten-Oberflächenproteins von Eimeria acervulina mit 250.000 Dalton kodiert. Das Expressions-Produkt dieser cDNS wurde von einem Antiserum gegen den Organismus erkannt.
Fortschritte in der rekombinanten DNS-Technik haben einen anderen Lösungsweg zugänglich gemacht, d. h. eine Untereinheit als Impfstoff. Beispiele für solche Untereinheiten als Impfstoffe werden beschrieben in den Europäischen Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungs-Nummern 324 648, 337 589 und 344 808.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Protein zur Verfügung mit einer oder mehreren immunreaktiven und/oder antigenen Determinanten des Oberflächenantigens von Eimeria-Merozoiten, wobei das Oberflächen-Antigen ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 23 Kilodalton mit Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) hat und sich von einem Vorläufer-Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 30 Kilodalton gemäß SDS-PAGE ableitet, wobei das Protein durch die Nucleotidsequenz
oder eine äquivalente Sequenz davon kodiert wird, wobei das Protein von anderen Eimeria-Proteinen frei ist.
Genauer liefert die Erfindung ein isoliertes Protein, das das Oberflächen-Antigen von Eimeria-Merozoiten ist mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 23 Kilodalton, bestimmt mit SDS-PAGE und Fragmente dieses Proteins. Diese Proteine und Fragmente sind frei von anderen Eimeria-Proteinen.
Die Erfindung liefert weiterhin ein Protein, das das Vorläufer-Protein des oben erwähnten Eimeria-Merozoiten-Oberflächen-Antigens oder eines Fragments davon ist, wobei das Vorläuferprotein ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30 Kilodalton hat, bestimmt mit SDS-PAGE, und die oben in Figur 1 gezeigte Aminosäuresequenz hat. Dieses Vorläufer- Protein ist frei von anderen Eimeria-Proteinen.
Das bevorzugte Protein der vorliegenden Erfindung ist das reife Oberflächen-Antigen-Protein der Eimeria-Merozoiten mit der in Figur 1 gezeigten Aminosäuresequenz, dem die Signalpeptid-Sequenz am N-Ende fehlt, wobei diese Signalpeptid-Sequenz die ersten 20 Aminosäuren in der in Figur 1 gezeigten Sequenz umfaßt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein funktionell äquivalentes Protein mit einer Aminosäuresequenz, die mit der Aminosäuresequenz durch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen verwandt ist, ohne die immunologischen Eigenschaften des Proteins zu verändern.
Die Erfindung liefert weiterhin eine DNS, die das gesamte Eimeria-Merozoiten-Oberflächen-Antigen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 23 Kilodalton oder einem Teil davon oder das vorher erwähnte Vorläufer-Protein kodiert, rekombinante Vektoren, die die Expression der DNS in kompatiblen Wirtsorganismen steuern können und Mikroorganismen, die solche Vektoren enthalten.
Die Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit einer oder mehreren immunreaktiven und/oder antigenen Determinanten eines Merozoiten-Oberflächenantigens von Eimeria, wobei das Oberflächenantigen ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 23 Kilodalton hat, wobei das Verfahren umfaßt, daß man:
(a) einen Mikroorganismus züchtet, der einen rekombinanten Vektor enthält, der eine DNS mit einer Nucleotid- Sequenz, die das Protein kodiert, wie z.B. die DNS mit der in Figur 1 dargestellten Nucleotidsequenz oder ein Fragment davon umfaßt, unter Bedingungen, bei denen die DNS-Sequenz oder das DNS-Fragment exprimiert wird und
(b) das Protein aus der Kultur isoliert.
Die Erfindung liefert weiterhin Impfstoffe oder Vakzinen, um Geflügel gegen Kokzidiose zu schützen, die eine wirksame Menge eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Proteine und einen physiologisch annehmbaren Träger umfassen.
Die Erfindung liefert weiterhin Impfstoffe, um Geflügel gegen Kokzidiose zu schützen, die einen rekombinanten Virus, der eine DNS-Sequenz enthält, die ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, wobei der rekombinante Virus die Expression der DNS-Sequenz verursachen kann, und einen physiologisch annehmbaren Träger umfaßt.
Die Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zum Schutz von Geflügel gegen Kokzidiose, wobei das Verfahren umfaßt, daß man jungem Geflügel, das für Kokzidiose anfällig ist, eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Impfstoffes verabreicht.
Die Eimeria-Proteine der Erfindung sind wichtige Impf-Antigene, da sie durch Verwendung von Antikörpern in den Seren von Tieren, die gegen den Kokzidiose-Organismus immunisiert wurden, und eine Immunität dagegen entwickelt hatten, identifiziert wurden. Daher ist es sehr wahrscheinlich, daß diese Proteine eine wesentliche Rolle beim Schutz von Geflügel vor Kokzidiose spielen.
Die Erfindung kann leichter verstanden werden unter Bezugnahme auf die Figuren, worin:
Fig. 1 die Nucleotidsequenz des 1,2 kb cDNS-Moleküls zeigt, das das Eimeria-Vorläuferprotein kodiert, das von Antikörpern der Antikörperauswahl von Kaninchen und von Geflügel-Immunseren erkannt wird. Wie aus Figur 1 zu ersehen ist, ist die Nucleotidsequenz, die das Vorläuferprotein kodiert, zwischen dem ATG von Nucleotid 68 und dem Stop-Codon TAA von Nucleotid 668, enthalten (kodierend für 200 Aminosäuren). Figur 1 zeigt auch die Aminosäureseguenz des Eimeria-Vorläuferproteins, die durch die Nucleotid-Sequenz bestimmt wird. Es werden die üblichen Ein-Buchstaben-Abkürzungen verwendet, um die Nucleotide und Aminosäuren darzustellen. Die Bedeutungen dieser Abkürzungen finden sich in Standard-Lehrbüchern der Biochemie, z.B. Lehninger, Principles of Biochemistry, 1984, Worth Publishers, Inc., New York, Seite 96, 798.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer SDS-PAGE-Analyse verschiedener Eimeria-Merozoiten-Proteine. Die Platte A ist ein Immunoblot aller Merozoitproteine, die mit Kontroll- (a) oder mit Antikörperauswahl(b)-Antikörpern sondiert wurden. Der Pfeil bei Platte A zeigt die Position einer Bande, die ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 23 Kilodalton enthält. Die Platte B ist ein Autoradiogramm von mit ¹²&sup5;I an der Oberfläche markierten Merozoiten-Proteinen, die mit Kontroll(a) oder mit Antikörperauswahl- (b) Antikörpern immunologisch ausgefällt wurden. Platte C zeigt die vollständige Mischung von Produkten, die durch in vitro Translation von Merozoit-mRNA erzeugt wurden (a) und die Translations-Produkte, die mit Antikörpern immunologisch ausgefällt wurden, die ausgewählt wurden unter Verwendung des lambda 5-7-Klons (b), mit Antikörpern, die unter Verwendung eines anderen Phagen-Klons ausgewählt wurden, der Proteine erzeugt, die mit Anti-Merozoitenserum reagieren (c), und mit Kontroll-Antikörper, die aus Merozoitenserum ausgewählt wurden unter Verwendung nicht rekombinanter Phagen (d). Die Banden wurden durch Fluorographie sichtbar gemacht. Die Positionen der Molekulargewichts- Markierungen mit dem angegebenen Molekulargewicht in Kilodalton (kDa) sind rechts von der Figur gezeigt.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse einer Southern-Blot-Analyse der Genom-DNS von sporulierten Oozysten von Eimeria tenella, die mit PvuII (Bahn 1), HincII (Bahn 2), PstI (Bahn 3), SphI (Bahn 4) oder SacI (Bahn 5) verdaut wurde. Die Positionen der Standard-DNSs mit den angegebenen Größen in kb sind rechts von der Figur gezeigt.
Figur 4 zeigt eine schematische Zeichnung des Plasmids pDS56/RBSII. In diesem Diagramm und in den Figuren 6, 8 und 10 zeigen die Abkürzungen und Symbole B, Bg, E, H, N, P, S, X und Xb Schnittstellen der Restriktions-Enzyme BamHI, BglII, EcoRI, HindIII, NcoI, PstI, SalI, XhoI bzw. XbaI. bedeutet das regulierbare Promotor/- Operator-Element N25OPSN25OP29; bedeutet die ribosomalen Bindungsstellen RBSII, RSBII(-1) und RBSII(-2);
T bedeutet kodierende Regionen unter der Kontrolle dieser ribosomalen Bindungsstellen;
bedeutet eine Region, die sechs Histidin-Reste kodiert; bedeutet die Terminatoren to und Tl; bedeutet die Region, die für die DNS-Replikation in E. coli (Repl.) erforderlich ist; bedeutet kodierende Regionen für Dihydrofolat-Reduktase (dhfr), Chloramphenicol-Acetyltransferase (cat), beta-Lactamase (bla), lac-Repressor (lacl) und Neomycin-Phosphotransferase (neo).
Fig. 5 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz des Plasmids pDS56/RBSII. In dieser Sequenz sind die Erkennungs-Sequenzen der Restriktions-Enzyme, die in Fig. 4 dargestellt sind, gezeigt. Die gezeigte Aminosäure-Sequenz stellt den offenen Leserahmen unter der Kontrolle der ribosomalen Bindungsstelle RBSII dar.
Fig. 6 ist eine schematische Zeichnung des Plasmids pDS56/RBSII(-1).
Fig. 7 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz des Plasmids pDS56/RBSII(-1). In dieser Sequenz sind die Erkennungs-Sequenzen der Restriktionsenzyme, die in Figur 6 gezeigt sind, angedeutet. Die gezeigte Aminosäure-Sequenz stellt den offenen Leserahmen unter Kontrolle der ribosomalen Bindungsstelle RBSII(-1) dar.
Figur 8 ist eine schematische Zeichnung des Plasmids pDS56/RBSII(-2).
Fig. 9 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz des Plasmids pDS56/RBSII(-2). In dieser Sequenz sind die Erkennungs-Sequenzen der Restriktionsenzyme, die in Figur 8 dargestellt sind, angegeben. Die gezeigte Aminosäuresequenz stellt den offenen Leserahmen unter Kontrolle der ribosomalen Bindungsstelle RBSII(-2) dar.
Fig. 10 ist eine schematische Zeichnung des Plasmids pDMI.1.
Fig. 11 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz des Plasmids pDMI.1. In dieser Sequenz sind die Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme, die in Fig. 10 dargestellt sind, angegeben. Die gezeigten Aminosäuren schließen den offenen Leserahmen ein, der die Neomycin-Phospho-Transferase (Met bis Phe) und den lac-Repressor (Met bis Gln; die umgekehrte Orientierung dieses Gens ist zu beachten) kodiert.
Alle hier zitierten Bezugnahmen werden in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
Die folgenden Ausdrücke sollen, wenn sie hier verwendet werden, die folgenden Bedeutungen haben:
"Eimeria-Oberflächenantigen" bedeutet ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 23 Kilodalton mit SDS-PAGE, das im Merozoiten-Stadium von Eimeria tenella vorhanden ist. Dieses Protein scheint bei der posttranslationalen Prozessierung des in vivo Expressionsproduktes eines Gens mit der Nucleotidsequenz, die in Figur 1 gezeigt ist, erzeugt zu werden.
"Vorläuferprotein" bedeutet ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 30 Kilodalton gemäß SDS- PAGE. Es wird angenommen, daß dieses Protein durch Proteolyse in vivo zu dem Eimeria-Oberflächenantigen prozessiert wird. Die Nucleotidsequenz eines cDNS-Moleküls, das dieses Protein kodiert, und die Aminosäuresequenz, die daraus vorhergesagt wird, sind in Figur 1 gezeigt.
