PL184202B1 - Nieterapeutyczny sposób zwiększania zdolności produkcyjnej ptaka, fuzyjne białko heterologiczne obejmujące białko ptasiej inhibiny oraz sposób wytwarzania fuzyjnego białka heterologicznego, gen fuzyjny, komórka gospodarza i wektor - Google Patents

Abstract

1 . N ieterap eu ty czn y sp o só b zw ie k sz a n ia zd olnosci p rodukcyjnej ptaka, z n a m ie n n y ty m , ze o b e jm u je p o d aw an ie p tak o w i sk u te c z n e j ilosci b ialk a h e te ro lo - giczn eg o o b ejm u jaceg o b ialk o ptasiej in hibiny, alb o je g o im m unogenny fragm ent, o raz b ialko n o sn ik o w e, p rzy czym b ialk o p tasiej in h ib in y a lb o je g o im m u n o - genny fragm ent ob ejm u je se k w e n c je o Id S ekw n r 2 alb o 4 22 F uzyjne b ialk o h e te ro lo g ic z n e o b ejm u jace b ialk o ptasiej m hibiny albo je g o im m u n o g en n y frag m en t, p o d d an y f u g i z b ialk iem n o sn ik o w y m , z n a m ie n - n e ty m , ze b ialk o p tasiej in h ib m y a lb o je g o im m u n o g en n y fragm ent o b ejm u je sek w en cje o Id S ek w n r 2 alb o 4 25 Sposób w y tw arzan ia fu zy jn e g o b ialk a h etero lo g iczn eg o , z n a m ie n n y ty m , ze o bejm uje n astep u jace etap y (a) do starczen ie d w u n icio w eg o c D N A k o d u jaceg o p tasia inhibine, albo je j frag m en t o Id S ekw n r 1 alb o Id S ek w n r 3, (b) do starczen ie w ek to ra k o d u jac e g o in fo rm acje d o produkcji bialk a nosn ik o w eg o , (c) h g acja cD N A ptasiej in h ib m y do w ek to ra, (d) w p ro w ad zan ie lig o w an e g o w ek to ra d o uk lad u ek sp resy jn eg o i (e) w y razan ie fu zy jn e g o b ialk a h etero lo g iczn eg o zaw ierajacego b ialko n o sn ik o w e i b ialk o ptasiej inhibiny o Id S ek w n r 2 a lb o Id S e k w n r 4 30 G en fu zy jn y , k o d u jacy gen d o ekspresji b ialk a in hibiny, a lbo je g o im m un o g en n eg o frag m en tu , p o d d an y fuzji z gen em k o d u jac y m e k sp re sje b ialk a n o s - nik o w eg o , p rzy czym w y razo n e b ialk o inhibiny a lb o jej im m unogenny frag m en t p o d d an y fuzji z bialk iem n o sn ik o w y m z w ie k sz a ilo sci zn o szo n y c h ja j, p rzy sp ie - sza rozpoczecie skladania ja j, p rzy sp ie sz a o stag n iecie m aksim um skladania ja j, zw iek sza lic z b e ja j sk lad an y ch w c iag u z y c ia , z w ie k sz a w y tw a rz a n ie ja j, zw iek sza w y d ajn o sc p ro d u k cji ja j, p rzed lu za trw an ie sk lad an ia ja j, przy sp iesza w y stap ien ie d o jrzalo sci albo p rzy sp iesza ro zp o c z e c ie o w u la c ji p o p o d an iu p tak o - wi skutecznej ilosci, p rzy czy m p ro d u k t o b ejm u je gen do ekspresji b ialka p tasiej inhibiny, a lb o je j im m u n o g en n eg o fra g m en tu , p o d d a n y fu zji z genem k o - du jacy m ek sp resje bialk a n o sn ik o w e g o , p rzy czym gen ko d u jacy ekspresje b ialk a ptasiej inhibm y a lb o je j im m u n o g en n y fra g m en t k o d u je b ialk o o b ejm u jace sek w en cje o Id S ekw n r 2 alb o Id S ek w n r 4 33 K om orka z aw iera ja c a w e k to r, k tóry ob ejm u je sek w en cje D N A k o d u jaca b ialk o in hibiny, a lb o je j im m u n o g en n y f ra g m en t, o raz b ialk o n o sn ik o w e, p rzy czym b ialko in h ib iny a lb o je j im m u n o g en n y fragm ent p oddany fuzji z bialkiem nosnikow ym zw ie k sz a ilosci zn o szo n y ch ja j, p rz y sp ie sz a ro zp o c z e c ie sk lad an ia ja j, p rzyspiesza osiag n iecie m ak sim u m sk la d a n ia ja j, zw iek sza licz b e ja j sk lad an y ch w ciagu zy cia, z w iek sza w y tw a rz a n ie ja j, z w ie k sz a w y d a jn o sc pro d u k cji ja j, p rzed lu za trw an ie s k la d a n ia ja j, p rzy sp iesza w y stap ien ie d ojrzalosci alb o p rzy sp ie sz a ro zp o czecie o w u lacji p o p o d an iu p tak o w i sk u teczn ej ilo sci, p rzy czy m b ialk o ptasiej in h ib in y a lb o je j im m u n o g en n y frag m en t m a sekw encje Id S ek w n r 2 albo Id S ek w n r 4 34 W ektor, k tó ry o b ejm u je sek w en cje D N A k o d u jac a bialko inhibiny, a lb o je j im m unogenny frag m en t, o raz b ialk o n o sn ik o w e , p rz y czym b ialk o ptasiej in - hib in y albo je g o im m u n o g en n y fra g m en t o b ejm u je sek w en cje o Id S ekw n r 2 alb o 4 1 po d d an e fuzji z b ialk iem n o sn ik o w y m z w ie k sz a ilo sci zn o szo n y ch ja j, p rzy sp iesza ro zp o czecie sk la d a n ia ja j, p rzy sp iesza o siag n iecie m aksim um sk la d a n ia ja j, zw iek sza lic z b e ja j sk lad an y ch w ciag u z y c ia , z w ie k sz a w y tw arzan ie ja j, zw iek sza w y d ajn o sc p ro d u k cji ja j, p rze d lu z a trw an ie sk lad an ia jaj, przy spiesza w y stap ien ie d ojrzalosci albo p rzy sp iesza ro zp o c z e c ie o w u la c ji p o p o d a n iu p tak o wi skutecznej ilosci, p rzy czy m p ro d u k t o b ejm u je gen d o e kspresji bialka inh ib in y , a lb o jej im m u n o g en n eg o frag m en tu , p o d d a n y f u g i z g en em k o d u jac y m e k s- p resje bialk a n o sn ik o w eg o PL

Description

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy, nieterapeutycznego sposobu zwiększania zdolności produkcyjnej ptaków przez przyspieszania dojrzewania u ptaków, szczególnie ratites i psittaciformes, przez podawanie heterologicznego białka zawierającego białko inhibinę, albo jej fragment, oraz białko nośnikowe. Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu zwiększania produkcji jaj przez zwierzęta, zwłaszcza ptaki, zaś szczególnie ratites, przez podawanie heterologicznego białka zawierającego białko inhibiny, albo jej fragmentu, oraz białko nośnikowe.

Niniejszy wynalazek dalej dotyczy heterologicznego białka zawierającego białko inhibiny, albojej fragment, oraz białko nośnikowe, jak również sposobu produkcji białka heterologicznego, w którym inhibina jest poddana fuzji albo konjugacji z białkiem nośnikowym.

Podstawa wynalazku

Ratites są nielotnymi, zasadniczo dużymi, biegającymi ptakami, obejmującymi kilka rzędów włączywszy takie gatunki jak strusie, emu, rhea, kazuary i kiwi. Emu (Dromiceius novaehollamiae) jest australijskim ratite, charakteryzującym się szczątkowymi skrzydłami i bezpiórą głową i szyją. Średnie dorosłe emu osiąga wzrost około 1,8 metra i wagę około 70 kilogramów. Struś (Struthio camelius) jest wielkim ptakiem biegającym o małych skrzydłach i grubych, silnych nogach. Standardowy dorosły struś osiąga wzrost około 2,4 metra i wagę około 157 do 170 kilogra mów. Określenie „rhea” jest wspólną nazwą dla członków ptasiego rzędu Rheiformes. Rheiformes są rzędem południowoamerykańskich ptaków biegających, zwanych amerykański184 202 mi strusiami, różniących się od strusi między innymi mniejszymi wymiarami, upierzoną głową i szyją oraz trójpalczastą stopą.

Struś i emu od dawna posiadająwartość handlową w ich naturalnych środowiskach, odpowiednio, Południowej Afryki i Australii. Na produkty strusi zapotrzebowanie sięga 100 lat wstecz i istnieje światowy rynek na ich skóry, mięso i pióra. Przykładowo skóra strusi używana jest do wyrobu butów, torebek, kurtek, aktówek, portfeli i wielu innych artykułów. Strusie pióra używane sąw modzie, kostiumach i jako miotełki do kurzu. Przykładowo, strusie pióra sprzedawane sąw Europie za około 60-1200 $ za kilogram. Strusie pióra uważane sąrównież za „magnesy kurzu” i stąd istnieje wysoki popyt na nie w przemyśle komputerowym i samochodowym w Stanach Zjednoczonych i z granicami.

W przeciwieństwie do powyższego, emu jest względnie nowy na rynku. Cenionyjest za te same produkty oraz dodatkowo za olej stosowany w przemyśle kosmetycznym. Olej emu, uzyskiwany z grubej warstwy podskórnego tłuszczu posiada właściwości głębokiego przenikania, co czyni ten olej użytecznym w kremach kosmetycznych, jak np. preparatach wygładzających zmarszczki. Ba dane sąrównież ewentualne zastosowania medyczne oleju z emu, takie jak leczenie reumatoidalnego zapalenia stawów. Typowe dorosłe emu osiąga wysokość 1,6 do 1,9 metra i wagę 30 do 45 kilogramów lub więcej. Emu dojrzewająw wieku około roku zaś osobniki przed i po okresie dojrzewania nie wykazują swoistych cech fenotypowych płci. Podobnie jak strusie, populacja emu w Stanach Zjednoczonych przeżywa wybuchowy wzrost w ciągu ostat nich kilku lat. W roku 1994 całkowita liczba emu w Stanach Zjednoczonych wynosiła 150000, z czego 15000 par rodzicielskich. Uważa się, że w roku 1995 liczba emu zwiększy się do 500000-750000, w tym 45000 par rodzicielskich.

Rysuje się rosnące zapotrzebowanie na produkty ratites w niektórych krajach, w tym Australii, Belgii, Izraelu, Kanadzie, Holandii, Namibii, Afryce Południowej i Zimbabwe. Nawiązując, w ciągu ostatnich kilku lat nastąpił wybuchowy wzrost na krajowym rynku strusi i emu, oraz w mniejszym stopniu rhea. W ostatnich pięciu latach liczba par rodzicielskich strusi i całkowita liczba tych ptaków wzrosła w Stanach Zjednoczonych, odpowiednio, 7,5- i 20-krotnie. Ocenia się, że w 1995 w Stanach Zjednoczonych będzie 200000 strusi z czego 20000 par rodzicielskich. Olbrzymie zainteresowanie hodowlą tych zwierząt spowodowane jest wysokąceną dorosłych, jak również niedojrzałych zwierząt, zwłaszcza zaś sprawdzonych par rodzicielskich, których wartość dochodzi do 75000$, zaś dla emu 30000$ i więcej. Niedojrzałe strusie w wieku trzech-czterech miesięcy wyceniane są na około 7500$, zaś niedojrzałe emu 5000$. Większość zwierząt nabywana jest w wieku trzech-sześciu miesięcy.

Dalej, istnieje olbrzymie zainteresowanie ratites jako alternatywą bardziej tradycyjnych form hodowli zwierzęcej. Kilka czynników dotyczących ratites czyni je lepszą alternatywąhodowli gospodarczej (jak bydło rzeźne, trzoda czy owce). Obejmują one: najwyższy wskaźnik przetwarzania paszy, dużą możliwość hodowli intensywnej, duże wymiary zwierzęcia, zwiększona zdolność rozrodu oraz niezwykła wartość odżywcza ich mięsa.

Przykładowo, mięso strusia, będące czerwonym mięsem przy pominającym wołowinę, zawiera znacznie mniej tłuszczu, kalorii i cholesterolu niż mięso kurczaka czy indyka. W szczególności, porcja mięsa strusia o wadze 85 gramów zawiera 2 gramy tłuszczu, 58 mg cholesterolu i 97 kalorii. W przeciwieństwie do powyższego, 85-gramowa porcja mięsa indyka zawiera 3 gramy tłuszczu, 59 mg cholesterolu i 135 kalorii. 86-gramowa porcja mięsa kurczaka zawiera 3 gramy tłuszczu, 73 mg cholesterolu i 140 kalorii. 85-gramowa porcja wołowiny (stek) zawiera 15 gramów tłuszczu, 77 mg cholesterolu i 240 kalorii. Na koniec, porcja wieprzowiny o wadze 85 gramów zawiera 19 gramów tłuszczu, 84 mg cholesterolu i 275 kalorii (wartości dla mięsa strusia uzyskano z AMSI Ouality Laboratory Report #0800100, zaś wartości dla innych mięs z U.S.D.A. Handbook No. 8, „Nutritive Value of Foods”). Podobnie jak strusie, mięso emu jest niskocholesterolowym czerwonym mięsem. W szczególności, 100-gramowa porcja mięsa emu zawiera 1,7 g tłuszczu, 57,5 mg cholesterolu i 109 kalorii (wartości dla mięsa emu uzyskano z Silliker Laboratories of Texas, Inc.).

