JP2000139483A - 組み換えコクシジウム症ワクチン - Google Patents
組み換えコクシジウム症ワクチンInfo
- Publication number
- JP2000139483A JP2000139483A JP11330532A JP33053299A JP2000139483A JP 2000139483 A JP2000139483 A JP 2000139483A JP 11330532 A JP11330532 A JP 11330532A JP 33053299 A JP33053299 A JP 33053299A JP 2000139483 A JP2000139483 A JP 2000139483A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- amino acid
- acid sequence
- eimeria
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 208000003495 Coccidiosis Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 206010023076 Isosporiasis Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 title abstract 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 title abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 197
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 164
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 claims abstract description 63
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 45
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 17
- 101710203310 Apical membrane antigen 1 Proteins 0.000 claims description 14
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003936 merozoite Anatomy 0.000 abstract description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 abstract description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 abstract 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 56
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 49
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 29
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 26
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 19
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 19
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 210000003250 oocyst Anatomy 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- -1 t-butyloxy Chemical group 0.000 description 10
- 241000223932 Eimeria tenella Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 9
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 6
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 3
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 239000012742 immunoprecipitation (IP) buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N (4-methylphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJLUATLTXUNBOT-UHFFFAOYSA-N 1-Hexadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCN FJLUATLTXUNBOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYAFUXYGTYWWBP-UHFFFAOYSA-N 19-methoxynonadecane-1,2,3-triol Chemical compound COCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)CO PYAFUXYGTYWWBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 2H-pyran Chemical compound C1OC=CC=C1 MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNMSJGSGAXHQRC-UHFFFAOYSA-N 3,3-diamino-2-methylpropan-1-ol Chemical compound OCC(C)C(N)N GNMSJGSGAXHQRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000223931 Eimeria acervulina Species 0.000 description 1
- 241000223934 Eimeria maxima Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000840267 Homo sapiens Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100029616 Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000934179 Meria <ascomycete> Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFDGPVCHZBVARC-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylglycine Chemical compound CN(C)CC(O)=O FFDGPVCHZBVARC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910017917 NH4 Cl Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 102100029251 Phagocytosis-stimulating peptide Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000897961 Rattus norvegicus Endothelial cell-specific molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100308578 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RSF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010084754 Tuftsin Proteins 0.000 description 1
- WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N Zalcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- LUXUAZKGQZPOBZ-SAXJAHGMSA-N [(3S,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] (Z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O LUXUAZKGQZPOBZ-SAXJAHGMSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150115889 al gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001165 anti-coccidial effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005392 carboxamide group Chemical group NC(=O)* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003224 coccidiostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M dimethyl(dioctadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700003601 dimethylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 1
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 208000003013 permanent neonatal diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009958 sewing Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- IESDGNYHXIOKRW-LEOABGAYSA-N tuftsin Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O IESDGNYHXIOKRW-LEOABGAYSA-N 0.000 description 1
- 229940035670 tuftsin Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N urethane group Chemical group NC(=O)OCC JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/455—Eimeria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】コクシジウム症から家禽を保護するためのワク
チンの提供。 【解決手段】アイメリアメロゾイト表面抗原の免疫反応
決定基および／または抗原決定基を1以上有する蛋白ま
たは該蛋白をコードするＤＮＡを発現する組換えウイル
ス、および生理学的に許容しうる担体またはアジュバン
トを含有する、コクシジウム症から家禽を保護するため
のワクチン。
チンの提供。 【解決手段】アイメリアメロゾイト表面抗原の免疫反応
決定基および／または抗原決定基を1以上有する蛋白ま
たは該蛋白をコードするＤＮＡを発現する組換えウイル
ス、および生理学的に許容しうる担体またはアジュバン
トを含有する、コクシジウム症から家禽を保護するため
のワクチン。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は寄生性のアイメリア（Ei
meria ）原虫の抗原をコードするＤＮＡを発現する組換
えウイルス、該組換えウイルスの作成法、該抗原を含
む、コクシジウム症から家禽を保護するためのワクチン
に関する。
meria ）原虫の抗原をコードするＤＮＡを発現する組換
えウイルス、該組換えウイルスの作成法、該抗原を含
む、コクシジウム症から家禽を保護するためのワクチン
に関する。
【０００２】
【従来の技術】コクシジウム症はアイメリア属の寄生性
細胞内原虫によって引き起こされる家禽の疾病である。
この疾病は大規模な集約的家禽飼育施設に特有の病気で
ある。化学療法によってこの疾病を防ぐための概算費用
はアメリカ合衆国だけで毎年１億ドルを越える。既知の
抗コクシジウム薬に対する耐性の出現が絶えず新薬の開
発を必要としているが、新薬の開発にはますます費用が
かかるようになってきており、しかも食用動物中の残留
薬剤に対する消費者の許容範囲が次第に狭まりつつあ
る。
細胞内原虫によって引き起こされる家禽の疾病である。
この疾病は大規模な集約的家禽飼育施設に特有の病気で
ある。化学療法によってこの疾病を防ぐための概算費用
はアメリカ合衆国だけで毎年１億ドルを越える。既知の
抗コクシジウム薬に対する耐性の出現が絶えず新薬の開
発を必要としているが、新薬の開発にはますます費用が
かかるようになってきており、しかも食用動物中の残留
薬剤に対する消費者の許容範囲が次第に狭まりつつあ
る。
【０００３】自然のコクシジウム症感染に対する防御免
疫は十分に文献中で実証されている。少数の生存性オー
シストを数週間にわたって毎日管理投与すると、通常の
毒性量のチャレンジ感染に対して完全な免疫が賦与され
ることが示されている〔Roseら, Parasitology73:25 (1
976); Roseら, Parasitology88:199 (1984) 〕。感染に
対する抵抗が獲得されたことの証明により、ひな鳥に免
疫を誘導するワクチン製造の可能性が示唆され、これは
コクシジウム化学抑制剤の必要性を回避するものであっ
た。実際に、この種の概念は Sterwin Laboratories (O
pelika, AL) のCoccivac （登録商標）配合物において
試験されている。
疫は十分に文献中で実証されている。少数の生存性オー
シストを数週間にわたって毎日管理投与すると、通常の
毒性量のチャレンジ感染に対して完全な免疫が賦与され
ることが示されている〔Roseら, Parasitology73:25 (1
976); Roseら, Parasitology88:199 (1984) 〕。感染に
対する抵抗が獲得されたことの証明により、ひな鳥に免
疫を誘導するワクチン製造の可能性が示唆され、これは
コクシジウム化学抑制剤の必要性を回避するものであっ
た。実際に、この種の概念は Sterwin Laboratories (O
pelika, AL) のCoccivac （登録商標）配合物において
試験されている。
【０００４】コクシジウム症のワクチンを製造する目的
で、Murrayらの欧州特許出願公開第１６７，４４３号
は、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella ）のスポロ
ゾイトまたは胞子形成オーシストから少なくとも１５種
類のポリペプチド（これらの多くはスポロゾイトの表面
に関連する）を含有する抽出物を調製した。これらの抽
出物をニワトリに注射すると、毒性Ｅ. テネラの胞子形
成オーシストを経口接種させた後の盲腸病変が軽減され
た。
で、Murrayらの欧州特許出願公開第１６７，４４３号
は、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella ）のスポロ
ゾイトまたは胞子形成オーシストから少なくとも１５種
類のポリペプチド（これらの多くはスポロゾイトの表面
に関連する）を含有する抽出物を調製した。これらの抽
出物をニワトリに注射すると、毒性Ｅ. テネラの胞子形
成オーシストを経口接種させた後の盲腸病変が軽減され
た。
【０００５】比較的最近になって、Schenkelらの米国特
許第４，６５０，６７６号は、Ｅ.テネラのメロゾイト
に対するモノクローナル抗体の生産を開示した。これら
の抗体を用いて、Schenkelらはこれら抗体に対する抗原
を数多く同定した。Ｅ. テネラのスポロゾイトをこれら
の抗体とプレインキュベートし、次に処理済のスポロゾ
イトをニワトリの盲腸に導入することにより、Schenkel
らは盲腸病変の程度を未処理スポロゾイト対照と比べて
若干低下させることができた。
許第４，６５０，６７６号は、Ｅ.テネラのメロゾイト
に対するモノクローナル抗体の生産を開示した。これら
の抗体を用いて、Schenkelらはこれら抗体に対する抗原
を数多く同定した。Ｅ. テネラのスポロゾイトをこれら
の抗体とプレインキュベートし、次に処理済のスポロゾ
イトをニワトリの盲腸に導入することにより、Schenkel
らは盲腸病変の程度を未処理スポロゾイト対照と比べて
若干低下させることができた。
【０００６】組み換えＤＮＡ方法を用いて、Newmanら
（欧州特許出願公開第１６４，１７６号）はアイメリア
・テネラから２５，０００ダルトン抗原をコードするス
ポロゾイト期からの遺伝子をクローニングした。死滅し
たＥ. テネラスポロゾイトを用いる反復免疫感作により
免疫したニワトリからの血清は、ヨウ素化スポロシスト
およびスポロゾイト膜調製物からこの抗原を免疫沈降さ
せた。より最近、Jenkins Nucleic Acids Res. 16:986
3 (1988) はアイメリア・アセルブリナ（Eimeria acer
vulina）からの２５０，０００ダルトンのメロゾイト表
面蛋白の一部をコードするｃＤＮＡについて記載してい
る。このｃＤＮＡの発現産物はこの生物に対する抗血清
により認識された。
（欧州特許出願公開第１６４，１７６号）はアイメリア
・テネラから２５，０００ダルトン抗原をコードするス
ポロゾイト期からの遺伝子をクローニングした。死滅し
たＥ. テネラスポロゾイトを用いる反復免疫感作により
免疫したニワトリからの血清は、ヨウ素化スポロシスト
およびスポロゾイト膜調製物からこの抗原を免疫沈降さ
せた。より最近、Jenkins Nucleic Acids Res. 16:986
3 (1988) はアイメリア・アセルブリナ（Eimeria acer
vulina）からの２５０，０００ダルトンのメロゾイト表
面蛋白の一部をコードするｃＤＮＡについて記載してい
る。このｃＤＮＡの発現産物はこの生物に対する抗血清
により認識された。
【０００７】組み換えＤＮＡ技術の進歩により別のアプ
ローチ、すなわちサブユニットワクチン、が利用可能と
なった。かかるサブユニットワクチンの例は、例えば欧
州特許出願公開第３２４６４８号、同第３３７５８９号
および同第３４４８０８号に記載されている。
ローチ、すなわちサブユニットワクチン、が利用可能と
なった。かかるサブユニットワクチンの例は、例えば欧
州特許出願公開第３２４６４８号、同第３３７５８９号
および同第３４４８０８号に記載されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アイメリア
メロゾイト表面抗原の免疫反応決定基および／または抗
原決定基を1以上有する蛋白をコードするＤＮＡ配列を
含有し、かつ該ＤＮＡ配列を発現できる組換えウイルス
並びにコクシジウム症から家禽を保護するためのワクチ
ンを提供しようとするものである。
メロゾイト表面抗原の免疫反応決定基および／または抗
原決定基を1以上有する蛋白をコードするＤＮＡ配列を
含有し、かつ該ＤＮＡ配列を発現できる組換えウイルス
並びにコクシジウム症から家禽を保護するためのワクチ
ンを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】本発明は、ドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）で測定して約２３キロダルトンの見掛け分
子量を有し、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約３０キ
ロダルトンの見掛け分子量を有する前駆体蛋白から誘導
されるアイメリアメロゾイト表面抗原の免疫反応決定基
および／または抗原決定基の１つまたはそれ以上を有す
る精製蛋白を提供する。これらの蛋白は他のアイメリア
蛋白を実質的に含まない。
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）で測定して約２３キロダルトンの見掛け分
子量を有し、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約３０キ
ロダルトンの見掛け分子量を有する前駆体蛋白から誘導
されるアイメリアメロゾイト表面抗原の免疫反応決定基
および／または抗原決定基の１つまたはそれ以上を有す
る精製蛋白を提供する。これらの蛋白は他のアイメリア
蛋白を実質的に含まない。
【０００９】より詳細には、本発明は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで測定して約２３キロダルトンの見掛け分子量を有す
るアイメリアメロゾイト表面抗原から成る単離蛋白およ
び該蛋白の断片を提供する。これらの蛋白および断片は
他のアイメリア蛋白を実質的に含まない。本発明はさら
に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約３０キロダルトンの
見掛け分子量を有し、かつ図１に示されるアミノ酸配列
を有する、前記アイメリアメロゾイト表面抗原の前駆体
蛋白から成る蛋白またはその断片を提供する。該前駆体
蛋白は他のアイメリア蛋白を実質的に含まない。
Ｅで測定して約２３キロダルトンの見掛け分子量を有す
るアイメリアメロゾイト表面抗原から成る単離蛋白およ
び該蛋白の断片を提供する。これらの蛋白および断片は
他のアイメリア蛋白を実質的に含まない。本発明はさら
に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約３０キロダルトンの
見掛け分子量を有し、かつ図１に示されるアミノ酸配列
を有する、前記アイメリアメロゾイト表面抗原の前駆体
蛋白から成る蛋白またはその断片を提供する。該前駆体
蛋白は他のアイメリア蛋白を実質的に含まない。
【００１０】本発明の好適な蛋白は、図１に示されるア
ミノ酸配列を有するがＮ末端のシグナルペプチド配列
（このシグナルペプチド配列は図１に示される配列中の
最初の２０個のアミノ酸から実質的に成る）を欠く成熟
アイメリアメロゾイト表面抗原蛋白である。本発明はま
た、前記蛋白の免疫学的性質を実質的に変えることなく
欠失、挿入または置換により前記アミノ酸配列と関連す
るアミノ酸配列を有するその機能的同等蛋白にも関す
る。
ミノ酸配列を有するがＮ末端のシグナルペプチド配列
（このシグナルペプチド配列は図１に示される配列中の
最初の２０個のアミノ酸から実質的に成る）を欠く成熟
アイメリアメロゾイト表面抗原蛋白である。本発明はま
た、前記蛋白の免疫学的性質を実質的に変えることなく
欠失、挿入または置換により前記アミノ酸配列と関連す
るアミノ酸配列を有するその機能的同等蛋白にも関す
る。
【００１１】本発明はさらに、約２３キロダルトンの見
掛け分子量を有するアイメリアメロゾイト表面抗原また
は先に述べたその前駆体蛋白の全部または一部をコード
するＤＮＡ、前記ＤＮＡを含有しかつ適合性の宿主生物
内で前記ＤＮＡの発現を指示しうる組み換えベクター、
およびかかるベクターを含有する微生物をも提供する。
掛け分子量を有するアイメリアメロゾイト表面抗原また
は先に述べたその前駆体蛋白の全部または一部をコード
するＤＮＡ、前記ＤＮＡを含有しかつ適合性の宿主生物
内で前記ＤＮＡの発現を指示しうる組み換えベクター、
およびかかるベクターを含有する微生物をも提供する。
【００１２】本発明はさらに、約２３キロダルトンの見
掛け分子量を有するアイメリアメロゾイト表面抗原の免
疫反応決定基および／または抗原決定基の１つまたはそ
れ以上を有する蛋白を生産する方法であって、（ａ）前
記蛋白をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
（例えば、図１に示されるヌクレオチド配列を有するＤ
ＮＡ）またはその断片を含んでなる組み換えベクターを
含有する微生物を、該ＤＮＡ配列または断片が発現され
る条件下で培養し；そして（ｂ）この培養物から前記蛋
白を単離する、ことを含んで成る方法をも提供する。
掛け分子量を有するアイメリアメロゾイト表面抗原の免
疫反応決定基および／または抗原決定基の１つまたはそ
れ以上を有する蛋白を生産する方法であって、（ａ）前
記蛋白をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
（例えば、図１に示されるヌクレオチド配列を有するＤ
ＮＡ）またはその断片を含んでなる組み換えベクターを
含有する微生物を、該ＤＮＡ配列または断片が発現され
る条件下で培養し；そして（ｂ）この培養物から前記蛋
白を単離する、ことを含んで成る方法をも提供する。
【００１３】本発明はさらに、本発明蛋白の１種または
それ以上の有効量および生理学的に許容しうる担体を含
有する、コクシジウム症から家禽を保護するためのワク
チンを提供する。本発明はさらに、本発明蛋白をコード
するＤＮＡ配列を含有しかつ該ＤＮＡ配列を発現させる
ことができる組み換えウイルスおよび生理学的に許容し
うる担体を含有する、コクシジウム症から家禽を保護す
るためのワクチンをも提供する。
それ以上の有効量および生理学的に許容しうる担体を含
有する、コクシジウム症から家禽を保護するためのワク
チンを提供する。本発明はさらに、本発明蛋白をコード
するＤＮＡ配列を含有しかつ該ＤＮＡ配列を発現させる
ことができる組み換えウイルスおよび生理学的に許容し
うる担体を含有する、コクシジウム症から家禽を保護す
るためのワクチンをも提供する。
【００１４】本発明はさらに、コクシジウム症にかかり
やすい若い家禽に有効量の本発明ワクチンを投与するこ
とから成る、コクシジウム症から家禽を保護する方法を
も提供する。本発明のアイメリア蛋白は、コクシジウム
症の原因生物に対して免疫を獲得した動物の血清に含ま
れる抗体を用いて同定されたので、重要なワクチン抗原
である。このために、これらの蛋白はコクシジウム症か
らの家禽の保護において重要な役割を演ずる可能性が高
い。
やすい若い家禽に有効量の本発明ワクチンを投与するこ
とから成る、コクシジウム症から家禽を保護する方法を
も提供する。本発明のアイメリア蛋白は、コクシジウム
症の原因生物に対して免疫を獲得した動物の血清に含ま
れる抗体を用いて同定されたので、重要なワクチン抗原
である。このために、これらの蛋白はコクシジウム症か
らの家禽の保護において重要な役割を演ずる可能性が高
い。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明は図面を参照することによ
って一層理解しやすくなるであろう。図１は、ウサギ由
来の抗体選別した抗体と免疫ニワトリ血清により認識さ
れるアイメリア前駆体蛋白をコードする１．２ｋｂのｃ
ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す。図１から分かる
とおり、該前駆体蛋白をコードするヌクレオチド配列は
ヌクレオチド６８のＡＴＧとヌクレオチド６６８の停止
コドンＴＡＡの間に含まれる（２００個のアミノ酸をコ
ードする）。図１はまた提示されたヌクレオチド配列か
ら予測されるアイメリア前駆体蛋白のアミノ酸配列も示
す。ヌクレオチドおよびアミノ酸を表すのに標準一文字
略号が用いられる。これらの略号の意味は、Lehninger,
Principles of Biochemistry, 1984, Worth Publisher
s,Inc.,New York, p.96, 798 のような標準的な生化学
の書物に記載されている。
って一層理解しやすくなるであろう。図１は、ウサギ由
来の抗体選別した抗体と免疫ニワトリ血清により認識さ
れるアイメリア前駆体蛋白をコードする１．２ｋｂのｃ
ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す。図１から分かる
とおり、該前駆体蛋白をコードするヌクレオチド配列は
ヌクレオチド６８のＡＴＧとヌクレオチド６６８の停止
コドンＴＡＡの間に含まれる（２００個のアミノ酸をコ
ードする）。図１はまた提示されたヌクレオチド配列か
ら予測されるアイメリア前駆体蛋白のアミノ酸配列も示
す。ヌクレオチドおよびアミノ酸を表すのに標準一文字
略号が用いられる。これらの略号の意味は、Lehninger,
Principles of Biochemistry, 1984, Worth Publisher
s,Inc.,New York, p.96, 798 のような標準的な生化学
の書物に記載されている。
【００１６】図２は、種々のアイメリアメロゾイト蛋白
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。パネルＡは対照
（ａ）または抗体選別した抗体（ｂ）を用いて検索した
全メロゾイト蛋白のイムノブロットである。パネルＡ中
の矢印は約２３キロダルトンの分子量を有する蛋白を含
有するバンドの位置を示す。パネルＢは対照（ａ）また
は抗体選別した抗体（ｂ）で免疫沈降した125 −Ｉ−表
面標識メロゾイト蛋白のオートラジオグラムである。パ
ネルＣはメロゾイトｍＲＮＡのインビトロ翻訳により作
製された生産物の完全混合物（ａ）、およびラムダ５−
７クローンを用いて選別した抗体（ｂ）、抗メロゾイト
血清と反応性の蛋白を生産する別のファージクローンを
用いて選別した抗体（ｃ）および非組み換えファージを
用いてメロゾイト血清から選別した対照抗体（ｄ）を用
いて免疫沈降させた翻訳産物を示す。バンドはフルオロ
グラフィーにより可視化した。キロダルトン（ｋＤａ）
で示した分子量をもつ分子量マーカーの位置を図面の右
側に示す。
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。パネルＡは対照
（ａ）または抗体選別した抗体（ｂ）を用いて検索した
全メロゾイト蛋白のイムノブロットである。パネルＡ中
の矢印は約２３キロダルトンの分子量を有する蛋白を含
