PT96581B - Processo para a preparacao de uma proteina possuindo um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigenicos de um antigene de superficie merozoito de eimeria - Google Patents

Description

Processo para a preparação de uma proteína possuindo um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigênicos de um antigene de superfície.merozoito de Eimeria

O presente pedido de patente de invenção refere-se a antigenes de parasitas protozoãricos' Eimeria. Podem utilizar-se estes antigenes, segundo diversas vias de administração, para proteger aves domésticas contra a coccidiose.

A coccidiose ê uma doença das aves domésticas originada por parasitas protozoários intracelulares do gênero Eimeria. A doença ê largamente endémica, em instalações de criação intensiva de aves. 0 custo estimado do controlo da doença atra vês de quimioterapia excede, apenas nos Estados Unidos da América, os 100 milhões de dólares por ano. O desenvolvimento de resistência a fãrmacos anti-coccidianos conhecidos torna necessário um contínuo desenvolvimento de novos agentes, numa altura em que o desenvolvimento de fãrmacos se torna cada vez mais dis pendioso e diminui a aceitação do consumidor aos resíduos do fármaco nos animais destinados à alimentação.

Encontra-se bem documentada a protecção imunitária contra a infecção natural pela coccidiose. Demonstrou-se que a administração diária, controlada, de um pequeno número de oocis tos viáveis durante algumas semanas originava uma imunidade total para um estímulo infeccioso de uma dose normalmente virulen ta Z?Rose et al., Parasitology,73 (1976) 25; Rose et al., Parasitology 88 (1984) 199J7. A demonstração da resistência adquirida a infecção sugere a possibilidade de se construir uma vaci

na para induzir a imunidade em frangos jovens, ultrapassando a necessidade de coccidiostãticos químicos. De facto, ensaiou-se este conceito na formulação Coccivac '-J* dos Sterwin Laboratories, Opelika, AL. Tendo em vista a produção de uma vacina para a coccidiose, Murray e outros, no pedido de patente de inven ção europeia, publicação N9 167443, prepararam extractos de esporozõitos ou de oocistos esporulados, de Eimeria tenella que contêm, pelo menos, 15 polipêptidos, a maioria dos quais se encontram associados à superfície do esporozóito. A injecção desses extractos nos frangos, reduziu as lesões cecais a seguir à inoculação oral com oocitos esporulados de E. tenella virulenta.

Mais recentemente, Schenkel e outros, na patente de invenção norte-americana n9 4650676, descreveram a produção de anticorpos monoclonais contra os merozõitos dá E. tenella. Utilizando estes anticorpos, Schenkel e outros identificaram diver sos antigenes contra os quais os anticorpos se dirigiam. Por pré -incubação dos esporozõitos de E. tenella com estes anticorpos e posterior introdução dos esporozõitos tratados nos cegos dos frangos, foi possível a Schenkel e outros demonstrar alguma redu ção nos níveis de lesões cecais, por comparação com os controlos de esporozõitos não tratados.

Utilizando a metodologia do ADN recombinante, Newman e outros, (pedido de patente de invenção europeia, publicação N9 164176) clonaram um gene do estádio de esporozóito que codifi cava um antigene de 25000 daltcns dé Eimeria tenella. Os soros de frangos imunizados por imunização repetida com esporozõitos aniquilados de E. tenella imuncprecipitaram este antigene a partir de esporozõitos iodados e de preparações de irenbrana. Mais reoentemente, Jenkins, Nucleic AClds Bes. 16 (1988)

9863 descreveu um cADN que codificava uma parte de uma proteí na de superfície de um merozóito de 250 000 daltons provenien te de Eimeria acervulina. 0 produto de expressão deste CADN foi reconhecido pelo anti-soro contra o organismo.

Os avanços na tecnologia do ADN recombinante tornaram possível uma outra abordagem, isto ê, uma vacina subunitã ria. Encontram-se descritos exemplos dessas vacinas, por exem pio, nos pedidos de patente de invenção europeia, publicações N°s 324 646, 337 589 e 334 808.

A presente invenção proporciona proteínas purificadas que têm um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigênicos de um antigene de superfície de um merozóito de Eimeria, possuindo esse antigene de superfície um peso molecular aparente de 23 quilodaltons aproximadamente, segundo se determinou por electroforese sobre gel de dodecil-sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e f derivado de uma proteína precur sora que tem um peso molecular aparente de aproximadamente 30 quilodaltons, segundo determinado por SDS-PAGE, encontrando-se essa proteína substancialmente isenta de outras proteínas de Eimeria.

De um modo mais específico, a presente invenção proporciona uma proteína isolada que consiste num antigene de superfície de merozóito que tem um peso molecular aparente de, aproximadamente, 23 quilodaltons, conforme determinado por SDS-PAGE, e fragmentos da referida proteína. Estes fragmentos de proteína encontram substancialmente isentos de outras proteínas de Eimeria.

A presente invenção proporciona também uma proteína que ê uma proteína precursora do antigene de superfície do me-

cl rozóito de Eimeria anteriormente referido, ou um seu fragmento, tendo essa proteína precursora um peso molecular aparente de aproximadamente 30 quilodaltons, tal como se determinou por SDS-PAGE, e tendo a sequência de aminoãcidos representada na Figura 1. A referida proteína precursora encóntra-se substancialmente isenta de outras proteínas de Eimeria.

A proteína preferencial da presente invenção consis^ te numa proteína madura do antigene de superfície do merozõito de Eimeria que tem a sequência de aminoãcidos indicada na Figura 1, mas que nao tem a sequência peptídica principal de sinal na extremidade N, consistindo essa sequência principal essencialmente nos primeiros vinte aminoãcidos da sequência indicada na Figura 1. A presente invenção refere-se também a uma proteína funcionalmente equivalente â proteína anteriormen te referida e que tem uma sequência de aminoãcidos que ê aparentada com a sequência de aminoãcidos referida por eliminações, inserções ou substituições sem alterar essencialmente as propriedades imunolõgicas da referida proteína.

A presente invenção ainda proporciona um ADN que codifica todos ou sõ uma parte dos antigenes de superfície dos mero.zõitos de Eimeria, e que tem um peso molecular aparente de aproximadamente 23 quilodaltons ou a sua proteína precursora anteriormente mencionada, vectores recómbinantes que contêm o referido ADN e capazes de comandarem a expressão do referido ADN em organismos hospedeiros compatíveis e em microrganismos que contenham estes vectores.

A presente invenção, proporciona, para além disso, um processo para a preparação de uma proteína que tenha um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigênicos de um antigene de superficie de um merozõito de Eimeria, tendo esse entigene de superfície um peso molecular aparente de, aproximadamente, 23 quilodaltons, consistindo esse processo em:

a) cultivar um microrganismo que contenha um vector recom binante constituído por um ADN com uma sequência nucleotídica que codifique a referida proteína, tal como o ADN que tem a sequência nucleotídica indicada na Figura 1, ou um seu fragmen to, nas condições em que a sequência de ADN ou o seu fragmento se exprime; e

b) isolar a proteína a partir da cultura.

A presente invenção proporciona ainda vacinas para proteger as aves domesticas contra ã coccidiose, constituídas por uma quantidade eficaz de uma ou mais proteínas da presente invenção e por um veículo fisiològicamente aceitável.

A presente invenção proporciona, para além disto, va cinas para proteger as aves domésticas contra a coccidiose, constituídas por um vírus recombinante que contêm uma sequência de ADN que codifica uma proteína da presente invenção, sen do o vírus recombinante capaz de causar a expressão da referida sequência de ADN, e por um veículo fisiològicamente aceitável.

A presente invenção também proporciona, um método pa ra proteger as aves domésticas contra a coccidiose, que consis^ te em administrar uma quantidade eficaz de uma vacina da presente invenção a uma ave jovem que seja sensível a coccidiose.

As proteínas de Eimeria da presente invenção são antigenes importantes para vacinas devido ao facto de serem iden tificados pela utilização de anticorpos no soro de animais que foram imunizados contra o organismo da coccidiose e que desen-6'I β

volveram imunidade em relação a essa doença. Por este motivo, é mais provável que estas proteínas desempenhem um papel impor tante na protecção das aves domésticas contra a coccidiose.

A presente invenção pode ser melhor compreendida por referência âs figuras, nas quais:

A Fig. 1, indica uma sequência nucleotídica da molécula ds cADN de 1,2 kb que codifica a proteína precursora de Eimeria reconhecida por anticorpos seleccionados por um anticorpo, de coelho e por soro imunizado de frangos. Tal como se pode observar na Fig.l, a sequência nucleotídica que codifica a referida proteína precursora encontra-se entre o ATG no nucleõtido 68 e o codão de paragem TAA no nucleõtido 668 (codificando 200 aminoácidos). A Fig. 1 também indica a sequência de aminoácidos da proteína precursora de Eimeria prevista a partir da sequência nucleotídica fornecida. Utilizam-se abreviaturas normalizadas de uma única letra para se representarem os nucleõtidos e os aminoácidos. Podem ver-se os significados. destas abreviaturas em tratados de bioquímica, tais como Lehninger, Principies of Bio'chemis'try,New York, Worth Publishers, Inc. 1984, pp, 96, 798.

A Fig. 2, representa os resultados de uma análise

SDS-PAGE de diversas proteínas de merozóitos de Eimeria. O Pai nel A representa uma mancha imunológica das proteínas totais do merozoito, que se sondaram com controlo (a) ou anticorpos seleccionados por um anticorpo (b). A seta no Painel A indica a posição de uma banda que contêm uma proteína que possui um pe so molecular de aproximadamente 23 quilodaltons. 0 Painel B re presenta um auto-radiograma de proteínas de superfície de mero- 125 zoitos marcadas com I e imunoprecipitadas com controlo (a)

7ou com anticorpos seleccionados por um anticorpo (b). 0 Painel C indica a mistura completa de produtos originada pelatransferência in vitro de mARN de merozóito (a) e os produtos de transferência que se imunoprecipitaram utilizando o clõne lamb da 5-7 (b), anticorpos seleccionados por utilização de outro clone de bacteriofagos que produziram proteínas que reagiam com o soro anti-merozoítico(c) e anticorpos de controlo seleccionados a partir do soro de merozõitos utilizando bacteriõfagos não recombinantes (d). Visualizaram-se as bandas por fluorografia. As posições dos indicadores de pesos moleculares que possuiam um peso molecular em quilodaltons (KDa) encontram-se indicados â direita da Figura.

A Figura 3 indica os resultados de uma analise de man cha de Southern de ADN genõmico de oocistos esporulados de Eimeria tenella digeridos com PvuII (pista 1), Hincll (pista 2), PstI (pista 3), Sphl (pista 4) ou Saci (pista 5). As posições de ADNs normalizadas que têm os tamanhos indicados em kb encontram-se indicadas ã direita da Figura.