184 202

Ratites, jak np. strusie dostarczająw wieku 12 miesięcy około 45 kilogramów mięsa a więc wytwarzają znaczną ilość mięsa we względnie krótkim czasie.

Przykładem wyższości hodowli ratites nad bardziej tradycyjnymi formami hodowli jest następujące porównanie strusi i krów. Po pierwsze, okres ciąży i inkubacji jaj u strusi wynosi 42 dni, podczas gdy u krów okres ciąży wynosi 280 dni. Po drugie, przeciętny struś daje 20 sztuk potomstwa w roku podczas gdy krowa tylkojedno. Po trzecie, wskaźnik przetwarzania paszy u strusi wynosi 2:1 podczas gdy u krów 5:1. Po czwarte, czas od poczęcia do uboju u strusi wynosi około 407 dni, zaś u krów 645. Na koniec, strusie oprócz mięsa i skóry dostarczają piór, podczas gdy krowy dostarczająjedynie mięsa i skór.

Wziąwszy pod uwagę te cechy, oraz rosnące zapotrzebowanie populacji światowej na mięso o dużej wartości a jednocześnie niskotłuszczowe i niskocholesterolowe, oraz które może być produkowane z możliwie najmniejszym ujemnym wpływem na środowisko, przemysł hodowli strusi posiada olbrzymi potencjał dalszego rozwoju.

Obecnie, zapotrzebowanie na ratites znacznie przewyższa podaż. Jednakże, hodowcy ograniczani są suboptymalnąprodukcjąjaj przez samice w wieku rozrodczym. Zależnie od gatunku, większość ratites w niewoli składa średnio 10-20 jaj rocznie podczas gdy ich potencjał genetyczny produkcji jaj oceniany jest na 60 jaj rocznie. Przykładowo, wysokorozrodczy struś żyjący na wolności może składać w sezonie rozrodczymjedno jajo co około 48 godzin zaś żyjące na wolności emu co około 72 godziny. W przeciwieństwie do powyższego, strusiowi w niewoli złożenie jaja zajmuje zwykle 5 do 10 dni, zaś emu 4 do 8 dni.

Rynek rzeźny nie rozwinie się dopóki nie będzie wytwarzana rocznie odpowiednia liczba potomstwa. Według pewnych ocen, aby utrzymać rynek rzeźny musi być dostępnych 250000 zwierząt rocznie. Stąd, sposób zwiększenia produkcji jaj spowodowałby znaczny wzrost rynku. Nawiązując, istnieje potrzeba kompozycji i sposobów zwiększenia produkcji jaj przez ptaki, zaś szczególnie ratites jak strusie i emu.

Istniej e również potrzeba kompozycj i i sposobów zwiększania produkcji jaj przez ptaki egzotyczne jak psittaciformes. Psittaciformes obejmująpapugi i są rzędem obejmującymjednąrodzinę ptaków wykazujących zygodaktylizm i posiadających silny, hakowaty dziób. Papugi określa się jako członków rodziny ptaków Psittacidae (pojedyncza rodzina Psittaciformes), rozróżniana po krótkim, silnym, hakowate zakrzywionym dziobie.

Ostatnio, hormon - inhibina, badany jest jako silny czynnik zwiększający owulację u ssaków. Inhibina jest hormonem peptydowym produkowanym w gonadach, zwłaszcza zaś w rosnących pęcherzykach. U ssaków, działa onjako regulator hamującej pętli zwrotnej wydzielania przysadkowego hormonu folikulostymuliny („FSH”), Mimo iż obecność inhibiny była postulowana już 60 lat temu, dopiero ostatnio udało się ją wyizolować.

Inhibiną ssaków jest dimerycznym hormonem peptydowym, zbudowanym z podjednostki a (ciężar cząsteczkowy 18000) i podjednostki β (ciężar cząsteczkowy 14000). Podjednostka α występuje wyłącznie w inhibinie, podczas gdy podjednostki β jak dimer tworzą aktywinę, hormon uwalniający FSH z przysadki. Podjednostka Pwystępuje w dwóch postaciach (β_Α i ββ), które sąpodobne, choć różne. Stąd, zależnie od postaci podjednostki β, inhibiną występuje w dwóch formach jako inhibina-A i inhibina-B. Obie podjednostki α i β, połączone wiązaniem siarczkowym, konieczne są do aktywności biologicznej przejawiającej się hamowaniem wydzielania z przysadki hormonu folikulostymuliny („FSH”). Sekwencja aminokwasowa podjednostki α inhibiny wykazuje około 80-90% podobieństwo międzygatunkowe u świni, wołu, człowieka, myszy i kurcząt. Doskonały przegląd wiedzy, dotyczący izolacji, wytwarzania, testów i działań biologicznych inhibmy znajduje się w Risbridger i in., Current Perspectives of Inhibin Biology, Acta Endocrinologica (Copenh). 122:763-682, (1990); i Rivier, C. i in., Studies of the Inhibin Family ofHormones: A Revew, Hormone Research 28:104-118 (1987), załączone tujako odnośniki.

U ssaków i ptaków FSH odgrywa rołę we wzroście i rozwoju pęcherzyka, podczas gdy hormon luteinizujący („H”, jak się uważa, wywołuje owulację. W kontroli uwalniania hormonu gonadotropowego oddziaływuje kilka czynników mózgowych i gonadalnych (peptydowych i sterydowych). Wśród tych czynników, hormon uwalniający gonadotropinę („GnRH” i inhibiną

184 202 wywierają przeciwne działania na wydzielanie FSH przez przysadkę ssaków. Hormon uwalniający gonądotropinę jest dekapeptydem mózgowym działającym pobudzająco na wydzielanie FSH i LH, podczas gdy inhibina jest białkiem gonadalnym, które prawdopodobnie selektywnie hamuje wydzielanie FSH u ssaków.

Podstawowa znajomość procesu owulacyjnego ptaków niezbędna jest do zrozumienia działania inhibiny w kontroli endokrynnej owulacji ptaków. Pęcherzyki rosnące na dojrzałym czynnościowo jajniku kury domowej występująw hierarchii różnic wielkości. Typowyjajnik zawiera cztery do sześciu dużych, dwu-cztero centymetrowej średnicy pęcherzyków, wypełnionych żółtkiem (FI do F4, F6), otoczonych większą liczbą mniejszych, dwu-dziesięcio milimetrowej średnicy pęcherzyków żółtych oraz licznych bardzo małych pęcherzyków białych. Największy pęcherzyk przedowulacyjny (FI) przeznaczony jest do owulacji następnego dnia, drugi co do wielkości (F2) kolejnego dnia (około 26 godzin później) itd. Kontrola rekrutacji pęcherzyków i organizacja tej hierarchii jest słabo poznana. Udział gonadotropiny przysadkowej została potwierdzona, pozostaje jednak niejasna rola inhibiny w kontroli wydzielania ptasiej gonadotropiny i kontroli owulacji.

Najnowszą strategią wywoływania hiperowulacji u gatunków ssaków jest opracowanie sposobów obejmujących neutralizację aktywności endogennej inhibiny. Przykładowo, badana jest aktywna immunizacja ssaków przeciwko różnym kompozycjom zawierającym inhibinę. Neutralizacja immunologiczna inhibiny związana była ze zwiększonym tempem owulacji u jałówek, owiec i szczurów.

Zwiększone tempo owulacji stwierdzone u ssaków szczepionych antygenowymi preparatami inhibinyjest, jak się uważa, wynikiem podwyższonego poziomu FSH w surowicy co prowadzi do przyspieszonego dojrzewania pęcherzyków jajnikowych. W badaniach wykazujących zwiększenie tempa owulacji u ssaków wykorzystywano liczne antygeny. Niektóre z badanych antygenów: uzyskane drogą rekombinacji DNA fragmenty podjednostki a inhibiny (Wrathall i in., Effects of active immunisation against a synthetic peptide seguence of the inhibin α-subunit on plasma gonadotropin concentration, ovulation rate and lambing rate in ewes, J. Reprod. Fert., 95:175-182,1992; i Meyer i in., Antiserum to an Alpha-Chain Peptide Neutralizes Inhibin Bioactivity and Increases Ovulation Rate in Sheep, Scientific Journal Series of the Minnesota Agric. Exp. Sta., paper No. 17,103, 1991), syntetyczne repliki peptydowe N-końcowej sekwencji podjednostki α wołowej inhibiny sprzęgnięte z owalbumina(Glencross i in., Effect ofactive immunisation of heifers against inhibin on plasma FSH concentrations, ovarian follicular development and ovulation rate, Journal of Endocrinology, 13411-18, 1992), syntetyczne peptydy o sekwencjach podjednostki α wołowej inhibiny sprzęgnięte z albuminą surowicy ludzkiej (Morris i in., Effect ofimmunization against synthetic peptide seguences ofbovine inhibin α-subunit on ovulation rate and twincalving rate in heifers, Journal ofReproduction and Fertility, 97:255-261, 1993) oraz częściowo oczyszczona inhibiną z wołowego płynu pęcherzykowego (Morris i in., Effect of Immunizing Prepuberal Lambs of Low and High Ovulation Rate Genotypes with Inhibin Partially Purified From bovine Follicular Fluid, Theriogenology, vol. 35 No. 2, 1991).

Mimo sprzecznych danych na to jak zmienia się poziom FSH w trakcie cyklu owulacyjnego, u wszystkich badanych ssaków neutralizacja immunologiczna endogennej inhibiny przyspiesza rozwój pęcherzyków jajnikowych oraz tempo owulacji, niezależnie od stosowanego antygenu czy badanego gatunku ssaków.

Jak stwierdzono powyżej, udział inhibiny w regulacji czynności reprodukcyjnych u gatunków ptasich pozostaje niejasny. Jak dotąd, opublikowane doniesienia ograniczają się do wpływu inhibiny na czynności reprodukcyjne drobiu domowego. Większość literatury wspiera teorię, że inhibiną raczej wywiera u drobiu równoległy fizjologiczny wpływ, jak opisany u ssaków: u kur, inhibiną może służyć jako regulator rekrutacji i/lub dojrzewania pęcherzyków. Jednakże, u ptaków udział inhibiny w kontroli tempa owulacji może, ale nie musi zachodzić przez hamowanie wydzielania przysadkowego FSH. Przykładowo, mimo iż u kur o małej produkcji jaj stwierdzono w surowicy oraz w warstwie komórek ziarnistych wyższy poziom inhibiny niż u kur o dużej produkcjijaj, nie stwierdzono różnic w poziomach FSH w surowicy w zależności od ilości produ8

184 202 kowanychjaj (Wang i in., Increase in Ovarian α-Inhibin Gene Expression and Plasma Immunoreactive Inhibm Level is Correlated with Decrease in Ovulation Rate in tne Domestic Hen, ' General and Comparative Endocrinology, 91,52-58(1993)). Tak więc, publikacja ta sugeruje, że u kur zależne od tempa owulacji zmiany w ekspresji genu podjednostki «.inhibiny i poziomu immunoreaktywnej inhibiny w surowicy nie wpływająbezpośrednio na tempo owulacji przez modulowanie poziomu FSH w surowicy. Ponadto, w pracy Johnson P. A., Inhibin in the Hen, Poultry Science, 72:955-958 (1993) z powodzeniem zastosowano układ RIA wołu do badania immunoreaktywnej inhibmy w osoczu kur, jednakże nie stwierdzono znaczącego szczytu immunoreaktywnej inhibiny w trakcie cyklu owulacyjnego mimo przedowulacyjnej fluktuacji LH.

Ostatnio, sklonowano i sekwencjonowano podjednostkę a kurzej inhibiny (Wang i Johnson, Complementary Deoxyribonucleic Acid Cloning and Seguence Analysis of the O-Subunit of Inhibin from Chicken Ovarian Granulosa Cells, Biology af Reproduction, 49, 1-6 (1993)), załączone tu w całości jako odnośnik. Porównanie sekwencji ptasiej inhibiny ze znanymi sekwencjami ssaczymi podjednostki a inhibiny, wykazało 86-89% homologię. Analiza metodąNorthem biot przy zastosowaniu dwóch izolowanych sond (cINA₆ i cINA₁₂) wykazało, że podjednostka α inhibiny ulega ekspresji w warstwie komórek ziarnistych jajnika kury ale nie w mózgu, nerkach, wątrobie czy śledzionie. Stąd, biologia inhibiny u ptaków pozostaje słabo wyjaśniona, zaś badania odpowiedzi ptaków na ekspozycję na antygenową inhibinę nie zostały podjęte czy obserwowane. W nawiązaniu, rynek ratites jest mocno ograniczony z powodu suboptymalnego tempa składaniajaj przez strusie, emu i rhea, co powoduje potrzebę kompozycji i sposobów zwiększania produkcji jaj przez te ptaki. Istnieje również potrzeba kompozycji i sposobów przy-pie-zania składaniajaj przez ptaki. Istnieje również zapotrzebowanie na kompozycje i sposoby zwiększania ilości składanych jaj przez ptaki w trakcie ich życia. Jest również, ciągła potrzeba szybkiego, prostego, wiarygodnego i ekonomicznego sposobu sprawdzenia czy ptak odpowiedział immunologicznie na ekspozycję na antygenowąkompozycję inhibiny. Ponadto, istnieje ciągła potrzeba szybkiego, prostego, wiarygodnego i ekonomicznego sposobu sprawdzenia czy ptak jest predysponowany hormonalnie do skladan łajaj w dużej czy małej ilości.

