CN1149258A - 抑制素组合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及经投用包含抑制素或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质，以加速鸟类，特别是扁平胸鸟类和鹦鹉样鸟类之初情期开始的方法。本发明还涉及通过投用外源蛋白质以提高动物，特别是鸟类，更具体地说是平胸鸟类之卵产生量的方法。本发明进一步涉及异源蛋白质和生产异源蛋白质的方法。生产融合异源蛋白质的方法包括将编码抑制剂或其片段的双链cDNA插入编码载体蛋白质如麦芽糖结合蛋白质或牛血清白蛋白的载体中。将此载体插入表达系统中后，由该系统表达融合的异源蛋白质。在纯化所表达的异源蛋白质后，给动物投用有效量的该蛋白质，从而在动物体内引发抗异源蛋白质的免疫学反应。
Description
本申请是1994年2月28日提交的美国专利申请序号NO.08/202,964的部分继续部分。
发明的领域
本发明总地涉及经投用包含抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质，以加速鸟类特别是平胸鸟和鹦鹉样鸟类的初情期开始。
本发明还涉及经投用包含抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质，以增加动物，特别是鸟类，更具体地说是平胸鸟类之卵产生量的方法。本发明进一步涉及包含抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质，以及生产该异源蛋白质的方法，其中抑制素是与载体蛋白质融合或结合的。
发明的背景
平胸鸟是不能飞的，一般都很大的奔跑的鸟类，其中包括驼鸟、鸸鹋、美洲驼、食火鸡及几维等几个目。鸸鹋(Dromiceius novaehol-landiae)是一种澳大利亚平胸鸟，其特征是有已退化的翅膀和长着羽毛的头和颈。成年鸸鹋平均约6英尺高，体重约150磅。鸵鸟(Struthio camelius)是一种大的奔跑的鸟，有小翅膀和粗壮有力的腿。标准的成年鸵鸟约8英尺高，体重约325至375磅。术语“美洲鸵”是Rheiformes目鸟类成员的通称。Rheiformes是称为美洲鸵的南洲奔跑鸟类的一个目，其在身体较小、有带羽毛的头和颈及三趾足等特征上不同于纯种鸵鸟。
鸵鸟和鸸鹋分别在其南美和澳大利亚的自然环境中长期来就具有商业价值。对鸵鸟产品的需求已有100年以上的历史，实质上在世界范围内对其皮、肉和羽毛均有市场。例如，鸵鸟皮被用于制作皮靴、手袋、上衣、手提箱、钱包及许多其他用品。鸵鸟毛被用于制作时装、戏装及羽毛掸子。例如，在欧洲市场上每公斤售价约60至1,200美元。另外，鸵鸟毛被看作是“灰尘磁石”，因此在美国及其他国家的计算机和汽车工业中有很高的需求量。
相反，鸸鹋则是新近进入市场的。其产品的价值在于另外还提供用于化妆品工业的基本油脂。由厚的皮下脂肪层得到的鸸鹋油具有深的穿透性质，而使该油适用于制作化妆软膏，如有皱纹阻滞作用的润肤剂。另外，最近有人研究可能使用鸸鹋油制备例如用于治疗关节炎的药物。典型的充分生长的鸸鹋可达到身高1.6至1.9米或更高，体重可在30至45Kg或更高。鸸鹋在大约一年时成熟，并且在达到青春期前后，鸸鹋从不显示有性特异性表型差异。与鸵鸟相似，近几年内鸸鹋群体在美国也已经历了暴发性生长。在1994年，美国约总共有150,000只鸸鹋，其中包括15,000对处于繁殖期的。预测1995年鸸鹋的数目将增加到500,000至750,000只，其中估计有45,000只繁殖对的鸟。
在包括澳大利亚、比利时、以色列、加拿大、新西兰、纳米比亚、南非和津巴布韦在内的几个国对平胸鸟产生有越来越大的需求量。因此，在过去的几年里在国内市场上对鸵鸟和鸸鹋的需求剧增，其次则是非洲鸵。在近五年里，美国繁殖鸵鸟对的数目和总鸟数目已分别增加了7.5和20倍。估1995年美国将有200,000只鸵鸟，其中包括20,000对繁殖期鸵鸟。之所以对繁殖这些动物有极大兴趣是由于成年以及未成年动物的巨大经济价值，特别是已证明的鸵鸟的生育对，其估价高达75,000.00美元，鸸鹋估价为30,000.00美元或更高。3至4月龄的未成年鸵鸟定价约7,500美元，未成年鸸鹋定价约5,000美元。大部分动物都在3至6月龄间上市。
此外，对作为更传统形式之动物农业的代用物的平胸鸟有着极大兴趣。与平胸鸟类相关的几种因素使之成为更传统之动物农业(即肉牛、猪和羊繁殖业)的高级代用品。这些因素包括：较高的饲料转化率、更大的广泛养殖能力、大的动物体重、提高的生殖能力以及其肉品的独特营养价值。
例如，鸵鸟肉是相似于牛肉的红色肉，其含有比鸡肉或火鸡肉明显少的脂肪、热量和胆固醇。更具体地说，85g鸵鸟肉含有2g脂肪、58mg胆固醇和97卡热量。相反，85g火鸡肉含有3g脂肪、59mg胆固醇和135卡热量。86g鸡肉含有3g脂肪、73mg胆固醇和140卡热量。85g牛肉(牛排)含有15g脂肪、77mg胆固醇和240卡热量。最后，85g猪肉含有19g脂肪、84mg胆固醇和275卡热量。(鸵鸟肉的价值是根据AMSI Quality Laboratory Report # 0800100推算的。其他肉类的价值是根据U.S.D.A.Handbook No.8，“Nutritive Val-ue of Foods”推算的)。与鸵鸟相似，鸸鹋肉也是低脂肪的红色肉。更具体地说，100g鸸鹋肉含有1.7g脂肪、57.5mg胆固醇和109卡热量。(鸸鹋肉的价值来自Silliker Laboratories of Texas，Inc.)。
另外，例如鸵鸟等平胸鸟在12月龄时可提供大约100磅肉，因此可在相对短的时间里产生大量的肉。
下列对鸵鸟和母牛的比较说明平胸鸟类是更传统的动物农业形式的较好代用品。首先，鸵鸟有42天的孵卵和孵化期，其中母牛需要280天。其次，鸵鸟平均每年产生20个以上的子代，而母牛每年产生一只小牛。第三，鸵鸟的饲料转化率小于2∶1，而母牛的饲料转化率为5∶1。第四，鸵鸟从受孕到屠宰的天数约为407天，而母牛则需645天。最后，除了产生肉和皮外，鸵鸟还产生羽毛，而母牛则不产生除肉和皮以外的产品。
考虑到这些贡献，以及世界各地的人群对富于营养而又含有低脂肪和胆固醇，并可有效地以对环境产生最小不良影响的方式产生的肉类的需要越来越大，平胸鸟生产工业在未来将具有很大潜力。
目前，对平胸鸟的需求量远大于供应量。然而，平胸鸟类生产者却受到大量数生殖年龄雌鸟之次最佳卵产生量的限制。根据不同的品种，目前大多数圈养的平胸鸟每年平均产10-20只卵，而据信它们产卵的遗传潜力为每年超过60只卵。例如，在繁殖期里野外的高生产能力鸵鸟可以每48小时产一只卵，并且在繁殖期里野外的高生产能力鸸鹋大约每72小时可产一只卵。相反，鸵鸟在圈养环境中通常用5至10天产一只卵，而鸸鹋常常花费4至8天产一只卵。
在没有达到每年产生足够数目子代的情况下，平胸鸟屠宰市场将不能得到发展。根据某些估测结果，为了维持屠宰市场，每年至少要可以获得250,000只动物。因此，提高卵产生量的方法将大大加速市场的增长。因此，需要有提高鸟类，特别是鸵鸟和鸸鹋等无胸鸟之卵产生量的组合物和方法。
另外还需要提供增加外国种鸟如鹦鹉型鸟之卵生产量的组合物和方法。鹦鹉型鸟包括鹦鹉，并且是表现有双趾和具有强钓状喙的单家系目鸟类。鹦鹉被定义为鹦鹉科鸟类的任何成员(鹦鹉型鸟的单一科)，特征是有短而厚的强有力钓状喙。
近年，已研究证明抑制素为增加哺乳动物排卵的潜在活性因子。抑制素是主要由性腺，特别是由生长的卵泡产生的肽激素。在哺乳动物体内，其功能是垂体卵泡刺激激素(“FSH”)分泌的抑制性反馈调节剂。虽然早在60年前即认定了抑制素的存在，但只是在近年才完成了其化学分离工作。
哺乳动物抑制素是α亚单位(分子量18,000)和β亚单位(分子量14,000)组成的二聚体蛋白质激素。α亚单位对抑制素是独特的，作为β亚单位的二聚体其形成活化素(activin)，即一种从脑垂体释放FSH的激素。β亚单位以两种(βA和βB)即不同又十分相似的形式存在。因此，依据β亚单的参于情况，抑制素以抑制素A或抑制素B的形式存在。当通过二硫键结合时，α和β亚单位两者是抑制卵泡刺激素(“FSH”)从垂体中分泌这一生物学活性所必需的。在猪、牛、人、鼠和家禽中，抑制素之α亚单位的氨基酸序列表现出近80-90％的相似性。Risbridger等人(Current Perspectives of Hor-mones：A Review，Hormone Research，28：104-118(1987)，其列为本文参考文献)对抑制素的分离、生产、捡测及生物学作用进行了极好的评述。
在哺乳动物和鸟类体内，FSH起促进卵泡生长和发育作用，而促黄体生成激素(“LH”)则可诱导排卵。几种脑和性腺因子(肽和类固醇激素)相互作用控制促性腺激素释放。在这些因子中，促性腺素释放激素(“GnRH”)和抑制素对哺乳动物的脑垂体FSH分泌发挥相反控制作用。促性腺素释放激素是一种脑内产生的十肽，其作用是刺激FSH和LH分泌；而抑制素则是一种性腺蛋白质，其可明显地选择性抑制哺乳动物的FSH分泌。
为了了解抑制素在对鸟类排卵的内分泌控制中的作用，需要获得鸟排卵过程的基本知识。在家鸡的功能性成熟卵巢生长的卵泡以不同的大小级系存在。典型的卵巢含有4至6个大的，直经2至4厘米的，充有卵黄的卵泡(F1至F4，F6)，伴有较大数目的较小的，2至10毫米的黄色卵泡，并有许多很小的白色卵泡。注定最大的排卵前卵泡(F1)要在下一天排卵，第二个最大的(F2)在下一天排卵(约26小时后)，并以此类推。对这个级系内卵泡补充和发育的控制尚不完全清楚。已证明了垂体促性腺素的参于，但有关抑制素在控制鸟促性腺素分泌及控制排卵中的作用仍不明了。
就诱导哺乳动物过量排卵的目前策略来说，已建立了一些方法，其中包括中和内源性抑制素活性。例如，已经针对各种含抑制素化合物研究了哺乳动物的活性中和作用。已发现抑制素的免疫中和作用与小母牛、羊、小母猪及大鼠的增加的排卵率有关。
认为在接种抗原性抑制素制剂的哺乳动物中发现的加速排卵率是提高了血浆FSH水平的结果，后者则导致加快卵巢的卵泡发育。已在研究中使用了各种抗原作为疫苗并证明了哺乳动物排卵率的升高。在哺乳动物中试验的某些抗原包括：衍生于抑制素α亚单位之片段的重组DNA(Wrathall et al.，Effect of active immunization a-gainst a synthetic peptide sequence of The inhibin α-subunit on plas-ma gonadotrophin concentrations，ovulation rate and lambing rate inewes，J.Reprod.Fert.，95：175-182，1992；和Meyer et al.，Anti-serum to an Inhibin Alpha-Chain Peptide Neutralizes Inhibin Bioac-tivity and Increases Ovulation Rate in Sheep，Scientific Journal Seriesof the Mimesota Agric.Exp.Sta.，paper No.17,103,1991)、与卵白蛋白偶联的牛抑制素α亚单位之N未端序列的合成肽复制物(Glen-cross et al.，Effect of active immunization of heifers against inhibin onplasma FSH concentrations，ovarian follicular development and ovula-tion rate，Journal of Endocrinology，134，11-18，1992)、与人血清白蛋白结合的牛抑制素α亚单位的合成肽序列(Morris，et al，Effect ofimmunization againt synthetic peptide sequences of bovine inhibin α-subunit on ovulation rate and twin-calving rate in heifers，Journal ofReproduction and Fertility，97：255-261，1993)，以及从牛卵泡液中部分纯化的抑制素(Morris et al，Effect of Immunizing PrepuberalLambs of Low and High Ovulation Rate Geotypes with Inhibin Par-tially Purified From Bovine Follicular Fluid，Theriogenollogy，vol.35，No.2，1991).
