NO303910B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt protein med immunogene og/eller antigene determinater av et Eimeria merozoitt overflateantigen, DNA, rekombinant vektor og transformert mikroorganisme - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører antigener av protozoiske Eimeria-parasitter. Disse antigener kan tilføres på forskjellige måter for å beskytte fjørfe mot coccidiose.

Coccidiose er en fjørfesykdom som er forårsaket av protozoiske intracellulære parasitter av slekten Eimeria. Sykdommen er endemisk i store intensive fjørfeoppdrettsan-legg. Den beregnede kostnad for kontroll av sykdommen ved hjelp av kjemoterapi overskrider 100 millioner dollar hvert år i USA alene. Utviklingen av resistens mot de kjente anticoccidiale legemidler nødvendiggjør en fortsatt utvikling av nye midler, i en tid da legemiddelutvikling blir stadig dyrere og forbrukeraksepteringen av gjenværende legemiddelrester i dyr til matvarer blir stadig mindre.

Beskyttende immunitet mot naturlig coccidoseinfeksjon er vel dokumentert. Kontrollerte, daglige tilførsler av et lite antall levedyktige oocyster i flere uker har vist seg å resultere i fullstendig immunitet mot en tilført infeksjon av en normalt virulent dose [Rose et al., Parasitology 73:25 (1976); Rose et al., Parasitology 88:199

(1984)] . Oppvisning av ervervet resistens mot infeksjon antyder muligheten av å konstruere en vaksine for å indusere immunitet i unge kyllinger og omgå behovet for kjemiske coccidiostater. Faktisk har et slikt konsept blitt utprøvet i Coccivac®- formuleringen fra Sterwin Laboratories, Opelika, AL.

I den hensikt å fremskaffe en coccidiosevaksine fremstilte Murray et al., europeisk patentsøknad publ. nr. 167.443 ekstrakter fra sprozoiter eller sporulerte oocyster av Eimeria tenella som inneholder minst 15 polypeptider, hvorav mange var assossiert med sporozoitens overflate. Injeksjon av disse ekstrakter i kyllinger reduserte cae-kale lesjoner etter oral inokulering med virulente E. tenella- sporulerte oocyster.

Nyligere beskrev Schenkel et al., US patent nr. 4.650.676, fremstillingen av monoklonale antistoffer mot E. tenella merozoitter. Ved å bruke disse antistoffer identifiserte Schenkel et al. et antall antigener, mot hvilke antistoffene ble rettet. Ved å preinkubere E. tenella-sporozoitter med disse antistoffer og deretter introdusere de behand-lede sporozoitter i tykktarmen hos kyllinger var Schenkel et al. i stand til å vise en viss reduksjon i lesjoner i tykktarmen, sammenlignet med ubehandlede sporozoittkon-troller.

Ved å bruke rekombinant DNA-metodologi har Newman et al.

(europeisk patentsøknad, publ.nr. 164.176) klonet et gen

fra sporozoittstadiet som koder for et 25.000 dalton antigen fra Eimeria tenella. Sera fra kyllinger immunisert ved gjentatte immuniseringer med avlivede E. tenella-sporozoitter immunoutfelte dette antigen fra iodinerte sporocyst-og sporozoitt-membranpreparater. Nyligere har Jenkins [Nucleic Acids Res. 16_:9863 (1988)] beskrevet et cDNA som koder for en del av et 250.000 dalton merozoittoverflate-protein fra Eimeria azervulina. Ekspresjonsproduktet av dette cDNA ble gjenkjent av antiserum mot organismen.

Fremskritt i rekombinant DNA-teknologi har gjort en annen tilnærmelse mulig, dvs. en subenhetvaksine. Eksempler på slike subenhetvaksiner er beskrevet f.eks. i europeisk patentsøknad publ. nr. 324.648, 337.589 og 344.808.

Det er tidligere kjent et immunogent antigen fra Eimeria tenella merozoitter fra EP patentsøknad 135.073 (Schenkel et al.). Imidlertid skiller dette antigen seg vesentlig fra proteinene fremstilt ifølge foreliggnede oppfinnelse, noe som ble vist ved følgende forsøk.

Materiale

Det monoklonale antistoff betegnet 2.03 og 8.03 fra Schenkel ble fremskaffet fra henholdsvis hybridomene HB 8389 og 8388 deponert hos the American Type Culture Collection (ATCC).

CVl-celler infisert med vaccinia-virus rW R3.2 og kanin anti-E. tenella antiserum ble dannet som beskrevet i nevnte publikasjon fra Schenkel et al.

Fremgangsmåte

Fremstilling av lysater av E. tenella sporozoitt og merozoitt- celler og CVl- celler: E tenella sporozoitt-lysat og merozoitt-lysat ble fremstilt ved å sentrifugere parasittene og resuspendere og solubilisere de resulterende pelleter i Laemmli prøve-buffer ved nærvær av beta-merkaptoetanol (Nature 227: 680-4, 1970). Kontroll-lysat inneholdende Mz 5-7-protein ble spesielt fremstilt på tilsvarende måte fra CVl-celler infisert med vaccinia-virus rW R3.2 som forårsaker ekspresjon av Mz 5-7.

Fremstilling av elektroforetisk adskilte lysatproteiner samt overføring av proteiner på nitrocellulose- membraner: Lysater ble overført som angitt i Schenkel et al., bortsett fra at 17,5% SDS_PAGE plategeler ble benyttet i stedet for 12,5% SDS_PAGE plategeler), noe som resulterer i nitrocellulose-membraner med adskilte merozoittprote-iner, adskilte sporozoittproteiner samt Mz 5-7 kontroll-proteinet.

Immunopåvisning av proteiner bundet til nitrocellulosen: Nitrocellulose-membranene ble behandlet som beskrevet i Schenkel et al-dokumentet. Det første inkuberingstrinnet var over natten. Mz 5-7 kontroilmembranen ble inkubet med kanin anti-E. tenella antiserum og merozoitt- og spo-rozoittmembranene ble behandlet med Schenkels monoklonale antistoffer 2.03 (ATCC deponeringsnummer HB8389) og 8.03 (ATCC deponeringsnummer HB8388). Påvisningsantistoffene var affinitetsrenset geite anti-kanin IgG (H+L) eller geite anti-mus IgG (H+L) peroksydase-konjugater.

Resultater

Resultatene fra Western blottene er vist i den medfølg-ende figur 12, og viser at de monoklonale antistoffer ifølge Schenkel ikke binder til Mz 5-7-proteinet fremstilt ifølge foreliggnede oppfinnelse. Resultatene viser også at de monoklonale antistoffer ifølge Schenkel binder seg til et omtrentlig 18 kilosalten stort protein. I tillegg har Mz 5-7-proteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse en molekylvekt på omkring 33 kilodalton.

I figur 12 viser panel A, spor 2 og 3 et E. tenella sporozoitt-lysat og merozoitt-lysat som har blitt omsatt med Schenkel's monoklonale antistoff fra HB8389 (mAb A). Et bånd blir observert i disse spor som er mindre enn 18 kD og som ligger innenfor området til proteinet ifølge Schenkel, noe som indikerer at det finnes et protein som gjenkjennes av mAb A. Spor 4 viser et lysat av infiserte CVl-celler som uttrykker Mz 5-7-proteinet. Dette spor har ingen bånd, noe som viser at mAb A ikke er bundet til Mz 5-7-proteinet. På lignende måte blir det i panel B, som viser Schenkel's monoklonale antistoff fra HB8388 (mAb B), vist i spor 3 og 4 at dette binder seg til det omtrentlig 18 kilodalten store båndet i merozoitt- og sporozoitt-lysatene, og binder seg ikke i spor 2 til Mz 5-7-proteinet.

Panel C er en kontroll som viser at lysatet av rekombinant virus rW R3-2-infiserte celler, som uttrykker Mz 5-7-proteinet fremstilt ifølge foreliggende opfinnelse, faktisk inneholder Mz 5-7-proteinet. Kanin anti-E-tenella-serumet binder til bånd av omtrintlig 33 kilodalton og 23 kilodalton, som vist i spor 2. 33 kilodalton-proteinet er Mz 5-7-proteinet og er prekursoren for 23 kilodalton-proteinet fra Mz 5-7-proteinet, hvorav begge former er tilstede.

Båndet i panel A og B er det samme som Schenkel-proteinet definert som 18+ eller -3 kilodalton, siden Schenkel-proteinet også ble identifisert i et merozoitt-lysat ved å bruke samme mAb'er. Det er også vist i patentet til Schenkel at mAb A og B binder seg til et omtrentlig 18 kilodalton bånd i et E. tenella sporozoitt-lysat. Lysatet og Western blottet blir fremstilt ved metoder som er like dem benyttet i de beskrevne forsøk i Schenkel.

Diskusjon og resultater

De ovennevnte resultater indikerer at mAb'ene A og B ikke gjenkjenner Mz 5-7-proteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, og at siden Mz 5-7-proteinet ikke blir gjenkjent av de mAb's som blinder seg til Schenkel-proteinet, viser dette at Mz 5-7-proteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er forskjellig fra Schenkel-proteinet. Videre ble forsøkene utført under reduserende betingelser slik at proteinene er i denaturert form og deres epitoper eksponert. Dette viser at på ingen steder på Mz 5-7-proteinet er det noe sete hvor mAb'ene A eller B kan binde seg.

I tillegg har ikke Mz 5-7-proteinet samme molekylvekt som

Schenkel-proteinet. Det er vist at i motsetning til det omtrentlig 18 kilodalton store proteinet som bindes av mAb og B, har Mz 5-7-proteinet en molekylvekt på omkring 33 kilodalton og blir etterbehandlet (prosessert) til omkring 23 kilodalton. Det kan finnes ved å sammenligne markørsporene i panel A, B og C, at Mz 5-7-båndene i panel C klart har vesentlig høyere molekylvekt enn de omtrentlig 18 kilodalton tunge bånd bundet av mAb A og B i panel A og B.

Konklusjon

Disse forsøk viser at mAb A og B ifølge Schenkel ikke binder til et lysat inneholdende Mz 5-7-proteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, men binder seg under samme betingelser til et omtrentlig 18 kilodalton stort protein i merozoitt- og sporozoitt-lysater. Dette 18 kilodalton store protein er det samme som er beskrevet i EP patentsøknad 135.073 tilhørende Schenkel et al, hvor det også ble bundet av mAb A og B i et merozoitt- og sporozoitt-lysat.