Der Ausdruck "ein Protein mit einer oder mehreren immunreaktiven und/oder antigenen Determinanten des Eimeria- Oberflächenantigens" bedeutet ein Protein mit einer oder mehreren Regionen oder Epitopen, die eine Immunantwort in einem immunologisch kompetenten Wirtsorganismus hervorrufen können und/oder an einen komplementären Antikörper spezifisch binden können, die den Epitopen des oben definierten Eimeria-Oberflächenantigens entsprechen. Dieses Protein kann durch funktionelle Äquivalente der Nucleotidsequenz von Figur 1 kodiert werden. Diese funktionell äquivalenten Proteine haben Aminosäuresequenzen, die mit der Sequenz von Figur 1 verwandt sind durch Aminosäure-Substitutionen, die die immunologische Aktivität nicht wesentlich verändern (d.h. die im wesentlichen die immunreaktiven und/oder antigenen Determinanten nicht zerstören).
Wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes versteht es sich von selbst, daß es viele potentielle Nucleotidsequenzen (funktionelle Äquivalente) gibt, die die in Figur 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodieren können. Es versteht sich auch, daß die Nucleotidsequenzen der DNS-Sequenzen und Fragmente der Erfindung, die in Vektoren eingesetzt werden, Nucleotide einschließen können, die nicht Teil der aktuellen Strukturgene sind, solange die rekombinanten Vektoren, die eine solche Sequenz oder solche Fragmente enthalten, die die Erzeugung eines Proteins oder Fragments mit einer oder mehreren immunreaktiven und/oder antigenen Determinanten des Eimeria Oberflächenantigens in einem geeigneten Wirtsorganismus steuern können.
Aminosäure-Substitutionen bei Proteinen, die die biologischen und immunologischen Aktivitäten nicht wesentlich verändern, sind bekannt und wurden z.B. beschrieben von Neurath et al., in "The Proteins", Academic Press, New York, (1979), insbesondere in Figur 6 auf Seite 14. Die am häufigsten beobachteten Aminosäure-Substitutionen sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly und umgekehrt.
Solche funktionell äquivalenten Nucleotid-Sequenz-Variationen und Aminosäure-Substitutionen der beispielhaften Ausführungsformen der Erfindung liegen im Rahmen der Erfindung, solange die entstehenden Proteine ein oder mehrere immunreaktive und/oder antigene Determinanten des hier definierten Eimeria-Oberflächenantigens behalten.
Andere DNS-Sequenzen, die die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder durch Substitutionen verwandte Aminosäuresequenzen kodieren, können leicht hergestellt werden unter Verwendung geeigneter synthetischer Oligonucleotide mit der durch Primer gesteuerten Schnittstellen-spezifischen Mutagenese der beispielhaften cDNS der Erfindung (Fig. 1), wie von Morinaga et al. beschrieben [Biotechnology 2:636 (1984)].
Der Ausdruck "Fragment" bedeutet ein Oligonucleotid oder Polypeptid, das eine Untersequenz einer der cDNS's oder Proteine der Erfindung umfaßt. Solche Fragmente können durch enzymatische Spaltung der größeren Moleküle, unter Verwendung von Restriktions-Endonucleasen für die DNS und von Proteasen für die Proteine erzeugt werden. Die erfindungsgemäßen Fragmente sind jedoch nicht auf die Produkte irgendeiner Form einer enzymatischen Spaltung beschränkt, sondern schließen Untersequenzen ein, deren Enden nicht irgendwelchen enzymatischen Spaltungsstellen entsprechen. Solche Fragmente können z.B. durch chemische Synthese hergestellt werden unter Verwendung der Sequenzdaten, die hier geliefert werden. Die DNS-Fragmente können auch hergestellt werden durch unvollständige Synthese der komplementären DNS (cDNS) aus isolierter Messenger-RNA (mRNA). Proteinfragmente können auch hergestellt werden, indem DNS-Fragmente exprimiert werden, die Proteinfragmente kodieren. Solche Proteinfragmente können für die vorliegende Erfindung nützlich sein, wenn sie eine ausreichende Anzahl von Aminosäureresten enthalten, um eine immunreaktive und/oder antigene Determinante zu bilden. Allgemein sind mindestens etwa 7 oder 8 Reste notwendig. Wie unten erklärt, kann es notwendig sein, solche Fragmente an ein immunogenes Trägermolekül zu kuppeln, um sie immunreaktiv zu machen.
Die erfindungsgemäßen Proteine können mit auf diesem Gebiet bekannten Methoden hergestellt werden, z.B. durch rekombinante DNS-Methodik, chemische Synthese oder Isolierung von Eimeria-Präparaten.
Die DNS, die erforderlich ist, um die Proteine der Erfindung herzustellen, könnte chemisch synthetisiert werden unter Verwendung der in Figur 1 gelieferten Nucleotidsequenz-Information. Eine solche chemische Synthese kann durchgeführt werden unter Verwendung irgendwelcher bekannter Methoden, wie z.B. der Phosphoramidit-Methode mit festem Träger von Matteucci et al. [J. Am. chem. Soc. 103:3185 (1981)].
Alternativ kann cDNS aus Eimeria-mRNA hergestellt werden. Messenger-RNA kann von Eimeria-Merozoiten isoliert werden unter Verwendung von Standard-Techniken. Diese mRNA-Proben können verwendet werden, um doppelsträngige cDNS herzustellen, wie von Maniatis et al. beschrieben [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]. Diese cDNS kann in einen geeigneten Klonierungsvektor insertiert werden, der verwendet werden kann, um E. coli zu transformieren, um eine cDNS-Bibliothek herzustellen.
Die cDNS-Bibliothek kann dann gescreent werden unter Verwendung des erfindungsgemäßen geklonten Gens oder von Fragmenten davon als Sonden. Solche Gene oder Fragmente können radioaktiv markiert werden, z.B. durch Nick-Translation unter Verwendung von Pol I DNS-Polymerase in Gegenwart der vier Desoxyribonucleotide, von denen eines ³²P an einer Stelle enthält (Maniatis et al., oben, Seite 109) zur Verwendung als Sonden. Die Sonden können auch hergestellt werden durch Oligonucleotid-Synthese auf Basis der bekannten Sequenz der cDNS des Eimeria-Oberflächenantigens.
Obwohl Eimeria tenella als mRNA-Quelle in den Beispielen unten verwendet wurde, können die klonierten Gene dieser Art als Sonden verwendet werden, um Gene von anderen Arten von Eimeria zu isolieren aufgrund der DNS-Sequenz-Homologie unter den verschiedenen Arten.
Einmal identifiziert und isoliert werden die Eimeria-DNS- Sequenzen der Erfindung in ein geeignetes Expressionshilfsmittel insertiert, das die Elemente enthält, die notwendig sind für die Transkription und Translation der insertierten Gensequenzen. Geeignete Klonierungshilfsmittel können aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNS-Sequenzen bestehen, wie z.B. verschiedenen bekannten Bakterien-Plasmiden, Phagen-DNS, Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNS, z.B. Plasmiden, die modifiziert wurden unter Anwendung von Phagen-DNS oder anderen Expressions-Kontrollsequenzen oder Hefe-Plasmiden. Spezifische Klonierungshilfsmittel, die verwendet werden können, schließen pEV-vrf-Plasmide (pEV-vrf1, -2 und -3, die von Crowl et al., Gene 38:31 (1985) beschrieben werden); SV40; Adenovirus; Hefe; lambda-gt-WES-lambda B; Charon 4A und 28; lambda-gt-1-lambda B; Vektoren, die sich von M13 ableiten, z.B. pUC8, 9, 18 und 19, pBR313, 322 und 325; pAC105; pVA51; pACY177; pKH47; pACYC184; pUB110; pMB9; colE1; pSC101; pML21; RSF2124; pCRl oder RP4; Geflügelpocken; Vaccinia; Mitglieder der Herpes-Virus-Familie ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Insertion der Eimeria-Gene in einen Klonierungs-Vektor kann leicht erreicht werden, wenn sowohl die Gene als auch der gewünschte Klonierungsvektor mit dem gleichen Restriktionsenzym oder den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten wurden, da dadurch komplementäre DNS-Enden erzeugt werden. Wenn dies nicht erreicht werden kann, kann es notwendig sein, die geschnittenen Enden, die erzeugt wurden durch Verdau der einzelsträngigen DNS unter Erzeugung glatter Enden, zu modifizieren oder dasselbe Resultat zu erreichen, indem die einzelsträngigen Enden mit einer geeigneten DNS-Polymerase aufgefüllt werden. Auf diese Weise kann eine Blunt-End-Ligierung mit einem Enzym wie der T4-DNS-Ligase durchgeführt werden. Alternativ kann irgendeine gewünschte Stelle erzeugt werden, indem Nucleotidsequenzen (Linker) an die DNS-Enden ligiert werden. Solche Linker können spezifische Oligonucleotidsequenzen umfassen, die Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme kodieren. Der gespaltene Vektor und die Eimeria-Gene oder -Fragmente können auch durch Homopolymerschwänze modifiziert werden, wie von Morrow beschrieben [Methods in Enzymology 68:3 (1979)].
Viele der Klonierungshilfsmittel, die für die Erfindung verwendet werden können, enthalten ein oder mehrere Markierungs-Aktivitäten, die verwendet werden können, um die gewünschten Transformanden auszuwählen, z.B. Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz bei pBR322, Ampicillin-Resistenz und β-Galactosidase-Aktivität bei pUC8 und Ampicillin-Resistenz bei pEV-vrf-Plasmiden. Die Selektion von Wirtszellen, in die solche Vektoren insertiert wurden, wird stark vereinfacht, wenn den Wirtszellen ansonsten die durch die Vektoren vermittelten Aktivitäten fehlen.
Es versteht sich, daß die Nucleotidsequenzen der Eimeria- Gene, die an einer ausgewählten Stelle in einen Klonierungsvektor insertiert werden, Nucleotide einschließen können, die nicht Teil der tatsächlichen Strukturgene sind. Alternativ können die Gene nur einen Teil des vollständigen Wildtypgens enthalten. Es ist nur erforderlich, daß die Genfragmente nach der Insertion in einen Klonierungsvektor die Produktion eines Polypeptids oder Proteins mit mindestens einer immunreaktiven und/oder antigenen Determinante des Eimeria-Oberflächenantigens in einem geeigneten Wirtsorganismus steuern können. Somit können die rekombinanten Vektoren, die eine DNS mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, enthalten, hergestellt werden, indem:
(a) eine DNS mit der Nucleotidsequenz, die das Protein kodiert, in einen Vektor insertiert wird;
(b) der Vektor in einen Mikroorganismus repliziert wird und
(c) der rekombinante Vektor aus dem Mikroorganismus isoliert wird.
Die Auswahl eines geeigneten Wirtsorganismus wird beeinflußt von einer Anzahl von Faktoren, die im Stand der Technik bekannt sind. Diese Faktoren schließen z.B. die Kompatibilität mit dem ausgewählten Vektor, die Toxizität der von dem Hybrid-Plasmid kodierten Proteine, die Leichtigkeit der Gewinnung des gewünschten Proteins, Expressions-Eigenschaften, biologische Sicherheit und Kosten ein. Ein Ausgleich dieser Faktoren muß beachtet werden und es versteht sich, daß nicht alle Wirte gleich effektiv sind bei der Expression eines speziellen rekombinanten DNS-Moleküls.