尽管有关在所研究的所有哺乳动物之排卵周期中FSH水平波动的数据存在矛盾，但不论使用什么抗原或攻击何种动物，对内源性抑制素的免疫中和作用总是可增进卵巢的卵泡发育和排卵率。
如上文指出的，抑制素参于调节鸟类之生殖功能的问题尚不明确。迄今为止，已发表的报导只限于家禽体内抑制素的生殖功能。该文献的大部分内容支持抑制素很可能在鸟体内发挥与文献中记载的其在哺乳动物体内之相似生理作用这一理论：在母鸡体内，抑制素可作为卵泡补充和/或发育的调节剂。但在鸟体内，抑制素参于控制排卵率可能或可能不是通过抑制脑垂体FSH分泌而实现的。例如，虽然已发现低产卵母鸡血浆和排卵前卵泡的粒层细胞中比高产卵母鸡有较高的抑制素水平，但发现与产卵率相关的血浆FSH水平却没有差异(Wang et al，Increase in Ovarian α-Inhibin Gene Expressionand Plasma Immunoreactive Inhibin Level is Correlated with a De-crease in Ovulation Rate in the Domestic Hen，General and Compara-tive Endocrinology，91，52-58(1993))。因此，该文献提示在母鸡体内排卵相关的抑制素α亚单位基因表达和血浆免疫反应性抑制素水平的改变并不直接通过调节血浆FSH水平来影响排卵率。另外，Johnson，P.A.(Inhibin in the ben，Poultry Science，72：955-958(1993))使用牛RIA系统成功地估测了母鸡血浆中的免疫反应性抑制素，尽管排卵前LH急剧增加，但在整个排卵周期中没有检测的显著的免疫反应性抑制素峰。因此，抑制素在鸟体中卵泡发生中的作用尚不清楚。
最近，已成功地克隆了鸡抑制素的α亚单位并测定了其核苷酸序列(参见Wang and Johnson，Complementary Deoxyribonucleic AcidCloning and Sequence Analysis of the α-Subunit of Inhibin fromChichen Ovarian Granulosa Cells，Biology of Reproduction，49，1-6(1993)，该文列为本文参考文献)。将鸟类抑制素序列与已知的哺乳动物抑制素α-亚单位序列相比较，结果显示有86-89％同源性。使用两个分离的探针(cINA6和cINA12)揭示，抑制素α亚单位在鸡卵巢粒层细胞中表达，但不在鸡脑、肾、肝或脾组织中表达。
因此，对抑制素在鸟体内的生物学知识仍所知甚少，也尚没有尝试或监测鸟对抗原性抑制素攻击的反应。这些，鉴于平胸鸟市场受到许多鸵鸟、鸸鹋和美洲鸵鸟之亚最佳产孵率的限制，因而需要人们进一步研究用于增加这些鸟类之产卵率的组合物和方法。还要求得到加速鸟类产卵开始的组合物和方法。还需要有增加鸟在整个生存期间之产卵数的组合物和方法。另外，还需建立迅速、简单、可靠、低成本的检测鸟是否对抗原性抑制素组合物产生免疫学反应的方法。再者，仍需要建立迅速、简单、可靠、低花费地检测鸟是否从激素上预确定为高水平或低水平产卵鸟的方法。
对增加卵产生率之组合物和方法的需要不只限于鸟类。还需要有用于增加许多动物之产卵量的有效的组合物和方法。例如，仍需要增加大多数常用农业动物如猪、牛、羊和鸡等的卵产生量。仍需要增加毛皮动物如水貂、狐狸、水獭、雪貂和浣熊的卵产生量，并且还需要更多的其他带有可用于装饰目的之皮毛的动物。另外，还需要有增加卵产生量的组合物及方法，以增加许多外来的或频临灭绝之动物品种的群体数目，避免其绝种。另外仍然需要增加某些用于赛跑、娱乐或表演(竞赛)之动物如马、狗、猫、动物园动物和马戏团动物的卵产生量。如进一步提高了对人不育症治疗的要求所显示的，还需要增加人的卵产生量。因此，仍需要增加许多动物之排卵的组合物及方法。
发明的概要
本发明涉及含有抑制素或其片段及载体蛋白质的组合物和制备外源蛋白质的方法。抑制素蛋白质或其片段可以是鸟抑制素、哺乳动物抑制素或爬引动物抑制素。载体蛋白质包括但不只限于麦芽糖结合蛋白质或牛血清白蛋白等。优选的载体蛋白质是麦芽糖结合蛋白质。
异源蛋白质可以是与载体蛋白质结合的抑制素或与载体蛋白质融合的抑制素。生产融合的异源蛋白质的方法包括将为表达而编码抑制素或其片段的cDNA插入含有用于生产载体蛋白质之编码信息的载体中。将此载体插入表达系统后，由该系统表达融合的异源蛋白质。异源蛋白质最好由平胸鸟抑制素如鸵鸟抑制素、鸸鹋抑制素及美洲鸵抑制素组成。
本发明还涉及通过投用本发明的异源蛋白质来增加动物卵产量的方法，其中所说的异源蛋白质包括抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质。该方法包括给动物投用有效量的蛋白质，以增加动物的卵产生量。较好在动物体内发生抗该蛋白质的免疫学反应。最好在动物体内发生也抗由动物产生之抑制素蛋白质(内源性抑制素)的免疫学反应。该方法增加那些产生抑制素之雌性动物如哺乳动物、爬行动物及平胸鸟等鸟类动物的卵产生量。更具体地说，该方法增加如鸵鸟、鸸鹋及美洲鸵等雌性平胸鸟的卵产生量。
本发明还涉及加速雌性鸟的产卵开始的方法，其包括给雌性鸟投用有效量的包含α亚单位鸟抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质，以加速鸟开始产卵的步骤。本发明还涉及增加雌鸟产生之低胆固醇卵之数目的方法，其包括给雌性鸟投用有效量的包含α亚单位鸟抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质的步骤，以使鸟产生更大数目的低胆固醇卵。本发明还涉及增加雌性鸟终生总产卵数的方法，其包括给雌性鸟投用有效量的含有α亚单位鸟抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质的步骤，从而增加鸟的终生总产卵量的方法。
本发明进一步涉及产生抗本发明异源蛋白质之抗体的方法。总地说来，产生抗异源蛋白质之抗体的方法包括给动物投用有效量的含有抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质，从而在动物体内发生抗异源蛋白质的免疫学反应。然后，从动物体内得到血液样品，并从血液样品的血清中分离抗抑制素抗体。较好使血清通过一个含有有效量载体蛋白质的柱以从血液样品的血清中分离抗体。
此外，本发明涉及迅速、简单、可靠、花费合理地检测动物是否为从激素上预安排为高水平或低水平产卵动物的方法。该方法包括确定由动物产生的，与动物之产卵能力相关的抑制素的量。简单地说，确定动物血液中抑制素量的方法包括从动物体内抽取血样，并使血液样品与对动物的内源性抑制素特异的抗抑制素抗体接触。使血液样品在允许抗体与存在于样品中之抑制素选择性反应的条件下与抗抑制素抗体接触。然后，从发生反应的抗体中除去未反应的抗体，并检测发生反应之抗体的量。
本发明还涉及用于检测动物是否对抑制素组合物攻击发生了免疫学反应的迅速、简便、可靠、花费合理的方法。简单地说，该方法包括将本发明的抑制素或异源蛋白质结合到固相上，并使固相化的抑制素与待检动物的血液样品接触。使样品在允许抑制素与样品中的抗抑制素抗体选择性反应的条件下与固相化的抑制素接触。从样品中除去未反应的抗体后，加入一定量抗一类第一动物抗体之第二动物的标记的抗体。然后抗该动物抗体的标记抗体将选择性地与结合于固相化抑制素上的抗体反应。除去未反应的标记抗体后，经观察标记物来确定已反应之标记抗体的存在或其量。从而该方法可确定抗动物体内抑制素之抗体的存在及量，并因而确定动物是否对投用含抑制素的组合物发生了免疫学反应。
因此，本发明的一个目的是提供一种在给动物用药后在动物体内诱导免疫学反应的抑制素组合物。
本发明的另一个目的是提供包含抑制素蛋白质或其片段，以及载体蛋白质的异源蛋白质。
本发明的再一个目的是提供包含融合之异源蛋白质的组合物，所说的融合的异源蛋白质含有抑制素或其片段。
本发明的再一个目的是提供产生异源蛋白质的方法，其中蛋白质之一是由抑制素或其片段组成的。
本发明的另一个目的是提供生产融合的异源蛋白质的方法，其中蛋白质之一是由抑制素或其片段组成的。
本发明的再一个目的是提供生产包含抑制素蛋白质或其片段，及载体蛋白质之异源蛋白质的方法。
本发明的再一个目的是提供一种加速鸟的产卵初情期开始的方法。
本发明的再一个目的是提供一种加速鸵鸟和鸸鹋等平胸鸟之产卵(初情期)开始的方法。
本发明的再一个目的是提供一种加速鹦鹉样鸟之产卵(初情期)开始的方法。
本发明的再一个目的是提供一种增加鸟在其生命期内总产卵数的方法。
本发明的再一个目的是提供一种减少或消除对脱毛产卵鸟之需要的方法。
本发明的再一个目的是提供一种诱导鸟产生比正常见于该品种鸟产生卵含有较低胆固醇量之卵的方法。
本发明的再一个目的是提供一种增加动物之卵产生率的方法。
本发明的再一个目的是提供一种增加哺乳动物卵产生率的方法。
本发明的再一个目的是提供一种增加人的卵产生率的方法。
本发明的再一个目的是提供一种增加母牛的卵产生率的方法。
本发明的再一个目的是提供一种增加爬行动物之卵产生率的方法。
本发明的再一个目的是提供一种增加鸟类的卵产生率的方法。
本发明的再一个目的是提供一种增加鸵鸟和鸸鹋等平胸鸟之卵产生率的方法。
本发明的再一个目的是提供一种用于检测动物是否对含有抑制素或其片段的抑制素组合物的攻击产生了免疫学反应的迅速、简便、可靠、花费合理的方法。
本发明的再一个目的是提供一种检测动物是否已在激素上安排为高水平或低水平产卵动物的迅速、简便、可靠、花费合理的方法。
本发明的再一个目的是提供一种检测鸟是否已在激素上预确定为高水平或低水平产卵鸟的迅速、简便、可靠、花费合理的方法。
本发明的再一个目的是提供一种生产抗抑制素或其片段之抗体的方法。
本发明的再一个目的是提供一种生产抗包含抑制素或其片段之异源蛋白质的抗体的方法。
本发明的再一个目的是提供一种准确地检测存在于动物血液中之抑制素的量的方法。
本发明的再一个目的是提供一种包含抗另一动物抗体之抗体的组合物。
本发明的再一个目的是提供一种生产抗另一动物之抗体的动物抗体的方法。
本发明的这些和其他目的、特征及优点将会在评阅了下列已公开实施方案的详细说明及待批权利要求之后变得更加清楚。
附图的简要说明
图1是SDS-PAGE凝胶，其中A是鸵鸟抗(鸡抑制素-麦芽糖结合蛋白质)抗体、B是质粒pMALTM-C载体标准品、C是蛋白质分子量标准品，D是用于制备融合异源蛋白质的真正pMALTM-C载体，E是纯化的本发明融合的鸡抑制素-麦芽糖结合蛋白质(异源蛋白质)、F是得自纯化程序的不带有异源蛋白质的洗脱物。
图2图解说明使用与cINA515编码蛋白质融合的麦芽糖结合蛋白质在日本鹌鹑(Japanese Quail)中进行的抑制素α亚单位免疫中和作用对母鸟日产卵量(“HDEP”)的影响。更具体地说，图2是实施例8的表2所示数据的图解说明。
图3是图解说明书只考虑两个注射处理组：对照组和抑制素免疫组时，使用与cINA515编码的蛋白质融合的麦芽糖结合蛋白质在日本鹌鹑中试验的抑制素α亚单位免疫中和作用对母鸟日产卵量(“HDEP”)的影响。
详细说明
本文使用的术语“鸟”或“禽”被限定为一个以温血的、产卵的、基本上适应于飞行的脊椎动物纲。本文使用的术语“平胸鸟”被限定为一类不能飞的、大多数是大的、包括几个目的奔跑的鸟，其中包括鸸鹋、鸵鸟、几维及食火鸡。本文所使用的术语“鹦鹉样鸟类”包括鹦鹉，并且是表现为对趾型并有强钩状喙的单家族鸟纲。鹦鹉被限定为鸟纲家族鹦鹉科(鹦鹉样鸟的单一家庭)的任何成员，其特征是有短的、强壮的、强钩状喙。
术语“卵”在本文中限定为由鸟和爬行动物产生的包在多孔的钙质式坚韧的外壳内的大的雌性细胞。本文所说的“鸟或爬行动物的卵产生”是指鸟产卵的行为，或称“产卵”。术语“卵细胞”定义为雌性配子，也称为卵。因此，本文中所说的除鸟和爬行动物外的所有动物的卵产生被定义为从卵巢中产生并排出卵细胞，或称“排卵”。因此应明确的是，本文中所使用的术语“卵”，当其由鸟或爬行动物产生时是指包围在多孔的、钙质或坚韧外壳内的大的雌性细胞，或当其由所有其他动物产生时为卵细胞。
就鸟类来说术语“产卵”和“初情期”在本文中可互换使用，并且是指鸟产生出其第一个卵。因此，本文中所说的加速鸟的产卵或初情期的开始，是指诱导鸟比在正常情况下较早地产出第一只卵。
本文所说的“降低卵的胆固醇水平”的方法是指诱导鸟产出一个或多个比同样品种的鸟所产生的卵有较低胆固醇含量的卵的方法。
短语鸟的“终生总产卵量”是指鸟在其整个生命过程中产卵的总数。本文中使用的短语“母鸟日产卵量”或“HDEP”是指特定组的母鸟每天产卵的数目。
与术语鸟或禽相反，术语“哺乳动物”是指哺乳动物纲的成员，其为一大类温血脊椎动物，包括以有乳腺、身体被附毛发、中耳内有三块听骨、一个肌性横隔膜将胸腔和腹腔分隔开、红血细胞没有核、胚胎在尿囊和羊膜中发育。
本文中使用的术语“爬行动物”被定义为爬行动物纲的任何成员，其为以没有毛、羽和乳腺，其皮肤上披被鳞片，并且有三腔心脏，以及其胸腔和腹腔相连续为特征的陆生脊椎动物。
本文所说的异源蛋白质是指包含抑制素蛋白质或其片段，以及载体蛋白质的蛋白质。应明确的是，术语“抑制素”和“抑制素的片段”在异源蛋白质组合物、制造异源蛋白质的方法、及使用本发明的异源蛋白质的方法中是可以互换使用的。