有するバンドの位置を示す。パネルＢは対照（ａ）また
は抗体選別した抗体（ｂ）で免疫沈降した125 −Ｉ−表
面標識メロゾイト蛋白のオートラジオグラムである。パ
ネルＣはメロゾイトｍＲＮＡのインビトロ翻訳により作
製された生産物の完全混合物（ａ）、およびラムダ５−
７クローンを用いて選別した抗体（ｂ）、抗メロゾイト
血清と反応性の蛋白を生産する別のファージクローンを
用いて選別した抗体（ｃ）および非組み換えファージを
用いてメロゾイト血清から選別した対照抗体（ｄ）を用
いて免疫沈降させた翻訳産物を示す。バンドはフルオロ
グラフィーにより可視化した。キロダルトン（ｋＤａ）
で示した分子量をもつ分子量マーカーの位置を図面の右
側に示す。
【００１７】図３は、ＰｖｕＩＩ（レーン１）、Ｈｉｎ
ｃＩＩ（レーン２）、ＰｓｔＩ（レーン３）、ＳｐｈＩ
（レーン４）またはＳａｃＩ（レーン５）を用いて消化
したアイメリア・テネラの胞子形成オーシストのゲノム
ＤＮＡのサザンブロット分析の結果を示す。ｋｂで示し
た大きさをもつ標準ＤＮＡの位置を図面の右側に示す。
ｃＩＩ（レーン２）、ＰｓｔＩ（レーン３）、ＳｐｈＩ
（レーン４）またはＳａｃＩ（レーン５）を用いて消化
したアイメリア・テネラの胞子形成オーシストのゲノム
ＤＮＡのサザンブロット分析の結果を示す。ｋｂで示し
た大きさをもつ標準ＤＮＡの位置を図面の右側に示す。
【００１８】図４は、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ
Ｉの模式図を示す。この図および図６、８、１０におい
て、略号および記号Ｂ、Ｂｇ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｘ
およびＸｂはそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩの切断位置を示
す。
Ｉの模式図を示す。この図および図６、８、１０におい
て、略号および記号Ｂ、Ｂｇ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｘ
およびＸｂはそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩの切断位置を示
す。
【００１９】
【化２】
【００２０】図５は、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ
Ｉの全ヌクレオチド配列を示す。この配列には、図４で
示される制限酵素の認識配列が示してある。示したアミ
ノ酸配列はリボソーム結合部位ＲＢＳＩＩの支配下にあ
るオープン・リーディング・フレームを表す。図６は、
プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−１）の模式図を
示す。
Ｉの全ヌクレオチド配列を示す。この配列には、図４で
示される制限酵素の認識配列が示してある。示したアミ
ノ酸配列はリボソーム結合部位ＲＢＳＩＩの支配下にあ
るオープン・リーディング・フレームを表す。図６は、
プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−１）の模式図を
示す。
【００２１】図７は、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ
Ｉ（−１）の全ヌクレオチド配列を示す。この配列に
は、図６に示される制限酵素の認識配列が示してある。
示したアミノ酸配列はリボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ
（−１）の支配下にあるオープン・リーディング・フレ
ームを表す。図８は、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ
Ｉ（−２）の模式図を示す。
Ｉ（−１）の全ヌクレオチド配列を示す。この配列に
は、図６に示される制限酵素の認識配列が示してある。
示したアミノ酸配列はリボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ
（−１）の支配下にあるオープン・リーディング・フレ
ームを表す。図８は、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ
Ｉ（−２）の模式図を示す。
【００２２】図９は、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ
Ｉ（−２）の全ヌクレオチド配列を示す。この配列に
は、図８に示される制限酵素の認識配列が示してある。
示したアミノ酸配列はリボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ
（−２）の支配下にあるオープン・リーディング・フレ
ームを表す。図１０は、プラスミドｐＤＭＩ．１の模式
図を示す。
Ｉ（−２）の全ヌクレオチド配列を示す。この配列に
は、図８に示される制限酵素の認識配列が示してある。
示したアミノ酸配列はリボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ
（−２）の支配下にあるオープン・リーディング・フレ
ームを表す。図１０は、プラスミドｐＤＭＩ．１の模式
図を示す。
【００２３】図１１は、プラスミドｐＤＭＩ．１の全ヌ
クレオチド配列を示す。この配列には、図１０に示され
る制限酵素の認識配列が示してある。示したアミノ酸は
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＭｅｔからＰ
ｈｅまで）およびlac リプレッサー（ＭｅｔからＧｌｎ
まで；この遺伝子の逆方向に留意されたい）をコードす
るオープン・リーディング・フレームを包含する。
クレオチド配列を示す。この配列には、図１０に示され
る制限酵素の認識配列が示してある。示したアミノ酸は
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＭｅｔからＰ
ｈｅまで）およびlac リプレッサー（ＭｅｔからＧｌｎ
まで；この遺伝子の逆方向に留意されたい）をコードす
るオープン・リーディング・フレームを包含する。
【００２４】ここに引用したすべての文献は参照として
そのすべてがここにとり込まれるものとする。本明細書
中で用いられる以下の用語は次の意味をもつものとす
る：「アイメリア表面抗原」はアイメリア・テネラのメ
ロゾイト期に存在する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約
２３キロダルトンの見掛け分子量を有する蛋白を意味す
る。この蛋白は図１に示されるヌクレオチド配列を有す
る遺伝子のインビボ発現産物の翻訳後プロセッシングに
より生成されると考えられる。
そのすべてがここにとり込まれるものとする。本明細書
中で用いられる以下の用語は次の意味をもつものとす
る：「アイメリア表面抗原」はアイメリア・テネラのメ
ロゾイト期に存在する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約
２３キロダルトンの見掛け分子量を有する蛋白を意味す
る。この蛋白は図１に示されるヌクレオチド配列を有す
る遺伝子のインビボ発現産物の翻訳後プロセッシングに
より生成されると考えられる。
【００２５】「前駆体蛋白」はＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定
して約３０キロダルトンの見掛け分子量を有する蛋白を
意味する。この蛋白はインビボ蛋白分解によりアイメリ
ア表面抗原にプロセッシングされると考えられる。この
蛋白をコードするｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列およ
びそれから予測されるアミノ酸配列を図１に示してあ
る。
して約３０キロダルトンの見掛け分子量を有する蛋白を
意味する。この蛋白はインビボ蛋白分解によりアイメリ
ア表面抗原にプロセッシングされると考えられる。この
蛋白をコードするｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列およ
びそれから予測されるアミノ酸配列を図１に示してあ
る。
【００２６】「アイメリア表面抗原の免疫反応決定基お
よび／または抗原決定基の１つまたはそれ以上を有する
蛋白」という表現は、免疫学的にコンピテントな宿主生
物に免疫応答を惹起させることができおよび／または相
補的抗体に特異的に結合することができ、そして前記定
義したアイメリア表面抗原のエピトープに相当する領域
またはエピトープを１つまたはそれ以上有する蛋白を意
味する。前記蛋白は図１のヌクレオチド配列の機能的同
等物によりコードされうる。これらの機能的同等蛋白
は、免疫学的活性を実質的に変えない（すなわち、免疫
反応決定基および／または抗原決定基を実質的に破壊し
ない）アミノ酸置換により図１の配列と関連するアミノ
酸配列をもっている。
よび／または抗原決定基の１つまたはそれ以上を有する
蛋白」という表現は、免疫学的にコンピテントな宿主生
物に免疫応答を惹起させることができおよび／または相
補的抗体に特異的に結合することができ、そして前記定
義したアイメリア表面抗原のエピトープに相当する領域
またはエピトープを１つまたはそれ以上有する蛋白を意
味する。前記蛋白は図１のヌクレオチド配列の機能的同
等物によりコードされうる。これらの機能的同等蛋白
は、免疫学的活性を実質的に変えない（すなわち、免疫
反応決定基および／または抗原決定基を実質的に破壊し
ない）アミノ酸置換により図１の配列と関連するアミノ
酸配列をもっている。
【００２７】遺伝暗号の縮重ゆえに、図１に示されるア
ミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列（機能的同
等物）は多数存在しうることが理解されよう。また、ベ
クターに挿入された本発明のＤＮＡ配列および断片のヌ
クレオチド配列は、かかる配列または断片を含有する組
み換えベクターが適当な宿主生物内でアイメリア表面抗
原の免疫反応決定基および／または抗原決定基の１つま
たはそれ以上を有する蛋白もしくは断片の生産を指示し
うる限り、実際の構造遺伝子の部分でないヌクレオチド
を包含しうることも理解されよう。
ミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列（機能的同
等物）は多数存在しうることが理解されよう。また、ベ
クターに挿入された本発明のＤＮＡ配列および断片のヌ
クレオチド配列は、かかる配列または断片を含有する組
み換えベクターが適当な宿主生物内でアイメリア表面抗
原の免疫反応決定基および／または抗原決定基の１つま
たはそれ以上を有する蛋白もしくは断片の生産を指示し
うる限り、実際の構造遺伝子の部分でないヌクレオチド
を包含しうることも理解されよう。
【００２８】蛋白の生物学的および免疫学的活性を実質
的に変えないアミノ酸置換が起こることは知られてお
り、例えば Neurathら, “The Proteins", Academic Pr
ess, New York (1979) 、特に１４頁の図６、に記載さ
れている。最もしばしば観察されるアミノ酸置換はＡｌ
ａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ
／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／
Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐ
ｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓ
ｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌ
ｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、およびこれらの逆である。
的に変えないアミノ酸置換が起こることは知られてお
り、例えば Neurathら, “The Proteins", Academic Pr
ess, New York (1979) 、特に１４頁の図６、に記載さ
れている。最もしばしば観察されるアミノ酸置換はＡｌ
ａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ
／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／
Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐ
ｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓ
ｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌ
ｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、およびこれらの逆である。
【００２９】本発明具体例のかかる機能的に同等なヌク
レオチド配列変更およびアミノ酸置換は、生成する蛋白
がここに定義されるアイメリア表面抗原の免疫反応決定
基および／または抗原決定基の１つまたはそれ以上を保
有する限り、本発明の範囲内にある。図１のアミノ酸配
列または置換により関係づけられたアミノ酸配列をコー
ドする他のＤＮＡ配列は、Morinagaら, Biotechnology
2:636 (1984) に記載されるように、本発明の例示ｃＤ
ＮＡ（図１）に対するプライマー指示部位特異的突然変
異誘発により、適当な合成オリゴヌクレオチドを用いて
簡単に作製することができる。
レオチド配列変更およびアミノ酸置換は、生成する蛋白
がここに定義されるアイメリア表面抗原の免疫反応決定
基および／または抗原決定基の１つまたはそれ以上を保
有する限り、本発明の範囲内にある。図１のアミノ酸配
列または置換により関係づけられたアミノ酸配列をコー
ドする他のＤＮＡ配列は、Morinagaら, Biotechnology
2:636 (1984) に記載されるように、本発明の例示ｃＤ
ＮＡ（図１）に対するプライマー指示部位特異的突然変
異誘発により、適当な合成オリゴヌクレオチドを用いて
簡単に作製することができる。
【００３０】「断片」なる用語は本発明のｃＤＮＡまた
は蛋白の１つのサブ配列から成るオリゴヌクレオチドま
たはポリペプチドを意味する。かかる断片はＤＮＡに対
しては制限エンドヌクレアーゼを、蛋白に対してはプロ
テアーゼを使って、より大きい分子を酵素的に切断する
ことにより生成できる。しかしながら、本発明の断片は
酵素切断産物に限定されず、末端が酵素切断点に一致し
ないサブ配列をも包含する。かかる断片は、例えば化学
合成により、ここに示した配列データを用いて作ること
ができる。また、ＤＮＡ断片は単離したメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から不完全な相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）合成により作ることもできる。蛋白断片はまたその
蛋白断片をコードするＤＮＡ断片を発現させることによ
っても作製できる。かかる蛋白断片は、それらが免疫反
応決定基および／または抗原決定基を構成するに足る数
のアミノ酸残基を含有する場合に、本発明において有用
でありうる。一般には、少なくとも約７個か８個の残基
が必要である。以下で説明するように、かかる断片を免
疫反応性となすためには、それらを免疫原性のあるキャ
リアー分子に結合させることが必要であるかもしれな
い。
は蛋白の１つのサブ配列から成るオリゴヌクレオチドま
たはポリペプチドを意味する。かかる断片はＤＮＡに対
しては制限エンドヌクレアーゼを、蛋白に対してはプロ
テアーゼを使って、より大きい分子を酵素的に切断する
ことにより生成できる。しかしながら、本発明の断片は
酵素切断産物に限定されず、末端が酵素切断点に一致し
ないサブ配列をも包含する。かかる断片は、例えば化学
合成により、ここに示した配列データを用いて作ること
ができる。また、ＤＮＡ断片は単離したメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から不完全な相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）合成により作ることもできる。蛋白断片はまたその
蛋白断片をコードするＤＮＡ断片を発現させることによ
っても作製できる。かかる蛋白断片は、それらが免疫反
応決定基および／または抗原決定基を構成するに足る数
のアミノ酸残基を含有する場合に、本発明において有用
でありうる。一般には、少なくとも約７個か８個の残基
が必要である。以下で説明するように、かかる断片を免
疫反応性となすためには、それらを免疫原性のあるキャ
リアー分子に結合させることが必要であるかもしれな
い。
【００３１】本発明の蛋白は組み換えＤＮＡ技術、化学
合成またはアイメリア調製物からの単離のような当分野
で知られた方法により作ることができる。本発明蛋白を
作るために必要とされるＤＮＡは、図１に示されるヌク
レオチド配列情報を用いて化学的に合成できよう。かか
る化学合成はMatteucci ら, J.Am.Chem.Soc. 103:3185
(1981) により開示されるホスホルアミダイト固形支持
体法のような任意の既知方法を用いて実施できる。
合成またはアイメリア調製物からの単離のような当分野
で知られた方法により作ることができる。本発明蛋白を
作るために必要とされるＤＮＡは、図１に示されるヌク
レオチド配列情報を用いて化学的に合成できよう。かか
る化学合成はMatteucci ら, J.Am.Chem.Soc. 103:3185
(1981) により開示されるホスホルアミダイト固形支持
体法のような任意の既知方法を用いて実施できる。
【００３２】あるいはまた、ｃＤＮＡはアイメリアｍＲ
ＮＡから作ることもできる。メッセンジャーＲＮＡは標
準技法を使ってアイメリアメロゾイトから単離できる。
これらのｍＲＮＡサンプルを用いて、Maniatisら, Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY に記
載されるようにして二本鎖ｃＤＮＡを作ることができ
る。このｃＤＮＡは次に、E.コリの形質転換に使用でき
る適当なクローニングベクターに挿入してｃＤＮＡライ
ブラリーを作製することができる。
ＮＡから作ることもできる。メッセンジャーＲＮＡは標
準技法を使ってアイメリアメロゾイトから単離できる。
これらのｍＲＮＡサンプルを用いて、Maniatisら, Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY に記
載されるようにして二本鎖ｃＤＮＡを作ることができ
る。このｃＤＮＡは次に、E.コリの形質転換に使用でき
る適当なクローニングベクターに挿入してｃＤＮＡライ
ブラリーを作製することができる。
【００３３】ｃＤＮＡライブラリーを次に本発明のクロ
ーン化遺伝子またはその断片をプローブとして用いてス
クリーニングすることができる。かかる遺伝子または断
片は、プローブとして使用するには、例えば４種類のデ
オキシリボヌクレオチド（これらのうちの１種はα位置
に32Ｐを含有）の存在下にＰｏｌ Ｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いてニック−トランスレーションすることによ
り放射性標識できる（Maniatisら, 前出 , p.109）。こ
れらプローブはまたアイメリア表面抗原のｃＤＮＡの既
知配列に基づくオリゴヌクレオチド合成によっても作製
できる。
ーン化遺伝子またはその断片をプローブとして用いてス
クリーニングすることができる。かかる遺伝子または断
片は、プローブとして使用するには、例えば４種類のデ
オキシリボヌクレオチド（これらのうちの１種はα位置
に32Ｐを含有）の存在下にＰｏｌ Ｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いてニック−トランスレーションすることによ
り放射性標識できる（Maniatisら, 前出 , p.109）。こ
れらプローブはまたアイメリア表面抗原のｃＤＮＡの既
知配列に基づくオリゴヌクレオチド合成によっても作製
できる。
【００３４】以下の実施例ではｍＲＮＡ源としてアイメ
リア・テネラを使用したが、この種からのクローン化遺
伝子は、様々な種間のＤＮＡ配列相同性ゆえに、他のア
イメリア種からの遺伝子を単離するためのプローブとし
て使用できる。本発明のアイメリアＤＮＡ配列は、ひと
たび同定されて単離されると、挿入した遺伝子配列の転
写および翻訳に必要な要素を含有する適当な発現ベヒク
ルに挿入される。有用なクローニングベヒクルは染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントから成
ることができ、例えばいろいろな既知の細菌プラスミ
ド、ファージＤＮＡ、プラスミドとファージＤＮＡの組
み合わせ（例．ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列
を用いるために修飾されたプラスミド）、もしくは酵母
プラスミドである。使用しうる詳細なクローニングベヒ
クルには、それらに制限されるわけではないが、ｐＥＶ
−ｖｒｆプラスミド（ｐＥＶ−ｖｒｆ１、−２および−
３；Crowl ら, Gene 38:31 (1985) に記載されてい
る）；ＳＶ４０；アデノウイルス；酵母；ラムダｇｔ−
ＷＥＳ−ラムダＢ；Charon 4A および 28 ；ラムダ−ｇ
ｔ−１−ラムダＢ；Ｍ１３由来ベクター、例えばｐＵＣ
８、９、１８および１９、ｐＢＲ３１３、３２２および
３２５；ｐＡＣ１０５；ｐＶＡ５１；ｐＡＣＹ１７７；
ｐＫＨ４７；ｐＡＣＹＣ１８４；ｐＵＢ１１０；ｐＭＢ
９；ｃｏｌＥ１；ｐＳＣ１０１；ｐＭＬ２１；ＲＳＦ２
１２４；ｐＣＲ１またはＲＰ４；鶏痘ウイルス；ワクシ
ニアウイルス；ヘルペスウイルス群の一員、が包含され
る。
リア・テネラを使用したが、この種からのクローン化遺
伝子は、様々な種間のＤＮＡ配列相同性ゆえに、他のア
イメリア種からの遺伝子を単離するためのプローブとし
て使用できる。本発明のアイメリアＤＮＡ配列は、ひと
たび同定されて単離されると、挿入した遺伝子配列の転
写および翻訳に必要な要素を含有する適当な発現ベヒク
ルに挿入される。有用なクローニングベヒクルは染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントから成
ることができ、例えばいろいろな既知の細菌プラスミ
ド、ファージＤＮＡ、プラスミドとファージＤＮＡの組
み合わせ（例．ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列
を用いるために修飾されたプラスミド）、もしくは酵母
プラスミドである。使用しうる詳細なクローニングベヒ
クルには、それらに制限されるわけではないが、ｐＥＶ
−ｖｒｆプラスミド（ｐＥＶ−ｖｒｆ１、−２および−
３；Crowl ら, Gene 38:31 (1985) に記載されてい
る）；ＳＶ４０；アデノウイルス；酵母；ラムダｇｔ−
ＷＥＳ−ラムダＢ；Charon 4A および 28 ；ラムダ−ｇ
ｔ−１−ラムダＢ；Ｍ１３由来ベクター、例えばｐＵＣ
８、９、１８および１９、ｐＢＲ３１３、３２２および
３２５；ｐＡＣ１０５；ｐＶＡ５１；ｐＡＣＹ１７７；
ｐＫＨ４７；ｐＡＣＹＣ１８４；ｐＵＢ１１０；ｐＭＢ
９；ｃｏｌＥ１；ｐＳＣ１０１；ｐＭＬ２１；ＲＳＦ２
１２４；ｐＣＲ１またはＲＰ４；鶏痘ウイルス；ワクシ
ニアウイルス；ヘルペスウイルス群の一員、が包含され
る。
【００３５】クローニングベクターへのアイメリア遺伝
子の挿入は、この遺伝子と所望のクローニングベヒクル
がともに同一の制限酵素で切断された場合、相補性ＤＮ
Ａ末端が形成されるので、容易に達成される。これによ
り達成できない場合は、一本鎖ＤＮＡを消化して平滑末
端とするか、あるいは一本鎖末端を適当なＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて充填して同一の結果を得ることにより、
切断した末端を修飾することが必要であろう。この方法
では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのような酵素による平滑末
端の連結を実施できる。あるいはまた、ＤＮＡ末端にヌ
クレオチド配列（リンカー）を連結することにより所望
の任意の部位を生成させることもできる。かかるリンカ
ーは制限部位認識配列をコードする特定のオリゴヌクレ
オチド配列を含有しうる。また、切断したベクターおよ
びアイメリア遺伝子または断片は、Morrow Methods in
Enzymology 68:3 (1979) 〕に記載されるようにホモポ
リマーテイリングにより修飾することもできる。
子の挿入は、この遺伝子と所望のクローニングベヒクル
がともに同一の制限酵素で切断された場合、相補性ＤＮ
Ａ末端が形成されるので、容易に達成される。これによ
り達成できない場合は、一本鎖ＤＮＡを消化して平滑末
端とするか、あるいは一本鎖末端を適当なＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて充填して同一の結果を得ることにより、
切断した末端を修飾することが必要であろう。この方法
では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのような酵素による平滑末
端の連結を実施できる。あるいはまた、ＤＮＡ末端にヌ
クレオチド配列（リンカー）を連結することにより所望
の任意の部位を生成させることもできる。かかるリンカ
ーは制限部位認識配列をコードする特定のオリゴヌクレ
オチド配列を含有しうる。また、切断したベクターおよ
びアイメリア遺伝子または断片は、Morrow Methods in
Enzymology 68:3 (1979) 〕に記載されるようにホモポ
リマーテイリングにより修飾することもできる。
【００３６】本発明で使用できるクローニングベヒクル
の多くは、所望の形質転換体の選択に使用しうるマーカ
ー活性、例えばｐＢＲ３２２中のアンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性、ｐＵＣ８中のアンピシリン耐性お
よびβ−ガラクトシダーゼ活性、並びにｐＥＶ−ｖｒｆ
プラスミド中のアンピシリン耐性、の１種またはそれ以
上を含有する。かかるベクターが挿入された宿主細胞の
選択は、宿主細胞がそれ以外はベクターにより与えられ
る活性を欠く場合に非常に単純化される。
の多くは、所望の形質転換体の選択に使用しうるマーカ
ー活性、例えばｐＢＲ３２２中のアンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性、ｐＵＣ８中のアンピシリン耐性お
よびβ−ガラクトシダーゼ活性、並びにｐＥＶ−ｖｒｆ
プラスミド中のアンピシリン耐性、の１種またはそれ以
上を含有する。かかるベクターが挿入された宿主細胞の
選択は、宿主細胞がそれ以外はベクターにより与えられ
る活性を欠く場合に非常に単純化される。
【００３７】クローニングベヒクル中の選択された部位
に挿入されるアイメリア遺伝子のヌクレオチド配列は実
際の構造遺伝子の部分でないヌクレオチドを包含しうる
ことは理解されるべきである。また、その遺伝子は完全
な野生型遺伝子の部分のみを含んでいてもよい。必要と
されていることの全ては、クローニングベヒクルへ挿入
後の遺伝子断片がアイメリア表面抗原の免疫反応決定基
および／または抗原決定基を少なくとも１つ有するポリ
ペプチドまたは蛋白の適当な宿主生物内における生産を
指示できるということである。従って、本発明蛋白をコ
ードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含有する組
み換えベクターは、（ａ）前記蛋白をコードするヌクレ
オチド配列を有するＤＮＡをベクターに挿入し；（ｂ）
該ベクターを微生物内で複製させ；そして（ｃ）その微
生物から組み換えベクターを単離することにより作製で
きる。
に挿入されるアイメリア遺伝子のヌクレオチド配列は実
際の構造遺伝子の部分でないヌクレオチドを包含しうる
ことは理解されるべきである。また、その遺伝子は完全
な野生型遺伝子の部分のみを含んでいてもよい。必要と
されていることの全ては、クローニングベヒクルへ挿入
後の遺伝子断片がアイメリア表面抗原の免疫反応決定基
および／または抗原決定基を少なくとも１つ有するポリ
ペプチドまたは蛋白の適当な宿主生物内における生産を
指示できるということである。従って、本発明蛋白をコ
ードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含有する組
み換えベクターは、（ａ）前記蛋白をコードするヌクレ
オチド配列を有するＤＮＡをベクターに挿入し；（ｂ）
該ベクターを微生物内で複製させ；そして（ｃ）その微
生物から組み換えベクターを単離することにより作製で
きる。
【００３８】適切な宿主生物の選択は当分野で知られた
多くの要因に影響される。これらの要因には、例えば選
ばれたベクターとの適合性、ハイブリッドプラスミドに
よりコードされる蛋白の毒性、所望の蛋白の回収容易
性、発現特性、生物学的安全性、費用などが含まれる。
これらの要因のバランスが考慮されねばならず、また全
ての宿主が特定の組み換えＤＮＡ分子の発現に等しく効
果的というわけではないことも理解されねばならない。
多くの要因に影響される。これらの要因には、例えば選
ばれたベクターとの適合性、ハイブリッドプラスミドに
よりコードされる蛋白の毒性、所望の蛋白の回収容易
性、発現特性、生物学的安全性、費用などが含まれる。
これらの要因のバランスが考慮されねばならず、また全
ての宿主が特定の組み換えＤＮＡ分子の発現に等しく効
果的というわけではないことも理解されねばならない。
【００３９】本発明で使用しうる好適な宿主微生物に
は、それらに限定されるわけではないが、植物、哺乳類
または酵母細胞、および細菌例えばエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacill
ussubtilis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ba
cillus stearothermophilus ）、アクチノミセス属（Ac
tinomyces ）が包含される。エシエリヒア・コリＭＣ１
０６１株〔Casadaban ら, J.Mol.Biol. 138:179 (1980)
に記載されている〕、またはプラスミドｐＲＫ２４８ｃ
Ｉｔｓを含有する他のＥ．コリＫ−１２株が使用でき
る。他のＥ．コリＫ−１２株に使用されるプラスミドｐ
ＲＫ２４８ｃＩｔｓは Bernhard ら Meth.of Enzymol.