Geeignete Wirtsorganismen, die für die Erfindung verwendet werden können, schließen Pflanzen-, Säugetier- oder Hefezellen und Bakterien wie Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus und Actinomyces ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Escherichia coli Stamm MC1061, der von Casadaban et al. beschrieben wurde [J. Mol. Biol. 138:179 (1980)] kann verwendet werden oder irgendein anderer Stamm von E. coli K-12, der das Plasmid pRK248cIts enthält. Das Plasmid pRK248cIts für die Verwendung in anderen E. coli K-12-Stämmen wird beschrieben von Bernhard et al. [Meth. of Enzymol. 68:482 (1979) und ist auch von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 33766 erhältlich. Der E. coli-Stamm MC1061 ist im Handel erhältlich, z.B. von CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA und ist auch erhältlich von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53338. Die Plasmide pDM1.1, pDS56/RBSII, -1 oder -2 zur Verwendung in dem E. coli-Stamm M15 werden unten beschrieben.
Der Transfer des rekombinanten Klonierungs-Vektors in die Wirtszelle kann auf einer Vielzahl von Wegen durchgeführt werden. Abhängig von dem jeweiligen ausgewählten Vektor/- Wirtszellsystem kann ein solcher Transfer bewirkt werden durch Transformation, Transduktion oder Transfektion. Wenn einmal eine modifizierte Wirtszelle erzeugt worden ist, kann die Zelle gezüchtet werden und das Protein-Expressionsprodukt kann aus der Kultur isoliert werden.
Transformantenklone, die das Vorläuferprotein des Eimeria- Oberflächenantigens erzeugen, werden identifiziert durch Screening mit Serum von Tieren, die mit an Glutaraldehyd gebundenen Sporozoiten oder Merozoiten von E. tenella immunisiert wurden. In den Beispielen unten wurde Kaninchen- Anti-Merozoitserum verwendet zum Screening und Charakterisieren des Genproduktes. Ein paralleles immunologisches Screening mit Hühner-Immunserum führte zu der unabhängigen Isolierung der das Merozoit-Oberflächenantigen kodierenden cDNS.
Die Spezifität der Antiseren, die für das immunologische Screening oder die Immunfällung verwendet werden, kann erhöht werden, indem eine Variation der Antikörper-Auswahlmethode von Hall et al. [Nature 311:379 (1984)] verwendet wird. Bei diesem Verfahren, das unten genauer beschrieben wird, werden Antikörper, die für Eimeria-Proteine, die von den Klonen hergestellt werden, spezifisch sind, an Filtern absorbiert.
Der Nachweis von Eimeria-Antigen produzierenden Klonen kann erreicht werden durch Verwendung von wohlbekannten Standard-Testmethoden, einschließlich der Immunfällung, des Enzym-Immuno-Assays und von Radio-Immuno-Assay-Techniken, die in der Literatur beschrieben wurden [siehe z.B. Kennet et al. (Herausgeber), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, 1980, Plenum Press, New York, Seiten 376 bis 384].
Große Mengen des rekombinanten Eimeria-Proteins können erzeugt werden, indem die transformierten Mikroorganismen, die auf diesem Weg erhalten wurden, in einer Fermentationsbrühe gezüchtet werden, die die notwendigen Nährstoffe enthält, unter Bedingungen, die für die Expression der rekombinanten DNS geeignet sind. Die rekombinanten Eimeria-Proteine sind, wenn sie in E. coli erzeugt werden, im Cytoplasma oder in Einschlußkörpern (inclusion bodies) vorhanden. Um die Proteine freizusetzen, ist es daher notwendig, die äußere Membran der Bakterien zu zerstören. Dies wird durch Beschallung oder andere mechanisch zerstörende Mittel erreicht, z.B. unter Verwendung einer French-Presse oder eines Gaulin-Homogenisators [Charm et al., Meth. Enzymol. 22, 476-556 (1971)].
Das Zerbrechen der Zellen kann auch mit chemischen oder enzymatischen Mitteln erreicht werden. Da divalente Kationen oft für die Integrität der Zellmembran erforderlich sind, könnte eine Behandlung mit geeigneten Komplexierungsmitteln wie EDTA oder EGTA ausreichend zerstörend wirken, um das Austreten der Proteine aus den Zellen zu ermöglichen. In ähnlicher Weise wurden Enzyme wie Lysozym verwendet, um das gleiche Ergebnis zu erreichen. Dieses Enzym hydrolysiert das Peptidoglycangerüst der Zellwand.
Die Anwendung des osmotischen Schocks ist auch möglich. Kurz gesagt kann dies erreicht werden, indem die Zellen zuerst in eine hypertonische Lösung gebracht werden, die verursacht, daß sie Wasser verlieren und schrumpfen. Wenn man sie anschließend in eine hypotonische "Schock"-Lösung bringt, kommt es zu einem schnellen Einfließen von Wasser in die Zellen, was zu einem Ausstoßen der gewünschten Proteine führt.
Wenn die Eimeria-Proteine einmal aus den Zellen befreit sind, können sie durch Ausfällung mit Salzen wie Natrium- oder Ammoniumsulfat, Ultrafiltration oder andere Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, konzentriert werden. Eine weitere Reinigung könnte mit üblichen Protein-Reinigungstechniken einschließlich der Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatographie, präparativen Disk-Gel- oder Bahn-Elektrophorese, isoelektrischen Fokussierung, Fraktionierung in einem organischen Lösungsmittel bei niedriger Temperatur oder Gegenstrom-Verteilung erreicht werden. Die Reinigung kann auch mit Immun- Affinitätschromatographie durchgeführt werden.
Spezifische Methoden zur Reinigung von Eimeria-Proteinen aus den Organismen sind auf diesem Gebiet bekannt. Siehe z.B. Newman et al., Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 164 176.
Die erfindungsgemäßen Proteine oder deren Fragmente können auch chemisch synthetisiert werden mit einer geeigneten Methode, z.B. ausschließlich durch Festphasensynthese, Teil-Festphasenmethoden, Fragmentkondensation oder die klassische Lösungssynthese. Die Festphasensynthese, wie von Merrifield beschrieben [J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)] ist bevorzugt.
Eine solche Synthese wird mit Aminosäuren durchgeführt, die am α-Aminoende geschützt sind. Trifunktionelle Aminosäuren mit labilen Seitenketten werden auch mit geeigneten Gruppen geschützt, die verhindern, daß eine chemische Reaktion an dieser Stelle während des Aufbaus des Peptids erfolgt. Die α-Aminoschutzgruppe wird selektiv entfernt, um eine nachfolgende Reaktion an dem Amino-Ende stattfinden zu lassen. Die Bedingungen für die Entfernung der α-Aminoschutzgruppe verursachen nicht die Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen.
Die α-Aminoschutzgruppen sind solche, von denen bekannt ist, daß sie geeignet sind zur stufenweisen Synthese von Peptiden. Eingeschlossen sind Acylschutzgruppen (z.B. Formyl-, Trifluoracetyl-, Acetylgruppen), aromatische Urethanschutzgruppen (z.B. Benzyloxycarbonyl- (Cbz) und substituierte Benzyloxycarbonylgruppen), aliphatische Urethanschutzgruppen (z.B. t-Butyloxycarbonyl- (Boc), Isopropyloxycarbonyl-, Cyclohexyloxycarbonylgruppen) und Alkylschutzgruppen (z.B. Benzyl-, Triphenylmethylgruppen). Die bevorzugte Schutzgruppe ist Boc. Die Seitenkettenschutzgruppen für Tyr schließen Tetrahydropyranyl-, tert.-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, Cbz-, 4-Br-Cbz- und 2,6-Dichlorbenzylgruppen ein. Die bevorzugte Seitenkettenschutzgruppe für Tyr ist die 2,6-Dichlorbenzylgruppe. Die Seitenkettenschutzgruppen für Asp schließen Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl-, Methyl-, Ethyl- und Cyclohexylgruppen ein. Die bevorzugte Seitenkettenschutzgruppe für Asp ist die Cyclohexylgruppe. Die Seitenkettenschutzgruppen für Thr und Ser schließen Acetyl-, Benzoyl-, Trityl-, Tetrahydropyranyl-, Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl und Cbz-Gruppen ein. Die bevorzugte Schutzgruppe für Thr und Ser ist die Benzylgruppe. Die Seitenkettenschutzgruppen für Arg schließen Nitro-, Tos-, Cbz-, Adamantyloxycarbonyl- oder Boc-Gruppen ein. Die bevorzugte Schutzgruppe für Arg ist Tos. Die Seitenketten-Aminogruppe von Lys kann geschützt werden mit cbz, 2-Cl- Cbz, Tos oder Boc. Die 2-Cl-Cbz-Gruppe ist die bevorzugte Schutzgruppe für Lys. Die Auswahl der Seitenkettenschutzgruppe basiert auf dem Folgenden: die Seitenkettenschutzgruppe bleibt während des Kuppelns intakt und wird nicht abgespalten, wenn die Schutzgruppe für das Aminoende abgespalten wird oder unter Kupplungsbedingungen. Die Seitenkettenschutzgruppe muß entfernbar sein nach Abschluß der Synthese des endgültigen Peptids unter Verwendung von Reaktionsbedingungen, die das Zielpeptid nicht verändern.
Die Festphasensynthese wird in üblicher Weise durchgeführt vom Carboxyende her, indem die an der α-Aminogruppe geschützte (Seitenketten-geschützte) Aminosäure an einen geeigneten festen Träger gekuppelt wird. Eine Esterbindung wird gebildet, wenn die Bindung an ein chlormethyliertes oder Hydroxymethyl-Harz erfolgt und das entstehende Zielpeptid wird eine freie Carboxylgruppe am C-Ende haben. Alternativ wird ein Benzhydrylamin- oder p-Methylbenzhydrylamin-Harz verwendet, wobei dann eine Amidbildung geformt wird und das entstehende Ziel-Peptid eine Carboxamidgruppe am C-Ende haben wird. Diese Harze sind im Handel erhältlich und ihre Herstellung wird von Stewart et al. beschrieben in "Solid Phase Peptide Synthesis" (2. Ausgabe, Pierce Chemical Co., Rockford, IL., 1984).
Die C-terminale Aminosäure, Arg, geschützt an der Seitenkette mit Tos und an der α-Aminofunktion mit Boc wird an das Benzhydrylamin-Harz gekuppelt unter Verwendung verschiedener Aktivierungsmittel einschließlich Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid und Carbonyldiimidazol. Nach dem Binden an den Harzträger wird die α-Aminoschutzgruppe entfernt unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) oder HCl in Dioxan bei einer Temperatur zwischen 0 und 25ºC. Dimethylsulfid wird zu dem TFA nach Einführung von Methionin (Met) zugegeben, um eine mögliche S-Alkylierung zu unterdrücken. Nach Entfernung der α- Aminoschutzgruppe werden die verbleibenden geschützten Aminosäuren stufenweise in der erforderlichen Reihenfolge gekuppelt, um die gewünschte Peptidsequenz zu erhalten.
Verschiedene Aktivierungsmittel können für die Kupplungsreaktionen verwendet werden einschließlich DDC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorphosphat (BOP) und DCC-Hydroxybenzotriazol (HoBt). Jede geschützte Aminosäure wird im Überschuß verwendet (> 2,5 Äquivalente) und die Kupplungen werden gewöhnlich in DMF, CH&sub2;Cl&sub2; oder Mischungen davon durchgeführt. Das Ausmaß der Vollständigkeit der Kupplungs- Reaktion wird in jeder Stufe überwacht durch die Ninhydrin- Reaktion, wie von Kaiser et al. beschrieben [Anal. Biochem. 34:595 (1970)]. In Fällen, in denen eine unvollständige Kupplung festgestellt wird, wird die Kupplungsreaktion wiederholt. Die Kupplungsreaktionen können automatisch an einer Synthese-Vorrichtung Vega 250 von Applied Biosystems oder einem anderen im Handel erhältlichen Gerät durchgeführt werden. Nach dem vollständigen Aufbau des Zielpeptids werden die Schutzgruppen des Peptidharzes mit TFA/Dithioethan abgespalten und dann wird das Zielpeptid mit einem Reagenz wie flüssigem HF 1 bis 2 Stunden bei 0ºC abgespalten, was das Peptid von dem Harz abspaltet und alle Seitenkettenschutzgruppen entfernt.