还应了解到的是，本文使用的符号“cINA515得自鸡基因组DNA的515碱基对序列(SEQ ID NO：1)，或代表516碱基对序列(SEQ ID NO：3)，或代表第3页所列cINA6相应序列(在大约碱基对位置编号790处开始并在大约碱基对位置编号1310处结束)(参见Wang and Johnson，Complementary Deoxyribonucleic Acid Cloningand Sequence Analysis of the α-Subuint of Inhibin from Chicken O-varian Granulosa Cells，Biology of Reproduction，49，p，1-6，1993，其列为本文参考文献)。cINA515编码鸵鸟抑制素α亚单位的一部分，如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：40“MBP-cINA515”代表将cINA515克隆到重组宿主细胞中并表达包含麦芽糖结合蛋白质(“MBP”)和由cINA515编码之抑制素蛋白质α亚单位片段的融合异源蛋白质后，从重组宿主细胞表达的蛋白质结合物。因此，“cINA515”代表核苷酸序列，“MBP-cINA515”代表融合的异源蛋白质。
本文所使用的术语“融合的异源蛋白质”被定义为由融合于载体蛋白质上的抑制素蛋白质或其片段组成的蛋白质。融合的异源蛋白质是以包含融合的基因产物的表达系统表达的，所说的基因产物包含编码抑制素或其片段的基因，该基因又是与编码载体蛋白质的基因融合的。本文所说的“融合的基因产物”被定义为将编码表达抑制素蛋白质或其片段的基因和编码表达载体蛋白质的基因相融合所得到的产物。
本文使用的术语“结合的异源蛋白质”是指含有与载体蛋白质结合之抑制素蛋白质或其片段的蛋白质。结合的异源蛋白质是通过化学反应以共价键将抑制素蛋白质连接到载体蛋白质上而产生的。
动物对已投用于该动物之物质的免疫学反应是指动物的对所说物质特异的细胞介导的反应和/或体液反应。
本文使用的术语“选择性相互作用”是指两种主体物质借助共价键、非共价键、静电力、受体-配体相互作用、酶-底物相互作用或其他结合或连接方式彼此结合。结合是选择性的，其中两种主体以特异方式、特定位置，或只在彼此间相互作用。
本发明总地涉及用于加速鸟产卵开始之方法中的组合物。该组合物由包含抑制素蛋白质或其片段，以及载体蛋白质的异源蛋白质组成。抑制素可以是由产生抑制素的任何一种动物产生的抑制素。抑制素包括但不只限于鸟抑制素、哺乳动物抑制素、爬行动物抑制素、两栖动物抑制素或鱼抑制素。更具体地说，哺乳动物抑制素可选自但不限于牛抑制素、人抑制素、马抑制素、猫抑制素、狗抑制素、羊抑制素、水貂抑制素、狐狸抑制素、水獭抑制素、雪貂抑制素、浣熊抑制素和猪抑制素。鸟抑制素可选自但不只限于鸵鸟抑制素、鸸鹋抑制素、美洲鸵抑制素、食火鸡抑制素、几维抑制素、火鸡抑制素、鹌鹑抑制素、鸡抑制素，以及鹦鹉样鸟目之其他成员的抑制素。优选的抑制素是鸟抑制素。更优选的抑制素是平胸鸟抑制素。特别优选的抑制素是鸵鸟抑制素。另一种优选的抑制素是鸸鹋抑制素。再一种优选的抑制素是美洲鸵抑制素。另一种优选的抑制素是鸡抑制素。更具体地说，本发明的异源蛋白质包含α亚单位抑制素蛋白质或其片段，以及载体蛋白质。
本发明的异源蛋白质包含抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质，其可用于增加鸟类的终生总产卵数的方法中。该组合物也可用于增加动物之产卵率的方法中。该组合物还可用于降低鸟所产出之卵中的胆固醇含量的方法中。该组合物还可用于减少或消除对鸟脱羽的要求。下文中将更详细地讨论这些方法，以及加速鸟的产卵开始的方法。
可以从动物体液中分离、可以在表达系统中从基因工程细胞表达、或经一系列化学反应合成产生抑制素或其片段。更具体地说，抑制素的片段可选自但不限于选自下列组分：α亚基抑制素；β亚基抑制素；重组DNA衍生的α亚基抑制素或β亚基抑制素的片段；合成的α亚基抑制素或β亚基抑制素之片段的肽复制物；合成的α亚基抑制素或β亚基抑制素之N末端序列的肽复制物；从卵泡液部分纯化的抑制素的片段；内源性α亚基抑制素或β抑制素的片段；以及外源性α亚基抑制素或β亚基抑制素的片段。如上文所指出的，抑制素的片段最好是α亚基抑制素或其片段。
异源蛋白质中的抑制素是按下文所述与载体蛋白质融合或结合的。当抑制素与载体蛋白质融合时，异源蛋白质是“融合的异源蛋白质”。当抑制素与载体蛋白质结合时，异源蛋白质是“结合的异源蛋白质”。优选的异源蛋白质是融合的异源蛋白质。
载体蛋白在异源蛋白质中的同一性对本发明并不是很严格的。本领域中已知的任何蛋白质却可用于异源蛋白质中。可用于本发明的载体蛋白质可以选自但不只限于下列一组蛋白质：麦芽糖结合蛋白质“MBP”；牛血清白蛋白“BSA”；匙孔血蓝蛋白“KLH”；卵白蛋白；鞭毛蛋白；任何种动物的血清白蛋白；任何种动物的γ球蛋白；同源细胞；携带Ia抗原的同源细胞；以及D和/或L氨基酸的聚合物。优选的载体蛋白质是MBP。如果异源蛋白质不是用于牛或马，则另一种优选的载体蛋白质是BSA。如果异源蛋白质不是用于鸟类，再一种优选的载体蛋白质是卵白蛋白。最优选的载体蛋白质是MBP。载体蛋白质较好是对使用该蛋白质的动物有免疫原性的。
本发明还涉及生产本发明之结合的异源蛋白质的方法。生产结合的蛋白质的方法是本领域中已知的。Antibodies A LaboratoryManual，Ed Harlow & David Lane，Cold Spring Harbor Lab(1988)(其列为本文参考文献)中充分描述了将蛋白质与蛋白质结合的方法。
虽然结合的蛋白质可以用于本发明的方法中，但较好是使用融合的蛋白质。更具体地说，异源蛋白质是融合产生的异源蛋白质，其中蛋白质的不同片段总是以相同位置融合，并且融合相同量的蛋白质片段。另外，可以均匀地，低花费地并且大量地生产融合的异源蛋白质。相反，结合的异源蛋白质则不象融合蛋白质这样均一。例如，依据被结合的蛋白质的不同，结合反应可产生有一种或多种结合的蛋白质、有在不同位置上结合的蛋白质，或仍未结合的蛋白质的混合物。另外，某些结合可以使异源蛋白质的可能的应用受到空间阻碍(例如使蛋白质的免疫原性部分受到空间阻碍)。再者，结合反应条件和试剂可能降解其中所产生的蛋白质。例如，通常在结合反应中使用戊二醛，而该试剂将会修饰蛋白质的构型。还有，生产结合的蛋白质要比生产融合蛋白质的花费更大。
本发明进一步涉及生产融合的异源蛋白质的方法。由融合基因产物表达融合的异源蛋白质，所说的融合基因产物包括编码抑制素蛋白质或其片段的基因，以及编码载体蛋白质的基因。下面将更详细地描述融合基因产物和制备融合基因产物的方法。简单地说，生产本发明的融合异源蛋白质的方法包括将融合基因产物插入到质粒的编码区内、用将质粒转染宿主细胞，以及用本领域已知的方法由宿主细胞表达融合的异源蛋白质。
制备融合的异源蛋白质的许多方法都是本领域中已知的。因此，可以使用本领域中已知的任何一种方法生产本发明的融合的异源蛋白质。许多商业上可得到的载体试剂盒和表达系统均可用于制备本发明的融合的异源蛋白质。这类商业上可得到的载体试剂盒和表达系统的一个例子是pMALTM-C(New England Biolabs，BeverlyMassachusetts)。融合的异源蛋白质的胞质表达发生在pMALTM-C系统中。下文实施例1和2中充分描述了从pMALTM-C试剂盒生产本发明的融合的异源蛋白质的方法。可用于生产本发明融合的异源蛋白质的其他载体试剂盒及表达系统的来源包括但不只限于：Pharmacia Biotech of Piscataway，New Jersey；和Clonetech，Palo Al-to，California。
本发明进一步涉及包括编码抑制素蛋白质或其片段之基因，及编码载体蛋白质之基因的融合的基因产物。抑制素基因可得自能产生抑制素的任何一种动物。抑制素基因可以是鸟类抑制素基因、哺乳动物抑制素基因、爬行动物抑制素基因、两栖动物基因或鱼基因。更具体地说，可从下列一组动物抑制素基因中选择哺乳动物抑制素基因，但不只限于这些：牛抑制素基因、人抑制素基因、马抑制素基因、猫抑制素基因、狗抑制素基因、羊抑制素基因、水貂抑制素基因、狐狸抑制素基因、水獭抑制素基因、雪貂抑制素基因、浣熊抑制素基因及猪抑制素基因。可从鸵鸟抑制素基因、鸸鹋抑制素基因、美洲鸵抑制素基因、食火鸡抑制素基因、几维抑制素基因、火鸡抑制素基因、鹌鹑抑制素基因、鸡抑制素基因、鹦鹉形鸟目之其他成员的抑制素基因、隼形目鸟的抑制素基因、鸳形目鸟的抑制素基因、鸮形目鸟的抑制素基因、佛法僧目鸟的抑制素基因、秧鸡形目鸟的抑制素基因、雀形目鸟的抑制素基因、鹃形目鸟的抑制素基因、鸽形鸟的抑制素基因、鸡形鸟(家禽)的抑制素基因、鹅形目鸟(鹅、鸭及其他水禽)的抑制素基因、鹭目鸟的抑制素基因、以及下列各种鸟的抑制素基因：隼、雕、鹰、鸽、长尾小鹦鹉、风头鹦鹉、鹦鹉及栖木鸟(如燕雀、松鸦、黑鸟、雀科鸣鸟、刺嘴莺和麻雀)。优选的抑制素基因是鸟抑制素其因。更优选的抑制素基因是平胸鸟抑制素基因。特别优选的抑制素基因是鸵鸟抑制素基因。另一种优选的抑制素基因是鸸鹋抑制素基因。再一种优选的抑制素基因是美洲鸵抑制素基因。再一种优选的抑制素基因是鸡抑制素基因。
插入到Bluescript(Stratagene，La Jolla，CA)中之EcoRI位点中的鸡抑制素α亚素cDNA克隆(cINA6；Wang and Joknson，Comple-mentary deoxyribonucleic acid cloning and sequence analysis of the α-Subumit of inhibin from chicken ovarian granulosa cells，Biology of Re-production，49：453-458，1993)由P.A.Johnson(Cornell University)惠赠。cINA6克隆在Southern分析中与鸵鸟基因组DNA特异杂交，表明这两个种之间有显著的DNA同源性(Chouljenko et al.，Ex-pression and purification of chicken α-inhibin as a fusion protein withthe E.coli maltose binding protein，Poultry Science，73(Suppl.1)：84，1994)。使用PstI消化从cINA6克隆上切下一DNA片段(“cINA515”)。该cINA515DNA片段包括了大部分的成熟鸡抑制素α亚基。
用本领域已知的聚合酶链反应(PCR)方法得到鸵鸟抑制素α亚基序列。更具体地说，基于Wang报导的序列构建下列引物，并用于鸵鸟基因组DNA的PCR反应中：5′-TCTTTCGAG-GAGCTGGGCTGG-3′和3′-GGGCCGTGGTACCGC-GAGTGACGCA-5′。已将cINA515的约75％的DNA序列与鸵鸟基因组DNA进行了比较。迄今已进行鸡和鸵鸟DNA间的比较证明有100％序列同源性。
如上所述，载体蛋白质并不是本发明的一个重要方面。因此，可在本发明中使用编码表达任何载体蛋白质的基因。载体蛋白质基因可选自但不只限于编码表达下列蛋白质的基因：麦芽糖结合蛋白质“MBP”、牛血清白蛋白“BSA”、匙孔血蓝蛋白“KLH”、卵白蛋白、鞭毛蛋白、任何种的血清白蛋白、任何种的γ球蛋白、同种细胞、携带Ia抗原的同种细胞，以及D和/或L氨基酸的聚合物。优选的载体蛋白质基因是编码表达MBP的其因。另一种优选的载体蛋白质其因是BSA基因，但这种情况下所得到的异源蛋白质不能用于牛或马。再一种优选的载体蛋白质基因是卵白蛋白基因，但这种情况下所得到的异源蛋白质不能用于鸟。最优选的载体蛋白质基因是编码表达MBP的基因。优选的载体蛋白质基因编码的蛋白质将增加宿主对抑制素蛋白质之免疫反应的强度和时间。
本发明进一步涉及制备融合基因产物的方法，其包括将编码抑制素蛋白质或其片段的基因与编码载体蛋白质的基因融合。简单地说，制备本发明融合基因的方法包括分离所需的抑制素互补DNA(cDNA)，产生双链抑制素DNA，得到双链载体蛋白质DNA，按某种方式将双链抑制素DNA融合到双链载体蛋白质DNA上，以使融合的DNA能够表达包含抑制素蛋白质或其片段，以及载体蛋白质的融合的异源蛋白质。
分离基因和制备融合基因产物的许多方面是本领域中已知的(例如参见Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning，A Lab-oratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，vol.I、II、III)。因此，可使用本领域已知的任何方法产生本发明的融合基因产物。可使用许多可从市场上可获得的载体试剂盒制备本发明的融合基因产物。这样的可从市场上获得的载体的一个例子是New England Biolabs(Beverly Massachusetts)的pMALTM-c。下文实施例1中充分描述可从pMALTM-c试剂盒制得融合基因产物的方法。可用于产生本发明之融合基因产物的其他载体试剂盒来源包括但不只限于：Pharmacia Bictech，Piscataway，New Jersey和Clonetech，Palo Alto，California。
如上文指出的，插入到Bluescript之EcoRI位点的鸡抑制素α亚基cDNA克隆(cINA6)是由P.A.Johnson(Correll University)惠赠的。
使用PstI酶切从cINA6克隆中切下一DNA片段(“cINA515”)。将该片段(cINA515)克隆到质粒p-MALTM-c的读码中，并在IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导和SDS-PAGE后检测麦芽糖结合蛋白质(“MBP”)和有适当大小的融合蛋白质(泳道E；图1)。按实施例1中详述的方法，使用所得到的蛋白质结合物(“MBP-cINA515)作为抗原免疫发情前期的雌性日本鹌鹑(Coturnix japorica)以对抗循环抑制素。