68:482 (1979) 〕により記載されており、そしてアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションから寄託番
号ＡＴＣＣ３３７６６の下に入手できる。Ｅ．コリＭＣ
１０６１株は例えば CLONTECH Laboratories, Inc. (Pa
lo Alto, CA ）から市販されており、またアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションから寄託番号ＡＴＣ
Ｃ５３３３８の下に入手できる。Ｅ．コリＭ１５株に用
いるプラスミドｐＤＭ１．１、ｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ
Ｉ、−１または−２は以下で述べることにする。
は、それらに限定されるわけではないが、植物、哺乳類
または酵母細胞、および細菌例えばエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacill
ussubtilis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ba
cillus stearothermophilus ）、アクチノミセス属（Ac
tinomyces ）が包含される。エシエリヒア・コリＭＣ１
０６１株〔Casadaban ら, J.Mol.Biol. 138:179 (1980)
に記載されている〕、またはプラスミドｐＲＫ２４８ｃ
Ｉｔｓを含有する他のＥ．コリＫ−１２株が使用でき
る。他のＥ．コリＫ−１２株に使用されるプラスミドｐ
ＲＫ２４８ｃＩｔｓは Bernhard ら Meth.of Enzymol.
68:482 (1979) 〕により記載されており、そしてアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションから寄託番
号ＡＴＣＣ３３７６６の下に入手できる。Ｅ．コリＭＣ
１０６１株は例えば CLONTECH Laboratories, Inc. (Pa
lo Alto, CA ）から市販されており、またアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションから寄託番号ＡＴＣ
Ｃ５３３３８の下に入手できる。Ｅ．コリＭ１５株に用
いるプラスミドｐＤＭ１．１、ｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ
Ｉ、−１または−２は以下で述べることにする。
【００４０】宿主細胞への組み換えクローニングベクタ
ーの移入はいろいろな方法で実施できる。選択されたベ
クター／宿主細胞系に応じて、かかる移入は形質転換、
形質導入またはトランスフェクションにより行われう
る。ひとたびかかる修飾宿主細胞が作製されると、その
細胞を培養して、培養物から蛋白発現産物を単離でき
る。
ーの移入はいろいろな方法で実施できる。選択されたベ
クター／宿主細胞系に応じて、かかる移入は形質転換、
形質導入またはトランスフェクションにより行われう
る。ひとたびかかる修飾宿主細胞が作製されると、その
細胞を培養して、培養物から蛋白発現産物を単離でき
る。
【００４１】アイメリア表面抗原の前駆体蛋白を生産す
る形質転換体クローンは、Ｅ．テネラのグルタルアルデ
ヒド固定スポロゾイトまたはメロゾイトに対して免疫し
た動物からの血清を用いてスクリーニングすることによ
り同定される。以下の実施例では、遺伝子産物のスクリ
ーニングおよび特性決定にウサギ抗メロゾイト血清が使
用された。免疫ニワトリ血清を用いる免疫学的スクリー
ニングを並行して行うと、メロゾイト表面抗原をコード
するｃＤＮＡが独立して単離された。
る形質転換体クローンは、Ｅ．テネラのグルタルアルデ
ヒド固定スポロゾイトまたはメロゾイトに対して免疫し
た動物からの血清を用いてスクリーニングすることによ
り同定される。以下の実施例では、遺伝子産物のスクリ
ーニングおよび特性決定にウサギ抗メロゾイト血清が使
用された。免疫ニワトリ血清を用いる免疫学的スクリー
ニングを並行して行うと、メロゾイト表面抗原をコード
するｃＤＮＡが独立して単離された。
【００４２】免疫学的スクリーニングまたは免疫沈降に
使用する抗血清の特異性は、HallらNature311:379 (198
4)〕の抗体選別法の変法を用いて高めることができる。
この方法では、以下で詳しく説明するが、クローンによ
り生産されたアイメリア蛋白に特異的な抗体がフィルタ
ーに吸着される。アイメリア抗原産生性クローンの検出
は、文献に記載されている免疫沈降、酵素結合イムノア
ッセイおよびラジオイムノアッセイ技法を含めた既知の
標準アッセイ法を用いて達成できる〔例えば、Kennetら
(編), Monoclonal Antibodiesand Hybridomas: A New
Dimension in Biological Analyses, 1980, Plenum Pre
ss, New York, p.376-384 を参照〕。
使用する抗血清の特異性は、HallらNature311:379 (198
4)〕の抗体選別法の変法を用いて高めることができる。
この方法では、以下で詳しく説明するが、クローンによ
り生産されたアイメリア蛋白に特異的な抗体がフィルタ
ーに吸着される。アイメリア抗原産生性クローンの検出
は、文献に記載されている免疫沈降、酵素結合イムノア
ッセイおよびラジオイムノアッセイ技法を含めた既知の
標準アッセイ法を用いて達成できる〔例えば、Kennetら
(編), Monoclonal Antibodiesand Hybridomas: A New
Dimension in Biological Analyses, 1980, Plenum Pre
ss, New York, p.376-384 を参照〕。
【００４３】大量の組み換えアイメリア蛋白は、このよ
うにして得られた形質転換微生物を、必要な栄養素を含
有する醗酵ブロス中で組み換えＤＮＡの発現に適した条
件下に増殖させることにより生産できる。Ｅ．コリによ
り生産される場合、組み換えアイメリア蛋白は細胞質の
中または封入体の中に存在する。従って、この蛋白を遊
離させるためには、細菌の外層膜を破壊する必要があ
る。これは超音波処理によるか、あるいは他の機械的破
壊手段、例えばフレンチ加圧型セルまたはガウリンホモ
ジナイザーを用いて達成できる〔Charm ら, Meth.Enzym
ol. 22, 476-556(1971)〕。
うにして得られた形質転換微生物を、必要な栄養素を含
有する醗酵ブロス中で組み換えＤＮＡの発現に適した条
件下に増殖させることにより生産できる。Ｅ．コリによ
り生産される場合、組み換えアイメリア蛋白は細胞質の
中または封入体の中に存在する。従って、この蛋白を遊
離させるためには、細菌の外層膜を破壊する必要があ
る。これは超音波処理によるか、あるいは他の機械的破
壊手段、例えばフレンチ加圧型セルまたはガウリンホモ
ジナイザーを用いて達成できる〔Charm ら, Meth.Enzym
ol. 22, 476-556(1971)〕。
【００４４】細胞破壊は化学的もしくは酵素的手段によ
っても達成できる。２価カチオンはしばしば細胞膜の保
全に必要とされるので、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡのよう
な適当なキレート化剤での処理は細胞からの蛋白の漏出
を促進させるに充分に破壊的であることが判明しよう。
同様に、リゾチームのような酵素も同じ結果を得るため
に使用されている。この酵素は細胞壁のペプチドグリカ
ン主鎖を加水分解する。
っても達成できる。２価カチオンはしばしば細胞膜の保
全に必要とされるので、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡのよう
な適当なキレート化剤での処理は細胞からの蛋白の漏出
を促進させるに充分に破壊的であることが判明しよう。
同様に、リゾチームのような酵素も同じ結果を得るため
に使用されている。この酵素は細胞壁のペプチドグリカ
ン主鎖を加水分解する。
【００４５】さらに、浸透ショック法の適用も採用でき
る。簡単に説明すると、これは初めに細胞を高張溶液
（細胞から水を失わせ、収縮させる）の中に入れ、その
後低張“ショック”溶液の中に入れて、細胞への急激な
水の流入を起こさせ、所望の蛋白を放出させることによ
り達成される。ひとたび細胞から遊離されると、アイメ
リア蛋白は硫酸ナトリウムまたはアンモニウムのような
塩による沈殿、限外濾過または当分野でよく知られた他
の方法により濃縮できる。更なる精製は、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、分離用ディスク−ゲル、
カーテン電気泳動、等電点電気泳動、低温有機溶剤分画
化、または向流分配を含めた慣用の蛋白精製技法により
達成できようがそれらに限定されるわけではない。精製
はイムノアフィニティークロマトグラフィーによっても
行うことができる。
る。簡単に説明すると、これは初めに細胞を高張溶液
（細胞から水を失わせ、収縮させる）の中に入れ、その
後低張“ショック”溶液の中に入れて、細胞への急激な
水の流入を起こさせ、所望の蛋白を放出させることによ
り達成される。ひとたび細胞から遊離されると、アイメ
リア蛋白は硫酸ナトリウムまたはアンモニウムのような
塩による沈殿、限外濾過または当分野でよく知られた他
の方法により濃縮できる。更なる精製は、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、分離用ディスク−ゲル、
カーテン電気泳動、等電点電気泳動、低温有機溶剤分画
化、または向流分配を含めた慣用の蛋白精製技法により
達成できようがそれらに限定されるわけではない。精製
はイムノアフィニティークロマトグラフィーによっても
行うことができる。
【００４６】生物からアイメリア蛋白を精製するための
詳細な方法は当分野で知られている。例えば、Newmanら
の欧州特許出願公開第１６４１７６号を参照されたい。
本発明の蛋白またはその断片は独占的固相合成、部分的
固相法、断片縮合または古典的溶液合成のような適当な
方法により化学的に合成することもできる。Merrifield
J.Am.Chem.Soc. 85:2149 (1963) 〕記載の固相合成が
好適である。
詳細な方法は当分野で知られている。例えば、Newmanら
の欧州特許出願公開第１６４１７６号を参照されたい。
本発明の蛋白またはその断片は独占的固相合成、部分的
固相法、断片縮合または古典的溶液合成のような適当な
方法により化学的に合成することもできる。Merrifield
J.Am.Chem.Soc. 85:2149 (1963) 〕記載の固相合成が
好適である。
【００４７】かかる合成はα−アミノ末端で保護された
アミノ酸を用いて実施される。不安定な側鎖をもつ三官
能性アミノ酸も、ペプチド製造中にその部位で化学反応
が起こるのを阻止する適当な基で保護される。α−アミ
ノ保護基はアミノ末端で後続の反応を行わせるために選
択的に除去される。α−アミノ保護基の除去条件は側鎖
保護基の除去を引き起こさないものである。
アミノ酸を用いて実施される。不安定な側鎖をもつ三官
能性アミノ酸も、ペプチド製造中にその部位で化学反応
が起こるのを阻止する適当な基で保護される。α−アミ
ノ保護基はアミノ末端で後続の反応を行わせるために選
択的に除去される。α−アミノ保護基の除去条件は側鎖
保護基の除去を引き起こさないものである。
【００４８】α−アミノ保護基は段階的ペプチド合成の
分野において有用であることが知られているものであ
る。アシル型保護基（例．ホルミル、トリフルオロアセ
チル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基（例．ベン
ジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、置換ベンジルオキシ
カルボニル）、脂肪族ウレタン保護基（例．ｔ−ブチル
オキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカル
ボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル）およびアル
キル型保護基（例．ベンジル、トリフェニルメチル）が
包含される。好適な保護基はＢｏｃである。Ｔｙｒのた
めの側鎖保護基にはテトラヒドロピラニル、ｔ−ブチ
ル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、４−Ｂｒ−Ｃｂｚお
よび２，６−ジクロロベンジルが包含される。Ｔｙｒの
好適な側鎖保護基は２，６−ジクロロベンジルである。
Ａｓｐのための側鎖保護基にはベンジル、２，６−ジク
ロロベンジル、メチル、エチルおよびシクロヘキシルが
包含される。Ａｓｐの好適な側鎖保護基はシクロヘキシ
ルである。ＴｈｒおよびＳｅｒのための側鎖保護基には
アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニ
ル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジルおよびＣｂｚ
が包含される。ＴｈｒおよびＳｅｒの好適な側鎖保護基
はベンジルである。Ａｒｇのための側鎖保護基にはニト
ロ、Ｔｏｓ、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニルま
たはＢｏｃが包含される。Ａｒｇの好適な保護基はＴｏ
ｓである。Ｌｙｓの側鎖アミノ基はＣｂｚ、２−Ｃｌ−
Ｃｂｚ、ＴｏｓまたはＢｏｃで保護することができる。
２−Ｃｌ−Ｃｂｚ基がＬｙｓの好適な保護基である。側
鎖保護基の選択は下記のことに基づいている：すなわ
ち、側鎖保護基はカップリングの期間中無傷で残存しそ
してアミノ末端保護基の脱保護期間中またはカップリン
グ条件期間中には切断されない。側鎖保護基は最終ペプ
チドの合成が完了すると、その標的ペプチドを変更しな
い反応条件を用いて除去できねばならない。
分野において有用であることが知られているものであ
る。アシル型保護基（例．ホルミル、トリフルオロアセ
チル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基（例．ベン
ジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、置換ベンジルオキシ
カルボニル）、脂肪族ウレタン保護基（例．ｔ−ブチル
オキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカル
ボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル）およびアル
キル型保護基（例．ベンジル、トリフェニルメチル）が
包含される。好適な保護基はＢｏｃである。Ｔｙｒのた
めの側鎖保護基にはテトラヒドロピラニル、ｔ−ブチ
ル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、４−Ｂｒ−Ｃｂｚお
よび２，６−ジクロロベンジルが包含される。Ｔｙｒの
好適な側鎖保護基は２，６−ジクロロベンジルである。
Ａｓｐのための側鎖保護基にはベンジル、２，６−ジク
ロロベンジル、メチル、エチルおよびシクロヘキシルが
包含される。Ａｓｐの好適な側鎖保護基はシクロヘキシ
ルである。ＴｈｒおよびＳｅｒのための側鎖保護基には
アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニ
ル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジルおよびＣｂｚ
が包含される。ＴｈｒおよびＳｅｒの好適な側鎖保護基
はベンジルである。Ａｒｇのための側鎖保護基にはニト
ロ、Ｔｏｓ、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニルま
たはＢｏｃが包含される。Ａｒｇの好適な保護基はＴｏ
ｓである。Ｌｙｓの側鎖アミノ基はＣｂｚ、２−Ｃｌ−
Ｃｂｚ、ＴｏｓまたはＢｏｃで保護することができる。
２−Ｃｌ−Ｃｂｚ基がＬｙｓの好適な保護基である。側
鎖保護基の選択は下記のことに基づいている：すなわ
ち、側鎖保護基はカップリングの期間中無傷で残存しそ
してアミノ末端保護基の脱保護期間中またはカップリン
グ条件期間中には切断されない。側鎖保護基は最終ペプ
チドの合成が完了すると、その標的ペプチドを変更しな
い反応条件を用いて除去できねばならない。
【００４９】固相合成は通常α−アミノ保護（側鎖保
護）アミノ酸を適当な固形支持体にカップリングさせる
ことによりカルボキシ末端から実施される。クロロメチ
ル化またはヒドロキシメチル樹脂に結合させる場合はエ
ステル結合が形成され、生成する標的ペプチドはＣ末端
に遊離のカルボキシル基を有しよう。あるいはまた、ベ
ンズヒドリルアミンまたはｐ−メチルベンズヒドリルア
ミン樹脂が用いられる場合は、アミド結合が形成され、
生成する標的ペプチドはＣ末端にカルボキサミド基を有
しよう。これらの樹脂は市販されており、それらの製法
は Stewartら, “Solid Phase Peptide Synthesis"
（第２版、Pierce Chemical Co., Rockford,IL., 198
4）に記載されている。
護）アミノ酸を適当な固形支持体にカップリングさせる
ことによりカルボキシ末端から実施される。クロロメチ
ル化またはヒドロキシメチル樹脂に結合させる場合はエ
ステル結合が形成され、生成する標的ペプチドはＣ末端
に遊離のカルボキシル基を有しよう。あるいはまた、ベ
ンズヒドリルアミンまたはｐ−メチルベンズヒドリルア
ミン樹脂が用いられる場合は、アミド結合が形成され、
生成する標的ペプチドはＣ末端にカルボキサミド基を有
しよう。これらの樹脂は市販されており、それらの製法
は Stewartら, “Solid Phase Peptide Synthesis"
（第２版、Pierce Chemical Co., Rockford,IL., 198
4）に記載されている。
【００５０】側鎖をＴｏｓで、そしてα−アミノ官能基
をＢｏｃで保護したＣ末端アミノ酸Ａｒｇは、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソ
プロピルカルボジイミドおよびカルボニルジイミダゾー
ルを含めた種々の活性化剤を用いて、ベンズヒドリルア
ミン樹脂にカップリングさせる。樹脂支持体に結合後、
α−アミノ保護基を０−２５°Ｃの温度でジオキサン中
のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＨＣｌを用いて除
去する。起こりうるＳ−アルキル化を抑制するためにメ
チオニン（Ｍｅｔ）の導入後にジメチルスルフィドをＴ
ＦＡに加える。α−アミノ保護基の除去後、残りの保護
アミノ酸を必要な順序で逐次カップリングさせて所望の
ペプチド配列を得る。
をＢｏｃで保護したＣ末端アミノ酸Ａｒｇは、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソ
プロピルカルボジイミドおよびカルボニルジイミダゾー
ルを含めた種々の活性化剤を用いて、ベンズヒドリルア
ミン樹脂にカップリングさせる。樹脂支持体に結合後、
α−アミノ保護基を０−２５°Ｃの温度でジオキサン中
のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＨＣｌを用いて除
去する。起こりうるＳ−アルキル化を抑制するためにメ
チオニン（Ｍｅｔ）の導入後にジメチルスルフィドをＴ
ＦＡに加える。α−アミノ保護基の除去後、残りの保護
アミノ酸を必要な順序で逐次カップリングさせて所望の
ペプチド配列を得る。
【００５１】カップリング反応には、ＤＤＣ、Ｎ，Ｎ’
−ジイソプロピルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール
−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホ
スホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）およ
びＤＣＣ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）
を含む種々の活性化剤を使用できる。それぞれの保護ア
ミノ酸は過剰量（＞２．５当量）で使用され、カップリ
ングは通常ＤＭＦ、ＣＨ２ Ｃｌ２ またはそれらの混合
物中で実施される。カップリング反応の完結の程度は、
Kaiserら Anal.Biochem. 34:595 (1970)〕により記載
されたニンヒドリン反応により各段階で監視される。不
完全なカップリングが判明した場合は、そのカップリン
グ反応を繰り返す。カップリング反応は Vega 250 ，Ap
plied Biosystems シンセサイザーまたは他の市販の装
置を用いて自動的に行うことができる。標的ペプチドの
全合成後、ペプチド−樹脂をＴＦＡ／ジチオエタンを用
いて脱保護し、次にペプチドを樹脂から切断しかつ全て
の側鎖保護基を除去する液体ＨＦのような試薬を用いて
０°Ｃで１−２時間処理する。
−ジイソプロピルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール
−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホ
スホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）およ
びＤＣＣ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）
を含む種々の活性化剤を使用できる。それぞれの保護ア
ミノ酸は過剰量（＞２．５当量）で使用され、カップリ
ングは通常ＤＭＦ、ＣＨ２ Ｃｌ２ またはそれらの混合
物中で実施される。カップリング反応の完結の程度は、
Kaiserら Anal.Biochem. 34:595 (1970)〕により記載
されたニンヒドリン反応により各段階で監視される。不
完全なカップリングが判明した場合は、そのカップリン
グ反応を繰り返す。カップリング反応は Vega 250 ，Ap
plied Biosystems シンセサイザーまたは他の市販の装
置を用いて自動的に行うことができる。標的ペプチドの
全合成後、ペプチド−樹脂をＴＦＡ／ジチオエタンを用
いて脱保護し、次にペプチドを樹脂から切断しかつ全て
の側鎖保護基を除去する液体ＨＦのような試薬を用いて
０°Ｃで１−２時間処理する。
【００５２】固形支持体上での側鎖−側鎖環化は、酸性
アミノ酸（例．Ａｓｐ）および塩基性アミノ酸（例．Ｌ