Die Cyclisierung von Seitenkette zu Seitenkette an dem festen Träger erfordert die Verwendung eines orthogonalen Schutzschemas, was die selektive Spaltung der Seitenketten-Funktionen der sauren Aminosäuren (z.B. Asp) und der basischen Aminosäuren (z.B. Lys) ermöglicht. Die 9-Fluorenylmethyl-(OFm)-Schutzgruppe für die Seitenkette von Asp und die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc)-Schutzgruppe für die Seitenkette von Lys können zu diesem Zweck verwendet werden. In diesen Fällen werden die Seitenkettenschutzgruppen des Boc-geschützten Peptidharzes selektiv mit Piperidin in DMF entfernt. Die cyclisierung wird an dem festen Träger erreicht unter Verwendung verschiedener Aktivierungsmittel einschließlich DCC, DCC/HOBt oder BOP. Die HF-Reaktion wird an dem cyclisierten Peptidharz durchgeführt, wie oben beschrieben.
Die Reinigung der synthetischen Proteine kann, wie oben für die rekombinant erzeugten Proteine beschrieben, durchgeführt werden.
Eimeria-Proteine können auch aus den Organismen, aus Extrakten von Membranproteinen gewonnen werden. Solche Methoden können die vollständigen Wildtyp-Proteine erzeugen. Monoklonale Antikörper für diesen Zweck können hergestellt werden, wie von Köhler und Milstein beschrieben [Nature 256:495 (1975)] unter Verwendung synthetischer oder natürlicher Eimeria-Proteine als Antigen. Diese Methoden können verwendet werden, um das 23 kd Eimeria-Oberflächenantigen der Erfindung zu reinigen.
Ein oder mehrere Eimeria-Proteine der Erfindung können zu Impfstoffen formuliert werden, die die Proteine und einen physiologisch annehmbaren Träger umfassen. Geeignete Träger schließen z.B. 0,01 bis 0,1 M Phosphatpuffer mit neutralem pH oder physiologische Kochsalzlösung ein.
Eine verbesserte Immunität gegenüber Kokzidiose kann auf einem von zwei Wegen erzeugt werden. Zuerst kann ein Adjuvans oder ein Immunverstärker zu dem Impfstoff zugegeben werden. Als zweites können die erfindungsgemäßen Proteine einem Tier, das immunisiert werden soll, in einer größeren Form, entweder als vernetzter Komplex oder konjugiert mit einem Trägermolekül, präsentiert werden.
Geeignete Adjuvantien für die Impfung von Tieren schließen Adjuvans 65 (enthaltend Erdnußöl, Mannid-Monooleat und Aluminium-Monostearat); Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Alaun; Tenside wie Hexadecylamin, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N',N'-bis (2-hydroxymethyl)propandiamin, Methoxyhexadecylglycerin und Pluronic-Polyole; Polyanionen wie Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure und Carbopol; Peptide wie Muramyldipeptid, Dimethylglycin und Tuftsin und Ölemulsionen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Proteine könnten auch nach Einarbeitung in Liposomen oder andere Mikroträger verabreicht werden.
Das Einarbeiten in Liposomen oder andere Mikroträger bietet ein Mittel, mit dem die Freisetzung der Impfstoffe über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten werden kann. Eine Pumpe, z.B. eine osmotische Alza-Pumpe, kann zum selben Zweck verwendet werden.
Die Immunogenizität der erfindungsgemäßen Proteine, insbesondere der kleineren Fragmente, kann durch Vernetzung oder Kupplung an ein immunogenes Trägermolekül (d.h. ein Makromolekül mit der Eigenschaft, unabhängig eine immunologische Antwort bei einem Wirtstier hervorzurufen, an das die Proteine und Protein-Fragmente der Erfindung kovalent gebunden werden können) verbessert werden. Das Vernetzen oder die Konjugation mit einem Trägermolekül können erforderlich sein, da kleine Proteinfragmente manchmal als Haptene wirken (Moleküle, die spezifisch an einen Antikörper binden können, aber keine Antikörper-Produktion hervorrufen können, d.h. sie sind nicht immunogen). Die Konjugation solcher Fragmente an ein immunogenes Trägermolekül macht die Fragmente immunogen durch die allgemein bekannte "Trägerwirkung".
Geeignete Trägermoleküle schließen z.B. Proteine und natürliche oder synthetische polymere Verbindungen wie Polypeptide, Polysaccharide, Lipopolysaccharide etc. ein. Ein geeigneter Träger ist ein Glycosid mit dem Namen Quil A, das von Morein et al. beschrieben wurde [Nature 308:457 (1984)]. Proteinträgermoleküle sind besonders bevorzugt, einschließlich Säugetier-Serumproteine wie Keyhole-Limpet- Hämocyanin, menschlichem oder Rinder-gamma-Globulin, menschlichem oder Rinder- oder Kaninchenserumalbumin oder methylierten oder anderen Derivaten solcher Proteine, sind aber nicht darauf beschränkt. Andere Proteinträger sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt aber nicht notwendig kann der Proteinträger für das Wirtstier, in dem die Antikörper gegen die Eimeria-Proteine erzeugt werden sollen, fremd sein.
Das kovalente Kuppeln an das Trägermolekül kann durchgeführt werden unter Verwendung von Methoden, die auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, wobei die genaue Auswahl durch die Art des verwendeten Trägermoleküls bestimmt wird. Wenn das immunogene Trägermolekül ein Protein ist, können die Proteine oder Fragmente der Erfindung z.B. gekuppelt werden unter Verwendung von wasserlöslichen Carbodiimiden wie Dicyclohexylcarbodiimid oder Glutaraldehyd.
Kupplungsmittel, wie diese, können auch verwendet werden, um die Proteine und Fragmente mit sich selbst zu vernetzen, ohne die Verwendung eines separaten Trägermoleküls. Ein solches Vernetzen zu Protein- oder Proteinfragment-Aggregaten kann auch die Immunogenität erhöhen.
Die Verabreichung einer wirksamen Menge der Impfstoffe der Erfindung kann Geflügel gegen eine Infektion mit E. tenella schützen. Monoklonale Antikörper gegen E. tenella Antigene kreuzreagieren mit E. acervulina und E. maxima in vitro, was darauf hindeutet, daß ein Schutz auch gegen diese Arten erreicht werden kann. Eine wirksame Dosis der Proteine oder Proteinfragmente liegt im Bereich von etwa 5 bis etwa 50 kg/kg Körpergewicht des geimpften Tieres. Eine Dosis von etwa 25 bis 50 kg/kg ist bevorzugt. An die anfänglichen Impfungen schließen sich vorzugsweise Booster-Impfungen an, die 1 bis mehrere Wochen später gegeben werden. Mehrfache Booster-Impfungen können verabreicht werden. Die Dosierungen solcher Booster-Impfungen liegen allgemein im Bereich von etwa 5 bis 50 ug/kg, vorzugsweise etwa 20 bis 50 ug/kg. Die Standard-Verabreichungswege können verwendet werden, z.B. subcutan, intradermal, intramuskulär, oral, anal oder in ovo.
Die Präsentation der Kokzidien-Antigene der Erfindung für das Immunsystem des Geflügels kann auch erreicht werden, indem Gene, die die Antigene in den Bakterien (z.B. E. coli oder Salmonella) oder in Viren (z.B. Pockenvirus oder Herpesvirus) kodieren, kloniert werden und indem das lebende Vektorsystem oder, falls erforderlich, in der inaktivierten Form den Vögeln oral, durch Injektion oder auf anderen, üblicherweise verwendeten Wegen verabreicht wird. Carbit et al. [in: Vaccines, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 68 bis 71] haben die Verwendung von E. coli beschrieben, während Clements [Pathol. Immunopathol. Res. 6:137 (1987)] die Verwendung von Salmonellen beschrieben haben. Moss et al. [Ann. Rev. Immunol. 5:305 (1987)] haben eine Übersicht über die Verwendung von viralen Vektorsystemen unter Anwendung rekombinanter Pockenviren gegeben.
Eine Art von Pockenvirus, der Vaccinia-Virus, kann verwendet werden, um die Freisetzung der Kokzidienantigene in die Zellkultur und die Tiere zu testen. Es wurde gefunden, daß für analytische Studien der Vaccinia-Virus effizienter ist als der Geflügelpocken-Virus, ein anderer Pocken-Virus, der verwendet werden kann. Dies ist der Fall, weil der Vaccinia-Virus sich viel schneller vermehrt als der Avian- Virus und bezüglich des Wirts nicht auf Hühnerzellen beschränkt ist. Große Mengen heterologer DNS können in das Vaccinia-Virengenom insertiert werden, ohne die Viren- Reifung und Infektiosität zu hemmen [Smith et al., Gene 25:21 (1983)]. Die Insertion und Expression verschiedener heterologer Gene unter Verwendung des Virus erzeugt eine Antikörper-Produktion gegen die exprimierten Antigene bei den infizierten Tieren [Perkus et al., Science 229:981 (1985)].
Die zur Erzeugung der rekombinanten Vaccinia-Viren verwendeten Techniken können leicht an Routine-Verfahren für Geflügelpocken- oder Herpes-Virus-Systeme angepaßt werden. Ein rekombinanter Virus, der eine DNS mit einer Nucleotidsequenz umfaßt, die ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, kann hergestellt werden, indem:
(a) eine DNS mit einer Nucleotidsequenz, die das Protein kodiert, in das Genom eines Virus insertiert wird, ohne die Viren-Reifung und Infektiosität zu hemmen;
(b) der rekombinante Virus in einer Zellkultur amplifiziert wird und
(c) der rekombinante Virus von dem Zellmedium gereinigt wird.
Die Verwendung rekombinanter Viren als Träger für Impfstoffe gegen Kokzidiose ist besonders vorteilhaft, da geimpftes Geflügel eine Immunität sowohl gegenüber dem Kokzidien-Antigen als auch gegenüber dem viralen Träger entwickelt (d.h. solche Impfstoffe sind bivalent). Die Nützlichkeit solcher Impfstoffe kann weiter verbessert werden, indem zusätzliche Gene in den Trägervirus insertiert werden. Zum Beispiel können Teile des Viren-Genoms der Newcastlekrankheit zusammen mit einem Kokzidien-Antigen-Gen in einen Geflügelpocken-Virus insertiert werden, wodurch eine Immunität gegenüber der Newcastle-Krankheit, Kokzidiose und Geflügelpocken vermittelt wird, alles mit einem einzigen Impfstoff.
Die Verabreichung der lebenden Impfstoffe der Erfindung kann mit zahlreichen Methoden, die auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das "Stift"-Verfahren verwendet werden, das üblicherweise verwendet wird, um Geflügel gegen den Geflügelpocken-Virus zu impf en. Dieses Verfahren besteht darin, die Haut des Flügelgewebes zu durchbohren oder zu durchstechen mit einer scharfen Nadel, die in den Impfstoff getaucht wird. Die Nadel hat üblicherweise ein Öhr in der Nähe der Spitze, wie eine Nähmaschinennadel, das einen Tropfen Impfstoff trägt. Alternativ kann der lebende Impfstoff subcutan oder intradermal in das Flügelgewebe oder an irgendeiner anderen Stelle injiziert werden.
Der rekombinante lebende Vektor-Impfstoff kann auch zu Trinkwasser zugegeben werden oder sogar über das Geflügel gesprüht werden, das geimpft werden soll. Er kann auch im Futter verabreicht werden, vorzugsweise nach einer schützenden Einkapselung [Balancou et al., Nature 322:373 (1986)] oder in ovo. Bei letzterer Methode werden die Viren-Impfstoffe direkt in Hühnerembryos injiziert [Sharma, Avian Dis. 25:1155 (1985)].