Potrzeba kompozycji i sposobów zwiększania produkcji jaj nie jest ograniczona do ptaków. Wciąż istnieje zapotrzebowanie na efektywną kompozycję i sposób zwiększania produkcji jaj przez wiele zwierząt. Przykładowo, wciąż istnieje zapotrzebowanie na efektywną kompozycję i sposób zwiększania produkcji jaj przez większość zwierząt hodowanych gospodarczo jak świnie, krowy, owce i kury. Wciąż istnieje również zapotrzebowanie na zwiększanie produkcji jaj przez zwierzęta futerkowe jak norki, lisy, fretki, wydry i szopy oraz ta sama potrzeba dla zwierząt, których futra używane są dla celów dekoracyjnych. Również, kompozycja i sposób zwiększania produkcji jaj jest użyteczny do zwiększania populacjiiicznych zwierzątjak gatunki egzotyczne czy zagrożone, aby zapobiec ich wyginięciu. Istnieje również dalej ciągła potrzeba zwiększania ilości produkowanychjaj u zwierząt używanych do wyścigów, występów czy przedstawień (zawodów) jak koni, psów, kotów, zwierząt ogrodów zoologicznych i cyrkowych. Jak wykazano przez zwiększone zapotrzebowanie na leczenie niepłodności ludzi, jest również potrzeba kompozycji i sposobów zwiększania owulacji u ludzi.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazkujest nieterapeutyczny sposób zwiększania zdolności produkcyjnej ptaka, obejmujący podawanie ptakowi skutecznej ilości białka heterologicznego według wynalazku obejmującego białko ptasiej inhibiny, albo jego immunogenny fragment, oraz białko nośnikowe, przy czym białko ptasiej inhibiny albo jego immunogenny fragment obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 2 albo 4. Ptak wybrany jest z grupy obejmującej strusiowate, papugowate, drapieżne, dzięciołowate, sowowate, kraskowate, ralliformes, wróblowate, kukułkowate, gołębiowate, kuraki, blaszkodziobe oraz herodiones. W szczególności, sposób można stosować u ptaków wybranych z grupy składającej się z kury domowej, indyka, papugi, papugi długoogonowej, makaw, sokoła, orła, przepiórki, jastrzębia, gołębia, kukułki, słowika, kakadu, sójki, szpaka, zięby, gajówki, skowronka i wróbla. Inhibina, albo jej fragment, może być inhibi:ną ptasią. Białko nośnikowe wybrane jest z grupy składającej się z białka wiążącego maltozę, albuminy su184 202 rowicy bydlęcej, owalbuminy, flagelliny, hemocyjaniny skałoczepa, albuminy surowicy, gammaglobuliny oraz polimerów aminokwasów. Najkorzystniejszym białkiem nośnikowym jest białko wiążące maltozę. Białko heterologiczne może być inhibinąskoniugowanąz białkiem nośnikowym albo inhibiną^ poddaną fuzji z białkiem nośnikowym. Sposób wytwarzania fuzyjnego białka heterologicznego obejmuje wprowadzenie cDNA kodującego ekspresję inhibiny, albo jej fragmentu, do wektora zawierającego informację dotyczącą wytwarzania białka nośnikowego. Po wprowadzeniu wektora do układu ekspresyjnego, fuzyjne białko heterologiczne ulega ekspresji w tym układzie. Najkorzystniej, białko heterologiczne obejmuje inhibinę kurzą. Korzystne działanie nieterapeutycznego sposobu zwiększania zdolności produkcyjnej ptaka polega na tym, że zwiększona jest ilość znoszonych jaj, przyspieszone jest rozpoczęcie składaniajaj, przyspieszonejest osiągnięcie maksimum składaniajaj, zwiększonajest liczbajaj składanych w ciągu życia, zwiększone jest wytwarzanie jaj, zwiększona jest wydajność produkcji jaj, przedłużone jest trwanie składaniajaj, przyspieszone jest wystąpię nie dojrzałości albo przyspieszone jest rozpoczęcie owulacji.

Przedmiotem wynalazkujest również gen fuzyjny, kodujący gen do ekspresji białka inhibiny, albo jego immunogennego fragmentu, poddany fuzji z genem kodującym ekspresję białka nośnikowego, przy czym wyrażane białko inhibiny albo jej immunogenny fragment poddany fuzji z białkiem nośnikowym zwiększa ilości znoszonych jaj, przyspiesza rozpoczęcie składania jaj, przyspiesza osiągnięcie maksimum składaniajaj, zwiększa liczbęjaj składanych w ciągu życia, zwiększa wytwarzanie jaj, zwiększa wydajność produkcji jaj, przedłuża trwanie składania jaj, przyspiesza wystąpienie dojrzałości albo przyspiesza rozpoczęcie owulacji po podaniu ptakowi skutecznej ilości, przy czym produkt obejmuje gen do ekspresji białka ptasiej inhibiny, albo jej immunogennego fragmentu, poddany fuzji z genem kodującym ekspresję białka nośnikowego, przy czym gen koduj ący ekspresję białka ptasiej inhibiny albojej immunogenny fragment koduje białko obejmujące sekwencję o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4.

Przedmiotem wynalazkujest również wektor, który obejmuje sekwencję DNA kodującą białko inhibiny, albo jej immunogenny fragment, oraz białko nośnikowe, przy czym białko ptasiej inhibiny albo jego immunogenny fragment obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 2 albo 4 i poddane fuzji z białkiem nośnikowym zwiększa ilości znoszonych jaj, przyspiesza rozpoczęcie składaaiająj, przyspiesza osiągnięcie maksimum składaniajaj, zwiększa liczbę jaj składanych w ciągu życia, zwiększa wytwarzanie jaj, zwiększa wydajność produkcji jaj, przedłuża trwanie składaniajaj, przyspiesza wystąpienie dojrzałości albo przyspiesza rozpoczęcie owulacji po podaniu ptakowi skutecznej ilości, przy czym produkt obejmuje gen do ekspresji białka inhibmy, albo jej immunogennego fragmentu, poddany fuzji z genem kodującym ekspresję białka nośnikowego.

Jeszcze innym przedmiotem wynalazkujest komórka zawierająca wektor, który obejmuje sekwencję DNA kodująca białko inhibiny, albo jej immunogenny fragment, oraz białko nośnikowe, przy czym białko inhibiny albo jej immunogenny fragment poddany fuzji z białkiem nośnikowym zwiększa ilości znoszonych jaj, przyspiesza rozpoczęcie składania jaj, przyspiesza osiągnięcie maksimum składaniajaj, zwiększa liczbęjaj składanych w ciągu życia, zwiększa wytwarzanie jaj, zwiększa wydajność produkcji jaj, przedłuża trwanie składamajaj, przyspiesza wystąpienie dojrzałości albo przyspiesza rozpoczęcie owulacji po podaniu ptakowi skutecznej ilości, przy czym białko ptasiej inhibiny albojej immunogenny fragment ma sekwencję Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4.

Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu zwiększania produkcji jaj u zwierząt przez podawanie heterologicznego białka według wynalazku zawierającego białko inhibiny, lub jego fragment, oraz białko nośnikowe. Sposób obejmuje podawanie efektywnej ilości białka zwierzęciu tak, że ulega zwiększeniu produkcjajaj przez to zwierzę. Korzystnie, u zwierzęcia występuje odpowiedź odpornościowa skierowana przeciwko białku. Bardziej korzystnie, odpowiedź odpornościowa, która pojawia się u zwierzęcia jest również skierowana przeciwko białku inhibiny wytwarzanemu przez to zwierzę (inhibiną endogenna). Sposób zwiększa produkcję jaj u samic zwierząt, które wytwarzają inhibinę, jak ptaki jak np. ratites.

184 202

W szczególności, sposób ten zwiększa produkcjęjaj u samic ratitesjak strusie, emu oraz rhea.

Wynalazek dotyczy również sposobu przyspieszania znoszenia jaj u samic ptaków, obejmujący etap podawania efektywnej ilości heterologicznego białka zawierającego podjednostkę a białka inhibiny, albo jego fragmentu, oraz białka nośnikowego samicy ptaka tak, że rozpoczęcie składaniajaj jest przyspieszone. Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu zwiększania liczby niskocholesterolowychjaj składanych przez samicę ptaka, obejmujący etap podawania efektywnej ilości heterologicznego białka zawierającego podjednostkę abiałka inhibiny, albo jego fragmentu, oraz białka nośnikowego samicy ptaka tak, że produkuje ona większą liczbę niskocholesterolowych jaj. Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu zwiększania całkowitej liczby jaj składanych przez samicę ptaka w ciągu życia, obejmujący etap podawania efektywnej ilości heterologicznego białka zawierającego podjednostkę a białka inhibiny, albo jego fragmentu, oraz białka nośnikowego samicy ptaka tak, że produkuje ona większą liczbę jaj składanych w ciągu życia.

W niniejszym wynalazku opisano również sposób wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko białku heterologicznemu. Ogólnie, sposób wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko białku heterologicznemu obejmuje podawanie efektywnej ilości heterologicznego białka zawierającego białko inhibmy, albo jego fragmentu, oraz białka nośnikowego zwierzęciu tak, by u zwierzęcia wystąpiła odpowiedź odpornościowa skierowana przeciwko temu białku. Następnie, pobiera się próbkę krwi zwierzęcia i izoluje się z surowicy przeciwciała skierowane przeciwko inhibinie. Przykładowo, przeciwciało izolowane jest z surowicy próbki krwi przez przepuszczenie tej surowicy przez kolumnę zawierającą efektywną ilość białka nośnikowego w celu oddzielenia przeciwciał od surowicy.

Dalej, w opisie wynalazku podano szybki, prosty, wiarygodny, ekonomiczny sposób określania czy zwierzę jest predysponowane hormonalnie do składaniajaj w dużej czy małej ilości. Sposób polega na oznaczaniu ilości inhibiny wytwarzanej przez zwierzę, co koreluje ze zdolnością do wytwarzania jaj przez zwierzę. Pokrótce opisując, sposób oznaczania ilości inhibiny we krwi zwierzęcia obejmuje pobranie próbki krwi od zwierzęcia i doprowadzenie do kontaktu próbki krwi z przeciwciałami przeciwko inhibinie, skierowanymi swoiście przeciwko endogennej inhibinie zwierzęcia. Próbka krwi poddanajest kontaktowi z przeciwciałami przeciwko inhibinie w warunkach umożliwiających przeciwciałom swoiste oddziaływanie z inhibiną znajdującą się w próbce. Następnie, niezwiązane przeciwciała są usuwane i oznaczana jest ilość przeciwciał związanych.

W niniejszym wynalazku opisano również szybki, prosty, wiarygodny, ekonomiczny sposób określania czy zwierzę odpowiedziało immunologicznie na ekspozycję na kompozycję inhibiny. Pokrótce opisując, sposób polega na wiązaniu inhibiny albo białka heterologicznego według niniejszego wynalazku, na podłożu stałym, oraz doprowadzenie do kontaktu unieruchomionej inhibiny z próbką krwi od badanego zwierzęcia. Próbka jest poddana kontaktowi z unieruchomioną inhibiną w warunkach, w których inhibiną oddziaływuje swoiście z przeciwciałami przeciwko inhibinie znajdującymi się w próbce. Po usunięciu niezwiązanych przeciwciał z próbki, dodaje się pewną ilość znakowanych przeciwciał od drugiego zwierzęcia, które zostały wywołane przeciwko klasie przeciwciał pierwszego zwierzęcia. Znakowane przeciwciała, skierowane przeciwko przeciwciałom zwierzęcia odziaływują swoiście z przeciwciałami związanymi z unieruchomioną inhibiną. Po usunięciu nadmiaru przeciwciał obecność lub ilość znakowanych przeciwciał związanych określana jest przez uwidocznienie znacznika. Tak więc, sposób wykrywa obecność i ilość przeciwciał skierowanych przeciwko inhibinie u zwierzęcia i w ten sposób określa czy zwierzę odpowiedziało immunologicznie na podawanie kompozycji zawierającej inhibinę.

Nawiązując, w niniejszym wynalazku opisano również kompozycję inhibiny, wywołującą odpowiedź odpornościową u zwierzęcia po podaniu jej zwierzęciu.

Jednym z celów niniejszego wynalazku jest dostarczenie białka heterologicznego zawierającego białko inhibiny, albo jego fragment oraz białko nośnikowe. Również w mniejszym wy184 202 nalazku opisano kompozycję zawierającą fuzyjne białko heterologiczne zawierające inhibinę albo jej fragment.

Jeszcze innym celem niniejszego wynalazkujest dostarczenie sposobu wytwarzania białka heterologicznego, w którym jedno z białek jest białkiem inhibiny lub jego fragmentem.

Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania fuzyjnego białka heterologicznego, w którym jedno z białek jest białkiem inhibiny lub jego fragmentem.

Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania białka heterologicznego zawierającego białko inhibiny, albo jego fragment oraz białko nośnikowe.

Jeszcze innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu przyspieszania składania jaj (dojrzewania) u ptaków.

Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu przyspieszania składania jaj (dojrzewania) u ratites jak strusie i emu.

Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu przyspieszania składania jaj (dojrzewania) u Psittaciformes.

Jeszcze dalszym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu zwiększania całkowitej liczby jaj składanych przez ptaka w ciągu życia.

Innym celem niniejszego wynalazkujewt dostarczenie sposobu ograniczania lub eliminacji konieczności przepierzania ptaków składających jaja.

Jeszcze innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wywoływania u ptaków składaniajaj zawierających mniejsze ilości cholesterolu niż normalnie spotykane w jajach składanych przez ptaki tego samego gatunku.

Innym celem niniejszego wynalazkujest dostarczenie sposobu zwiększania tempa wytwarzania jaj u zwierząt.

Jeszcze innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu zwiększania tempa wytwarzania jaj przez ptaki.

Jeszcze innym celem niniejszego wynalazkujest dostarczenie sposobu zwiększania tempa wytwarzania jaj przez ratites jak np. strusie i emu.

Jeszcze innym celem niniejszego wynalazkujest dostarczenie sposobu zwiększania tempa wytwarzania jaj przez kurczęta.