已不可预见地发现，本发明组合物可加速鸟产卵开始。本发明进一步涉及通过投用有效量的本发明异源蛋白质(含有抑制素或其片段，及载体蛋白质)以加速雌性鸟产卵或初情期开始的方法。术语“加速”是指经处理的卵产卵开始至少比未经处理的鸟常规产卵开始早大约3％时间。较好产卵早至少5％时间，最好早7％时间。更优选的是，产卵开始时间至少比未经处理的鸟早大约10％，最好早13％。应理解到，“经处理的”鸟是已投用本发明之异源蛋白质的鸟。在鸟体内较好发生抗抑制素的免疫学反应。最好也产生抗鸟产生之内源性抑制素的免疫学反应。
本发明的方法可用于加速可产生抑制素之任何种雌性鸟的产卵开始。雌性鸟可选自但不只限于平胸鸟、鹦鹉形目鸟、隼形目鸟、
形目鸟、鸮形目鸟、佛法僧目鸟、秧鸡形目鸟、雀形目鸟、鹃形目鸟、鸽形目鸟、鸡形目鸟(家禽)，鹅形目鸟(鹅、鸭、其他水禽)及鹭目鸟。更具体地说，雌性鸟可选自但不只限于鸵鸟、鸸鹋、美洲鸵、几维、食火鸡、火鸡、鹌鹑、鸡、年、雕、鹰、鸽、长尾小鹦鹉、凤头鹦鹉、鹦鹉及栖木鸟(如燕雀、松鸦、黑鸟、雀科鸣鸟、刺嘴莺及麻雀)，和鹦鹉形目的其他成员。优选的鸟是平胸鸟。更优选的鸟是鸵鸟。另一优选的平胸鸟是鸸鹋。再一优选的平胸鸟是美洲鸵。另一优选的鸟是其他鹦鹉形目鸟的任何成员。再一优选的鸟是鸡。再一优选的鸟是鹌鹑。本发明的方法可用于加速频临危险之种系鸟的产卵开始。这些频临危险的鸟包括但不只限于雕、鹰、兀鹫和猫头鹰。
根据本发明异源蛋白质组合物所投用的动物的不同，其中的抑制素和载体蛋白质亦可有所不同。当组合物投用于鸟时，较好使用鸟抑制素和麦芽糖结合蛋白质。当组合物投用于平胸鸟时，优选的抑制素是家禽或平胸鸟抑制素。更具体地说，当组合物将投用于鸵鸟时，优选的抑制素是家禽或鸵鸟抑制素。
应理解到的是，异源蛋白质中的抑制素不一定来自将投用该异源蛋白质的同一个种。例如，投用于鸵鸟的异源蛋白质可以由鸡抑制素和载体蛋白质组成。还应了解到的是，该组合物可进一步包含佐剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂、稳定剂及本领域已知和用于疫苗中的其他已知成分。本发明的组合物中可以使用任何已知的佐剂系统。优选的佐剂系统是弗氏不完全佐剂。另一个优选的佐剂系统是弗氏完全佐剂。再一个优选的佐剂系统是多分散的β-(1，4)连接的乙酰化甘露聚糖(“Acemannan”)。
可按任何已知的投药方式给雌性鸟投用本发明的异源蛋白质组合物。例如，可经皮下、腹腔内或肌肉内等途径投用本发明的组合物，其中较好的给药方式是皮下注射。可按一剂或多剂给鸟投用该组合物，但较好是进行多剂给药，其中在初始免疫后进行加强免疫。
在鸟达到产卵或初情期前给雌鸟投用本发明的组合物。给动物首次投用本发明组合物的优选年龄取决于所涉及的动物的品种、动物的交配季节、鸟的大小、组合物中各成分(抑制素和载体蛋白质)的同一性。
用于雌性鸟的本发明异源蛋白质的量将根据鸟的品种、鸟的年龄和体重、投用蛋白质时鸟是否所处于繁殖季节(如果鸟有繁殖季节的话)，以及将投用蛋白质的次数等因素而异。另外，用药开始时间或处理程序将取决于鸟的品种、该种鸟产卵开始的平均年龄、鸟的家族史(开始产卵的家族史)；每年鸟孵化的次数、鸟的营养水平(对那些营养不足的鸟在进入初情期时给予高营养喂饲)、给药开始时鸟的一般健康状况、鸟的长期健康状况、是否存在极端气候条件(鸟不适应的长期的过多的恶劣气候，如雨、热或风)、圈养条件(过度拥挤)及缺少锻炼等因素。
本领域普通技术人员在阅读了本发明的教导后将能够经常规试验确定为在鸟体内引发蛋白质的免疫学反应所需要的异源蛋白质的量。
例如，下文简要总结了如实施例8中充分描述的本发明加速日本鹌鹑初情期开始的方法。未经处理的鹌鹑初情期平均年龄约为6至8周龄。对平均体重约为0.1至0.25磅的日本鹌鹑的处理程序如下：在25天龄时初次注射0.75mg本发明的异源蛋白质；并在第32、39、46、53、60和90天龄时加强注射0.375mg。
更具体地说，在25天令时将100只鹌鹑随机并均等地分成下列4个注射组(每组25只)：(1)加在多分散的β-(1，4)连接的乙酰化甘露聚糖(“Acemannan”)(一种免疫刺激剂载体)中的MBP-cINA515(“MBP-cINA515/ACE”)，(2)加在弗氏佐剂中的MBP-cINA515(“MBP-cINA515/FRN”)，(3)Acemannan(免疫刺激剂对照；“ACE”)，或(4)弗氏佐剂(佐剂对照：“FRN”)。每只鸟使用约0.75mg加在适当对照载体中的MBP-cINA515以产生抗抑制素免疫。分别在1和3及2和4组中使用ACE或FRN的等同载体注射体积(0.2ml)。所有注射均使用配有25号针头的结核菌素注射器经皮下进行注射。每周每只鸟给予大约0.375mg MBP-cINA515进加强抑制素免疫，或皮下用适当的对照物攻击，连续注射5周。
从第41天龄开始(看作是产卵周期的第1天)，每天记录雌鸟日产卵率(“HDEP”)和死亡率(“MORT”)，连续记录12周。另外，计算四个处理组的雌鸟第一次产卵(“FIRST”)的平均日龄和达到50％产卵率(“FIFTY”)的日龄。如在实施例8中详细讨论时，对HDEP数据进行两个不同的方差分析。
迄今，只初步收集了35天的数据。图2(其中4个注射组被看作是分别处理组)和图3(其中只作了未免疫对照组对抑制素免疫组的比较)显示在研究的前35天期间对每周产卵间期(0、7、14、21和35天)的累积百分HDEP率的作图。
表2中给出第1周、第2周、第3周、第4周、第5周和被认为是独立处理的4个注射组的第1至5周组合的平均HDEP率。更具体地说，表2中的数值是代表百分产卵率。例如，在研究的第1周中，ACE组只有5.8％的鸟1天产1只卵。在研究的第2周，ACE组中有39.56％鸟1天产1只卵(第2周的39.56％包括第1周中的5.8％)。
另外，表2显示，在第4周MBP-cINA515/FRN注射组达到96.57％的峰值产卵率。因此，从表2所示数值看出，其他3个注射组因为它们的百分产卵率从第4周增加到第5周，所以在第4周时没有达到峰值。1-5周栏代表1-5周时各注射组的平均百分产卵率。
表3中给出在如表2的同样时间里的平均百分HDEP率，其中合并了指示对照组对免疫处理组比较的数据。1-5周栏代表第1至5周龄并的对照组对合并的抑制素免疫组的平均百分产卵率。
表4中包括所考虑的两种统计学情况的FIRST产率数据(即4个注射处理组和合并的数据比较结果)。表4中第一次产卵的日龄代表各组中所有鸟的产卵第1天的统计学平均值。应注意的是，表5显示FRN组的鸟和MBP-cINA515/FRN组的鸟之间产卵开始时间加速5天以上。另外表5显示对照组的鸟和免疫组的鸟之间产卵开始的时间加速3天以上(参见实施例8，表2，3和4)。
抑制素免疫中和作用对生产效能的初始正效应是显著的。这一效应在合并的HDEP(表3)和FIRST(表4)数据中得到特殊的证据，所列数据增加了观察的数目，其中包括所应用的统计学试验的平均放大倍数。
就对反应的开始、倍数和持续时间的影响研究了对处理的定时生物学反应。其中，已收集到的数据初步的(即整个产卵周期(产卵开始后约12周)的数据)。因此，还有待进一步确定抗抑制素免疫的鹌鹑如何改变生产效能的全部有关机制。然而，目前的数据显示了抑制素免疫中和作用对产卵周期初始阶段(即初情期开始)的影响。
数据显示在抑制素处理组中加速了初情期的开始。这一点已由所收集的HDEP和FIRST数据中得到证实。发现在研究的第1周内抑制素处理的鹌鹑中有与较高平均HDEP率相关的高度统计学可信度(P＜.0095)，在第2周期间差异则较小(P＜.0888)(表3)。在第2周期观察到的这一界限处理组差异可能代表在对照注射的鹌鹑中虽然延迟了产卵，但开始得到加强(参见图2)。 因此，第1周见于两个处理组(抑制素对非抑制素处理组)之间的统计学差异的强度可能如所预期的因产卵时间提前而冲淡了。当将第1至5周的数据合一起时，在抑制素处理的雌鸟中确实发现有中间统计学相关性的明确高的平均HDEP比率(P＜.0763)。
已选择鹌鹑来强化产卵，并认为鹌鹑属比单纯为提供食用卵而进行商业养殖的母鸡(单肉冠白色来杭鸡)有更大的产卵潜力。其次，发现经免疫的鹌鹑产出其第一只卵(FIRST)的平均日龄(51.98天龄)要比未免疫的鹌鹑(55.33天)要早3天以上(P＜.0373)(表4)。抑制素免疫对加速产卵的这种作用在MBP-cINA515/FRN处理的鹌鹑中表现得特别显著，其平均FIRST为50.38天令(表4)。这些结果还表明，当使用弗氏佐剂作为MBP-cINA515的载体时，比使用Acemannan可对异源蛋白质攻击产生更高滴度的抗体(并因此而有更大的抑制素免疫中和作用)。
附加的证据也支持抑制素免疫中和作用加速鹌鹑初情期的开始这一结论。具体地说，所有(100％)抑制素处理的雌鸟此时(即76天令或实验的第35天)均已挑动了产卵，而两个对照处理的雌鸟则已开始产卵。此提示如果其余两只雌鸟从未开始产卵，则抑制素免疫中和作用即可已诱导了可能尚未产卵的雌鸟产卵。再者，如果同样这两只鸟未曾产卵，或者在研究终止前(到124天令)其余两只雌鸟开始产卵，则本文中报导的FIRST产卵数据中的3天以上差异将因数学处理而进一步扩大。此外，虽然FIFTY数据的统计学试验还是不宜进行的(因为大约23％的雌鸟已达到50％HDEP)，但这些脱产卵鸟中的大部分(约57％)是两个对照(未免疫)组的成员。这一发现进一步支持HDEP和FIRST数据，提示在抑制素免疫中和的雌性鹌鹑中加速了初情期的开始。
因此，上述数据表明本发明的抑制素组合物加速日本鹌鹑的初情期开始。因为就其繁殖系统而言日本鹌鹑是鸡的可接受的动物模型，所以上述数据表明本发明的方法也将加速鸡的产卵开始。因此，本发明的方法将导致产卵鸟以较低的饲养成本生产出更多的卵。
下面简单总结如实施例9中讨论的本发明加速鸵鸟初情期开始的方法。未处理的鸵鸟初情期平均月龄为大约28至32个月。对近似体重范围为150至300磅的鸵鸟的处理程序如下：在26月龄时初次(第一次)注射5.0mg本发明的异源蛋白质；并于第27、28、30、32、34和36月龄时加强注射2.5mg。
简要总结如实施例10中讨论的本发明加速鸸鹋初情期开始的方法如下。未处理的鸸鹋初情期平均约在20月龄。对平均体重范围为50至90磅的鸸鹋进行如下处理：在其第18个月龄时初次注射3.0mg本发明的异源蛋白质；并在第19、20、22、24、26和30月龄时加强注射1.5mg。
以下简单总结如实施例11中讨论的本发明加速鸡初情期开始的方法。未处理的鸡初情期平均出现在大约20周令。对具有大约2.0至3.5磅体重的鸡作如下处理：在其15周令时用1.5mg本发明的异源蛋白质进行第一次注射；并在第17、20、24、30、40和50周令时加强注射0.75mg。
以下是对如实施例12中所讨论的本发明的加速火鸡初情期开始之方法的简单总结。未处理的火鸡的初情期在大约30周令。对具有大约9.0至12磅体重范围的火鸡进行下述处理：在其28周令时初次注射2.0mg本发明的异源蛋白质；然后第29、30、34、38、46和54周令时加强注射1.0mg。
以下是对实施例13中讨论的本发明加速鹦鹉初情期开始之方法的简单总结。未处理的鹦鹉初情期平均年龄为大约30个月。对具有大约0.5至1.25磅体重范围的鹦鹉进行如下处理：在其第28月龄时首次注射0.75mg本发明的异源蛋白质；并在第29、30、32、34、36和38月龄时加强注射0.375mg。
本发明的另一个实施方案涉及通过投用有效量本发明的异源蛋白质(含有抑制素或其片段，及载体蛋白质)，以增加动物卵产生量的方法。术语“增加”是指就未处理的鸟的卵产生量来说，经处理的鸟的卵产生量至少增加3％。卵产生量较好增加至少约7％，最好增加至少约12％。应了解的是，“经处理的”鸟是已经使用了本发明的异源蛋白质的鸟。较好在动物体内发生抗抑制素的免疫学反应。免疫学反应较好是针对由动物产生的内源性抑制素的。
本发明的方法可用于增加可产生抑制素之任何种雌性动物的卵产生量。动物可以是鸟、哺乳动物、爬行动物、两栖动物或鱼。更具体地说，哺乳动物可选自但不只限于牛、人、马、猫、狗、羊、水貂、狐狸、水獭、雪貂、浣熊和猪。优选的动物是鸟。雌性鸟可选自但不只限于平胸鸟、鹦鹉形鸟、隼形目鸟、鸮形目鸟、
形目鸟、佛法僧目鸟、秧鸡形目鸟、雀形目鸟、鹃形目鸟、鸽形目鸟、鸡形目鸟(家禽)、鹅形目鸟(鹅、鸭、其他水禽)及鹭目鸟。更具体地说，雌性鸟可选自但不限于鸵鸟、鸸鹋、美洲鸵、几维、食火鸡、火鸡、鹌鹑、鸡、隼、雕、鹰、鸽、花尾小鹦鹉、凤头鹦鹉、鹦鹉及栖木鸟(如燕雀、松鸦、黑鸟、雀科鸣鸟、刺嘴莺及麻雀)，以及鹦鹉形目的任何成员。优选的鸟是平胸鸟。更优选的鸟是鸵鸟。另一种优选的平胸鸟是鸸鹋。再一种优选的平胸鸟是美洲鸵。另一种优选的鸟是鹦鹉目的任何成员。再一种优选的鸟是鸡。再一种优选的鸟是鹌鹑。本发明的方法还可用于增加频临危险之鸟种的产卵量。这些频临危险的鸟包括但不只限于雕、鹰、兀鹫和猫头鹰。
本发明异源蛋白质组合物中抑制素和载体蛋白质可根据该组合物将投用的动物种不同而不同。上文已充分讨论了本发明的异源组合物。将组合物用于鸟时，较好使用鸟类抑制素及麦芽糖结合蛋白质。当组合物用于平胸鸟时，优选的抑制素是家鸡或平胸鸟抑制素。当组合物用于鸵鸟时，优选的抑制素是家鸡或鸵鸟抑制素。
应明确的是，异源蛋白质中的抑制素不一定是来自将投用该异源蛋白质之同种动物的抑制素。例如，用于鸵鸟的异源蛋白质可以由鸡抑制素和载体蛋白质组成。还应明确的是，组合物可以进一步包含佐剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂、稳定剂、及本领域已知的和用于现有疫苗中的其他成分。本领域已知的任何佐剂系统均可用于本发明的组合物中。优选的佐剂系统是弗氏不完全佐剂。另一优选的佐剂系统是弗氏完全佐剂。
可用本领域已知的任何方法投用本发明的异源蛋白质组合物。例如，可经皮下、腹腔内、或肌肉内投用该组合物。较好皮下注射使用该组合物。可以分一剂或多剂给动物投用组合物。较好以多剂投用组合物，其中在初始免疫后进行加强免疫。