Beispiel

Alle Bezugnahmen, die hier angegeben werden, werden vollständig durch Bezugnahme eingeschlossen.
Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die unten angegebenen Prozentangaben für Feststoffe in festen Mischungen, Flüssigkeiten in Flüssigkeiten und Feststoffe in Flüssigkeiten auf Gew./Gew., Vol/Vol bzw. Gew./Vol.

Reinigung von Merozoiten

Merozoiten von E. tenella wurden von den Zäka von 50 infizierten Hühnchen (3 Wochen alt, Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown NJ) geerntet 5 Tage nach Infektion mit 50.000 der obigen sporulierten Oozysten pro Vogel. Ähnliche Hühnchen aus anderen Quellen können verwendet werden. Die Zäka werden entfernt und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 15 Minuten lang in einem Magnetrührer gewaschen. Die Epitel-Bruchstücke wurden teilweise entfernt durch Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit (50 x g) und die rohen Merozoiten wurden durch Zentrifugation 10 Minuten lang mit 2.000 x g bei 4ºC gewonnen. Das Pellet wurde in Lyse-Puffer (8,29 g/l HN&sub4;Cl, 0,372 g/l Na&sub2;EDTA, 1,0 g/l KHCO&sub3;, pH 7,6) resuspendiert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Merozoiten wurden durch Zentrifugation gesammelt, einmal mit PBS gewaschen und über eine Säule geleitet, die 1,0 g gesponnene Nylonfaser (Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories, Deerfield, IL) in einem Scheidetrichter enthielt. Die Merozoiten wurden durch Zentrifugation wie vorher gesammelt und auf Trockeneis für die RNA-Isolierung eingefroren oder weiter gereinigt mit Diethylaminoethyl-Cellulose (DEAE, Whatman DE52, Whatman Bio Systems, Inc., Clifton, NJ) für die Western-Blot- Analyse.
Zur Reinigung in DEAE-Cellulose wurden ungefähr 1 x 10&sup9; Merozoiten in PBS auf eine Säule mit einem Bettvolumen von 10 ml aufgetragen und mit PBS eluiert. Die Merozoiten wurden mit den ersten 100 ml der durchlaufenden Flüssigkeit gewonnen, die im wesentlichen frei war von roten Blutkörperchen und anderen zellulären Bruchstücken.

Immunfällung von mit ¹²&sup5;I-markierten Oberflächenproteinen

Die Oberflächenproteine der gereinigten Merozoiten wurden mit ¹²&sup5;I markiert mit der IODOGEN-Methode (Pierce Chemical Co.) oder unter Verwendung von IODOBEADS (Pierce Chemical Co.). Für letzteres Verfahren wurden 4 IODOBEADS dreimal mit 0,2 M Natriumphosphat, pH 7,5 gewaschen und 1 - 3 mCi ¹²&sup5;I-Na wurden zugegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Gereinigte Merozoiten (3 x 10&sup8;) in 200 ul PBS, pH 7,0, wurden zu dem Reaktionsgefäß zugegeben und die Inkubation wurde 15 Minuten fortgesetzt. Am Ende der Inkubation wurde Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) auf eine Endkonzentration von 5 mM zugegeben.
Die markierten Merozoiten wurden aus der Inkubations- Mischung durch Zentrifugation 30 Sekunden lang mit 12.000 x g gewonnen und in 1 ml 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) oder 1 % Triton X-100 in PBS, pH 7,0, solubilisiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation 3 Minuten lang mit 12.000 x g entfernt. Die solubilisierten Proteine wurden gegen 3 l PBS, pH 7,0 bei 4ºC dialysiert unter Verwendung einer Ausschlußmembran für ein Molekulargewicht von 3.500, um jegliche restliche freie ¹²&sup5;I zu entfernen. Die mit ¹²&sup5;I markierten Proteine (typischerweise sind etwa 1,5 x 10&sup8; cpm in das Protein eingebaut) wurden bis zu ihrer Verwendung bei 4ºC gelagert. Die mit TCA ausfällbare Radioaktivität war typischerweise mehr als 95 % der Gesamtradioaktivität.
Kaninchen-Antiserum gegen an Glutaraldehyd gebundene Merozoiten wurde wie folgt hergestellt:
ungefähr 1 x 10&sup9; gereinigte Merozoiten wurden in 1 % Glutaraldehyd in PBS suspendiert und bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert. Die gebundenen Parasiten wurden durch Zentrifugation 5 Minuten lang mit 2.000 x g geerntet, dreimal mit PBS gewaschen und in 1 ml PBS wieder suspendiert. Weiße Kaninchen aus Neuseeland erhielten mehrfache intradermale Injektionen in die Haut des Rückens mit insgesamt 0,5 ml der gebundenen Parasiten-Lösung, die mit 0,5 ml komplettem Freund's Adjuvans emulgiert war. Die Kaninchen erhielten zwei Booster-Injektionen, die das gleiche Parasiten-Protein in inkomplettem Freund's Adjuvans enthielten, in Intervallen von 2 Wochen. Blut wurde aus der Ohrvene 2 Wochen nach der letzten Booster-Injektion entnommen und Serum, das Antikörper enthielt, wurde erhalten durch Zentrifugation der koagulierten Blutproben 15 Minuten lang mit 2.500 x g.
Proben der markierten Proteine für die Immunfällung (5 ul, enthaltend 5 x 10&sup5; cpm) wurden in 100 ul IP-Puffer (0,25 % NP-40, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl) verdünnt, durch Inkubation 20 Minuten lang auf Eis mit 5 ug Staph-A-Protein (Pansorbin , Calbiochem Corp., San Diego, CA) vorgeklärt und mehrere Stunden bei 4ºC mit 5 bis 10 ul Kaninchen-Antimerozoitserum inkubiert. Die Antikörper-Komplexe wurden durch eine zweite Inkubation mit 5 ug Staph-A-Protein 20 Minuten lang auf Eis gesammelt und 15 Sekunden in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Die Pellets wurden viermal mit IP-Puffer gewaschen und die markierten Proteine, die durch das Antikörper-Reagenz immunologisch gefällt wurden, wurden von dem Komplex eluiert, indem sie 5 Minuten lang in SDS-Gel-Probenpuffer (65 mM Tris pH 6,8, 0,5 % SDS, 5 % β-Mercaptoethanol, 10 % Glycerin, 0,1 % Bromphenol blau) auf 100ºC erhitzt wurde. SDS-PAGE wurde durchgeführt, wie von Laemmli beschrieben [Nature 227:680 (1970)].
Die mit dem Kaninchen-Antiserum erhaltenen Ergebnisse wurden bestätigt unter Verwendung eines Hühner-Immunserums, das wie folgt hergestellt wurde:
Hühner wurden immunisiert durch wiederholte Infektion mit lebensfähigen sporulierten Oozysten von E. tenella (100.000 Oozysten, dreimal in Intervallen von 2 Wochen gegeben). Das Blut wurde abgenommen durch Herzpunktion und das Serum, das die Antikörper enthielt, wurden von den koagulierten Bruchstücken getrennt nach Zentrifugation 5 Minuten lang mit 2.500 x g.
Vergleichsuntersuchungen wurden durchgeführt, bei denen sowohl das Anti-Merozoiten-Kaninchenserum als auch das Hühner-Immunserum für die Immunfällung von (1) mit ¹²&sup5;I an der Oberfläche markierten Eimeria-Merozoit-Proteinen und (2) den in vitro Produkten der Translation von poly(A)-enthaltender Merozoit-RNA verwendet wurde. Die ausgefällten Proteine wurden dann einer SDS-PAGE unterzogen und durch Fluorographie sichtbar gemacht unter Verwendung von Standard-Fluorographie-Techniken und Reagenzien.
Diese Untersuchungen zeigten, daß viele Proteine aus beiden Quellen von beiden Seren ausgefällt wurden. Somit könnte jedes der beiden Serum verwendet werden, um die genetischen Rekombinanten, die Eimeria-Proteine exprimieren, zu screenen. Der Einfachheit halber wurde das Kaninchen-Anti- Merozoit-Serum zuerst für das unten beschriebene Screening- Verfahren verwendet. Jedoch wurde das Hühner-Immunserum bei dem parallelen Screening der cDNS-Bibliothek, wie unten beschrieben, verwendet. Dies war wesentlich für die Identifizierung der Proteine, von denen wahrscheinlich war, daß sie wesentlich für die Immunantwort der infektiösen Organismen waren, da nur das Hühnerserum als Antwort auf den Test mit lebenden Organismen erzeugt wurde. Nur die immunisierten Hühner waren nachweisbar resistent gegenüber solchen Organismen.
Um die Spezifität des Kaninchen-Antimerozoit-Serums für Eimeria-Proteine zu erhöhen, wurde eine Antikörper-Auswahl mit den Seren durchgeführt, im wesentlichen wie von Hall et al. oben beschrieben. Kurz gesagt wurden Antikörper, die für das von einem rekombinanten Phagenklon (siehe unten) exprimierte Vorläuferprotein spezifisch waren, aus dem Kaninchen-Anti-Merozoit-Serum wie folgt gereinigt.
Der positive Phage wurde in hoher Dichte plattiert und 3,5 Stunden bei 42ºC gezüchtet. Die Expression des Fusions-Proteins wurde induziert, indem auf die Platte ein Nitrocellulosefilter, der mit 10 mM Isopropylthiogalactosid (IPTG) gesättigt war, gelegt wurde und die Inkubation wurde 6 bis 8 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Die mit Antigen beladenen Filter wurden mit TBS (20 mM Tris HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl) gewaschen und 8 bis 10 Stunden bei 4ºC mit einem Überschuß von Anti-Merozoit-Serum inkubiert, das mit den E. coli Wirtsbakterien vorabsorbiert worden war. Die Filter wurden dreimal mit TBS gewaschen, um nicht spezifische Antikörper zu entfernen.
Die an das Fusionsprotein auf den Filtern spezifisch gebundenen Antikörper wurden mit 2,0 ml 0,1 M Glycin, pH 2,6, 0,15 M NaCl (15 Minuten bei 20ºC) eluiert. Die eluierten Antikörper wurden sofort mit einem gleichen Volumen 0,1 H Tris-HCl, pH 8,0 neutralisiert. Die ausgewählten Antikörper (im folgenden als "Antikörper der Antikörper-Auswahl" bezeichnet) wurden dann bei der Immunfällung der an der Oberfläche markierten Merozoiten oder für die in vitro- Translationsprodukte oder als Sonden bei Western-Blots des gesamten Merozoitproteins verwendet. Kontrollseren wurden hergestellt unter Verwendung nicht rekombinanter Phagen bei den Antikörper-Auswahl-Verfahren.
Die Ergebnisse von Western-Blot und Immunfällungsanalysen unter Verwendung der Antikörper der Antikörper-Auswahl sind in Figur 2 gezeigt. Die Produkte der Immunfällung der markierten Proteine wurden durch Fluorographie sichtbar gemacht, wie von Bonner et al. beschrieben [Eur. J. Biochem., 46:83 (1974)]. Die Zahl auf der rechten Seite der Figur zeigt die Positionen der Marker-Proteine für das Molekulargewicht mit den angegebenen Molekulargewichtsgrößen in Kilodalton.
Platte A von Figur 2 zeigt einen Immunoblot der Gesamt- Merozoitproteine, behandelt mit Kontroll- (a) oder Antikörperauswahl- (b) Antikörpern. Platte B zeigt mit ¹²&sup5;I an der Oberfläche markierte Merozoitproteine, die mit Kontroll- (a) oder Antikörperauswahl- (b) Antikörpern immungefällt worden waren.