Oprócz tego, w niniejszym wynalazku opisano szybki, prosty, wiarygodny, i ekonomiczny sposób sprawdzenia czy ptak odpowiedział immunologicznie na ekspozycję na antygenową kompozycję inhibiny zawierającej białko inhibiny albo jej fragment.

Ponadto, niniejszym wynalazku opisano szybki, prosty, wiarygodny, i ekonomiczny sposób sprawdzenia czy zwierzę jest predysponowane hormonalnie do wytwarzania jaj w dużej czy małej ilości.

Oprócz tego, w niniejszym wynalazku opisano szybki, prosty, wiarygodny, i ekonomiczny sposób sprawdzenia czy ptakjest predysponowany hormonalnie do wytwarzaniajaj w dużej czy małej ilości. Również opisano sposób wytwarzania przeciwciał przeciwko inhibinie lub jej fragmentowi.

Ponadto, w niniejszym wynalazku opisano sposób wytwarzania przeciwciał przeciwko białku heterologicznemu zawierającemu inhibinę lub jej fragment. Opisano również w niniejszym wynalazku sposób dokładnego określania ilości inhibiny obecnej w próbce krwi.

Ponadto opisano kompozycję zawierającą przeciwciała skierowane przeciwko przeciwciałom innego zwierzęcia oraz sposób wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko przeciwciałom innego zwierzęcia. Te i inne cele, cechy i zalety niniejszego wynalazku staną się jasne po przejrzeniu poniższego szczegółowego opisu wyjawionych wykonań i dołączonych zastrzeżeń.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia żel SDS-PAGE, w którym A oznacza przeciwciała strusie przeciwko kurzej inhibinie-białku wiążącemu maltozę, B oznacza standard wektora pMAL™-c, C oznacza białkowy standard ciężaru cząsteczkowego, D oznacza rzeczywisty wektor pMAL™-c zastosowany w wykonaniu fuzyjnego białka heterologicznego, E oznacza oczyszczone fuzyjne białko kurzej inhibiny-białka wiążącego maltozę (białko heterologiczne) według niniejszego wynalaz12

184 202 ku zaś F oznacza eluent służący do oczyszczania, którego nie nałożono na żel wraz z białkiem heterologicznym.

Figura 2 pokazuje wpływ neutralizacji immunologicznej podjednostki α inhibiny, na parametr dziennego skladaniajaj przez stado („HDEP”) u przepiórki japońskiej, przy zastosowaniu fuzji białka wiążącego maltozę z białkiem kodowanym przez cINA5₁₅. Bardziej szczegółowo figura 2 jest graficznym przedstawieniem danych z tabeli 2 w przykładzie 8.

Figura 3 pokazuje wpływ neutralizacji immunologicznej podjednostki α inhibiny, na parametr dziennego skladaniajaj przez stado („HDEP”) u przepiórki japońskiej, przy zastosowaniu fuzji białka wiążącego maltozę z białkiem kodowanym przez cINA515, gdy podawano tylko dwa rodzaje działania: kontrola i immunizacja inhibiną. Bardziej szczegółowo figura 3 jest graficznym przedstawieniem danych z tabeli 3 w przykładzie 8. Szczegółowy opis określenia „ptak” i „drób” w znaczeniu tu użytym, oznaczają zwierzę, członka klasy Aves, charakteryzującego się tym, że jest to ciepłokrwisty, składający jaja kręgowiec pierwotnie za adaptowany do latania. Określenie „ratites”, w znaczeniu tu użytym, zdefiniowane jest jako grupa nielotnych, w większości dużych, biegających ptaków składająca się z kilku rzędów i obejmująca emu, strusie, kiwi i kazuary. Określenie „Psittaciformes”, w znaczeniu tu użytym, obejmuje papugi i oznacza rząd obejmujący jedną rodzinę ptaków wykazujących zygodaktylizm i posiadających silny, hakowaty dziób. „Papuga” oznacza członka ptasiej rodziny Psittacidae (pojedynczej rodziny Psittaciformes), charakteryzującej się krótkim, mocnym, silnie zagiętym dziobem.

Określenie ,jajo” w znaczeniu tu użytym oznacza wielką żeńską komórkę rozrodczą zamkniętą w porowatej, wapiennej albo skórzastej skorupie, wytwarzaną przez ptaki i gady. „Wytwarzanie jaj przez ptaka lub gada” w znaczeniu tu użytym oznacza akt składaniajaja przez ptaka, albo „owipozycję”. „Ovum” określonejestjako gameta żeńska, znana równieżjakjaja. Stąd, wytwarzanie jaj u wszystkich zwierząt innych niż ptaki czy gady, w znaczeniu tu użytym, określone jest jako wytwarzanie i uwalnianie ovum z jajnika albo „owulacja”,, Nawiązując, należy rozumieć, że określenie Jajo” w znaczeniu tu użytym oznacza wielką żeńską komórkę rozrodczą zamkniętą w porowatej, wapiennej albo skórzastej skorupie, gdy jest wytwarzana przez ptaki i gadym, albo jest ovum, gdy jest wytwarzana przez inne zwierzęta.

Określenie „składanie jaj” oraz „dojrzałość”, w odniesieniu do ptakówjest tu używane zamiennie i oznacza moment kiedy ptak składa swoje pierwsze jajo. Nawiązując, „przyspieszanie” składamajaj albo dojrzewania u ptaków, w znaczeniu tu użytym oznacza wywołanie wcześniejszego złożenia pierwszego jaja niż by to miało miejsce normalnie.

Powinno być zrozumiałe, że sposób „obniżaniapoziomu cholesterolu” jaja, w znaczeniu tu użytym oznacza sposób wywoływania złożenia przez ptakajednego lub więcej jaj posiadających niższązawartość cholesterolu niż przeciętna zawartość wjaju zniesionym przez ptaka tego samego gatunku.

Określenie „całkowita liczba jaj złożonych w ciągu życia” ptaka oznacza całkowitą liczbę jaj złożonych przez ptaka w ciągujego życia. Określenie „dzienne składaniejaj przez stado” albo „HDEP” oznacza liczbę jaj zniesionych przez pewną grupę kur w ciągu dnia.

W przeciwieństwie do określenia ptak czy drób, określenie „ssak”, w znaczeniu tu użytym, oznacza członka klasy „Mammalia” która jest wielką klasą ciepłokrwistych kręgowców obejmującą zwierzęta posiadające gruczoły mlekowe, ciało pokryte włosami, trzy kostki słuchowe w uchu środkowym, mięśniową przeponę oddzielającąjamę otrzewną od jamy opłucnej, erytrocyty bez jąder i ich rozwój embrionalny odbywa się w jamie omoczni i owodni.

Określenie „gad” w znaczeniu tu użytym oznacza członka klasy ,R.eptilia“, którajest klasą ziemnych kręgowców nie posiadających włosów, piór oraz gruczołów mlekowych, których skóra pokryta jest łuską, oraz które posiadają trójkomorowe serce a ich jamy otrzewna i opłucna są połączone.

Białko heterologiczne, w znaczeniu tu użytym oznacza białko zawierające białko inhibiny albo jego fragment oraz białko nośnikowe. Powinno być zrozumiałe, że określenie „inhibiną” oraz „fragment inhibiny” jest używane zamiennie w kompozycji białka heterologicznego, sposo184 202 bach wytwarzania białka heterologicznego oraz sposobach zastosowania białka heterologicznego według niniejszego wynalazku.

Powinno być również zrozumiałe, że „cINA₅,5” w znaczeniu tu użytym oznacza sekwencję o długości 515 par zasad (Identyfikator Sekw. Nr 1) albo sekwencję o długości 516 par zasad (Identyfikator Sekw. Nr 3) albo oznacza odpowiednią sekwencję cINA_5L5 podaną na stronie 3 (począwszy od pary zasad o numerze 790 i zakończywszy na parze zasad o numerze 1310), Wang i Johnson, Complementary Deoxyribonucleic Acid Cloning and Sequence Analysis of the α-Subunit of Inhibin from Chicken Ovarian Granulosa Cells, Biology of Reproduction, 49, 1-6 (1993), załączone tu w całości jako odnośnik, uzyskane z genomowego DNA kurczęcia. cINA₅₁5 koduje część podjednostki a inhibiny strusia, jak Identyfikator Sekw. Nr 2 albo Identyfikator Sekw. Nr 4. W znaczeniu tu użytym „MB P-cINA₅₁₅” jest konjugatem białkowym ulegającym ekspresji w rekombinowanych komórkach gospodarza, po klonowaniu cINA515 do rekombinowanej komórki gospodarza i ekspresjonowaniu fuzyjnego białka heterologicznego zawierającego białko wiążące maltozę („MBP”) oraz fragment podjednostki a inhibiny kodowany przez cINA515. Nawiązując, „cINA^” oznacza sekwencję nukleotydową zaś „mBP-cINA515” oznacza fuzyjne białko heterologiczne.

Fuzyjne białko heterologiczne, w znaczeniu tu użytym oznacza białko zawierające białko inhibiny, łub jego fragment oraz białko nośnikowe. Fuzyjne białko heterologiczne ulega ekspresji w układzie ekspresyjnym zawierającym fuzyjny produkt genowy, kodujący ekspresję białka inhibiny, lub jego fragment, poddane fuzji z genem kodującym ekspresję białka nośnikowego. „Fuzyjny produkt genowy” w znaczeniu tu użytym oznacza produkt powstały na skutek fuzji genu kodującego ekspresję białka inhibiny, lub jego fragmentu, oraz genu kodującego ekspresję białka nośnikowego.

Skoniugowane białko heterologiczne, w znaczeniu tu użytym oznacza białko zawierające białko inhibiny, albo jego fragment, skoniugowane z białkiem nośnikowym. Skoniugowane białko heterologiczne wytwarzane jest w reakcji chemicznej wiążącej białko inhibiny z białkiem nośnikowym przez wiązanie kowalencyjne.

Odpowiedź odpornościowa zwierzęcia na substancję podaną zwierzęciu, w znaczeniu tu użytym oznacza odpowiedź zależną od komórek i/lub humoralną zwierzęcia, która jest swoista w stosunku do substancji.

Określenie „swoiście oddziaływuje” w znaczeniu tu użytym oznacza jako wiązanie się dwóch obiektów ze sobą przez wiązanie kowalencyjne, niekowalencyjne, elektrostatyczne, oddziaływanie typu receptor-ligand, oddziaływanie typu enzym-substrat albo inne wiązanie czy przyłączanie Połączenie jest wybiórcze tak, że obiekty oddziaływaaąw sposób swoisty, w swoistej pozycji i tylko ze sobą.

W wynalazku opisuje się ogólnie kompozycje zastosowane w sposobie przyspieszania składaniajaj przez ptaki. Kompozycja zawiera białko heterologiczne zawierające białko inhibiny, albo jego fragment oraz białko nośnikowe. Inhibina może być inhibiną z dowolnego gatunku zwierząt wytwarzających inhibinę. Inhibiną obejmuje, choć nie jest ograniczona do, między innymi, inhibiny ptaka, inhibiny ssaka, inhibiny gada, inhibiny płaza czy inhibiny ryb. W szczególności, inhibiną ssaka może być wybrana spośród, choć nieograniczona do inhibiny krowiej, inhibiny ludzkiej, inhibiny końskiej, inhibiny kociej, inhibiny psiej, inhibiny owczej, inhibiny norki, inhibiny wydry, inhibiny fretki, inhibiny szopa oraz inhibiny świńskiej. Ptasia inhibiną może być wybrana spośród, choć nie ograniczona do inhibiny strusiej, inhibiny emu, inhibiny rhea, inhibmy kazuara, inhibiny kiwi, inhibiny indyczej, inhibmy przepiórczej, inhibiny kurzej oraz inhibiny członków rzędu psittaciformes. Korzystną inhibiną jest inhibiną ptasia. Bardziej korzystna jest inhibiną ratites. Szczególnie korzystną inhibiną jest inhibiną strusia. Inną korzystną inhibiną jest inhibiną emu. Jeszcze inną korzystną inhibiną jest inhibiną rhea. Kolejną korzystną inhibinąjest inhibiną kurza. Najkorzystniej, białko heterologiczne według wynalazku zawiera białko podjednostki a inhibiny, albo jego fragment oraz białko nośnikowe.

Białko heterologiczne według niniejszego wynalazku, zawierające białko inhibiny, albo jego fragment oraz białko nośnikowe jest stosowane w sposobie zwiększania całkowitej liczby

184 202 jaj złożonej w ciągu życia ptaka. Kompozycj aj est również stosowana w sposobie zwiększania tempa wytwarzania jaj przez zwierzęta. Kompozycja jest dalej stosowana w sposobie zmniejszania zawartości cholesterolu wjajach składanych przez ptaki. Kompozycja ta jest również stosowana w sposobie ograniczania lub eliminacji konieczności przepierzania ptaków składających jaja. Sposoby te oraz sposoby przyspieszania składaniajaj u ptaków będą szczegółowo dyskutowane poniżej.

Inhibina, albo jej fragment, mogą być izolowane z płynów zwierząt, ekspresjonowane w zmienionych genetycznie komórkach w układach ekspresyjnych albo produkowane syntetycznie w ciągu reakcji chemicznych. Bardziej szczegółowo, fragment inhibiny może być wybrany spośród, choć nie ograniczony do następujących kompozycji: podjednostka α inhibiny; podjednostka β inhibiny; fragment podjednostki aalbo β inhibiny uzyskany drogą rekombinacji DNA; syntetyczne repliki peptydowe fragmentów podjednostki aalbo β inhibiny; fragmenty częściowo oczyszczonej inhibmy z płynu pęcherzykowego oraz fragmenty endogennej podjednostki aalbo podjednostki β inhibiny. Jak to stwierdzono powyżej, najkorzystniejsze jest by fragment inhibiny był podjednostka alfa (a) inhibiny albo jej fragmentem.