ｙｓ）の側鎖官能基の選択的開裂を可能にするオルソゴ
ナル・プロテクション・スキーム（orthogonal protect
ion scheme）の使用を必要とする。Ａｓｐの側鎖のため
の９−フルオレニルメチル（ＯＦｍ）保護基およびＬｙ
ｓの側鎖のための９−フルオレニルメトキシカルボニル
（Ｆｍｏｃ）保護基がこの目的に使用できる。これらの
場合、Ｂｏｃ−保護ペプチド−樹脂の側鎖保護基はＤＭ
Ｆ中のピペリジンを用いて選択的に除去できる。環化は
ＤＣＣ、ＤＣＣ／ＨＯＢｔまたはＢＯＰを含む種々の活
性化剤を用いて固形支持体上で達成される。ＨＦ反応が
先に述べたようにして環化ペプチド−樹脂に対して実施
される。
アミノ酸（例．Ａｓｐ）および塩基性アミノ酸（例．Ｌ
ｙｓ）の側鎖官能基の選択的開裂を可能にするオルソゴ
ナル・プロテクション・スキーム（orthogonal protect
ion scheme）の使用を必要とする。Ａｓｐの側鎖のため
の９−フルオレニルメチル（ＯＦｍ）保護基およびＬｙ
ｓの側鎖のための９−フルオレニルメトキシカルボニル
（Ｆｍｏｃ）保護基がこの目的に使用できる。これらの
場合、Ｂｏｃ−保護ペプチド−樹脂の側鎖保護基はＤＭ
Ｆ中のピペリジンを用いて選択的に除去できる。環化は
ＤＣＣ、ＤＣＣ／ＨＯＢｔまたはＢＯＰを含む種々の活
性化剤を用いて固形支持体上で達成される。ＨＦ反応が
先に述べたようにして環化ペプチド−樹脂に対して実施
される。
【００５３】合成蛋白の精製は組み換え法により生産さ
れた蛋白について前記したようにして実施できる。アイ
メリア蛋白はさらに、生物から、膜蛋白の抽出物から回
収することもできる。かかる方法により完全な野生型蛋
白が生産がてきる。この目的に用いられるモノクローナ
ル抗体は、合成または天然のアイメリア蛋白を抗原とし
て用いて、Kohler および Milstein Nature 256:49
5 (1975)〕に記載されるようにして作製することができ
る。これらの方法は本発明の２３ｋｄアイメリア表面抗
原を精製するのに使用できる。
れた蛋白について前記したようにして実施できる。アイ
メリア蛋白はさらに、生物から、膜蛋白の抽出物から回
収することもできる。かかる方法により完全な野生型蛋
白が生産がてきる。この目的に用いられるモノクローナ
ル抗体は、合成または天然のアイメリア蛋白を抗原とし
て用いて、Kohler および Milstein Nature 256:49
5 (1975)〕に記載されるようにして作製することができ
る。これらの方法は本発明の２３ｋｄアイメリア表面抗
原を精製するのに使用できる。
【００５４】本発明のアイメリア蛋白の１種またはそれ
以上を、この蛋白と生理学的に許容しうる担体とを含有
するワクチンに製剤化できる。好適な担体には例えば中
性ｐＨの０．０１−０．１Ｍリン酸塩緩衝液または生理
食塩液が含有される。コクシジウム症に対する免疫は２
通りの方法の１つを用いて増強しうる。第一の方法で
は、ワクチンにアジュバントまたは免疫強化剤を添加で
きる。第二の方法 では、本発明の蛋白をより大きい形
態で、架橋複合体としてまたはキャリアー分子に結合さ
せた形態のいずれかで、免疫しようとする動物に投与で
きる。
以上を、この蛋白と生理学的に許容しうる担体とを含有
するワクチンに製剤化できる。好適な担体には例えば中
性ｐＨの０．０１−０．１Ｍリン酸塩緩衝液または生理
食塩液が含有される。コクシジウム症に対する免疫は２
通りの方法の１つを用いて増強しうる。第一の方法で
は、ワクチンにアジュバントまたは免疫強化剤を添加で
きる。第二の方法 では、本発明の蛋白をより大きい形
態で、架橋複合体としてまたはキャリアー分子に結合さ
せた形態のいずれかで、免疫しようとする動物に投与で
きる。
【００５５】動物のワクチン接種に適するアジュバント
には、それらに限定されるわけではないが、アジュバン
ト６５（ピーナッツ油、マンニドモノオレエートおよび
アルミニウムモノステアレートを含有）；無機物ゲル
（例．水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョ
ウバン）；界面活性剤（例．ヘキサデシルアミン、オク
タデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシ
ルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−
Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジ
アミン、メトキシヘキサデシルグリセロール、プルロニ
ックポリオール）；ポリアニオン類（例．ピラン、デキ
ストラン硫酸、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、カルボポー
ル）；ペプチド（例．ムラミルジペプチド、ジメチルグ
リシン、タフトシン）；および油エマルジョンが包含さ
れる。本発明蛋白はまた、リポソームまたは他のマイク
ロキャリアー内に封入させた後で投与することもでき
る。
には、それらに限定されるわけではないが、アジュバン
ト６５（ピーナッツ油、マンニドモノオレエートおよび
アルミニウムモノステアレートを含有）；無機物ゲル
（例．水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョ
ウバン）；界面活性剤（例．ヘキサデシルアミン、オク
タデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシ
ルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−
Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジ
アミン、メトキシヘキサデシルグリセロール、プルロニ
ックポリオール）；ポリアニオン類（例．ピラン、デキ
ストラン硫酸、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、カルボポー
ル）；ペプチド（例．ムラミルジペプチド、ジメチルグ
リシン、タフトシン）；および油エマルジョンが包含さ
れる。本発明蛋白はまた、リポソームまたは他のマイク
ロキャリアー内に封入させた後で投与することもでき
る。
【００５６】リポソームまたは他のマイクロキャリアー
への封入は、ワクチンの放出を長時間にわたり持続でき
る手段を提供する。Alza浸透ポンプのようなポンプがこ
の目的に使用できよう。本発明の蛋白（特に、比較的小
さい断片）の免疫原性は、架橋することにより、あるい
は免疫原性キャリアー分子（すなわち、宿主動物に免疫
応答を独立して惹起させる性質を有する巨大分子；この
分子に本発明の蛋白および蛋白断片が共有結合できる）
に結合させることにより増強できる。架橋またはキャリ
アー分子への接合は、小さな蛋白断片が時々ハプテン
（抗体と特異的に結合できるが、抗体生産を惹起できな
い分子；すなわち、それらは免疫原性がない）として作
用するので必要でありうる。免疫原性キャリアー分子へ
のかかる断片の接合によりその断片に免疫原性が付与さ
れ、このことは一般に「キャリアー効果」として知られ
ている。
への封入は、ワクチンの放出を長時間にわたり持続でき
る手段を提供する。Alza浸透ポンプのようなポンプがこ
の目的に使用できよう。本発明の蛋白（特に、比較的小
さい断片）の免疫原性は、架橋することにより、あるい
は免疫原性キャリアー分子（すなわち、宿主動物に免疫
応答を独立して惹起させる性質を有する巨大分子；この
分子に本発明の蛋白および蛋白断片が共有結合できる）
に結合させることにより増強できる。架橋またはキャリ
アー分子への接合は、小さな蛋白断片が時々ハプテン
（抗体と特異的に結合できるが、抗体生産を惹起できな
い分子；すなわち、それらは免疫原性がない）として作
用するので必要でありうる。免疫原性キャリアー分子へ
のかかる断片の接合によりその断片に免疫原性が付与さ
れ、このことは一般に「キャリアー効果」として知られ
ている。
【００５７】適当なキャリアー分子には例えばポリペプ
チド、多糖類、リポ多糖類等のような蛋白および天然ま
たは合成高分子化合物が包含される。有用なキャリアー
はQuil Aと呼ばれるグリコシドであり、これは Morein
ら Nature 308:457 (1984)に記載されている。キーホ
ールリンペット（keyhole limpet）ヘモシアニン、ヒト
またはウシγ−グロブリン、ヒト、ウシまたはウサギ血
清アルブミン、もしくはかかる蛋白のメチル化または他
の誘導体のような哺乳類血清蛋白を含めた蛋白キャリア
ー分子が特に好適であるが、それらに限定されない。他
の蛋白キャリアーは当分野で習熟した者にとって明白で
あろう。必ずそうというわけではないが蛋白キャリアー
はアイメリア蛋白に対する抗体を惹起させる予定の宿主
動物に異種のものであるのが好ましい。
チド、多糖類、リポ多糖類等のような蛋白および天然ま
たは合成高分子化合物が包含される。有用なキャリアー
はQuil Aと呼ばれるグリコシドであり、これは Morein
ら Nature 308:457 (1984)に記載されている。キーホ
ールリンペット（keyhole limpet）ヘモシアニン、ヒト
またはウシγ−グロブリン、ヒト、ウシまたはウサギ血
清アルブミン、もしくはかかる蛋白のメチル化または他
の誘導体のような哺乳類血清蛋白を含めた蛋白キャリア
ー分子が特に好適であるが、それらに限定されない。他
の蛋白キャリアーは当分野で習熟した者にとって明白で
あろう。必ずそうというわけではないが蛋白キャリアー
はアイメリア蛋白に対する抗体を惹起させる予定の宿主
動物に異種のものであるのが好ましい。
【００５８】キャリアー分子への共有結合は当分野でよ
く知られた方法を用いて実施でき、その厳密な選択は用
いるキャリアー分子の性質に左右されよう。免疫原性キ
ャリアー分子が蛋白である場合、本発明の蛋白または断
片は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドのような
水溶性カルボジイミド類またはグルタルアルデヒドを用
いて結合させることができる。
く知られた方法を用いて実施でき、その厳密な選択は用
いるキャリアー分子の性質に左右されよう。免疫原性キ
ャリアー分子が蛋白である場合、本発明の蛋白または断
片は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドのような
水溶性カルボジイミド類またはグルタルアルデヒドを用
いて結合させることができる。
【００５９】このようなカップリング剤はまた、別のキ
ャリアー分子を使用せずに、蛋白および断片をそれら自
体に架橋するためにも使用できる。蛋白または蛋白断片
の集合体をもたらすこのような架橋も免疫原性を高める
ことができる。有効量の本発明ワクチンの投与により
Ｅ．テネラによる感染から家禽を保護することができ
る。Ｅ．テネラ抗原に対するモノクローナル抗体は イ
ンビトロでＥ．アセルブリナ（E.acervulina）および
Ｅ．マキシマ（E.maxima）と交差反応し、このことはこ
れらの種に対しても防御が賦与されうることを示してい
る。本発明蛋白または蛋白断片の有効量は約５−５０μ
ｇ／ｋｇ（ワクチン接種動物の体重）の範囲である。約
２５−５０μｇ／ｋｇの量が好適である。最初のワクチ
ン接種に続いて、１週間ないし数週間後に追加免疫接種
が行われるのが好ましい。追加免疫は複数回投与でき
る。かかる追加免疫量は一般に約５−５０μｇ／ｋｇ、
好ましくは約２０−５０μｇ／ｋｇである。投与経路は
皮下、皮内、筋肉内、経口、肛門または卵内投与のよう
な標準経路が使用できる。
ャリアー分子を使用せずに、蛋白および断片をそれら自
体に架橋するためにも使用できる。蛋白または蛋白断片
の集合体をもたらすこのような架橋も免疫原性を高める
ことができる。有効量の本発明ワクチンの投与により
Ｅ．テネラによる感染から家禽を保護することができ
る。Ｅ．テネラ抗原に対するモノクローナル抗体は イ
ンビトロでＥ．アセルブリナ（E.acervulina）および
Ｅ．マキシマ（E.maxima）と交差反応し、このことはこ
れらの種に対しても防御が賦与されうることを示してい
る。本発明蛋白または蛋白断片の有効量は約５−５０μ
ｇ／ｋｇ（ワクチン接種動物の体重）の範囲である。約
２５−５０μｇ／ｋｇの量が好適である。最初のワクチ
ン接種に続いて、１週間ないし数週間後に追加免疫接種
が行われるのが好ましい。追加免疫は複数回投与でき
る。かかる追加免疫量は一般に約５−５０μｇ／ｋｇ、
好ましくは約２０−５０μｇ／ｋｇである。投与経路は
皮下、皮内、筋肉内、経口、肛門または卵内投与のよう
な標準経路が使用できる。
【００６０】また、家禽の免疫系への本発明コクシジウ
ム抗原の投与は、その抗原をコードする遺伝子を細菌
（例．Ｅ．コリ、サルモネラ）またはウイルス（例．ポ
ックスウイルス、ヘルペスウイルス）にクローニング
し、その生きたベクター系を、または適宜にその不活化
形態を家禽に経口的に、注射により、あるいは他の常用
される経路により投与することによっても達成できる。
Carbitら Vaccines, 1987, Cold Spring Harbor Labor
atory, p.68-71 はＥ．コリの使用を記載し、一方Clem
ents Pathol.Immunopathol.Res. 6:137 (1987)〕はサ
ルモネラの使用を記載している。Mossら Ann.Rev.Immu
nol.5:305 (1987)〕は組み換えポックスウイルスを使用
するウイルスベクター系の使用を概説している。
ム抗原の投与は、その抗原をコードする遺伝子を細菌
（例．Ｅ．コリ、サルモネラ）またはウイルス（例．ポ
ックスウイルス、ヘルペスウイルス）にクローニング
し、その生きたベクター系を、または適宜にその不活化
形態を家禽に経口的に、注射により、あるいは他の常用
される経路により投与することによっても達成できる。
Carbitら Vaccines, 1987, Cold Spring Harbor Labor
atory, p.68-71 はＥ．コリの使用を記載し、一方Clem
ents Pathol.Immunopathol.Res. 6:137 (1987)〕はサ
ルモネラの使用を記載している。Mossら Ann.Rev.Immu
nol.5:305 (1987)〕は組み換えポックスウイルスを使用
するウイルスベクター系の使用を概説している。
【００６１】ポックスウイルスの１種であるワクシニア
ウイルスは細胞培養物および動物へのコクシジウム抗原
の付与を試験するために使用できる。分析試験には、ワ
クシニアウイルスは鶏痘ウイルス（使用できるもう一つ
のポックスウイルスキャリアー）よりも効果的であるこ
とが判明している。これはワクシニアウイルスがトリウ
イルスより速やかに増殖し、そしてニワトリ細胞に制限
されない宿主領域を有するためである。大量の異種ＤＮ
Ａを、ウイルスの成熟および感染力を妨げずにワクシニ
アウイルスゲノムに挿入することが可能である〔Smith
ら, Gene 25:21(1983) 〕。ウイルスを用いた、多重異
種遺伝子の挿入および発現は、感染動物に発現抗原に対
する抗体の産生を誘起させる〔Perkusら, Science 22
9:981 (1985) 〕。
ウイルスは細胞培養物および動物へのコクシジウム抗原
の付与を試験するために使用できる。分析試験には、ワ
クシニアウイルスは鶏痘ウイルス（使用できるもう一つ
のポックスウイルスキャリアー）よりも効果的であるこ
とが判明している。これはワクシニアウイルスがトリウ
イルスより速やかに増殖し、そしてニワトリ細胞に制限
されない宿主領域を有するためである。大量の異種ＤＮ
Ａを、ウイルスの成熟および感染力を妨げずにワクシニ
アウイルスゲノムに挿入することが可能である〔Smith
ら, Gene 25:21(1983) 〕。ウイルスを用いた、多重異
種遺伝子の挿入および発現は、感染動物に発現抗原に対
する抗体の産生を誘起させる〔Perkusら, Science 22
9:981 (1985) 〕。
【００６２】組み換えワクシニアウイルスの作製に使用
される技術は、ルーチン法によって鶏痘ウイルスやヘル
ペスウイルス系に容易に適合させることができる。本発
明蛋白をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを
含有するむ組み換えウイルスは、（ａ）前記蛋白をコー
ドするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、ウイルスの
成熟および感染力を阻害することなくウイルスゲノムに
挿入し；（ｂ）該組み換えウイルスを細胞培養物内で増
幅させ；そして（ｃ）培地から組み換えウイルスを精製
することにより作製できる。
される技術は、ルーチン法によって鶏痘ウイルスやヘル
ペスウイルス系に容易に適合させることができる。本発
明蛋白をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを
含有するむ組み換えウイルスは、（ａ）前記蛋白をコー
ドするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、ウイルスの
成熟および感染力を阻害することなくウイルスゲノムに
挿入し；（ｂ）該組み換えウイルスを細胞培養物内で増
幅させ；そして（ｃ）培地から組み換えウイルスを精製
することにより作製できる。
【００６３】コクシジウム症に対するワクチンにおいて
組み換えウイルスをキャリアーとして使用することは、
ワクチン接種した家禽がコクシジウム抗原とウイルスキ
ャリアーの両方に対して免疫を獲得する（すなわち、こ
のようなワクチンは二価である）という点で特に有利で
ある。かかるワクチンの有用性はキャリアーウイルスに
別の遺伝子を挿入することによってさらに増強できる。
例えば、ニューカッスル病ウイルスゲノムの一部をコク
シジウム抗原遺伝子と共に鶏痘ウイルスに挿入すること
ができ、これにより単一のワクチンを用いてニューカッ
スル病、コクシジウム症および鶏痘の全てに対する免疫
を賦与することができる。
組み換えウイルスをキャリアーとして使用することは、
ワクチン接種した家禽がコクシジウム抗原とウイルスキ
ャリアーの両方に対して免疫を獲得する（すなわち、こ
のようなワクチンは二価である）という点で特に有利で
ある。かかるワクチンの有用性はキャリアーウイルスに
別の遺伝子を挿入することによってさらに増強できる。
例えば、ニューカッスル病ウイルスゲノムの一部をコク
シジウム抗原遺伝子と共に鶏痘ウイルスに挿入すること
ができ、これにより単一のワクチンを用いてニューカッ
スル病、コクシジウム症および鶏痘の全てに対する免疫
を賦与することができる。
【００６４】本発明のベクター生ワクチンの投与は当分
野でよく知られた多数の方法によって行いうる。例え
ば、鶏痘ウイルスに対して家禽を予防接種するのに普通
に用いられる“スティック（stick ）”法を使用するこ
とができる。この方法はワクチンに浸した鋭利な針で翼
の飛膜（wing web）の皮膚を突いたり刺したりすること
から成っている。この針は通常ミシン針のように先端付
近に１滴のワクチンを保持する穴がついている。あるい
はまた、生ワクチンは翼の飛膜または任意の他の部位に
皮下もしくは皮内注射することもできる。
野でよく知られた多数の方法によって行いうる。例え
ば、鶏痘ウイルスに対して家禽を予防接種するのに普通
に用いられる“スティック（stick ）”法を使用するこ
とができる。この方法はワクチンに浸した鋭利な針で翼
の飛膜（wing web）の皮膚を突いたり刺したりすること
から成っている。この針は通常ミシン針のように先端付
近に１滴のワクチンを保持する穴がついている。あるい
はまた、生ワクチンは翼の飛膜または任意の他の部位に
皮下もしくは皮内注射することもできる。
【００６５】さらに、組み換えベクター生ワクチンは飲
み水に加えてもよく、それどころかワクチン接種しよう
とするニワトリにスプレーしてもよい。それらはまた、
好ましくは保護カプセル封入後に〔Balancouら, Nature
322:373 (1986)〕餌の中に、あるいは卵の中に投与する
こともできる。後者の方法では、ウイルスワクチンがニ
ワトリの胚に直接注入される〔Sharma, Avian Dis. 25:
1155 (1985) 〕。
み水に加えてもよく、それどころかワクチン接種しよう
とするニワトリにスプレーしてもよい。それらはまた、
好ましくは保護カプセル封入後に〔Balancouら, Nature
322:373 (1986)〕餌の中に、あるいは卵の中に投与する
こともできる。後者の方法では、ウイルスワクチンがニ
ワトリの胚に直接注入される〔Sharma, Avian Dis. 25:
1155 (1985) 〕。
【００６６】
【実施例】ここに引用した文献はすべて参照としてその
全てがここにとり込まれるものとする。特に指定しない
限り、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体
中の固体について以下に示す百分率はそれぞれ wt/wt、
vol/vol および wt/vol 基準である。メロゾイトの精製 Ｅ．テネラのメロゾイトは、鳥一羽あたり５０，０００
個の上記胞子形成オーシストを感染させた５日後に、５
０羽の感染ニワトリ（生後３週間、Hubbard Cross;Avia
n Services, Frenchtown, NJ）の盲腸から収穫した。他
の起源の同様のニワトリを使用してもよい。盲腸を取り
出し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて磁気攪拌機
上で１５分間洗浄した。低速遠心（５０ x g）により上
皮細胞破片を部分的に除き、そして粗製メロゾイトを
２，０００ x g，４°Ｃで１０分間遠心して回収した。
ペレットを Lysing 緩衝液（８．２９ｇ／ｌ ＮＨ４
Ｃｌ、０．３７２ｇ／ｌ Ｎａ２ ＥＤＴＡ、１．０ｇ
／ｌ ＫＨＣＯ３ 、ｐＨ７．６）に懸濁し、氷上で３
０分間インキュベートした。メロゾイトを遠心により集
め、ＰＢＳで１回洗浄し、そして分液漏斗中にスパンナ
イロン繊維（Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratorie
s, Deerfield, IL）１．０ｇを含有するカラムに通し
た。メロゾイトを前のように遠心により集め、そしてＲ
ＮＡ単離のためにドライアイス上で凍結するか、あるい
はウェスタンブロット分析のためにジエチルアミノエチ
ルセルロース（ＤＥＡＥ，Whatman DE52, Whatman Bio
Systems, Inc., Clifton, NJ）でさらに精製した。
全てがここにとり込まれるものとする。特に指定しない
限り、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体