Isolatierung und in vitro-Translation von Merozoit-mRNA

Gefrorene Merozoit-Pellets, die 1 x 10&sup9; bis 1 x 10¹&sup0; Organismen enthielten, wurden aufgetaut in 10 ml TEL/SDS-Puffer (0,2 M Tris HCl, 0,1 M LiCl, 25 mM EDTA, 1 % (G/V) Natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8,8), der 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 300 Einheiten RNasin (Promega Biotec, Madison, WI) enthielt und mit 10 bis 12 Schlägen in einem mit Teflon beschichteten Gewebe-Homogenisator homogenisiert. Unlösliche Bruchstücke wurden durch Zentrifugation in der Kälte mit 3.000 x g abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit wurde zweimal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (24:24:1, V/V), das vorher mit TEL-Puffer äquilibriert worden war, extrahiert.
Die wäßrige Phase wurde mit 100 mg/ml Proteinase K bei 37ºC 30 Minuten lang verdaut und mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform (1:1) wieder extrahiert und die Nucleinsäure wurde mit zwei Volumina Ethanol eine Stunde auf Trockeneis oder über Nacht bei -20ºC ausgefällt. Das Pellet wurde nach einstündiger Zentrifugation mit 10.000 x g in TE (10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM EDTA) wieder suspendiert und durch ein 4 ml CsCl-Puffer (5,7 H CsCl, 0,1 M EDTA) gewirbelt mit 150.000 x g 20 Stunden bei 15ºC. Das RNA-Pellet wurde wieder aus 0,2 H Kaliumacetat mit 2,5 Volumina Ethanol ausgefällt. Diese Gesamt-RNA wurde einmal über Oligo-dT-Cellulose geleitet, um Poly(A)+-RNA anzureichern, wie von Maniatis, oben, Seite 197 beschrieben. Eine typische Ausbeute von 1,9 mg Gesamt-RNA aus 5 x 10&sup9; Merozoiten enthielt ungefähr 20 ug Poly(A)+-RNA.
Zwischen 0,1 und 0,5 ug mRNA wurden verwendet, um die in vitro-Proteinsynthese in einem mit Nuclease behandelten Kaninchen-Reticulocyten-Lysat (Amersham Corp., Arlington Heights, IL oder Promega Biotec), das mit 10 bis 20 uCi ³&sup5;S-Methionin pro 20 ul Reaktionsmischung angereichert war, zu steuern. Die in vitro-Translationsprodukte wurden analysiert durch Immunfällung und anschließend mit SDS-PAGE und sichtbar gemacht durch Fluorographie, wie oben beschrieben, mit den in Figur 2, Platte C gezeigten Ergebnissen.
Die Bahn a von Platte C zeigt die vollständige Mischung der Produkte, die die Poly-(A)-enthaltende Merozoit-RNA ergibt. Bahn b, c und d zeigen Translationsprodukte, die durch Antikörper immungefällt wurden, die durch einen rekombinanten Phagenklon ausgewählt wurden, der mit lambda 5-7 bezeichnet wurde (siehe unten; dieser Klon exprimiert ein Gen, das das Eimeria-Vorläuferprotein kodiert), einem anderen Phagenklon, der mit Anti-Merozoit-Serum reagiert bzw. einem nicht rekombinanten lambda-gt11-Klon.
Es ist anzumerken, daß ein Hauptprotein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 30 Kilodalton in den Bahnen a und b, Figur 2, Platte C zu sehen ist. Dieses Protein ist nicht vorhanden in der Bahn, die die Gesamt-Merozoit-Proteine enthält, die mit Antikörpern der Antikörper-Auswahl sondiert wurden (Platte A, Bahn b), aber eine 23 Kilodalton-Bande ist auf diesem Gel zu sehen (Platte A, Bahn b, Pfeil). Ein Protein mit 23 Kilodalton wurde auch immunologisch gefällt mit Antikörpern der Antikörper-Auswahl aus mit ¹²&sup5;I-markierten Merozoitproteinen, wie in Figur 3 gezeigt, Platte B, Bahn b. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, daß das 30 Kilodalton-Vorläuferprotein durch proteolytische Spaltung in reifen Merozoiten in das 23 Kilodalton Oberflächenantigen prozessiert werden kann.

Herstellung von einer Merozoit-cDNS-Expressions-Bibliothek

Doppelsträngige cDNS wurde aus 6 ug Merozoit-Poly-(A)+-RNA synthetisiert, wie von Gubler et al., Gene 25:263 (1983) beschrieben, unter Verwendung von reverser Transkriptase (BRL, Gaithersburg, MD), ausgehend von einem Oligo(dT)- Primer und RNase H (BRL) und E. coli DNS-Polymerase I (New England Biolabs, Beverly, MA), um den komplementären Strang zu synthetisieren. Die doppelsträngige cDNS erhielt dann glatte Enden mit T4-DNS-Polymerase (BRL) und EcoRI-Linker (GGAATTCC, Collaborative Research Inc., Bedford, MA) wurden nach Behandlung mit EcoRI-Methylase (New England Biolabs) zugegeben nach den Angaben des Herstellers.
Nach dem Verdau mit EcoRI wurden die cDNS's in Biogel A-50M fraktioniert, um überschüssige Linker-Moleküle und cDNS, die kleiner war als ungefähr 300 bp, zu entfernen, wie von Huynh et al., oben, beschrieben. Die cDNS wurde dann durch Ausfällen mit Ethanol eingeengt.
Eine Bibliothek wurde hergestellt in lambda-gt11 (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA), wie von Huynh et al. in D. Glover (ed.,) DNS Cloning Band I: A Practical Approach, 1985, IRL Press, Washington, D.C., Seiten 49 bis 78 beschrieben. Die EcoRI-cDNS-Fragmente wurden mit mit EcoRI verdauten dephosphorylierten lambda-gt11-Armen (Stratagene Cloning Systems) ligiert und die entstehende DNS wurde in Phagen verpackt mit dem Gigapack -Kit (Stratagene Cloning Systems), gemäß den Angaben des Herstellers.
Die entstehende Bibliothek wurde amplifiziert, indem auf Y1088-Wirtszellen plattiert wurde. Der Prozentanteil der Rekombinanten wurde abgeschätzt aus dem Verhältnis von blauen zu farblosen Plaques auf X-gal-Platten (Maniatis, oben, Seite 24) in Gegenwart von Isopropylthiagalactosid (IPTG, Sigma Chemical Co.) mit etwa 90 %.

Immunologisches Screening der cDNS-Bibliothek

Die lambda-gt11-Merozoit-DNS-Expressions-Bibliothek wurde auf Y1090-Zellen in einer Dichte von etwa 10.000 Plaques pro 150 mm Platte plattiert. Sechs solche Platten wurden 3,5 Stunden bei 42ºC inkubiert, mit Nitrocellulosefiltern überschichtet, die vorher in 10 mM IPTG eingeweicht worden waren, um die Expression des β-Galactosidase-Fusionsproteins zu induzieren und weitere 4 bis 5 Stunden bis über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Filter wurden von den Platten entfernt und mehreren chargenweisen Waschungen mit TBS (20 mM Tris HCl, pH 8,0, 0,15 M NaCl) unterworfen. Nicht spezifische Protein-Bindungsstellen wurden blockiert durch Inkubation in 20 % foetalem Kälberserum (FCS) in TBS eine Stunde lang bei Raumtemperatur.
Die Filter wurden dann eine Stunde mit Kaninchen-Anti- Merozoit-Serum inkubiert, das mit Y1090-Zellen voradsorbiert worden war, in einer Verdünnung von 1:100 in TBS, das 20 % Kälberserum enthielt. Nicht spezifische Antikörper wurden entfernt in aufeinanderfolgenden Waschungen mit TBS, wobei einmal 0,1 % NP-40 enthalten war. Die Filter wurden mit Ziegen-Antikaninchen-Peroxidase-Konjugat (BioRad, Richmond, CA) in einer Verdünnung von 1:1.000 in TBS plus Kälberserum eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Farbreaktion wurde entwickelt mit 4-Chlor-1-naphthol (BioRad), nach den Angaben des Herstellers.
Serum von immunen Hühnern wurde auch für das Screening verwendet. Dieses Serum wurde mit Y1090-Zellen voradsorbiert und mit der gleichen Verdünnung wie das Kaninchenserum verwendet. Kaninchen-Anti-Hühner-Antikörper wurden verwendet als zweite Antikörper und Ziegen-Anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat wurde verwendet als Nachweisantikörper. Einzelne Plaques wurden isoliert bei einem zweiten Screening unter Verwendung derselben Reagenzien.
Ein Klon, der als lambda 5-7 bezeichnet wurde, erzeugte ein Protein, das stark mit Antikörpern des Kaninchenserums reagierte. Ein zweites Isolat, I-5 wurde identifiziert durch Screening mit Hühner-Immunserum und es zeigte sich, daß es ein cDNS-Insert der gleichen Größe wie der 5-7-Klon enthielt. Die DNS-Sequenz-Analyse zeigte, daß diese Phagen- Klone das gleiche Merozoit-Antigen kodierten.