Inhibina w białku heterologicznym jest poddana fuzji bądź skonjugowana z białkiem nośnikowym jak to opisano poniżej. Gdy inhibina jest poddana fuzji z białkiem nośnikowym, białko heterologiczne jest „fuzyjnym białkiem heterologicznym”. Gdy inhibina jest skonjugowana z białkiem nośnikowym, białko heterologiczne jest „konjugowanym białkiem heterologicznym”. Korzystnym białkiem heterologicznym jest fuzyjne białko heterologiczne.

Rodzaj białka nośnikowego niejest kluczowym aspektem niniejszego wynalazku. Każde białko nośnikowe znane w dziedzinie wiedzy może być zastosowane w białku heterologicznym Białko nośnikowe, które może być zastosowane może być wybrane spośród grupy składającej się z białka wiążącego maltozę „MBP”; albuminy surowicy wołowej; flagelliny; hemocyjaniny skałoczepa „KLH”; owalbuminy; albuminy surowicy dowolnego gatunku; gammaglobuliny dowolnego gatunku; komórek syngenicznych; komórek syngenicznych posiadających antygeny la oraz polimerów D- i/lub L-aminokwasów. Korzystnym białkiem nośnikowym jest MBP. Innym korzystnym białkiem nośnikowym jest BSA, o ile białko heterologiczne nie będzie podawane krowie łub koniowi. Jeszcze innym korzystnym białkiem nośnikowym jest owalbumina jeżeli białko heterologiczne nie będzie podawane ptakowi. Najkorzystniejszym białkiem nośnikowym jest MBP. Jest korzystne by białko nośnikowe było immunogenne dla zwierzęcia, któremu będzie podawane.

Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania konjugowanego białka heterologicznego według wynalazku. Sposoby wytwarzania białek konjugowanych są dobrze znane w dziedzinie wiedzy. Sposoby konjugacji białek z białkami są wyczerpująco opisane w Antibodies, A Laboratory Manul, wyd. Ed Harlow i David Lane, Cold Spring Harbor Lab (1988), załączony tu jako odnośnik.

Jakkolwiek skonjugowane białka mogąbyć zastosowane w sposobach według wynalazku, korzystniejsze sąbiałka fuzyjne. W szczególności, białka heterologiczne poddane fuzji dająbardziej homogenny produkt, w którym różne segmenty białka są zawsze sfuzowane w tym samym położeniu i w tych samych ilościach. Również, fuzyjne białka heterologiczne mogąbyć produkowane jednolicie, niedrogo i w dużych ilościach. W przeciwieństwie, konjugowane białka heterologiczne nie sątak jednolite jak białka fuzyjne. Przykładowo, w zależności od białka, które ma być konjugowane, reakcja konjugacji może dać mieszaninę białek o jednej lub wielu konjugatach, białek konjugowanych w różnych położeniach i białek które nie uległy konjugacji.

Ponadto, niektóre z konjugacji mogą uczynić białko heterologiczne sterycznie uszkodzone i niemożliwe do jego zastosowania (np. część immunogenna białka zostanie sterycznie uszkodzona). Również, warunki i odczynniki reakcji konjugacji mogą degradować wytworzo ne białko. Przykładowo, glutaraldehyd powszechnie używany w reakcjach konjugacji modyfikuje konformację białek. Dalej, konjugowane białka są droższe w produkcji w dużych ilościach niż białka fuzyjne.

184 202

Wynalazek dotyczy dalej sposobu wytwarzania fuzyjnego białka heterologicznego. Fuzyjne białko heterologiczne ulega ekspresji jako produkt genu fuzyjnego, zawierającego gen kodujący ekspresję białka inhibiny, lub jego fragment oraz gen kodujący ekspresję białka nośnikowego. Produkt genu fuzyjnego oraz sposób tworzenia produktu genu fuzyjnego opisano poniżej. Pokrótce opisując, sposób produkcji fuzyjnego białka heterologicznego według niniejszego wynalazku obejmuje etapy wprowadzania produktu genu fuzyjnego do regionu kodującego plazmidu, transfekowane komórki gospodarza plazmidem i ekspresjonowanie fuzyjnego białka heterologicznego w komórce gospodarza sposobami dobrze znanymi w dziedzinie wiedzy.

Znanych w dziedzinie wiedzy jest wiele sposobów tworzenia fuzyjnych białek heterologicznych. Stąd, każdy sposób znany w dziedzinie wiedzy może być wykorzystany w produkcji fuzyjnego białka heterologicznego według wynalazku. Przykładem dostępnego w handlu zestawu wektora i układu ekspresyjnego jest pMAL™-c f-my New England Biolabs, Beverly Massachusetts. W układzie pMAL™-c zachodzi ekspresja cytoplazmatyczna fuzyjnego białka heterologicznego. Sposób tworzenia fuzyjnego białka heterologicznego według wynalazku przy użyciu zestawu pMAL™-c opisano w pełni w przykładach 1 i 2. Inne źródła zestawów wektorów i układów ekspresyjnych, które mogą być zastosowane w wytwarzaniu białka fuzyjnego według wynalazku obejmują, choć nie są ograniczone do: Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey i Clontech, Palo Alto, California.

Niniejszy wynalazek dalej dotyczy produktu genu fuzyjnego zawierającego gen kodujący ekspresję białka inhibiny, albo jego fragmentu oraz gen kodujący ekspresję białka nośnikowego. Gen inhibiny może być genem inhibiny ptaka. Gen ptasiej inhibiny może być wybrany spośród, choć nie ograniczony do genu inhibiny strusiej, genu inhibiny emu, genu inhibiny rhea, genu inhibiny kazuara, genu inhibiny kiwi, genu inhibiny indyczej, genu inhibiny przepiórczej, genu inhibiny kurzej, genu inhibiny członków rzędu psittaciformes, genu inhibiny któregokolwiek z falconiformes, genu inhibiny któregokolwiek z piciformes, genu inhibiny któregokolwiek z strigiformes, genu inhibiny któregokolwiek z coraciformes, genu inhibmy któregokolwiek z railiformes, genu inhibiny któregokolwiek z passeriformes, genu inhibiny któregokolwiek z cuculiformes, genu inhibiny któregokolwiek z columbiformes, genu inhibiny któregokolwiek z galliformes (drób domowy), genu inhibiny któregokolwiek z anseriformes (gęsi, kaczki, inny drób wodny), genu inhibiny któregokolwiek z herodiones oraz genu inhibiny któregokolwiek następujących ptaków: sokoła, orła, jastrzębia, gołębia, papugi długoogonowej, kakadu, makaw, papugi i takich ptaków jak słowik, sójka, szpak, zięba, skowronek i wróbel. Korzystnym genem inhibinyjest gen inhibmy ratites. Szczególnie korzystnym genem inhibiny jest gen inhibiny strusia. Innym korzystnym genem inhibinyjest gen, inhibiny emu. Jeszcze innym korzystnym genem inhibinyjest gen inhibiny rhea. Kolejnym korzystnym genem inhibinyjest gen inhibiny kurzej.

Klon cDNA podjednostki α kurzej inhibiny (cINA6; Wang i Johnson, Complementary Deoxyribonucleic Acid Cloning and Sequence Analysis of the α-Subunit of Inhibin from Chicken Ovarian Granulosa Cells, Biology afReproduction, 49,1-6(1993)), wprowadzony do w miejsce EcoRI plazmidu pBluescript (Stratagene, La Joli, CA) uzyskano dzięki uprzejmości P. A. Johnsona (Cornell University). Klon cINA6 hybrydyzował swoiście ze strusim genomowym DNA w badaniu metodą Southern biot, wskazując na znaczną homologię między oboma gatunkami (Choulienko i in., Expression and purification of chicken α-inhibin as fusion protein with E.coli maltose binding protein, Poultry Science, 73 (suppl. 1):84, 1994). Fragment DNA („CINA₅₁5”) wycięto z klonu cINA6 przy zastosowaniu trawienia Pstl. Fragment DNA cINA₅₁5 obejmował większość dojrzałej podjednostki a kurzej inhibiny.

Sekwencję podjednostki a strasiej inhibiny uzyskano metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), dobrze znanej w dziedzinie wiedzy. Konkretnie, w oparciu o sekwencję opisaną przez Wanga, opracowano następujące startery i zastosowano je w reakcji PCR z użyciem strusiego DNA: 5 '-TCTTTCGAGGAGCTGGGCTGG-3 ’; i 3 ’-GGGCCGTGG TACGCGAG TGACGCA-5'. Porównano prawie 75% sekwencji DNA klonu cINA₅1₅ z genomowym DNA strusia. Jak dotąd obserwowano 100% homologię pomiędzy strusim i kurzym DNA.

184 202

Jak stwierdzono powyżej, musi być zrozumiałe, że białko nośnikowe nie jest kluczowym aspektem niniejszego wynalazku. Stąd, w niniejszym wynalazku może być użyty gen kodujący ekspresję dowolnego białka nośnikowego. Gen białka nośnikowego, który może być zastosowany może być wybrany spośród grupy genów składającej się z genów kodujących ekspresję białka wiążącego maltozę „MBP”; albuminy surowicy wołowej; flagelliny; hemocyjaniny skałoczepa „KLH”; owalbuminy; albuminy surowicy dowolnego gatunku; gammaglobuliny dowolnego gatunku; komórek syngenicznych; komórek syngenicznych posiadających antygeny la oraz polimerów D- i/lub L-aminokwasów. Korzystnym genem kodującym białko nośnikowe jest gen kodujący ekspresję MBP. Innym korzystnym genem kodującym ekspresję białka nośnikowego jest gen kodujący ekspresję BSA, o ile powstałe białko heterologiczne nie będzie podawane krowie lub koniowi. Jeszcze innym korzystnym genem ekspresjonującym białko nośnikowejest gen kodujący ekspresję owalbuminy jeżeli powstałe białko heterologiczne nie będzie podawane ptakowi. Najkorzystniejszym genem kodującym białko nośnikowe jest gen kodujący ekspresję MBP. Korzystne geny białka nośnikowego kodująbiałka, które zwiększą zarówno natężenie jak i czas trwania odpowiedzi odpornościowej gospodarza na białko inhibiny.

Niniejszy wynalazek dalej dotyczy sposobu tworzenia produktu genu fuzyjnego, obejmującego etap fuzji genu kodującego ekspresję białka inhibiny, albojego fragmentu z genem kodującym ekspresję białka nośnikowego. Opisując w skrócie, sposób tworzenia genu fuzyjnego według niniejszego wynalazku obejmuje etapy izolacji pożądanego komplementarnego DNA inhibiny (cDNA), tworzenia dwuniciowego DNA inhibiny, uzyskanie dwuniciowego DNA białka nośnikowego i poddanie fuzji dwuniciowego DNA inhibiny z dwuniciowym DNA białka nośnikowego w taki sposób by fuzyjny DNA umożliwiał ekspresję fuzyjnego białka heterologicznego zawierającego białko inhibiny, albo jego fragment oraz białko nośnikowe .

Znanych jest wiele sposobów izolowania genów i tworzenia produktów genów fuzyjnych. Patrz, przykładowo, Sambrook, Fritsch i Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, vol. I, II i III.

Tak więc, każdy sposób znany w dziedzinie wiedzy może być zastosowany w celu wytworzenia produktu genu fuzyjnego według wynalazku. Wiele dostępnych w handlu zestawów wektorów może być zastosowanych w celu wytworzenia produktu genu fuzyjnego według wynalazku. Przykładem dostępnego w handlu zestawu wektora jest pMAL™-c f-my New England Biolabs, Beverly Massachusetts. Sposób tworzenia produktu genu fuzyjnego według wynalazku przy użyciu zestawu pMAL™-c opisano w pełni w przykładzie 1. Inne źródła zestawów wektorów, które mogą być zastosowane w wytwarzaniu produktu genu fuzyjnego według wynalazku obejmują, choć nie są ograniczone do: Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey i Clontech, Palo Alto, California.

Jak to stwierdzono wyżej, klon cDNA podjednostki a kurzej inhibiny (cINA6) wprowadzony w miejsce EcoRI pBluescript uzyskano jako dar od P. A. Johnsona (Cornell University). Fragment DNA („cINA₅ ^) wycięto z klonu cINA6 przy zastosowaniu trawienia Pstl. Fragment ten wklonowano do plazmidu p-MAL™-c wjednej ramce odczytu z białkiem wiążącym maltozę („MBP”), po czym białko fuzyjne o odpowiedniej wielkości (ścieżka E; figura 1) wykrywano po indukcji IpTG (izopropylo-3-D-tiogalaktopiranozyd) iS DS-PAGE. Powstały konjugat białkowy („MBP-cINA5i₅”) zastosowano jako antygen do immunizacji niedojrzałych samic przepiórki japońskiej (Coturnix coturnix japonica), przeciwko krążącej inhibinie, jak to opisano wyczerpująco w przykładzie 8.

Nieoczekiwanie odkryto, że kompozycja opisana w niniejszym wynalazku przyspiesza rozpoczęcie składaniajaj u ptaków. Wynalazek dalej dotyczy sposobu przyspieszania rozpoczęcia składaniajaj albo dojrzewania samic ptaków przez podawanie efektywnej ilości białka heterologicznego według wynalazku (zawierającej inhibinę, albo jej fragment oraz białko nośnikowe) w taki sposób, że rozpoczęcie składaniajaj przez ptaki jest przyspieszone. Określenie „przyspieszenie” w znaczeniu tu użytym oznacza, że rozpoczęcie składaniajaj przez w ten sposób traktowanego ptaka występuje przynajmniej 3% wcześniej niż składanie jaj przez ptaka nie traktowanego. Korzystnie, składanie jaj rozpoczyna się przynajmniej 5% wcześniej zaś bar184 202 dziej korzystnie około 7% wcześniej. Jeszcze korzystniej składanie jaj występuje przynajmniej 10% wcześniej, zaś najkorzystniej występuje przynajmniej 13%o wcześniej niż występuje normalnie u nietraktowanych ptaków. Należy rozumieć, że ptak „traktowany” oznacza ptaka, któremu podano białko heterologic-zne według wynalazku. Korzystnie, u ptaka zachodzi odpowiedź odpornościowa na inhibinę. Korzystniej, odpowiedź odpornościowa jest również skierowana na endogenną inhibinę wytwarzaną przez ptaka.