A Figura 4 consiste num gráfico esquemático do plasmídeo pDS56/RBSII. Neste diagrama e nas Figuras 6,8 e 10, as abreviaturas e símbolos B, Bg, Ε, Η, N, P, S, Xe Xb indicam os sítios de clivagem para os enzimas de restrição, respectivamente BamII, BglII, EcoRI, HindIII, Ncol, PstI, Sall, Xhol, e Xbal. _representa o elemento regulável promotor/operaribossomica;

dor N250PSN250P29; ΙίίΐίίϊίΔΐίΙί representa os sítios de ligação ri bossõmica RBSII, RBSII(-1) e RBSII(-2); -^representa as re giões de codificação sob o controlo destes sítios de ligação representa uma região que codifica seis resíduos de histidina;..........I... representa os terminadores t e

-8// .1

Τ_χ; <- - representa e região necessária para a replicação de ADN na E. coli (repl.) ,Ή^ representa as regiões de codificação para a di-hidrofolato-redutase (dhfr), cloranfenicol-ace tiltransferase (cat),-lactamase (bla), repressor lac (lacl) e neomicina-fosfotransferase (neo).

A Figura 5 apresenta a sequência nucleotídica comple ta do plasmideo pDS56/RBSII. Nesta sequência, encontram-se indicadas as sequências de reconhecimento dos enzimas indicados na Fig. 4. A sequência de aminoácidos indicada representa a se quência de transcrição aberta sob o controlo do sitio de ligação ribossõmico RBSII.

A Fig. 6 ê um desenho esquemático do plasmideo pDS56/ /RBSII (-1) .

A Fig. 7 apresenta a sequência nucleotídica completa do plasmideo pDS56/RBSII(-1). Nesta sequência, encontram-se indicadas as sequências de reconhecimento dos enzimas de restrição indicados na Figura 6. A sequência de aminoácidos indicada representa a sequência de transcrição aberta sob o controlo do sítio de ligação ribossómica RBSII(-1).

A Fig. 8 ê um desenho esquemático do plasmideo pDS56/ /RBSII(-2).

A Fig.9 apresenta a sequência nucleotídica completa do plasmideo pDS56/RBSH (-2) .Nesta sequência, as sequências de reccnhecinten to dos enzimas de restrição indicados na Fig. 8. A sequência de aminoácidos indicada representa a sequência de transcrição aberta sob o controlo do sítio de ligação ribossómica RBSII(-2).

A Fig. 10 ê um desenho esquemático do plasmideo pMDI.l.

A Fig. 11 apresenta a sequência nucleotídica completa do plasmideo pDMI.l. Nesta sequência, encontram-se indicadas as

-9sequências de reconhecimento dos enzimas de restrição indicados na Fig. 10. Os aminoãcidos indicados englobam as sequências de transcrição abertas que codificam a neomicina-fosfotransferase (Met a Phe) e o repressor lac (Met a Gin; note-se o sentido inverso deste gene).

Todas as referências mencionadas na presente invenção, encontram-se aqui incorporadas na sua totalidade, como referência.

Na presente invenção os termos que se seguem possuem os significados seguintes:

Antigene de superfície de Eimeria significa uma proteína que tem um peso molecular aparente de aproximadamente 23 quilodaltons, em SDS-PAGE, que se encontra presente no estádio merozõito de Eimeria tenella. Esta proteína parece ser produzida por processamento põs-transferencial do produto de expressão in vivo de um gene que tenha a sequência nucleotídica indi cada na Fig. 1.

Proteína precursora significa uma proteína que tem um peso molecular aparente de aproximadamente 30 quilodaltons em SDS-PAGE. Crê-se’ que esta proteína seja processada por proteõlise in vivo do antigene de superfície de Eimeria. Na Fig.l indica-se a sequência nucleotídica de uma molécula de cADN que codifica esta proteína e a sequência de aminoãcidos prevista a partir dela.

A expressão uma proteína que tem um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigênicos do entigene de superfície de Eimeria diz respeito a uma proteína que tenha uma ou mais regiões ou epítopes capazes de suscitar uma resposta imuno lógica num organismo hospedeiro Ãmunològicamente competente e/ou

-10sao capazes de se ligarem especificamente a um anticorpo complementar e que corresponde aos epítopes do antigene de superfície de Eimeria anteriormente definido. A referida proteína pode ser codificada por equivalentes funcionais de sequência nucleotídica da Fig. 1. Estas proteínas funcionalmente equivalentes têm sequências de aminoãcidos relacionados com a sequên cia da Fig. 1 por substituições de aminoãcidos que não alteram substancialmente a actividade imunolõgica (isto ê, que não des^ troem substancialmente os determinantes imuno-reactivos e/ou antigênicos).

Devido â degenerescência do código genético, deverá considerar-se que existem muitas sequências nucleotídicas potenciais (equivalentes funcionais) que podem codificar para a sequência de aminoãcidos apresentada na Fig. 1. Também se deve rã ter em conta que as sequências nucleotídicas das sequências e fragmentos de ADN da presente invenção, inseridas em vectores, podem incluir nucleótidos que nao fazem parte dos genes estruturais actuais, desde que os vectores recombinantes que contêm essa sequência ou fragmentos sejam capazes de comandar a produ ção, num organismo hospedeiro adequado, de uma proteína ou fraçf mento com um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigênicos do antigene de superfície de Eimeria.

Sabe-se da ocorrência e foram descritas, por exemplo, por Neurath et al. em The' Proteins, New York, Academic Press 1979, especialmente na Fig. 6, pãg. 14, substituições de aminoãcidos em proteínas que não alteram substancialmente as suas actividades biológica e imunolõgica. As substituições de aminoãcidos mais frequentemente observadas são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly,

-ΜV.

Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu,

Asp/Gly, e vice-versa.

Estas variações funcionalmente equivalentes da sequên cia nucleotídica e substituições de aminoãcidos dos aspectos exemplificativos da presente invenção, estão abrangidos pelo âmbito da mesma, desde que originem proteínas que conservem um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigênicos do antigene de superfície de Eimeria, tal como anteriormente definido.

Podem preparar-se, facilmente outras sequências de

ADN que codifiquem a sequência de aminoãcidos da Fig. 1 ou sequências de aminoãcidos aparentadas, por substituições, utilizando, oligonucleõtidos sintéticos adequados na mutagénese específica de um sítio comandada por um precursor, no exemplo de cADN da presente invenção (Fig. 1), tal como é descrito por Mo rinaga et al. , Biotechnology, 2_ (1984) 636.

termo fragmento refere-se a um oligonucleõtido ou polipêptido constituído por uma sub-sequência de um dos cADNs ou proteínas da presente invenção. Podem produzir-se tais fragmentos por clivagem enzimática de moléculas maiores, utilizando endonucleases de restrição para o ADN e proteases para as proteínas. No entanto, os fragmentos da presente invenção nao se limitam aos produtos de qualquer forma de clivagem enzimática, mas incluem sub-sequências, cujos extremos não correspondem a quaisquer pontos de clivagem enzimática. Podem construir-se esses fragmentos por síntese química, utilizando os dados sequen ciais que se proporcionam na presente invenção. Também se podem produzir os fragmentos de ADN por síntese incompleta do ADN com plementar (cADN) a partir do ARN mensageiro isolado (mARN). Tam bém se podem produzir os fragmentos de proteína por expressão

-12dos fragmentos de ADN que codificam os fragmentos de proteína. Estes fragmentos de proteína podem ser úteis na presente inven ção se contiverem um número suficiente de resíduos aminoãcidos para se constituir um determinante imuno-reactivo e/ou antigênico. Sao necessários, geralmente, pelo menos 7 ou 8 resíduos. Tal como adiante se farã referência, pode ser necessário acoplar esses fragmentos a uma molécula veículo imunogênica, para torná-los imuno-reactivos.

Podem preparar-se as proteínas da presente invenção de acordo com métodos conhecidos na especialidade, tais como, a metodologia do ADN recombinante, sintese química ou por isolamento a partir de preparações de Eimeria.

Pode sintetizar-se quimicamente o ADN necessário para a preparação das proteínas da presente invenção, utilizando a informação da sequência nucleotídica apresentada na Fig. 1. Pode efectuar-se esta síntese química utilizando qualquer dos métodos conhecidos tais como o método do suporte sólido de fosforamidite de Matteucci et al., Am. Chem. Soe., 103 (1981) 3185.

De um modo alternativo, pode construir-se o cADN a partir do mARN dé Eimeria. Pode isolar-se o ARN mensageiro dos merozóitos de Eimeria utilizando técnicas normalizadas. Podem utilizar-se as amostras de mARN para se produzir cADN de cordão duplo, tal como descrito por Maniatis et al., Molecular Cloning; A líaboratory Manual, Cold Spting Harbor, N.Y. , Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

Depois, pode inserir-se este cADN num vector de clonagem adequado que se pode utilizar para transformar a E. coli, e produzir uma biblioteca de cADN.

Pode, então efectuar-se o rastreio da biblioteca de

-13cADN, utilizando como sondas o gene clonado da presente invenção, ou os seus fragmentos. Podem marcar-se radioactivamente estes genes ou fragmentos, por exemplo por marcação radioactiva do: ADN (nick-translation) utilizando ADN polimerase Pol I, na presença de quatro desoxi-ribonucleótidos, um dos quais con„32 têm P na posição a (Maniatis et al., supra, p.109), para serem utilizados como sondas. Também se podem preparar as sondas por síntese de oligonucleõtidos com base na sequência conhecida do cADN do antigene de superfície de Eimeria.

Embora se tenha utilizado a Eimeria tenella como uma fonte de mARN, nos Exemplos apresentados a seguir podem utilizar-se os genes clonados desta espécie como sondas para se isolarem genes de outras espécies de Eimeria, devido à homologia da sequência do ADN entre as diversas espécies.

Uma vez identificadas e isoladas, as sequências de ADN de Eimeria da presente invenção são inseridas no veículo de expressão adequado que contêm os elementos necessários para a transcrição e transferência das sequências do gene inserido. Os veículos de clonagem adequados podem consistir em segmentos de sequências de ADN cromossõmico, não cromossómico e sintético, tal como diversos plasmídeos bacterianos conhecidos, ADN de bac teriõfagos, combinações de plasmídeos e ADN de bacteriófagos, tal como plasmídeos modificados de. modo a utilizar ADN de bacte riõfago ou outras sequências de controlo de expressão, ou plasmídeos de levedura. Os veículos específicos de clonagem que se podem utilizar incluem, mas não se limitam aos plasmídeos pEV-vrf (os pEV-vrfl, -2 e -3 que foram descritos por Crowl et al., Gene, 38 (1985) 31); SV40; adenovírus; levedura; lambda gt-WES-

-lambda B; Charon 4A e 28; lambda-gt-l-lambda B; vectores deri vados de M13, tais como pUC8, 9, 18 e 19, pBR313, 322 e 325; pAC105; pVA51; pACYl77; pKH47; pACYCl84;pUBllO; pMB9; colEl; pSClOl; pML21; RSF2124; pCRl ou RP4; varicela; vacínia; um mem bro da família do vírus Herpes.