Basert på det ovenstående eksperimentelle bevismateriale, er Mz 5-7-proteinet forskjellig fra proteinet til Schenkel et al. siden (1) monoklonale antistoffer som binder til Schenkel-proteinet ikke binder til noen steder på Mz 5-7-proteinet, og (2) Mz 5-7-proteinet har en påvist høyere molekylvekt enn Schenkel-proteinet.

Foreliggende oppfinnelse gir en fremgangsmåte for fremstilling av rensede proteiner med én eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter av et Eimeria merozoit overflateantigen, hvilket overflateantigen har en observert molekylvekt på omkring 23 kilodalton ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS PAGE) og er avledet fra et forløperprotein med en observert molekylvekt på omkring 30 kilodalton ved SDS PAGE og hvilket protein er i hovedsak fritt for andre Eimeria-proteiner, hvor proteinet blir kodet av den nukleotidsekvensen som er angitt i krav l"s ingress. Fremgangsmåten er særpreget ved de trekk som går frem av krav l"s karakteriserende del.

Mer spesielt gir foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et protein som er Eimeria merozoit overflateantigenet med en observert molekylvekt på omkring 23 kilodalton bestemt ved SDS PAGE og fragmenter av nevnte protein. Disse proteiner og fragmenter er i hovedsak fri for andre Eimeria-proteiner.

Foreliggende oppfinnelse gir en fremgangsmåte for fremstilling av et protein som er avledet fra forløperprote-inet til Eimeria merozoitt overflateantigenet nevnt ovenfor eller et fragment derav, hvilket forløperprotein har en observert molekylvekt på omkring 30 kilo-dalton bestemt ved SDS PAGE og har aminosyresekvensen vist i fig. 1. Nevnte forløperprotein er i hovedsak fritt for andre Eimeria-proteiner.

Det foretrukne protein fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er det ferdigutviklede Eimeria merozoit overflateantigen-protein med aminosyresekvensen vist i fig. 1, men uten signalpeptidsekvensen ved N-terminalen. Denne signalpeptidsekvens omfatter i hovedsak de første tyve aminosyrer i sekvensen vist i fig. 1. Foreliggende oppfinnelse angår også fremstilling av et funksjonelt ekvivalent protein derav med en aminosyresekvens som er relatert til nevnte aminosyresekvens ved delesjoner, innskudd eller substitusjoner uten i hovedsak å forandre de immunologiske egenskaper av nevnte protein.

Foreliggende oppfinnelse gir videre et DNA som koder for hele eller en del av Eimeria-merozoitt overflateantigenet med en observert molekylvekt på omkring 23 kilodalton eller dets ovenfornevnte forløperprotein, rekombinante vektorer inneholdende og i stand til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA i kompatible vertsorganismer, samt mikroorganismer inneholdende slike vektorer.

Foreliggende oppfinnelse gir en fremgangsmåte for å frem-stille et protein med en eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter av et Eimeria merozoitt-overflateantigen, hvilket overflateantigen har en observert molekylvekt på omkring 23 kilodalton, hvilken fremgangsmåte omfatter: (a) å dyrke en mikroorganisme inneholdende en rekombinant vektor omfattende et DNA med et nukleotidsekvens som koder for nevnte protein, såsom det DNA som har nukleotidsekvensen angitt i fig.

1 eller et fragment derav, under betingelser

hvor DNA-sekvensen eller fragmentet uttrykkes, og

(b) å isolere proteinet fra kulturen.

Foreliggende oppfinnelse gir en fremgangsmåte for fremstilling av proteiner som er egnet i vaksiner for å beskytte fjørfe mot coccidiose, og omfattende en effektiv mengde av ett eller flere av proteinene samt et fysiologisk akseptabelt bæremiddel.

Foreliggende oppfinnelse gir dessuten en fremgangsmåte for fremstilling av proteiner som er egnet i vaksiner for å beskytte fjørfe mot coccidiose, som omfatter et rekombin-antvirus inneholdende en DNA-sekvens som koder for et protein ifølge foreliggende oppfinnelse, hvilket rekombinante virus er i stand til å forårsake ekspresjon av nevnte DNA-sekvens, samt et fysiologisk akseptabelt bæremiddel. Eimeria-proteinene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er viktige vaksineantigener, fordi de ble identifisert ved bruken av antistoff i sera fra dyr som hadde blitt immunisert mot coccidiose-organismen og hadde ut-viklet immunitet mot denne. På grunn av dette er det høyst sannsynlig at disse proteiner spiller en vesentlig rolle i beskyttelsen av fjørfe mot coccidiose.

Oppfinnelsen kan lettere forstås under henvisning til f igurene, hvor: Fig. 1 viser nukleotidsekvensen av 1,2 kb cDNA-molekylet som koder for Eimeria-forløperproteinet gjenkjent av antistoffutvalgte antistoffer fra kanin- og ved kylling-immunsera. Som det kan ses fra fig. 1, ligger nukleotidsekvensen som koder for nevnte forløperprotein mellom ATG ved nukleotid 68 og stoppkodonet TAA ved nukleotid 668 (som koder for 200 aminosyrer). Fig. 1 viser også aminosyresekvensen av Eimeria forløperproteinet utledet fra den fremskaffede nukleotidsekvens. Standard enkeltbokstavfor-kortelser blir brukt for å representere nukleotider og aminosyrer. Betydningene av disse forkortelser kan finnes i standard lærebøker i biokjemi, såsom Lehninger, Princi-ples of Biochemistry, 1984, Worth Publishers, Inc., New York, s. 96, s. 798. Fig. 2 viser resultatene av en SDS PAGE-analyse av forskjellige Eimeria merozoitt-proteiner. Panel A er et immunoblot av totale merozoitt-proteiner probet med kontroll (a) eller antistoff-utvalgte (b) antistoffer. Pilen i panel A indikerer posisjonen for et bånd inneholdende et protein med en molekylvekt på omkring 23 kilodalton. Panel B er et autoradiogram av 125I-overf latemerkede merozoitt-proteiner immunoutfelt med kontroll (a) eller antistoff-utvalgte (b) antistoffer. Panel C viser den fullstendige blanding av produkter dannet ved in vitro translasjonen av merozoitt mRNA (a) og translasjonsprodukter som hadde blitt immunoutfelt med antistoff utvalgt ved å bruke lambda 5-7-klonen (b), antistoff utvalgt ved å bruke en annen fag-klon som dannet proteiner som var reaktive med anti-merozoitt-serum (c) og kontrollantistoff valgt fra merozoittserum ved å bruke ikke-rekombinant fag (d). Båndene ble gjort synlige ved fluorografi. Posisjonene for molekylvektsmarkørene med de angitte molkeylvekter i kilodalton (kDa) er vist til høyre på figuren. Fig. 3 viser resultatene av Southern blot-analyse av Eimeria tenella sporulert oocyste genomisk mDNA, som har blitt for-døyet med PvuII (spor 1), HincII (spor 2), Pstl (spor 3), SphI (spor 4) eller SacI (spor 5). Posisjonene for standard DNA med de angitte størrelser i kb er vist til høyre på figuren. Fig. 4 viser en skjematisk tegning av plasmidet pDS56/RBSII. I dette diagram og i figurene 6, 8 og 10 indikerer forkor-telsene og symbolene B, Bg, E, H, N, P, S, X og Xb henholdsvis spaltningsseter for restriksjonsenzymene BamHI, Bglll, EcoRI, Hindlll, Ncol, Pstl, Sali, Xhol og Xbal. I IS^ i^ l representerer det regulerbare promoter/operator-element N250PSN250P29 :!*•* » **■ »*.*■ *. f representerer det ribosomale bindingssete RBSII, RBSII(-l) og RBSIK-2); y representerer kodende omr åder under kontroll av disse ribosomale bindingsseter; Y / S // f // fA represe nterer et område som koder for seks hist idin-residuer; f 1 f f f f ffi/ Hf " fj representerer terminatorene t0og T1: ~ >t ^ representerer området som er nødvendig for DNA-replikasjon i E.coli (repl.) ;flHH^ representerer de kodende områder for dihydrofolat reduktase (dhfr.), kloramfenikol acetyltrans-ferase (eat), S-lactamase (bla), lac repressor (lacl) og neomycin fosfotransferase (neo). Fig. 5 viser den fullstendige nukleotidsekvens av plasmidet pDS56/RBSII. I denne sekvens er gjenkjennelsessekven-sene av seksjonsenzymene angitt i fig. 4 indikert. Aminosyresekvensen som er vist, representerer den åpne leseramme under kontroll av det ribosomale bindingssete RBSII. Fig. 6 er en skjematisk tegning av plasmidet pDS56/RBSII (-1) . Fig. 7 viser den fullstendige nukleotidsekvens av plasmidet pDS56/RBSII(-1). I denne sekvens er gjenkjenneIses-sekvensen av restriksjonsenzymene angitt i fig. 6 indikert . Aminosyresekvensen som er vist, representerer den åpne leseramme under kontroll av det ribosomale bindingssete RBSII(-1). Fig. 8 er en skjematisk tegning av plasmidet pDS56/RBSII (-2) . Fig. 9 viser den fullstendige nukleotidsekvens av plasmidet pDS56/RBSII(-2). I denne sekvens er gjenkjennelses-sekvensene for restriksjonsenzymene angitt i fig. 8, indikert . Den viste aminosyresekvens representerer den åpne leseramme under kontroll av det ribosomale bindingssete RBSII (-2) .

Fig. 10 er en skjematisk tegning av plasmidet pDMI.1.

Fig. 11 viser den fullstendige nukleotidsekvens av pias midet pDMI.l. I denne sekvens er gjenkjenneIsessekvensene for restriksonsenzymene angitt i fig. 10 indikert. De viste aminosyrer omfatter de åpne leserammer som koder for neomycin fosfotransferase (Met til Phe) og lac-repressoren (Met til Gin; vennligst bemerk dette gens motsatte orien-tering) . Fig. 12 viser sammenligning av fysiske og kjemiske data mellom proteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse og proteiner ifølge tidligere teknikk. Figuren viser en Western blot-analyse av proteiner fra hybridomer samt kanin anti-E-tenella merozoitt-serum. 1 x IO<6>E.tenella merozoitter, 1 x IO<6>E.tenella sporozoitter og CVl-celler infisert med det rekombinante virus rW R3-2 ble adskilt på en 17,5% SDS-PAGE-gel elektroforetisk overført til nitrocellulose og inkubert med monoklonale antistoff eller antiserum.