Sposób według niniejszego wynalazku może być zastosowany do przyspieszania rozpoczęcia składaniajaj u każdego gatunku ptaków wytwarzających inhibinę. Samica ptaka może być wybrana, choć nie jest ograniczona do: ratites, psittaciformes, falconi-formes, piciformes, strigiformes, coraciformes, ralliformes, passenformes, cuculiformes, ćolumbiformes, galliformes (drób domowy), anseriformes (gęsi, kaczki, inny drób wodny) albo herodiones. W szczególności samica ptaka może być wybrana spośród, choć nie ograniczona do strusia, emu, rhea, kazuara, kiwi, indyka, przepiórki, kury, sokoła, orła, jastrzębia, gołębia, papugi długoogonowej, kakadu, makaw, papugi i takich ptakówjak słowik, sójka, szpak, zięba, skowronek i wróbel oraz każdego z rzędu psittaciformes. Korzystnym ptakiem jest ratites. Bardziej korzystnym ptakiem jest struś. Innym korzystnym ratite jest emu. Innym korzystnym ratite jest rhea. Jeszcze innym korzystnym ptakiem jest członek rzędu psittaciformes. Innym korzystnym ptakiem jest kura. Kolejnym korzystnym ptakiem jest przepiórka. Sposób według wynalazku może być również zastosowany w celu przyspieszenia rozpoczęcia składaniajaj przez gatunki ptaków zagrożonych. Ptaki takie obejmują, choć nie są ograniczone do orłów, jastrzębi, kondorów i sów.

Inhibina i białko nośnikowe w białku heterologicznym według wynalazku różni się w zależności od tego, któremu gatunkowi ptaka będzie ona podawana. Jest korzystne by ptasia inhibiną i białko wiążące maltozę były stosowane gdy białko będzie podawane ptakowi. Korzystną, inhibinąjest inhibiną kury domowej lub inhibiną ratites, gdy białko będzie podawane jakiemuś ratite. Bardziej korzystnie, korzystną inhibiną jest inhibna kury domowej lub inhibiną strusia, gdy białko będzie podawane strusiowi.

Powinno być zrozumiałe, że inhibiną w białku heterologicznym nie musi pochodzić z tego samego gatunku co gatunek, któremu będzie podawane białko heterologiczne. Przykładowo, białko heterologiczne, które będzie podawane strusiowi może zawierać inhibinę kurzą i białko nośnikowe. Powinno być również zrozumiale, że kompozycja zawierająca białko może dodatkowo zawierać adjuwanty, konserwanty, rozpuszczalniki, emulgatory, stabilizatory oraz inne znane składniki, znane w dziedzinie wiedzy i stosowane w dotychczasowych szczepionkach. Każdy układ adjuwantowy może być zastosowany w kompozycji do podawania ptakom. Korzystnym układem adjuwantowym jest niekompletny adjuwant Freunda. Innym korzystnym układem adjuwantowymjest kompletny adjuwant Freunda. Jeszcze innym korzystnym układem adjuwantowym jest acetylomannan beta-(l,4) sieciowany („Acemannan”).

Kompozycja białka heterologicznego opisana w niniej szym wynalazku może być podawana samicy ptaka dowolnym sposobem znanym w dziedzinie wiedzy. Przykładowo, kompozycja może być podawana podskórnie, dootrzewnowe albo domięśniowo. Najlepiej, gdy kompozycja jest wstrzykiwana podskórnie. Kompozycja może być podawana ptakowi w jednej lub licznych dawkach. Kompozycja jest podawana ptakowi w licznych dawkach tak, że po wstępnej immunizacji podawane są dawki przypominające.

Kompozycja powinna być podawana samicy ptaka zanim ptak osiągnie moment składania jaj albo dojrzałość. Najlepszy wiek, w którym kompozycja jest po raz pierwszy podawana zwierzęciu zależy od gatunku zwierzęcia, sezonu rozmnażania zwierzęcia (o ile taki istnieje), od wielkości ptaka oraz od składników (inhibiny i białka nośnikowego) kompozycji.

Ilość białka heterologicznego według wynalazku podawana samicy ptaka różni się w zależności od gatunku ptaka, wieku i ciężaru ptaka, gdy białko jest podawane w zależności od sezonu rozmnażania (o ile ptak ma sezon rozmnażania) oraz jak często podawane jest białko. Rozpoczęcie schematu podawania, czy leczenia, różni się zależnie od gatunku ptaka, średniego wieku rozpoczęcia składaniajaj danego gatunku ptaków, historii rodzinnej ptaka (w odniesieniu do historii rozpoczęcia składaniajaj), pory roku kiedy ptakjest kryty, schematu żywienia ptaka (ptaki inten18

184 202 sywnie karmione dojrzewaiąwcześmej niż niedożywione), ogólnego stanu zdrowia ptaka w momencie rozpoczęcia podawania, historii zdrowia ptaka, wystąpienia skrajnych warunków pogody (przedłużające się zaostrzenie pogody jak deszcz, upał czy wiatr, do których ptak nie jest przywykły), warunki hodowli (zatłoczenie) czy brak ruchu.

Specjaliści, w świetle wskazówek z niniejszego wynalazku powinni być zdolni do określenia, drogą rutynowych badań, ilości białka heterologicznego, które będzie niezbędne do wywołania u ptaka odpowiedzi odpornościowej na białko.

Przykładowo, poniżej znajduje się krótkie streszczenie sposobu, według wynalazku, przy-pieszanij dojrzewania i przepiórki japońskiej jak to szczegółowo opisano w przykładzie 8. Średni wiek osiągania dojrzałości przez przepiórkę wynosi sześć do ośmiu tygodni. Poniżej zamieszczono schemat traktowania przepiórki japońskiej o średnim ciężarze rzędu 0,05 do 0,11 kilograma: wstrzyknięcie wstępne (pierwsze) 0,75 mg białka heterologicznego według wynalazku w 25 dniu życia i dawka przypominająca 0,375 mg w 32, 39, 46, 53, 60 i 90 dniu życia.

W szczególności, w 25 dniu życia 100 przepiórek rozdzielono losowo do czterech grup (po 25 ptaków w grupie) jak następuje: (1) MBP-cINa_5]5 w β-(1,4) sieciowanym acetylomannanie (,,Acemannan”), nośniku immunostymulującym, („MBP-cINAj^/ACE”) , (2) MBP-cINA₅i w adjuwancie Freunda („MBP-cINA₅₁₅/FrN”) , (3) A-cemannan (kontrola immunostymulatora; „ACE”) i (4) adjuwant Freunda (kontrola adjuwantu; „FRN”). Ptakom immunizowanym w stosunku do inhibiny (Grupa 1 i 2) podawano po około 0,75 mg MBP-cINA,^ dziennie na ptaka w odpowiednim nośniku kontrolnym. Równowartość objętości odpowiedniego nośnika (0,2 ml) ACE albo FRN stosowano odpowiednio w grupach 1 i 3 oraz grupach 2 i 4. Wszystkie wstrzyknięcia podawano podskórnie przy użyciu strzykawek tuberkulinowych z igłą 25 Gauge. Następnie podawano cotygodniowe immumunizacje przypominające po około 0,375 mg MBP-cINA₅₎₅ na ptaka albo odpowiedniej kontroli, przez kolejnych pięć tygodni.

Począwszy od 41 dnia życia (w odniesieniu do 1 dnia cyklu składaniajaj) odnotowywano pomiary dziennej produkcji jaj przez grupę („HDEP”) i śmiertelność („MORT”) przez kolejne 12 tygodni. Dodatkowo, dla każdej grupy wyliczono średni wiek pierwszego złożenia jaja (,,FIRST”) oraz wiek, gdy kura osiągnęła 50% zdolności znoszenia jaj („FIFTY”). Jak to szczegółowo będzie dyskutowane w przykładzie 8 dane HDEP poddano dwóm róż nym analizom wariancji.

Do tej pory zebrano jedynie wstępne dane z 35 dni. Skumulowane procentowe odsetki HDEP dla tygodniowych odstępów składaniajaj (dni 0,7,14,21 i 35) podczas pierwszych 35 dni badania wykreślono na figurze 2 (na której każdą z grup traktowano osobno) oraz figurze 3 (na której porównano grupy nie immunizowane (kontrolne) w stosunku do grup immunizowanych inhibiną).

Średnie tempa HDEP podczas tygodnia 1, tygodnia 2, tygodnia 3, tygodnia 4 i tygodnia 5 oraz tygodni od 1do 5 połączone dla wszystkich grup traktowanych jak niezależne traktowanie podano w tabeli 2. W szczególności wartości w tabeli 2 przedstawiają odsetek tempa składania jaj. Przykładowo, w tygodniu 1 badania tylko 5,8% ptaków w grupie ACE składało jajo codziennie. W tygodniu 2 badania 39,56% ptaków w grupie ACE składało jajo codziennie (39,56% w tygodniu 2 obejmuje 5,8% z tygodnia 1).

Tabela 2 pokazuje również, że w tygodniu 4 grupa MBP-cINAj^/FRN miała szczyt tempa składaniajaj wynoszący 96,57%. Tak więc, wnioskując z wartości w tabeli 2, pozostałe trzy grupy nie wykazywały w tygodniu 4 szczytu składaniajaj, ponieważ ich odsetek tempa składaniajaj rósł pomiędzy tygodniem 4 i tygodniem 5. Kolumna pod tygodniami 1-5 przedstawia średni od setek tempa składaniajaj każdej z grup dla tygodnia od 1 do 5.

Tabela 3 pokazuje średni HDEP w procentach w tych samych ramach czasowych co w tabeli 2, ale w postaci danych pulowanych do bezpośredniego porównania kontroli w stosunku do immunizowanych. Kolumna pod tygodniami 1 -5 przedstawia średni odsetek tempa składaniajaj dla połączonych grup kontroli w stosunku do grup immunizowanych inhibiną w tygodniach od 1 do 5.

Tabela 4 zawiera dane FIRST dotyczące składania jaj dla obu scenariuszy statystycznych (tzn. porównania dla czterech grup oraz danych połączonych). Wiek pierwszego złożenia jaja w tabeli 4 przedstawia średnią statystycznąpierwszego dnia złożenia dla wszystkich

184 202 ptaków w każdej z grup. Należy zaznaczyć, że tabela 5 pokazuje ponad 5-dniowe przyspieszenie rozpoczęcia skladaniajaj w porównaniu grupy FRN w stosunku do grupy MBP-cINA₅1₅/FRN. Tabela 5 pokazuje również ponad 3-dniowe przyspieszenie rozpoczęcia skladaniajaj pomiędzy grupami Kontroli i grupą ptaków immunizowanych (dla tabel 2,3 14 patrz przykład 8).

Początkowy pozytywny wpływ neutralizacji immunologicznej inhibiny na efektywność produkcji pozostawał zachowany. Wpływ tenjest szczególnie zauważalny w połączonych wynikach HDEP (tabela 3) oraz FIRST (tabela 4), gdzie zwiększona liczba obserwacji wyników średnich zwiększała moc zastosowanego testu statystycznego.

Większość czasowych odpowiedzi biologicznych na leczenie badano dla wpływu na czas rozpoczęcia, wielkość i długość działania. Zamieszczone dane sąwstępne (tzn. zbieranajestjeszcze informacja dotycząca całkowitego cyklu składania jaj (około 12 tygodni po rozpoczęciu składaniajaj)). Stąd, pełne zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw wpływu immunizacji przeciwko inhibinie na zmienioną wydajność przepiórek wymaga określenia. Jednakże, obecne dane nie wykazują wpływu neutralizacji immunologicznej inhibiny na część początkową cyklu skladaniajaj (tzn. rozpoczęcia dojrzałości).

Dane pokazują że początek dojrzałości był przyspieszony w grupach immunizowanych inhibiną. Potwierdzają to dane HDEP i FIRST. Stwierdzono wysoki poziom istotności statystycznej (P<0,0095) w połączeniu z wyższą średnią HDEP stwierdzoną u przepiórek immunizowanych inhibinąpodczas tygodnia 1 badania, która to różnica zacierała się w tygodniu 2 (P<0.0888) (tabela 3). Różnica ta w krańcowej postaci obserwowana w tygodniu 2 może oznaczać, że składanie jaj, jakkolwiek opóźnione, zaczynało się nasilać w kontrolnej grupie przepiórek (patrz figura 2). W następstwie powyższego, siła różnicy statystycznej stwierdzanej pomiędzy obiema grupami (inhibiną w stosunku do kontroli) podczas tygodnia 1 stawała się słabsza wraz z upływem czasu skladaniajaj. W rzeczywistości, po połączeniu danych z tygodni od 1 do 5, stwierdzono w grupie kur immunizowanych inhibiną znacznie wyższą średnią HDEP o średnim poziomie istotności statystycznej (P<0,0763).