Expression von lambda 5-7 cDNS in E. coli

Ein 1,2 kb Insert aus lambda 5-7 wurde isoliert durch EcoRI-Verdau und Agarose-Gelelektrophorese [Maniatis et al., oben, Seiten 157 bis 170]. Die EcoRI-Enden wurden mit Klenow-Polymerase in Gegenwart von dATP und dTTP wieder hergestellt und BamHI-Linker (GGGATCCC) wurden an beide Enden ligiert. Das modifizierte Fragment wurde jeweils in die drei Expressionsvektoren pDS56/RBSII, pDS56/RBSII,-1 und pDS56/RBSII,-2 an der BamHI-Stelle insertiert. Diese drei Vektoren werden unten beschrieben. Plasmide, die die Inserte in den beiden möglichen Orientierungen enthielten, wurden transformiert, wie von Mandel et al. beschrieben [J. Mol. Biol. 53:159 (1970)] in E. coli Stamm M15, der das kompatible Plasmid pDMI.1 trug. Der E. coli Stamm M15, der die Plasmide pDS56/RBSII und pDMI.1 beherbergt, ist in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nummer 316 695 beschrieben.

Plasmid-Konstruktion

Allgemein enthalten die Plasmide pDS56/RBSII,-1 und -2 das regulierbare Promotor/Operator-Element N25OPSN25OP29 und die ribosomalen Bindungsstellen RBSII, RBSII(-1) bzw. RBSII(-2). Diese ribosomalen Bindungsstellen stammten von der ribosomalen Bindungsstelle des Promotors PG25 des E. coli-Phagen T5 (Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nummer 207 459) und wurden durch DNS-Synthese erhalten.
Aufgrund der hohen Effizienz der Expression können die oben erwähnten Plasmide in E. coli-Zellen nur gehalten werden, wenn das Promotor/Operator-Element durch die Bindung eines lac-Repressors an den Operator reprimiert wird. Der lac-Repressor wird von dem lacI-Gen kodiert. N25OPSN25OP29 kann nur effizient reprimiert werden, wenn eine ausreichende Anzahl von Repressor-Molekülen in den Zellen vorhanden ist. Daher wurde das lacIq-Allel, das eine Promotor-Mutante enthält, die verantwortlich ist für eine erhöhte Expression des Repressor-Gens, verwendet. Dieses lacIq-Allel ist auf dem Plasmid pDMI.1, das unten beschrieben wird, vorhanden.
Das pDMI.1-Plasmid trägt zusätzlich zu dem lacI-Gen das Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das den Bakterien die Kanamycin-Resistenz vermittelt und als Selektionsmarker verwendet wird. pDMI.1 ist kompatibel mit den Plasmiden pDS56/RBSII, -1 und -2. E. coli-Zellen, die mit den Expressionsvektoren PDS56/RBSII, -1 und -2 transformiert werden, müssen pDMI.1 enthalten, um zu garantieren, daß der Expressionsvektor in den Zellen stabil gehalten wird. Die Induktion dieses Systems wird erreicht, indem IPTG zum Medium zugegeben wird.

Plasmid pDS56/RBSII

Der Teil von pDS56/RBSII, der zwischen den Restriktionsspaltungsstellen für XbaI und XhoI liegt und der den Replikationsbereich und das Gen für β-Lactamase (das den Zellen die Ampicillin-Resistenz vermittelt) (Figuren 4 und 5) enthält, stammte ursprünglich aus dem Plasmid pBR322 [Bolivar et al., Gene 2: 95-113 (1977); Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43: 77-90 (1979)]. Jedoch wird das Gen für die β-Lactamase modifiziert durch Eliminierung der Spaltungsstellen für die Restriktionsenzyme HincII und PstI. Diese Veränderungen der DNS-Sequenz haben keine Wirkung auf die Aminosäure-Sequenz der β-Lactamase. Der verbleibende Teil des Plasmids trägt das regulierbare Promotor/Operator-Element N25OPSOP29 und anschließend die ribosomale Bindungsstelle RBSII, die Teil eines EcoRI/BamHI-Fragmentes ist, Spaltungsstellen für die Restriktionsenzyme SalI, PstI und HindIII, den Terminator to des E. coli-Phagen lambda [Schwarz et al., Nature 272: 410-414 (1978)]; das promotorfreie Gen für Chloramphenicol- Acetyltransferase [Marcoli et al., FEBS Letters, 110: 11-14 (1980)] und den Terminator Tl des E. coli rrnB-Operons [Brosius et al., J. Mol. Biol. 148: 107-127 (1981)].

Plasmid PDS56/RBSII(-1)

Plasmid pDS56/RBSII(-1) (Figuren 6 und 7) ist ähnlich dem Plasmid pDS56/RBSII, enthält aber die ribosomale Bindungsstelle RBSII(-1).

Plasmid pDS56/RBSII(-2)

Plasmid pDS56/RBSII(-2) (Figuren 8 und 9) ist ähnlich dem Plasmid pDS56/RBSII, enthält aber die ribosomale Bindungsstelle RBSII(-2).
Der Unterschied bei diesen drei Plasmiden ist der, daß sie sich um ein Nucleotid nach dem ATG-Startcodon unterscheiden, was zu einer Protein-Expression von allen drei potentiellen Leserahmen führt.

Plasmid pDMI.1

Plasmid pDMI.1 (Figuren 10 und 11) trägt das Gen für die Neomycin-Phosphotransferase aus dem Transposon Tn5 [Beck et al., Gene 19: 327-336 (1982)], das den E. coli-Zellen die Kanamycin-Resistenz vermittelt, und das lacI-Gen [Farabough, Nature 274: 765-769 (1978)] mit der Promotor- Mutation Iq [Calos, Nature 274: 762-765 (1978)], das den lac-Repressor kodiert. Außerdem enthält das P1asmid pDMI.1 einen Bereich des Plasmids pACYC184 [Chang und Cohen, J. Bacteriol. 134: 1141-1156 (1978)], das alle Informationen enthält, die erforderlich sind für die Replikation und stabile Weitergabe an die Tochterzellen.
Es versteht sich, daß zusätzlich zu dem oben beschriebenen Plasmid jedes E. coli-Expressionssystem als geeignet angesehen wird für diesen Versuch.
Die bakteriellen Transformanten werden bei 37ºC in LB-Medium gezüchtet [Maniatis et al., oben, Seite 68] und die Expression des Proteins wird induziert durch Zugabe von 1mM IPTG zu dem Medium. Nach einstündigem Inkubieren wurden 1 ml Proben entnommen und die Zellen in den Proben wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellpellets wurden behandelt, wie von Crowl et al., oben, beschrieben und die Lysate wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine in dem Gel entweder mit Coomassie-Brillant-Blau gefärbt oder auf Nitrocellulose- Membranen für die Western-Blot-Analyse überführt [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979); Burnetti, Anal. Biochem. 112:195 (1981)] unter Verwendung des Kaninchen-Antimerozoit-Serums, wie oben beschrieben.
Diese Analyse zeigte, daß das 1,2 kb cDNS-Molekül in einer Orientierung in allen drei Leserahmen ein Protein erzeugte, das mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 30 Kilodalton wanderte und mit den Antikörpern aus dem Kaninchen-Antimerozoit-Serum reagierte. Dies stimmt überein mit der Gegenwart von Stopcodons in allen drei Leserahmen, die dem ATG-Startcodon bei Nucleotid 68 in der cDNS-Sequenz vorhergehen, wie in Figur 1 gezeigt.

DNS-Sequenz-Analyse

Allgemein wurde eine Isolierung der Plasmid-DNS in kleinem Maßstab aus 1 ml gesättigten Übernacht-Kulturen durchgeführt unter Verwendung des Verfahrens von Birnboim et al. [Nucleic Acids Research 7:1513 (1979)]. Dieses Verfahren läßt die Isolierung einer geringen Menge DNS aus einer Bakterienkolonie für analytische Zwecke zu. Größere Mengen Plasmid-DNS wurden hergestellt unter Verwendung von 1 l Kulturen gemäß einem Standard-Protokoll mit Cesiumchlorid- Zentrifugation [Maniatis et al., oben, Seite 93].
Die DNS-Sequenz des 1,2 kb EcoRI-cDNS-Inserts von lambda 5- 7 wurde wie folgt bestimmt. Das Insert wurde mit EcoRI verdaut, im Gel isoliert und mit dem mit EcoRI verdauten pEV-vrf-Plasmid, das von Crowl et al. beschrieben wurde [Gene 38:31 (1985)] ligiert. Dieses Plasmid wurde als pEV/5-7 bezeichnet und wurde verwendet, um das 1,2 kb cDNS- Insert für die Hybridisierungs-Analyse zu vermehren (wie unten beschrieben) und in der vorhergehenden DNS-Sequenz- Analyse mit dem Verfahren von Zagursky et al. [Gene Anal. Tech 2:89 (1983)].
Um die vollständige DNS-Sequenz zu bestimmen, wurde das 1,2 kb cDNS-Insert weiter subkloniert in den einzelsträngigen Phagen-Vektoren M13, Mp18 und Mp19 unter Verwendung des Bio-Rad M13 Klonierungs- und Sequenzierungs-Kits. Die DNS- Sequenz wurde bestimmt mit dem Didesoxykettenabbruchverfahren von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977)] unter Verwendung der Reagenzien und Angaben, die dem Bio-Rad-Kit beilagen.
Die vollständige Nucleotid-Sequenz der 1,2 kb cDNS aus lambda 5-7 einschließlich der 5' und 3' nicht translatierten Bereiche ist in Figur 1 gezeigt. Die Analyse der Sequenz eines zweiten Isolats, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, unter Verwendung von Hühner-Immunserum, bezeichnet als 1-5, zeigte, daß dieses Isolat das folgende zusätzliche Nucleotid am 5'-Ende enthielt und die EcoRI- Stelle des 5-7-Inserts fehlte:
Der Rest der Sequenz dieses zweiten Isolats ist identisch mit dem von lambda 5-7 von der Basennummer 8 bis zum Beginn des Poly-A-Teils, außer dem Nucleotid Nr. 300, wo sich ein Cytidin-Rest findet anstelle eines Thymidin-Restes.
Die cDNS-Sequenz sagt einen offenen Leserahmen vorher, der sich von dem ATG an Position 68 bis zu dem TAA-Stopcodon an Position 668 erstreckt, der 200 Aminosäurereste kodiert, wie in Figur 1 gezeigt.
Die theoretische Größe von 24 Kilodalton für ein Protein mit 200 Aminosäuren ist etwas kleiner als die geschätzte Größe des primären Translations-Produktes, das in dem Immunpräzipitat der Merozoit-mRNA beobachtet wurde (Figur 3, Platte c, Bahn b) mit dem Antikörper-Auswahl-Reagenz und dem Protein, das von der cDNS in den oben beschriebenen E. coli-Expressionsvektoren exprimiert wurde. Jedoch liegt dieses theoretische Molekulargewicht im Bereich der zwischen theoretischen Molekulargewichten und durch Interpolation, bezogen auf Molekulargewichts-Standards auf SDS- PAGE bestimmten Molekülgröße erwarteten Abweichung.
Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Proteins, das von dem lambda 5-7 cDNS-Insert (Figur 1) kodiert wird, zeigt, daß die ersten 20 aminoterminalen Aminosäurereste insgesamt einen hydrophoben Charakter haben, was auf eine mögliche Signalsequenz deutet.