中の固体について以下に示す百分率はそれぞれ wt/wt、
vol/vol および wt/vol 基準である。メロゾイトの精製 Ｅ．テネラのメロゾイトは、鳥一羽あたり５０，０００
個の上記胞子形成オーシストを感染させた５日後に、５
０羽の感染ニワトリ（生後３週間、Hubbard Cross;Avia
n Services, Frenchtown, NJ）の盲腸から収穫した。他
の起源の同様のニワトリを使用してもよい。盲腸を取り
出し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて磁気攪拌機
上で１５分間洗浄した。低速遠心（５０ x g）により上
皮細胞破片を部分的に除き、そして粗製メロゾイトを
２，０００ x g，４°Ｃで１０分間遠心して回収した。
ペレットを Lysing 緩衝液（８．２９ｇ／ｌ ＮＨ４
Ｃｌ、０．３７２ｇ／ｌ Ｎａ２ ＥＤＴＡ、１．０ｇ
／ｌ ＫＨＣＯ３ 、ｐＨ７．６）に懸濁し、氷上で３
０分間インキュベートした。メロゾイトを遠心により集
め、ＰＢＳで１回洗浄し、そして分液漏斗中にスパンナ
イロン繊維（Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratorie
s, Deerfield, IL）１．０ｇを含有するカラムに通し
た。メロゾイトを前のように遠心により集め、そしてＲ
ＮＡ単離のためにドライアイス上で凍結するか、あるい
はウェスタンブロット分析のためにジエチルアミノエチ
ルセルロース（ＤＥＡＥ，Whatman DE52, Whatman Bio
Systems, Inc., Clifton, NJ）でさらに精製した。
【００６７】ＤＥＡＥセルロースでの精製には、約１ｘ
１０9 個のメロゾイトをＰＢＳ中で１０mlベッドボリュ
ームのカラムにかけ、ＰＢＳで溶離した。メロゾイトは
最初の１００mlの通り抜け画分中に回収され、実質的に
赤血球および他の細胞破片を含んでいなかった。 125 Ｉ−標識表面蛋白の免疫沈降 精製したメロゾイトの表面蛋白をＩＯＤＯＧＥＮ法（Pi
erce Chemical Co. ）によるか、またはＩＯＤＯＢＥＡ
ＤＳ（Pierce Chemical Co. ）の使用により12 5 Ｉで標
識した。後者の方法では、４つのＩＯＤＯＢＥＡＤＳを
０．２Ｍリン酸ナトリウム，ｐＨ７．５で３回洗浄し、
１−３ｍＣｉの125 Ｉ−Ｎａを加え、そして室温で５分
間インキュベートした。この反応バイアルに２００μｌ
のＰＢＳ，ｐＨ７．０中の精製メロゾイト（３ｘ１０
8 ）を加え、インキュベーションを１５分間続けた。イ
ンキュベーションの終わりに、フェニルメタンスルホニ
ルフルオライド（ＰＭＳＦ）を最終濃度５ｍＭとなるま
で加えた。
１０9 個のメロゾイトをＰＢＳ中で１０mlベッドボリュ
ームのカラムにかけ、ＰＢＳで溶離した。メロゾイトは
最初の１００mlの通り抜け画分中に回収され、実質的に
赤血球および他の細胞破片を含んでいなかった。 125 Ｉ−標識表面蛋白の免疫沈降 精製したメロゾイトの表面蛋白をＩＯＤＯＧＥＮ法（Pi
erce Chemical Co. ）によるか、またはＩＯＤＯＢＥＡ
ＤＳ（Pierce Chemical Co. ）の使用により12 5 Ｉで標
識した。後者の方法では、４つのＩＯＤＯＢＥＡＤＳを
０．２Ｍリン酸ナトリウム，ｐＨ７．５で３回洗浄し、
１−３ｍＣｉの125 Ｉ−Ｎａを加え、そして室温で５分
間インキュベートした。この反応バイアルに２００μｌ
のＰＢＳ，ｐＨ７．０中の精製メロゾイト（３ｘ１０
8 ）を加え、インキュベーションを１５分間続けた。イ
ンキュベーションの終わりに、フェニルメタンスルホニ
ルフルオライド（ＰＭＳＦ）を最終濃度５ｍＭとなるま
で加えた。
【００６８】標識したメロゾイトを１２，０００ｘｇで
３０秒遠心することによりインキュベーション混合物か
ら回収し、そしてＰＢＳ，ｐＨ７．０中の２％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）または１％トリトンＸ−１０
０のいずれかの１ml中に可溶化した。不溶物質は１２，
０００ｘｇで３分間遠心して除いた。可溶蛋白を３，５
００分子量カットオフメンブランを用いて４°Ｃで３リ
ットルのＰＢＳ，ｐＨ７．０で透析して、残留する遊離
の125 Ｉを除去した。125 Ｉ−標識蛋白（一般に約１．
５ｘ１０8 ｃｐｍが蛋白に組み込まれる）を使用時まで
４°Ｃで貯蔵した。ＴＣＡ沈殿可能な放射能は一般に全
放射能の９５％を越えていた。
３０秒遠心することによりインキュベーション混合物か
ら回収し、そしてＰＢＳ，ｐＨ７．０中の２％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）または１％トリトンＸ−１０
０のいずれかの１ml中に可溶化した。不溶物質は１２，
０００ｘｇで３分間遠心して除いた。可溶蛋白を３，５
００分子量カットオフメンブランを用いて４°Ｃで３リ
ットルのＰＢＳ，ｐＨ７．０で透析して、残留する遊離
の125 Ｉを除去した。125 Ｉ−標識蛋白（一般に約１．
５ｘ１０8 ｃｐｍが蛋白に組み込まれる）を使用時まで
４°Ｃで貯蔵した。ＴＣＡ沈殿可能な放射能は一般に全
放射能の９５％を越えていた。
【００６９】グルタルアルデヒド固定メロゾイトに対す
るウサギ抗血清は次のようにして調製した：約１ｘ１０
9 個の精製メロゾイトをＰＢＳ中の１％グルタルアルデ
ヒドに懸濁し、そして室温で５分間インキュベートし
た。固定された寄生虫は２０００ｘｇで５分間遠心する
ことにより回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして１mlの
ＰＢＳ中に再懸濁した。ニュージーランド白ウサギの背
中の皮膚に０．５mlの完全フロインドアジュバントで乳
化した固定寄生虫溶液を数回皮内注射して合計０．５ml
を投与した。これらのウサギに２週間の間隔をおいて不
完全フロインドアジュバント中に同一の寄生虫蛋白を含
有する追加免疫注射を２回与えた。最後の追加免疫の２
週間後に耳の静脈から採血し、凝固した血液サンプルを
２５００ｘｇで１５分間遠心することにより抗体含有血
清を得た。
るウサギ抗血清は次のようにして調製した：約１ｘ１０
9 個の精製メロゾイトをＰＢＳ中の１％グルタルアルデ
ヒドに懸濁し、そして室温で５分間インキュベートし
た。固定された寄生虫は２０００ｘｇで５分間遠心する
ことにより回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして１mlの
ＰＢＳ中に再懸濁した。ニュージーランド白ウサギの背
中の皮膚に０．５mlの完全フロインドアジュバントで乳
化した固定寄生虫溶液を数回皮内注射して合計０．５ml
を投与した。これらのウサギに２週間の間隔をおいて不
完全フロインドアジュバント中に同一の寄生虫蛋白を含
有する追加免疫注射を２回与えた。最後の追加免疫の２
週間後に耳の静脈から採血し、凝固した血液サンプルを
２５００ｘｇで１５分間遠心することにより抗体含有血
清を得た。
【００７０】免疫沈降用の標識蛋白のサンプル（５μ
ｌ、５ｘ１０5 ｃｐｍ含有）を１００μｌのＩＰ緩衝液
（０．２５％ＮＰ−４０、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中に希釈し、５μｇ
の Staph-A蛋白（Pansorbin （登録商標）, Calbiochem
Corp., San Diego, CA ）と共に氷上で２０分間インキ
ュベートすることにより予め清澄化し、そして５−１０
μｌのウサギ抗メロゾイト血清と４°Ｃで数時間インキ
ュベートした。抗体複合体を５μｇの Staph-A蛋白と氷
上で２０分間２回目のインキュベーションを行って集
め、Eppendorf 遠心機で１５秒間遠心した。このペレッ
トをＩＰ緩衝液で４回洗い、そして抗体試薬により免疫
沈降し標識蛋白をＳＤＳゲルサンプル緩衝液（６５ｍＭ
トリス，ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、５％β−メルカ
プトエタノール、１０％グリセロール、０．１％ブロモ
フェノールブルー）中１００°Ｃで５分間加熱すること
により複合体から溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは Laemm
li Nature 227:680 (1970) 〕に記載のようにして実施
した。
ｌ、５ｘ１０5 ｃｐｍ含有）を１００μｌのＩＰ緩衝液
（０．２５％ＮＰ−４０、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中に希釈し、５μｇ
の Staph-A蛋白（Pansorbin （登録商標）, Calbiochem
Corp., San Diego, CA ）と共に氷上で２０分間インキ
ュベートすることにより予め清澄化し、そして５−１０
μｌのウサギ抗メロゾイト血清と４°Ｃで数時間インキ
ュベートした。抗体複合体を５μｇの Staph-A蛋白と氷
上で２０分間２回目のインキュベーションを行って集
め、Eppendorf 遠心機で１５秒間遠心した。このペレッ
トをＩＰ緩衝液で４回洗い、そして抗体試薬により免疫
沈降し標識蛋白をＳＤＳゲルサンプル緩衝液（６５ｍＭ
トリス，ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、５％β−メルカ
プトエタノール、１０％グリセロール、０．１％ブロモ
フェノールブルー）中１００°Ｃで５分間加熱すること
により複合体から溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは Laemm
li Nature 227:680 (1970) 〕に記載のようにして実施
した。
【００７１】ウサギ抗血清で得られた結果は以下のよう
に調製した免疫ニワトリ血清を用いて確認された：ニワ
トリをＥ．テネラの生存胞子形成オーシストを繰り返し
感染させることにより免疫した（１００，０００オーシ
スト、２週間の間隔で３回与えた）。血液を心臓穿刺に
より採取し、抗体含有血清を２５００ｘｇで５分遠心し
たのち凝固細胞破片から分離した。
に調製した免疫ニワトリ血清を用いて確認された：ニワ
トリをＥ．テネラの生存胞子形成オーシストを繰り返し
感染させることにより免疫した（１００，０００オーシ
スト、２週間の間隔で３回与えた）。血液を心臓穿刺に
より採取し、抗体含有血清を２５００ｘｇで５分遠心し
たのち凝固細胞破片から分離した。
【００７２】抗メロゾイトウサギ血清および免疫ニワト
リ血清を用いて（１）125 Ｉ−表面−標識アイメリアメ
ロゾイト蛋白および、（２）ポリ（Ａ）含有メロゾイト
ＲＮＡのインビトロ翻訳産物を免疫沈降させる比較実験
を行った。次に、沈殿した蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
け、標準フルオログラフィー技法および試薬を用いるフ
ルオログラフィーにより可視化した。
リ血清を用いて（１）125 Ｉ−表面−標識アイメリアメ
ロゾイト蛋白および、（２）ポリ（Ａ）含有メロゾイト
ＲＮＡのインビトロ翻訳産物を免疫沈降させる比較実験
を行った。次に、沈殿した蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
け、標準フルオログラフィー技法および試薬を用いるフ
ルオログラフィーにより可視化した。
【００７３】これらの実験により、両方の起源からの多
数の蛋白が両方の血清によって沈降されることが判明し
た。従って、どちらの血清もアイメリア蛋白を発現する
遺伝子組み換え体をスクリーニングするのに使用できよ
う。便宜上、以下で説明するスクリーニング法では最初
にウサギ抗メロゾイト血清が使用された。しかしなが
ら、以下に記載するｃＤＮＡライブラリーの平行スクリ
ーニングでは免疫ニワトリ血清が使用された。これは、
ニワトリ血清のみが生存生物でのチャレンジに応答して
生産されたので、伝染性生物に対する免疫応答に重要な
役割を果たすと思われる蛋白の同定に必要不可欠であっ
た。免疫したニワトリだけが明らかにこのような生物に
抵抗を示した。
数の蛋白が両方の血清によって沈降されることが判明し
た。従って、どちらの血清もアイメリア蛋白を発現する
遺伝子組み換え体をスクリーニングするのに使用できよ
う。便宜上、以下で説明するスクリーニング法では最初
にウサギ抗メロゾイト血清が使用された。しかしなが
ら、以下に記載するｃＤＮＡライブラリーの平行スクリ
ーニングでは免疫ニワトリ血清が使用された。これは、
ニワトリ血清のみが生存生物でのチャレンジに応答して
生産されたので、伝染性生物に対する免疫応答に重要な
役割を果たすと思われる蛋白の同定に必要不可欠であっ
た。免疫したニワトリだけが明らかにこのような生物に
抵抗を示した。
【００７４】アイメリア蛋白に対するウサギ抗メロゾイ
ト血清の特異性を増強するために、Hallら, 前出、によ
り実質的に記載された抗体選別（antibody select ）を
この血清に対して実施した。簡単に説明すると、組み換
えファージクローン（以下参照）により発現された前駆
体蛋白に特異な抗体が次のようにしてウサギ抗メロゾイ
ト血清から精製された。
ト血清の特異性を増強するために、Hallら, 前出、によ
り実質的に記載された抗体選別（antibody select ）を
この血清に対して実施した。簡単に説明すると、組み換
えファージクローン（以下参照）により発現された前駆
体蛋白に特異な抗体が次のようにしてウサギ抗メロゾイ
ト血清から精製された。
【００７５】陽性ファージを高密度にまき、４２°Ｃで
３．５時間増殖させた。融合蛋白の発現はこのプレート
に１０ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
を飽和させたニトロセルロースフィルターを重層するこ
とにより誘導し、インキュベーションを３７°Ｃで６−
８時間続けた。抗原負荷フィルターをＴＢＳ（２０ｍＭ
トリスＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で
洗浄し、過剰の抗メロゾイト血清（Ｅ・コリ宿主細菌を
用いて予め吸収させたもの）と４°Ｃで８−１０時間イ
ンキュベートした。このフィルターをＴＢＳで３回洗浄
して非特異的抗体を除去した。
３．５時間増殖させた。融合蛋白の発現はこのプレート
に１０ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
を飽和させたニトロセルロースフィルターを重層するこ
とにより誘導し、インキュベーションを３７°Ｃで６−
８時間続けた。抗原負荷フィルターをＴＢＳ（２０ｍＭ
トリスＨＣｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で
洗浄し、過剰の抗メロゾイト血清（Ｅ・コリ宿主細菌を
用いて予め吸収させたもの）と４°Ｃで８−１０時間イ
ンキュベートした。このフィルターをＴＢＳで３回洗浄
して非特異的抗体を除去した。
【００７６】フィルター上で融合蛋白に特異的に結合し
た抗体を０．１Ｍグリシン，ｐＨ２．６、０．１５Ｍ
ＮａＣｌの２．０mlので溶離した（２０°Ｃで１５
分）。溶離された抗体を直ちに同量の０．１ＭトリスＨ
Ｃｌ，ｐＨ８．０で中和した。選別した抗体（以後“抗
体選別した抗体”と呼ぶ）を次に表面標識メロゾイトま
たは インビトロ 翻訳産物の免疫沈降に、あるいは全
メロゾイト蛋白のウェスタンブロットにおけるプローブ
として使用した。対照血清は抗体選別法において非組み
換えファージを用いて調製した。
た抗体を０．１Ｍグリシン，ｐＨ２．６、０．１５Ｍ
ＮａＣｌの２．０mlので溶離した（２０°Ｃで１５
分）。溶離された抗体を直ちに同量の０．１ＭトリスＨ
Ｃｌ，ｐＨ８．０で中和した。選別した抗体（以後“抗
体選別した抗体”と呼ぶ）を次に表面標識メロゾイトま
たは インビトロ 翻訳産物の免疫沈降に、あるいは全
メロゾイト蛋白のウェスタンブロットにおけるプローブ
として使用した。対照血清は抗体選別法において非組み
換えファージを用いて調製した。
【００７７】抗体選別した抗体を用いたウェスタンブロ
ットおよび免疫沈降分析の結果は図２に示してある。標
識蛋白の免疫沈降産物は Bonner ら Eur.J.Biochem, 4
6:83(1974) 〕に記載されるフルオログラフィーにより
可視化した。図面の右側の数字はキロダルトンで示した
大きさの分子量マーカー蛋白の位置を示す。図２のパネ
ルＡは対照（ａ）または抗体選別した抗体（ｂ）を用い
て検索した全メロゾイト蛋白のイムノブロットである。
パネルＢは対照（ａ）または抗体選別した抗体（ｂ）で
免疫沈降し125 −Ｉ−表面標識メロゾイト蛋白を示す。メロゾイトｍＲＮＡの単離および インビトロ 翻訳 １ｘ１０9 −１ｘ１０10の生物を含有する凍結メロゾイ
トペレットを１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）およ
び３００単位のＲＮａｓｉｎ（Promega Biotec, Madiso
n, WI ）を含有する１０mlのＴＥＬ／ＳＤＳ緩衝液
（０．２ＭトリスＨＣｌ、０．１Ｍ ＬｉＣｌ、２５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）、ｐＨ８．８）中で解凍し、そしてテフロン
被覆組織ホモジナイザーを使って１０−１２ストローク
でホモジナイズした。不溶性破片を３，０００ｘｇで低
温で遠心して分離した。上清をＴＥＬ緩衝液で平衡化し
たフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール
（２４：２４：１，ｖ／ｖ）を用いて２回抽出した。
ットおよび免疫沈降分析の結果は図２に示してある。標
識蛋白の免疫沈降産物は Bonner ら Eur.J.Biochem, 4
6:83(1974) 〕に記載されるフルオログラフィーにより
可視化した。図面の右側の数字はキロダルトンで示した
大きさの分子量マーカー蛋白の位置を示す。図２のパネ
ルＡは対照（ａ）または抗体選別した抗体（ｂ）を用い
て検索した全メロゾイト蛋白のイムノブロットである。
パネルＢは対照（ａ）または抗体選別した抗体（ｂ）で
免疫沈降し125 −Ｉ−表面標識メロゾイト蛋白を示す。メロゾイトｍＲＮＡの単離および インビトロ 翻訳 １ｘ１０9 −１ｘ１０10の生物を含有する凍結メロゾイ
トペレットを１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）およ
び３００単位のＲＮａｓｉｎ（Promega Biotec, Madiso
n, WI ）を含有する１０mlのＴＥＬ／ＳＤＳ緩衝液
（０．２ＭトリスＨＣｌ、０．１Ｍ ＬｉＣｌ、２５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）、ｐＨ８．８）中で解凍し、そしてテフロン
被覆組織ホモジナイザーを使って１０−１２ストローク
でホモジナイズした。不溶性破片を３，０００ｘｇで低
温で遠心して分離した。上清をＴＥＬ緩衝液で平衡化し
たフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール
（２４：２４：１，ｖ／ｖ）を用いて２回抽出した。
【００７８】水相を１００ｍｇ／mlのプロテイナーゼＫ
を用いて３７°Ｃで３０分消化し、等容量のフェノー
ル：クロロホルム（１：１）で再抽出しそして核酸を２
倍容量のエタノールを用いてドライアイス上で１時間、
または−２０°Ｃで一晩沈殿させた。１０，０００ｘｇ
で１時間遠心後、ペレットをＴＥ（１０ｍＭトリス，ｐ
Ｈ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、４mlのＣｓ
Ｃｌ層（５．７Ｍ ＣｓＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ）を
通して１５０，０００ｘｇ，１５°Ｃで２０時間遠心し
た。ＲＮＡペレットを２．５倍容量のエタノールを用い
て０．２Ｍ酢酸カリウムから再沈殿させた。この全ＲＮ
Ａを、Maniatis, 前出、 p.197に記載されるようにし
て、オリゴ−ｄＴセルロースに一回通してポリ（Ａ）+
ＲＮＡを濃縮した。５ｘ１０9 メロゾイトからの全ＲＮ
Ａ１．９ｍｇの一般的収量は約２０μｇのポリ（Ａ）+
ＲＮＡを含んでいた。
を用いて３７°Ｃで３０分消化し、等容量のフェノー
ル：クロロホルム（１：１）で再抽出しそして核酸を２
倍容量のエタノールを用いてドライアイス上で１時間、
または−２０°Ｃで一晩沈殿させた。１０，０００ｘｇ
で１時間遠心後、ペレットをＴＥ（１０ｍＭトリス，ｐ
Ｈ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、４mlのＣｓ
Ｃｌ層（５．７Ｍ ＣｓＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ）を
通して１５０，０００ｘｇ，１５°Ｃで２０時間遠心し
た。ＲＮＡペレットを２．５倍容量のエタノールを用い
て０．２Ｍ酢酸カリウムから再沈殿させた。この全ＲＮ
Ａを、Maniatis, 前出、 p.197に記載されるようにし
て、オリゴ−ｄＴセルロースに一回通してポリ（Ａ）+
ＲＮＡを濃縮した。５ｘ１０9 メロゾイトからの全ＲＮ
Ａ１．９ｍｇの一般的収量は約２０μｇのポリ（Ａ）+
ＲＮＡを含んでいた。
【００７９】０．１−０．５μｇのｍＲＮＡを用い、反
応混合物２０μｌあたり１０−２０μＣｉの35Ｓ−メチ
オニンを補添したヌクレアーゼ処理ウサギ網状赤血球溶
解物（Amersham Corp., Arlington Heigths, IL または
Promega Biotec ）中で インビトロ 蛋白合成を計画
した。インビトロ翻訳産物は先に述べたように免疫沈降
に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、フルオログラフ
ィーにより可視化した。これらの結果は図２、パネルＣ
に示してある。
応混合物２０μｌあたり１０−２０μＣｉの35Ｓ−メチ
オニンを補添したヌクレアーゼ処理ウサギ網状赤血球溶
解物（Amersham Corp., Arlington Heigths, IL または
Promega Biotec ）中で インビトロ 蛋白合成を計画
した。インビトロ翻訳産物は先に述べたように免疫沈降
に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、フルオログラフ
ィーにより可視化した。これらの結果は図２、パネルＣ
に示してある。
【００８０】パネルＣのレーンａは、ポリ（Ａ）含有メ
ロゾイトＲＮＡにより計画された産物の完全な混合物を
示す。レーンｂ、ｃおよびｄは、それぞれラムダ５−７