Efectua-se facilmente a inserção de genes de Eimeria num vector de clonagem, se se cortarem os genes e o veículo de clonagem desejado com o(s) mesmo(s) enzima ou enzimas de restrição, uma vez que, deste modo, se produzem extremidades complementares de ADN. Se não for possível efectuar esta operação, serã necessário modificar as extremidades de corte obtidas efec tuando novamente a digestão do ADN de cordão simples para se ob terem extremidades complementares ou obtendo os mesmos resultados por complementarização das extremidades do cordão simples com uma ADN polimerase adequada. De acordo com este procedimento, pode depois efectuar-se a ligação das extremidades complementares com um enzima tal como ADN ligasse T4. Como alternativa, pode produzir-se qualquer sítio desejado por ligação de sequências nucleotídicas (ligantes) na extremidade do ADN. Tais ligantes podem consistir em sequências oliginucleotídicas específicas que codificam as sequências de reconhecimento dos sítios de restrição. Também se podem modificar o vector clivado e os genes ou fragmentos de Eimeria por corte com homopolímeros, tal como ê descrito por Marrow, Methods in Enzymology, 68 (1979) 3.

Muitos dos veículos de clonagem que se podem utilizar na presente invenção, contêm uma ou mais actividades indicadoras que se podem utilizar para se seleccionar os transformantes desejados, tais como resistência â ampicilina e â tetraciclina,

no plasmídeo pBR322, resistência â ampicilina e actividade de J^-galactosidase no plasmídeo pUC8 e resistência â ampicilina nos plasmídeos pEV-vrf. A selecção de células hospedeiras nas quais se inseriram estes vectores torna-se muito mais simplificada se as células hospedeiras não possuirem de qualquer outro modo as actividades para as quais estes vectores contribui ram.

Deverá entender-se que as sequências nucleotídicas dos genes de Eimeria inseridos num sítio seleccionado num veículo de clonagem podem incluir nucleotidos que não façam parte dos genes estruturais. Em alternativa, os genes podem conter apenas uma parte do gene completo de tipo selvagem. Tudo o que ê necessário ê que os fragmentos de genes apôs inserção no veí culo de clonagem sejam capazes de comandar a produção num orga nismo hospedeiro adequado de um polipêptido ou proteína que te nha pelo menos um determinante imuno-reactivo e/ou antigênico do antigene de superfície de Eimeria. Deste modo, podem preparar-se os vectores recombinantes constituídos por um ADN com uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína da presen te invenção:

a) inserindo um ADN que tem uma sequência nucleotídica que codifique a referida proteína, num vector;

b)

c) ganismo replicação isolamento

A selecção do referido vector num microrganismo; e do vector recombinante a partir do micror de um organismo hospedeiro adequado é afec tada por diversos factores conhecidos na especialidade. Estes

-16factores incluem, por exemplo, compatibilidade com o vector escolhido,toxicidade das proteínas codificadas pelo plasmídeo híbrido, facilidade de recuperação da proteína desejada, carac terísticas de expressão, segurança biológica e custos. Deve fazer-se um balanço destes factores e deve ter-se em conta que nem todos os hospedeiros serão igualmente eficazes para a expressão de uma molécula específica de ADN recombinante.

Os microrganismos hospedeiros adequados que se podem utilizar na presente invenção incluem, mas não se limitam a, células de plantas, de mamíferos ou de leveduras e bactérias tais como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearotermiphilus e' Actinomyces.Pode utilizar-se a Escherichia coli, estirpe MC1061, descrita por Casadaban et al., J.Biol., 138 (1980) 179 ou qualquer outra estirpe de E. coli K-12 que contenha o plasmídeo pKK248cIts. O plasmídeo PK248cIts para utilização noutras estirpes de E. coli K-12, estã descrito por Bernhard et al., Me th . of Enzymol., 68 (1979) 482 e também se encontra disponível na American Type Culture Collection sob o nú mero de Acesso ATCC 33766. A estirpe MC1061 de E. coli encontra-se comercialmente disponível, por exemplo nos CLONTECH Labo ratories, Inc., Paio Alto, CA e também estã disponível na American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC N9 53338. Descrevem-se, a seguir os plasmídeos pDMl.l, pDS56/RBSII, -1 ou -2 para uso na Escherichia coli,estirpe M15.

Pode efectuar-se a transferência do vector de clonagem recombinante para a célula hospedeira mediante diversas vias Dependendo do sistema especifico vector/cêlula hospedeira escolhido, podem efectuar-se essas transferências por transformação, transdução ou transfecção. Uma vez produzida uma tal célula hos

pedeira modificada, pode cultivar-se essa célula e podem isolar-se os produtos de expressão da proteína a partir da cultura.

Identificam-se os clones transformantes que produzem a proteína precursora do antigene de superfície de Eimeria, por rastreio com soro de animais imunizados contra os esporozõitos ou merozõitos de E. tenella fixos com glutaraldeído. Nos exemplos que se apresentam, utilizou-se soro de coelho anti-merozóítico para se efectuar o rastreio e caracterizar o produto genético. 0 rastreio imunolõgico paralelo efectuado com soro de aves imunizadas originou o isolamento independente do cADN que codifica o antigene de superfície dos merozõitos.

Pode intensificar-se a especificidade dos anti-soros utilizados para se efectuar o rastreio imunolõgico ou a imunoprecipitação, utilizando uma variante do método para selecçao de anticorpos, de acordo com Hall et al., Nature, 311 (1984)

379. De acordo com este método, que se descreve adiante de um modo mais completo, os anticorpos específicos para as proteínas de Eimeria produzidos pelos clones sao adsorvidos sobre filtros.

Pode levar-se a efeito a detecção dos clones produtores do antigene de Eimeria, utilizando métodos de ensaio normalizados bem conhecidos na especialidade, incluindo técnicas de imunoprecipitação, ensaios imunolõgicos ligados a enzimas e têc nicas de ensaio rádio-imunolõgico, que se encontram descritas na literatura /^ver, e.g., Kennet et al. (editores), Monoclonal Antibodies' and ITybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, New York, Plenum Press, 1980, pp. 376-384 J .

Podem produzir-se grandes quantidades de proteína re

,V combinante de Eimeria, desenvolvendo os microrganismos transformados obtidos deste modo, num caldo de fermentação que contenha os nutrientes adequados sob condições adequadas para expressão do ADN recombinante. Na E. coli, as proteínas recombinantes de Eimeria encontram-se no citoplasma ou nos corpos de inclusão. Para se libertarem as proteínas é, portanto, necessário romper-se a membrana exterior das bactérias. Esta operação efectua-se, por tratamento com ultra-sons ou por outros meios mecânicos de ruptura, como, por exemplo, utilizando uma célula de pressão de French ou um homogeneizador Gaulin £Charm et al. Me th. Ehzymol. , 22 (1971), 476-556J7.

Também se pode efectuar a ruptura das células por meios químicos ou enzimãticos. Uma vez que, muitas vezes, sao necessários catiões bivalentes para a integridade da membrana, o tratamento com agentes quelantes adequados, tais como EDTA ou EGTA, pode originar uma ruptura suficiente para facilitar a saí^ da das proteínas das células. De modo semelhante, utilizaram-se enzimas, tais como lisozima para se obter o mesmo resultado. Aquele enzima hidrolisa a cadeia principal do peptidoglicano da parede celular.

Também se pode aplicar um choque osmótico. Resumidamente, pode efectuar-se esta operação, colocando, em primeiro lugar as células numa solução hipertõnica que farâ com que as células percam ãgua e se contraiam. A colocação subsequente das células numa solução hipotõnica de choque levaria a um rápido influxo da ãgua para o interior das células com a expulsão das proteínas necessárias.

Uma vez libertas das células, podem concentrar-se as proteínas de Eimeria por precipitação com sais, tais como sulfa

-19-y to de sódio ou de amónio, ultrafiltração ou outros métodos bem conhecidos na especialidade. Pode efectuar-se ainda uma purifi cação de acordo com técnicas de purificação convencionais, que incluem, mas não se limitam a filtração por gel, cromatografia de permuta iónica, electroforese preparatória em discos de gel ou de tecido, focalizaçao isoeléctrica, fraccionamento de dissolventes orgânicos a baixa temperatura ou distribuição em con tra-corrente. Pode também efectuar-se a purificação por cromatografia de imunoafinidade.

Os métodos específicos para purificar as proteínas de Eimeria a partir dos organismos são conhecidas na especialidade. Ver, por exemplo, Newman et al., pedido de patente de inven ção europeia, publicação N9 164 176.

As proteínas de acordo com a presente invenção ou os seus fragmentos podem também ser sintetizados por um método apro priado, tal como por síntese em fase sólida de exclusão, métodos de fase sólida parcial, condensação de fragmentos ou síntese em solução convencional. Dã-se preferência ã síntese em fase solida, tal como é descrita por Merrifield, J.Am. Chem. Soc., 85 (1963) zl49.

Efectua-se esta síntese com aminoácidos protegidos na extremidade alfa-amino. Os aminoácidos trifuncionais com cadeias laterais lãbeis também se protegem com grupos adequados que evitarão que ocorra uma reacção química nesse local durante a ligação do pêptido.

Remove-se selectivamente o grupo protector de alfa-ami no, para permitir a ocorrência de uma reacção subsequente na extremidade alfa-amino. As condições para remoção do grupo protector de alfa-amino não originarão a desprotecção dos grupos pro20tectores da cadeia'lateral.

Os grupos protector de alfa-amino são aqueles que são conhecidos na técnica como sendo utilizáveis para a síntese dos pêptidos, passo a passo. Incluem-se os grupos protectores de ti po acilo (por exemplo, os grupos formilo, trifluoroacetilo, ace tilo), grupos protectores de tipo uretano aromático (por exemplo, os grupos benziloxicarbonilo (Cbz) e benziloxicarbonilo substituído), grupos protectores de tipo uretano alifático (por exemplo, t-butiloxicarbonilo (boc) isopropiloxicarbonilo, ciclo -hexiloxicarbonilo) e grupos protectores de tipo alquilo (por exemplo, os grupos benzilo, trifenilmetilo). O grupo protector preferido é o grupo Boc. Os grupos protectores das cadeias laterais para a Tyr incluem os grupos tetra-hidropiranilo, tert-butilo, tritilo, benzilo, Cbz, 4-Br-Cbz e 2,6-diclorobenzilo.

O grupo protector das cadeias laterais preferido para a Tyr ê o 2,6-diclorobenzilo. Os grupos protectores das cadeias laterais para Asp incluem os grupos benzilo, 2,6-diclorobenzilo, metilo, etilo e ciclo-hexilo. O grupo protector das cadeias laterais preferido para Asp é o grupo ciclo-hexilo. Os grupos pro tectores das cadeias laterais para Thr e Ser incluem os grupos acetilo, benzoílo, tritilo, tetra-hidropiranilo, benzilo, 2,6-diclorobenzilo e Cbz. O grupo protector preferido para Thr e Ser ê o grupo benzilo. Os grupos protectores das cadeias laterais para Arg incluem os grupos Tos, Cbz, adamantiloxicarbonilo ou Boc. O grupo protector preferido para Arg ê o grupo Tos. Pode proteger-se o grupo amino da cadeia lateral de Lys com os grupos Cbz, 2-ClCbz, Tos ou Boc. O grupo 2-Cl-Cbz ê o grupo preferido para Lys. A selecção do grupo protector da cadeia la teral baseia-se no seguinte: o grupo protector de cadeia?· lateral permanace intacto durante a ligação e não se desintegra durante a desprotecção do grupo protector da extremidade amino ou sob condições de ligação. 0 grupo protector da cadeia lateral deve ser removível após ter-se completado a síntese do pêp tido final, utilizando condições de reacção que não alterem o péptido pretendido.