可以在动物因疾病或年龄关系停止排卵之前的任何时间给雌性动物投用组合物。给动物投用本发明组合物的优选年龄会取决于所涉及的动物的品种、动物的交配季节(如果有的话)、以及投用组合物的目的。
例如，在为增加具有繁殖季节之农业动物的产卵量而投用组合物的情况下，投用组合物的优选时间是在繁殖季节开始之前。相反，当将组合物用于具有受到抑制产卵率的成熟动物时，则应于意识到所发生的抑制成了问题时投用组合物。
例如，虽然可在鸟例如平胸鸟处于任何年龄时投用杂源蛋白质，较好在鸟的第一个繁殖季节前6个月期间免疫鸟。本领域普通技术人员都会知道，一般雌性鸟均在第一个繁殖季节里开始产卵。更好是在鸟的第一个繁殖季节之前约6个月免疫鸟，然后在鸟的第一个繁殖季节前以一个月间隔进行加强免疫。最好在鸟的第一个繁殖季节前约6个月免疫鸟，然后在6个月里以1个月的间隔进行加强免疫。
给动物投用本发明异源蛋白质的量依据动物种、动物的年龄和体重、与繁殖季节(如果动物有繁殖季节的话)相关的投用蛋白质的时间，以及将投用蛋白质的次数而定。本领域技术人员将会依据本发明的教导经常规试验确定为引发动物抗蛋白质之免疫学反应所必需的异源蛋白质的量。
例如，为在增加雌性鸵鸟产卵率中获得最好的结果，在其第一个繁殖季节前约6个月给鸵鸟进行初始免疫，然后在6个月里以1个月间隔进行加强免疫。初始免疫使用大约0.3至3.0mg的本发明的异源蛋白质。初始免疫较好包括大约1.5至3.0mg的本发明的异源蛋白质。加强免疫包括大约0.75至1.5mg本发明的异源蛋白质。初始免疫中较好在弗氏完全佐剂(Sigma Chemical Co，St.Louis，Mo)乳化异源蛋白质，并且在加强免疫中较好在弗氏不完全佐剂(Sigma)中乳化异源蛋白质。更优选的是经皮下注射异源蛋白质组合物。特别是在沿着鸵鸟之腿上部的三个位点皮下注射异源蛋白质组合物。
本发明增加鸟产卵率的方法可使那些尚没有从遗传上选择了多产卵特性的鸟大大增加产卵率。例如，自20年代后期即从遗传上选择有最大产卵率的鸡(如参见Jull，M.A.1932，Poultry Breeding，John Wiley & Sons)。就短生命过程的鸡来说，涉及选择这种特性经过了大约从1928年至今的时间。相反，平胸鸟和鹦鹉形目鸟以及大多数其外来鸟则没有从遗传上选择多产卵特性。另外，那些频临危险的鸟也没有被从遗传上选择多产卵特性。因此，鉴于鸡已是遗传上极好的产卵鸟，与遗传上产卵能力差至中等产卵能力的鸟相比，限制了用本发明方法可见到的产卵量的改善。因此，可就尚未从遗传上选择了多产卵特征的鸟，如平胸鸟、鹦鹉目鸟、其他外来鸟及频临危险的鸟来说，使用本发明的方法可见到产卵率的更大程度的改善。
下面是增加产卵之方法的另一个例子。给哺乳动物投用有效量的结合的异源蛋白质组合物，从而在动物体内出现抗异源蛋白质的免疫学反应。异源蛋白质较好由与麦芽糖结合蛋白质结合的哺乳动物抑制素组成。另一种优选的结合的异源蛋白质包括鸟类或爬行动物抑制素，及麦芽糖结合蛋白质。
用本发明的异源蛋白质免疫动物以诱导动物产生选择性抗异源蛋白质的抗体。免疫作用较好诱导动物产生选择性对抗内源性抑制素的抗体。由鸟产生的这些抗体缩短了鸟初情期或产卵开始的时间。由于抗体可中和动物血流中抑制素的生物学活性，所以动物产生这些抗体也可提高动物的产卵能力。
虽然并不拘泥于理论，但据信抑制素的α亚单位可结合FSH受体并因而抑制素可竞争结合有这些受体位点的FSH。降低可能与受体位点结合之抑制素的水平，由于降低了对FSH受体位点的竞争因而增加了动物体内FSH的生物学效应。认为抗体通过与循环抑制素相互作用而中和抑制素，进而从空间上干扰相互作用之抑制素与FSH受体位点的结合。
令人惊奇的是，本发明的组合物也能用于增加鸟的终生总产卵数。术语“增加”是指经处理的鸟的终生总产卵数比未处理的鸟终生产卵数至少增加约3％。终生总产卵数较好至少增加约7％，更好增加至少约12％。更优选的是，终生总产卵数至少增加约15％。“经处理的”鸟应理解为已接受了本发明的异源蛋白质的鸟。简单地说，经投用有效量的本发明异源蛋白质以在鸟体内诱发免疫学反应，然后再投用有效量的异源蛋白质(加强免疫)以使反应保持最大，或比正常产卵的更高，从而可增加鸟的终生总产卵数。更具体地说，如果按上述加速产卵或初情期开始的方法中公开的剂量给雌鸟连续投用本发明的异源蛋白质，则经如此处理鸟与未经本发明的组合物处理的鸟相比，其将会增加终生总产卵数。
总地说来，本发明的方法将导致那些未经遗传上选择了多产卵特性之鸟的终生总产卵数。鸟的终生总产卵数受到产生鸟之死子的数目的限制。然而，某些种的鸟已经在遗传上选择了最大排卵或产卵特性。如上所述，自20年代后期即从遗传上选择了有最大产卵数的鸡。就鸡的短生命期而言，涉及对这一特性的选择经过了差不多从1928年至今的长时间。相反，平胸鸟和鹦鹉形目鸟以及大多数其他外来鸟则没有从遗传选择多产卵的特性。另外，频临危险的鸟也尚未经受遗传上对多产卵特性的选择。因此，鉴于鸡已是遗传上极好的产卵鸟，所以与那些遗传上产卵能力差或中等的鸟相比，用本发明的方法可看到的产卵数的改善便受到了限制。因此，对那些尚没有在遗传上选择了多产卵特性的鸟，如平胸鸟、鹦鹉形目鸟、其他外来鸟及频临危险的鸟来说，用本发明的方法可以看出终生总产卵数的更大程度的增加。因此增加终生总产卵数将导致由同样数目的鸟产生更多的卵，使产卵鸟发挥更大的效益。
不可预见到的是，本发明的组合物也可以用减少或消除使雌鸟脱羽的要求。更具体地说，如果按上文公开的方法给雌鸟连续投用上述组合物，与未用本发明的组合物处理的鸟相比，其产卵率将保持在足够高的水平，以致鸟不必为改善其产卵率而脱羽。当雌鸟如母鸡(单肉冠的白色来杭鸡，食用卵生产鸡)产卵率降低时，本领域常用的方法是使之脱去羽毛，这样维持鸟生长的花费就超出了由其所产生卵所带来的经济效益。为了使母鸡“脱羽”，鸡要经受大约4至14天的禁食，直到其开始脱羽即脱掉羽毛。在脱羽期间鸟即停止产卵。将鸟放回正常喂养条件后，鸟重新开始产卵。整个脱羽期是从开始禁食到下一个产卵周期开始要经过大约2个月的时间。实际上，鸟的产卵率得到了重新恢复。然而，在鸡脱羽后，其在下一个产卵周期中的产卵率并不等于在第一个产卵周期的产卵率(M.North and D.Bell，Commercial Chicken Production Manual，4th ed.，Chapter 19，Van Norstrand Reinhold，NY)。
例如，鸡在大约20周令时产卵并在大约40至50周产出经济上有显著数目的卵。在峰值产卵期，鸡可每10天产生8至9只卵。但在大约产卵50周之后，产卵率低至产卵高峰期的大约60％。在此时，鸡饲料的价值大于其所产卵的价值。实践通常在此时间使之脱羽，以使鸡重新开始产卵，并增加产卵率。
因此，鉴于使用本发明的组合物可使鸟比未用该组合物处理鸟产卵率保持在较高水平上，所以减少或消除了对使鸟脱羽的必要。减少或消除脱羽的要求可大大节省开支。更具体地说，在鸟脱毛前过多时间不产卵，并在恢复饲养后也有一段时间不能生产。因此消除或减少这段不能生产的阶段，使产卵率维持在较高水平可减少生产成本并提高生产效益。因为脱羽后的产卵率不等于如上文讨论的第一个产卵周期中的产卵率，所以保持较高产卵水平，可进一步提高生产者的利润。
简单地说，通过投用有效量的本发明异源蛋白质以诱导鸟的免疫学反应，然后再投用有效量的异源蛋白质(加强免疫)以维持较高于正常水平的产卵率，可提高鸟的产卵率从而不必使鸟脱羽。
本发明的另一个不可预见和令人惊奇的方面是，与未经处理鸟产的卵相比，本发明的组合物可使鸟产出更多减低了胆固醇含量的卵。更具体地说，如果按上述方法给鸟投用上述组合物，与未用本发明的组合物处理的鸟相比，鸟可在较长时间里产生降低了胆固醇含量的卵。因此，本发明的组合物可使鸟增加或产生更大数目的低胆固醇卵。
术语“增加”或“更大数目的”是指由经过处理的鸟产生的低胆固醇卵的数目比由未经处理鸟产生的低胆固醇卵数目至少增加约5％。所产生的低胆固醇卵的数目较好至少增加约10％，并且更好增加至少约15％。“经处理的”鸟是指已接受了本发明异源蛋白质的鸟。术语“低胆固醇”或“较低胆固醇”是指卵的胆固醇含量比该种鸟在终生产卵期间产生的卵的平均胆固醇含量至少低约10％。低胆固醇卵的胆固醇含量比平均水平较好至少低大约20％。更优选的是，低胆固醇卵的胆固醇含量比平均水平约低30％。
已知在鸡中，在其达到初情期后，由雌鸟产出的前5至6只卵的胆固醇比它后来产的卵低。本发明的组合物可诱导雌鸟在较长时间里产出有低胆固醇含量的卵。由于与血中高胆固醇水平有关的健康问题，所以仍有对低胆固醇卵产品的需求。因此，本发明的组合物可提供更大数目高度选择卵类型的产卵鸟。
因此本发明的增加产卵并加速鸟产卵开始的方法将大大加速群体的生长，并因而将借助本方法扩大如鸵鸟和鸸鹋等亚最佳产卵率之平胸鸟的市场。本发明的方法还将继续满足对家禽及其卵的需求。
本发明增加产卵之方法的实用性不限于增加鸟的产卵量。本发明的方法还可用于改善许多动物的产卵能力。例如，本方法可用于增加大多数农业饲养动物如猪、牛、羊和鸡的产卵量。另外，本发明的方法还可用于增加带皮毛动物如水貂、狐狸、水獭、雪貂和浣熊，以及其他其兽皮可用于装饰目的之动物的产卵率。本发明的增加卵产生的方法还可用于增加许多动物如外来动物或频临危险之动物的群体数，并且就频临危险的动物种来说该方法可防止其灭绝。本发明的方法还可用于增加那些用来赛跑、娱乐或演出(竞赛)的动物如马、狗、猫、动物园动物及马戏团动物的产卵数。再者，本发明的方法还可用作动物不育症的治疗方法。
本发明的另一个方面是生产抗本发明异源蛋白质之抗体的方法。一般地说，生产抗异源蛋白质之抗体的方法包括以下步骤：给动物注射有效量包含抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质，以在动物体内引发抗异源蛋白质的免疫学反应；收集动物的血液样品；然后从血液样品的血清中分离抗抑制素的任何抗体。较好使血清通过一个含有有效量载体蛋白质的柱以从血液样品的血清中分离出抗体。用于产生和纯化抗本发明异源蛋白质之抗体的技术是本领域普通技术人员已知的。
还应了解的是，可依据所需抗体的类型将本发明的异源蛋白质投用于任何动物。另外，抑制素可以是外源的或内源的。因此，可根据所需的抗体的类型来确定本发明异源蛋白质中抑制素的类型，以及接受组合物之动物的种。例如，为产生鸵鸟抗鸡抑制素抗体，可给鸵鸟投用包含鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白质的异源蛋白质。另外，为产生鸵鸟抗鸵鸟抑制素抗体，可给鸵鸟投用包含鸵鸟抑制素和麦芽糖结合蛋白质的异源蛋白质。
本发明还涉及检测由动物产生之抑制素的量，因而得以确定动物之产卵能力的方法。简单地说，检测动物血液中抑制素的量的方法包括以下步骤：从动物体内抽取血样；使血液样品在允许抗体选择性地与可能存在于样品中的任何抑制素反应的条件下，与特异性抗动物之内源性抑制素的抗抑制素抗体接触；从已相互作用的抗体中除去任何未相互作用的抗体；并检测发生相互作用的抗体的量。
本领域普通技术人员将会理解到，可用于上述方法的免疫检测技术是本领域中已知的。因此，本领域已知的任何免疫检测技术、标记物及显色方法均可用于上述方法中。优选的免疫检测法是ELISA(“酶联免疫吸附试验”)，优选的标记物是辣根过氧化物酶。另一种优选的标记物是显颜色的胶乳珠。带颜色的胶乳小珠可以是带任何为观察目的之颜色的。胶乳珠较好是黄色、红色、兰色或绿色。带颜色的胶乳小珠可以是中空的实心的，但较好是中空的以减小其重量。胶乳小珠可根据其在免疫检测法中的预期应用而有不同的大小。本领域普通技术人员可通过常规试验确定可以看到的但又不会从空间上干扰免疫检测反应的最大珠直径。胶乳珠的直径较好小于0.5μ，最好小于0.2μ。
例如，可使用常规夹心ELISA检测技术确定鸟血液中的循环抑制素浓度。首先，将针对抑制素部分或其片段的抗抑制素抗体结合到微量海定板的小孔上。洗涤并封闭之后，加入一定量从待试鸟中得到的血浆。使样品中可能存在的抑制素与固相化抗抑制素抗体发生选择性的相互作用，从平板的小孔中洗掉样品。然后向小孔内加入抗抑制素之不同部分或其片段的标记的抗抑制素抗体，并使抗体固定于小孔中。可用本领域中已知的任何标记物如辣根过氧化物酶标记抗体。使标记的抗抑制素抗体与任何固相化的抑制素发生选择性相互作用后，洗掉未发生作用的标记的抗抑制素抗体。使用适当的显示小孔中标记之抗抑制素抗体的工具检测血浆样品中存在的抑制素的量。同时在相邻的平板小孔中加用标准阳性和阴性对照物。
可用上述方法检测产生抑制素之任何动物的繁殖能力。可用本发明的方法确定由产生抑制素之任何种雌性动物产生的抑制素量。动物可以是鸟、哺乳动物或爬行动物。更具体地说，哺乳动物可选自但不只限于牛、人、马、猫、狗、羊、水貂、狐狸、水獭、雪貂、浣熊和猪。鸟可选自但不只限于鸵鸟、鸸鹋和鸡。优选的动物是鸟。更优选的动物是平胸鸟类。特别优选的动物是鸵鸟。另一种优选的动物是鸸鹋。再一种优选的动物是鸡。
有高水平抑制素的动物具有低的繁殖潜力，并且依据所涉及的物种及它们是否为农业目的而被繁殖，而选出这种低产卵率的动物进行屠、宰而不再用于繁殖目的。相反，那些有低水平抑制素的农业上繁殖的动物则是较高产卵的动物并一般被用于繁殖目的，对这些动物则不予宰杀。
动物体内的抑制素水平随其年龄、种属、以及与繁殖季节(如果有的话)相关的时间而异。因此，与有差不多同样年龄、同样动物繁殖季节的同种动物的平均抑制素水平相比，确定与这些因素有关的动物的产卵潜力，并测定动物的抑制素水平是最有价值的。
因为鸟产生的抑制素的量依据上述因素而有所不同，故确定不同月龄组鸟的抑制素相对量如下。表1说明平胸鸟如鸸鹋和鸵鸟的抑制素产生量的变化取决于它们是否为差的或好的产卵鸟，并取决于平胸鸟的月龄。
表1月龄 抑制素水平 繁殖潜力6-12 ＞5 差6-12 2-5 中等6-12 0-1.5 好24+ ＞7 差24+ 3-7 中等24+ 0-2 好