と命名された組み換えファージクローン（以下参照；こ
のクローンはアイメリア前駆体蛋白をコードする遺伝子
を発現する）、抗メロゾイト血清と反応する別のファー
ジクローン、および非組み換えラムダｇｔ１１クローン
により選択された抗体により免疫沈降された翻訳産物を
示す。
ロゾイトＲＮＡにより計画された産物の完全な混合物を
示す。レーンｂ、ｃおよびｄは、それぞれラムダ５−７
と命名された組み換えファージクローン（以下参照；こ
のクローンはアイメリア前駆体蛋白をコードする遺伝子
を発現する）、抗メロゾイト血清と反応する別のファー
ジクローン、および非組み換えラムダｇｔ１１クローン
により選択された抗体により免疫沈降された翻訳産物を
示す。
【００８１】図２、パネルＣのレーンａおよびｃには、
約３０キロダルトンの見掛け分子量をもつ主要蛋白が見
られることに注意すべきである。この蛋白は抗体選別し
た抗体により検索された全メロゾイト蛋白を含有するレ
ーン（パネルＡ、レーンｂ）には存在しないが、このゲ
ルには２３キロダルトンバンドが見られる（パネルＡ、
レーンｂ、矢印）。この２３キロダルトン蛋白はまた図
２、パネルＢ、レーンｂに示されるように125 Ｉ−標識
メロゾイト蛋白から抗体選別した抗体によっても免疫沈
降された。これらの観察を合わせると、３０キロダルト
ン前駆体蛋白が成熟メロゾイト中で蛋白分解的切断によ
り２３キロダルトン表面抗原にプロセッシングされうる
ことを示唆している。メロゾイトｃＤＮＡ発現ライブラリーの作製 二本鎖ｃＤＮＡは６μｇのメロゾイトポリ（Ａ）+ ＲＮ
Ａから、Gublerら, Gene25:263 (1983) に記載されるよ
うにして、オリゴ（ｄＴ）プライマーから伸長させるた
めの逆転写酵素（ＢＲＬ，Gaithersburg, MD) 並びに相
補鎖を合成するためのＲＮａｓｅ Ｈ（ＢＲＬ）および
Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ（New England Biolabs,
Beverly, MA）を用いて合成した。次に、二本鎖ｃＤＮ
ＡはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を用いて平滑末
端となし、製造者のプロトコールに従ってＥｃｏＲＩメ
チラーゼ（New England Biolabs ）で処理した後Ｅｃｏ
ＲＩリンカー（ＧＧＡＡＴＴＣＣ，Collaborative Rese
arch Inc., Bedford, MA）を付加した。
約３０キロダルトンの見掛け分子量をもつ主要蛋白が見
られることに注意すべきである。この蛋白は抗体選別し
た抗体により検索された全メロゾイト蛋白を含有するレ
ーン（パネルＡ、レーンｂ）には存在しないが、このゲ
ルには２３キロダルトンバンドが見られる（パネルＡ、
レーンｂ、矢印）。この２３キロダルトン蛋白はまた図
２、パネルＢ、レーンｂに示されるように125 Ｉ−標識
メロゾイト蛋白から抗体選別した抗体によっても免疫沈
降された。これらの観察を合わせると、３０キロダルト
ン前駆体蛋白が成熟メロゾイト中で蛋白分解的切断によ
り２３キロダルトン表面抗原にプロセッシングされうる
ことを示唆している。メロゾイトｃＤＮＡ発現ライブラリーの作製 二本鎖ｃＤＮＡは６μｇのメロゾイトポリ（Ａ）+ ＲＮ
Ａから、Gublerら, Gene25:263 (1983) に記載されるよ
うにして、オリゴ（ｄＴ）プライマーから伸長させるた
めの逆転写酵素（ＢＲＬ，Gaithersburg, MD) 並びに相
補鎖を合成するためのＲＮａｓｅ Ｈ（ＢＲＬ）および
Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ（New England Biolabs,
Beverly, MA）を用いて合成した。次に、二本鎖ｃＤＮ
ＡはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を用いて平滑末
端となし、製造者のプロトコールに従ってＥｃｏＲＩメ
チラーゼ（New England Biolabs ）で処理した後Ｅｃｏ
ＲＩリンカー（ＧＧＡＡＴＴＣＣ，Collaborative Rese
arch Inc., Bedford, MA）を付加した。
【００８２】ＥｃｏＲＩで消化後、下記の Huynhらによ
り記載されるようにして、ｃＤＮＡをバイオゲルＡ−５
０Ｍで分画化して過剰のリンカー分子と約３００ｂｐよ
り小さいｃＤＮＡを除去した。次にこのｃＤＮＡをエタ
ノール沈殿によって濃縮した。ライブラリーは D.Glove
r （編), DNA Cloning Vol.I: A Practical Approach,
1985, IRL Press, Washington,D.C., p.49-78 中で Huy
nhらにより記載されるようにしてλｇｔ１１（Stratage
ne Cloning Systems, San Diego, CA ）中に作製した。
ＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ消化した脱リ
ン酸化λｇｔ１１アーム（Stratagene Cloning System
s）に連結し、そして生成するＤＮＡを製造者のプロト
コールに従って Gigapack （登録商標）キット（Strata
gene Cloning Systems）を使ってファージにパッケージ
ングした。
り記載されるようにして、ｃＤＮＡをバイオゲルＡ−５
０Ｍで分画化して過剰のリンカー分子と約３００ｂｐよ
り小さいｃＤＮＡを除去した。次にこのｃＤＮＡをエタ
ノール沈殿によって濃縮した。ライブラリーは D.Glove
r （編), DNA Cloning Vol.I: A Practical Approach,
1985, IRL Press, Washington,D.C., p.49-78 中で Huy
nhらにより記載されるようにしてλｇｔ１１（Stratage
ne Cloning Systems, San Diego, CA ）中に作製した。
ＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ消化した脱リ
ン酸化λｇｔ１１アーム（Stratagene Cloning System
s）に連結し、そして生成するＤＮＡを製造者のプロト
コールに従って Gigapack （登録商標）キット（Strata
gene Cloning Systems）を使ってファージにパッケージ
ングした。
【００８３】生成したライブラリーをＹ１０８８宿主細
胞にまいて増幅させた。組み換え体の百分率は、イソプ
ロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ，Sigma Chemical C
o.）の存在下にＸ−ｇａｌプレート（Maniatis, 前出，
p.24 ）上で青色プラーク対無色プラークの比から、約
９０％であると概算された。ｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニング λｇｔ１１メロゾイトｃＤＮＡ発現ライブラリーを、約
１００００プラーク／１５０ｍｍプレートの密度でＹ１
０９０細胞にまいた。かかるプレート６個を４２°Ｃで
３．５時間インキュベートし、１０ｍＭ ＩＰＴＧに予
め浸したニトロセルロースフィルターを重層してβ−ガ
ラクトシダーゼ融合蛋白の発現を誘導し、そして３７°
Ｃでさらに４−５時間ないし一晩インキュベートした。
フィルターをプレートからとり出し、ＴＢＳ（２０ｍＭ
トリスＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で
数回バッチ洗浄した。非特異的蛋白結合部位は２０％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＴＢＳ中で室温にて１
時間インキュベートすることにより遮断した。
胞にまいて増幅させた。組み換え体の百分率は、イソプ
ロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ，Sigma Chemical C
o.）の存在下にＸ−ｇａｌプレート（Maniatis, 前出，
p.24 ）上で青色プラーク対無色プラークの比から、約
９０％であると概算された。ｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニング λｇｔ１１メロゾイトｃＤＮＡ発現ライブラリーを、約
１００００プラーク／１５０ｍｍプレートの密度でＹ１
０９０細胞にまいた。かかるプレート６個を４２°Ｃで
３．５時間インキュベートし、１０ｍＭ ＩＰＴＧに予
め浸したニトロセルロースフィルターを重層してβ−ガ
ラクトシダーゼ融合蛋白の発現を誘導し、そして３７°
Ｃでさらに４−５時間ないし一晩インキュベートした。
フィルターをプレートからとり出し、ＴＢＳ（２０ｍＭ
トリスＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で
数回バッチ洗浄した。非特異的蛋白結合部位は２０％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＴＢＳ中で室温にて１
時間インキュベートすることにより遮断した。
【００８４】次にフィルターを、Ｙ１０９０細胞を用い
て予め吸着させたウサギ抗メロゾイト血清と共に、２０
％ウシ血清を含有するＴＢＳ中１：１００の希釈度で１
時間インキュベートした。非特異的抗体はＴＢＳでの連
続洗浄（このうちの１回は０．１％ＮＰ−４０を含有）
で除去した。この、フィルターをヤギ抗ウサギペルオキ
シダーゼ接合体（BioRad, Richmond, CA）と共にウシ血
清含有ＴＢＳ中１：１０００の希釈度で室温にて１時間
インキュベートした。４−クロロ−１−ナフトール（Bi
oRad）を用いて製造者の説明書に従い発色反応を起こさ
せた。
て予め吸着させたウサギ抗メロゾイト血清と共に、２０
％ウシ血清を含有するＴＢＳ中１：１００の希釈度で１
時間インキュベートした。非特異的抗体はＴＢＳでの連
続洗浄（このうちの１回は０．１％ＮＰ−４０を含有）
で除去した。この、フィルターをヤギ抗ウサギペルオキ
シダーゼ接合体（BioRad, Richmond, CA）と共にウシ血
清含有ＴＢＳ中１：１０００の希釈度で室温にて１時間
インキュベートした。４−クロロ−１−ナフトール（Bi
oRad）を用いて製造者の説明書に従い発色反応を起こさ
せた。
【００８５】免疫ニワトリからの血清もスクリーニング
に使用した。この血清はＹ１０９０細胞を用いて予め吸
着させ、そしてウサギ血清と同じ希釈度で使用した。ウ
サギ抗ニワトリ抗体を第二抗体として使用し、ヤギ抗ウ
サギ西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体を検出抗体とし
て使用した。単一プラークが同一試薬を使って２回目の
スクリーニングにより単離された。
に使用した。この血清はＹ１０９０細胞を用いて予め吸
着させ、そしてウサギ血清と同じ希釈度で使用した。ウ
サギ抗ニワトリ抗体を第二抗体として使用し、ヤギ抗ウ
サギ西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体を検出抗体とし
て使用した。単一プラークが同一試薬を使って２回目の
スクリーニングにより単離された。
【００８６】ラムダ５−７と命名された１つのクローン
は、ウサギ血清からの抗体と強く反応する蛋白を生産し
た。第二単離物であるＩ−５は免疫ニワトリ血清を用い
たスクリーニングにより同定され、５−７クローンと同
じ大きさのｃＤＮＡ挿入物を含有することが証明され
た。ＤＮＡ配列解析により、これらのファージクローン
が同じメロゾイト抗原をコードすることが示された。Ｅ．コリ内でのラムダ５−７ｃＤＮＡの発現 ラムダ５−７からの１．２ｋｂ挿入物をＥｃｏＲＩ消化
およびアガロースゲル電気泳動により単離した〔Maniat
isら, 前出， p.157-170〕。ＥｃｏＲＩ末端をｄＡＴＰ
およびｄＴＴＰの存在下にクレノウポリメラーゼで修復
し、そして両末端にＢａｍＨＩリンカー（ＧＧＧＡＴＣ
ＣＣ）を連結させた。この修飾断片を３種類の発現ベク
ターｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ、ｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ
Ｉ，−１およびｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ，−２のそれぞ
れのＢａｍＨＩ部位に挿入した。これら３種類のベクタ
ーについては以下で説明する。起こりうる両方の方向で
挿入物を含有するプラスミドを、Mandelら J.Mol.Bio
l. 53:159 (1970)〕に記載されるようにして、適合性
プラスミドｐＤＭＩ．１を担持するＥ．コリＭ１５株に
形質転換した。プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩおよ
びｐＤＭＩ．１を保有するＥ．コリＭ１５株は欧州特許
出願公開第３１６６９５号に開示されている。プラスミドの構築 一般に、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ、−１およ
び−２は調節可能なプロモーター／オペレーター要素Ｎ
２５ＯＰＳＮ２５ＯＰ２９およびリボソーム結合部位Ｒ
ＢＳＩＩ、ＲＢＳＩＩ（−１）およびＲＢＳＩＩ（−
２）をそれぞれ含有する。これらのリボソーム結合部位
はＥ．コリファージＴ５のプロモーターＰＧ２５ のリ
ボソーム結合部位に由来し〔欧州特許出願公開第２０７
４５９号〕、ＤＮＡ合成により得られた。
は、ウサギ血清からの抗体と強く反応する蛋白を生産し
た。第二単離物であるＩ−５は免疫ニワトリ血清を用い
たスクリーニングにより同定され、５−７クローンと同
じ大きさのｃＤＮＡ挿入物を含有することが証明され
た。ＤＮＡ配列解析により、これらのファージクローン
が同じメロゾイト抗原をコードすることが示された。Ｅ．コリ内でのラムダ５−７ｃＤＮＡの発現 ラムダ５−７からの１．２ｋｂ挿入物をＥｃｏＲＩ消化
およびアガロースゲル電気泳動により単離した〔Maniat
isら, 前出， p.157-170〕。ＥｃｏＲＩ末端をｄＡＴＰ
およびｄＴＴＰの存在下にクレノウポリメラーゼで修復
し、そして両末端にＢａｍＨＩリンカー（ＧＧＧＡＴＣ
ＣＣ）を連結させた。この修飾断片を３種類の発現ベク
ターｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ、ｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ
Ｉ，−１およびｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ，−２のそれぞ
れのＢａｍＨＩ部位に挿入した。これら３種類のベクタ
ーについては以下で説明する。起こりうる両方の方向で
挿入物を含有するプラスミドを、Mandelら J.Mol.Bio
l. 53:159 (1970)〕に記載されるようにして、適合性
プラスミドｐＤＭＩ．１を担持するＥ．コリＭ１５株に
形質転換した。プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩおよ
びｐＤＭＩ．１を保有するＥ．コリＭ１５株は欧州特許
出願公開第３１６６９５号に開示されている。プラスミドの構築 一般に、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ、−１およ
び−２は調節可能なプロモーター／オペレーター要素Ｎ
２５ＯＰＳＮ２５ＯＰ２９およびリボソーム結合部位Ｒ
ＢＳＩＩ、ＲＢＳＩＩ（−１）およびＲＢＳＩＩ（−
２）をそれぞれ含有する。これらのリボソーム結合部位
はＥ．コリファージＴ５のプロモーターＰＧ２５ のリ
ボソーム結合部位に由来し〔欧州特許出願公開第２０７
４５９号〕、ＤＮＡ合成により得られた。
【００８７】高い発現効率ゆえ、前記プラスミドは、プ
ロモーター／オペレーター要素がオペレーターへのｌａ
ｃリプレッサーの結合により抑制される場合にのみ、
Ｅ．コリ細胞内に維持されうる。Ｎ２５ＯＰＳＮ２５Ｏ
Ｐ２９は、十分な数のリプレッサー分子が細胞内に存在
する場合にのみ、効果的に抑制されうる。それ故に、リ
プレッサー遺伝子の発現増加をもたらすプロモーター変
異型を含有するｌａｃＩ q 対立遺伝子が使用された。こ
のｌａｃＩq 対立遺伝子は以下で説明するプラスミドｐ
ＤＭＩ．１上に存在する。
ロモーター／オペレーター要素がオペレーターへのｌａ
ｃリプレッサーの結合により抑制される場合にのみ、
Ｅ．コリ細胞内に維持されうる。Ｎ２５ＯＰＳＮ２５Ｏ
Ｐ２９は、十分な数のリプレッサー分子が細胞内に存在
する場合にのみ、効果的に抑制されうる。それ故に、リ
プレッサー遺伝子の発現増加をもたらすプロモーター変
異型を含有するｌａｃＩ q 対立遺伝子が使用された。こ
のｌａｃＩq 対立遺伝子は以下で説明するプラスミドｐ
ＤＭＩ．１上に存在する。
【００８８】ｐＤＭＩ．１プラスミドは、ｌａｃＩ遺伝
子のほかに、細菌にカナマイシン耐性を付与し、選択マ
ーカーとして使用されるネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子を担持する。ｐＤＭＩ．１はｐＤＳ５６
／ＲＢＳＩＩ、−１および−２プラスミドと適合しう
る。発現ベクターｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ、−１および
−２で形質転換されるＥ．コリ細胞は、この発現ベクタ
ーが細胞内に安定して保持されるよう確保するために、
ｐＤＭＩ．１を含有する必要がある。この系の誘導は培
地にＩＰＴＧを加えることにより達成される。プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ ＸｂａＩとＸｈｏＩの制限切断部位間にありかつ複製領
域およびβ−ラクタマーゼ遺伝子（細胞にアンピシリン
耐性を与える）（図４および５参照）を含有するｐＤＳ
５６／ＲＢＳＩＩの部分は、もともとプラスミドｐＢＲ
３２２から誘導された〔Bolivar ら, Gene 2:95-113 (1
977); Sutcliffe, Cold Spring HarborSymp.Quant.Bio
l. 43:77-90 (1979)〕。しかしながら、β−ラクタマー
ゼ遺伝子は制限酵素ＨｉｎｃＩＩおよびＰｓｔＩの切断
部位を除くことにより修飾される。ＤＮＡ配列における
これらの変更はβ−ラクタマーゼのアミノ酸配列に何ら
影響を与えない。このプラスミドの残りの部分は調節可
能なプロモーター／オペレーター要素Ｎ２５ＯＰＳＮ２
５ＯＰ２９、リボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ（ＥｃｏＲ
Ｉ／ＢａｍＨＩ断片の部分である）、制限酵素Ｓａｌ
Ｉ、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの切断部位、Ｅ．コ
リファージラムダのターミネーターｔｏ 〔Schwarz
ら, Nature 272:410-414 (1978) 〕、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼのプロモーター不含遺
伝子〔Marcoli ら, FEBS Letters, 110:11-14 (1980)〕
およびＥ．コリｒｒｎＢオペロンのターミネーターＴ１
〔Brosiusら, J.Mol.Biol. 148:107-127 (1981)〕を担
持する。プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−１） プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−１）（図６およ
び７）はプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩと同様であ
るが、リボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ（−１）を含有す
る。プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−２） プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−２）（図８およ
び９）はプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩと同様であ
るが、リボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ（−２）を含有す
るでいる。
子のほかに、細菌にカナマイシン耐性を付与し、選択マ
ーカーとして使用されるネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子を担持する。ｐＤＭＩ．１はｐＤＳ５６
／ＲＢＳＩＩ、−１および−２プラスミドと適合しう
る。発現ベクターｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ、−１および
−２で形質転換されるＥ．コリ細胞は、この発現ベクタ
ーが細胞内に安定して保持されるよう確保するために、
ｐＤＭＩ．１を含有する必要がある。この系の誘導は培
地にＩＰＴＧを加えることにより達成される。プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ ＸｂａＩとＸｈｏＩの制限切断部位間にありかつ複製領
域およびβ−ラクタマーゼ遺伝子（細胞にアンピシリン
耐性を与える）（図４および５参照）を含有するｐＤＳ
５６／ＲＢＳＩＩの部分は、もともとプラスミドｐＢＲ
３２２から誘導された〔Bolivar ら, Gene 2:95-113 (1
977); Sutcliffe, Cold Spring HarborSymp.Quant.Bio
l. 43:77-90 (1979)〕。しかしながら、β−ラクタマー
ゼ遺伝子は制限酵素ＨｉｎｃＩＩおよびＰｓｔＩの切断
部位を除くことにより修飾される。ＤＮＡ配列における
これらの変更はβ−ラクタマーゼのアミノ酸配列に何ら
影響を与えない。このプラスミドの残りの部分は調節可
能なプロモーター／オペレーター要素Ｎ２５ＯＰＳＮ２
５ＯＰ２９、リボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ（ＥｃｏＲ
Ｉ／ＢａｍＨＩ断片の部分である）、制限酵素Ｓａｌ
Ｉ、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの切断部位、Ｅ．コ