Efectua-se, geralmente, a síntese em fase sólida a partir da extremidade carboxi, ligando o aminoãcido protegido (cadeia lateral protegida) a um suporte sólido adequado. Forma -se uma ligação éster quando se efectua a ligação a uma resina clorometilada ou hidroximetilada e o péptido pretendido resultante possuirá um grupo carboxilo livre C-terminal. Como alter nativa, utiliza-se uma resina de benzidrilamina ou de g-metilbenzidrilamina, formando-se, neste caso, uma ponte amida e ten do o péptido alvo resultante um grupo carboxamida C-terminal. Estas resinas estão comercializadas e a sua preparação ê descrita por Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Rockford, IL, Pierce Chemical Co., 2^a ed., 1984.

Liga-se o aminoãcido C-terminal Arg, com a cadeia lateral protegida com Tos e com a função alfa-amino protegida com Bõc, â resina benzidrilamina utilizando diversos agentes activa dores, incluindo diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) N-N’-di-isopro pilcarbodiimida e carbonildiimidazol.

Ά seguir â ligação ao suporte de resina, remove-se o grupo protector de alfa-amino utilizando ácido trifluoroacêtico (TFA) ou HCl em dioxano a uma temperatura compreendida entre 0° e 25°C. Adiciona-se sulfureto de dimetilo a TFA, após a introdução de metionina (Met) para suprimir uma possível S-alquila-22ção. Após remoção do grupo protector de alfa-amino, ligam-se, passo a passo, os restantes aminoácidos protegidos, pela ordem necessária para se obter a sequência peptídica desejada.

Podem utilizar-se diversos agentes de activação para as reacções de ligação, incluindo DDC, N,N'-diisopropilcarbodiimida, hexafluorofosfato de benzatriazol-l-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfónio (BOP) e DCC-hidroxibenzotriazol (HOBt). Utilizou-se cada um dos aminoácidos protegidos em excesso (>2,5 equivalentes) e efectuaram-se, geralmente, as reacções de ligação no seio de DMF, ou misturas dos mesmos. Verifica-se em cada uma das fases a extensão em que se realizou a reacção de ligação, por meio da reacção da ninidrina, tal como ê descrito por Kaiser e outros, Ana. Biochem. 34 (1970) 595. Nos casos em que se verificou existir uma ligação incompleta, repe tiu-se a reacção de ligação. Podem efectuar-se as reacções de ligação automaticamente, num sintetizador Vega 250 de Applied Biosystems ou num outro dispositivo comercialmente disponível.

A ciclização cadeia lateral a cadeia lateral sobre o suporte sólido necessita da utilização de um esquema de protec ção ortogonal que possibilite clivagens selectivas nas funções das cadeias laterais dos aminoácidos acídicos (por exemplo,

Asp) e nos aminoácidos básicos (por exemplo, Lys). Pode utilizar-se com esse objectivo o grupo protector da cadeia lateral de Asp, 9-fluorenilmetilo (OFm), e o grupo protector da cadeia lateral de Lys, 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Nestes casos, removem-se os grupos protectores da cadeia lateral do pêptido-resina protegidos com Boc com piperidina em DMF. Efectua-se a ciclização sobre o suporte sólido utilizando diversos agentes de activação incluindo, DCC, DCC/HOBt ou BOP. Efectua-se

-23a reacção HF no pêptido-resina ciclizado tal como anteriormente se descreveu.

Pode efectuar-se a purificação das proteínas sintêti cas, tal como anteriormente se descreveu, para as proteínas produzidas por via recombinante.

Também se podem recuperar as proteínas de Eimeria a partir dos microrganismos, a partir de extractos de proteínas de membranas. Tais métodos podem produzir as proteínas completas de tipo selvagem. Podem produzir-se anticorpos monoclonais para este fim, tal como é descrito por Kohler e Milstein, Nature, (1975) 495, utilizando proteínas de Eimeria, sintéticas ou naturais, como antigene. Podem utilizar-se estes métodos para se purificar o antigene de superfície de Eimeria de 23 KD, da presente invenção.

Podem formular-se uma ou mais proteínas de Eimeria da presente invenção em vacinas que contêm as proteínas e um veículo fisiologicamente aceitável. Os veículos adequados incluem, por exemplo, tampão fosfato de 0,01 a 0,1 M, a pH neutro ou solução salina fisiológica.

Pode intensificar-se a imunidade contra a coccidiose de acordo com duas vias. Em primeiro lugar, pode adicionar-se â vacina um adjuvante ou imunopotenciador. Em segundo lugar, podem administrar-se as proteínas da presente invenção a um animal que se pretenda imunizar numa forma mais alargada, quer como um complexo reticulado quer como conjugados com uma molécula veículo.

Os adjuvantes adequados para a vacinação de animais incluem, mas não se limitam a, Adjuvante 65 (que contêm óleo de amendoim, mono-oleato de manitol e mono-estearato de alumí-24,ν nio); geles minerais, tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e alúmen; agentes tensioactivos tais como hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, brometo de dimetildioc tadecilamónio, N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroximetil)-propanodiamina, metoxi-hexadecilglicerol e polióis plurõnicos; po lianiões, tais como pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico e carbopol; péptidos, tais como o dipêptido mu ramilo, a dimetilglicina e a tuftsina; e emulsões oleosas. Tam bém se podem administrar as proteínas a seguir â incorporação nos lipossomas ou noutros micro-veículos.

A incorporação nos lipossomas ou noutros micro-veícu los proporciona um meio segundo o qual a libertação das vacinas pode ser mantida durante um período mais prolongado. Com a mesma finalidade pode utilizar-se uma bomba, tal como úma bomba osmotica Alza.

Pode intensificar-se a imunogenicidade das proteínas da presente invenção, espeeialmente dos fragmentos mais pequenos ret±culando-as ou acoplando-as a uma molécula veicular imunogénica (isto ê, uma macromolecula que possua a propriedade de despoletar de um modo independente uma resposta imunológica num animal hospedeiro e â qual as proteínas e os fragmentos de proteínas da presente invenção se possam ligar por covalência). Pode ser necessário efectuar a retieulaçâo ou a conjugação com uma molécula veículo devido ao facto de os pequenos fragmentos proteicos actuarem, por vezes, como haptenos (moléculas que são capazes de se ligarem especificamente a um anticorpo mas que são capazes de despoletar a produção de anticorpos, isto é não são imunogênicas). A conjugação desses fragmentos a uma mo lêcula veicular imunogênica torna os fragmentos imunogénicos

-25através do que se designa habitualmente por efeito veicular.

As moléculas veiculares adequadas incluem, por exemplo, proteínas e compostos poliméricos naturais ou sintéticos, tais como polipéptidos, polissacarídeos, lipopolissacarídeos, etc. Um veículo adequado consiste num glicósido designado por Quil A, que foi descrito por Morein et al., Nature, 308 (1984) 457. Dá-se preferência âs moléculas veiculares de proteínas incluindo, mas não se limitando às proteínas do soro dos mamíferos, tais como a hemocianina de moluscos, a gamaglobulina de bovinos ou de seres humanos, a albumina do soro de seres hu manos, de bovinos ou de coelhos, ou derivados metilados ou outros derivados de tais proteínas. O especialista conhecerá, co mo é evidente, outras proteínas veículos. De preferência, mas não necessariamente, a proteína veiculo será uma proteína estranha para o animal hospedeiro no qual se pretende provocar a formação de anticorpos contra as proteínas de Eimeria.

Pode efectuar-se a ligação covalente da molécula vejL culo utilizando métodos conhecidos na especialidade, cuja escolha dependerá da natureza da molécula veículo que se pretende utilizar. Quando a molécula veicular imunogênica ê uma proteína podem ligar-se as proteínas ou fragmentos de proteínas da presente invenção utilizando, por exemplo, carbodiimidas solúveis na água, tais como a diciclo-hexilcarbodiimida, ou glu taraldeído.

Também se podem utilizar agentes de ligação como estes para reticular as proteínas e os fragmentos de proteínas a si proprios sem utilizar uma molécula veicular separada. Esta reticulação na proteína ou nos agregados dos fragmentos de proteína também pode aumentar a imunoganicidade.

-26A administração de uma quantidade eficaz de vacinas da presente invenção pode proteger as aves domésticas contra a infecção pela E. tene11a. Os anticorpos monoclonais contra os antigenes de E. tene11a reagem reticularmente com a E. acervulina e a E. maxima in vitro, indicando que também pode ser con ferida protecção contra estas espécies. Uma dose eficaz de pro teínas ou de fragmentos de proteínas encontra-se compreendida entre cerca de 5 e cerca de 50 microgramas/Kg de peso do corpo do animal vacinado. Dã-se preferência a uma dose compreendida entre cerca de 25 e cerca de 50jig/Kg. Também se dã preferência a vacinações iniciais seguidas de vacinações de reforço adrnini^ tradas uma a várias semanas depois. Podem administrar-se múltiplas inoculações de reforço. As dosagens destas inoculações de reforço estão geralmente compreendidas entre cerca de 5 e 50 jig/kg, de preferência entre cerca de 20 e 50^ig/kg. Podem utilizar-se as vias de administração convencionais, tais como a via subcutânea, a via intradérmica, a via intramuscular, a via oral, a via anal ou a administração in ovo.

A apresentação dos antigenes coccidiais da presente invenção aos sistemas imunitários das aves também pode ser intensificado por elonagem dos genes que codificam para os antigenes nas bactérias (por exemplo, E. coli ou salmonela) ou em vírus (por exemplo, vírus da varicela ou vírus do herpes) e pe la administração do sistema vector vivo ou, se adequado, na sua forma inactivada, ãs ' aves, por via oral, por injecção ou de acordo com outras vias comummente utilizadas. Carbit et al., in VacCines. Cold Spring Harbor Laboratory, 1967, pp. 68-71, descreveram a utilização de E. coli, enquanto Clements, Pathol. Imunopathol. Res. (1987) 137 descreveu a utilização da Salmo»»

-27.,¢Λ

X

ί.

•ή.

nella, Moss et al. , Anil. Rev. Immunol., _5 (1987) 305 descreveram a utilização de sistemas de vectores virais empregando vírus recombinantes da varicela.

Pode utilizar-se uma espécie de vírus da varicela, o vírus vacinia para se ensaiar a libertação de entigene coccidianos numa cultura de células e em animais. Descobriu-se de que para estudos analíticos o vírus vacinia era mais eficaz do que o vírus da varicela nas aves, um outro veículo de vírus da varicela que se pode utilizar. Isto deve-se ao facto de o vírus vacinia se multiplicar mais rapidamente do que o vírus das aves e ter um alcance em relação aos hospedeiros que não se limita âs células de aves de capoeira. Podem inserir-se grandes quantidades de ADN heterõlogo no genoma virai de vacinia sem se inibir a maturação virai e o grau de infecção /7 Smith et al., Gene, 25 (1983) 21J7. A inserção e expressão de genes heterõlogos múltiplos utilizando o vírus despoleta a produção de anticorpos contra oa antigenes expressos nos animais infec tados ^Perkus et al. , Science, 229 (1985) 981J7.