Hybridisierungs-Analyse

DNS wurde isoliert aus sporulierten Oozysten nach Behandlung mit Trypsin und Gallensalzen und Waschen mit PBS wie folgt:
Das Parasitenmaterial (ungefähr 1 x 10&sup9; Oozysten) wurde in 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0, 0,5 % Sarcosyl (Sigma, St. Louis, MO) suspendiert und mit Proteinase K (Boehringer Mannheim, BRD) mit 0,1 ug/ml 2 Stunden lang bei 50ºC, mit RNase (10 ug/ml) eine Stunde bei 37ºC und wiederum mit Proteinase K eine Stunde bei 50ºC verdaut. Das Protein wurde mit zwei Extraktionen mit Phenol, das mit 20 mM Tris HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA (TE) gesättigt war, und einer Extraktion mit Phenol/Chloroform (1:1) entfernt. Die wäßrige Phase wurde ausgiebig gegen TE dialysiert und durch Ethanol-Ausfällung eingeengt. Eine typische Ausbeute von 0,4 mg DNS pro 1 x 10&sup6; Oozysten wurde erhalten.
Die Parasiten-DNS wurde mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen verdaut gemäß den Angaben des Herstellers und die entstehenden DNS-Fragmente wurden durch Elektrophorese mit 40 V 2,5 Stunden lang in 0,8 % Agarose in Loening-Puffer (4,7 g NaH&sub2;PO&sub4;, 4,36 g Tris-Base, 0,372 g Na&sub2;EDTA pro Liter, pH 7,6) aufgetrennt. Das Gel wurde mit 0,25 M HCl 30 Minuten lang behandelt und auf eine Zetaprobe-Membran (Bio-Rad) überführt in 0,4 M NaOH über Nacht. Der Filter wurde in 2 x SSC (pH 6,8) neutralisiert und eine Stunde bei 80ºC im Vakuum gebacken.
Der Filter wurde 3 Stunden bei 65ºC in 7 % SDS, 1 % BSA (Boehringer, Fraktion V), 0,5 M NaHPO4-Puffer, pH 7,2, vorhybridisiert. Das 5-7-Gen EcoRI-Insert wurde mit Gel isoliert nach dem Verdau des pEV/5-7-Plasmids, wie oben beschrieben, mit EcoRI und durch statistisches Primen mit Klenow-Fragment in Gegenwart von mit ³²P-markierten Desoxynucleotiden markiert. Das markierte Insert wurde von nicht eingebauten Nucleotiden in Spin-Säulen (Bio-Rad) getrennt, denaturiert und zu der Hybridisierungs-Lösung zugegeben. Nach 12stündiger Inkubation bei 65ºC wurden die Filter dreimal mit 2 x SSC/0,1 % SDS und zweimal mit 0,1 x SSC/0,1 % SDS bei 65ºC gewaschen. Die genomischen DNS-Fragmente, die mit der Sonde hybridisierten, wurden durch Autoradiographie nachgewiesen. Obwohl hier das pEV/5-7-Plasmid verwendet wurde, versteht es sich, daß jeder äquivalente Vektor, der das 1,2 kb cDNS-Insert des Merozoit-5-7-Gens enthält, in ähnlicher Weise geeignet wäre.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Figur 3 gezeigt, wo die Ergebnisse des Verdaus mit PvuII (1), HincII (2), PstI (3), SphI (4) oder SacI (5) zu sehen sind.
Genomische DNS-Fragmente mit 6,5 und 3,6 kb wurden nach dem Verdau mit PvuII und SacI in den Bahnen 1 und 5 nachgewiesen. Da es keine Stellen für diese Enzyme in dem cDNS-Klon gibt, kann die maximale Größe des Eimeria-Gens auf 3,6 kb geschätzt werden. Der Verdau von genomischer DNS mit EcoRI erzeugte ein 1,2 kb Genomfragment, das in der Größe dem cDNS-Fragment entsprach. Ein doppelter Verdau mit HincII und EcoRI erzeugte ein 0,9 kb Fragment, das vorhergesagt wurde aus der cDNS-Sequenz, die von zwei EcoRI-Stellen dicht flankiert wird.
Drei Fragmente wurden nach dem Verdau mit PstI nachgewiesen (Bahn 3). Zwei PstI-Stellen werden aus der cDNS-Sequenz vorhergesagt, die ein inneres Fragment von 305 bp und zwei anschließende Fragmente erzeugen würden. Das Auftreten eines dritten großen PstI-Fragmentes ist wahrscheinlich das Ergebnis eines unvollständigen Verdaus der inneren PstI- Stellen.
Das Muster der von SphI erzeugten Fragmente (Bahn 4), die auch zweimal in der cDNS schneidet, liefert keine definitive Information. Das kleine innere SphI-Fragment, das aus der cDNS-Sequenz vorhergesagt wird, konnte nicht in dem Gel nachgewiesen werden.
Bei einer Nothern-Blot-Analyse [Alwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5350 (1977)] von Poly(A)-haltiger mRNA, die aus Merozoiten isoliert wurde, hybridisierte das 1,2 kb cDNS-Fragment des lambda-5-7-Gens mit einer einzelnen mRNA- Art von ungefähr 1,3 kb Länge. Aus der Größenkorrelation ergibt sich, daß der 5-7-Klon zusammen mit der 5'-Verlängerung, die in dem oben erwähnten I-5-Isolat bestimmt wurde, die vollständige Sequenz der cDNS darstellt, mit der möglichen Ausnahme der äußersten 5'-Nucleotide. Zusammengenommen stimmen die vorhergehenden Beobachtungen überein mit einer Co-Linearität der cDNS und der genomischen Sequenzen.
Viele Modifikationen und Variationen der Erfindung können gemacht werden, ohne von Sinn und Bereich abzuweichen, wie es dem Fachmann offensichtlich ist. Die spezifischen Ausführungsformen, die hier beschrieben wurden, werden nur als Beispiele angegeben und die Erfindung wird nur durch die beigefügten Ansprüche begrenzt.

Claims

1. Ein Protein mit einer oder mehreren immunreaktiven und/oder antigenischen Determinante(n) eines Eimeria-Merozoitenoberflächenantigens, wobei das Oberflächenantigen ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 23 Kilodalton bei Polyakrylamidgelelektrophorese in SDS hat und von einem Vorgängermolekül mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 30 Kilodalton bei Polyakrylamidgelektrophorese in SDS abstammt und wobei das Protein von der Nukleotidsequenz kodiert wird:

oder einer äquivalenten Sequenz davon und das Protein frei ist von anderen Eimeriaproteinen.

2. Das Protein von Anspruch 1 mit der Aminosäuresequenz

oder einer Teilsequenz davon, wie die Teilsequenz der die ersten zwanzig Aminosäurereste in der oben definierten Aminosäuresequenz fehlen, oder ein funktionell äquivalentes Protein davon mit einer Aminosäuresequenz, die sich auf besagte Aminosäuresequenz durch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen bezieht ohne die immunologischen Eigenschaften des Proteins zu ändern.

3. Eine DNS die für ein Protein gemäss den Ansprüchen 1 oder 2 kodiert.

4. Eine DNS, die für ein Protein gemäss den Ansprüchen 1 oder 2 kodiert, mit der gesamten oder einem Teil der Nukleotidsequenz:

oder einem funktionellen Äquivalent davon.

5. Ein rekominanter Vektor, der eine DNS mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Protein gemäss Anspruch 1 oder 2 kodiert, umfasst, wobei der rekominante Vektor fähig ist, die Expression dieser besagten DNS in einem verträglichen Wirtsorganismus zu lenken.

6. Ein rekombinanter Virus, der eine DNS mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Protein gemäss Anspruch 1 oder 2 kodiert, umfasst, wobei der rekombinante Virus fähig ist, die Expression dieser besagten DNS in einem verträglichen Wirtsorganismus zu lenken.

7. Ein transformierter Mikroorganismus, der einen rekombinanten Vektor enthält, der eine DNS mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Protein nach Anspruch 1 oder 2 kodiert enthält, wobei der Mikroorganismus befähigt ist, besagte DNS zu exprimieren.

8. Ein Protein nach Anspruch 1 oder 2 zur Immunisierung von Geflügel gegen Kokzidiose.

9. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2, welches

(a) die Kultivierung eines Mikroorganismus der einen rekombinanten Vektor, der eine DNS mit einer Nukleotidsequenz, die für besagtes Protein kodiert unter Bedingungen unter denen die DNS exprimiert wird, umfasst; und

(b) die Isolierung des Proteins oder Fragments aus der Kultur umfasst.

10. Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vektors der eine DNS umfasst mit einer Nukleotidsequenz die für ein Protein nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, wobei das Verfahren:

(a) das Einsetzen einer DNS mit einer besagtes Protein kodierenden Nukleotidsequenz in einen Vektor;

(b) das Replizieren besagten Vektors in einem Mikroorganismus; und

(c) die Isolierung des rekombinanten Vektors aus dem Mikroorganismus umfasst.

11. Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Virus der eine DNS mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Protein nach Anspruch 1 oder 2 kodiert umfasst, wobei das Verfahren:

(a) das Einsetzen einer DNS mit einer Nukleotidsequenz die für besagtes Protein kodiert in das Genom eines Virus ohne die Reifung und die Übertragbarkeit des Virus zu hemmen;

(b) die Vervielfachung besagten rekombinanten Virus in einer Zellkultur; und

(c) die Reinigung des rekombinanten Virus aus dem Kulturmedien umfasst.

12. Ein Verfahren zur Herstellung eines transformierten Mikroorganismus der zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 befähigt ist, wobei das Verfahren

(a) die Transformation des Mikroorganismus mit einem rekombinierten Vektor, der eine DNS mit einer Nukleotidsequenz, die besagtes Protein kodiert; und

(b) das Wachsen des transformierten Mikroorganismus in einer Fermentationsbrühe umfasst.

13. Ein Vakzin zum Schutz von Geflügel gegen Kokzidiose das ein Protein gemäss Anspruch 1 oder 2 und ein physiologisch verträglichen Träger oder Begleitstoff umfasst.

14. Ein Vakzin zum Schutz von Geflügel gegen Kokzidiose, das einen rekombinanten Vektor enthält, der eine DNS umfasst mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Protein gemäss Anspruch 1 oder 2 kodiert, wobei der rekombinante Virus befähigt ist, die Expression der DNS in einem verträglichen Wirtsorganismus zu lenken, und einen physiologisch verträglichen Träger oder Begleitstoff.

15. Die Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Vakzins das fähig ist, Geflügel gegen Kokzidiose zu schützen.