Przepiórki japońskie wybrano ze względu na intensywność składania jaj zaś potencjał składaniajaj uważany za wyższy u Cotumix od kury domowej (odmiana Single Comb White Leghorn) cenionej w handlu za cechę produkcji jaj spożywczych. Po wtóre, średni wiek, w którym immunizowana przepiórka (51,98 dni) sk-ła dała pierwsze jajo (FIRST) był skrócony (P,0373) o ponad 3 dni w porównaniu z przepiórkami nieimmunizowanymi (55,33 dni) (tabela 4). Ten wpływ immunizacji inhibiną na przyspieszenie składaniajaj był szczególnie wart odnotowania u przepiórek traktowanych MBP-cINA515/FRN, których średnia FIRST wynosiła 50,38 dni (tabela 4). Wyniki te wskazująrównież, że wyższe miana przeciwciał w stosunku do białka, na które eksponowano (a stąd większa neutralizacja immunologiczna) powstają, gdy jako nośnik dla MBP-cINAsis stosowany był adjuwant Freunda, niż Ace-mannan.

Dodatkowy dowód wspiera wniosek, że neutralizacja immunologiczna inhibiny przyspieszała początek dojrzałości u przepiórek. W szczególności, jak dotąd wszystkie (100%) kury traktowane inhibiną (tzn. w 76 dniu życia, albo dniu 35 doświadczenia) rozpoczęły składanie jaj, podczas gdy dwie spośród kur kontrolnych jeszcze nie rozpoczęły skladaniajaj. Wskazuje to, że jeżeli dwie z pozostałych kur nie rozpoczną składaniaj aj, neutralizacj a immunologiczna inhibiny mogłaby spowodować indukcję składaniajaj u kur, które inaczej nigdyby nie zaczęły składać jaj. Ponadto, jeżeli te dwa ptaki nigdy nie złożąjaj, lub gdy zaczną składać jaja w okolicach końca badania (124 dzień życia) ponad 3 -dniowa różnica w danych FIRST, z powodów matematycznych, ulegnie wydłużeniu. Dodatkowo, pomimo iż badanie statystyczne parametru FIFTY niejestjeszcze wskazane (ponieważ około 23% kur nie osiągnęło jeszcze 50% HDEP) większość kur późno składających jaja (około 57%) należy do grup kontrolnych (nieimmunizowanych). Wynik ten wspiera dalej dane HDEP i FIRST, które wskazują, że dojrzewanie zostało przyspieszone u przepiórek immunizowanych w stosunku do inhibiny.

Nawiązując, powyższe dane pokazują, że kompozycja inhibiny według niniejszego wynalazku przyspiesza początek dojrzałości u przepiórek japońskich. Ponieważ przepiórki japońskie są uznanym modelem zwierzęcym dla kury domowej w odniesieniu do ich układu rozrodczego,

184 202 powyższe dane wskazują, że sposób według wynalazku powinien również przyspieszyć rozpoczęcie składaniajaj u kur. W nawiązaniu, sposób według wynalazku powinien spowodować dla producenta jaj większą produkcję jaj przy niższych kosztach paszy.

Poniżej przedstawiono krótkie streszczenie sposobu, według wynalazku, na przyspieszenie dojrzewania u strusi, jak to dyskutowano w przykładzie 9. Średni wiek osiągnięcia dojrzałości u strusi wynosi od 28 do 32 miesięcy. Poniżej podano schemat podawania dla strusi o średnim ciężarze od 70 do 140 kilogramów: wstępne (pierwsze) wstrzyknięcie 5,0 mg białka heterologicznego według wynalazku w 26 miesiącu życia i dawki przypominające po

2,5 mg w 27, 28, 30, 32, 34 i 36 miesiącu życia.

Poniżej przedstawiono krótkie streszczenie sposobu według wynalazku na przyspieszenie dojrzewania u emu, jak to dyskutowano w przykładzie 10. Średni wiek osiągnięcia dojrzałości u emu wynosi około 20 miesięcy. Poniżej podano schemat podawania dla emu o średnim ciężarze od 23 do 41 kilogramów: wstępne (pierwsze) wstrzyknięcie 3,0 mg białka heterologicznego według wynalazku w 18 miesiącu życia i dawki przypominające po 1,5 mg w 19, 20, 22, 24, 26 i 30 miesiącu życia.

Poniżej przedstawiono krótkie streszczenie sposobu według wynalazku na przyspieszenie dojrzewania u kury domowej,jak to dyskutowano w przykładzie 11. Średni wiek osiągnięcia dojrzałości u kury domowej wynosi około 20 tygodni. Poniżej podano schemat podawania dla kur o średnim ciężarze od 0,9 do 1,6 kilogramów: wstępne (pierwsze) wstrzyknięcie 1,5 mg białka heterologicznego według wynalazku w 15 tygodniu życia i dawki przypominające po 0,75 mg w 17, 20, 24, 30, 40 i 50 tygodniu życia.

Poniżej przedstawiono krótkie streszczenie sposobu według wynalazku na przyspieszenie dojrzewania u indyków, jak to dyskutowano w przykładzie 12. Średni wiek osiągnięcia dojrzałości u indyków wynosi około 30 tygodni. Poniżej podano schemat podawania dla indyków o średnim ciężarze od 4 do 5,5 kilogramów: wstępne (pierwsze) wstrzyknięcie 2,0 mg białka heterologicznego według wynalazku w 28 tygodniu życia i dawki przypominające po 1,0 mg w 29, 30, 34, 38, 46 i 54 tygodniu życia.

Poniżej przedstawiono krótkie streszczenie sposobu według wynalazku na przyspieszenie dojrzewania u papug, jak to dyskutowano w przykładzie 13. Średni wiek osiągnięcia dojrzałości u papug wynosi około 30 miesięcy. Poniżej podano schemat podawania dla papug o średnim ciężarze od 0,22 do 0,56 kilograma: wstępne (pierwsze) wstrzyknięcie 0,75 mg białka heterologicznego według wynalazku w 28 miesiącu życia i dawki przypominające po 0,375 mg w 29, 30,32, 34, 36 i 38 miesiącu życia.

Inne wykonanie niniejszego wynalazku dotyczy sposobu zwiększania produkcji jaj u zwierząt przez podawanie efektywnej ilości białka heterologicznego według wynalazku (zawierającego inhibinę, albo jej fragment oraz białko nośnikowe) w taki sposób, że zwiększa ilość jaj wytwarzanych przez ptaka. Określenie „zwiększa” oznacza, że wytwarzanie jaj przez ptaka zwiększa się o około 3% w porównaniu wytwarzaniem jaj u ptaka nie traktowanego. Korzystnie, wytwarzanie jaj zwiększa się o około 7%, zaś korzystniej o około 12%o. Powinno być zrozumiałe, że ptak „traktowany” oznacza ptaka, któremu podawane jest białko heterologiczne według wynalazku. Korzystnie, u zwierzęcia rozwija się odpowiedź odpornościowa przeciwko inhibinie. Korzystnie, odpowiedź odpornościowa jest również skierowana przeciwko endogennej inhibinie wytwarzanej przez zwierzę.

Sposób według wynalazku może być zastosowany do zwiększania produkcji jaj przez samicę zwierzęcia każdego gatunku wytwarzającego inhibinę. Zwierzę może być, między innymi, ptakiem. Korzystnym zwierzęciem jest ptak. Samica ptaka może być wybrana z grupy składającej się z, choć nie ograniczonej do ratites, psittaciformes, falconiformes, piciformes, strigiformes, coraciformes, ralliformes, passeriformes, cuculiformes, columbiformes, galliformes (drób domowy), anseriformes (gęsi, kaczki, inny drób wodny), herodiones. W szczególności, samica ptaka może być wybrana spośród, choć nieograniczona do strusia, emu, rhea, kiwi, kazuara, indyka, przepiórki, kury domowej, sokoła, orła, jastrzębia, gołębia, papugi długoogonowej, kakadu, makaw, papugi i takich ptaków jak słowik, sójka, szpak, zięba, skowronek i wróbel oraz

184 202 któregokolwiek z rzędu psittaciformes. Korzystnym ptakiem jest ratites. Szczególnie korzystny jest struś. Innym korzystnym ptakiemjest emu. Jeszcze innym korzystnym ptakiemjest rhea. Kolejnym korzystnym ptakiem jest kura domowa. Jeszcze innym korzystnym ptakiem jest przepiórka.

Sposób według wynalazku może być również zastosowany w celu zwiększenia składania jaj u gatunków ptaków zagrożonych. Gatunki te obejmują, choć nie są ograniczone do orłów, jastrzębi, kondorów i sów.

Inhibiną i białko nośnikowe w kompozycji białka heterologicznego według wynalazku różni się w zależności od tego, któremu gatunkowi będzie ona podawana. Białko heterologiczne według wynalazku dyskutowane było powyżej. Jest korzystne by ptasia inhibiną i białko wiążące maltozę były stosowane gdy kompozycja będzie podawana ptakowi. Korzystną inhibinąjest inhibina kury domowej lub inhibiną ratites, gdy kompozycja będzie podawana jakiemuś ratites. Bardziej korzystnie, korzystną inhibiną jest inhibiną kury domowej lub inhibiną strusia, gdy kompozycja będzie podawana strusiowi.

Powinno być zrozumiałe, że inhibiną w białku heterologicznym nie musi pochodzić z tego samego gatunku co gatunek, któremu będzie podawana białko heterologiczne. Przykładowo, białko heterologiczne, które będzie podawane strusiowi może zawierać inhibinę kurzą i białko nośnikowe. Powinno być również zrozumiałe, że kompozycja może zawierać adjuwanty, konserwanty, rozpuszczalniki, emulgatory, stabilizatory oraz inne znane składniki, znane w dziedzinie wiedzy i stosowane w dotychczasowych szczepionkach. Każdy układ adjuwantowy może być zastosowany w kompozycji według niniejszego wynalazku. Korzystnym układem adjuwantowym jest niekompletny adjuwant Freunda. Innym korzystnym układem adjuwantowym jest kompletny adjuwant Freunda.

Kompozycja białka heterologicznego opisana również w niniejszym wynalazku może być podawana zwierzęciu dowolnym sposobem znanym w dziedzinie wiedzy. Przykładowo, kompozycja może być podawana podskórnie, dootrzewnowe albo domięśniowo. Korzystnie, kompozycja jest wstrzykiwana podskórnie. Kompozycja może być podawana ptakowi w jednej lub licznych dawkach. Korzystnie, kompozycja jest podawana ptakowi w licznych dawkach tak, że po wstępnej immunizacji podawane są dawki przypominające.

Kompozycja powinna być podawana samicy zwierzęcia zanim zwierzę przestanie owulować z powodu choroby lub wieku. Korzystnym wiekiem, w którym kompozycja według wynalazku jest po raz pierwszy podawana zwierzęciu zależy od gatunku zwierzęcia, sezonu rozmnażania zwierzęcia (o ile taki istnieje) oraz przyczyny dla której kompozycja jest podawana.

Przykładowo, gdy kompozycja podawana jest w celu zwiększenia produkcji jaja zwierzęcia hodowlanego posiadającego sezon rozmnażania, korzystny czas podawania kompozycji przypada przed początkiem sezonu rozmnażania. W przeciwieństwie do powyższego, jeżeli kompozycjajest podawana dojrzałemu zwierzęciu, u którego nastąpiło zablokowanie tempa produkcji jaj, kompozycja powinna być podawana w czasie gdy zablokowanie zostanie uznane za problematyczne.

Przykładowo, jakkolwiek białko heterologiczne może być podawane ptakowi, jak np. ratites, w dowolnym wieku, korzystna jest immunizacja ptaka w ciągu sześciu miesięcy przed pierwszym sezonem rozmnażania. Zrozumiałe jest dla specjalistów, że przeciętna samica ptaka rozpoczyna sezon składaniajaj podczas swego pierwszego sezonu rozmnażania. Jest jeszcze korzystniejsze, by immunizować ptaka na sześć miesięcy przed pierwszym sezonem rozmnażania ptaka, poczym podać dawkę przypominającą w odstępach miesięcznych przed pierwszym sezonem rozmnażania. Jest najkorzystniejsze, aby immunizować ptaka około sześć miesięcy przed pierwszym sezonem rozmnażania a następnie podawać dawki przypominające co miesiąc przez sześć miesięcy.

Ilość białka heterologicznego według wynalazku podawana zwierzęciu zmienia się w zależności od gatunku zwierzęcia, wieku i ciężaru, gdy białko podawane jest w zależności od sezonu rozmnażania (jeżeli zwierzę ma sezon rozmnażania) oraz ile razy białko będzie podawane. Specjalista w dziedzinie w świetle wskazań niniejszego wynalazku może określić w rutynowych ba22

184 202 daniach ilość białka heterologicznego niezbędną do wywołania odpowiedzi odpornościowej zwierzęcia na białko.

Przykładowo, w celu uzyskania najlepszego wyniku w zwiększaniu ilości jaj u strusia, wstępna immunizacja podawanajest strusiowi około sześciu miesięcy przed jego pierwszym sezonem rozmnażania, poczym podawane są immunizację przypominające w odstępach miesięcznych przez sześć miesięcy. Wstępna immunizacja zawiera od około 0,5 do 4,5 mg białka heterologicznego według wynalazku. Immunizację przypominające zawierają od około 0,3 do 3,0 mg białka heterologicznego według wynalazku. Korzystnie, immunizacja zawiera od około

1,5 do 3,0 mg białka heterologicznego według wynalazku. Immunizację przypominające zawierająod około 0,75 do 1,5 mg białka heterologicznego według wynalazku. Korzystnej est również, aby białko heterologiczne było emulgowane w kompletnym adjuwancie Freunda (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) podczas wstępnej immunizacji zaś emulgowane w niekompletnym adjuwancie Freunda (Sigma) podczas immunizacji przypominających. Jeszcze bardziej korzystne jest by kompozycja białka heterologicznego podawana była podskórnie. Najkorzystniejsze jest, by kompozycja białka heterologicznego podawana była podskórnie w trzy miejsca wzdłuż górnego regionu uda strusia.