上表中，抑制素水平与平均每个繁殖季节产50至60只卵之雌性平胸鸟的标准集合值1相关，其为繁殖潜力好的；而每个繁殖季节产不足5只卵的功能上非产卵雌性平胸鸟的集合值7者为繁殖潜力差的。
本发明的再一个方面是产生抗另一类动物抗体，如IgG之动物抗体的方法。简单地说，在动物体内产生抗另一动物之IgG的抗体的方法包括以下步骤：给第二动物注射有效量的如抗上述方法产生之第一动物的抗体，以在第二动物体内发生抗第一动物抗体的免疫学反应；从第二动物体内抽取血液样品；并按上述方法从血液样品的血清中分离第二动物的抗体。第二动物较好是与第一动物不同种的。
本发明还涉及检测动物是否对投用含抑制素之组合物发生了免疫学反应的方法。该方法利用抗如上所述第一动物之抗体的第二动物抗体。简单地说，该方法包括使抑制素或本发明的异源蛋白质结合到固相上，并使固相化的抑制素与待试动物的血液样品接触。使样品在利于抑制素与样品中的抗抑制素抗体选择性相互作用的条件下与固相化的抑制素接触。从样品中除去未相互作用的抗体并洗涤后，加入一定量标记的来自抗第一动物抗体之第二动物的抗体。然后抗动物抗体的标记的抗体将选择性地与结合于固相比抑制素上的抗体相互作用。除去未相互作用的标记的抗体后，经显示标记物来确定相互作用之标记抗体的存在或其量。可见该方法可检测抗动物体内抑制素之抗体的存在，并因而确定动物是否已发生了针对含抑制素之组合物的免疫学反应。
可对任何种的雌性动物进行检测，以确定其是否对投用含抑制素的组合物发生了免疫学反应。动物可以是鸟、哺乳动物或爬行动物。更具体地说，哺乳动物可选自但不只限于牛、人、马、猫、狗、羊、水貂、狐狸、水獭、雪貂、浣熊及猪。鸟可以选自但不只限于鸵鸟、鸸鹋、美洲鸵和鸡。优选的动物是鸟。更优选的动物是平胸鸟。另一种优选的动物是鸸鹋。再一种优选的动物是美洲鸵。
本领域普通技术人员将会理解到，可用于上述方法的免疫检测技术都是本领域中已知的。因此，任何免疫检测技术、标记物及结果观察方法均可用于上述方法中。优选的免疫检测法是ELISA，并且优选的标记物是辣根过氧化物酶。另一种优选的标记物是带颜色的胶乳小珠。带颜色的胶乳小珠可呈任何利于显示的颜色。胶乳小珠可以是黄色、红色、兰色或绿色的。带颜色的胶乳小珠可以是中空或实心的，但为了更可能的减小带重量，较好是中空的。胶乳小珠的大小可因其在免疫检测中的应用而异。本领域普通技术人员可以确定可以看到的但又不干扰免疫检测反应的最大小珠直径。胶乳小珠直径较好小于0.5μ，最好小于0.2μ。
本发明的另一个实施方案涉及上述确定动物是否对投用包含抑制素的组织物产生了免疫学反应的方法，其中对免疫检测法作了如下改动。简单地说，该方法包括从动物体内得到血液样品，并使之与标记的动物抑制素或其片段接触。使样品在动物抑制素将与样品中的抗抑制素抗体特异性相互作用的条件下与标记的动物抑制素接触。从样品中除去未作用的标记的抑制素后，经使标记物显色来确定发生作用之标记的抑制素的存在或其量。用于该方法的抑制素选自但不只限于本发明的融合的异源抑制素蛋白质、内源性抑制素或其片段，以及外源性抑制素或其片段。标记的抑制素最好是内源性抑制素。
下列实施例进一步举例说明本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。相反，应明确的是，在阅读了本说明书后可以提示本领域技术人员在不背离本发明的精神和/或待批权利要求之范围的前提下对发明作出各种其他体现、改动和等同替代。
实施例1
产生包含编码表达鸡抑制素之基因，和编码表达麦芽糖结合蛋白质之基因的融合基因产物的方法。
下文描述产生包含编码表达α亚单位鸡抑制素的片段(SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4)的基因(cINA515)，以及编码表达麦芽糖结合蛋白质的基因的融合基因产物的方法。本发明的融合基因产物是从pMALTM-c载体试验盒(New England Biolabs，Beverly Mas-sachusetts)制得的。
pMALTM载体为表达从克隆的基因或开放阅读框架表达的蛋白质提供了一种方法。将克隆的基因插入到编码麦芽糖结合蛋白质(“MBP”)之malE基因的下游，并导致MBP融合蛋白质(“MBP-cINA515”)的表达。该方法使克隆的序列得以高水平表达，并使用对麦芽糖的MBP亲合柱一步骤纯化融合蛋白质，MBP-cINA515。
以下是将抑制素基因cINA515连接到pMALTM-c载体中的方法：
1.在含鸡抑制素基因，cINA515的20μl反应体积中消化0.5μgpMALTM-c质粒DNA。
2.在含鸡抑制素基因cINA515的200μl反应体积中消化来自gt11克隆的20μgλDNA。
3.向载体DNA消化反应中加入0.05单位小牛肠碱性磷酸酶(NEB#290)。37℃保温1小时。
4.在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离4μl pMALTM反应混合物和15μlλ反应混合物，以检查是否完成消化。向pMALTM和λgt11消化反应中分别加入1μl和8μl0.5M EDTA。
5.向限制性消化产物中加入等体积的1∶1苯酚/氯仿混合物、混合并除去液相(上层)，然后放入新的试管中。单独用氯仿重复上述提取。
6.向载体消化产物中加入作为载体的10μg糖原或tRNA。而消化产物中均加入1/10体积的3M乙酸钠，混合，然后加入等体积的异丙醇。室温下保温10分钟。
7.微量离心10分钟。倾掉上清，用70％乙醇淋洗沉淀物，并使之干燥。
8.在25μl含10mMTris-Cl、1mM EDTA(pH8.0)的溶液中重新悬浮各样品。
9.混合2μl载体消化产物、6μl插入段消化产物，加入8μl水，然后将此DNA混合物于65℃加热5分钟。在冰上冷却，然后加入4ml 5X连接酶缓冲液、0.5μlNEB T4连接酶(#202；～200单位)，并于16℃保温2小时到过夜。
10.于65℃加热5分钟；在冰上冷却。
11.与25μl感受态TB1(或任何lacZα补充菌株)混合并在水上保温5分钟。于42℃加热2分钟。
12.加入0.1μlIB并于37℃保温20分钟。分散于含100μg/ml氨苄青霉素(amp)的LB平板上。37℃保温过夜。用无菌牙签将菌落挑到主LB-amp平板上及含有80μg/ml Xgal和0.1mM IPTG的LB-amp平板上。37℃保温8至16小时。计数Xgal平板上的Lac表型并从主平板上回收“白色”克隆。
13.按下述一种或两种方法筛选插入物：
A.制备小量制备DNA。用适当的限制性核酸内切酶消化以确定插入物的存在及方向。
B.i)在LB-amp培养液中培养5ml培养以达到大约2×108个细胞/ml。
ii)取1ml样品。微量离心2分钟，弃去上清并将细胞重新悬浮于50μl蛋白质凝胶SDS-PAGE样品缓冲液中。。
iii)向剩余培养物中加入IPTG至0.3mM，例如加入15μl0.1M贮备溶液。在良好通气条件下37℃保温2小时。
iv)取0.5ml样品。微量离心2分钟，弃去上清并将细胞重新悬浮在100μlSDS-PAGE样品缓冲液。
v)将样品煮沸5分钟。各15μl样品连同一组蛋白质分子量(MW)标准品及15μl加在SDS-PAGE样品缓冲液中的MBP，在10％SDS-PAGE凝胶上电泳。用考马斯亮蓝着染凝胶。在相当于融合蛋白质之分子量的位置上很容易看到导出的带。单独MBP的分子量为42,000道尔顿。
实施例2
生产含有鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白质之融合的异源蛋白质“MBP-cINA515”的方法。
以下描述生产含有鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白质之融合的异源蛋白质“MBP-cINA515”的方法。按下述步骤由实施例1的融合基因产物表达融合的异源麦芽糖结合蛋白质-抑制素蛋白质“MBP-cINA515”：
1.用0.8ml含有实施例1之融合质粒的过夜细胞培养物接种80ml含葡萄糖和氨苄青霉素的丰富培养液(参见下文“培养基和溶液”)。
2.在良好通气条件下将细胞37℃培养至2×108细胞/ml(A600约为0.5)。取1μl样品并微量离心2分钟(未被诱导的细胞)。弃去上清并将细胞重新悬浮在50μlSDS-PAGE样品缓冲液中。涡流搅拌并置于冰上。
3.加其余培养物中加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)使其终浓度达到0.3mM，例如加入溶于水中的0.24ml的0.1M贮备液(参见“培养基和溶液”)。37℃继续保温2小时。取0.5ml样品并微量离心2分钟(诱导的细胞)。弃去上清并将细胞重新悬浮在100μlSDS-PAGE：样品缓冲液中。涡动搅拌以重新悬浮细胞并置于冰上。
4.将培养物分成两等份。以4000xg离心10分钟以收获细胞。弃去上清并将1份沉淀物(样品A)重新悬浮在5ml溶胞缓冲液(参见“培养基和溶液”)中。将另一份沉淀物(样品B)重新悬浮在10ml含20％蔗糖的30mM Tris-Cl，pH8.0中(每0.1g湿重细胞用8ml溶液)。
5.在干冰-乙醇浴中冷冻样品(或于-28℃过夜)。在冷水中融化(20℃比70℃更有效，但所需时间更长)。
6.超声破碎细胞，使用Bradford检测法检测蛋白质的释放或测A260吸光率确定核酸释放量直至其达到最大值，以监测细胞破碎情况。加0.6μl5MNaCl。
7.以9,000xg离心20分钟。弃去上清(粗提物1)并保存于冰上。将沉淀物重新悬浮于5ml溶胞缓冲液中。此为不溶性材料的悬浮液(粗提物2)。
按下述步骤柱纯化如上产生的异源融合的麦芽糖结合蛋白质-抑制素蛋白质“MBP-cINA515”：
1.在加250ml过滤瓶中的5ml柱缓冲液(参见“培养基和溶液”)中将直链淀粉树脂(1.5g)溶胀30分钟。用吸引器脱气。倾入2.5×10cm柱中。用3倍柱体积的含0.25％Tween20的同样缓冲液洗柱。所需树脂的量取决于所产生的融合蛋白质的量。树脂结合大约3mg/ml床体积，所以大约15ml的柱应足以产生每升培养物高达45mg的融合蛋白质。可用塞有硅烷化玻璃纤维的50ml注射器代替2.5cm柱。柱高对直径的比例应小于或等于4。
2.用含有0.25％Tween20的柱缓冲液以1∶5比例稀释粗提物。将稀释的粗提物以[10x(柱直径(cm))2]ml/小时的流速上柱。对于2.5cm柱这一流速约相当于1ml/分钟。
使粗提物稀释液的蛋白质浓度降低到大约2.5mg/ml。如果粗提物浓度不够低，则不作如此大的稀释。一个好的经验是1g湿重细胞大约产生120mg蛋白质。
3.用2倍柱体积的柱缓冲液+0.25％Tween20洗柱。
4.用3倍柱体积的不含Tween20的柱缓冲液洗柱。
5.用柱缓冲液+10mM麦芽糖+0.1％SDS(也可以含10mMβ-巯基乙醇，1mM EGTA)洗脱融合蛋白质。收集10-20管每管3ml的洗脱物。用Bradford检测法或测A260吸光率以检测各管蛋白质；含有融合蛋白质的各管内有可容易检测的蛋白质。在柱的排空体积之后即很快洗脱融合蛋白质。培养基和溶液*丰富培养基+葡萄糖和氨苄青霉素＝每升含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5gNaCl、2g葡萄糖。高压灭菌，加入无菌氨苄青霉素至100μg/ml。*0.1M IPTG贮备液＝1.41g IPTG(异丙基-β-O-硫代半乳糖苷)，加水至50ml。过滤并除菌。*0.5M磷酸钠缓冲液，PH7.2(贮存液)＝
(A)69.0gNaH2PO4.H2O加水至1升。
(B)70.9gNa2HPO4加水至1升。将117ml(A)与383ml(B)混合。该贮备液的PH应为～7.2。在柱缓冲液中稀释至10mM。pH应为7.0。
溶胞缓冲液
每升 终浓度20ml0.5MNa2HPO4 10mM磷酸盐1.75g NaCl 30mM NaCl10ml 25％Tween 20 0.25％Tween j200.7mlβ-巯基乙醇(β-ME)(可有可无)10mMβ-ME20ml0.5M EDTA(pH8) 10mM EDTA10ml1M EGTA(pH7) 10mM EGTA用HCl或NaOH调至pH7.0
柱缓冲液
每升 终浓度20ml0.5M磷酸钠，pH7.2 10mM磷酸盐29.2g NaCl 0.5M NaCl1ml 1M叠氮钠 1mM叠氮化物0.7mMβ-ME(可有可无) 10mMβ-ME1ml1M EGTA(pH7)(可有可无) 1mM EGTA必要时调至pH7.0。
低盐柱缓冲液
每升 终浓度20ml 0.5M磷酸钠，pH7.2 10mM磷酸盐1.75g NaCl 30mM NaCl1ml 1M叠氮钠 1mM叠氮化物0.7mlβ-巯基乙醇(可有可无) 10mMβ-ME1ml1M EGTA(pH7)(可有可无) 1mM EGTA必要时调至pH7.0。
图1中“E”栏说明了在通过柱后融合的鸡抑制素-MBP异源蛋白质“MBP-cINA515”的纯度。标示“F”的栏是柱上不加异源蛋白质时从柱上得到的洗脱物(阴性对照)。标示“B”的栏代表质粒pMALTM-c载体标准品。标示“C”的栏是分子量标准品。标示“D”是在按实施例2中所述方法插入抑制素基因之前，用于制备融合的鸡抑制素-MBP异源蛋白质的真正pMALTM-c载体。将上述蛋白质在加于SDS-PAGE样品缓冲液中的SDS-PAGE凝胶上电泳，并用考马斯亮蓝染料染色。
实施例3
免疫鸵鸟抗抑制素的方法