リファージラムダのターミネーターｔｏ 〔Schwarz
ら, Nature 272:410-414 (1978) 〕、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼのプロモーター不含遺
伝子〔Marcoli ら, FEBS Letters, 110:11-14 (1980)〕
およびＥ．コリｒｒｎＢオペロンのターミネーターＴ１
〔Brosiusら, J.Mol.Biol. 148:107-127 (1981)〕を担
持する。プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−１） プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−１）（図６およ
び７）はプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩと同様であ
るが、リボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ（−１）を含有す
る。プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−２） プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−２）（図８およ
び９）はプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩと同様であ
るが、リボソーム結合部位ＲＢＳＩＩ（−２）を含有す
るでいる。
【００８９】これら３種類のプラスミドの差異は、それ
らが全３種の可能なリーディングフレームからの蛋白発
現をもたらすＡＴＧ開始コドンに続く１つのヌクレオチ
ドが相違する点である。プラスミドｐＤＭＩ．１ プラスミドｐＤＭＩ．１（図１０および１１）は、Ｅ．
コリ細胞にカナマイシン耐性を付与するものであるトラ
ンスポゾンＴｎ５〔Beckら, Gene19:327-336 (1982) 〕
からのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、
およびｌａｃリプレッサーをコードするものであるプロ
モーター変異Ｉq 〔Calos, Nature 274:762-765 (197
8)〕を伴うｌａｃＩ遺伝子〔Farabough, Nature 274:76
5-769 (1978)〕を担持する。さらに、プラスミドｐＤＭ
Ｉ．１は複製および娘細胞への安定した伝達に必要な全
ての情報を含有するプラスミドｐＡＣＹＣ１８４〔Chan
g および Cohen, J.Bacteriol.134:1141-1156 (1978)〕
の領域を含有する。
らが全３種の可能なリーディングフレームからの蛋白発
現をもたらすＡＴＧ開始コドンに続く１つのヌクレオチ
ドが相違する点である。プラスミドｐＤＭＩ．１ プラスミドｐＤＭＩ．１（図１０および１１）は、Ｅ．
コリ細胞にカナマイシン耐性を付与するものであるトラ
ンスポゾンＴｎ５〔Beckら, Gene19:327-336 (1982) 〕
からのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、
およびｌａｃリプレッサーをコードするものであるプロ
モーター変異Ｉq 〔Calos, Nature 274:762-765 (197
8)〕を伴うｌａｃＩ遺伝子〔Farabough, Nature 274:76
5-769 (1978)〕を担持する。さらに、プラスミドｐＤＭ
Ｉ．１は複製および娘細胞への安定した伝達に必要な全
ての情報を含有するプラスミドｐＡＣＹＣ１８４〔Chan
g および Cohen, J.Bacteriol.134:1141-1156 (1978)〕
の領域を含有する。
【００９０】上記のプラスミドに加え、Ｅ．コリ発現系
はどれもこの実験に有用であることが期待されることを
理解すべきである。細菌形質転換体をＬＢ培地中で３７
°Ｃにて増殖させ〔Maniatisら, 前出， p.68 〕、この
培地に１ｍＭ ＩＰＴＧを加えることにより蛋白の発現
を誘導した。１時間のインキュベーション後、１mlのサ
ンプルを採取し、サンプル中の細胞を遠心により集め
た。細胞ペレットを Crowlら, 前出，に記載されるよう
にして処理しそして溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
た。電気泳動後、ゲル中の蛋白はクーマシーブリリアン
トブルーで染色するか、あるいは前記のようにしてウサ
ギ抗メロゾイト血清を用いるウェスタンブロット分析
〔Towbinら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:4350 (1979);
Burnetti, Anal.Biochem. 112:195 (1981)〕のためにニ
トロセルロース膜に移行させた。
はどれもこの実験に有用であることが期待されることを
理解すべきである。細菌形質転換体をＬＢ培地中で３７
°Ｃにて増殖させ〔Maniatisら, 前出， p.68 〕、この
培地に１ｍＭ ＩＰＴＧを加えることにより蛋白の発現
を誘導した。１時間のインキュベーション後、１mlのサ
ンプルを採取し、サンプル中の細胞を遠心により集め
た。細胞ペレットを Crowlら, 前出，に記載されるよう
にして処理しそして溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
た。電気泳動後、ゲル中の蛋白はクーマシーブリリアン
トブルーで染色するか、あるいは前記のようにしてウサ
ギ抗メロゾイト血清を用いるウェスタンブロット分析
〔Towbinら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:4350 (1979);
Burnetti, Anal.Biochem. 112:195 (1981)〕のためにニ
トロセルロース膜に移行させた。
【００９１】この分析では、３つの全てのリーディング
フレームにおいて１つの方向にある１．２ｋｂのｃＤＮ
Ａ分子が約３０キロダルトンの見掛け分子量でもって移
動しかつウサギ抗メロゾイト血清からの抗体と反応する
蛋白を生産したことが示された。これは図１に示される
ようにｃＤＮＡ配列中のヌクレオチド６８のＡＴＧ開始
コドンに先行する３つの全てのリーディングフレーム内
の停止コドンの存在と一致する。ＤＮＡ配列解析 一般に、１mlの飽和一晩培養物からのプラスミドＤＮＡ
の小規模分離は、 Birnboim ら Nucleic Acids Resear
ch 7:1513 (1979)〕の方法を用いて実施した。この方法
は分析目的のために細菌コロニーから少量のＤＮＡを単
離できる。比較的大量のプラスミドＤＮＡは塩化セシウ
ム遠心を用いる標準プロトコール〔Maniatisら, 前出，
p.93 〕に従って１リットル培養物から調製した。
フレームにおいて１つの方向にある１．２ｋｂのｃＤＮ
Ａ分子が約３０キロダルトンの見掛け分子量でもって移
動しかつウサギ抗メロゾイト血清からの抗体と反応する
蛋白を生産したことが示された。これは図１に示される
ようにｃＤＮＡ配列中のヌクレオチド６８のＡＴＧ開始
コドンに先行する３つの全てのリーディングフレーム内
の停止コドンの存在と一致する。ＤＮＡ配列解析 一般に、１mlの飽和一晩培養物からのプラスミドＤＮＡ
の小規模分離は、 Birnboim ら Nucleic Acids Resear
ch 7:1513 (1979)〕の方法を用いて実施した。この方法
は分析目的のために細菌コロニーから少量のＤＮＡを単
離できる。比較的大量のプラスミドＤＮＡは塩化セシウ
ム遠心を用いる標準プロトコール〔Maniatisら, 前出，
p.93 〕に従って１リットル培養物から調製した。
【００９２】ラムダ５−７からの１．２ｋｂ ＥｃｏＲ
Ｉ ｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列は次のようにして決定
した。この挿入物をＥｃｏＲＩで消化し、ゲル分離にか
け、Crowl ら Gene 38:31 (1985) 〕に記載されるＥｃ
ｏＲＩ消化ｐＥＶ−ｖｒｆプラスミドに連結した。この
プラスミドをｐＥＶ／５−７と命名し、ハイブリダイゼ
ーション分析（以下で説明する）用の１．２ｋｂ ｃＤ
ＮＡ挿入物を増やすために、および Zagursky ら Gene
Anal.Tech 2:89 (1983)〕の方法による予備ＤＮＡ配列
分析において使用した。
Ｉ ｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列は次のようにして決定
した。この挿入物をＥｃｏＲＩで消化し、ゲル分離にか
け、Crowl ら Gene 38:31 (1985) 〕に記載されるＥｃ
ｏＲＩ消化ｐＥＶ−ｖｒｆプラスミドに連結した。この
プラスミドをｐＥＶ／５−７と命名し、ハイブリダイゼ
ーション分析（以下で説明する）用の１．２ｋｂ ｃＤ
ＮＡ挿入物を増やすために、および Zagursky ら Gene
Anal.Tech 2:89 (1983)〕の方法による予備ＤＮＡ配列
分析において使用した。
【００９３】完全なＤＮＡ配列を決定するには、１．２
ｋｂのｃＤＮＡ挿入物をＭ１３、Ｍｐ１８およびＭｐ１
９一本鎖ファージベクターに Bio-Rad M13クローニング
・アンド・シークエンシングキットを用いてサブクロー
ニングした。ＤＮＡ配列は Sanger ら Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74:5463 (1977) 〕のジデオキシ・チェイン
・ターミネーション法を用いて、 Bio-Radキットにより
提供される試薬およびプロトコールを使って決定した。
ｋｂのｃＤＮＡ挿入物をＭ１３、Ｍｐ１８およびＭｐ１
９一本鎖ファージベクターに Bio-Rad M13クローニング
・アンド・シークエンシングキットを用いてサブクロー
ニングした。ＤＮＡ配列は Sanger ら Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74:5463 (1977) 〕のジデオキシ・チェイン
・ターミネーション法を用いて、 Bio-Radキットにより
提供される試薬およびプロトコールを使って決定した。
【００９４】５’および３’非翻訳領域を含むラムダ５
−７からの１．２ｋｂ ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド
配列は図１に示してある。Ｉ−５と命名された、免疫ニ
ワトリ血清を用いて上記のようにして調製した第二単離
物のＤＮＡ配列を分析すると、この単離物が５’末端で
下記ヌクレオチドを付加的に含有しそして、５−７挿入
物のＥｃｏＲＩ部位を欠くことが示された：
−７からの１．２ｋｂ ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド
配列は図１に示してある。Ｉ−５と命名された、免疫ニ
ワトリ血清を用いて上記のようにして調製した第二単離
物のＤＮＡ配列を分析すると、この単離物が５’末端で
下記ヌクレオチドを付加的に含有しそして、５−７挿入
物のＥｃｏＲＩ部位を欠くことが示された：
【００９５】
【化３】
【００９６】この第二単離物の配列の残りは塩基番号８
からポリＡ鎖の始めまでのラムダ５−７の配列と同一で
あるが、ただしヌクレオチド番号３００ではチミジン残
基の代わりにシチジン残基が存在する。このｃＤＮＡ配
列は図１に示される２００個のアミノ酸残基をコードす
る６８位のＡＴＧから６６８位のＴＡＡ停止コドンまで
延びるオープン・リーディング・フレームを予測させ
る。
からポリＡ鎖の始めまでのラムダ５−７の配列と同一で
あるが、ただしヌクレオチド番号３００ではチミジン残
基の代わりにシチジン残基が存在する。このｃＤＮＡ配
列は図１に示される２００個のアミノ酸残基をコードす
る６８位のＡＴＧから６６８位のＴＡＡ停止コドンまで
延びるオープン・リーディング・フレームを予測させ
る。
【００９７】２００個のアミノ酸から成る蛋白について
の２４キロダルトンの理論的大きさは、抗体選別した試
薬による免疫沈降（図３、パネルｃ、レーンｂ）におい
て観察されたメロゾイトｍＲＮＡの一次翻訳産物、およ
び前記Ｅ．コリ発現ベクター中のｃＤＮＡから発現され
た蛋白、の概算分子量よりもわずかに小さい。しかしな
がら、この理論的分子量は理論的分子量とＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥでの分子量標準物に対する内挿により測定された分
子量との間に予期される変動の範囲内である。
の２４キロダルトンの理論的大きさは、抗体選別した試
薬による免疫沈降（図３、パネルｃ、レーンｂ）におい
て観察されたメロゾイトｍＲＮＡの一次翻訳産物、およ
び前記Ｅ．コリ発現ベクター中のｃＤＮＡから発現され
た蛋白、の概算分子量よりもわずかに小さい。しかしな
がら、この理論的分子量は理論的分子量とＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥでの分子量標準物に対する内挿により測定された分
子量との間に予期される変動の範囲内である。
【００９８】ラムダ５−７ｃＤＮＡ挿入物によりコード
される蛋白の推定アミノ酸配列（図１）の分析により、
最初の２０個のアミノ末端アミノ酸残基はシグナル配列
の存在を示唆する全体的疎水性をもつことが判明した。ハイブリダイゼーション分析 ＤＮＡを以下のようにしてトリプシンおよび胆汁で処理
し、ＰＢＳで洗浄した後の脱のうした胞子形成オーシス
トから単離した。
される蛋白の推定アミノ酸配列（図１）の分析により、
最初の２０個のアミノ末端アミノ酸残基はシグナル配列
の存在を示唆する全体的疎水性をもつことが判明した。ハイブリダイゼーション分析 ＤＮＡを以下のようにしてトリプシンおよび胆汁で処理
し、ＰＢＳで洗浄した後の脱のうした胞子形成オーシス
トから単離した。
【００９９】寄生虫物質（約１ｘ１０9 オーシスト）を
２０mlの０．５Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、０．５％サ
ルコシル（Sigma, St.Louis, MO ）に懸濁し、０．１μ
ｇ／mlのプロテイナーゼＫ（Boehringer-Mannheim, BR
D）を用いて５０°Ｃで２時間、１０μｇ／mlのＲＮア
ーゼを用いて３７°Ｃで１時間、そして再度プロテイナ
ーゼＫを用いて５０°Ｃで１時間消化した。蛋白は２０
ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｔ
Ｅ）を飽和させたフェノールで２回抽出しそしてフェノ
ール／クロロホルム（１：１）で１回抽出することによ
り除いた。水相をＴＥに対して十分に透析し、エタノー
ル沈殿により濃縮した。１ｘ１０6 オーシストあたりＤ
ＮＡ０．４ｍｇの一般的収量が得られた。
２０mlの０．５Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、０．５％サ
ルコシル（Sigma, St.Louis, MO ）に懸濁し、０．１μ
ｇ／mlのプロテイナーゼＫ（Boehringer-Mannheim, BR
D）を用いて５０°Ｃで２時間、１０μｇ／mlのＲＮア
ーゼを用いて３７°Ｃで１時間、そして再度プロテイナ
ーゼＫを用いて５０°Ｃで１時間消化した。蛋白は２０
ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｔ
Ｅ）を飽和させたフェノールで２回抽出しそしてフェノ
ール／クロロホルム（１：１）で１回抽出することによ
り除いた。水相をＴＥに対して十分に透析し、エタノー
ル沈殿により濃縮した。１ｘ１０6 オーシストあたりＤ
ＮＡ０．４ｍｇの一般的収量が得られた。
【０１００】寄生虫ＤＮＡを製造者のプロトコールに従
って種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして生
成するＤＮＡ断片を Loening緩衝液（４．７ｇ ＮａＨ
２ＰＯ４ 、４．３６ｇトリス塩基、０．３７２ｇ Ｎ
ａ２ ＥＤＴＡ／リットル，ｐＨ７．６）中の０．８％
アガロース中４０Ｖ、２．５時間電気泳動することによ
り分離した。このゲルを０．２５Ｍ ＨＣｌで３０分間
処理し、そして０．４ＭＮａＯＨ中でZeta-Probeメンブ
ラン（Bio-Rad ）に一晩移行させた。フィルターを２ｘ
ＳＳＣ（ｐＨ６．８）で中和し、真空下に８０°Ｃで１
時間焼いた。
って種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして生
成するＤＮＡ断片を Loening緩衝液（４．７ｇ ＮａＨ
２ＰＯ４ 、４．３６ｇトリス塩基、０．３７２ｇ Ｎ
ａ２ ＥＤＴＡ／リットル，ｐＨ７．６）中の０．８％
アガロース中４０Ｖ、２．５時間電気泳動することによ
り分離した。このゲルを０．２５Ｍ ＨＣｌで３０分間
処理し、そして０．４ＭＮａＯＨ中でZeta-Probeメンブ
ラン（Bio-Rad ）に一晩移行させた。フィルターを２ｘ
ＳＳＣ（ｐＨ６．８）で中和し、真空下に８０°Ｃで１
時間焼いた。
【０１０１】このフィルターを７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ
（Boehringer, フラクションＶ）、０．５Ｍ ＮａＨＰ
Ｏ４ 緩衝液，ｐＨ７．２中６５°Ｃで、３時間プレハ
イブリダイゼーションを行った。５−７遺伝子ＥｃｏＲ
Ｉ挿入物は前記のｐＥＶ／５−７プラスミドをＥｃｏＲ
Ｉで消化した後にゲル分離し、そして32Ｐ−標識デオキ
シヌクレオチドの存在下にクレノウ断片でランダム−プ
ライミングすることにより標識した。標識した挿入物を
スピンカラム（Bio-Rad ）中で組み込まれなかったヌク
レオチドから分離し、変性させそしてハイブリダイゼー
ション溶液に加えた。６５°Ｃで１２時間インキュベー
ション後、フィルターを２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで
３回、そして０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回、
６５°Ｃにて洗浄した。プローブとハイブリダイズする
ゲノムＤＮＡ断片をオートラジオグラフィーにより検出
した。ここではｐＥＶ／５−７プラスミドが使用された
が、メロゾイト５−７遺伝子の１．２ｋｂのｃＤＮＡ挿
入物を含有する任意の同等のベクターも許容できるやり
方でその機能を果たすことが理解される。
（Boehringer, フラクションＶ）、０．５Ｍ ＮａＨＰ
Ｏ４ 緩衝液，ｐＨ７．２中６５°Ｃで、３時間プレハ
イブリダイゼーションを行った。５−７遺伝子ＥｃｏＲ
Ｉ挿入物は前記のｐＥＶ／５−７プラスミドをＥｃｏＲ
Ｉで消化した後にゲル分離し、そして32Ｐ−標識デオキ
シヌクレオチドの存在下にクレノウ断片でランダム−プ
ライミングすることにより標識した。標識した挿入物を
スピンカラム（Bio-Rad ）中で組み込まれなかったヌク
レオチドから分離し、変性させそしてハイブリダイゼー
ション溶液に加えた。６５°Ｃで１２時間インキュベー
ション後、フィルターを２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで
３回、そして０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回、
６５°Ｃにて洗浄した。プローブとハイブリダイズする
ゲノムＤＮＡ断片をオートラジオグラフィーにより検出
した。ここではｐＥＶ／５−７プラスミドが使用された
が、メロゾイト５−７遺伝子の１．２ｋｂのｃＤＮＡ挿
入物を含有する任意の同等のベクターも許容できるやり
方でその機能を果たすことが理解される。
【０１０２】この分析の結果は図３に示してあり、そこ
ではＰｖｕＩＩ（１）、ＨｉｎｃＩＩ（２）、ＰｓｔＩ
（３）、ＳｐｈＩ（４）またはＳａｃＩ（５）による消
化の結果が示される。６．５および３．６ｋｂのゲノム
ＤＮＡ断片は、それぞれレーン１と５に、ＰｖｕＩＩお
よびＳａｃＩでの消化後に検出された。ｃＤＮＡクロー
ンにはこれらの酵素の部位は存在しないので、アイメリ
ア遺伝子の大きさは最大３．６ｋｂであると見積もるこ
とができる。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩでの消化すると
大きさの点でｃＤＮＡ断片に一致する１．２ｋｂゲノム
断片が生成した。ＨｉｎｃＩＩとＥｃｏＲＩによる二重
消化により、ＥｃｏＲＩ部位により近接してはさまれた
ｃＤＮＡ配列から予測される０．９ｋｂ断片が生成し
た。
ではＰｖｕＩＩ（１）、ＨｉｎｃＩＩ（２）、ＰｓｔＩ
（３）、ＳｐｈＩ（４）またはＳａｃＩ（５）による消
化の結果が示される。６．５および３．６ｋｂのゲノム
ＤＮＡ断片は、それぞれレーン１と５に、ＰｖｕＩＩお
よびＳａｃＩでの消化後に検出された。ｃＤＮＡクロー
ンにはこれらの酵素の部位は存在しないので、アイメリ
ア遺伝子の大きさは最大３．６ｋｂであると見積もるこ
とができる。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩでの消化すると
大きさの点でｃＤＮＡ断片に一致する１．２ｋｂゲノム
断片が生成した。ＨｉｎｃＩＩとＥｃｏＲＩによる二重
消化により、ＥｃｏＲＩ部位により近接してはさまれた
ｃＤＮＡ配列から予測される０．９ｋｂ断片が生成し
た。
【０１０３】ＰｓｔＩ消化では３つの断片が検出された
（レーン３）。ｃＤＮＡ配列から２つのＰｓｔＩ部位が
予測され、これは３０５ｂｐの内部断片および２つの接
合断片をもたらすであろう。第三の大きいＰｓｔＩ断片
の出現は恐らく内部ＰｓｔＩ部位での不完全消化の結果
である。ｃＤＮＡを２回切断するＳｐｈＩにより生成さ
れる断片のパターン（レーン４）からは何ら明確な情報
を生いない。ｃＤＮＡ配列から予測される小さい内部Ｓ
ｐｈＩ断片はこのゲルにおいては検出できなかった。
（レーン３）。ｃＤＮＡ配列から２つのＰｓｔＩ部位が
予測され、これは３０５ｂｐの内部断片および２つの接
合断片をもたらすであろう。第三の大きいＰｓｔＩ断片
の出現は恐らく内部ＰｓｔＩ部位での不完全消化の結果
である。ｃＤＮＡを２回切断するＳｐｈＩにより生成さ
れる断片のパターン（レーン４）からは何ら明確な情報
を生いない。ｃＤＮＡ配列から予測される小さい内部Ｓ
ｐｈＩ断片はこのゲルにおいては検出できなかった。
【０１０４】メロゾイトから単離されたポリ（Ａ）含有
ｍＲＮＡのノーザンブロット分析〔Alwineら, Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA74:5350 (1977)〕においては、ラムダ５