Som brukt heri, har de følgende uttrykk de følgende betyd-ninger : "Eimeria overflateantigen" betyr et protein med en observert molekylvekt på omkring 23 kilodalton i SDS PAGE, som er tilstede i merozoittstadiet av Eimeria tenella. Dette protein synes å bli dannet ved post-translasjonell behandling av in vivo ekspresjonsproduktet fra et gen med nukleotidsekvensen vist i fig. 1.

"Forløperprotein" betyr et protein med en observert molekylvekt på omkring 30 kilodalton i SDS PAGE. Dette protein er antatt å bli behandlet ved proteolyse in vivo til Eimeria overflateantigenet. Nukleotidsekvensen av et cDNA-molekyl som koder for dette protein og aminosyresekvensen forutsagt fra dette, er vist i fig. 1.

Uttrykket "et protein med en eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter av Eimeria overflateantigenet" betyr et protein med ett eller flere områder eller epitoper som er i stand til å fremskaffe en immunrespons i en immunologisk kompetent vertsorganisme og/eller er i stand til spesifikt å binde til et komplementært anti-stoff, og som tilsvarer epitopene av Eimeria overflateantigenet definert ovenfor. Nevnte protein kan være kodet for av funksjonelle ekvivalenter av nukleotidsekvensen fra fig. 1. Disse funksjonelle ekvivalente proteiner har aminosyresekvenser som er relatert til sekvensen i fig. 1 ved aminosyresubstitusjoner som ikke i hovedsak endrer den immunologiske reaktivitet (dvs. som ikke i vesentlig grad ødelegger immunoreaktive og/eller antigene determinanter).

På grunn av degenerasjonen av den genetiske kode må det forstås at det er mange potensielle nukleotidsekvenser (funksjonelle ekvivalenter) som kunne kode for aminosyresekvensen vist i fig. 1. Man bør også merke seg at nukleotidsekvensene av DNA-sekvensene og fragmentene ifølge oppfinnelsen satt inn i vektorer kan innbefatte nukleotider som ikke er del av de faktiske strukturelle gener, så lenge de rekombinante vektorer som inneholder slike sekvenser eller fragmenter er i stand til å dirigere produk-sjonen i en passende vertsorganisme av et protein eller fragment med én eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter av Eimeria overflateantigenet.

Det er kjent at aminosyresubstitusjoner i proteiner som ikke i vesentlig grad endrer biologiske og immunologiske aktiviteter kan inntreffe, og har blitt beskrevet f,eks, av Neurath et al., i "The Proteins", Academic Press, New York (1979), spesielt i fig. 6 på side 14. De oftest observerte aminosyresubstitusjoner er Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val,

Ala/Glu, Asp/Gly, og omvent.

Slike funksjonelt ekvivalente nukleotidsekvensvariasjoner og aminosyresubstitusjoner av de eksempelvise utførelses-former ifølge foreliggende oppfinnelse ligger innenfor oppfinnelsens område sålenge de resulterende proteiner beholder en eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter av Eimeria overflateantigenet som definert heri.

Andre DNA-sekvenser som koder for aminosyresekvensen fra fig. 1 eller aminosyresekvensene relatert ved substitusjoner kan lett fremstilles ved å bruke passende syntetiske oligonukleotider i primer-rettet setespesifikk mutagenese på det eksempelvise cDNA ifølge foreliggende oppfinnelse (fig. 1) som beskrevet av Morinaga et al. [Biotechnology 2:636 (1984)] .

Uttrykket "fragment" betyr et oligonukleotid eller polypeptid som omfatter en subsekvens av enten en cDNA eller

et av proteinene ifølge oppfinnelsen. Slike fragmenter kan fremstilles ved enzymatisk spalting av de større molekyler ved å bruke restriksjonsendonukleaser for DNA og proteaser for proteinene. Fragmentene ifølge oppfinnelsen er

imidlertid ikke begrenset til produktene av noen form for enzymatisk spalting, men innbefatter subsekvenser hvis termini ikke tilsvarer noen enzymatiske spaltningspunkter. Slike fragmenter kan dannes, f.eks. ved kjemisk syntese, ved å bruke sekvensdataene angitt heri. DNA-fragmenter kan også bli dan-net ved ufullstendig komplementær DNA (cDNA) - syntese fra iso-lert messenger-RNA (mRNA) . Proteinfragmenter kan også bli dannet ved å uttrykke DNA-fragmenter som koder for proteinfragmentene. Slike proteinfragmenter kan være anvendelige i foreliggende oppfinnelse dersom de inneholder et tilstrekkelig antall aminosyreresiduer til å utgjøre en immunoreaktiv og/eller antigen determinant. Generelt er minst omkring 7 eller 8 residuer nødvendig. Som forklart nedenfor, kan det være nødvendig å koble slike fragmenter til et immunogent bærermolekyl for å gjøre dem immunoreaktive.

DNA som er nødvendig for å danne proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan syntetiseres kjemisk ved å bruke nukleotidsekvens-informasjonen gitt i fig. 1. Slik kjemisk syntese kan utføres ved å bruke enhver av de egnede metoder, såsom fosforamiditt faststøttemetoden til

Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)].

Alternativt kan cDNA bli dannet fra Eimeria mRNA. Messenger RNA kan isoleres fra Eimeria merozoitter ved å bruke standard teknikker. Disse mRNA-prøver kan bli brukt for å danne dobbeltkjedet cDNA som beskrevet av Maniatis et al.

[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY] . Dette cDNA kan så bli satt inn i en passende kloningsvektor som kan brukes til å transformere E.coli, for å danne et cDNA-bibliotek.

cDNA-biblioteket kan så bli undersøkt ved å bruke det klonede gen anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse eller fragmenter derav som prober. Slike gener eller fragmenter kan bli radiomerket, f.eks. ved brudd-translasjon ved å bruke Pol I DNA polymerase i nærvær av de fire deoksyribo-nukleotider, hvorav en inneholder<32>P i a-posisjonen (Maniatis et al., supra, s.109), for bruk som prober. Probene kan også fremstilles ved oligonukleotidsyntese basert på den kjente sekvens av cDNA fra Eimeria overflateantigenet.

Selv om Eimeria tenella blir brukt som en mRNA-kilde i eksemplene nedenfor, kan de klonede gener fra denne art bli brukt som prober for å isolere gener fra andre arter av

Eimeria grunnet DNA-sekvenshomologi blant de forskjellige arter.

Når de først er identifisert og isolert, blir Eimeria DNA-sekvensene satt inn i en passende ekspresjonsvektor som inneholder elementene som er nødvendig for transkripsjon og translasjon av de innsatte gensekvenser. Anvendelige kloningsvektorer kan omfatte segmenter av kromosomale, ikke-kromosomale og syntetiske DNA-sekvenser såsom forskjellige kjente bakterielle plasmider, fag-DNA, kombinasjoner av plasmider og fagDNA, såsom plasmider som har blitt modifisert for å anvende fag-DNA, eller andre ekspresjonskontrollsekvenser eller gjærplasmider. Spesifikke kloningsvektorer som brukes innbefatter, men er ikke begrenset til, pEV-vrf-plasmidene (pEV-vrfl -2 og -3 som er beskrevet i Crowl et al., Gene 3_8:31 (1985)); SV40; adenovirus; gjær; lambda gt-WES-lambda B; Charon 4A og 28; lambda-gt-l-lambda B; Ma3-deriverte vektorer såsom pUC8, 9, 18 og 19, pBR313, 322 og 325; pAC105; pVA51; pACY177; pKH47; pACYC184; pUBHO; pMB9; colEl; pSClOl; pML21; RSF2124; pCRl eller RP4; fjørfekopper; vaccinia; et medlem av herpesvirus-familien.

Innsetning av Eimeria-genene i en kloningsvektor kan lett utføres når både genene og den ønskede kloningsvektor har blitt spaltet med samme restriksjonsenzym eller -enzymer, siden komplementære DNA-termini derved blir dannet. Hvis dette ikke kan utføres, kan det være nødvendig å modifi-sere de spaltede ender som blir dannet ved å fordøye tilbake enkeltkjedet DNA for å danne butte ender, eller ved å oppnå samme resultat ved å fylle inn de enkeltkjedede termini med en passende DNA-polymerase. På denne måte kan buttendet ligering med et enzym såsom T4 DNA ligase bli utført. Alternativt kan ethvert ønsket sete bli dannet ved å ligere nukleotidsekvenser (linkere) til DNA-endene. Slike linkere kan omfatte spesifikke oligonukleotidsekven-ser som koder for restriksjonssete-gjenkjennelsessekven-ser. Den spaltede vektor og Eimeria-genene eller fragmentene kan også bli modifisert ved homopolymer forlengelse, som beskrevet av Morrow [Methods in Enzymology 6_8:3

(1979)] .

Mange av kloningsvektorene som kan brukes i foreliggende oppfinnelse inneholder en eller flere markøraktiviteter som kan brukes for å selektere for ønskede transformanter, såsom ampicillin og tetracyklin-resistens i pBR322, ampicillin-resistens og S-galaktosidaseaktivitet i pUC8, og ampicillin-resistens i pEV-vrf-plasmidene. Utvelgelse av vertsceller hvori slike vektorer har blitt satt inn blir vesentlig forenklet når vertscellene ellers mangler akti-vitenene som blir fremskaffet av vektorene.

Det bør være forstått at nukleotidsekvensene fra Eimeria-genene satt inn ved et ønsket sete i en kloningsvektor, kan innbefatte nukleotider som ikke er del av de faktiske strukturelle gener. Alternativt kan genene inneholde deler av det fullstendige vill-type gen. Alt som er nødvendig, er at genfragmentene etter innsetting i en kloningsvektor er i stand til å rette fremstillingen i en passende vertsorganisme av et polypeptid eller protein som har minst en immunoreaktiv og/eller antigen determinant av Eimeria overflateantigenet. Således kan rekombinante vektorer omfattende et DNA med en nukleotidsekvens som koder for et gitt protein bli fremstilt ved: (a) å sette inn et DNA med en nukleotidsekvens som koder for nevnte protein i en vektor, (b) å replikere nevnte vektor i en mikroorganisme og (c) å isolere den rekombinante vektor fra mikroorganismen.

Utvelgelsen av en passende vertsorganisme påvirkes av et antall faktorer kjent i faget. Disse faktorer innbefattter f.eks. kompatibilitet med den valgte vektor, toksisitet av proteinene kodet for av hybridplasmidet, enkelhet ved gjenvinning av det ønskede protein, ekspresjonskarakte-ristika, biosikkerhet og kostnader. En balanse mellom disse faktorer må vurderes, og det må innses at ikke alle vertsorganismer vil være like effektive for ekspresjon av et spesielt rekombinant DNA-molekyl.

Egnede verts-mikroorganismer som kan brukes i foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, plante-pattedyr- eller gjærceller og bakterier som Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermop-hilus og Actinomyces. Escherichia coli stamme MC1061, som er blitt beskrevet av Casadaban et al. [J. Mol. Biol. 138:179 (1980)], kan brukes, eller enhver annen stamme av E.coli

K-12 inneholdende plasmidet pRK248cIts. Plasmidet pRK248cIts for bruk i andre E.coli kontroiIstammer er beskrevet av Bernhard et al. [Meth. of Enzymol. 68:482

(1979)] og er også tilgjengelig fra the American Type Culture Collection under tilgangsmummer ATCC 33766. E.coli-stammen MC1061 er kommersielt tilgjengelig f.eks. fra CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, CA og er også tilgjengelig fra the American Type Culture Collection under tilgangsmnummer ATCC 53338. Plasmidene pDMl.l, pDS/56RBSII, -1 eller -2 for bruk i E.coli-stamme M15 er beskrevet infra.

Overføring av den rekombinante kloningsvektor til vertsc-ellen kan utføres på et antall måter. Avhengig av den spesielle vektor/vertscellesystem som er valgt, kan slik overføring utføres ved transformasjon, transduksjon eller transfeksjon. Når en slik modifisert celle blir dannet, kan cellen bli dyrket og protein ekspresjonsproduktet kan bli isolert fra kulturen.

Transformante kloner som danner forløperproteinet av Eimeria overflateantigenet blir identifisert ved å isolere avskjerme med serum fra dyr immunisert mot glutaraldehydfikserte sporozoiter eller merozoitter fra E. tenella. I eksemplene nedenfor ble kanin-anti-merozoitserum brukt for utvelgelse og karakterisering av genproduktet. Parallelle immunologiske utvelgelser med immun-kyllingserum resulterte i den uavhengige isolasjon av cDNA som koder for merozoit overflate-antigenet. Spesifisiteten av antiseraene som er brukt for immunologisk utvelgelse eller immunoutfelling kan bli øket ved å bruke en variasjon av den antistoffutvelgende metode til Hall et al. [Nature 311:379 (1984)]. I denne metode, som er beskrevet mer fullstendig nedenfor, blir antistoffer som er spesifike for Eimeria proteiner dannet av klonene adsorbert ut på filtere.

Påvisningen av Eimeria antigendannende kloner kan oppnås ved å bruke velkjente standard assaymetoder, innbefattende immunoutfelling, enzym-tilknyttet innumoassay og radio-immunoassayteknikker som har blitt beskrevet i litteratu-ren (se f.eks. Kennet et al. (utg.), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, 1980, Plenum Press, New York, s. 376-384] .

Store mengder av det rekombinante Eimeriaprotein kan dannes ved å dyrke de transformerte mikroorganismer erholdt på denne måte i et fermenteringsmedium omfattende de nødvendige næringsmidler under betingelser som er egnet for ekspresjon av et rekombinant DNA. Som dannet i E. coli foreligger de rekombinante Eimeriaproteiner i cytoplasma eller i inklusjonslegemer. For å frigjøre proteinene er det således nødvendig å ødelegge bakteriens ytre membran. Dette blir utført ved ultralydbehandling eller ved andre, mekaniske ødeleggelsesmetoder, såsom ved å bruke en fransk trykkcelle eller Gaulin homogenisator [Charms et al., Meth. Enzymol. 22, 476-556 (1971)].

Celleødeleggelse kan også utføres ved kjemiske eller enzymatiske metoder. Siden divalente kationer ofte er nødvendig for cellemembranintegritet, kan behandling med passende chelateringsmidler, såsom EDTA eller EGTA vise seg å være tilstrekkelig disruptive for å lette lekkasje av proteinene fra cellene. På lignende måte har enzymer som lysozym blitt brukt for å oppnå samme resultat. Dette enzym hydrolyserer peptidoglycanstammen i celleveggen. Tilføring av osmotisk sjokk kan også anvendes. Kort for-talt kan dette bli utført ved først å plassere cellene i en hypertonisk oppløsning, noe som vil gjøre at de mister vann og krymper. Etterfølgende plassering i en hypotonisk "sjokk"-oppløsning vil så føre til en rask innstrømming av vann i cellene med en utstøtning av de ønskede proteiner.

Når de først er frigjort fra cellene, kan Eimeria-proteinene bli konsentrert ved utfelling med salter såsom natri-um-eller ammoniumsulfat, ultrafiltrering eller andre velkjente metoder for fagmannen. Ytterligere rensing kan ut-føres med konvensjonelle proteinrensningsteknikker, innbefattende, men ikke begrenset til, gelfiltrering, ione-byttekromatografi, preparativ disgel eller slørelektro-forese, isoelektrisk fokusering, lavtemperatur organisk oppløsningsmiddelfraksjonering eller motstrømsfordeling. Rensing kan også utføres med immunoaffinitetskromatografi.

Spesielle metoder for å rense Eimeriaproteiner fra orga-nismene er kjent i faget, se f.eks. Newman et al., europeisk patentsøknad publ. nr. 164.176.

Slik syntese utføres med aminosyrer som er beskyttet ved alfa-amino-terminalen. Trifunksjonelle aminosyrer med labile sidekjeder er også beskyttet med passende grupper som vil forhindre en kjemisk reaksjon fra å finne sted ved dette sted under oppbyggingen av peptidet. Den alfa-aminobeskyttende gruppe blir selektivt fjernet for å tillate den etterfølgende reaksjon å finne sted ved aminotermina-len.

Betingelsene for fjerning av alfa-aminobeskyttende grupper forårsaker ikke deblokkering av de sidekjedebeskyttende grupper.

De alfa-aminobeskyttende grupper er slike som er kjent for å være anvendelig i faget for trinnvis syntese av peptider. Innbefattet er acyltype blokkerende grupper (f.eks. formyl) trifluoracetyl, acetyl), aromatiske uretan-type beskyttende grupper (f,eks. benzyloksykarbonyl (Cbz) og substituert benzylosykarbonyl), alifatiske uretanbeskyt-tende grupper (f.eks.t-butyloksykarbonyl (Boe), isopropy-loksykarbonyl, cykloheksyloksykarbonyl) og alkyl-type beskyttende grupper (f.eks. benzyl, trifenylmetyl). Den foretrukne beskyttende gruppe er Boe. Sidekjede beskyttende grupper for Tyr innbefatter tetrahydropyranyl, tert.-butyl, triyl, benzyl, Cbz, 4-Br-Cbz og 2,6-diklorbenzyl. Den foretrukne sidekjedebeskyttende gruppe for Tyr er 2,6-diklorbenzyl. De sidekjedebeskyttene grupper for Asp innbefatter benzyl, 2,6-dikloorbenzyl, metyl, etyl og cykloheksyl. Den foretrukne sidekjedebeskyttende gruppe for Asp er cykloheksyl. De sidekjedebeskyttende grupper for Thr og Ser innbefatter acetyl, benzoyl, trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-diklorbenzyl og Cbz. Den foretrukne beskyttende gruppe for Thr og Ser er benzyl. De sidekjedebeskyttedende grupper for Arg innbefatter nitro, Tos, Cbz, adamantyloksykarbonyl eller Boe. Den foretrukne beskyttende gruppe for Arg er Tos. Sidekjedeaminogruppen Lys kan beskyttes med Cbz, 2-ClCbz, Tos eller Boe. 2-C1-Cbz-gruppen er den foretrukne beskyttelsesgruppe for Lys. Utvelgensen av den sidekjedebeskyttende gruppe er basert på følgende: Den sidekjedebeskyttende gruppe forblir intakt under kobling og spaltes ikke fra under deblokkering av den aminoterminale beskyttende gruppe eller under koblingsbetingelser. Den sidekjedebeskyttende gruppe må kunne fjernes ved avslutning av syntesen av det endelige peptid ved å bruke reaksjonsbetingelser som ikke vil endre målpeptidet.

Ett eller flere av Eimeriaproteinene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres til vaksiner omfattende proteinene og et fysiologisk akseptabelt bære middel. Egnede bæremidler innbefatter f.eks. 0,01-0,1 M fosfatbuffer av nøytral pH eller oppløsning av fysiologisk saltvann.

Øket immunitet mot coccidiose kan fremskaffes på to måter. I den første kan et hjelpestoff eller en immunopotensiator tilsettes vaksinen. I den andre kan proteinene ifølge oppfinnelsen bli gitt til et dyr som skal immuniseres i en større form, enten som et fornettet kompleks eller konju-gert til et bærermolekyl.

Egnede hjelpestoffer for vaksinering av dyr innbefatter, men er ikke begrenset til, Adjuvant 65 (inneholdende peanøttolje, mannid monooleat og aluminiummonostearat); mineralgeler såsom aluminiumhydroksyd, aluminiumfosfat og alum; overflateaktive midler som heksadecylamin, oktadecy-lamin, lysolecitin, dimetyldioktadecylammoniumbromid, N,N'-dioktadecyl-N',N'-bis (2-hydroksymetyl)propandiamin, metoksyheksadecylglycerol og pluroniske polyoler; poly-anioner såsom pyran dekstransulfat, poly IC, polyakrylsyre og karbopol; peptider såsom myramyldipeptid, dimetylglycin og tuftsin; og oljeemulsjoner. Proteinet kan også tilføres etter inkorporering i liposomer eller andre mikrobærere.

Inkorporering i liposomer eller andre mikrobærere gir en mulighet hvor frigjøringen av vaksinene kan opprettholdes over en forlenget tidsperiode. En pumpe, såsom en Alza osmotisk pumpe kan brukes for samme formål.

Immunogenisiteten av proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen, spesielt de mindre fragmenter, kan økes ved for-netting eller ved kobling til et immunogent bærermolekyl (dvs. et makromolekyl med egenskapen å uavhengig fremskaffe en immunologisk respons i et vertsdyr, til hvilken proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan bindes kovalent).

Egnede bærerraolekyler innbefatter f.eks. proteiner og nøytrale eller syntetiske polymere forbindelser, såsom polypeptider, polysakkarider, lipopolysakkarider osv. Et egnet bæremiddel er et glykosid kalt Quil A, som har blitt beskrevet av Morein et al. [Nature 308:457 (1984)]. Pro-teinbærermolekyler er spesielt foretrukne, innbefattende, men ikke begrenset til serumproteiner fra pattedyr, såsom nøkkelhull-igle-hemocyanin, human eller bovin gamma globu-lin, human, bovin eller kanin serum albumin, eller mety-lerte eller andre derivater av slike proteiner. Andre proteinbærere vil være innlysende for fagmannen. Foretrukket, men ikke nødvendigvis, vil proteinet være fremmed for vertsdyret i hvilket antistoffene mot Eimeria-proteinene skal dannes.

Kovalent kobling til bærermolekylet kan utføres ved å bruke metoder som er velkjente i faget, hvorav det nøyak-tige valg vil være diktert av det anvendte bærermolekyls natur. Når det immunogene bærermolekyl er et protein, kan proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen kobles f.eks. ved å bruke vannoppløselige karbodiimider såsom dicyklohek-sylkarbodiimid eller glutaraldehyd.

Koblingsmidler som disse kan også bli brukt til å fornette proteinene til seg selv uten bruk av et separat bærermolekyl. Slik fornetning til protein- eller proteinfragmentag-gregater kan også øke immunogenisiteten.

Tilførsel av en effektiv mengde av vaksinen inneholdende proteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan beskytte fjørfe mot infeksjon av E. tenella. Monoklonale antistoffer mot E. tenella-antigenene kryssreagerer med E. acervulina og E. maxima in vitro, noe som indikerer at beskyttelse også kan tilføres mot disse arter. En effektiv dose av proteinene strekker seg fra omkring 5 til omkring 50 mikrogram pr. kg kroppsvekt av det vaksinerte dyr. En dose på omkring 25-50^g/kg er foretrukket. Initielle vak- sineringer blir fortrinnsvis fulgt av forsterkningsvak-sineringer gitt fra én til flere uker senere. Multiple forsterkninger kan tilføres. Doseringene for slike forsterkninger ligger generelt fra omkring 5-50j^g/kg, fortrinnsvis omkring 20-50j^g/kg. Standard tilførselsmåter kan brukes, såsom subkutan, intradermal, intramuskulær, oral, anal eller in ovo tilførsel.

Tilføringen av de coccidiale antigener fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse til immunsystemet hos fjørfe kan også bli oppnådd ved å klone gener som koder for antigenene i bakterier (f.eks. E.coli eller Salmonella) eller i virus (f.eks. koppevirus eller herpesvirus) og tilføre det levende vektor system eller, når det passer, dets inakti-verte form til fuglene oralt, ved injeksjon eller via andre vanlig benyttede måter. Carbit et al. [i Vaccines, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 68-71] har beskrevet bruken av E. coli, mens Clemens [Pathol. Immunopathol. Res. 6_:137 (1987)] har beskrevet bruken av Salmonella. Moss et al. [Ann. Rev. Immunol. 5:305 (1987)] har sett på bruken av virale vektorsystemer som bruker rekombinante koppevirus.

En type koppevirus, vaccinia-virus, kan bli brukt for å undersøke avleveringen av coccoidale antigener i cellekultur og i dyr. For analytiske studier har vacciniavirus blitt funnet å være mer effektivt enn fjørfekoppevirus, som er en annen koppevirusbærer som kan brukes. Dette er fordi vaccinia-virus formerer seg raskere enn fugleviruset og har et vertsområde som ikke er begrenset til kylling-celler. Større mengder av heterologt DNA kan bli satt inn i det vaccinia virale genom uten å hemme viral utvikling av infektivitet [Smith et al., Gene 25:21 (1983)]. Innset-ningen og ekspresjonen av multiple heterologe gener ved å bruke viruset, fremskaffer antistoffproduksjon mot ut-trykte antigener i infiserte dyr [Perkus et al., Science 229:981 (1985)].

Teknikkene som er brukt for å danne rekombinante vaccinia-virus kan lett bli tilpasset ved rutinemessige prosedyrer til fjørfekopper eller herpesvirussystemer. Et rekombi-nantvirus omfattende et DNA med en nukleotidsekvens som koder for et aktuelt protein kan fremstilles ved: (a) å sette inn et DNA med en nukleotidsekvens som koder for nevnte protein i genomet hos en virus uten å inhibere viral utvikling og infektivitet; (b) å amplifisere nevnte rekombinante virus i en cellekultur, og (c) å rense det rekombinante virus fra kultur-mediet.

Bruken av rekombinante virus som bærere i vaksiner mot coccidiose er spesielt fordelaktig ved at vaksinert fjørfe utvikler immunitet mot både det coccidiale antigen og den virale bærer (dvs. slike vaksiner er bivalente). Anven-deligheten av slike vaksiner kan økes ved å sette inn ytterligere gener i bærerviruset. For eksempel kan deler av det Newcastle-sykdom virale genom settes inn sammen med et coccidialantigen gen i et fjørfekoppevirus, for derved å tilføre immunitet mot Newcastle-sykdom, coccidiose og fjørfekopper, alt med en enkelt vaksine.

Tilføringen av levende vektorvaksiner kan utføres ved et antall metoder som er velkjente i faget. For eksempel kan "stikke"-metoden som vanligvis blir brukt for å vaksinere fjørfe mot fjørfekoppevirus brukes. Denne metode består i å stikke eller prikke huden i vingevevet med en skarp nål dyppet i vaksine. Nålen har vanligvis et øye nær tuppen lik en symaskinnål, som bærer en dråpe av vaksinen. Alternativt kan de levende vaksiner bli injisert subkutant eller intradermalt i vingevevet eller ethvert annet sted.

De rekombinante levende vektorvaksiner kan også tilsettes til drikkevannet eller til og med sprøytes over kyllinger som skal vaksineres. De kan også tilføres i foret, spesielt etter beskyttene innkapsling [Balancou et al. , Nature 322:373 (1986)], eller in ovo. I sistnevnte metode blir de virale vaksiner injisert direkte i kyllingembryoer [Sharma, Avian Dis. 25:1155 (1985)].

Med mindre annet er angitt, er prosentdeler gitt nedenfor for faststoff i faste blandinger, væsker i væsker, og faststoff i væsker, henholdsvis på w/w, vol/vol og w/vol-basis.

Rensing av merozoitter

Merozoitter av E. tenella ble innhøstet fra caeca i 50 infiserte kyllinger (3 uker gamle Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, NJ) 5 dager etter infeksjon med 50.000 av de ovennevnte sporulerte oocyster pr. fugl. Lignende kyllinger fra andre kilder kan brukes. Caeca ble fjernet og vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) i 15 min på en magnetisk rører. Det epitele avfall ble delvis fjernet ved lavhastighetssentrifugering (50 x g), og de grovrensede merozoitter ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 2000 x g ved 4°C i 10 min. Pelleten ble resuspendert i lyseringsbuffer (8,29 g/l NH4C1, 0,372 g/l Na2EDTA, 1,0 g/l KHCO3, pH 7,6) og inkubert på is i 30 min. Merozoittene ble samlet opp ved sentrifugering, vasket én gang i PBS og passert over en kolonne inneholdende 1,0 g av spunnet nylonfiber (Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories, Deerfield, IL) i en separasjonstrakt. Merozoittene ble samlet opp ved sentrifugering som tidligere og frosset på tørris for RNA-isolering, eller renset ytterligere i dietylaminoetyl-cellulose (DEAE, Whatman DE52, Whatman Bio Systems, Inc., Clifton, NJ) for Western blot analyse.

For opprensning i DEAE-cellulose ble omkring 1 xIO"<9>merozoitter påført i PBS til en 10 milliliters bed volum-kolonne og eluert med PBS. Merozoittene ble gjenvunnet i det første 100 ml av gjennomstrømningsvolumet, i hovedsak fri for røde blodceller og annet cellulært avfall.

Immunoutfelling av 125 I- merkede overflateproteiner Overflateproteinene av rensede merozoitter ble merket med<125>I ved IODOGEN-metoden (Pierce Chemical Co.) eller ved bruk av IODOBEADS (Pierce Chemical Co.). For sistnevnte prosedyre ble 4 IODOBEADS vasket 3 x med 0,2 M natriumfos-fat pH 7,5, 1-3 mBi av125I-Na ble tilsatt og inkubert i 5 min ved romtemperatur. Rensede merozoitter (3 x IO<8>) i 200 ul PBS, pH 7,0, ble tilsatt til reaksjonsbegeret og inku-beringen ble fortsatt i 15 min. Ved slutten av inkuberin-gen ble fenyImetansulfonylfluorid (PMSF) tilsatt til en endelig konsentrasjon på 5 mM.

De merkede merozoitter ble gjenvunnet fra inkuberingsblan-digen ved sentrifugering ved 12.000 x g i 30 sek og solu-bilisert i 1 ml av enten 2% natriumdodecylsulfat (SDS) eller 1% Triton X-100 i PBS, pH 7,0. Uløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering i 3 min ved 12.000 x g. De solubiliserte proteiner ble dialysert mot 3 1 PBS, pH 7,0, ved 4°C ved å bruke en 3.500 molekylvekts cuttoff-membran for å fjerne ethvert gjenværende fritt125I. De<125>I-merkede proteiner (typisk omkring 1,5 x IO<8>cpm inkorporert i proteinet) ble lagret ved 4°C inntil bruk. Den TCA-utfelte radioaktivitet var typisk i overkant av 95% av den totale radioaktivitet.

Kanin antiserum mot glutaraldehydfikserte merozoitter ble fremstilt som følger: Omkring 1 x 10<9>rensede merozoitter ble suspendert i 1% glutaraldehyd i PBS og inkubert ved romtemperatur i 5 min. De fikserte parasitter ble innhøstet ved sentrifugering ved 2000 x g i 5 min, vasket tre ganger med PBS og resuspendert i 1 ml PBS. New Zealand hvite kaniner ble gitt multiple intradermale injeksjoner i huden på ryggen med et totale på 0,5 ml av den fikserte parasittoppløsning emul-gert med 0,5 ml fullstendig Freund's medium. Kaniner fikk to forsterkningsinjeksjoner inneholdende det samme para-sittprotein i ufullstendig Freund's medium ved 2 ukers intervaller. Blod ble innsamlet fra ørevenen 2 uker etter siste forsterkning og serum inneholdende antistoff ble erholdt ved sentifugering av koagulerte blodprøver i 15 mn ved 2500 x g.

Prøver av merkede proteiner for immunout f elling (5 al inneholdende 5 x IO<5>cpm) ble fortynnet i 100 jjl IP-buffer (0,25% NP-40, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl), på forhånd klaret ved inkubering i 20 min på is med 5^g av Staph-A protein (Pansorbini, Calbiochem Corp., San Diego, CA) , og inkubert i flere timer ved 4°C med 5-10^1 av kanin anti-merozoittserumet. Antistoffkompleksene ble samlet opp ved en andre inkubering med 5^g av Staph-A-protein i 20 min på is og sentrifugert i 15 sek i en Eppendorf sentri-fuge. Pelletene ble vasket 4 ganger med IP-buffer, og de merkede proteiner immunoutfelt med antistoffreagenset ble eluert fra komplekset ved oppvarming til 100°C i 5 min i SDS-gel prøvebuffer (65 mM Tris pH 6,8, 0,5% SDS, 5% S-merkaptoetanol, 10% glycerol, 0,1% bromfenolblått). SDS PAGE ble utført som beskrevet av Laemmli [Nature 227:680

(1979)].

Resultater erholdt med kaninantiserumet ble bekreftet ved å bruke immun kyllingserum fremstilt som følger: Kyllinger ble immunisert ved gjentatt infeksjon med levedyktige sporulerte oocyster av E. tenella (100.000 oocyster, gitt 3 ganger med 2 ukers mellomrom). Blod ble oppsam-let ved hjertepunktur og serumet inneholdende antistoff ble separert fra koagulert avfall etter sentrifugering ved 2.500 x g i 5 min.

Sammenligningsstudier ble utført hvor både antimerozoitt kaninserumet og det immune kyllingserum ble brukt for å immunoutfelle (1) 125I-overf latemerkede Eimeria merozoitt-proteiner og (2) in vitro-produktene fra translasjonen av poly(A)-inneholdende merozoitt-RNA. De utfelte proteiner ble så underkastet SDS PAGE og gjort synlig ved fluorografi ved å bruke standard fluorografiteknikker og reagenser .

Disse studier viste at de mange proteiner fra begge kilder ble utfelt av begge sera. Således kunne hvert serum bli brukt til å velge ut genetiske rekombinanter som uttrykker Eimeria-proteiner. For letthets skyld ble kanin anti-merozoittserumet brukt først i utvelgelsesprosedyrene beskrevet nedenfor. Imidlertid ble immun kyllingserum brukt i parallell utvelgelse av cDNA-biblioteket som beskrevet nedenfor. Dette var essensielt for identifise-ringen av proteiner som sannsynligvis var viktige i immun-responsen mot den infiserende organisme, fordi kun kyl-lingserumet var dannet i respons til tilføringen av levende organismer. Kun de immuniserte kyllinger var påvise-lig resistente mot slike organismer.

For å øke spesifisiteten av kanin anti-merozoittserumet for Eimeria-proteiner, ble antistoffutvelgelse utført på serumene i hovedsak som beskrevet av Hallet et al., supra. Kort angitt ble antistoff som var spesifikke for forløper-proteinet uttrykt av en rekombinant fag-klon (se nedenfor) , renset fra kanin antimerozoitserumet som følger. Den positive fag ble platet til høy tetthet og dyrket ved 42°C i 3,5 time. Ekspresjon av fusjonsproteinet ble indusert ved å overlegge platen med et nitrocellulosefilter mettet med 10 mM isopropyltiogalactosid (IPTG), og inkubering ble fortsatt ved 37°C i 6-8 timer. De antigen-tilførte filtere ble vasket i TBS (20 mM Tris HC1, pH 8,0, 150 mM NaCl) og inkubert i 8-10 timer ved 4°C med overskudd av antimerozoit-serum som hadde blitt reabsorbert med E. coli vertsbakterien. Filtrene ble vasket tre ganger med TBS for å fjerne ikke-spesifikke antistoffer.

Antistoffene som var spesifikt bundet til fusjonsproteinet på filtrene, ble eluert med 2,0 ml 0,1 M glycin, pH 2,6, 0,25 M NaCl (15 min ved 20°C) . De eluerte antistoffer ble nøytralisert umiddelbart med et likt volum 0,1 M Tris HCl, pH 8,0. De utvalgte antistoff (heretter referert til som "antistoffutvalgte antistoff") ble så brukt i immunoutfellingen av overflatemerkede merozoitter eller in vitro-translasjonsprodukter, eller som prober i Western blots av helt merozoitprotein. Kontrollsera ble fremstilt ved å bruke ikke-rekombinant fag i den antistoffutvelgende fremgangsmåte.

Resultatene av Western blot og immunoutfellingsanalysene som brukte antistof f utvalgte antistoff, er vist i fig. 2. Produktene av immunoutfellingen av merkede proteiner ble gjort synlig ved fluorografi som beskrevet av Bonner et al. [Eur. J. Biochem. 46_:83 (1974)]. Tall til høyre på figuren viser posisjonene av molekylvektsmarkørproteiner med de angitte størrelser i kilodalton.

Panel A i fig. 2 viser et immunoblot av de totale merozoit-proteiner probet med kontroll (a) eller antistof f utvalgte antistoff (b) . Panel B viser<125>I-overflatemerkede merozoitproteiner som hadde blitt immunoutfelt med kontroll (a) eller antistoffutvalgte (b) antistoff.

Isolering og in vitro translasjon av merozoit mRNA

Frosne merozoitpelleter inneholdende1xIO<9>til 1 xIO<10>organismer ble tint i 10 ml TEL/SDS-buffer (0,2 M Tris HCL, 0,1 M LiCl, 25 mM EDTA, 1% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8,8), inneholdende 1 mM ditiotreitol (DTT) og 300 enheter RNasin (Promega Biotec, Madison, WI) og homo-genisert med 10-12 slag i en teflonbelagt vevshomogenisa-tor. Uløselig avfall ble separert ved sentrigfugering i kulde ved 3.000 x g. Supernatantvæsken be ekstrahert to ganger med f enol: kloroform: isoamylalkohol (24 :24:1, v/v) som hadde blitt ekvilibrert med TEL-bufferen.

Den vandige fase ble fordøyet med 100 mg/ml proteinase K ved 37°C i 30 min og så reekstrahert med et likt volum av fenol: kloroform (1:1), og nukleinsyren ble utfelt med to volumdeler etanol i 1 time på tørris, eller over natten ved -20°C. Pelleten ble etter sentrifugering ved 10000 x g i 1 time resuspendert i TE (10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM EDTA) og spunnet gjennom en 4 ml CsCl-pute (5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA) ved 150.000 x g i 20 timer ved 15°C. RNA-pelleten ble igjen utfelt fra 0,2 M kaliumacetat med 2,5 volumdeler etanol. Dette totale RNA ble passert en gang over oligo-dT cellulose for å anrike for poly(A)<+>RNA, som beskrevet av Maniatis, supra, s. 197. Et typisk utbytte på 1,9 mg av totalt RNA fra 5 x IO<9>merozoitter inneholdt omtrent 20^g poly(A)<+>RNA.

Mellom 0,1 og 0,5j^g av mRNA ble brukt for å programmere in vitro proteinsyntese i et nukleasebehandlet kanin reticulocytt-lysat (Amersham Corp., Arlington Heights, IL eller Promega Biotec) supplementert med 10-20^Ci av35S-Metio-nin pr. 20^1 av reaksjonsblandingen. In vitro translasjonsproduktene ble analysert ved immunoutfelling fulgt av SDS PAGE og gjort synlig ved fluorografi som beskrevet ovenfor, med resultatene vist i fig. 2, panel C.

Spor a i panel C viser en fullstendig blanding av produkter, programmert av det poly (A)-inneholdende merozoit-RNA. Spor b, c og d viser translasjonsprodukter immunoutfelt med anti-stoff utvalgt av en rekombinant fag-klonbe-tegnetn5-7 (se nedenfor; denne klon uttrykker et gen som koder for Eimeria forløperproteinet), en annen fag-klon som reagerer med henholdsvis anti-merozoitserum og en ikke-rekombinant lambda gt11-klon.

Det bør bemerkes at et hovedprotein med en observert molekylvekt på omkring 30 kilodalton kan observeres i spor a og b'fig. 2, panel C. Dette protein er ikke tilstede i sporet som inneholder totale merozoitproteiner probet med antistoff-utvalgte antistoff (panel A, spor b), men et 23 kilodalton bånd kan observeres i denne gel (panel A, spor b, pil). Et protein på 23 kilodalton ble også immunoutfelt med de antistof f-utvalgte antistoff fra<125>I-merkede merozoitproteiner som vist i fig. 3, panel B, spor b. Disse observasjoner antyder sammen at 30 kilodalton forløperpro-teinet kan bli behandlet med proteolytisk spaltning i ferdigutviklede merozoitter til 23 kilodalton overflateantigenet.

Fremstilling av et merozoit cDNA ekspresjonsbibliotek Dobbeltkjedet cDNA ble syntetisert fra 6^g av merozoit poly (A)<+>RNA, som beskrevet av Gubler et al., Gene 25:263

(1983), ved å bruke revers transkriptase (BRL, Gaithers-burg MD) for å forlenge fra en oligo(dT)-primer og RNase H (BRL) og E. coli DNA polymerase I (New England Biolabs, Beyerly, MA) for å syntetisere den fullstendige kjede. Det dobbeltkjedede cDNA ble så gjort buttendet med T4 DNA polymerase (BRL), og EcoRI-linkere (GGAATTCC, Collabora- tive Research Inc., Bedford, MA) ble tilsatt etter behandling med EcoRI-metylase (New England Biolabs), ifølge forhandlers bruksanvisning.

Etter fordøying med EcoRI, ble cDNA'ene fraksjonert i Biogel A-50M for å fjerne overskudd av linkermolekyler og cDNA mindre enn omkring 300 bp, som beskrevet av Huynh et al., infra. cDNA ble så konsentrert ved utfelling fra etanol.

Et bibliotek ble fremstilt iX,9tl:L (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA) som beskrevet av Huynh et al., i D. Glover (utg.) DNA cloning, Vol. I: A Practical Ap-proach, 1985, IRL Press, Washington, D.C., s. 49-78. EcoRI cDNA-fragmentene ble ligert til EcoRI-fordøyet, defosfory-lert

X,gtll-armer (Stratagene Cloning Systems) , og det resulterende DNA ble pakket i fager med Gigapack®-kit (Stratagene Cloning Systems), ifølge forhandlers bruksanvisning.

Det resulterende bibliotek ble amplifisert ved plating på Y1088 vertsceller. Prosentandelen av rekombinanter ble regnet ut fra forholdet av blå til fargeløse plaquer på X-gal-plater (Maniatis, supra, s. 24) i nærvær av isopropyl-tiogalaktocid (IPTG, Sigma Chemical Co.) til å være omkring 90%.

Immunologisk analyse av cDNA- biblioteket

ngtll merozoit cDNA ekspresjonsbiblioteket ble platet på Y1090-celler med en tetthet på omkring 10.000 plaquer pr. 140 mm plate. Seks slike plater ble inkubert i 3,5 time ved 42°C, overlagt med nitrocellulosefiltere som på forhånd var fuktet i 10 mM IPTG for å indusere ekspresjonen av S-galaktosidase fusjonsproteinet, og inkubert i ytterligere 4-5 timer til over natten ved 37°C.

Filtrene ble fjernet fra platene og underkastet flere porsjonsvise vaskinger med TBS (20 mM Tris HC1, pH 8,0, 0,15 M NaCl). Ikke-spesifikke proteinbindinsseter ble blokkert ved inkubering i 10% føtalt kalveserum (FCS) i TBS i 1 time ved romtemperatur.

Filtrene ble så inkubert i 1 time med kanin anti-merozoitserum som hadde blitt preadsorbert med Y1090-cellene ved 1:100 fortynning i TBS inneholdende 20% kalveserum. Ikke-spesif ikke antistoff ble fjernet i påfølgende vaskinger med TBS, hvorav én inneholdt 0,1% NP-40. Filtrene ble inkubert med geite antikanin peroksydasekonjugat (Bio-Rad, Richmond, CA) ved 1:1000 fortynning i TBS pluss kalveserum i1time ved romtemperatur. Fargereaksjonen ble fremkalt med 4-klor-l-naftol (Bio-Rad) ifølge forhandlers instruk-sjoner.

Serum fra immune kyllinger ble også brukt i analysen. Dette serum ble preadsorbert med Y1090-celler og brukt i samme fortynning som kaninserumet. Kanin-antikylling antistoff ble brukt som det sekundære antistoff og geite-anti-kanin pepperrotperoksydasekonjugat ble brukt som det påvisende antistoff. Enkle plaquer ble isolert i en sekun-dær analyse ved å bruke de samme reagenser.

En klon, betegnet lambda 5-7, dannet et protein som var sterkt reaktivt med antistoff fra kaninserumet. Et andre isolat, 1-5, ble identifisert ved å analysere med immun kyllingserum og viste seg å inneholde et cDNA-innskudd av samme størrelse som 5-7-klonen. DNA-sekvensanalysen indikerte at disse fag-kloner kodet for det samme merozoit-antigen.

Ekspresjon av lambda 5- 7 cDNA i E. coli

Et 1,2 kb innskudd fra lamda 5-7 ble isolert ved EcoRI-fordøying og agarosegelelektroforese [Maniatis et al., supra, s. 157-179]. EcoRI-endene ble reparert med Klenow polymerase i nærvær av dATP og dTTP, og BamHI-linkere (GGGATCCC) ble ligert til begge ender. Det modifiserte fragment ble satt inn i hver av de tre ekspresjonsvektorer pDS56/RBSII, pDS56/RBSII,-1 og pDS56/RBSII,-2 ved BamHI-setet. Disse tre vektorer er beskrevet nedenfor. Plasmider inneholdende innskuddene i begge mulige orienteringer ble transformert som beskrevet av Mandel et al. [J. Mol. Biol. 53:159 (1979)] i E.coli stamme M15, som bærer det kompatible plasmid pDMI.1. E.coli-stammen M15 som har plasmider pDS56/RBSII og pDMI.l, er beskrevet i europeisk patentsøk-nad, publ.nr. 316.695.

Plasmidkonstruksj on

Generelt inneholder plasmidene pDS56/RBSII,-1 og -2 det regulerbare promoter/operatorelement N250PSN250P29 og henholdsvis de ribosomale bindingsseter RBSII, RBSII(-1) og RBSII(-2). Disse ribosolmale bindingsseter var avledet fra det ribosomale bindingssete av promoteren PG25av E. coli fag T5 [europeisk patentsøknad publ. nr. 207.459] og ble erholdt via DNA-syntese.

Grunnet den høye ekspresjonseffektivitet kan de ovenfornevnte plasmider bli oppretholdt i E.coli-celler kun dersom promoter/operatorelementet undertrykkes ved binding av en lac repressor til operatoren, lac repressoren er kodet i lacl-genet. N250PSN250P29 kan effektivt bli under-trykt bare når et tilstrekkelig antall av repressormoleky-ler er til-stede i cellen. Derfor ble lacl<q>allele, som inneholder en promotermutant som er ansvarlig for en øket ekspresjon av repressorgenet, brukt. Dette lacl<q->allele er tilstede på plasmidet pDMI.l, som beskrevet nedenfor.

pDMI.1-plasmidet bærer i tillegg til lac I-genet neomycin fosfotransferasegenet, som gir kanamycinresistens til bakterien og som blir brukt som seleksjonsmarkør. pDMI.l er kompatibel med pDS56/RBSII,-1 og -2- plasmidene. E. coli-celler som er transformert med ekspresjonsvektorene pDS56/RBSII,-1 og -2 må inneholde pDM.l for å garantere at ekspresjonsvektoren blir holdt stabil i cellene. Induksjon

av dette system blir oppnådd ved å tilsette IPTG til mediet.

Plasmid pDS56/ RBSII

Den del av pDS56/RBSII som ligger mellom restriksjons-spaltningssetene for Xbal og Xhol og som inneholder repli-kas jonsregionen og genet for S-lactamase (som gir ampicil-linresistens til cellen) (fig. 4 og 5), ble opprinnelig avledet fra plasmidet pBR322 [Bolivar et al., Gene 2. 95-113 (1977); Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43: 77-90 (1979]. Imidlertid er genet for S-lactamase modifisert ved eliminering av spaltningssetene for restriksjonsenzymene HincII og Pstl. Disse endringer i DNA-sekvensen har ingen effekt på aminosyresekvensen av S-lactamasen. Den gjenværende del av plasmidet bærer det regulerbare promoter/operatorelement N250PSOP29, fulgt av det ribosomale bindings sete RBSII, som er del av et EcoRI/BamHI-fragment, spaltningssetet for restriksjonsenzymene Sali, Pstl og Hindlll, terminatoren t0av E.coli fag lambda [Schwarz et al., Nature 272: 410-414

(1978)], det promoterfrie gen av kloramfenikolacetyltrans-ferase [Marcoli et al., FEBS Letters, 110:11-14 (1980)] og terminatoren Tl av E.coli rrnB-operonet [Brosius et al., J. Mol. Biol. 148: 107-127 (1981)].

Plasmid pDS56/ RBSII(- 1)

Plasmid pDS56/RBSII(-1) (fig. 6 og 7) er lik plasmid pDS56/RBSII, men inneholder det ribosomale bindingssete RBSII(-1).

Plasmid pDS56/ RBSII(- 2)

Plasmid pDS56/RBSII(-2) (fig. 8 og 9) er lik plasmid pDS56/RBSII, men inneholder det ribosomale bindingssete RBSII (-2) .

Forskjellen i disse tre plasmider er at de er forskjellige ved et nukleotid etter ATG startkodonet som resulterer i proteinekspresjon fra alle tre potensielle leserammer.

Plasmid pDMI. l

Plasmid pDMI.l (fig. 10 og 11) bærer genet for neomycin fosfotransferase fra transposon Tn5 [Beck et al., Gene 19: 327-336 (1982)], som gir kanamycinresistens til E.coli-celler og lacl-genet [Farabough, Nature 274: 765-769

(1978)]

med promotermutasjonen Iq [Calos, Nature 274: 762-765

(1978)], som koder for laq-repressoren. Dessuten inneholder plasmid pDMI.1 et område av plasmidet pACYC184 [Chang og Cohen, J. Bacteriol. 134: 1141-1156 (1978)], som inneholder all informasjon som er nødvendig for replikasjonen og stabil transmisjon av dattercellene.

Det bør være forstått at i tillegg til det ovenfor beskrevne plasmid er ethvert E. coli ekspresjonssystem tenkt å være anvendelig i dette eksperiment.

De bakterielle transformanter ble dyrket ved 37°C i LB-medium Maniatis et al., supra, s. 68] og ekspresjon av protein ble indusert ved tilsetning av 1 mM IPTG til mediet. Etter inkubering i 1 time, ble 1 milliliters prøver tatt ut, og cellene i prøvene ble samlet opp ved sentrifugering. Cellepelletene ble behandlet som beskrevet av Crowl et al., supra, og lysatene ble underkastet SDS PAGE. Etter elektroforese ble proteinene i gelene enten farget med Comassie blue eller overført til nitrocellulo-semembraner for Western blot-analyse [Towbi et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA 76: 4350 (21979); Burnetti, Anal. Biochem. 112:195 (1981)], ved å bruke kanin anti-merozoit-serumet som beskrevet ovenfor.

Denne analyse viste at 1,2 kb cDNA-molekylet i en oriente- ring i alle tre leserammer dannet et protein som migrerte med en observert molekylvekt på omkring 30 kilodalton og reagerte med antistoffene fra kanin antimerozoit-serumet. Dette er konsistent med tilstedeværelsen av stoppkodoner i alle tre leserammer før ATG startkodonet ved nukleotid 68 i cDNA-sekvensen, som vist i fig. 1.

DNA- sekvensanalyse

Generelt ble isolering i liten skala av plasmid-DNA fra 1 ml mettet overnattingskultur utført ved å bruke fremgangsmåten til Birnboim et al. [Nucleic Acids Research 7:1513

(1979)] . Denne fremgangsmåte tillater isolering av en liten mengde DNA fra en bakteriell koloni for analytiske formål. Større mengder av plasmid DNA ble fremstilt ved å bruke 1-liters kulturer ifølge en standard fremgangsmåte med cesium-kloridsentrifugering [Maniatis et al., supra, s. 93].

DNA-sekvensen til 1,2 kb EcoRI cDNA-innskuddet fra lambda 5-7 ble bestemt som følger. Innskuddet ble fordøyet med EcoRI, gelisolert og ligert til EcoRI-fordøyet pEV-vrf plasmid beskrevet av Crowl et al. [Gene 38:31 (1985)]. Dette plasmid ble betegnet pEV/5-7 og ble brukt for å mangfoldiggjøre 1,2 kb cDNA-innskuddet for hybridiseringsanalyse (som beskrevet nedenfor) og i preliminær DNA-sekvensanalyse ved metoden til Zagursky et al. [Gene Anal. Tech. 2:89 (1983)].

For å bestemme den fullstendige DNA-sekvens ble 1,2 kb cDNA-innskuddet videre subklonet i de M13, Mpl8 og Mpl9 enkeltkjedede fagvektorer ved å bruke BioRAd M13 Cloning and Sequencing Kit. DNA-sekvensen ble bestemt ved dide-oksy kjedetermineringsmetoden til Sanger et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463 (1977)] ved å bruke reagenser og fremgangsmåter fremskaffet med Bio-Rad-kitet.

Den fullstendige nukleotidsekvens av 1,2 kb cDNA fra lambda 5-7 innbefattende de 5' og 3' utranslaterte regio-ner er vist i fig. 1. Analyse av sekvensen av et andre isolat fremstilt som beskrevet ovenfor ved å bruke immun kyllingserum betegnet 1-5, viste at dette isolat inneholdt det følgende ytterligere nukleotid ved 5<1>ende og mangler EcoRI-setet til 5-7-innskuddet:

AATTCGCCTTTNCGCTTGCACCCTTTGAGCT

AATTCGG (5-7)

Det gjenværende av sekvensen av dette andre isolat er identisk med den av lambda 5-7 fra base nummer 8 til begynnelsen av poly-A-lengden, bortsett fra nukleotid nr. 300, hvor et cytidinresiduum er funnet i stedet for et tymidinresiduum.

cDNA-sekvensen forutsier en åpen leseramme som strekker seg fra ATG ved posisjon 68 til TAA stoppkodonet ved posisjon 668 som koder for 200 aminosyreresiduer som vist i fig. 1.

Den teoretiske størrelse på 24 kd for et protein på 200 aminosyrer er noe mindre en den betegnede størrelse av det primære translasjonsprodukt observert i immunoutfellingen av merozoit mRNA (figur 3, panel c, gate b) ved det antistof f utvalgte reagens og proteinet uttrykt fra cDNA i E. coli ekspresjonsvektorene beskrevet ovenfor. Imidlertid ligger denne teoretiske molekylvekt innen variasjonsområ-det som er ventet mellom de teoretiske molekylvekter og molekylstørrelsen bestemt ved interpolering relativt til molekylvektstandardene på SDS-PAGE.

Analyse av den utledede aminosyresekvens av proteinet kodet for av lambda 5-7 cDNA-innskuddet (fig. 1) viser at de første tyve aminoterminale aminosyreresiduer har en vesentlig hydrofobisk karakter, noe som antyder en mulig signalsekvens.

Hybridiseringsanalyse

DNA ble isolert fra sprengte, sporulerte oocyster etter behandling med trypsin og galle og vask med PBS som føl-ger: Parasittmaterialet (ca. 1 x IO<9>oocyster) ble suspendert i 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0, 0,5% Sarcosyl (Sigma, ST. Louis, MO) og fordøyet med proteinase K (Boehringer-Mannheim, Tyskland) ved 0,1^g/ml i 2 timer ved 50 °C med RNase (10 j^g/ml) i 1 time ved 37°C og igjen med proteinase Kil time ved 50°C. Proteinet ble fjernet ved to ekstraksjoner med fenol mettet med 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA (TE), og en gang ekstraksjon med fenol/kloroform (1:1). Den vandige fase ble dialysert i utstrakt grad mot TE og konsentrert ved etanolutfelling. Et typisk utbytte på 0,4 mg DNA pr. 1 x IO<6>oocyster ble erholdt.

Dette parasitt-DNA ble fordøyet med forskjellige restriksjonsendonukleaser ifølge forhandlers fremgangsmåter og de resulterende DNA-fragmenter ble adskilt ved elektroforese ved 40 V i 2,5 timer i 0,8% agarose i Loening Buffer (4,7 g NaH2P04, 4,36 g Tris base, 0,372 g Na2EDTA pr. liter, pH 7,6). Gelen ble behandlet med 0,25 M HC1 i 30 minutter og overført til en Zeta-Probe-membran (BioRad) i 0,4 M NaOH over natten. Filteret ble nøytralisert i 2 X SSC (pH 6,8) og bakt 1 time ved 80°C under vakuum.

Filteret ble prehybridisert i 3 timer ved 65°C i 7% SDS, 1% BSA (Boehringer, fraksjon V), 0,5 M NaHP04-buf f er , pH 7,2. 5-7 gen EcoRI-innskudet ble gelisolert etter fordøying av pEV/5-7-plasmidet, som beskrevet ovenfor, med EcoRI, og merket ved tilfeldig priming med Klenow-fragment i nærvær av<32>P-merkete deoksynukleotider. Det merkede innskudd ble adskilt fra uinkorporerte nukleotider i Spin Columns

(Bio-Rad), denaturert og tilsatt til hybridiseringsoppløs-ningen. Etter inkubering i 12 timer ved 65°C ble filtrene vasket tre ganger med 2 X SSC/0,1% SDS, og to ganger med 0,1 X SSC/0,1% SDS ved 65°C. De genomiske DNA-f ragmenter som hybridiserer til proben ble påvist ved autoradiografi. Selv om pEV/5-7-plasmindet ble brukt her, skal det forstås at enhver ekvivalent vektor inneholdende 1,2 kb cDNA-innskuddet av merozoit 5-7-genet også ville virke på en akseptabel måte.

Resultatene av denne analyse er vist i fig. 3, hvorav resultatene av fordøying med PvuII (1), HineII (2), Pst (3), SphI (4) eller SacI (5) kan ses.

Genomiske DNA-fragmenter på 6,5 og 3,6 kb ble påvist etter fordøying med PvuII og SacI i henholdsvis gate 1 og 5. Siden det ikke er noen seter for disse enzymer i cDNA-klonen, kan den maksimale størrelse av Eimeria-genet bli beregnet til å være 3,6 kb. Fordøying av genomisk DNA med EcoRI dannet et 1,2 kb genomisk fragment som i størrelse svarer til cDNa-fragmentet. Dobbel fordøying med HincII og EcoRI dannet et 0,9 kb-fragment forutsagt fra cDNA-sekvensen som er tett flankert av EcoRI-seter.

Tre fragmenter ble påvist etter fordøying med Pstl (gate 3) .

To Pstl-seter er forutsagt fra cDNA-sekvensen, noe som ville danne et indre fragment på 305 bp og to tilleggs-fragmenter. Tilsynekomsten av et tredje stort Pstl-fragment er trolig resultatet av ufullstendig fordøying ved de indre PstI-seter.

Mønsteret av fragmenter dannet av SphI (spor 4), som også spalter to ganger i cDNA, gir ingen definitiv informasjon. Det lille indre SphI-fragment forutsagt fra cDNA-sekvensen

ville ikke ha blitt påvist i denne gel.

I en Northern blot analyse [Alwine et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74: 5350 (1977)] av poly(A)-inneholdende mRNA isolert fra merozoitter, hybridiserte 1,2 kb cDNA-fragmentet av lambda 5-7-genet til en enkelt mRNA-type på omkring 1,3 kb i lengde. Fra denne størrelseskorrelasjon er det tydelig at 5-7-klonen, sammen med 5' forlengelsen bestemt fra 1-5 isolatet nevnt ovenfor, representerer sekvensen av full lengde av cDNA med det mulige unntak av 5<1->nukleotidene som ligger lengst bort.

Tatt sammen er de foregående observasjoner konsistente med ko-linearitet av cDNA- og de genomiske sekvenser.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et terapeutisk aktivt protein med en eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter av et Eimeria merozoitt overflateantigen, hvilket overflateantigen har en observert molekylvekt på omkring 23 kilodalton i SDS PAGE og er avledet fra et forløperprotein med en observert molekylvekt på omkring 30 kilodalton i SDS PAGE hvilket protein blir kodet av nukleotidsekvensen

eller en ekvivalent sekvens derav, hvor proteinet er fritt for andre Eimeria-proteiner, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: (a) å dyrke en transformert mikroorganisme inneholdende en rekombinant vektor omfattende et DNA som har en nukleotidsekvens som koder for nevnte protein i kombinasjon med transkripsjons- og translasjons-regulerende sekvenser, samt inneholdende et seleksjonsmarkørgen, under betingelser hvor dette DNA blir uttrykt; og (b) isolere proteinet fra kulturen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor nevnte DNA-sekvens koder for et protein som har aminosyresekvensen

eller en delsekvens derav, slik at den partielle sekvens mangler de første tyve aminosyreresiduer i aminsyresekvensen angitt ovenfor, eller et funksjonelt ekvivialent protein derav, som har en aminosyresekvens som er relatert til nevnte aminosyresekvens ved deles joner, innskudd eller substitusjoner uten at proteinets immunologiske egenskaper endres,karakterisert vedat tilsvarende rekombinante vektor anvendes.

3. DNA,karakterisert vedat det koder for et protein med en eller flere antigene determinanter for et Eimeria merozoitt overflateantigen, hvilket overflateantigen har en observert molekylvekt på omkring 23 kilodalton i SDS PAGE og er avledet fra et precursor- protein med en observert molekylvekt på omkring 30 kilo-dalton i SDS PAGE, hvilket protein er fritt for andre Eimeria-proteiner, hvilken DNA-sekvens omfatter alt eller deler av nukleotidsekvensen

eller en funksjonell ekvivalent derav, eller DNA-sekvenser som er degenerert i forhold til denne sekvens basert på degerasjonen av den genetiske kode.

4. Rekombinant vektor, karakterisert vedat den omfatter et DNA som har en nukleotidsekvens som koder for et protein som angitt i krav 1 eller 2 i kombinasjon med transkripsjons- og translasjons-regulerende sekvenser samt et seleksjonsmarkørgen, hvor den rekombinante vektor er i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA i en kompatibel vertsorganisme.

5 . Rekombinant vektor ifølge krav 4,karakterisert vedat den er en E. coli- vektor.

6. Transformert mikroorganisme,karakterisert vedat den inneholder en rekombinant vektor ifølge krav 9-10 omfattende et DNA som har en nukleotidsekvens som koder for et protein som angitt i krav 1 eller 2, hvilken mikroorganisme er i stand til å uttrykke nevnte DNA.