以下描述免疫鸵鸟的对抗抑制素的方法。在鸟的第1个繁殖季节之前约6个月对鸵鸟进行初次免疫，然后在6个月里以1个月间隔期进行加强免疫。因此，最好在鸟处于18和24月龄之间时对鸵鸟进行初次免疫。初次免疫投用1.5至30mg含有鸡抑制素(α亚单位的片段)和麦芽糖结合蛋白质(按实施例1和2中所述方法生产的)的融合的异源蛋白质。加强免疫投用0.75至1.5mg融合的异源蛋白质。初次免疫中在弗氏完全佐剂(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)中乳化融合的异源蛋白质，加强免疫中在弗氏不完全佐剂(Sigma)中乳化融合的异源蛋白质。在沿着鸵鸟腿上部的三个位点处皮下注射融合的异源蛋白质。
实施例4
生产选择性抗抑制素之鸵鸟抗体的方法
以下描述生产选择性抗本发明包含鸡抑制素属麦芽糖结合蛋白质之异源蛋白质的鸵鸟抗体(“鸵鸟抗鸡抑制素抗体”)的方法。更具体地说，鸵鸟抗体是IgG抗体。所使用的异源蛋白质是按实施例1和2中所述方法生产的含鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白的融合蛋白质。为了生产抗体，按照实施例3中所述的方法用鸡抑制素-MBP异源蛋白质免疫鸵鸟。用于免疫鸵鸟的量必须足以在鸵鸟体内引发抗异源蛋白质的免疫学反应。从鸵鸟体内抽取约5ml血，然后从血样中分离抗抑制素抗体。本领域已知的任何分离方法均可被用于分离抗体。较好使用标准ELISA技术。
实施例5
生产选择性抗鸵鸟抗体之羊抗体的方法
本实施例描述选择性抗一类包括按实施例4中所述生产之抗体的鸵鸟抗体，特别是抗IgG鸵鸟抗体之羊抗体的方法。该方法中用0.5至3.0mg鸵鸟IgG免疫羊，从而在羊体内发生抗鸵鸟IgG的免疫学反应。从不同鸵鸟的合并的血清中得到鸵鸟IgG。从羊体内抽取血液，然后使用本领域已知的技术从样品中分离羊抗鸵鸟IgG。
使用标准技术纯化合并的血清，这些技术包括用50％硫酸铵进行沉淀，然后再使用A蛋白-Sepharose柱进行分级分离。较好按下述进行IgG沉淀。用50mMTris(pH8.0)按1∶1比例稀释含IgG的12ml血清。然后于搅拌下缓慢加入24ml饱和硫酸铵(均在4℃下进行)，并将混合物搅拌约2小时。10,000rpm离心混合物10分钟以收集沉淀物。将沉淀物重新悬浮在50mM-Tris/盐水中(至12ml)，并在4℃下对2L 50mM-Tris透析过夜，终体积为20ml。
然后较好按下述方法使用A蛋白-Sepharose柱进行分级分离。层析柱含有A蛋白-Sepharose CI-4B(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)。用大约5ml硫酸铵/血清沉淀物装柱。经大约30分钟使样品结合到A蛋白-Sepharose上。然后用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗柱，并用0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脱吸附的IgG。最后，加入几滴1M Tris-HCl(pH9)中和洗脱的部分。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后测纯化的鸵鸟IgG的量，然后用于免疫羊。
免疫方法和所使用的佐剂对本发明来说并不严格，因此本领域已知的任何方法均可使用，本领域已知的任何佐剂也均可使用。较好将纯化的鸵鸟IgG皮下注射到羊体内。同时较好使用弗氏不完全佐剂以四周间隔期进行加强注射。纯化的IgG较好与弗氏完全佐剂或Hunter′s Titermax(Sigma Chemical Co.，SE，Louis，Missouri)一起使用。在经过3至4次注射后，羊发展了令人满意的免疫反应。
然后，从羊体内抽取5-10ml血液，并从血液样品中分离抗鸵鸟IgG的羊抗体。本领域已知的任何方法均可用于从血液样品中分离羊抗体。从血液中分离羊抗体的优选方法是使血液样品通过鸵鸟IgG柱。然后用甘氨酸缓冲液(pH8.0)洗柱，以从柱上得到羊抗体。
实施例6
在用融合的异源蛋白质免疫接种后监测鸵鸟的免疫学反应的方法
以下描述在用包含按实施例1和2所述方法生产的鸡抑制素和麦芽糖结合蛋白质的融合异源蛋白质免疫接种鸵鸟之后，监测鸵鸟之免疫学反应的方法，其中是使用实施例5中生产的羊抗体监测免疫学反应。为了确定鸵鸟是否已与融合的抑制素-MBP异源蛋白质发生了免疫学反应，首先将异源蛋白质结合到固相上。然后，从已用异源蛋白质免疫的鸵鸟体内抽取5-10ml血液，并从血液中分离血清。在适于异源蛋白质选择性地与血清中的任何抗抑制素抗体结合的条件下，使固相化的异源蛋白质与血清接触。洗涤后，加入已用HRP标记的实施例5中产生的羊抗体。然后标记的羊抗体将选择性地与已结合到固相化异源蛋白质上的鸵鸟抗体相互作用。除去未相互作用的标记的抗体后，经显示标记物来确定发生相互作用之HRP标记的羊抗体的存在或其量。较好加入HRP的底物氮蓝四唑(“NBT”)来显示标记物。
本领域普通技术人员将会理解到，用于上述方法中的免疫检测技术是本领域中已知的。因此，任何免疫检测技术、标记物及显示方法均可用于上述方法中。优选的免疫检测法是ELISA，并且优选的标记物是辣根过氧化物酶。另一种优选的标记物是带颜色的胶乳小珠。
实施例7
确定鸵鸟之繁殖潜力的方法
本实施例描述通过定量鸵鸟血液中的抑制素含量来确定鸵鸟之繁殖能力的方法。可使用标准的夹心ELISA技术确定鸵鸟血液中的循环抑制素浓度。首先，将实施例4中产生的抗抑制素抗体结合到微量滴定板的小孔中。洗涤并封闭平板后，向微量滴定板的小孔中加入一定量得自鸵鸟的血浆或血清。使可能存在于样品中的抑制素与固相化抗抑制素抗体选择性地相互作用后，从平板的小孔中洗掉样品。然后，向小孔中加入实施例4中产生的与辣根过氧化物酶结合的不同的抗抑制素抗体。HRP连接的抗抑制素抗体不同于固相化的抗抑制素抗体在于它们可选择性地对抗抑制素的不同部分。使标记的抗抑制素抗体选择性地与任何固相化的抑制素相互作用后，经洗涤除去未发生相互作用的标记的抗抑制素抗体。向小孔中加入NBT并显示小孔中固相化标记的抗抑制素抗体的量，以确定血浆样品中存在的抑制素的量。同时在相邻平板小孔中检测标准阳性和阴性对照样品。标准阳性和阴性对照样品是在相邻平板小孔中同时进行检测的。许多免疫检测技术、标记物及结果显示方法都是本领域已知的。因此，任何免疫检测方法、标记物和显色技术均可用于本发明中。
实施例8
加速鹌鹑产卵开始的方法
如上所述，插入到Bluescript之EcoRI位点中的鸡抑制素α亚单位cDNA克隆(cINA6)是由P.A.Johnson(Connell University)惠赠的。经用PstI消化从cINA6克隆中切下一DNA片段(“cINA515”)。cINA515 DNA片段包括成熟鸡抑制素α亚基的大部分。将该片段码内克隆到质粒p-MALTM-c中，并在IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导和SDS-PAGE后检测麦芽糖结合蛋白质(“MBP”)和有适当大小的融合蛋白质(图1，泳道E)。按下述方法用所得到的蛋白质结合物(“MBP-cINA515”)作为抗原免疫初情期前的雌性日本鹌鹑(Coturnix Coturnix japonica)并检测其抗循环抑制素水平。
在为鹌鹑改进的2S-D型Petersime孵雏暖房中孵出初生雏鹌鹑。最初的孵雏温度约为37.8℃，每周降低约2.8℃，直至达到室温。在生长期间(即直到大约6周令)，提供鹌鹑初生阶段定量食物(28％CP，2,800大卡ME/公斤饲养)和水以使之随意消耗，将100只鹌鹑随机分成下列4个注射组(每组25只)：(1)加在多分散的β-(1，4)连接的乙酰化甘露糖醇(“Acemannan”)(一种免疫刺激剂载体，参见Chinnah et al.，Antigen dependent adjuvant activity of a poly-dispersed β-(1，4)-linked acetylated mannan(acemannan)，Vaccine，Vol.10，8，p551-557，1992)中的MBP-cINA515(“MBP-cINA515/ACE”)，(2)加在弗氏佐剂中的MBP-cINA515(“MBP-cINA515/FRN)，(3)Acemannan(免疫刺激剂对照，“ACE”)，或(4)弗氏佐剂(佐剂对照，“FRN”)。给抗抑制素免疫的每只鸟(1组和2组)投用约0.75mg加在适当的对照载体中的MBP-cINA515。对1和3组及2和4组分别给予等体积(0.2ml)的ACE或FRN注射。所有注射均使用配有25号针头的结核菌素注射器进行皮下注射。初次注射后，在翅膀上加带标记环以识别这些鹌鹑，然后圈养在产卵笼中(分别圈养)。然后每只鸟每周给予大约0.375mgMBP-cINA515进行加强免疫，或者予以注射适当的对照物，连续注射5周(即在第32、39、46、53和60日龄)。于6周令开始，给鹌鹑提供繁殖食物(21％卡值，每公斤饲料2,750大卡ME)和水以使之随意消耗。
从41天令开始(看作是产卵周期的第1天)，记录每天雌鸟产卵数(“HDEP”)和死亡率(“MORT”)，连续进行12周。另外，分别对四个处理组计算第一次产卵(“FIRST”)的平均日龄和雌鸟达到50％产卵率(“FIFTY”)的日龄。
对雌鸟日产卵数据进行两种不同的方差分析(“ANOVA”)，各分析均掺入完全随机的设计，并进行分开作图排布处理。在第一ANOVA中，主图由4种注射处理(MBP-cINA515/ACE、MBP-cINA515/FRN，ACE或FRN)组成，并且各7天的12个产卵期均包括分割隙。在第二ANOVA中，为了更有力地试验抑制素免疫中和效应对对照反应的差异，合并两个抑制处理组的数据，并合并两个对照处理组的数据。因此，主图由两种注射处理(合并的MBP-cINA515/ACE和MBP-cINA515/FRN数据对合并的ACE和FRN数据)组成，每7天的12个产卵周期每包括有分割隙。
至此，信息基本上是只作为35天数据收集的。在研究的前35天期间每周产卵间期(第0、7、14、21和35天)的累积百分HDEP率作图示于图2(其中4个注射组被看作是分别的处理)和图3(其中只作了非免疫(对照)对抑制素免疫组的比较)中。表2中给出作为独立处理的4个注射组在第1、2、3、4、5周和1至5周组合的平均HDEP率。
表3给出当为了进行对照对免疫处理比较而合并数据时，在同样时间框期间的HDEP率。表4包括所考虑的两种统计学处理情况的FIRST产卵数据(即4个注射处理组和合并之数据的比较)。
表2
使用麦芽糖结合蛋白质-鸡抑制素α亚单位融合产物(MBP-cINA515)进行抑制素免疫中和对日本鹌鹑雌鸟日产卵率(％)平均值(±SE)的影响
处理 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第1-5周Acemannan 5.82±2.78a，b 39.56±7.19 70.33±7.92 78.02±6.69a82.97±6.44 53.33±5.40(ACE)弗氏佐剂 2.65±2.16a 28.57±6.73 61.90±7.70 79.67±7.10a90.29±5.20 51.03±4.77(FRN)MBP-cINA51512.64±4.29a，b43.40±8.14 66.48±8.08 76.92±6.29a85.71±5.98 57.03±5.24/ACEMBP-cINA51516.48±5.70b 50.00±7.65 74.86±5.61 96.57±1.70b94.29±3.19 64.73±3.91/FRN其中标有不同右上角字的标的平均值是不同的(p＜0.05)±SE＝标准误差
表3
使用麦芽糖结合蛋白质-鸡抑制素α亚单位融合产物(MBP-cINA515)进行抑制素免疫中和对日本鹌鹑雌鸟日产率(％)平均值(上SE)的影响：合并的数据处理* 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第1-5周对照组 4.23±1.76a 33.96±4.93j 66.04±5.50 78.85±4.83 86.55±4.14 52.18±3.57x免疫组 14.56±3.54b 46.70±5.55k 70.59±4.94 86.55±3.57 89.92±3.44 60.88±3.28y*对照组＝合并的Acemannan(ACE)和弗氏佐剂(FRN)数据；免疫组＝合并的MBP-cINA515/ACE和MBP-cINA515/FRN数据。a，b(P＜.0095)；j，k(P＜.0888)；x，y(P＜.0763)±SE＝标准误差
表4使用麦芽糖结合蛋白质-鸡抑制素α亚基融合产物(MBP-cINA515)进行抑制素免疫中和对日本鹌鹑第一次产卵(FIRST)之平均日龄(±SE)的影响
处理* FIRST(日龄)Acemannan(ACE) 54.92±1.77a，b弗氏佐剂(FRN) 55.73±1.58aMBP-cINA515/ACE 53.58±1.8a，bMBP-cINA515/FRN 50.38±1.08b对照 55.33±1.17x免疫的 51.98±1.07y*对照＝合并的Acemannan(ACE)和弗氏佐剂(FRN)数据；免疫的＝合并的MBP-cINA515/ACE和MBP-cINA515/FRN数据a，b(P＜.05)；x，y(P＜.0373)SE＝标准误差
至此，死亡率已不再作4只已死亡鸟(3只对照鸟，1只经处理的鸟)的因数。在已达到76日龄之鹌鹑的预期限度内，这样的死亡率(4％)应是很好的数据。另外，无壳、薄壳和被损坏之卵的发生率低，都正常发生频率范围内，并且均匀地分布于4个注射处理组中(即抑制素免疫并没有改变所产出的有缺陷卵的数目)。
抑制素免疫对产卵效力的最初积极影响仍然存在。这种作用在合并的HDEP(表3)和FIRST(表4)中得到具体地证实，其中增加了观察到的数目，这些数据包括放大了所应用之统计学试验的倍数的平均值。
数据显示在抑制素处理组加速了初情期的开始。所收集的HDEP和FIRST数据证实了这一点。在研究的第1周，抑制素处理的鹌鹑中见有与较高平均HDEP率相关联的高度统计学可信度(p＜.0095)，第2周里差不太明显(p＜.0888)(表3)。在第2周观察到的这一临界处理组差异可能代表进行对照注射的鹌鹑产卵虽然延迟了，但此时已开始强化。因此，第1周在两个处理组(抑制素对非抑制素)间发现的统计学差异的强度因产卵时间提前而可预见地被冲淡了。确实，当将第1至5周的数据结合在一起时，在抑制素处理的雌鸟中发现有中等统计学相关性(p＜.0763)的显著高的平均HDEP率。
另外，与未免疫的鹌鹑(55.33日龄)相比，被免疫的鹌鹑(51.98日龄)产出其第一只卵(FIRST)时的平均日龄提前了3天以上(表4)。在具有50.38日龄之平均FIRST值的MBP-cINA515/FRN处理的鹌鹑中，抑制素免疫对加速产卵的这种影响特别显著。
实施例9
加速鸵鸟产卵开始的方法
使用蛋白质结合物(MBP-cINA515)作为抗原免疫初情期前的雌性鸵鸟以对抗循环抑制素，并因而加速经处理之鸵鸟的产卵开始。对实施例8中所述的方法改动如下。未处理之鸵鸟初情期的平均开始时间约为28至32月龄。对具有近似平均体重约156至300磅的鸵鸟进行如下处理：在其第26月龄时初次注射5.0mg本发明的异源蛋白质，在第27、28、30、32、34和36月龄时用2.5mg异源蛋白质进行加强免疫。
实施例10
加速鸸鹋产卵开始的方法
使用蛋白质结合物(MBP-cINA515)作为抗原免疫初情期前的雌性鸸鹋以抗循环抑制素水平，并因而加速被处理之鸸鹋的产卵开始。按照作了如下改动的实施例8所述方法进行免疫处理。未经处理的雌鸟初情期平均大约是20个月。对具有近似体重范围50至90磅的鸸鹋作如下免疫处理：于其第18个月龄时用3.0mg本发明的异源蛋白质进行初次(第1次)注射；并在第19，20，22，24，26和30月龄时进行加强免疫。
实施例11
加速鸡产卵开始的方法
使用蛋白质结合物(MBP-cINA515)作为抗循环抑制素水平的抗原免疫初情期的雌性鸡，并因而加速被处理鸡的产卵开始。按照作了如下改动的实施例8中所述方法免疫动物。未被处理鸡的初情期大约是20周。对体重范围约在2.0至3.5磅的鸡进行下列程序的免疫处理：在其第15周令时用1.5mg本发明的异源蛋白质进行初始(第一次)注射；并于第17，20，24，30，40和50周令时用0.75mg进行加强免疫。
实施例12
加速火鸡产卵开始的方法
使用蛋白质结合物(MBP-cINA515)作为抗原免疫初情期前的雌性火鸡对抗循环抑制素水平，并因而加速被处理火鸡的产卵开始。按照有如下改动的实施例8的方法进行免疫。未经处理之火鸡的初情期平均约为30周。对平均体重范围为9.0至12磅的火鸡进行如下处理：于其第28周令时用2.0mg本发明的异源蛋白质进行初始(第一次)注射；并于其第29、30、34、38、46和54周令时用1.0mg蛋白质作加强注射。
实施例13加速鹦鹉产卵开始的方法
针对循环抑制素水平使用蛋白质结合物(MBP-cINA515)作为抗原免疫初情期前的雌性鹦鹉，并因而加速被处理鹦鹉的产卵开始。按照作了下述改动的实施例8所述的方法进行免疫处理。对平均体重范围约为0.5至1.25磅的鹦鹉进行如下处理：在其第28月龄用0.75mg本发明的异源蛋白质进行初始(第一次)注射；并于第29，30，32，34，36和38月龄用0.375mg进行加速注射。
当然，应明确的是，上述内容只涉本发明的优选实施方案，并可没有背离本发明的精神和待批权利要求之范围的前提下对其作出许多改变或改动。
序列表
(1)一般信息：
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征
(A)长度：515碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：G CGC CCA TCG GAG GAC GTG GCC GCC CAC ACC AAC TGC CGC CGG GCG 46TCC CTC AAC ATC TCT TTC GAG GAG CTG GGC TGG GAC AAT TGG ATC GTG 94CAC CCC AGC AGC TTC GTT TTC CAC TAC TGC CAC GGG AAC TGT GCC GAA 142GGC GAC GGG CTG AGC CAC CGG CTG GGG GTG CAG CTG TGC TGC GCC GCG 190CTG CCC GGC ACC ATG CGC TCA CTG CGT GTC CGC ACC ACC TCT GAT GGT 238GGC TAC TCC TTC AAG TAC GAG ACG GTG CCC AAC ATC CTG GCG CAG GAC 286TGC ACC TGT GTC TAG C 302AGCTGGC ATGCACGGCC AGACCCGCGT GGATCTCCCC GTTGCCTCTG GACTGCCCCA 359GTGCCAGATG ATGAGCCCAT CCCAGGGATG GAGGAGTCAC TCACACGGGC ACTGCGCAGC 419CCGGAGCAGG GAGAGGGACC CAGGTGGAAG TTTTGGTGGT GCCACCCTCC CTTTGACTGC 479CAGGGTTTCA TGGTTTCAGG TTGCGTGGGT GCTGCA 515
(3)SEQ ID NO：2的信息
(i)序列特征
(A)长度：99残基
(B)类型：氨基酸
(C)链数：
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：Arg Pro Ser Glu Asp Val Ala Ala His Thr Asn Cys Arg Arg Ala 15Ser Leu Asn Ile Ser Phe Glu Glu Leu Gly Trp Asp Asn Trp Ile Val 31His Pro Ser Ser Phe Val Phe His Tyr Cys His Gly Asn Cys Ala Glu 47Gly Asp Gly Leu Ser His Arg Leu Gly Val Gln Leu Cys Cys Ala Ala 63Leu Pro Gly Thr Met Arg Ser Leu Arg Val Arg Thr Thr Ser Asp Gly 79Gly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Ile Leu Ala Gln Asp 95Cys Thr Cys Val 99
(4)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征
(A)长度：516碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：G CGC CCA TCG GAG GAC GTG GCC GCC CAC ACC AAC TGC CGC CGG GCG 46TCC CTC AAC ATC TCT TTC GAG GAG CTG GGC TGG GAC AAT TGG ATC GTG 94CAC CCC AGC AGC TTC GTT TTC CAC TAC TGC CAC GGG AAC TGT GCC GAA 142TGG CCA CGG GCT GAG CCA CCG GCT GGG GGT GCA GCT GTG CTG CGC CGC 190GCT GCC CGG CAC CAT GCG CTC ACT GCG TGT CCG CAC CAC CTC TGA 235TGGTGGCTAC TCCTTCAAGT ACGAGACGGT GCCCAACATC CTGGCGCAGG 285ACTGCACCTG TGTCTAGCAG CTGGCATGCA CGGCCAGACC CGCGTGGATC 335TCCCCGTTGC CTCTGGACTG CCCCAGTGCC AGATGATGAG CCCATCCCAG 385GGATGGAGGA GTCACTCACA CGGGCACTGC GCAGCCCGGA GCAGGGAGAG 435GGACCCAGGT GGAAGTTTTG GTGGTGCCAC CCTCCCTTTG ACTGCCAGGG 485TTTCATGGTT TCAGGTTGCG TGGGTGCTGC A 516(5)SEQ ID NO：4的信息
(i)序列特征
(A)长度：77残基
(B)类型：氨基酸
(C)链数：
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：Arg Pro Ser Glu Asp Val Ala Ala His Thr Asn Cys Arg Arg Ala 15Ser Leu Asn Ile Ser Phe Glu Glu Leu Gly Trp Asp Asn Trp Ile Val 31His Pro Ser Ser Phe Val Phe His Tyr Cys His Gly Asn Cys Ala Glu 47Trp Pro Arg Ala Glu Pro Pro Ala Gly Gly Ala Ala Val Leu Arg Arg 63Ala Ala Arg His His Ala Leu Thr Ala Cys Pro His His Leu 77
Claims (23)
1.加速雌性鸟产卵开始的方法，包括给雌性鸟投用有效量的包含α亚单位鸟抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白的异源蛋白质，从而加速鸟的产卵开始。
2.权利要求1的方法，其中鸟选自平胸鸟、鹦鹉形目鸟、隼形目鸟、
形目鸟、鸮形目鸟、雀形目鸟、佛法僧目鸟、秧鸡形目鸟、鹃形目鸟、鸽形目鸟、鸡形目鸟和herodiones。
3.权利要求2的方法，其中平胸鸟选自鸵鸟、鸸鹋、美洲鸵、几维和食火鸟。
4.权利要求2的方法，其中鸟选自鸡、火鸡、鹦鹉、makaw、隼、雕、鹌鹑、鹰、鸽、葵花鸟、燕雀亚目鸟、松鸦、黑鸟、雀科鸣鸟、刺嘴莺及麻雀。
5.权利要求1的方法，其中抑制素蛋白质具有或含有实质上如SEQ ID NO：2所示的相同序列。
6.权利要求1的方法，其中抑制素蛋白质具有或含有实质上如SEQ ID NO：4所示的相同序列。
7.权利要求1的方法，其中载体蛋白质选自麦芽糖结合蛋白质、牛血清白蛋白、卵白蛋白、鞭毛蛋白、匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、γ球蛋白、同源细胞、携带Ia抗原的同源细胞及氨基酸的聚合物。
8.增加雌性平胸鸟之卵产生率的方法，包括给雌性平胸鸟投用有效量的包含α亚单位鸟抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质，从而增加平胸鸟的产卵率。
9.权利要求9的方法，其中平胸鸟选自鸵鸟、鸸鹋、美洲鸵、几维和食火鸟。
10.权利要求9的方法，其中平胸鸟是鸵鸟。
11.权利要求8的方法，其中抑制素蛋白质具有或含有实质上如SEQ ID NO：2中所示的相同序列。
12.权利要求8的方法，其中抑制素蛋白质具有或含有实质上如SEQ ID NO：4中所示的相同序列。
13.权利要求8的方法，其中载体蛋白质选自麦芽糖结合蛋白质、牛血清白蛋白、卵白蛋白、鞭毛蛋白、匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、γ球蛋白、同源细胞、携带Ia抗原的同源细胞及氨基酸的聚合物。
14.增加雌鸟产生之低胆固醇卵的数目的方法，包括给雌鸟投用有效量的包含α亚单位鸟抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质，从而使鸟产出更大数目的低胆固醇卵。
15.增加雌鸟之终生总产卵数的方法，包括给雌鸟投用有效量的包含α亚单位鸟抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的异源蛋白质，从而增加鸟的终生总产卵数。
16.包含α亚单位抑制素蛋白质或其片段及载体蛋白质的融合的异源蛋白质。
17.权利要求16的融合的异源蛋白质，其中抑制素蛋白质具有或包含实质上如SEQ ID NO：2所示的相同序列。
18.权利要求16的融合的异源蛋白质，其中抑制素蛋白质具有或包含实质上如SEQ ID NO：4所示的相同序列。
19.权利要求16的融合的异源蛋白质，其中载体蛋白质选自麦芽糖结合蛋白质、牛血清白蛋白、卵白蛋白、鞭毛蛋白、匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、γ球蛋白、同源细胞、携带Ia抗原的同源细胞及氨基酸的聚合物。
20.生产融合的异源蛋白质的方法，其包括以下步骤：
(a)提供编码α亚单位抑制素或其片段的双链cDNA；
(b)提供具有产生载体蛋白之编码信息的载体；
(c)将抑制素cDNA连接到载体中；
(d)将连接的载体插入表达系统中；以及
(e)表达包含抑制素蛋白质和载体蛋白质的融合的异源蛋白质。
21.权利要求20的方法，其中抑制素cDNA具有或含有实质上如SEQ ID NO：1所示的相同序列。
22.权利要求20的方法，其中抑制素cDNA具有或包含实质上如SEQ ID NO：3所示的相同序列。
23.权利要求20的方法，其中载体蛋白质选自麦芽糖结合蛋白质、牛血清白蛋白、卵白蛋白、鞭毛蛋白、匙孔 血蓝蛋白、血清白蛋白、γ球蛋白、同源细胞、携带Ia抗原的同源细胞及氨基酸的聚合物。
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