Podem adaptar-se facilmente as técnicas utilizadas para se produzirem vírus vacinia recombinantes de acordo com procedimentos de rotina a sistemas de vírus de varicela das aves ou de vírus herpes. Pode preparar-se um vírus recombinante que compreenda um ADN que tenha uma sequência nucleotídica que codifique uma proteína da presente invenção por:

a) inserção de um ADN que tenha uma sequência nucleotídica que codifique a referida proteína no genoma de um vírus sem inibir a maturação virai e o grau de infecção;

b) amplificação do referido vírus recombinante numa cul

-28tura de células; e

c) purificação do vírus recombinante a partir do meio de cultura.

A utilização de vírus recombinantes como veículos nas vacinas contra a coccidiose é especialmente vantajosa devido ao facto de as aves vacinadas desenvolverem uma imunidade contra o antigene coccidiano e o veículo virai (isto é, essas vacinas são bivalentes) . Pode posteriormente aumentar-se a utjL lidade dessas vacinas inserindo genes adicionais nos vírus veí culo. Por exemplo, podem inserir-se partes do genoma virai da doença de Newcastle, conjuntamente com um gene do antigene coc cidiano num vírus da varicela das aves, conferindo, deste modo, uma imunidade contra a doença de Newcastle, contra a cocci diose e contra a varicela das aves, apenas com uma única vacina.

Pode efectuar-se a administração de vacinas com vectores vivos da presente invenção de acordo com numerosos métodos conhecidos na especialidade. Pode, por exemplo, utilizar-se o método do arranhão comummente utilizado para se vacinar as aves contra o vírus da varicela. Este método consiste em arranhar ou ferir a pele do tecido conjuntivo da asa com uma agulha cortante mergulhada na vacina. A agulha possui habitual mente um orifício próximo da extremidade, tal como uma agulha de uma maquina de costura, que transporta uma gota de vacina.

De um modo alternativo, podem injectar-se as vacinas vivas por via subcutânea ou por via intradêrmica no tecido conjuntivo da asa ou em qualquer outro local.

Também se pode adicionar as vacinas de vectores vivos /29 (

'^H<ax'M'T_-r=-’T^r recombinantes â agua de beber ou podem ser mesmo pulverizadas sobre as aves que se pretendem vacinar. Também podem ser administradas na alimentação, de preferência após o ancapsulamento de protecção /Balançou et al., Nature, 322 (1986) 373/7, ou no ovo. De acordo com este último método, as vacinas virais são injectadas directamente nos embriões das aves /sharma, Avian Dis. , 25 (1985) 1155/?.

EXEMPLOS

Consideram-se toas as referências aqui citadas incorporadas na presente invenção na sua totalidade.

Salvo indicação em contrário, as percentagens apresentadas adiante para os sólidos em misturas sólidas, líquidos em líquidos e sólidos em líquidos são expressas respectivamente, numa base p/p, v/v e p/v.

Purificação de Merozóitos

Recolheram-se merozóitos de E. tenella a partir do cego de 50 frangos infectados (com 3 semanas de idade, Hubbard Cross; Avian Servicas, Frenchtown, NJ), 5 dias após a infecção com 50 000 dos anteriores oocistos esporulados/ave. Podem utilizar-se aves semelhantes provenientes de outras fontes. Removeram-se os cegos e lavaram-se com solução salina de fosfato tampão (PBS) durante 15 minutos num agitador magnético. Remove ram-se parcialmente os detritos epiteliais por centrifugação a baixa velocidade (50 x g) e recuperaram-se os merozóitos brutos por centrifugação a 2.000 x g, a 4°C durante 10 minutos. Efec-31) tuou-se uma suspensão do sedimento em Tampão de Lise (8,29 g/1 de NH₄C1, 0,372 g/1 de Na^EDTA, 1,0 g/1 de KHCC>₃, a pH7,6) e incubou-se em gelo durante 30 minutos. Recolheram-se os merozõitos por centrifugação, lavaram-se uma vez com PBS e fizeram -se passar através de uma coluna que continha 1,0 g de fibra de nylon enrolada (Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories, Deerfield, IL) num funil de separação. Recolheram-se os merozõitos por centrifugação tal como anteriormente se referiu e congelaram-se em neve carbónica para se isolar o ARN ou para se purificar posteriormente em dietilaminocetil-celulose (DEAE, Whatman DE52, Whatman Bio Systems, Inc., Clifton, NJ) para se efectuar a análise de mancha de Western.

Para se efectuar a purificação em celulose DEAE, apli 9 caram-se aproximadamente 1 x 10 merozoitos numa coluna com um volume de leito de 10 ml e aluiu-se com PBS. Recuperaram-se os merozõitos nos primeiros 100 ml que passaram através de coluna essencialmente isentos de glõbulos vermelhos e de outros detri tos celulares.

Imunoprecipitação. das. Proteínas de Superfície Marcadas com . I

Marcaram-se as proteínas de superfície dos merozõi125 tos purificados com I de acordo com o método de IODOGEN (Pier ce Chemical Co.)_t òu: utilizando IODOBEADS (Pierce Chemical Co.). Para se levar a efeito o último procedimento lavaram-se 4 IODOBEADS 3 x com fosfato de sódio 0,2 M, a pH 7,5 e adicionou-se

125 a 3 mCi de I-Na e incubou-se durante 5 minutos a temperatu 8 ra ambiente. Adicionaram-se merozõitos purificados (3 x 10 ) em 200 ul de PBS, a pH 7,0, ao recipiente de reacção e continuou-se

-31a incubação durante 15 minutos. No final da incubação, adicionou-se fluoreto de fenilmetano-sulfonilo (PMSF) numa concentra ção final de 5mM.

Recolheram-se os merozóitos marcados da mistura de incubação por centrifugação a 12 000 x g durante 30 segundos e solubilizaram-se em 1 ml de dodecilsulfato de sódio a 2% (SDS) ou Triton X-100 a 1% em PBS, a pH 7,0. Removeu-se o material insolúvel por centrifugação durante 3 minutos a 12 000 x g. Dialisaram-se as proteínas solubilizadas contra 3 litros de

PBS, a pH 7,0, a 4°C utilizando uma membrana de peso molecular ~ 125 de admissao de 3 500 para se remover qualquer I residual LL •c 125 vre. As proteínas marcadas com I (habitualmente cerca de θ

1,5 x 10 cpm incorporado na proteína) foram armazenadas a 4°c até serem utilizadas. A radioactividade precipitãvel de TCA en contra-se habitualmente num excesso de 95% da radioactividade total.

Prepararam-se os merozóitos fixos com glutaraldeído contra o antissoro de coelho conforme se segue:

Efectuou-se uma suspensão de aproximadamente 1 x 10 merozóitos, purificados, em glutaraldeído a 1% em PBS e incuba ram-se â temperatura ambiente durante 5 minutos. Recolheram-se por centrifugação a 2000 x g durante 5 minutos os parasitas fi xos, lavaram-se três vezes com PBS e voltou a efectuar-se uma nova suspensão em 1 ml de PBS. Administraram-se a coelhos bran cos da Nova Zelândia múltiplas injecçÓes intradêrmicas na pele da parte posterior com um total de 0,5 ml de solução de parasi ta fixo emulsionado com 0,5 ml de adjuvante completo de Freund. Administrou-se aos coelhos duas injecções de reforço contendo a mesma proteína de parasita em adjuvante incompleto de Freund, •32sf com duas semanas de intervalo. Recolheu-se o sangue da veia da orelha duas semanas após a última inoculação de reforço e obteve-se o soro que continha os anticorpos por centrifugação das amostras de sangue coagulado durante 15 minutos a 2500 x g.

Diluiram-se amostras de proteínas marcadas para imu5 noprecipitaçao (5 yil, contendo 5 x 10 cpm) em 100 yil de tampão IP (NP-40 a 0,25%, Tris-HCl 20 mM, a pH 7,5, NaCl 0,15 M) que se clarificou previamente por incubação durante 20 minutos em gelo com 5 ^jig de proteína Staph-A (Pansorbin/^Calbiochem

Corp., San Diego, CA) e incubou-se durante várias horas a 4°C com 5 a 10 jil de soro de coelho anti-merozóito. Recolheram-se os complexos de anticorpos de acordo com uma segunda incubação com 5 jil de proteína Staph-A durante 2 0 minutos em gelo e centrifugou-se durante 15 segundos numa centrífuga de Eppendorf. Lavaram-se 4 vezes os sedimentos com tampão IP e eluiram-se as proteínas marcadas imunoprecipitadas pelo reagente do anticorpo a partir do complexo, por aquecimento a 100°C durante 5 minutos, em tampão de amostras de gel de SDS (Tris 65 mM, a pH $-r

6,8, SDS a 0,5%,

-mercaptoetanol a 5%, glicerol a 10%, azul de bromofenol a 0,1%). Efectuou-se a análise SDS-PAGE tal como ê descrito por Laemmli,· Mature, 227 (1970) 680.

Confirmaram-se os resultados obtidos com o anti-soro de coelho utilizando soro de frangos imunizados preparado conforme se segue:

Imunizaram-se frangos por infecção repetida com oocísí tos esporulados viáveis de E. tenella (100 000 oócistos fornecidos 3 vezes com intervalos de 2 semanas). Recolheu-se o sangue por punção cardíaca e separou-se o soro que continha os an ticorpos, dos detritos coagulados por centrifugação consecuti-33-

va a 2500 x g durante 5 minutos.

Efectuaram-se os estudos comparativos nos quais se utilizaram o soro de coelho anti-merozõitico e o soro de frango imunizado, para imunoprecipitar (1) as proteínas de superfície dos merozõitos de' Eimeria marcados com I e (2) os pro dutos in vitro da transferência de ARN dos merozóitos que continham a região poli(A). Depois, submeteram-se as proteínas precipitadas a uma analise SDS-PAGE e visualizaram-se por fluo rografia utilizando técnicas a reagentes de fluorografia norma lizados.

Estes estudos demonstraram que muitas proteínas de ambas as fontes tinham sido precipitadas por ambos os soros. Deste modo, pode utilizar-se qualquer destes soros para se efec tuar o rastreio de recombinantes genéticos que exprimem proteínas de Eimeria.Por conveniência, utilizou-se, em primeiro lugar, o soro anti-merozoítico de coelho nos procedimentos de rastreio descritos a seguir. No entanto, utilizou-se paralelamente o soro de frangos imunizados para se efectuar o rastreio da biblioteca de cADN, tal como adiante se descreve. Esta operação era essencial para a identificação de proteínas que são provavelmente importantes na resposta imunitária ao organismo infeccioso, devido ao facto de apenas se ter produzido soro de ave como resposta ao estímulo com organismos vivos. Apenas os frangos imunizados apresentaram uma resistência demonstrável a estes organismos.

Para aumentar a especificidade do soro anti-merozoitico de coelho para as proteínas de Eimeria efectuou-se a selecção de anticorpos nos soros, essencialmente tal como ê descrito por Hall e outros, supra. Resumidamente, purificaram-se

os anticorpos específicos para a proteína precursora expressa por um clone de fagos recombinantes (ver adiante), a partir de soro anti-merozoítico de coelho, tal como se segue.

Plaqueou-se o fago positivo a uma elevada densidade e desenvolveu-se a 42°C durante 3,5 horas. Induziu-se a expres^ são da proteína de fusão revestindo a placa com um filtro de nitrocelulose saturado com isõpropiltiogalactósido (IPTG) 10 mM, prolongando a incubação a 37°C durante 6 a 8 horas. Lavaram-se os filtros carregados de entigene em TBS (Tris-HCl 20 mM, a pH 8,0, NaCl 150 mM) e incubou-se durante 8 a 10 horas a 4°C com soro anti-merozoítico em excesso que tinha sido pré-absorvido pelas bactérias hospedeiras E. coli. Lavaram-se 3 vezes os fil tros com TBS para se removerem os anticorpos não específicos.

Eluiram-se os anticorpos que se ligaram especificamente â proteína de fusão nos filtros com 2,0 ml de glicina 0,1 M, a pH 2,6, NaCl 0,15 M (15 minutos a 20°C). Neutralizaram-se imediatamente os anticorpos eluídos com um igual volume de Tris-HC1 0,1 M, a pH 8,0. Depois utilizaram-se os anticorpos seleccionados (daqui em diante designados como anticorpos seleccionados por um anticorpo) na imunoprecipitação dos merozóitos de superfície marcados ou de produtos de transferência in vitro ou como sondas nas analises de mancha de Western da proteína total dos merozóitos. Prepararam-se os soros de controlo utilizando fagos não recombinantes no procedimento de selecção de anticorpos.

Os resultados da mancha de Western e das análises de imunoprecipitação utilizando anticorpos seleccionado pelo anticorpo encontram-se indicados na Fig. 2. Visualizaram-se os pro35/

b dutos da imunoprecipitação de proteínas marcadas, por fluorografia, tal como ê descrito por Bonner et al., Eur. J. Biochem, 46 (1974) 83. Os números à direita da figura indicam as posições das proteínas indicadoras do peso molecular que possuem os pesos indicados em Kilodaltons.

painel A da Fig. 2 indica uma mancha imunológica das proteínas totais do merozõito sondado com controlo (a) ou por anticorpos seleccionados pelo anticorpo (b). 0 painel B in dica as proteínas de superfície dos merozõitos marcadas com ¹²⁵i que se imunoprecipitaram com controlo (a) ou com anticorpos seleccionados pelo anticorpo (b).

Isolamento e Transferência in vitro do mAPN dos Merozõitos

Descongelaram-se agregados de merozõitos congelados 9 10 contendo 1 x 10 a 1 x 10 organismos em 10 ml de tampão TEL/ /SDS (Tris-HCl 0,2 M, LiCl 0,1 M, EDTA 25 mM, dodecilsulfato de sódio (SDS) a 1% (p/v), a pH 8,8) contendo ditiotreitol (DTT) 1 mM e 300 unidades de RNasin (Promega Biotec, Madison, WI) e homogeneizaram-se com 10 a 12 golpes num homogeneizador de tecidos revestido de teflon. Separaram-se os detritos inso lúveis por centrifugação a frio a 3 QQQ x g. Extraiu-se o sobrenadante fluido duas vezes com uma mistura de fenol/cloroformio/ãlcool isoamrlico (24;24;1, v/v) que se tinha equilibra do com tampão TEL.

Digeriu-se a fase aquosa com 100 mg/ml de protemase K a 37°C durante 30 minutos e reextraiu-se com igual volume de fenol/clorofórmio (1:1) e precipitou-se o ãcido nucleico com dois volumes de etanol durante 1 hora em neve carbónica ou du-36-.

/' rante uma noite a -20°C. Após centrifugação a 10 000 x g duran te uma hora efectuou-se nova suspensão do agregado em TE (Tris 10 mM, a pH 7,5, EDTA 2 mM) e fez-se girar através de uma almo fada de 4 ml de CsCl (CsCl 5,7 M, EDTA 0,1 M) a 150 000 x g du rante 20 horas a 15°C. Efectuou-se nova precipitação do agrega do de ARN a partir de acetato de potássio 0,2 M com 2,5 volumes de etanol. Fez-se passar este ARN total uma vez sobre celulose oligo-dT para enriquecer em ARN poli(A)⁺, tam como é descrito por Maniatis, supra, pagina 197. Uma produção de 1,9 9 mg de ARN total de 5 x 10 merozóitos continha aproximadamente 20yig de ARN poli(A)⁺.

Utilizaram-se 0,1 a 0,5jig de mARN para programar a síntese da proteína in vitro num lisado reticulocítico de coelho tratado com nuclease (Amersham Corp., Arlington Heigths,

IL or Promega Biotec) enriquecido com 10 a 20yiCi de S-Metio nina por 20 jil de mistura reaccional. Analisaram-se os produtos de transferência in vitro por imunoprecipitação, seguida de SDS-PAGE e visualizada por fluorografia, tal como anteriormente se descreveu, apresentando-se os resultados na Fig. 2,

Painel C.

A pista a do painel C indica a mistura completa de produtos programada pelo ARN merozoítico contendo poli(A). As pistas b, c e d indicam os produtos da transferência imunoprecipitados pelos anticorpos seleccionados por um clone de bacteriófagos recombinantes designado por lambda 5-7 (ver adiante: este clone exprime um gene que codifica a proteína precursora de Eimeria, um outro clone de fagos que reage com o soro antimerozoítico e um clone lambda gtll não recombinante, respectivamente .

Deverá ter-se em conta que a proteína principal, que tem um peso molecular aparente de aproximadamente 30 Kilodaltons, pode ser observada nas pistas a e b da Fig. 2, Painel C. Esta proteína não está presente na pista que contêm as proteí nas totais do merozõito sondadas com anticorpos seleccionados pelo anticorpo (Painel A, pista b), mas pode observar-se uma banda de 23 Kilodaltons neste gel (Painel A, pista b, seta). Uma proteína de 23 Kilodaltons foi também imunoprecipitada pelos anticorpos seleccionados pelo anticorpo a partir das proteínas dos merozóitos maracdas com I, tal como se indica na Fig. 3, painel B, pista b. Estas observações tomadas em con junto sugerem que se pode processar a proteína precursora de 30 Kilodaltons por clivagem proteolítica nos merozóitos maduros, clivagem essa efectuada no antigene de superfície de 23 Kilodaltons.

Preparação de uma Biblioteca de Expressão de CADN de Merozóitos

Efectuou-se a síntese de CADN de cordão duplo a partir de 6jjg de ARN de poli(A)⁺ de merozõito tal como descrito por Gubler et al., Gene, 25 (1983) 263, utilizando transcripta se inversa (BRL, Gaithersburg, MD) para efectuar o alongamento a partir de um precursor oligo(dT) e de RNase H (BRL) e de ADN polimerase I de E. coli (New England Biolabs, Beverly, MA) para sintetizar o cordão complementar. Depois, complementarizou-se o CADN de cordão duplo com ADN polimerase T4 (BRL) e adicio naram-se ligantes Eco RI (GGAATTCC, Collaborative Research Inc., Bedford, MA) após o tratamento com Eco RI metilase (New England Biolabs), seguindo as instruções do fabricante.

-38-s

C

A seguir à digestão com Eco RI, fraccionaram-se os cADNs em Biogel A-50M para se removerem as moléculas ligantes em excesso e os CADNs menores do que aproximadamente 300 pares de bases, tal como ê descrito por Huynh e outros, infra. Depois concentrou-se o cADN por precipitação a partir de etanol.

Preparou-se uma biblioteca em Xgtll (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA) tal como descrito por Huynh et al., in D. Glover (ed.), DNA Cloning A Practical Approach Whashington, D.C. IRL Press, 1985 Vol. I pp. 49-78. Ligaram-se os fragmentos de EcoRI de cADN aos fragmentos receptores de Xgtll defosforilados e digeridos com EcoRI (Stratagene Cloning Systems) e embalou-se o ADN resultante no fago utilizando um conjunto Gigapack''-*' (Stratagene Cloning Systems), seguindo as ins truções do fabricante.

Amplificou-se a biblioteca resultante colocando-a em células hospedeiras Y1088. A percentagem de recombinantes esti mada a partir da relação entre as placas azuis e as placas incolores nas placas X-gal (Maniatis, supra, página 24) na presença de isopropil-tiogalactõsido (IPTG, Sigma Chemical Co.) era de aproximadamente 90%.

Rastreio Imunológico de uma Biblioteca de cADN

Colocou-se a biblioteca de expressão de cADN merozoí tico deZgtll em células Y1090 a uma densidade de aproximadamente 10000 placas por 150 mm de lâmina. Incubaram-se seis de£ tas lâminas durante 3,5 horas a 42°C, recobriram-se com filtros de nitrocelulose previamente embebidos em IPTG 10 mM para induzir a expressão da proteína de fusão P-galactosidade e in

cubou-se durante um período adicional de 4 a 5 horas durante a noite a 37°C. Removeram-se os filtros das lâminas e submeteram -se a diversas lavagens lote a lote com TBS (Tris-HCl 20 mM, a pH 8,0, NaCl 0,15 M). Bloquearam-se os sítios não específicos de ligação de proteínas por incubação em soro de feto de vitela a 20% (FCS) em TBS durante 1 hora â temperatura ambiente.

Depois incubaram-se os filtros durante 1 hora com so ro anti-merozoítico de coelho que tinha sido pré-adsorvido com as células Y1090, a uma diluição de 1:100 em TBS contendo soro de vitela a 20%. Removeram-se os anticorpos não específicos com lavagens sucessivas com TBS, uma das quais continha NP-40 a 0,1%. Incubaram-se os filtros com anticorpos de coelho desen volvidos na cabra e conjugados com peroxidase (BioRad, Richmond·, CA) numa diluição a 1:1000 em TBS mais soro de vitela durante 1 hora à temperatura ambiente. Desenvolveu-se a reacção de cor com 4-cloro-l-naftol (BioRad), seguindo as instruções do fabricante.

Também se utilizou soro de frangos imunizados, para efectuar o rastreio. Este soro foi previamente adsorvido com células Y1090 e utilizou-se na mesma diluição do soro de coelho. Utilizou-se o anticorpo anti-frango desenvolvido no coelho como anticorpo secundário e o anticorpo de coelho desenvolvido na ca bra conjugado com peroxidase de rábano como o anticorpo de detecção. Isolaram-se placas individuais no rastreio secundário utilizando os mesmos reagentes.

Um dos clones que se designou por lambda 5-7, produziu uma proteína que reagiu fortemente com os anticorpos do soro de coelho. Um segundo isolado, 1-5 foi identificado por rastreio com soro de pinto imunizado e verificou-se conter uma inserção

-40/ · /

de cADN das mesmas dimensões das do clone 5-7. A análise da se quência de ADN indicou que estes clones de fagos codificavem o mesmo antigene de merozõito.

Expressão de CADN de' Lambda 5-7 na E. coli

Isolou-se uma inserção de 1,2 kb de lambda 5-7 por digestão com EcoRI e electroforese sobre gel de agarose £ Mania tis et al., supra, pp. 157-170Repararam-se as extemidades EcoRI com polimerase de Klenow na presença de dATP e de dTTP e ligaram-se ligantes de BamHI (GGGATCCC) a ambas as extemidades. Inseriu-se o fragmento modificado em cada um dos três vectores de expressão pDS56/RBSII, pDS56/RBSII,-1 e pDS56/RBSII,-2 no sítio BamHI. Estes três vectores são descritos adiante. Transformaram-se os plasmídeos que continham as inserções em ambos os sentidos possíveis, tal como ê descrito por Mandei et al.,

J. Mol. Biol., 53 (1970) 159 na estirpe M15 de E. coli portadora do plasmídeo pDMI.l compatível. A estirpe M15 de E. coli por tadora dos plamídeos pDS56/RBSII e pDMI.l está descrita no pedido de patente de invenção europeia, publicação N9 316 695.

Construção' de Plasmídeos

Geralmente, os plasmídeos pDS56/RBSII, -1 e -2 contêm o elemento regulável promotor/operador N250PSN250P29 e os sítios de ligação ribossõmicos RBSII, RBSII(-1) e KBSII(-2), respectivamente. Estes sítios de ligação aos ribossomas derivam do sítio de ligação aos ribossomas do promotor P_G25 bac teriõfago T5 de E.' coli /pedido de patente de invenção euro-41peia, publicação N9 207 459 J? e foram obtidos através da síntese do ADN.

Devida â elevada eficácia de expressão, os plasmídeos anteriormente mencionados apenas se podem manter nas células de E. coli se se reprimir o elemento promotor/operador ligando o repressor lac ao operador. O repressor lac encontra-se codificado no gene lacl. Pode reprimir-se eficazmente o elemento N250PSN250P29 apenas quando se encontra presente um número suficiente de moléculas repressoras nas células. Por isso, utili^ zou-se o alelo lacl^g que contêm um promotor mutante responsãvel por uma expressão aumentada do gene repressor. O alelo lacl'·' encontra-se presente no plasmídeos pDMI.l, tal como se descreve adiante.

Para além do gene lac I, o plasmídeo pDMI.l é portador do gene da neomicina-fosfotransferase, que confere resistência à canamicina âs bactérias e que se utiliza como um indi cador de selecção. O plasmídeo pDMI.l ê compatível com os plajs mídeos pDS56/RBSII, -1 e -2. As células de E. coli transformadas com os vectores de expressão pDS56/RBSII, -1 e -2 devem conter pDMI.l para garantir que o vector de espressão se conser varã estável nas células. Consegue-se a indução deste sistema adicionando IPTG ao meio.

Plasmídeo pDS 56/KBS I1

A parte do plasmídeo pDS56/RBSII que se situa entre os sítios de clivagem de restrição para Xbal e Xhol e que contêm a região de replicação e o gene para ^-lactamase (que confere resistência â ampicilina âs células) (Figs. 4 e 5) deriva

-42originalmente do plasmídeo pB.R322 X Bolívar et al,, Gene, 2_ (1977) 95-113; Sutcllffe,' Cold' Spring Harbor Symp,' Quarit'. Biol., 43 (1979) 77-90 J.

No entanto, o gene para a ^-lactamase estã modificado por eliminação dos sítios de clivagem para os enzimas de restrição Hincll e PstI. Estas alterações na sequência do ADN não têm qualquer efeito na sequência de aminoácidos de lacta mase. A parte restante do plasmídeo transporta o elemento regu lãvel promotor/operador N250PSQp29 seguido do sítio de ligação aos ribossomas RBSII que faz parte de um fragmento EcoRI/BamHl, sítios de clivagem para os enzimas de restrição Sall, PstI e HindIII, o terminador t do fago lambda de E. coli ^TSchwarz el al., Nature,272 (1978) 410-414 J o gene isento de promotor de cloranfenicol-acetiltransferase £ Marcoli et al., FEBS-Letters, 110 (1980) 11-14 J e o terminador tl do operão rrnB de E. coli ^*Brosius et al., J, Mol. Biol·.,148 (1981) 107-127

Plasmídeo pPS56/RBSII (-1)

O plasmídeo pDS56/RBSIl(-1) (figs. 6 e 7) ê semelhan te ao plasmídeo pDS56/RBSII mas contêm o sítio de ligação ribos sõmico RBSII(-1).

Plasmídeo pDS56/RBSII (-2)

O plasmídeo pDS56/RBSII(-2) (Figs, 8 e 9) ê semelhante ao plasmídeo pDS56/RBSII mas contêm o sítio de ligação aos ribossomas RBSII(-2).

A diferença entre estes três plasmídeos reside no facto de diferirem num nucleotido a seguir ao codão de iniciação ATG originando a expressão da proteína a partir das três sequências de transcrição potenciais.

-43-,

..-s>

Plasmídeo pDMI.1 plasmídeo pDMI.l (Figs. 10 e 11) transporta o gene para a neomicina-fosfotransferase a partir do transposão Tn5 /2Beck et al. , Gene, 19 (1982) 327-336/7 que confere resistência â canamicina âs células de E. coli e o gene lacl /Farabough, Nature,274 (1978) 765-769/7*' com o promotor de mutação /Calos, Nature,274(1978) 762-765/7 que codifica o repressor lac. Para além disso, o plasmídeo pDMI.l contêm uma região do plasmídeo pACYCl84 /* Chang e Cohen, J. Bacteriol., 134(1978) 1141-1156/7 que contêm toda a informação necessária para a replicação e a transmissão estável às células filhas.

Deverá considerar-se que para além dos plasmídeos an teriormente descritos qualquer sistema de expressão de E. coli é considerado util nesta experiência.

Desenvolveram-se os transformantes bacterianos a 37°C LB /Maniatis, supra, página 68/7 e induziu-se a expressão da proteína por adição de IPTG 1 mM ao meio. Apõs incubação durante 1 hora, tomaram-se amostras de 1 ml e recolheram-se as células nas amostras por centrifugação. Trataram-se os agregados celulares tal como é descrito por Crowl e outros, supra, e submeteram-se os lisados a SDS-PAGE.

A seguir à electroforese coraram-se as proteínas nos geles com azul brilhante de Coomassie ou transferiram-se para membranas de nitrocelulose para efectuar a análise de mancha de Western /^TOwbin' et al., Proc'.’ Natl. Acad. Sei. USA, 76 (1979) 4350 Burnetti, Anal. Bio chem.,112 (1981) 195/7, utilizando o soro anti-merozoítico de coelho, tal como anteriormente se descre veu.

Esta análise demonstrou que uma molécula de cADN de

-441,2 kb num sentido nas três sequências de transcrição produziu uma proteína que migrou com um peso molecular aparente de apro ximadamente 30 kilodaltons e que reagiu com os anticorpos do soro anti-merozoítico de coelho. Este facto ê consistente com a presença de codões de paragem nas três sequências de transcri ção que precedem o codão de iniciação ATG no nucleótido 68 na sequência de cADN, tal como se indica na Fig. 1.

Analise da Sequência de ADN

Geralmente, o isolamento em pequena escala de ADN pias mídico a partir de: 1 ml de culturas saturadas durante a noite, efectua-se utilizando o procedimento de Birnboim et al., Nucleic Acids Research, J_(1979) 1513. Este procedimento permite o isola mento de uma pequena quantidade de ADN a partir de uma colónia bacteriana para fins analíticos. Prepararam-se quantidades maiores de ADN plasmídico utilizando culturas de 1 litro seguindo um protocolo normalizado com centrifugação com cloreto de cesio /‘Maniatis, supra, página 93/?.

Determinou-se a sequência de ADN da inserção de cADN EcoRI de 1,2 kb a partir de lambda 5-7 conforme se segue. Digeriu-se a inserção com EcoRI, isolou-se em gel e ligou-se ao pla^ mídeo pEV-vrf digerido com EcoRI descrito por Crowl et al., Gene, 38/1985) 31. Designou-se este plasmídeo por pEV/5-7 e utilizou-se para se propagar a inserção de cADN de 1,2 kb para análise de hibridação (tal como descrito adiante) e na análise sequencial preliminar de ADN de acordo com o método de Zagursky et al., Gene Anal. Tech, 2(1983) 89.

-45/ <ΰ

Para se determinar a sequência completa de ADN subclonou-se posteriormente a inserção de ADN de 1,2 kb nos fagos vectores de cordão único M13, MplS e Mpl9 utilizando o conjunto de sequenciação e de clonagem Bio-Rad M13. Determinou-se a sequência de ADN de acordo com o método de terminação da cadeia didesoxi de Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463 utilizando reagentes e protocolos fornecidos com o conjunto Bio-Rad.

Na Fig. 1 indica-se a sequência nucleotídica completa do cADN de 1,2 kb a partir de lambda 5-7 incluindo as regiões não transferidas das extremidades 5¹ e 3¹. A análise da sequência de um segundo isolado preparado tal como anteriormen te se descreveu utilizando soro de frango imunizado, que se de signou por 1-5, demonstrou que este isolado continha um nucleõ tido adicional, que se indica a seguir, na extremidade 5' e que não possuia o sítio AcoRI da inserção 5-7:

AATTCGCCTTTNCGCTTGCACCCTTTGAGCTTCTTCTCGCCTGGAGACCTTGTGTCTGAAC..:(1-5) AATTCGG.. (5-7)

A parte restante da sequência deste segundo isolado ê idêntica ã de lambda 5-7 a partir da base número 8 até ao início tracto poli-A com excepção para o nucleotido número 300 em que se descobriu que existia um resíduo de citidina em vez de um resíduo de timidina.

A sequência de cADN faz prever uma sequência de trans crição aberta que se estende desde o codão ATG na posição 68 atê ao codão de paragem TAA na posição 668 que codifica os 200 resíduos aminoácidos tal como se indica na Fig. 1.

A dimensão teórica de 24 Kilodaltons para uma proteína de 200 aminoácidos ê ligeiramente inferior â dimensão calculada do produto primário de transferência observado na imunoprecipitação do mARN merozoítico (Fig. 3, painel c, pista b) pelo raegente de selecção do anticorpo e a proteína expressa a partir de cADN dos vectores de expressão de E. coli anterior mente descritos. No entanto, este peso molecular teórico encon tra-se dentro dos limites de variação esperados entre os pesos moleculares teóricos e os pesos moleculares determinados por interpolação relativa de padrões de peso molecular em SDS-PAGE.

A análise da sequência de aminoácidos deduzida da proteína codificada pela inserção de cADN de lambda 5-7 (Fig.l) indica que os primeiros vinte resíduos aminoácidos amino-terminais têm um carácter hidrófobo total que sugere uma possível se quência inicial (signal).

Análise de Hibridação

Isolou-se o ADN a partir de oócistos esporulados desenquistados, a seguir ao tratamento com tripsina e com bílis e lavagem com PBS conforme se segue:

Efectuou-se uma suspensão do material parasitário 9 (aproximadamente 1x10 oocistos) em 20 ml de EDTA 0,5 M, a pH 8,0, sarcosil a 0,5% (Sigma, St. Louis, MO) e digeriu-se com proteinase K (Boehringer-Mannheim, BRD) a 0,lJig/ml durante 2 horas a 50°C, com RNase (10 yig/ml) durante 1 hora a 37°C e novamente com proteinase K durante 1 hora a 50°C. Removeu-se a proteína com 2 extracções com fenol saturado com Tris-HCl 20 mM, a pH 7,5, EDTA 1 mM (TE) e uma extracção com fenol/clorofórmio (1:1). Dialisou-se a fase aquosa extensivamente contra TE e concentrou-se por precipitação com etanol. Obteve-se uma

-4Ί-.

produção típica de 0,4 mg de ADN por 1x10® oécistos.

Digeriu-se o ADN parasitário com diversas endonucleases de restrição seguindo as instruções dos fabricantes e resolveram-se os fragmentos de ADN resultantes por electroforese a 40 V durante 2,5 horas em agarose a 0,8% em tampão de Loening (4,7 g de Na^PO^, 4,36 g de Tris alcalino, 0,372 g de N&2EDTA por litro, a pH 7,6). Tratou-se o gel com HCl 0,25 M durante 30 minutos e transferiu-se para uma membrana Zeta-Probe (Bio-Rad) em NaOH 0,4 M durante uma noite. Neutralizou-se o filtro em 2 x SSC (pH 6,8) e cozeu-se durante uma hora a 80°C sob vazio.

Prê-hibridou-se o filtro durante 3 horas a 65°C em SDS a 7%, BSA a 1% (fracção V, Boehringer), tampão de NaHPCy 0,5 M, a pH 7,2. Isolou-se a inserção EcoRI do gene 5-7 sobre gel a seguir ã digestão do plasmídeo pEV/5-7, tal como anterior mente se descreveu, com EcoRI e marcou-se por recozimento aleatório com o fragmento de Klenow, na presença de desoxinucleõtidos marcados com P. Separou-se a inserção marcada dos nucleétidos não incorporados em colunas giratórias (Bio-Rad) desnaturaram-se e adicionaram-se â solução de hibridação. A seguir ã ~ o incubaçao durante 12 horas a 65 C lavaram-se 3 vezes os filtros com 2 x SSC/SDS a 0,1% e duas vezes com 0,1 x SSC/SDS a 0,1% a 65°C. Detectaram-se os fragmentos de ADN genómico hibridados com a sonda, por auto-radiografia. Apesar de se ter aqui utilizado o plasmídeo pEV/5-7, deve considerar-se que qualquer vector equivalente que contenha a inserção de cADN de 1,2 kb do ge ne 5-7 merozoítico também pode ser utilizado de um modo iguàlmente aceitável.

Indicam-se na Fig. 3 os resultados desta análise onde se podem observar os resultados da digestão com PvuII (1), HincII

-4( (2), PstI (3), Sphl (4) ou Saci (5).

Detectaram-se fragmentos de ADN genómico de 6,5 e de 3,6 Kb a seguir â digestão com PvuII e Saci, respectivamente, nas pistas 1 e 5. Uma vez que não existem sítios para estes en zimas no clone de cADN, pode calcular-se que as dimensões mãxi mas para o gene de Eimeria seja de 3,6 kb. A digestão do ADN genómico com EcoRI produziu um fragmento genómico de 1,2 kb que correspondia em tamanho ao fragmento de cADN. Uma dupla di gestão com HincII e com EcoRI produziu um fragmento de 0,9 kb preconizado a partir da sequência de cADN estreitamente franqueada pelos sítios EcoRI.

Detectaram-se estes três fragmentos a seguir à diges tão com Pstl (pista 3). Preconizaram-se dois sítios PstI a par tir da sequência de cADN que produziria um fragmento interno de 305 pb e dois fragmentos unidos. O aparecimento de um terceiro grande fragmento PstI é provavelmente o resultado da digestão incompleta dos sítios PstI internos.

O diagrama dos fragmentos produzidos por Sphl (pista 4) que também corta duas vezes o cADN não proporciona uma informação definitiva. 0 pequeno fragmento interno Sphl preconizado a partir da sequência de cADN podia não ter sido detectado neste gel.

Numa analise de mancha de Northern /TAlwine et al., Proc. Natl. Acad. S'ci'.' USA,' '74 (1977) 5350J7 de mARN contendo poli(A) isolado de merozõitos, o fragmento de cADN de 1,2 kb do gene lambda 5-7 hibridou-se com uma única espécie de mARN de aproximadamente 1,3 kb de extensão. A partir da correlação da extensão torna-se evidente que o clone 5-7 conjuntamente com a extensão da extremidade 5¹ determinada a partir do isolado 1-5

-49anteriormente mencionado representa a extensão total da sequên cia de cADN, com a possível excepção dos nucleõtidos da extremidade 5 ’.

Tomadas em conjunto, as observações antecedentes são consistentes com a co-linearidade das sequências genómicas e de cADN.

especialista verificará que é possível efectuarem-se diversas modificações e variações na presente invenção sem, contudo, sair do âmbito e espírito da mesma. Os aspectos específicos aqui descritos destinam-se apenas a exemplificar a pre sente invenção que apenas se encontra limitada nos termos das reivindicações em anexo.

Claims (13)

1. REIVINDICAÇOES

   1.- Processo para a preparação de uma proteína possuin do um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigénicos de um antigene de superfície merozoito de Eimeria_r cujo antigene de superfície tem um peso molecular aparente de cerca de 23 quilodaltons por SDS PAGE e é derivado a partir de uma proteína precursora com um peso molecular aparente de cerca de 30 quilodaltons por SDS PAGE e cuja proteína é substancialmente isenta de outras proteínas de Eimeria, caracterizado pelo facto:

   a) de se cultivar um microrganismo transformado contendo um vector recombinante constituído por um ADN que possui uma sequência de nucleotidos que codifica a referida proteína sob

   -51condições em que o ADN é exprimido; e

   b) de se isolar .a proteína da cultura.
2. 2.— Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado pelo facto de o microrganismo transformado conter um vector recombinante que compreende uma sequência de ADN que codifica uma proteína que possui a sequência de aminoácidos

   K A K S M Z S G I V c A G Z V A A A A A s s. A N. S A A N V r V Z £ S G P Ã V Q- B V P A 2. Z V T R* Λ 2 Z A £ P z Z z ' Z s A z' A— A τ Z A A A Z V Z Q c F N z Z s S tr tt- Q Q τ· S V. B Z. A A G. G A C G. σ .B.' B D. A D B σ ’ 11*· V S Q α A S: B B. B B :< P D τ P A A D £ V* D c V G G Τ' P V S V B P N V D B. V Z. Z. Q- r B tr B Q z F Z £ tr B w T G Q Z z. c V Z V Z. B Ei' Q- s B. P z Z z V A P ' T 'b Q BZ • z D Z A. V V £ s. c z G B £ D C ou uma sua sequência parcial, tal como a sequência parcial em que

   falta essencialmente os primeiros vinte resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos definida anteriormente, ou uma sua proteína equivalente funcional, possuindo uma sequência de amino ácidos que está relacionada com a sequência de aminoácidos referida por anulações, inserções ou substituições'sem alteração éssencialmente das propriedades imunolõgicas da proteína.
3. 3.- Processo para a preparação de um vector recombinan-52te compreendendo um ADN possuindo uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto:

   a) de se inserir um ADN possuindo uma sequência nucleotí dica que codifica a referida proteína num vector;

   b) de se replicar o referido vector num microrganismo; e

   c) de se isolar o vector recombinante a partir do micror ganismo.
4. 4. - Processo para a preparação de um vírus recombinante compreendendo um ADN possuindo uma sequência nucleotídica que co difica uma proteína preparada pelo^- processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto:

   a) de se inserir um ADN possuindo uma sequência nucleotí dica que codifica a. referida proteína no genoma de um vírus, sem inibir o contágio e a maturação virai;

   b) de se amplificar o referido vírus recombinante numa cultura celular; e

   c) de se purificar o. vírus recombinante a partir do meio de cultura.
5. 5. - Processo para a preparação de um microrganismo transformado susceptível de produzir uma proteína tal como definida nas reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto:

   a) de se transformar um microrganismo com um vector re-53,Υ combinante compreendendo um ADN possuindo uma sequência nucleotí dica que codifica’ a referida proteína; e

   b) de se - desenvolver, o microrganismo transformado num caldo de fermentação.
6. 6. - Processo para a preparação de uma vacina para a imu nização de aves domésticas contra a coccidiose, caracterizado pe lo facto de se misturar uma quantidade eficaz, de uma proteína, tal como preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, com um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. 7. - Método para a protecção de aves domésticas contra a coccidiose, caracterizado pelo, facto de se administrar uma quantidade eficaz compreendida entre 5 e 50 jag/Kg de.peso do corpo de uma vacina, constituída, por uma proteína preparada pelo proce£ so de acordo com a reivindicação 1 ou 2. e um veículo fisiológica mente aceitável, a uma. ave.doméstica jovem, susceptível à coccidiose.
8. 8.- Método de acordo com a reivindicação 7, para a protecçãò de aves domésticas contra a coccidiose,. caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz de .uma vacina que contém:

   a) um vírus recombinante compreendendo um ADN que possui uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína tal como de / (f í' finida na reivindicação 1 ou 2, cujo vírus recombinante é suscejo tível· de orientar a expressão do ADN num organismo hospedeiro compatível, e

   b) um veículo fisiologicamente aceitável, a uma ave doméstica jovem susceptível ã coccidiose.
9. 9.- Método de .acordo com a reivindicação 7, caracteriza do pelo facto de a dose eficaz de proteínas ou fragmentos proteí cos estar compreendida.entre 5 e 50 microgramas/Kg de peso do corpo do animal vacinado,, de preferência 25-50 microgramas/Kg.

   .
10. 10.- Método de acordo com a reivindicação 8,.caracterizado pelo facto de o vector de vírus recombinante. ser um vírus de varicela recombinante. tal como um vírus da varicela das aves domésticas recombinante.
11. 11. - Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo facto de se incorporar o passo adicional da administração de vacinações simples ou múltiplas de reforço.
12. 12. - Método para a protecçâo de aves domésticas contra a coccidiose, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz de uma vacina compreendendo uma proteína como definida na reivindicação 1 ou 2 e um veículo fisiologicamente aceitável, in ovo.

    55ί,
13. 13.- Método para a protecção de aves domésticas contra a coccidiose, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz de uma vacina contendo um vírus recombinante compreendendo um ADN possuindo uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína tai como definida na reivindicação 1 ou 2, em que o vector recombinante é susceptível de orientar a expressão do ADN, e um veículo fisiologicamente aceitável, in ovo. .