−７遺伝子の１．２ｋｂｃＤＮＡ断片は長さ約１．３ｋ
ｂの単一のｍＲＮＡ種にハイブリダイズした。大きさの
相互関係から、５−７クローンは、前記Ｉ−５単離物か
ら判明した５’伸長部と一緒になって、５’末端ヌクレ
オチドを場合により除く、全長ｃＤＮＡ配列を表すこと
が明らかである。
ｍＲＮＡのノーザンブロット分析〔Alwineら, Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA74:5350 (1977)〕においては、ラムダ５
−７遺伝子の１．２ｋｂｃＤＮＡ断片は長さ約１．３ｋ
ｂの単一のｍＲＮＡ種にハイブリダイズした。大きさの
相互関係から、５−７クローンは、前記Ｉ−５単離物か
ら判明した５’伸長部と一緒になって、５’末端ヌクレ
オチドを場合により除く、全長ｃＤＮＡ配列を表すこと
が明らかである。
【０１０５】諸般を考え合わせると、前記の観察はｃＤ
ＮＡおよびゲノム配列の共直線性と一致する。当分野で
習熟した者には明らかであるように、本発明の精神およ
び範囲を逸脱することなく本発明の多くの修飾および変
更が可能である。ここに記載した特定の実施態様は単な
る例示であって、本発明は添付の特許請求の範囲によっ
てのみ制限されるものとする。
ＮＡおよびゲノム配列の共直線性と一致する。当分野で
習熟した者には明らかであるように、本発明の精神およ
び範囲を逸脱することなく本発明の多くの修飾および変
更が可能である。ここに記載した特定の実施態様は単な
る例示であって、本発明は添付の特許請求の範囲によっ
てのみ制限されるものとする。
【発明の効果】本発明のアイメリア蛋白は、コクシジウ
ム症の原因生物に対して免疫を獲得した動物の血清に含
まれる抗体を用いて同定されたので、重要なワクチン抗
原であり、コクシジウム症にかかりやすい若い家禽を保
護するためのワクチンとして有用である。
ム症の原因生物に対して免疫を獲得した動物の血清に含
まれる抗体を用いて同定されたので、重要なワクチン抗
原であり、コクシジウム症にかかりやすい若い家禽を保
護するためのワクチンとして有用である。
【図１】ウサギ由来の抗体選別した抗体と免疫ニワトリ
血清により認識されるアイメリア前駆体蛋白をコードす
る１．２ｋｂのｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列および
該ヌクレオチド配列から推定されるアイメリア前駆体蛋
白のアミノ酸配列を示す。
血清により認識されるアイメリア前駆体蛋白をコードす
る１．２ｋｂのｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列および
該ヌクレオチド配列から推定されるアイメリア前駆体蛋
白のアミノ酸配列を示す。
【図２】種々のアイメリアメロゾイト蛋白のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析の結果を示す。
ＡＧＥ分析の結果を示す。
【図３】ＰｖｕＩＩ（レーン１）、ＨｉｎｃＩＩ（レー
ン２）、ＰｓｔＩ（レーン３）、ＳｐｈＩ（レーン４）
またはＳａｃＩ（レーン５）を用いて消化したアイメリ
ア・テネラの胞子形成オーシストのゲノムＤＮＡのサザ
ンブロット分析の結果を示す。
ン２）、ＰｓｔＩ（レーン３）、ＳｐｈＩ（レーン４）
またはＳａｃＩ（レーン５）を用いて消化したアイメリ
ア・テネラの胞子形成オーシストのゲノムＤＮＡのサザ
ンブロット分析の結果を示す。
【図４】プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩの模式図を
示す。
示す。
【図５】プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩの全ヌクレ
オチド配列を示す。
オチド配列を示す。
【図６】プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−１）の
模式図を示す。
模式図を示す。
【図７】プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−１）の
全ヌクレオチド配列を示す。
全ヌクレオチド配列を示す。
【図８】プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−２）の
模式図を示す。
模式図を示す。
【図９】プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ（−２）の
全ヌクレオチド配列を示す。
全ヌクレオチド配列を示す。
【図１０】プラスミドｐＤＭＩ．１の模式図を示す。
【図１１】プラスミドｐＤＭＩ．１の全ヌクレオチド配
列を示す。
列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Claims (5)
- 【請求項１】 アイメリア（Eimeria）メロゾイト表面
抗原の免疫反応決定基および／または抗原決定基の１つ
またはそれ以上を有する蛋白であって、前記表面抗原が
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約２３キロダルトンの見掛
け分子量を有しかつＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約３０
キロダルトンの見掛け分子量を有する前駆体蛋白から誘
導されるものである、他のアイメリア蛋白を実質的に含
まない蛋白であって、下記アミノ酸配列： 【化１】 もしくは、上記アミノ酸配列中の最初の２０個のアミノ
酸残基を実質的に欠いている部分配列を有する蛋白、ま
たは前記アイメリアメロゾイト表面抗原に対する抗体と
の免疫学的特性を実質的に変えることなく、前記アミノ
酸配列中のアミノ酸の欠失、挿入または置換により得ら
れる、その機能的均等蛋白コードするヌクレオチド配列
を有するＤＮＡを含んでなり、適合性の宿主生物内で該
ＤＮＡの発現を指示しうる組み換えウイルス。 - 【請求項２】 請求項１に記載のアミノ酸配列を有する
蛋白もしくは、該アミノ酸配列中の最初の２０個のアミ
ノ酸残基を実質的に欠いている部分配列を有する蛋白、
または該アイメリアメロゾイト表面抗原に対する抗体と
の免疫学的特性を実質的に変えることなく、該アミノ酸
配列中のアミノ酸の欠失、挿入または置換により得られ
る、その機能的均等蛋白をコードするヌクレオチド配列
を有するＤＮＡを包含する組み換えウイルスを作製する
方法であって： （ａ）前記蛋白をコードするヌクレオチド配列を有する
ＤＮＡを、ウイルスの成熟および感染力を阻害すること
なくウイルスゲノムに挿入し； （ｂ）前記組み換えウイルスを細胞培養物内で増幅さ
せ；そして （ｃ）培地から組み換えウイルスを精製する、ことを含
んで成る方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載のアミノ酸配列を有する
蛋白もしくは、該アミノ酸配列中の最初の２０個のアミ
ノ酸残基を実質的に欠いている部分配列を有する蛋白、
または該アイメリアメロゾイト表面抗原に対する抗体と
の免疫学的特性を実質的に変えることなく、該アミノ酸
配列中のアミノ酸の欠失、挿入または置換により得られ
る、その機能的均等蛋白および生理学的に許容しうる担
体またはアジュバントを含んでなる、コクシジウム症か
ら家禽を保護するためのワクチン。 - 【請求項４】 請求項１に記載のアミノ酸配列を有する
蛋白もしくは、該アミノ酸配列中の最初の２０個のアミ
ノ酸残基を実質的に欠いている部分配列を有する蛋白、
または該アイメリアメロゾイト表面抗原に対する抗体と
の免疫学的特性を実質的に変えることなく、該アミノ酸
配列中のアミノ酸の欠失、挿入または置換により得られ
る、その機能的均等蛋白をコードするヌクレオチド配列
を有するＤＮＡを包含しかつ適合性の宿主生物内で該Ｄ
ＮＡの発現を指示しうる組み換えウイルス、および生理
学的に許容しうる担体またはアジュバントを含有する、
コクシジウム症から家禽を保護するためのワクチン。 - 【請求項５】 請求項２に記載の方法により作製され
た、請求項１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白もしく
は、該アミノ酸配列中の最初の２０個のアミノ酸残基を
実質的に欠いている部分配列を有する蛋白、または該ア
イメリアメロゾイト表面抗原に対する抗体との免疫学的
特性を実質的に変えることなく、該アミノ酸配列中のア
ミノ酸の欠失、挿入または置換により得られる、その機
能的均等蛋白をコードするヌクレオチド配列を有するＤ
ＮＡを含んでなる組み換えウイルス。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47050890A | 1990-01-26 | 1990-01-26 | |
| US470508 | 1990-01-26 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3022573A Division JP3023997B2 (ja) | 1990-01-26 | 1991-01-24 | 組み換えコクシジウム症ワクチン−５−７アイメリア表面抗原 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000139483A true JP2000139483A (ja) | 2000-05-23 |
| JP3215692B2 JP3215692B2 (ja) | 2001-10-09 |
Family
ID=23867879
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3022573A Expired - Fee Related JP3023997B2 (ja) | 1990-01-26 | 1991-01-24 | 組み換えコクシジウム症ワクチン−５−７アイメリア表面抗原 |
| JP33053299A Expired - Fee Related JP3215692B2 (ja) | 1990-01-26 | 1999-11-19 | 組み換えコクシジウム症ワクチン |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3022573A Expired - Fee Related JP3023997B2 (ja) | 1990-01-26 | 1991-01-24 | 組み換えコクシジウム症ワクチン−５−７アイメリア表面抗原 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0439056B1 (ja) |
| JP (2) | JP3023997B2 (ja) |
| KR (2) | KR100197455B1 (ja) |
| AT (1) | ATE104349T1 (ja) |
| AU (1) | AU634335B2 (ja) |
| CA (1) | CA2034768A1 (ja) |
| DE (1) | DE69101646T2 (ja) |
| DK (1) | DK0439056T3 (ja) |
| ES (1) | ES2063383T3 (ja) |
| FI (1) | FI910398A (ja) |
| HR (1) | HRP930512B1 (ja) |
| HU (1) | HU211205B (ja) |
| IE (1) | IE65363B1 (ja) |
| IL (1) | IL97013A (ja) |
| MC (1) | MC2227A1 (ja) |
| NO (1) | NO303910B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ236864A (ja) |
| PT (1) | PT96581B (ja) |
| SA (1) | SA91110265B1 (ja) |
| YU (1) | YU48525B (ja) |
| ZA (1) | ZA9010461B (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5403581A (en) * | 1991-07-12 | 1995-04-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Coccidiosis vaccines |
| US6008342A (en) * | 1991-07-12 | 1999-12-28 | Roche Vitamins Inc. | DNA encoding eimeria antigen |
| DK0653489T3 (da) * | 1993-11-12 | 2003-06-10 | Akzo Nobel Nv | Coccidiosisvaccine til fjerkræ |
| SK282436B6 (sk) | 1995-06-07 | 2002-02-05 | Pfizer Inc. | Živé sporocysty alebo oocysty Eimeria alebo ich zmesi na výrobu očkovacej látky |
| ES2155129T3 (es) | 1995-06-07 | 2001-05-01 | Pfizer | Vacunacion in ovo contra la coccidiosis. |
| EP0872486A1 (en) * | 1997-04-09 | 1998-10-21 | Akzo Nobel N.V. | Eimeria proteins as vaccines |
| US6627205B2 (en) | 1997-12-01 | 2003-09-30 | Pfizer Incorporated | Ovo vaccination against coccidiosis |
| US6680061B1 (en) | 1998-10-07 | 2004-01-20 | Theodorus Cornelis Schaap | Coccidiosis vaccines |
| US6984378B1 (en) | 1999-02-26 | 2006-01-10 | Pfizer, Inc. | Method for the purification, recovery, and sporulation of cysts and oocysts |
| CA2452841C (en) | 2001-08-30 | 2012-10-02 | Embrex, Inc. | Method of sporulating eimeria oocytes |
| JP3995541B2 (ja) * | 2002-06-28 | 2007-10-24 | 株式会社ゲン・コーポレーション | 抗鶏コクシジウム症組成物 |
| WO2004063339A2 (en) | 2003-01-08 | 2004-07-29 | Lesley Davenport | G-quadruplex binding assays and compounds therefor |
| KR100628023B1 (ko) | 2004-06-11 | 2006-09-26 | (주)넥스젠 | 콕시듐 원충의 포자소체의 재조합 표면항원 단백질 및이를 포함하는 콕시듐병 백신 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0135073A3 (en) * | 1983-08-19 | 1987-05-27 | American Cyanamid Company | Antigens and monoclonal antibodies reactive against merozites of eimeria spp. |
| CA1340520C (en) * | 1984-06-05 | 1999-05-04 | Karel Z. Newman Jr. | Antigenic proteins and vaccines containing them and protective antibodies directed to them for prevention of coccidiosis caused by eimeria tenella and eimeria necatrix |
| ZA893740B (en) * | 1988-06-03 | 1990-02-28 | Hoffmann La Roche | Recombinant coccidiosis vaccines |
-
1990
- 1990-12-28 ZA ZA9010461A patent/ZA9010461B/xx unknown
-
1991
- 1991-01-17 AT AT91100502T patent/ATE104349T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-17 DK DK91100502.3T patent/DK0439056T3/da active
- 1991-01-17 ES ES91100502T patent/ES2063383T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-17 DE DE69101646T patent/DE69101646T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-17 EP EP91100502A patent/EP0439056B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-23 NZ NZ236864A patent/NZ236864A/xx unknown
- 1991-01-23 CA CA002034768A patent/CA2034768A1/en not_active Abandoned
- 1991-01-23 HU HU91235A patent/HU211205B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-01-24 NO NO910279A patent/NO303910B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-01-24 MC MC912167A patent/MC2227A1/xx unknown
- 1991-01-24 AU AU69952/91A patent/AU634335B2/en not_active Ceased
- 1991-01-24 IL IL97013A patent/IL97013A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-01-24 JP JP3022573A patent/JP3023997B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-25 KR KR1019910001306A patent/KR100197455B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-01-25 PT PT96581A patent/PT96581B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-01-25 IE IE27691A patent/IE65363B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-01-25 YU YU12991A patent/YU48525B/sh unknown
- 1991-01-25 FI FI910398A patent/FI910398A/fi unknown
- 1991-03-20 SA SA91110265A patent/SA91110265B1/ar unknown
-
1993
- 1993-03-24 HR HRP-129/91A patent/HRP930512B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-11-20 KR KR1019980049922A patent/KR100207354B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-11-19 JP JP33053299A patent/JP3215692B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1310921C (en) | Vector for the expression of fusion proteins and protein immunogens | |
| JP2584733B2 (ja) | 原虫類抗原用ｄｎａのクロ−ニング | |
| JP3215692B2 (ja) | 組み換えコクシジウム症ワクチン | |
| JP3450018B2 (ja) | コクシジウム症ワクチン | |
| JP3037359B2 (ja) | コクシジウム症ワクチン | |
| AU636290B2 (en) | Recombinant eimeria tenella vaccines | |
| WO2003004683A2 (en) | Nucleic acids encoding recombinant 56 and 82 kda antigens from gametocytes of eimeria maxima and their uses | |
| AU2002316558A1 (en) | Nucleic acids encoding recombinant 56 and 82 kDa antigens from gametocytes of Eimeria maxima and their uses | |
| WO1990000403A1 (en) | Genetically engineered coccidiosis vaccine | |
| US6008342A (en) | DNA encoding eimeria antigen | |
| NZ226025A (en) | Plasmodium falciparum merozoite epitope peptides, peptide conjugates, dna and antibodies | |
| US5225534A (en) | Recombinant malarial polypeptides | |
| JPH0686679A (ja) | プラズモジウム・スポロゾイド抗原 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |