KR100197455B1 - 재조합 콕시듐증 백신5-7- 아이메리아 표면 항원 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SDS PAGE 에서 약 23KD 의 분자량을 나타내는 아이메리아 분열소체 표면 항원의 전구체를 암호화하는 DNA 를 제공한다. 이 DNA 에 근거하여 상기 표면 항원의 하나나 그 이상의 면역 반응성 결정인자나 항원성 결정인자 혹은 그 두가지 결정인자를 모두 가지는 단백질들과, 상기 DNA 나 그 절편을 포함하는 재조합 벡터나 재조합 바이러스, 그런 벡터나 바이러스를 내포하는 형질전환된 미생물을 제조하였다. 본 발명은 또한 상기 단백질들과 형질전환 미생물들을 생산하는 방법과도 관계가 있다. 본 발명은 또한 정제된 23 KD 의 분열소재 표면 항원 자체와 그의 30 KD 짜리 전구체 그 자체와 콕시듐증에 대해 가금류를 보호하기 위해 아이메리아 표면 항원 그 전구체 단백질이나 그의 절편 혹은 그 두가지를 다 포함하여 사용하는 것과도 관계가 있다. 본 발명의 상기 단백질들과 그 절편들은, 정제된 단백질 형태로나 백시니아 바이러스 같이 적당한 바이러스 벡터에서 단백질을 암호화하는 DNA 형태로 가금류 보호를 위해 투여될 수 있다.

Description

재조합 콕시듐중 백신-5-7 아이메리아 표면 항원

제1(a, b)도는 아이메리아 분열소체 표면 항원의 전구체 단백질을 암호화하는 1.2 kb cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

제2도는 아이메리아 분열소체 단백질들을 SDS PAGE 로 분석한 것으로 제2a도는 전체 분열소체 단백질들의 면역블럿 결과, 제2b도는¹²⁵I로 표면을 표식한 분열소체 단백질들의 면역침전 결과, 제2c도는 분열소체 mRNA 의 생체외 단백질 면역 생성물의 면역침전 결과를 각각 나타낸다.

제3도는 아이메리아의 게놈 DNA 을 서던 블럿의 방법으로 분석한 결과를 나타낸다.

제4도는 플라스미드 pDS56/RBSII 를 나타낸다.

제5(a, b, c)도는 플라스미드 pDS56/RBSII 의 전체 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

제6도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-1)를 나타낸다.

제7(a, b, c)도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-1)의 전체 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

제8도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-2)를 나타낸다.

제9(a, b, c)도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-2)의 전체 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

제10도는 플라스미드 pDMI.1 을 나타낸다.

제11(a, b, c)도는 플라스미드 pDMI.1 의 전체 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

본 발명은 원생동물인 아이메리아(Eimeria) 기생충의 항원에 관한 것이다. 이 항원들은 여러 경로로 투여되어 가금류를 콕시듐증(coccidiosis)이라는 질병으로부터 보호하는데 사용될 수 있다.

콕시듐증은 가금류에 발생하는 질병이며 세포내에 기생하는, 아이메리아 속에 속하는 원생동물 기생충들 때문에 생기는 것으로 알려져 있다. 이 병은 대규모의 시설로 가금류를 집중적으로 키우는 곳에서의 풍토병이다. 화학치료를 통해 이 병을 치료하는데 드는 비용은 미합중국내에서만도 연간 1억 달러 이상 소요되고 있다. 이미 알려진 항-콕시듐증 약품들에 대한 저항성이 발달함에 따라 끊임없이 새로운 약품들의 개발이 필요한데, 약품 개발비가 점점 증가하는데 반하여 소비자들은 식용 가축내의 잔류 약품을 받아들이지 않으려는 경향이 강해지고 있다.

자연적인 콕시듐증 감염에 대해 보호되는 면역성에 관해서는 연구기록이 잘 되어 있다. 생존 가능성이 있는 낭포체(oocyst)를 매일 작은 수로 조절하여 몇주간 투여하면, 보통 감염되는 정도로 많은 양에 대해서도 완전한 면역성을 나타내어 감염되지 않는다[로즈(Rose) 등, Parasitology 73:25(1976); 로즈(Rose) 등, Parasitology 88:199(1984)]. 감염에 대한 저항성을 얻어낼 수 있다는 사실에 대한 증명은, 화학적 치료법에 우선하는 병아리의 면역성을 유도하는 백신을 만들 수도 있다는 가능성을 제시하고 있다. 실제로 그런 개념은 미합중국 알라바마주의 오펠리카(Opelika)에 있는 스터윈(Sterwin) 연구소의 Coccivac

방식에서 시험되어 왔다.

뮤레이(Murray) 등의 유럽 특허출원(공개번호 167 443)에서는 콕시듐증 백신을 만들기 위해 아이메리아 테넬라(Eimeria tenella)의 낭포체나 포자소체(sporozoite)로부터 최소한 15 펩티드로 구성된 추출물을 분리하였는데 그중 많은 것이 포자소체의 표면과 결합되어 있다. 이 추출물을 닭에 주입했을 때, 감염을 일으키는 아이메리아 테넬라의 낭포체를 닭의 구강으로 주입시켜 야기되는 맹장의 손상이 줄었다.

더 최근에 쉔켈(Schenkel) 등의 미합중국 특허 4,650,676 에서는 아이메리아 테넬라의 분열소체(merozoite)에 대한 단일 클론 항체 생산을 나타내고 있다. 이 항체를 이용하여 쉔켈 등은 이 항체 생산을 유도하는 많은 항원을 동정해내었다. 쉔켈 등은 아이메리아 테넬라의 포자소체를 이 항체들과 미리 반응시켜 처리한 후 이를 닭의 맹장에 주입시켜서, 미처리 포자소체를 주입한 경우와 비교했을때 맹장 손상이 다소 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.

DNA 재조합 방법을 이용하여 뉴만(Newman) 등은 (유럽 특허출원 공개번호 164 176) 아이메리아 테넬라의 포자소체 단계로부터 25,000 달톤(dalton)의 항원을 암호화(코딩)하는 유전자를 클론시켰다. 죽은 아이메리아 테넬라로 반복적으로 면역화시켜 면역성을 얻은 닭의 혈청은 요오드로 표지한 스포로시스트(sporocyst)와 포자소체 막으로 구성된 혼합물로부터 상기 항원과 면역반응 침전을 하였다. 더 최근에 젠킨스(Jenkins)는 아이메리아 아세불리나(Eimeria acervulina)로부터 250,000 달톤의 분열소체 표면 단백질중 일부를 암호화하는 cDNA 에 대해 기술하고 있다[Nucleic Acids Res. 16:9863(1988)]. 이 cDNA 의 발현 생성물은 아이메리아 아세불리나에 대한 항혈청에 의해 감지되었다.

DNA 재조합 기술의 진보로 인해 서브유닛(subunit) 백신이라는 또다른 방향에서의 접근이 가능해졌다. 서브유닛 백신의 예는 유럽 특허출원 공개번호 324 648 과 337 589 및 344 808 에서 찾아볼 수 있다.

본 발명은 아이메리아의 분열소체 표면 항원의 하나 이상의 면역반응 결정인자나 항원성 결정인자, 혹은 그 두가지를 다 갖는 정제된 단백질을 제공하는데 분열소체 표면 항원은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS polyacrylamide gel electrophoresis)에서 약 23 킬로달톤(KD) 분자량을 나타내며 이는 마찬가지 방법에 의해 약 30 KD 의 분자량을 나타내는 전구체 단백질에서 유래한 것으로 다른 아이메리아 단백질과 충분히 분리되어 있다.

특히 본 발명은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 약 23 KD 의 분자량으로 나타난 아이메리아 분열소체 표면 항원인 분리 단백질과 그 단백질의 절편들을 제공한다. 이 단백질과 그 절편들은 다른 아이메리아 단백질들과 충분히 분리되어 있다.

더우기 본 발명은 상기 언급된 아이메리아 분열소체 표면 항원 또는 그 절편들의 전구체 단백질도 제공하는데 이 전구체 단백질은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동에서 약 30 KD 의 분자량을 나타내며 제1도에 그 아미노산 서열이 나타나 있다. 이 전구체 단백질은 다른 아이메리아 단백질들과 충분히 분리되어 있다.

본 발명에서 바람직한 단백질은 제1도에서 나타낸 아미노산 서열을 가지며 N 말단의 신호(signal) 펩티드 서열이 없는 성숙된 아이메리아 분열소체 표면 항원인데, 그 N 말단 신호 펩티드는 제1도에 나타낸 서열에서 볼때 필수적으로 최초의 20 아미노산을 포함한다. 또한 본 발명은 면역학적 특성이 상기 언급한 단백질과 중요한 차이없이 상기 아미노산 서열을 삭제, 삽입 또는 치환 등에 의해 변형시킨 기능적으로 등가의 단백질들과도 관계가 있다.

본 발명은 또한 약 23 KD 의 분자량을 갖는 아이메리아 표면 항원이나 그 전구체 단백질의 전부 혹은 일부를 암호화하는 DNA 도 제공하며 또한 그런 DNA 를 포함하고 적합한 숙주 생물에서 발현시킬 수 있도록 된 재조합 벡터들과 그런 벡터들을 포함하고 있는 미생물들도 제공한다.

본 발명은 또한 약 23 KD 의 분자량을 갖는 것으로 보이는 아이메리아 분열소체 표면 항원의 면역 반응성 결정인자나 항원성 결정인자 또는 그 두가지를 하나 이상 갖는 단백질 생산에 대한 방법이 제공된다. 그 방법은 다음을 포함한다:

(a) 제1도에서 나타난 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 나 그 절편의 DNA 등 위에서 언급된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하고 있는 재조합 벡터를 가지고 있는 미생물을 그 DNA 서열이나 절편이 발현되는 조건하에서 배양하는 것; 및 (b) 그 배양물로부터 단백질을 분리해내는 것.

본 발명은 또한 가금류를 콕시듐증으로부터 보호하기 위해 본 발명의 하나 또는 그 이상의 적정량의 단백질과, 생리적으로 허용될 수 있는 담체(carrier)를 포함하는 백신을 제공한다.

본 발명은 가금류를 콕시듐증으로부터 보호하기 위해 본 발명에서의 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 그 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스와 생리학적으로 허용될 수 있는 담체를 함유하는 백신도 제공한다.

본 발명은 가금류를 콕시듐증으로부터 보호하기 위해 본 발명에서 제공하는 백신을 적절한 양으로 콕시듐증에 감염되기 쉬운 어린 가금류에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 아이메리아 단백질들은 중요한 백신 항원들인데 그 이유는 콕시듐증을 일으키는 생물들에 의해 면역되고 거기에 대한 면역성을 발달시킨 동물의 혈청에 있는 항체를 이용하여 그 단백질들을 동정했기 때문이다. 이 때문에 이 단백질들은 가금류를 콕시듐증으로부터 보호하는데 중요한 역할을 할 것으로 매우 기대된다.

본 발명은 도면들에 대한 설명에 의해 더 쉽게 이해될 수 있다. 제1도는 토끼로부터의 항체 선택 항체 및 닭의 면역 혈청에 의해 인지된 아이메리아 전구체 단백질을 암호화하는 1.2 kb cDNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 제1도에서 보는 것처럼 위에서 언급한 전구체 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 68 의 ATG 와 뉴클레오티드 668 에 있는 종결코돈 TAA 사이에 포함되어 있는 200개의 아미노산을 암호화한다. 제1도는 또한 제공된 뉴클레오티드 서열로부터 예측할 수 있는 아이메리아 전구체 단백질의 아미노산 서열도 나타내고 있다. 뉴클레오티드와 아미노산은 표준 단일 약자로 나타내고 있는데 이 약자의 의미는 통상의 생화학 교재, 예를들면 1984년 뉴욕의 Worth Publisher, Inc. 에서 출판된 레닌저(Lehninger)의 Principles of Biochemistry 96쪽과 798쪽에 나와 있다.

제2도는 여러 아이메리아 분열소체 단백질들의 SDS 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동 분석을 나타내고 있다. 제2a도는 전체 분열소체 단백질들을 면역 블럿(immunoblot)한 것인데 (a)는 대조구를, (b)는 항체 선택항체를 프로브(probe)로 하여 실험한 것이다. 제2a도의 화살표는 분자량 약 23 KD 의 단백질을 포함하는 띠의 위치를 가르킨다. 제2b도는¹²⁵I 로 표면을 표지한 분열소체 단백질을 대조구 (a), 항체선택 항체(b)와 면역침전(immmunoprecipitation)시킨 오토라디오그램(autoradiogram)이다. 제2c도는 분열소체 mRNA 를 생체외 단백질 번역(in vitro translation)시켜서 생산된 생성물의 완전한 혼합물(a)과 람다(lambda) 5-7 클론을 사용하여 선택된 항체로 면역 침전시킨 단백질 번역 생성물(b), 항-분열소체 혈청과 반응하는 단백질을 생산하는 또다른 파아지 클론을 사용하여 선택된 항체로 면역침전시킨 번역 생성물(c), 그리고 재조합하지 않은 파아지를 사용하여 분열소체 혈청으로부터 선택된 표준 항체와 면역침전시킨 번역생성물(d)을 나타내고 있다. 띠들은 형광사진(fluorography)에 의해 가시화되었다. 분자량 표지체(MW marker)의 위치는 그림 오른쪽에 KD 를 단위로 표시되어 있다.

제3도는 아이메리아 테넬라(Eimeria tenella)의 포자화된 낭포체의 게놈(genomic) DNA 를 각각 PvuII(레인 1), HincII(레인 2), PstI(레인 3), SphI(레인 4), 또는 SacI(레인 5)로 절단한 후 서던블럿(Southern blot) 분석한 것이다. DNA 크기를 나타내는 DNA 표준 표지 위치는 도면 오른쪽에 kb 단위로 나타나 있다.

제4도는 플라스미드 pDS56/RBSII 를 도식적으로 나타낸 것이다. 제4도와 제6도, 제8도, 제10도에서 약자와 기호 B, Bg, E, H, N, P, S, X, Xb 는 제한절단 효소인 Bam HI, BglII, Eco RI, HindIII, NcoI, PstI, SalI, XhoI 및 XbaI 의 인식서열 위치를 각각 나타내고 있다.

는 조절능력 있는 프로모터(promoter)/오퍼레이터(operator) 요소(element) N250PSN250P29 를 나타내고

는 리보좀 결합부위 RBSII, RBSII(-1)과 RBSII(-2)를 나타낸다.

는 이 리보좀 결합부위의 조절하에 있는 암호화 영역을 나타내며

는 6개 히스티딘을 암호화하는 영역을 나타낸다.

는 종결인자(terminator)인 to 와 T1 을 표시하고

는 이. 콜라이(Escherichia coli)에서의 DNA 복제에 필요한 부분을 표시한다.

는 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase; dhfr), 클로람페니콜 아세틸기 전이효소(chloramphenicol acetyltransferase; cat), β-락타메이즈(β-lactamase; bla), 락 억제인자(lac repressor; lac1), 네오마이신 인산 전이효소(neomycin phosphotransferase; neo)의 암호화 영역을 각각 나타낸다.

제5도는 플라스미드 pDS56/RBSII 의 전체 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이 서열에서 제4도에 표시된 제한 절단효소의 인식서열은 그 부위가 표시되어 있다. 표시된 아미노산 서열은 리보좀 결합부위 RBSII 의 조절하에 있는 열린 해독틀(open reading frame)을 나타낸 것이다.

제6도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-1)을 도식적으로 그린 것이다.

제7도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-1)의 전체 뉴클레오티드 서열을 표시하고 있다. 이 서열중에 있는, 제6도에 기술된 제한효소의 인식서열이 표시되어 있다. 여기 표시된 아미노산 서열은 리보좀 결합부위 RBSII(-1)의 조절하에 있는 열린 해독틀(open reading frame)을 나타낸 것이다.

제8도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-2)를 도식적으로 나타낸 것이다.

제9도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-2)의 전체 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 이 서열내에 있는 제8도에 표현된 제한효소의 인식 서열이 표시되어 있다. 여기 표시된 아미노산 서열은 리보좀 결합부위 RBSII(-2)의 조절하에 있는 열린 해독틀을 나타낸 것이다.

제10도는 플라스미드 pDMI.1 을 도식적으로 표현한 것이다.

제11도는 플라스미드 pDMI.1 의 전체 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 이 서열중에 있는, 제10도에 표시된 제한 효소의 인식서열이 표시되어 있다. 여기 표시된 아미노산 서열은 네오마이신 인산전이효소와 (Met 에서 Phe 까지의 서열) 락 억제인자(Met. 에서 Cln 까지: 이 유전자는 방향이 거꾸로임에 주의)를 암호화하는 열린 해독틀을 둘러싸고 있다.

여기에서 인용된 모든 참고문헌은 그대로 여기서 참고문헌으로 게재되어 있다.

여기서 사용된 다음 용어들은 아래와 같은 의미로 각각 쓰이고 있다.

아이메리아 표면 항원[Eimeria surface antigen)은 아이메리아 테넬라가 분열소체 단계에 있을 때 존재하는, SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 약 23 KD 의 분자량을 나타내는 단백질을 의미한다. 이 단백질은 제1도에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 생체내 발현 생성물의 후-번역 과정에 의해 생성되는 것으로 보인다.

전구체 단백질(precursor protein)은 SDS 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동에서 약 30 KD 의 분자량을 나타내며, 생체내에서 단백질 분해에 의해 아이메리아 표면 항원으로 된다고 여겨지는 단백질을 의미한다. 이 단백질을 암호화하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열과, 그로부터 예측되는 아미노산 서열은 제1도에 나타나 있다.

아이메리아 표면 항원의 하나 또는 그 이상의 면역반응 결정 인자나 항원성 결정인자, 혹은 그 두가지를 모두 갖는 단백질(a protein having one or more immunoreactive and/or antigenic determinants of the Eimeria surface antigen)이란 면역학적으로 적합한 숙주생물에서 면역반응을 일으킬수 있거나, 상보되는 항체에만 특별하게 결합할 수 있는 능력을 가지거나 이 두가지 특성을 다 갖는, 위에서 정의한 아이메리아 표면 항원의 에피토프(epitope)에 해당하는, 하나 또는 그 이상의 영역이나 에피토프를 갖는 단백질을 말한다. 여기서 말하는 단백질은 제1도의 뉴클레오티드 서열과 기능적으로 동일한 서열에 의해 암호화될 것으로 추축된다. 이런 서열들로부터 암호화되는 동기능적 단백질들은 면역학적 특성이 있는 실제적으로 변화하지 않는 범위에서 아미노산 서열이 치환된 정도, 즉 면역반응성 결정인자 및/또는 항원성 결정인자를 실제적으로 파괴하지 않는 정도로 제1도에 나타난 서열과 비슷한 아미노산 서열을 가진 단백질을 말한다.

유전 암호(genetic code)의 축퇴(degeneracy)때문에, 제1도에 나타낸 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 많은 가능한 뉴클레오티드 서열(즉, 동기능적인 서열)이 있을 수 있는 것이다. 또한 벡터에 삽입된 본 발명의 DNA 서열 및 그 절편들의 뉴클레오티드 서열들은, 적당한 숙주 생물내에서 그런 서열들을 포함하는 재조합 벡터가 아이메리아 표면 항원의, 하나나 그 이상의 면역 반응성 결정인자나 항원성 결정인자 또는 그 두가지를 갖는 단백질이나 단백질 절편의 생산을 유도하기만 한다면, 실제적인 구조 유전자(structural gene)가 아닌 부분의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다는 것도 알아야 한다.

단백질에서, 생물학적 면역학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 아미노산 치환은 많이 알려져 있고 뉴욕의 Academic Press 에서 1979년 펴낸 뉴라트(Neurath et al)의 The Proteins의 14쪽 그림 6 에 특히 잘 나타나 있다. 가장 빈번하게 관찰되는 아미노산 치환은 알라닌/세린, 발린/아이소루이신, 아스파르트산/글루탐산, 트레오닌/세린, 알라닌/글리신, 알라닌/트레오닌, 세린/아스파라진, 알라닌/발린, 세린/글리신, 티로신/페닐알라닌, 알라닌/프로린, 리신/아르기닌, 아스파르트산/아스파라진, 루이신/아이소루이신, 루이신/발린, 알라닌/글루탐산, 아스파르트산/글리신 등의 치환과 그 역방향의 치환이다.

그러한 동기능적인 뉴클레오티드 서열의 변형 및 본 발명에서 구체적으로 나타낸 단백질의 아미노산 치환은 그 결과로 되는 단백질들이 여기서 정의한 아이메리아 표면 항원의 하나 이상의 면역반응성 결정인자나 항원성 결정인자 또는 그 두가지를 모두 갖는다면 본 발명의 범위내에 속하는 것이다.

제1도의 아미노산 서열이나 치환으로 인한 비슷한 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열들은, 모리나가(Morinaga) 등[Biotechnology 2:636(1984)]의 기술방법에 따라 본 발명의 cDNA(제1도)를 바탕으로 적당한 합성 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 가지고 프라이머-지정 유전자 특정부위 변이 유발 방법(primer-directed sitespecific mutagenesis)에 의해 쉽게 만들 수 있다.

절편(fragment)이란 본 발명의 cDNA 들이나 단백질들 중 하나의 일부 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드나 폴리펩티드를 의미한다. 그러한 절편들은 DNA 에서는 제한 절단 효소를 사용하고 단백질들은 단백질 분해 효소를 사용하여, 즉 더 큰 분자들을 효소로 절단함으로써 만들어낼 수 있다. 그렇지만 본 발명의 절편들은 효소로 절단된 어떤 형태의 생성물에 한정되는 것은 아니고, 그 말단 부분이 어느 효소 절단 지점과 대응하지 않는 서열의 일부분도 포함한다. 그런 형태의 절편들은 여기서 제공된 서열 자료를 이용하여 화학합성 등의 방법에 의해 만들어 낼 수 있다. DNA 절편들은 또한 분리한 mRNA 로부터 불완전한 cDNA 합성에 의해서도 만들 수 있다. 또 단백질 절편들도 그것을 암호화하는 DNA 절편을 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 그러한 단백질 절편들도, 그것들이 면역반응 결정인자 및/또는 항원성 결정인자를 구성하는데 충분한 수의 아미노산 잔기를 갖는다면 본 발명에서 유용할 수 있다. 일반적으로 최소한 7, 8개의 아미노산 잔기가 필요하다. 그런 절편들이 면역반응성을 갖게 하기 위해서는 아래에서 설명하는 것처럼 그런 절편들을 면역원성 담체(immunogenic carrier)와 연결(coupling)할 필요가 있을 수도 있다.

본 발명의 단백질들은 재조합 DNA 방법, 화학합성, 또는 아이메리아로부터의 분리 등 당해 분야에서 알려진 여러 방법들을 사용하여 만들어낼 수 있다.

본 발명의 단백질들을 만드는데 필요한 DNA 는 제1도에서 제공된 뉴클레오티드 서열 정보를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 그런 화학 합성은 마튜시(Matteucci) 등의 포스포라미다이트(phosphoramidite) 고체 지지방법[J. Am. Chem. Soc. 103: 3185(1981)] 등 알려진 여러 방법들중 어느것을 사용해서도 할 수 있다.

또다른 방법으로서, cDNA 는 아이메리아 mRNA 로 부터도 만들 수 있다. mRNA 는 표준 기술을 이용하여 아이메리아 분열소체로부터 분리할 수 있다. 이 mRNA 를 사용하여 마니아티스(Maniatis) 등[Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 1982. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]이 기술한 대로 하면 이중가닥 cDNA 를 만들어 낼 수 있다.

이 cDNA 는 적당한 클로닝 벡터에 삽입시켜 이. 콜라이를 형질변환시켜서 cDNA 라이브러리(library)를 만드는데 사용할 수 있다.

이 cDNA 라이브러리는 본 발명에서 클로닝된 유전자나 그 절편들을 프로브(probe)로 사용하여 스크린(screen)될 수도 있다. 그런 유전자나 절편들은, a 위치가³²P 로 표지된 한 종류의 데옥시리보핵산(deoxyribonucleotide)을 포함하는 4가지 데옥시리보핵산을 넣고 PolI DNA 중합효소를 사용하여 닉-트랜스래이션(nick-translation)을 함으로써 프로브로 사용하기에 적당하게 방사능 표지를 할 수 있다. 이런 프로브들은 또한 아이메리아 표면 항원의 cDNA 의 알려진 서열을 바탕으로 올리고뉴클레오티드 합성에 의해서도 만들 수 있다.

비록 아이메리아 테넬라가 아래 예시에서 mRNA 의 근원(source)으로 사용되었어도 이 종(species)으로부터 클로닝된 유전자들은 여러 종 사이의 DNA 서열의 유사성으로 인해 아이메리아의 다른 종으로부터 유전자를 분리하는데에 프로브로 사용될 수 있다.

일단 동정되어 분리된 후, 본 발명의 아이메리아 DNA 서열들은, 삽입된 유전자 서열의 전사와 번역에 필요한 요소들을 갖춘 적절한 발현 비히클(vehicle)에 삽입된다. 여러 알려진 세균의 플라스미드, 파아지 DNA, 파아지 DNA 나 다른 발현 조절 서열들을 이용하기 위해 변화된 플라스미드 처럼 플라스미드와 파아지 DNA 의 복합체, 또는 효모 플라스미드 등 염색체의 절편, 비염색체 DNA 와 합성 DNA 서열들을 포함하는 클로닝 비히클들이 유용하게 사용된다. 사용될 수 있었던 특별한 클로닝 비히클들은 다음과 같은 것들을 포함하지만 다음에 한정되는 것은 아니다: pEV-vrf 플라스미드(크라울(crowl) 등, Gene 38: 31(1985)에 기술된 pEV-vrf1, -2, -3); SV 40; 아데노 바이러스; 효모; 람다 gt-WES-람다 B; 카론 4A 와 28; 람다-gt-1-람다 B; M13 에서 유래된 pUC 8, 9, 18, 19, pBR 313, 322, 325 등의 벡터들; pAC105; pVA 51; pACY 177; pKH 47; pACYC 184; pUB 110; pMB 9; Col E1; pSC101; pML 21; RSF 2124; pCR1 혹은 RP4; 파울폭스(fowlfox); 백시니아(vaccinia); 및 헤르페스 바이러스과에 속하는 바이러스 등이 그것이다.

아이메리아 유전자를 클로닝 벡터에 삽입하는 것은 이 두가지를 같은 제한 효소로 절단하면 쉽게 할 수 있는데 이는 상보적인 DNA 말단부분이 양쪽에 생기기 때문이다. 이 방법이 여의치 않을 때는 절단된 DNA 의 말단 부위의 외가닥 DNA 를 없애든가, 적당한 DNA 중합효소로 외가닥 DNA 부분을 메꾸어 넣어 양쪽 말단 부위를 평활말단(blunt end)으로 만드는 방법이 필요할 수도 있다. 이렇게 하여 T4 DNA 연결효소로 평활말단을 서로 연결시킬 수 있다. 또 다른 방법으로는 DNA 말단에 뉴클레오티드 서열(링커: linker)을 연결시켜 원하는 부분을 만들어 낼 수 있다. 이런 링커는 제한효소가 인식할 수 있는 서열을 갖도록 특정의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하게 할 수도 있다. 절단된 벡터와 아이메리아 유전자나 그 절편들은 모로우(Morrow)[Methods in Enzymology 68:3(1979)]가 기술한 것처럼 단일 폴리머(homopolymer)로 꼬리 붙이기를 함으로써 변형시켜 목적을 달성할 수도 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 많은 클로닝 비히클들은 원하는 형질변환 균주를 선택하는데 사용될 수 있는 하나나 그 이상의 , 표지가 되는 활성을 지니고 있는데, 예를들면 pBR 322 의 엠피실린(ampicillin)과 테트라사이클린(tetracycline)에 대한 저항성, pUC 8 의 엠피실린에 대한 저항성과 α-갈라토시다제(galactosidase) 활성, 그리고 pEV-vrf 플라스미드들의 엠피실린에 대한 저항성 등이 있다. 이런 벡터가 들어가 있는 숙주세포는 그 분리 선택이 아주 간단한데 그 이유는 벡터가 없으면 벡터에 의해 제공되는 여러 활성들이 결여되기 때문이다.

클로닝 비히클에서 선별된 부위에 삽입된 아이메리아 유전자의 뉴클레오티드 서열이 실제적인 구조 유전자의 일부분이 아닌 경우도 있을 수 있음을 알아야 한다. 또한 그 유전자들은 단지 완전한 야생(wild-type) 유전자의 일부분을 포함할 수도 있다. 유전자 절편들이 클로닝 비히클에 삽입된 후 적당한 숙주 생물내에서 아이메리아 표면 항원의 하나 이상의 면역 반응성 결정인자나 항원성 결정인자 혹은 그 두가지를 다 갖는 폴리펩티드나 단백질의 생성을 유도할 수 있는 것들 만이 필요하다. 그래서 본 발명에서의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하고 있는 재조합 벡터는 다음과 같이 제조한다.

(a) 상기 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 벡터내에 삽입시키고;

(b) 상기 벡터를 미생물내에서 복제시킨 후; 및

(c) 미생물로부터 재조합 벡터를 분리해낸다.

저당한 숙주생물의 선택은 당해 분야에서 알려진 많은 요인들에 의해 영향을 받는다. 이 요인들은 예를 들면, 사용하는 벡터와의 공존성, 하이브리드 플라스미드에 의해 암호화되는 단백질들의 독성, 원하는 단백질을 용이하게 회수할 수 있는가의 문제, 발현 특성, 생물학적 안전성 및 비용 등을 들 수 있다. 이런 요소들의 균형이 고려되어야 하고, 특정 재조합 DNA 분자의 발현이 모든 숙주에서 똑같이 효과적으로 되지 않는다는 것도 알아야만 한다.

본 발명에서 적당한 숙주 미생물은 식물, 동물, 효모 세포와 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 등과 같은 박테리아와 방선균 등을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 카사다반(Casadaban) 등이 기술했던 이. 콜라이 균주 MC1061[J. Mol. Biol. 138: 179(1980)]이 사용될 수도 있고 또는 플라스미드 pRK248 cIts 를 포함하는 다른 어떤 이. 콜라이 K-12 균주를 사용할 수도 있다. 다른 이. 콜라이 K-12 균주의 사용을 위한 플라스미드 pRK248 cIts 는 버나드(Bernhard) 등에 의해 기술되었으며 [Meth. of Enzymol. 68: 482(1979)] 또는 기탁번호 ATCC 33766 으로 미합중국 종균협회로부터 입수할 수도 있다. 이. 콜라이 균주 MC1061 은 클론테크(CLONTECH) 연구소(미합중국 캘리포니아주의 팔로 알토에 있음)로 부터 구입할 수도 있고, 기탁번호 ATCC 53338 로 미합중국 종균협회로부터도 얻를 수 있다. 이. 콜라이 균주 M15 에서 사용하기 위한 플라스미드 pDM1.1, pDS56/RBSII, -1 또는 -2 는 아래에서 기술하고 있다.

재조합 클로닝 벡터를 숙주세포내로 전달하는데에는 여러가지 방법이 쓰일 수 있다. 사용하는 벡터/숙주세포 체계의 특이성에 따라 형질전환(transformation), 형질도입(transduction), 형질감염(transfection)중 어느 것을 택해 전달할 수 있다. 일단 그런 변이 숙주 세포가 생겨나면 그 세포를 배양하여 발현된 생성물을 그 배양물로부터 분리할 수 있다.

아이메리아 표면 항원의 전구체 단백질을 생산하는 형질변환 균주 클론은, 아이메리아 테닐라의 포자 소체나 분열소체를 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 고정시킨 것에 대해 면역성이 생긴 동물로부터 분리한 혈청으로 검색하여 동정해 낸다. 아래의 예에서는, 토끼의 항-분열소체 혈청을 사용하여 유전자의 발현물을 검색하고 동정하였다. 면역화된 닭의 혈청으로 한 마찬가지 방법의 검색으로도 분열소체 표면 항원을 암호화하는 cDNA 를 독자적으로 분리할 수 있었다.

면역학적 검색이나 면역침전을 위해 사용하는 항혈청의 특이성은 홀(Hall) 등의 항체선택 방법을 변형시켜 사용함으로써 증가시킬 수 있었다[Nature 311:379(1984)]. 아래에서 더 상세히 설명하겠지만 이 방법에서는, 클론들에서 만들어진 아이메리아 단백질에 대한 특이성을 갖고 있는 항체를 막에 흡착시켰다.

아이메리아 항원을 생산하는 클론들을 찾는 것은 일반적으로 잘 알려진 표준 분석 방법을 사용해서 수행할 수 있는데, 그런 방법들로는 면역침전, 효소 면역 분석, 방사면역 분석 등이 있고 이들에 대해서는 여러 문헌들에 기술되어 있다(예를들면 커넷(Kennet) 등이 편집하고 뉴욕의 Plenum Press 에서 1980년 발간한 Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses 책의 376-384 쪽을 참조하라).

재조합 아이메리아 단백질을 다량 얻으려면 이런 방식으로 얻은 형질전환 미생물들을, 재조합 DNA 의 발현이 적절하게 되는 조건하에서 필요한 영양분을 포함하는 발효 배양액에서 배양시키면 된다. 이. 콜라이에서 생산될 때는 이 재조합 아이메리아 단백질은 세포질내에 있거나 세포 봉입체(inclusion body)내에 있게 된다. 그러므로 이 단백질을 분리하기 위해서는 박테리아의 외막(outer membrane)을 깰 필요가 있다. 이를 위해서는 초음파처리(sonication)를 하거나 프렌치(French) 세포 압착기나 가울린(Gaulin) 균질기(homogenizer) 등의 다른 기계적 분쇄 방법을 쓸 수도 있다[참(Charm) 등. Meth. Enzymol. 22, 476-556(1971)].

또 세포분쇄는 화학적 또는 효소적 방법에 의해서도 할 수 있다. 2가 양이온들은 세포막의 형태 보전에 자주 요구되기 때문에 EDTA 나 EGTA 같은 적당한 킬레이팅(chelating) 시약으로 처리하면 세포로부터 단백질이 누출되기 쉽도록 세포를 분쇄하기가 충분히 용이해진다. 이와 유사하게 라이소자임(lysozyme)과 같은 효소로도 같은 결과를 얻을 수 있다. 이 효소는 세포벽의 펩티도글리켄(peptidoglycan) 골격을 가수분해시킨다.

삼투압 충격의 방법도 또한 사용될 수 있다. 간단히 말하면 우선 세포들을 고장액에 넣어 수분을 잃어 수축하게 한 후 다음에서 저장액에 넣어 삼투압적으로 충격을 가함으로써 수분이 세포내로 급격히 유입되게 하는 동시에 원하는 단백질이 세포 밖으로 나오게 하는 것이다.

일단 세포로부터 분리된 아이메리아 단백질은 황산암모늄이나 황산나트륨 등의 염으로 침전시키든가, 한외여과나 기타 이 기술에서 잘 알려진 다른 방법들을 사용하여 농축시킨다. 더욱 정제하기 위해서 통상의 단백질 정제방법, 즉 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 정제용 디스크 겔(disc-gel)이나 커튼 전기영동(curtain electrophoresis), 등전 촛점법(isoelectric focusing), 저온 유기 용매 분별법이나 역류분배(countercurrent distribution)을 사용할 수 있으나 이 방법들에 한정되지는 않는다. 면역친화성(immunoaffinity) 크로마토그래피에 의해서도 정제가 가능하다.

생물체로부터 아이메리아 단백질들을 정제하는데 사용되는 특수한 방법들은 당해 분야에 이미 알려져 있다. 예를들면 뉴먼(Newman) 등의 유럽 특허출원 공개번호 164 176 를 참조하라.

본 발명의 단백질들이나 그 절편들은, 완전 고체상 합성(exclusive solid phase synthesis), 부분 고체상 합성(partial solid phase synthesis) 방법, 절편 축합(fragment condensation)이나 고전적인 용액 합성(solution synthesis)등과 같은 적당한 방법으로 화학적으로도 합성이 가능하다. 고체상 합성은 메리필드(Merrifield)가 기술한 방법이 많이 쓰이고 있다[J. Am. Chem. Soc. 85: 2149(1963)].

그러한 합성은 알파-아미노 말단이 보호된 아미노산으로 행해진다. 불안정한 측쇄(side-chain)를 가진 삼기작용성(trifunctional)의 아미노산도 펩티드가 조립(assemblage)되는 동안 그 부위에서 야기되는 화학 반응을 막기 위해 적절한 기(group)들로 보호한다. 알파-아미노 보호기는 아미노말단에서 다음 반응이 연속적으로 일어나도록 하기 위해 선택적으로 제거된다. 알파-아미노 보호기의 제거를 위한 조건은 보호기까지 제거하게 하지는 않는다.

알파-아미노 보호기들은 이 분야에서 펩티드를 단계적으로 합성하는데 유용하다고 알려진 것들이다. 여기에는 아실 형태 보호기(예를들면 포밀, 트리플루오로아세틸, 아세틸 등), 방향성 우레탄 형태 보호기(벤질옥시카보닐(benzyloxycarbonyl; Cbz), 치환 벤질옥시카보닐(substituted benzyloxycarbonyl) 등), 지방족 우레탄 보호기(3급 부틸옥시카보닐(t-부틸옥시카보닐; Boc), 이소프로필옥시카보닐(isopropyloxycrbonyl), 시클로헥실옥시카보닐(cyclohexyloxycarbonyl) 등)과 알킬 형태 보호기(벤질, 트리페닐메틸 등)등의 여러 형태가 포함된다. 바람직한 보호기는 3급-부틸옥시카보닐(Boc)이다. 티로신을 위한 측쇄 보호기는 테트라하이드로피라닐(tetrahydropyranyl), 3급 부틸, 트리틸(trityl), 벤질, Cbz, 4-Br-Cbz, 2,6-디클로로벤질(dichlorobenzyl)기 등이 포함된다. 티로신에 대한 바람직한 측쇄 보호기는 2,6-디클로로벤질기이다. 아스파르트산을 위한 측쇄 보호기는 벤질, 2,6-디클로로벤질, 메틸, 에틸, 시클로헥실기 등이 포함된다. 아스파르트산에 대한 바람직한 측쇄 보호기는 시클로헥실기이다. 트레오닌과 세린을 위한 측쇄 보호기는 아세틸, 벤조일, 트리틸, 테트라하이드로피라닐, 벤질, 2,6-디클로로벤질, Cbz 등이 포함되며, 트레오닌과 세린의 바람직한 보호기는 벤질기이다. 아르기닌을 위한 측쇄 보호기는 니트로, Tos, Cbz, 아다멘틸옥시카보닐(adamentyloxycarbonyl), 또는 Boc 등이 포함된다. 아르기닌을 위한 바람직한 보호기는 Tos 이다. 리신의 측쇄 아미노기는 Cbz, 2-클로로-Cbz, Tos 또는 Boc 등을 써서 보호할 수 있다. 리신에 대한 바람직한 보호기는 2-클로로-Cbz 기이다. 측쇄 보호기의 선택은 다음을 기본으로 한다: 측쇄 보호기가 연결반응 조건하에서나 아미노 말단보호기의 제거동안 분리되지 않고, 연결반응 동안 완전하게 남아 있어야 한다. 측쇄 보호기는 마지막 펩티드의 합성이 완성된 후 원하는 펩티드를 변화시지 않는 조건을 사용하여 제거할 수 있어야만 한다.

고체상 합성은 보통 알파-아미노기가 보호된(측쇄도 보호된) 아미노산을 적절한 고체지지(solid support)에 부착시켜 카복시 말단으로부터 수행한다. 그 부착이 클로로메틸화 되거나 하이드로메틸화된 수지에서 이루어지면 에스테르 연결형태가 생기고, 만들어진 목표 펩티드는 자유로운 카복실기가 C-말단에 생긴다. 다른 방법으로 벤즈하이드릴아민(benzhydrylamine) 수지나 p-메틸벤즈하이드릴아민(p-methylbenzhydrylamine) 수지가 사용되면 아미드 결합이 형성되고 거기서 생긴 목표 펩티드는 C-말단에 카복스아미드(carboxamide)기를 가지게 된다. 이 수지들은 상업적으로 구입할 수 있으며 실시 준비는 1984년 미합중국 일리노이주 Rockford 의 Pierece Chemical Co. 에서 발행한 스테워트(Stewart) 등의 Solid Phase Petide Synthesis 제 2 판에 기술되어 있다.

측쇄가 Tos 로 보호되고 알파-아미노기를 Boc 로 보호한 C-말단 아미노산인 아르기닌은, 디시클로헥실카보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide: DCC), N,N'-디이소프로필카보디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide), 카보닐디이미다졸(carbonyldiiimidazole) 등을 포함하는 여러 활성화 시약들을 사용하여 벤즈하이드릴아민 수지에 부착시킨다. 수지 지지대에 부착한 후 0℃ 에서 25℃ 사이 온도로 디옥산(dioxane)에서 트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid; TFA)나 HCl 을 사용하여 알파-아미노 보호기를 제거한다. 발생가능한 S-알킬화를 억제하기 위해 메티오닌을 넣은 후 TFA 에다 디메틸설파이드(dimethylsufide)를 첨가한다. 알파-아미노 보호기를 제거한 후, 남아 있는 보호된 아미노산은 원하는 펩티드 서열을 얻기 위해 필요한 순서대로 단계적으로 연결한다.

DDC, N,N'-디이소프로필카보디이미드, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP: benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate)와 DCC-하이드록시벤조트리아졸(DCC-hydroxybenzotriazole: HOBt) 등을 포함하는 여러 활성화 시약을 연결반응에 사용할 수 있다. 각각 보호된 아미노산은 과량(2.5배 이상)으로 사용하고 연결반응은 DMF 나 CH₂Cl₂나 그 혼합액에서 보통 실시한다. 연결반응의 완결 정도는 각 단계마다 카이저(Kaiser) 등이 언급한 닌하이드린 반응에 의해 검사된다[Anal. Biochem. 34: 595(1970)]. 불완전한 연결반응이 일어난 경우 그 연결반응은 반복된다. 이런 연결반응들은 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 합성기 베가(Vega) 250 이나 다른 상업적으로 구입할 수 있는 기구로 자동적으로 실시할 수도 있다. 원하는 펩티드를 완전히 만들어낸 후 펩티드-수지는 TFA/디티오에탄(dithioethane)으로 보호기를 제거하고 액체 HF 등의 시약으로 0℃ 에서 1-2시간 반응시켜 수지로부터 펩티드를 떼어내고, 모든 측쇄 보호기를 제거해낸다.

고체 지지대에서 측쇄와 측쇄의 고리화는 산성 아미노산(아스파르트산 등)과 염기성 아미노산(리신 등)의 측쇄기의 선택적 절단을 가능하게 하는 직교 보호 체계(orthogonal protection scheme)의 사용을 필요로 한다.

이 목적을 위해서, 아스파르트산의 측쇄에는 9-플루오르에닐메틸(9-fluorenylmethyl: OFm) 보호기를 사용하고 리신의 측쇄에는 9-플루오르에닐메톡시카보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl: Fmoc)이 사용될 수 있다. 이런 경우 Boc 로 보호되는 펩티드-수지의 측쇄 보호기들은 DMF 에서 피페리딘(piperidine)으로 선택적으로 제거할 수 있다. 고리화는 고체 지지대에서, DCC, DCC/HOBt 나 BOP 등을 포함하는 여러가지 활성화 시약들을 사용하여 실시된다. HF 반응은 상기 언급한 시클릭 펩티드-수지에서 수행한다.

합성된 단백질의 정제는 재조합 기술로 생산된 단백질에서 언급한 대로 하여 실시할 수 있다.

아이메리아 단백질들은 생물체나 막 단백질 추출물로부터도 회수할 수 있다. 그런 방법들로 완전한 야생의 단백질을 생산할 수 있다. 이 목적을 위해 합성되거나 천연의 아이메리아 단백질들을 항원으로 사용하여 쾰러와 밀슈타인(Kohler Milstein)이 기술한 것처럼 단일클론 항체를 생산할 수 있다[Nature 256: 495(1975)]. 이 방법들은 본 발명의 23KD 아이메리아 표면 항원을 정제하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 하나나 그 이상의 아이메리아 단백질들은 이 단백질들과 생리학적으로 적당한 담체를 포함하는 백신으로 조성될 수 있다. 적당한 담체는 중성 수소이온 농도의 0.01 에서 0.1M 인산 완충액이나 생리식염수 등을 예로 들 수 있다.

콕시듐증에 대한 면역성은 다음 두 방법중 하나를 사용하여 증진시킬 수 있다. 첫째는 보조제(adjuvant)나 면역증가제(immunopotentiator)를 백신에 첨가할 수 있다. 둘째는 본 발명의 단백질들을 교차 연결 복합체나 담체 분자에 결합시켜서 더 큰 형태로 만들어서, 면역화시키려는 동물에 주입할 수도 있다.

동물들의 백신화를 위한 적당한 보조제는 보조제65(땅콩 기름, 마니드 모노올리에이트(mannide monooleate), 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 등을 포함하는); 알루미늄 하이드록사이드, 인산 알루미늄, 황산 알루미늄 등의 무기물 겔; 헥사데실아민(hexadecylamine), 옥타데실아민(octadecylamine), 리소레시틴(lysolecithin), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide), N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시메틸)프로판디아민(N,N-dioctadecyl-N',N'-bis(2-hydroxymethy1)propanediamine), 메톡시헥사데실글리세롤(methoxyhexadecylgycerol), 플루로닉 폴리올 등의 표면활성제(surfactant); 피란(pyran), 덱스트란설페이트, 폴리 IC, 폴리아크릴산, 카르보폴 등의 다가음이온들; 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 디메틸글리신, 터프트신(tuftsin) 등의 펩티드 종류; 그리고 기름 유화제 등이 속하지만 반드시 이것들에 한정되는 것은 아니다. 본 단백질들은 리포좀이나 다른 미세담체(microcarrier)에 주입시킨 후 투여할 수도 있었다.

리포좀이나 다른 미세 담체에 주입하면 백신의 방출이 더 오랜 기간에 걸쳐 유지될 수 있도록 하게 한다. 알자(Alza) 삼투 펌프 같은 펌프도 같은 목적에 사용될 수 있다.

본 발명의 단백질들 특히 더 작은 절편들의 면역원성은 교차결합이나 면역원 보호 분자(즉, 숙주 동물내에서 면역반응을 독자적으로 일으키는 특성을 가지는 고분자로 거기에 본 발명의 단백질들이나 단백질 절편들을 공유결합시킬 수 있다)에 연결시킴으로써 증진시킬 수 있다. 작은 단백질 절편들은 자주 헵텐(hepten: 한 항체에 특수하게 결합할 수는 있어도 항체 생산을 유도할 수는 없는 분자들이다. 즉 면역원이 아니다)으로 작용하기 때문에 면역원 보유 분자에 교차결합이나 접합시키는 것이 필요할 수도 있다. 그런 단백질 절편들을 면역원 보유 분자에 접합시키면, 흔히 보유체 효과(carrier effect)라고 알려진 효과를 통해 그 절편들이 면역원성을 갖게 한다.

적당한 면역원 보유 분자들은 단백질들과 폴리펩티드나 다당류, 지질다당류 등의 천연이나 합성된 중합체등을 그 예로 들 수 있다. 모레인(Morein) 등이 기술한 퀼 A(Quil A)라 부르는 글리코시드는 바람직한 면역원 보유체이다[Nature 308: 457(1984)]. 단백질의 보유체 분자들이 특히 바람직한데 키홀(Keyhole) 꽃양산 조개(limpet)의 헤모시아닌, 사람이나 소의 감마글로불린, 사람, 소, 토끼의 혈청 알부민, 또 메틸화된 그런 단백질이나 다른 유도체 등의 동물 혈청 단백질등이 여기에 포함되지만 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 다른 단백질 보유체들은 이 분야에서 숙달된 사람들에게는 쉽게 알 수 있는 것일 것이다. 아이메리아 단백질에 대한 항체를 만들어내고자 하는 숙주 동물에게, 그 단백질 보유체가 외래 단백질일 것이 바람직하지만 꼭 그래야만 되는 것은 아니다.

면역원 보유체 분자에 공유결합시키는 것은 이 방면에서 잘 알려진 여러 방법으로 실시할 수 있는데, 사용하는 보유체 분자의 성질에 따라 방법을 선택해야 한다. 면역원 보유 분자가 단백질일때는 디시클로헥실카보디이미드 같은 수용성 카보디이미드나 글루타르알데히드 등의 여러 방법으로 본 발명의 단백질들이나 그 절편들을 결합시킬 수 있다.

이와같은 연결 시약들은 따로 보유체 분자를 사용하지 않고도 본 발명의 단백질이나 그 절편들을 그것들끼리 교차 결합시키는데도 사용할 수 있다. 단백질이나 그 절편의 집합체로 교차결합시키는 것도 면역원성을 증진시킨다.

본 발명의 백신을 적절한 양으로 투여하면 가금류를 아이메리아 테넬라 감염으로부터 예방할 수 있다. 아이메리아 테넬라 항원에 대한 단일 클론 항체는 아이메리아 아세르불리나와 아이메리아 맥시마(E. maxima)와도 생체외 실험에서 교차반응을 나타내었는데 이는 이러한 종(species)들로 부터도 감염 예방이 될 수도 있다는 것을 나타낸다. 본 단백질들이나 그 절편들의 효과적 투여량은 백신 접종을 할 동물의 체중 1kg 당 약 5 내지 50 마이크로그램(㎍)이다. 바람직한 양은 약 25 내지 50㎍/kg 이다. 최초 백신 접종 후 1 내지 몇주후 증폭(booster) 백신접종을 하는 것이 바람직하다. 몇번의 증폭 접종을 하게 될 수도 있다. 그러한 증폭 접종의 투여량은 일반적으로 체중 1kg 당 5 내지 50 ㎍ 을 사용하는데 20 내지 50 ㎍/kg 이 바람직하다. 투여의 표준 경로는 피하, 내피, 근육내, 경구, 직장 또는 알속으로 투여하는 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 콕시듐 항원을 가금의 면역 체계로 주입하는 것은, 그 항원들을 암호화하는 유전자들을 박테리아나(이. 콜라이나 살모넬라 등을 예로 들 수 있다) 바이러스(폭스바이러스나 헤르페스바이러스 등)에 클로닝시켜서 살아있는 벡터 체계나 필요할 때는 그것들의 비활성화된 형태를, 경구나 주사 또는 다른 흔한 경로를 사용해서 가금류에 투여함으로써 실시될 수 있다. 카르빗 등은 이. 콜라이 사용에 대해 기술한 반면[Vaccines, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory 68-71쪽] 클레멘트는 살모넬라의 사용에 대해 기술하고 있다[Pathol. Immunopathol. Res. 6: 137(1987)]. 모스(Moss) 등은 재조합 폭스바이러스를 사용하여 바이러스 벡터 체계의 사용을 자세히 기술했다[Ann. Rev. Immunol. 5: 305(1987)].

폭스바이러스의 한 종류인 백시니아 바이러스는 세포배양이나 동물체에서 콕시듐 항원의 전달을 시험하는데 사용될 수 있다. 분석용 연구를 위해서는 백시니아 바이러스가 또다른 사용가능한 폭스바이러스인 파울폭스(fowlpox)바이러스보다 더 효과적이다. 그 이유는 백시니아 바이러스가 조류의 바이러스에 비해 증식 속도가 빠르고 숙주범위가 닭 세포에 한정되지 않기 때문이다. 바이러스의 성숙(maturation)이나 감염성을 방해하지 않고도 많은 양의 이종(heterologous) DNA 를 백시니아 바이러스의 게놈(genome)에 삽입시킬 수가 있다[스미드(smith) 등, Gene 25: 21(1983)]. 바이러스를 이용하여 다양한 이종 유전자들을 삽입시키고 발현시켰을때, 감염된 동물에서는 발현된 항원에 대한 항체 생산이 이루어졌다[퍼커스(Perkus) 등, Science 229: 981(1985)].

재조합 백시니아 바이러스를 생산하기 위한 실험기술은 폭스바이러스나 헤르페스바이러스 체계에서 쓰는 일상적인 실험 과정에 의해 쉽게 적용될 수 있다. 본 발명의 한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 바이러스는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다:

(a) 언급된 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA 를, 바이러스의 성숙과 감염성을 방해하지 않게 바이러스의 게놈에 삽입시키고;

(b) 세포 배양으로 이 재조합 바이러스를 증폭시키고; 및

(c) 배양 배지로부터 이 재조합 바이러스를 분리 정제한다.

콕시듐증에 대한 백신에서 재조합 바이러스를 담체로 사용하면 백신 접종된 가금이 콕시듐증과 바이러스 매체에 대한 면역성을 둘다 갖게 되는 잇점이 있다(즉, 2가지 기능을 갖는 백신이 된다). 이런 백신의 유용성은 매체 바이러스에 또다른 유전자를 삽입시킴으로써 더 증가될 수 있다. 예를들면 뉴우캐슬(Newcastle)병 바이러스 게놈의 부분들을 콕시듐 항원 게놈과 함께 파울폭스 바이러스에 삽입시켜서 사용하면 한가지 백신으로 뉴우캐슬병, 콕시듐증, 파울폭스에 대한 면역성을 얻게할 수 있는 것이다.

본 발명의 살아있는 벡터 백신을 투여하는 것은 이 분야에서 잘 알려진 많은 방법들을 사용해서 실시할 수 있다. 예를들면 바늘(stick) 방법이 가금류에 파울폭스 바이러스에 대한 예방접종하는데에 흔히 사용된다. 이 방법은 날카로운 바늘을 백신에 담갔다가 깃자루 양쪽의 막 부분을찌르고 쑤시는 방법이다. 여기 사용하는 바늘은 백신 한방울을 묻힐 수 있도록 재봉틀 바늘처럼 끝부분에 구멍이 있는 것이 보통이다. 또한 다른 방법으로서 살아있는 백신을 깃자루 막 부분에 피하나 피내 혹은 다른 부위를 통해 주입할 수도 있다.

살아 있는 재조합 벡터 백신을 마시는 물에 첨가하거나 예방접종하려는 닭에게 뿌리는 방법을 쓸 수도 있다. 또한 사료에 넣어서 투여할 수도 있는데 이때는 보호 캡슐에 넣은 후([Balancou et al., Nature 322: 373(1986)])에 사용하는 것이 바람직하며, 알속으로 투여할 수도 있다. 후자의 방법으로 바이러스 백신을 달걀(embryo)로 직접 주입할 수 있다[샤르마(Sharma), Avian Dis. 25: 1155(1985)].

[실시예]

여기서 인용된 모든 참고문헌은 그대로 여기서 참고문헌으로 인용했다.

특별히 다른 언급이 없는 한 아래에 주어진 백분율은, 고체혼합물에서의 고체비율은 중량/중량으로, 액체에 대한 액체의 비율은 부피/부피로 액체에서의 고체 비율은 중량/부피를 각각 기준으로 하고 있다.

[실시예 1]

[분열소체의 정제]

아이메리아 테넬라의 분열소체는, 아이메리아 테넬라의 포자화된 낭포체를 닭 한마리당 50,000개 정도 닭에게 감염시킨후 5일된 50마리의 감염된 닭 (3주된 후버드 크로스(Hubbard Crss)종을 뉴저지주의 프렌치 타운에 있는 애비언 서비스 (Avian Services)에서 구입하여 사용)의 맹장으로부터 수확했다. 다른데서 얻은 비슷한 닭을 사용할 수도 있다. 이 맹장은 자력교반기(magnetic stirrer)위에서 15분간 인산 완충 염수(phosphate buffered saline: PBS)로 씻은후 제거해 버린다. 상피 파편들은 저속 원심분리(50 xg)에 의해 일부분 제거되고 4℃에서 10분간 2000 xg로 원심분리하면 조(crude)분열소체를 회수할 수 있다. 이 침전물을 용해 완충액(8.29g/l NH₄Cl, 0.372g/l Na₂EDTA, 1.0g/l KHCO₃, pH 7.6)에 다시 섞어서 얼음에 30분간 방치해 둔다. 분열소체들을 원심분리에 의해 모은후 PBS 에서 한번 씻고 분리용 깔대기에서 1.0 g 의 스펀 나일론 섬유(Scrub Nylon Fiber, Fenwell Lab. Deerfield, IL)를 채운 컬럼에 통과시킨다. 앞에서와 같이 원심분리에 의해 분열소체를 모아서 RNA 분리를 위해 드라이 아이스에서 얼리든가, 웨스턴 블럿(Western blot) 분석을 위해 디에틸아미노에틸 셀룰로즈(DEAE, Whatman DE52, Whatman Bio Systems, Inc, Clifton, NJ)에서 더 정제한다.

DEAE 셀룰로스에서 정제하기 위해서는 약 1 x 10⁹분열소체들을 PBS 에 녹여 10 ㎖ 흡착제 부피의 컬럼에 가한 후 PBS 로 용리한다. 분열소체는 최초의 컬럼통과액 100 ㎖ 에서 회수되었는데 적혈구나 다른 세포 파편들이 없었다.

[실시예 2]

[¹²⁵I으로 표지된 표면 단백질들의 면역침전]

정제된 분열소체의 표면 단백질들은 아이오도겐(IODOGEN) 방법(Pierce Chemical Co.) 또는 아이오도비드(IODOBEADS)(Pierce Chemical Co.)를 사용하여¹²⁵I로 표지되었다. 후자의 방법 과정을 위해 4 개의 아이오도비드를 pH 7.5 의 0.2 M 인산나트륨으로 3번 씻고 1 내지 3 mCi의¹²⁵I-Na 을 첨가하여 상온에서 5분간 방치하였다. 정제된 분열소체(3 x 10⁸)을 pH 7.0 의 PBS 200㎕ 에 섞어 상기 반응이 일어나고 있는 용기에 첨가하여 계속해서 15분간 방치하였다. 그 후 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)를 최종 농도 5 mM 이 되도록 넣어 주었다.

표지된 분열소체는 12,000 xg 에서 30초간 원심분리하여 반응 혼합물로부터 회수하여 PBS 에 녹인 2 % 소디움도데실 설페이트(SDS)나 1% 트리톤 X-100 1 ㎖ 에 녹였다. 녹지 않는 물질은 12,000g 에서 3분간 원심분리함으로써 제거했다. 녹인 단백질들은 3,500 분자량의 차단막을 사용해서 4℃ 에서 pH 7.0 의 PBS 3리터에서 투석하여 남아있는 유리¹²⁵I 를 제거했다.¹²⁵I 으로 표지된 단백질들은(보통 약 1.5 x 10⁸cpm 이 단백질에 결합되었다) 사용할 때까지 4℃ 에서 보관했다. TCA 로 침전될 수 있는 방사능은 보통 전체 방사능의 95 % 이상이었다.

글루타르알데히드로 고정된 분열소체에 대한 토끼의 항 혈청은 다음과 같은 방법으로 마련하였다:

약 1 x 10⁹의 정제된 기생충을, PBS 에 넣은 1 % 글루타르알데히드에 섞어서 상온에다 5분간 방치하였다. 고정된 분열소체는 2000 xg 에서 5분간 원심분리하여 모은 후 PBS 로 3번 씻고 1 ㎖ PBS 에 다시 섞었다. 0.5 ㎖ 의 완전 프로인트 보조제에 유화시킨 고정된 기생충 용액 총 0.5 ㎖ 을 뉴질랜드산 흰 토끼의 등 피부에 몇번 내피 주사를 놓았다. 그 다음에는 불완전 프로인트 보조제에 섞은 같은 기생충 단백질로, 2주 간격으로 2번의 증폭 접종을 하였다. 마지막 증폭 주사후 2주일 지난 다음, 귀의 정맥으로부터 피를 뽑아내고, 항체를 포함하는 혈청은 2500 xg 에서 15분간 응결된 뽑은 피를 원심분리함으로써 얻을 수 있었다.

면역침전을 위해 표지된 단백질 시료(5 x 10⁵cpm 을 포함하는 5 ㎕)는 100 ㎕ 의 IP 완충액(0.25% NP-40, 20mM 트리스-HCl, pH 7.5, 0.15 M 염화나트륨)에 희석하여 5 ㎍ 의 스태프-A (staph-A) 단백질(판소르빈

(Pansorbin

), Calbiochem Corp., San Diego, CA)와 함께 얼음에 20분간 방치함으로써 미리 깨끗이하고, 5 내지 10 ㎕ 의 토끼 항-분열소체 혈청과 함께 4℃ 에서 몇시간 방치하였다. 항체 복합체들은 5 ㎍ 의 스테프-A 단백질과 함께 얼음에서 20분간 두번째로 방치한 후 에펜도르프(Eppendorf)원심분리기에서 15초간 원심분리함으로써 모았다. 침전물은 IP 완충액으로 4번 씻었고, 항체반응액에 의해 면역침전된 표지 단백질들은, SDS 겔 시료 완충액 (65 mM 트리스 pH.8, 0.5% SDS, 5% β-멀캡토에탄올, 10% 글리세롤, 0.1% 브로모페놀 블루)에서 5분간 100℃ 에서 가열해줌으로써 복합체로 부터 용리되었다. SDS 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동은 램리(Laemmli)가 기술한 방법대로 실시하였다[Nature 227: 680 (1970)].

토끼 항혈청으로 얻은 결과들은 아래와 같이 준비한 면역된 닭 혈청을 사용하여 확인되었다. 닭들은 아이메리아 테넬라의 생존한 포자화된 낭포체를 반복해서 감염시킴으로써 면역화하였다(2주 간격으로 3번, 100,000 낭포체 사용). 심장에 구멍을 뚫어 피를 모으고, 2500 xg 에서 5분간 원심분리하여 응결된 덩어리들로부터 항체를 포함하는 혈청을 분리하였다.

항-분열소체 토끼 혈청과 면역된 닭의 혈청을 둘다

(1)¹²⁵I로 표면이 표지된 아이메리아 분열소체 단백질들과

(2) 폴리(A)-포함하는 분열소체 RNA 를 생체외 단백질 번역한 생성물들과 면역침전시키는데 사용함으로써 비교 연구를 하였다. 그리고 나서 침전된 단백질들은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 하고 표준 형광사진 기술과 시약들을 사용하여 형광사진으로 볼 수 있게 하였다.

이 연구는 두가지 근원으로부터 얻은 많은 단백질들이 두 혈청에 의해 침전된다는 것을 보여주었다. 따라서 둘 중 어떤 혈청도 아이메리아 단백질들을 발현하는 유전자 재조합체를 검색하는데 사용될 수 있었다. 편의상 토끼 항-분열소체 혈청을 아래에서 기술하는 검색과정에 우선 사용하였다. 하지만 면역된 닭 혈청은 아래에서 기술된 대로 cDNA 라이브러리의 마찬가지 검색 과정에서 사용하였다. 이것은 전염성 있는 생물에 대한 면역반응에서 중요할 것 같은 단백질의 감별에 필수적인데, 왜냐하면 닭 혈청만이 살아있는 생물의 공격에 반응하여 생산되었기 때문이다. 면역화된 닭만이 그런 생물들에 대해 뚜렷하게 저항력이 있다.

아이메리아 단백질들에 대한, 토끼 항-분열소체 혈청의 특수성을 증가시키기 위해 앞에 언급한 홀(Hall)등에 의해 기술된 대로 혈청에서 항체 선택을 실행하였다. 간략하게 말하면 재조합 파아지 클론(아래 참조)에 의해 발현되는 전구체 단백질에 대해 특수하게 반응하는 항체들은 아래와 같은 방법으로 토끼 항-분열소체 혈청으로 부터 정제되었다.

양성 반응의 파아지를 높은 밀도로 배지에 도말하여 42℃ 에서 3.5시간동안 키웠다. 융합 단백질의 발현은 평판배지위에 10mM 이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)로 포화된 니트로셀룰로스 필터를 깔아줌으로써 유도시키고 배양은 37℃ 에서 6 내지 8시간동안 계속하였다. 항원이 실려진 필터들을 TBS(20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl)에서 씻어내고, 이 콜라이 숙주 박테리아에 미리 흡착시킨 과량의 항-분열소체 혈청과 4℃ 에서 8 내지 10시간 동안 반응시켰다. 이 필터들은 비 특수성 항체를 제거하기 위해 TBS 로 3번 씻어주었다.

필터위에 있는 융합 단백질에 특수하게 붙은 항체들은 0.1M 글리신, pH 2.6, 0.15M NaCl 용액 2㎖ 로 용리시켰다(20℃ 에서 15분). 용리된 항체는 즉시 같은 부피의 pH 8.0 의 0.1M 트리스-HCl 로 중화시켰다. 이 선택된 항체들(이후로는 항체-선택 항체라고 부른다)은 표면이 표지된 분열소체이 면역침전, 생체외 단백질 번역 생성물의 면역침전, 또는 전체 분열소체 단백질의 웨스턴 블럿에서 프로브로 사용되었다. 기준 혈청은 항체 선택과정에서 비 재조합 파아지를 사용하여 준비하였다.

항체 선택 항체들을 사용한 웨스턴 블럿과 면역침전 분석의 결과는 제2도에 나타나 있다. 표지된 단백질의 면역침전의 생성물은 보너(Bonner)등이 기술한 형광사진에 의해 가시화되었다[Eur. J. Biochem. 46: 83(1974)]. 도면 오른쪽에 있는 숫자들은 분자량 표지 단백질들의 위치를 KD 단위로 표시한 것이다.

제2도의 A 란은 기준 혈청(a) 또는 항체-선택항체들(b)을 프로브로하여 전체 분열소체 단백질들을 면역 블럿한 것이다. B 란은 기준 항체와 면역침전(a) 또는 항체-선택 항체와 면역침전(b)시킨¹²⁵I로 표면이 표지된 분열소체 단백질들을 보여주고 있다.

[실시예 3]

[분열소체 mRNA의 분리와 생체외 단백질 번역]

1 x 10⁹내지 1 x 10¹⁰개의 생물을 포함하는 얼려놓은 분열소체 펠릿을 1mM 의 디티오트레이톨(DTT)과 300 유닛의 RNasin(Promega Biotec. Madison, WI)을 포함하는 10㎖ 의 TEL/SDS 완충액(0.2M Tris HCl, 0.1M LiCl, 25mM EDTA, 1%(w/v) SDS, pH 8.8)에 녹여서 테프론(teflon)을 입힌 조직 균질기(homogenizer)로 10 내지 12 회 저으면서 균질화시켰다. 녹지않는 파편은 3000 xg 에서 차가운 상태로 원심분리해서 분리하였다. 상층액은 TEL 완충액으로 평형화시킨 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(24:24:1, v/v)로 두번 추출해 주었다.

수성층에 단백질 분해 효소 K 를 100mg/㎖ 로 넣어 37℃ 에서 30분간 단백질을 분해시키고 같은 부피의 페놀:클로로포름(1:1)으로 재 추출하였다. 그리고나서 2배 부피의 에탄올을 넣고 드라이아이스에서 1시간동안 두거나 -20℃ 에서 밤새워 방치함으로써 핵산을 침전시켰다. 10,000 xg 에서 1시간동안 원심분리해서 얻은 침전물을 TE(10mM Tris, pH 7.5 2mM EDTA)에 다시 녹이고, 4㎖ 의 세슘클로라이드(CsCl) 쿠션(5.7M CsCl, 0.1M EDTA)에 통과하도록 20시간동안 15℃ 에서 150,000 xg 로 돌려주었다. RNA 침전물은 2.5배 부피 에탄올을 사용하여 0.2M 아세트산칼륨으로부터 재침전 시켰다. 이 전체 RNA 를 올리고-dT 셀룰로스에 한번 통과시켜 폴리(A)⁺RNA 의 비율을 늘였는데, 이 방법은 앞에서 언급한 마니아티스(Maniatis) 책의 197쪽에 기술되어 있다. 5 x 10⁹분열소체로부터 통상얻는 전체 RNA 1.9mg 에는 약 20㎍ 의 폴리(A)⁺RNA 가 포함되어 있다.

0.1에서 0.5㎍ 사이의 mRNA 를 생체외 단백질합성에 사용했는데, 이는 핵산분해효소로 처리한 토끼의 망상적혈구 분해물(Amersham Corp., Arlington Heights, IL or Promega Biotec)에 반응혼합물 20㎕ 당 10-20μCi 의³⁵S-메티오닌을 첨가한 반응액에서 실시했다. 생체외 단백질 번역 생성물은 면역침전 후 SDS PAGE 를 하여 상기 언급한 형광사진에 의해 가시화하여 분석하였는데 그 분석 결과는 제2도의 C 에서 보여주고 있다.

제2도 c 의 a 레인은 폴리(A)를 포함하는 분열소체 RNA 를 생체외 단백질 번역시킨 생성물의 완전 혼합물을 보여 주고 있다. b, c, d 레인은 단백질 번역 생성물을, 람다 5-7 로 표시된 재조합 파아지 클론(아래참조: 이 클론은 아이메리아 전구체 단백질을 암호화하는 유전자를 발현한다)에 의해 선택된 항체, 항-분열소체 혈청과 반응하는 또 다른 파아지 클론에 의해 선택된 항체, 비 재조합 람다 gt 11 클론에 의해 선택된 항체와 각각 면역침전 시킨 것을 나타낸다.

제2도 c 의 a 와 b 레인에서 분자량이 약 30KD 으로 나타나는 주요한 단백질을 볼 수 있다는 것을 주목해야만 한다. 이 단백질은 항체-선택 항체를 프로브로하여 면역 블럿한 전체 분열소체 단백질들을 포함하는 레인에서는 나타나지 않으나(A, b 레인), 23 KD 띠는 이 겔에서 볼 수 있다 (A 란, 레인 b, 화살표). 23 KD의 단백질도 제3도, B, b 레인에서 보는 것처럼¹²⁵I 로 표지된 분열소체 단백질로부터 항체 선택 항체에 의해 면역 침전 되었다. 이러한 사실들을 종합해 보면 30 KD 전구체 단백질이 단백질 분해에 의해 성숙된 분열소체에서는 23 KD 의 표면 항원으로 진행되었을 수 있다는 것을 시사한다.

[실시예 4]

[분열소체 cDNA 발현 라이브러리의 준비]

이중 가닥 cDNA 를 6㎍ 의 분열소체 폴리(A)⁺RNA 로부터 구블러(Gubler) 등이 기술한 방법대로 합성하였는데[Gene 25: 263(1983], 이 방법은 역전사효소(BRL, Gaithersburg, MD)를 사용하여 올리고(dT) 프라이머로부터 연장시키고 RNA 가수분해효소 H(RNaseH)(BRL)과 이.콜라이 DNA 중합효소 I(New England Biolabs., Beverly, MA)을 사용하여 상보적인 가닥을 합성하였다. 이중 가닥 cDNA 는 그 다음에 T4 DNA 중합효소(BRL)로 평활 말단화하고, 제조자의 실험방법에 따라 Eco RI 메틸화효소(New England Biolabs)로 처리한 후 Eco RI 링커(GGAATTCC, Collaborative REsearch Inc., Bedford, MA)를 첨가해 주었다.

Eco RI 으로 절단한 후, 후인(Huynh) 등에 의해 뒤에서 기술한 대로 과량의 링커 분자들과 약 300 bp 이하의 cDNA 를 제거하기 위해 바이오젤(Biogel) A-50M 에서 cDNA 를 분별하였다. 이 cDNA 는 그 다음에 에탄올 침전으로 농축시켰다.

라이브러리는 람다 gtll(λgtll; Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA)에 제조하였는데, 후인 등이 기술한 [글로버(Glover), DNA Cloning Vol.I: A Practical Approach, 1985, IRL Press, Washington, D.C., 49-78쪽]방법으로 만들었다. Eco RI으로 절단한 cDNA 절편들은 Eco RI으로 절단하고 탈인산화시킨 λgtll 가지(Stratagene Cloning Systems)에 연결시키고 이 연결된 DNA 를 제조자의 프로토콜에 따라 Gigapack

kit(Stratagene Cloning Systems)로 파아지내로 집어 넣었다.

이렇게 만든 라이브러리는 Y1088 숙주세포위에 도말하여 증폭시켰다. 재조합 파아지의 백분율은 이소프로필티오갈락토시드(IPTG, Sigma Chemical Co.)가 들어 있는 X-gal 평판 배지(상기 Maniatis, page 24)에서 형성되는 푸른색과 무색(투명한 색) 프라크(plaque)의 비율로부터 계산해 낼 수 있는데 약 90% 정도였다.

[실시예 5]

[cDNA 라이브러리의 면역학적 검색]

λgtll 분열소체 cDNA 발현 라이브러리는 150mm 평판 배지당 10,000 프라크정도의 밀도로 Y1090 세포위에 도말하였다. 이렇게 만든 6개의 평판배지를 42℃ 에서 3시간반 동안 배양한 후, β-갈락토시데이즈 융합 단백질의 발현을 유도하기 위해 10mM IPTG 에 미리 적신 니트로 셀룰로스 필터를 배지위에 올려놓고 37℃ 에서 다시 4 내지 5 시간에서 하룻밤동안 계속 배양하였다. 필터를 평판 배지로부터 때어내어 TBS(20mM 트리스 HCl, pH 8.0, 0.15M NaCl)로 회분식으로 몇번 씻어 주었다. 비특이적 단백질 결합 부위는 상온에서 1시간 동안 TBS 에 녹인 20% 태아 송아지 혈청에 넣어두어 미리 막아버렸다.

이 필터들은 그후 Y1090 세포들에 미리 흡착시켜 놓은 후 20% 송아지 혈청을 함유하는 TBS 에서 1:100 으로 희석시킨 토끼 항-분열소체 혈청과 1 시간동안 반응시켰다. 비특이적 항체들은 TBS 에 연속적으로 씻어주어 제거하는데, 그중 한번은 TBS 에 NP-40 를 0.1% 가 되도록 넣어준 후 씻는다. 이 필터들은 송아지 혈청을 첨가한 TBS 에 1:1000 으로 희석시킨 염소 항-토끼 퍼록시데이즈 결합체(BioRad, Richmond, CA)와 상온에서 1시간동안 반응시켜 주었다. 발색 반응은 4-클로로-1-나프톨(BioRad)로 제조자의 지침에 따라 실시했다.

또한 면역화된 닭의 혈청도 검색에 사용했다. 이 혈청은 Y1090 세포들에 미리 흡착시킨 후 토끼 혈청과 같은 방법으로 희석하여 사용했다. 토끼의 항-닭 항체를 이차적인 항체로 사용하고 염소의 항-토끼 양고추냉이(horseradish) 퍼록시데이즈 결합체를 탐지 항체로 사용하였다. 하나씩 분리된 프라크는 같은 시료를 사용하는 2차 검색에서 얻을 수 있었다.

람다 5-7 이라고 명명된 하나의 클론은 토끼 혈청의 항체와 강력하게 반응시키는 단백질을 생산했다. 두번째 분리물인 I-5 는 면역화된 닭의 혈청으로 검색하여 동정해내었는데 람다 5-7 클론과 같은 크기의 cDNA 를 포함하고 있는 것으로 밝혀졌다. DNA 서열 분석에 의해 이들 파아지 클론들은 똑 같은 분열소체 항원을 암호화하는 것을 알아낼 수 있었다.

[실시예 6]

[이. 콜라이에서 람다 5-7 cDNA의 발현]

람다 5-7 의 1.2 Kb 삽입물은 Eco RI 에 의한 절단과 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리해 내었다[마니아티스(Maniatis)등., 상기 참조. 157-170쪽]. Eco RI 말단은 클리나우 중합효소로 dATP, dTTP 를 넣어 반응시켜서 평활말단으로 만들고 이 양끝에 Bam HI 링커(GGGATCCC)를 연결시켰다. 이렇게 변형시킨 절편을 세가지 발현벡터 pDS56/RBSII, pDS56/RBSII, -1, pDS56/RBSII, -2 의 Bam HI 인식부위에 삽입시켰다. 이 세가지 벡터는 아래에서 언급되고 있다. 이렇게 하여 가능한 양 방향으로 삽입물을 포함하게 된 플라스미드로 공존할 수 있는 플라스미드 pDMI.1 을 갖고 있는 이. 콜라이 균주 M15을 만델(Mandel)등이 기술한 대로 형질 변환시켰다[J. Mol. Biol. 53: 159(1970)]. 플라스미드 pDS56/RBSII 와 pDMI.1 을 갖고 있는 이. 콜라이 균주 M15 은 유럽 특허 출원 공개번호 316 695 에 기술되어 있다.

[실시예 7]

[플라스미드 구성]

일반적으로 플라스미드 pDS56/RBSII, -1 과 -2 는 조절할 수 있는 프러모터/오퍼레이터 요소 N250PSN250P29 와 리보좀 결합 부위 RBSII, RBSII(-1)과 RBSII(-2)를 각각 가지고 있다. 이 리보좀 결합 부위들은 이. 콜라이 파아지 T25 의 프러모터 P_G25의 리보좀 결합 부위[유럽 특허출원 공개 번호 207 459]로부터 유래된 것이며 DNA 합성에 의해서 얻었다.

높은 효율로 발현되기 때문에 위에서 언급된 플라스미드들은 락 억제인자를 그 오퍼레이터에 결합시켜 그 프러모터/오퍼레이터 요소를 억제함으로써만 이. 콜라이 세포내에 유지될 수가 있다. 락 억제인자는 lacI 유전자에서 암호화된다. N250PSN250P29 는 충분한 수의 억제인자가 세포내에 존재해야만 효과적으로 억제될 수 있다. 그러므로 억제인자 유전자의 발현이 증가되는 프러모터 돌연변이를 갖는 lacI^q인자가 사용된다. 이 lacI^q인자는 아래에 기술하는 것처럼 pDMI.1 에 존재한다.

pDM.1 플라스미드는 lacI 유전자 외에도 세균에 카나마이신에 대한 저항성을 주는 네오마이신 인산전이효소 유전자도 가지고 있어서 이것을 선택표지로 사용한다. pDMI.1 은 pDS56/RBSII, -1 과 -2 플라스미드와 함께 공존할 수 있다. 발현 벡터 pDS56/RBSII, -1, -2 에 의해 형질변환된 이. 콜라이 세포들은 pDMI.1 을 포함하고 있어야만 발현 벡터가 세포내에 안정하게 유지될 수 있다. 이 체계의 발현 유도는 배지에 IPTG 를 첨가하면 된다.

(1) 플라스미드 pDS56/RBSII

XbaI 과 XhoI 제한 효소 절단 부위의 사이에 있는 pDS56/RBSII 의 부분은 복제부분과 β-락타메이즈(세포에게 엠피실린 저항성을 준다) 유전자를 가지는데(제4도와 제5도), 원래는 플라스미드 pBR322 로부터 유래되었다[볼리버(Bolivar) 등, Gene 2: 95-113(1977): Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43: 77-90(1970)].

그렇지만 β-락타메이즈 유전자는 제한 효소 HincII 와 PstI 에 대한 절단 부위가 제거되도록 변형시켰다. DNA 서열상에서의 이 변형은 β-락타메이즈의 아미노산 서열에는 아무 영향을 미치지 않는다. 이 플라스미드의 나머지 부분에는 조절가능한 프러모터/오퍼레이터 요소 N250PSOP29, Eco RI/Bam HI 절편 부분인 리보좀 결합부위 RBSII, 제한효소 SalI, PstI, HindIII 에 대한 절단 부위, 이. 콜라이 파아지 람다의 종결인자 to[슈와쯔(Schwarz) 등, Nature 272: 410-414(1978)], 프러모터 없는 클로람페니콜 아세틸전이효소 유전자[마르콜리(Marcoli) 등, FEBS Letters, 110: 11-14(1980)]과 이. 콜라이 rrnB 오페론의 종결인자 T1[브로시우스(Brosius) 등, J. Mol. Biol. 148: 107-127 (1981)] 등이 포함되어 있다.

(2) 플라스미드 pDS56/RBSII(-1)

플라스미드 pDS56/RBSII(-1) (제6도, 제7도)은 플라스미드 pDS56/RBSII 와 비슷하나 리보솜 결합부위 RBSII(-1)을 포함하고 있다.

(3) 플라스미드 pDS56/RBSII(-2)

플라스미드 pDS56/RBSII(-2) (제8도, 제9도)는 플라스미드 pDS56/RBSII 와 비슷하나 리보솜 결합부위 RBSII(-2)을 포함하고 있다.

이 세가지 플라스미드의 차이점은 ATG 시작 코돈 다음의 하나의 뉴클레오티드가 다르다는 것인데 그 결과 모든 세가지 가능한 해독틀로부터 단백질을 발현할 수 있게 한다.

(4) 플라스미드 pDMI.1

플라스미드 pDMI.1(제10도, 제11도)은 전위 유전군(Transposon) Tn5(베크(Beck) 등. Gene 19: 327-336(1982)]으로부터 온 네오마이신 인산전이효소의 유전자가 있어서 이. 콜라이 세포에게 카나마이신에 대한 저항성을 부여하고, 프러모터 돌연변이 I^q[칼로스(Calos), Nature 274: 762-765(1978)]을 갖는 lacI 유전자[파라보우(Farabough), Nature 274: 765-769(1978)]가 있어서 lac 억제인자를 암호화한다. 더우기 플라스미드 pDMI.1 은 플라스미드 pACYC184[창과 코헨(Chang and Cohen), J. Bacteriol. 134: 1141-1156(1978)]의 일부분을 가지고 있어서, 복제와 딸 세포로의 안정된 전달에 필요한 모든 정보를 가지고 있다.

위에서 언급한 플라스미드 외에도 어떤 이. 콜라이 발현 체계라도 이 실험에 유용하도록 계획될 수 있다는 것을 강조하는 바이다.

박테리아 형질 변환주들은 LB 배지[마니아티스 등. 상기참조. 68쪽)에서 37℃ 에서 배양되고 단백질의 발현은 1mM IPTG 를 배지에 첨가함으로써 유도 된다. 1시간동안 배양한 후 배양액 1㎖ 을 떼어내어 원심분리에 의해 세포들을 모았다. 이 세포 침전물은 크라울 등[상기 참조]이 기술한 대로 처리하였고 이 용균체(lysate)로 SDS PAGE 를 하였다. 전기영동후 겔에 있는 단백질은 코마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색시키거나 니트로셀룰로스 필터에 옮겨 위에 언급한 토끼 항-분열소체 혈청을 사용하여 웨스턴 블럿 분석에 사용하였다[토우빈(Towbin) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350(1979); Burnetti, Anal. Biochem. 112: 195 (1981)].

이 분석에서 모든 세가지 해독틀중에서 한 가지 방향의 1.2 Kb cDNA 분자가 약 30 KD 의 분자량을 나타내고 토끼 항-분열소체 혈청으로부터 얻은 항체와 반응하는 단백질을 생산하였다. 이 사실은 제1도에서 보는 것처럼 cDNA 서열의 68 뉴클레오티드에 있는 ATG 시작 코돈 후의 세가지 해독틀 모두에 종결 코돈이 존재하는 것과 일치한다.

[실시예 8]

[DNA 서열 분석]

일반적으로 하룻밤동안 배양하여 포화된 배양액 1㎖로부터 소규모로 플라스미드 DNA를 분리하는 것은 번보임(Birnboim)등의 실험방법을 사용하였다[Nucleic Acids Research 7: 1513(1979)]. 이 방법으로 분석 목적을 위해 박테리아 콜로니로부터 작은 양의 DNA 를 분리할 수도 있다. 더 많은 양의 플라스미드 DNA 는 1리터 배양후 세슘 클로라이드 원심분리를 사용하는 표준적 방식에 따라 분리하였다[마니아티스 등 상기참조. 93쪽]

람다 5-7에 있는 1.2 kb Eco RI cDNA 삽입물의 DNA 서열은 다음과 같이 결정하였다. Eco RI 으로 절단하고 겔 분리한 삽입물을 Eco RI 으로 절단한 pEV-vrf 플라스미드와 연결하였다[크라울(Crowl) 등 Gene 38: 31(1985)]. 이 플라스미드를 pEV/5-7 이라 명명하고 하이브리디제이션(hybridization) 분석(아래에 기술)과 자구르스키(Zagursky) 기술한 방법[Gene Anal. Tech 2: 89(1983)]에 의한 예비적 DNA 서열분석에 사용하기 위한 1.2 kb cDNA 삽입물을 많이 만드는데 사용하였다.

완전한 DNA 서열을 결정하기 위해 1.2 kb cDNA 삽입물은 Bio-Rad M13 클로닝과 서열결정 키트(Bio-Rad M13 Cloning and Sequencing Kit)를 사용하여 M13, Mp18, Mp19 등의 단일 가닥 파아지 벡터에 더 서브클론시켰다. DNA 서열은 Bio-Rad 키트에서 제공하는 시약과 지침서를 사용하여 생어(Sanger)등의 디데옥시 체인-종결 (dideoxy chain-termination) 방법에 의해 결정하였다[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977)].

5' 과 3' 의 번역되지 않는 부분을 포함하여 람다 5-7의 1.2 kb cDNA 의 완전한 뉴클레오티드 서열은 제1도에 나타나 있다. 면역화된 닭 혈청을 이용해서 위에서 기술한 대로 분리한 두번째 클론 I-5 의 서열을 분석한 결과 이 클론의 cDNA 삽입물은 5' 말단에 다음의 서열이 부가되어 있었고 5-7 삽입물의 Eco RI 부위가 결여되어 있었다:

이 두번째 클론의 나머지 서열은 람다 5-7 의 서열과 비교할때 뉴클레오티드 번호 8 부터 폴리-a 트랙(tract)의 개시부위까지 뉴클레오티드 번호 300 을 제외하고 모두 같았고 뉴클레오티드 번호 300 위치에서는 티미딘(thymidine)대신 시티딘(cytidine)이 발견되었다.

이 cDNA 서열로부터 제1도에서 보는 것처럼 68 위치의 ATG 에서 688 위치의 TAA 종결 코돈까지 200 아미노산 잔기들을 암호화하는 열린 해독틀을 추측해 낼 수 있었다.

200 아미노산으로 된 단백질의 이론적인 분자량인 24 KD 은 분열소체 mRNA 를 단백질 번역하여 항체-선택항체들에 의해 면역침전했을 때 관찰되는 제일 많은 생성물(제3도, C 란 b 레인)의 어림잡은 크기나 위에서 기술한 이. 콜라이 발현 벡터내에서 cDNA 로부터 발현된 단백질의 크기보다 다소 작다. 그러나 이 이론적인 분자량은 이론적 분자량과, SDS-PAGE 에서 표준 분자량 표지들과의 상대적 위치에 의해 결정된 분자량과의 사이에서 예측할 수 있는 변동폭의 범위내에 있다.

람다 5-7 cDNA 삽입물에 의해 암호화되는 단백질의 추측된 아미노산 서열을(제1도) 분석해 보면 처음 20개의 말단 아미노산 잔기들은 전부 소수성을 가지고 있어서 신호 서열(singnal sequence)로서의 가능성을 암시하고 있다.

[실시예 9]

[하이브리디제이션 분석]

탈낭된 포자화 낭포체를 트립신과 담즙으로 처리하고 PBS 로 씻은 후 다음과 같은 방법으로 DNA 를 분리하였다.

약 1 x 10⁹낭포체를 20㎖ 의 0.5M EDTA, pH 8.0, 0.5% 사르코실(Sigma, St. Louis, MO)에 혼탁시켜서 단백질 분해효소 K(proteinase K)(Boehringes-Mannheim, BRD)를 0.1㎍/㎖ 농도로 넣고 50℃ 에서 2시간 동안 분해시키고 RNA 분해효소(10㎍/㎖)로 37℃ 에서 1시간, 그리고 다시 단백질 분해 효소 K로 50℃ 에서 1시간 동안 분해시켰다. 단백질 제거를 위해 20mM 트리스 HCl, pH 7.5, 1mM EDTA(TE)로 포화된 페놀로 두번 추출하고 페놀:클로로포름(1:1)에서 한번 추출하였다. 수용층은 많은 양의 TE 에 대해 투석하고 에탄올 침전으로 농축하였다. 보통 1 x 10⁶낭포체에서 0.4mg 의 DNA 를 얻었다.

이렇게 얻은 기생충 DNA 는 제조자의 지침서에 따라 여러가지 제한 효소로 절단하고, 절단된 DNA 절편들은 로에닝(Loening) 완충액(4.7g NaH₂PO₄, 4.36g 트리스 염기, 0.372g Na₂EDTA/리터)에서 0.8% 아가로스 겔에 40볼트로 2.5시간동안 전기영동하여 분석하였다. 이 겔은 0.25M HCl로 30분간 처리한 후 0.4M NaOH에서 제타-프로브(Zata-probe) 막(Bio-Rad)에 밤새 옮겼다. 이 필터는 2 x SSC(pH 6.8)에서 중화시켜서 진공상태에서 80℃온도로 1시간동안 구웠다.

이 필터는 pH 7.2의 7% SDS, 1% BSA(Boehringer, 분류V), 0.5M NaHPO₄완충액에서 65℃ 온도로 3시간동안 프리하이브리디제이션(prehybridization)을 실시하였다. 5-7 유전자의 Eco RI 삽입물은 위에서 기술한대로 Eco RI 으로 pEV/5-7 플라스미드를 절단한 후 겔에서 분리하였고,³²P 로 표지된 데옥시뉴클레오티드를 넣고 클리나우 절편으로 무작위 프라이밍(random priming)하여 표지를 하였다. 이 표지된 삽입물은 스핀-컬럼(Spin-Columns)(Bio-Rad)으로 통합되지 않은 뉴클레오티드로부터 분리시키고 변성시킨 후 하이브리디제이션 용액에 첨가하였다. 12시간동안 65℃ 에서 반응시킨 후 필터들을 65℃ 에서 2 x SSC/0.1% SDS 로 3번 씻어내고 0.1 x SSC/0.1% SDS 로 두번 씻어 주었다. 프로브와 하이브리다이즈된 게놈 DNA 절편들은 방사선 사진으로 찾았다. 여기서는 pEV/5-7 플라스미드가 사용되었지만 분열소체 5-7 유전자의 1.2 kb cDNA 삽입물을 포함하는 대등한 벡터는 어떤 것이든 사용해도 만족한 결과를 얻을 수 있다는 것을 알고 있다.

이 분석의 결과는 제3도에 나타내었는데 PvuII(1), HincII(2), PstI(3), SphI(4) 또는 SacI(5)으로 절단한 결과들이 나타나 있다.

제3도의 레인 1 과 5 에서 각각 PvuII와 SacI으로 절단된 게놈 DNA 의 6.5 kb 와 3.6 kb 절편을 찾을 수 있었다. 이 효소들에 대한 인식부위가 cDNA 클론에는 없기 때문에 아미메리아 유전자의 최대한 크기는 3.6 kb 로 어림잡을 수 있다. 게놈 DNA 를 Eco RI 으로 절단하면 cDNA 절편 크기에 상당하는 1.2 kb 게놈 절편이 생겨났다.

HincII 와 Eco RI 으로 동시에 절단했을 때는, Eco RI 인식부위에 의해 가깝게 둘러싸인 cDNA 서열로부터 예측된 0.9 kb 절편이 생겼다.

PstI 으로 절단했을때 3개의 절편을 찾아볼 수 있었다(레인 3). cDNA 서열로부터 2개의 PstI 인식부위가 예상되었는데, PstI 으로 절단할 경우 305bp 의 내부 절편 하나와 2개의 접합 부분 절편을 만들어 낼 것으로 예상된다. 세번째의 큰 PstI 절편이 나타나는 것은 아마도 내부 PstI 절단부위에서 불완전한 절단이 생긴 결과일 것이다. cDNA 내에 두개의 인식부위가 있는 SphI 에 의해 생겨난 절편들의 형태(4 레인)는 어떤 단정적인 정보를 제공해 주지 않는다. cDNA 서열로부터 예측되는 작은 내부 SphI 절편은 이 겔에서는 아마 나타나지 않았을 것이다.

분열소체로부터 분리한 폴리(A)-포함하는 mRNA의 노던 블럿 분석에서는 람다 5-7 유전자의 1.2 kb cDNA 절편이 약 1.3 kb 길이의 단일한 mRNA 종류와 하이브리디제이션 하였다[알윈(Alwine)등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5350(1977)]. 길이의 상관관계로 볼때, 5-7 클론과 위에서 언급한 I-5 클론으로부터 결정된 5' 말단의 연장부분을 합한 것이 cDNA의 전체길이를 나타내는 것이라고 보여지지만 5' 말단 뉴클레오티드 부분에 예외가 있을 수도 있다.

이상을 종합해 볼 때 앞의 관찰들은 cDNA 와 게놈의 서열이 공통의 선상에 있다는 것과 일치하고 있다.

본 발명에 가하는 많은 변형과 변화가 본 발명의 본질과 영역을 벗어나지 않고 행해질 수 있고 그런 사실은 당해 분야에 숙달된 사람들에게는 자명한 일이다. 여기서 기술된 특정한 실시예는 단지 예를 들기 위해 제공된 것이고, 본 발명은 단지 첨부된 청구범위의 용어들에 의해서만 제한된다.

Claims (6)

1. SDS PAGE 에 의해 약 30 KD 의 분자량을 나타내는 전구체 단백질로부터 유래되어 SDS PAGE 에 의해 약 23 KD 의 분자량을 나타내는 아이메리아 분열소체 표면 항원의 면역반응성 및/또는 항원성 결정인자를 하나 이상 가지며; 하기 아미노산 서열을 갖거나, 또는 하기 아미노산 서열에서 최초 20개의 아미노산 잔기가 본질적으로 결여된 부분 서열을 가지며; 다른 아이메리아 단백질들은 실질적으로 제거된 단백질:

   
2. 제1항의 단백질을 암호화하는 DNA.
3. 하기 뉴클레오티드 서열의 전부나 일부를 갖는 제1항의 단백질을 암호화하는 DNA.

   
4. 제1항의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하고 적절한 숙주 생물내에서 상기 DNA 를 발현시킬 수 있는 재조합 벡터.
5. 제1항의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하고 적절한 숙주 생물내에서 상기 DNA 를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스.
6. 제1항의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 벡터를 내포하고, 상기 DNA 를 발현시킬 수 있는 형질전환된 미생물.

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