Sposób zwiększania produkcji jaj u ptaków, według wynalazku powoduje znaczne zwiększenie produkcji jaj, które wyselekcjonowano genetycznie pod kątem cechy zwiększania ilości składanych jaj. Przykładowo, kury selekcjonowano genetycznie pod względem maksymalnej produkcji jaj od późnych lat 20-tych (patrz, przykładowo, Juli, M. A, 1932, Poultry Breeding, John Willey & Sons). Z powodu krótkiego czasu życia kur, większa część selekcji pod względem tej cechy odbywała się od około 1928 roku do chwili obecnej. W przeciwieństwie, ratites i psittaciformes, oraz większość ptaków egzotycznych nie była selekcjonowana pod względem cechy zwiększania ilości składanychjaj. Również ptaki zagrożone nie były selekcjonowane pod względem cechy zwiększania ilości składanych jaj. W nawiązaniu, ponieważ kury domowe sąjuż genetycznie doskonałe pod względem składaniajaj, poprawa ilości obserwowana po zastosowaniu sposobu według wynalazku jest ograniczona w porównaniu z ptakami, które genetycznie słabo lub umiarkowanie znoszą jaja. Dlatego więc, obserwuje się znacznie większą poprawę w ilości składanych jaj dzięki sposobowi według wynalazku w przypadku ptaków których nie selekcjonowano genetycznie w kierunku zwiększania ilości składanychjaj, jak ratites, psittaciformes, innych ptaków egzotycznych oraz ptaków zagrożonych.

Immunizacja zwierzęcia przy użyciu białka heterologicznego według wynalazku wywołuje u zwierzęcia produkcję przeciwciał swoiście skierowanych przeciwko endogennej inhibinie. Wytwarzanie takich przeciwciał przez ptaka skraca czas do wystąpienia dojrzałości albo składaniajaj. Wytwarzanie takich przeciwciał przez zwierzę również zwiększa możliwości wytwarzaniajaj ponieważ przeciwciała neutralizują, aktywność biologicznąinhibiny w krwiobiegu zwierzęcia.

Nie chcąc być wiązanym poniższąteona, uważa się, że podjednostka a inhibiny wiąże się z receptorem FSH i w sposób kompetytywny hamuje wiązanie FSH z miejscem receptorowym. Przez zmniejszanie poziomu inhibiny, która może wiązać się z receptorem, zwiększa się biologiczny wpływ FSH u zwierzęcia ponieważ osłabionejest współzawodnictwo o miejsca receptorowe FSH. Uważa się, że przeciwciała neutralizują inhibinę przez oddziaływanie z krążącąinhibiną i w ten sposób interferując sterycznie z wiązaniem inhibiny z miejscami receptorowymi FSH.

Nieoczekiwanie, kompozycja według wynalazku może być również zastosowana do zwiększenia całkowitej liczby jaj składanych przez ptaka w ciągu życia. Określenie „zwiększania” oznacza, że całkowita liczba jaj złożonych przez traktowanego ptaka w ciągu życia jest zwiększona o około 3% w porównaniu z tą liczbąu ptaka nietraktowanego. Korzystnie, całkowita liczba jaj złożonych przez traktowanego ptaka w ciągu życia jest zwiększona o około 7%, zaś jeszcze korzystniej o około 12%. Najkorzystniej, całkowita liczba złożonych jaj jest zwiększona o około 15%. Należy rozumieć, że ptak „traktowany” oznacza ptaka, któremu podawane jest białko heterologiczne według wynalazku. Pokrótce, całkowita liczba jaj złożonych przez traktowanego ptaka w ciągu życia powinna być zwiększona przez podawanie efektywnej ilości białka

184 202 heterologicznego w celu wywołania odpowiedzi odpornościowej na białko, a następnie po dawanie efektywnej ilości białka heterologicznego (dawki przypominające) w celu utrzymania maksymalnej lub wyższej niż normalna, produkcji jaj. W szczególności, jeżeli białko heterologiczne według wynalazkujest podawane w sposób ciągły samicy ptaka, w wyjawionych tuw opisanych powyżej sposobach przybliżonych dawkach, całkowita liczbajaj złożonych przez ptaka w ciągu życia powinna być zwiększona w porównaniu z ptakiem, któremu nie podawano kompozycji według wynalazku.

Ogólnie, sposób według wynalazku powoduje maksymalne zwiększenie całkowitej liczby jaj złożonych u gatunków ptaków których nie selekcjonowano genetycznie w kierunku cech zwiększania liczby składanychjaj. Całkowita liczbajaj złożonych przez ptaka w ciągu życiajest ograniczona liczbą gamet, z którymi ptak się urodził. Jednakże, niektóre gatunki ptaków selekcjonowano genetycznie w kierunku maksymalnej owulacji albo uwalniania jaj. Jak to stwierdzono powyżej, przykładowo, kury domowe selekcjonowano genetycznie w kierunku maksymalnej produkcjijaj od końca lat 20. Z powodu krótkiego czasu życia kur, większa część selekcji pod względem tej cechy odbywała się od około 1928 roku do chwili obecnej. W przeciwieństwie, ratites i psittaciformes, oraz większość ptaków egzotycznych nie była selekcjonowana pod względem cechy zwiększania ilości składanych jaj. Również ptaki zagrożone nie były selekcjonowane pod względem cechy zwiększania ilości składanych jaj. W nawiązaniu, ponieważ kury domowe sąjuż genetycznie doskonałe pod względem składaniajaj, poprawa ilości obserwowana po zastosowaniu sposobu według wynalazkujest ograniczona w porównaniu z ptakami, które genetycznie słabo lub umiarkowanie znosząjaja. Dlatego więc, obserwuje się znacznie większąpoprawę w ilości składanychjaj dzięki sposobowi według wynalazku w przypadku ptaków których nie selekcjonowano genetycznie w kierunku zwiększania ilości składanych jaj, jak ratites, psittaciformes, innych ptaków egzotycznych oraz ptaków zagrożonych. Zwiększenie całkowitej liczby jaj złożonych przez ptaka w ciągu życia powoduje produkcję większej liczby jaj z tej samej liczby ptaków, powodując większy margines zysku producenta.

Nieoczekiwanie, kompozycja według wynalazku może być również zastosowana zmniejszenia lub wyeliminowania konieczności przepierzania samic ptaków. W szczególności, jeżeli kompozycja opisana wyżej jest podawana w sposób ciągły samicy ptaka, jak wyjawiono w sposobie, tempo składaniajaj przez ptaka, w porównaniu z ptakiem nie traktowanym kompozycją według wynalazku, pozostaje na tyle wysokie, że ptak nie musi być przepierzany, w celu poprawy tempa składaniajaj. Powszechną praktykąjest przepierzanie samic ptaków, jak kury domowej (Single Comb White Leghorn, składające jaja spożywcze), gdy produkcja jaj obniża się tak, że koszt ekonomiczny utrzymania ptaka przewyższa zysk ekonomiczny ze złożonych jaj. W celu „przepierzania” kury, ptak poddawanyjest okresowi głodzenia trwającemu cztery do czternastu dni dopóki nie zacznie się przepierzać, tzn. nie straci piór. Podczas okresu przepierzany ptak przestaje składać jaja. Po przywróceniu ptakowi normalnych ilości pożywienia, produkcjajaj powraca po pewnym czasie. Cały cykl przepierzania trwa około dwóch miesięcy począwszy od rozpoczęcia głodzenia do rozpoczęcia cyklu składamajaj. W wyniku, tempo produkcji jaj jest odnowione. Jednakże, po przepierzeniu kury, tempo składaniajaj w kolejnym cyklu nigdy nie jest równe produkcji jaj w poprzednim (przed przepierzaniem) cyklu (M. North i D. Bell, Commercial Chicken Production Manuał, wyd. IV, Rozdz. 19, Van Norstrand Reinhold ofNew York).

Przykładowo, kury rozpoczynają składanie jaj w wieku 20 tygodni i składają ekonomicznie istotną ilość przez około 40 do 50 tygodni. W szczycie składaniajaj, kury składają osiem do dziewięciujaj w ciągu dziesięciu dni. Jednakże, po około 50 tygodniach składania jaj, tempo produkcji zmniejsza się do około 60% szczytowej produkcji. W tym momencie koszt żywienia kury przewyższa wartość jaj, które składa. Jestpowszechnąpraktykąprzepierzanie ptaków w tym momencie, tak że gdy kura ponownie zaczyna składać jaja, ich ilość wzrasta.

Stąd, kompozycja według wynalazku, o ile utrzymuje tempo składaniajaj na poziomie wyższym niż u ptaków nietraktowanych kompozycją, zmniejsza lub eliminuje konieczność przepierzania ptaków. Zmniejszenie lub eliminacja konieczności przepierzania ptaka powoduje znaczne oszczędności. Konkretnie, w czasie gdy ptak jest przepierzany', pozostaje on

184 202 nieproduktywny w sensie kosztów żywienia przed okresem przepierzania oraz w trakcie żywienia po okresie przepierzania. Utrzymanie tempa składaniajaj na podwyższonym poziomie eliminuje lub skraca te nieproduktywne fazy życia ptaka, zmniejszając koszty producenta i zwiększając jego zysk. Utrzymanie tempa składania jaj na pod wyższonym poziomie dalej zwiększa zysk producenta ponieważ tempo składaniajaj po przepierzaniu nie równa się tempu składaniajaj w poprzednim cyklu, jak to dyskutowano powyżej.

Pokrótce, tempo składaniajaj powinno być podwyższone, co eliminuje potrzebę przepierzania ptaka, przez podawanie efektywnej ilości białka heterologicznego według wynalazku, w celu wywołania odpowiedzi odpornościowej na białko, a następnie podawanie efektywnej ilości białka heterologicznego (dawki przy pominające) w celu utrzymania wyższego niż normalne tempa składaniajaj.

Innym nieoczekiwanym i zaskakującym aspektem niniejszego wynalazku jest to, że kompozycja według wynalazku powoduje powstawanie jaj o obniżonej zawartości cholesterolu w porównaniu zjajami składanymi przez ptaki nietraktowane. W szczególności, jeżeli kompozycja według wynalazku podawana jest samicy ptaka, jak wyjawiono w sposobie powyżej, zawartość cholesterolu w jajach składanych przez ptaka będzie obniżona przez dłuższy okres czasu, w porównaniu z ptakiem nietraktowanym kompozycją według wynalazku. Stąd, kompozycja według wynalazku zwiększa lub wywołuje zwiększoną ilość niskocholesterolowych jaj.

Określenie „zwiększa” albo „zwiększoną ilość” oznacza, że liczba niskocholesterolowych jaj wytwarzanych przez traktowanego ptaka zwiększa się o przynajmniej 5% w stosunku do liczby niskocholesterolowych jaj wytwarzanych przez ptaka nietraktowanego. Korzystnie, liczba wytworzonych niskocholesterolowych jaj zwiększa się przynajmniej o około 10% zaś jeszcze korzystniej o 15%. Należy rozumieć, że ptak „traktowany” oznacza ptaka, któremu podawane jest białko heterologiczne według wynalazku. Określenie „obniżona zawartość cholesterolu” czy „niskocholesterolowe” oznacza, że zawartość cholesterolu wjajujest niższa niż przeciętna zawartość cholesterolu złożonym przez ptaka tego samego gatunku o co najmniej około 10%. Korzystnie, zawartość cholesterolujaja niskocholesterolowego jest niższa niż przeciętna o co najmniej około 20%. Jeszcze korzystniej, zawartość cholesterolu jaja niskocholesterolowego jest niższa niż przeciętna o co najmniej około 30%.

Wiadome jest, że u kur pierwsze pięć do sześciu jaj złożonych po osiągnięciu dojrzałości przez samicę ptaka (kurę) posiada niższą zawartość cholesterolu niż jaja złożone później. Kompozycja według wynalazku wywołuje u kury składanie jaj o niższej zawartości cholesterolu przez czas dłuższy. Z powodu konsekwencji zdrowotnych związanych z wysokim poziomem cholesterolu we krwi, powstaje zapotrzebowanie na niskocholesterolowe jaja. W nawiązaniu, kompozycja według wynalazku zapewnia producentowi jaj większej liczby bardziej poszukiwanego rodzaju jaj.

Stąd, sposób według wynalazku na zwiększenie produkcji jaj oraz przyspieszenie rozpoczęcia składaniajaj u ptaków znacznie przyspieszy wzrost populacji i w ten sposób rynku na ratites takich jak strusie i emu, ponieważ ich suboptymalne tempa składaniajaj zostaną zwiększone dzięki niniejszemu sposobowi. Sposób według wynalazku zaspokoi również zapotrzebowanie na drób, jak kury domowe i ich jaja.

Użyteczność sposobu zwiększania produkcji jaj nie jest ograniczona do ptaków Niniejszy sposób zwiększania produkcjijaj może być zastosowany w celu porawy produkcji jaj przez wiele zwierząt. Przykładowo, sposób może być zastosowany do zwiększania produkcji jaj przez większość zwierząt hodowanych gospodarczo jak świnie, krowy, owce i kury. Sposób może być zastosowany do zwiększania produkcji jaj przez zwierzęta futerkowe jaknorki, lisy, fretki, wydry i szopy oraz innych zwierząt, których futra używane są dla celów dekoracyjnych. Również, sposób zwiększania produkcji jaj jest użyteczny do zwiększania populacji licznych zwierząt jak gatunki egzotyczne czy zagrożone, aby zapobiec ich wyginięciu. Sposób może być zastosowany do zwiększania produkcji jaj przez zwierzęta używane do wyścigów, występów czy przedstawień (zawodów) jak koni, psów, kotów, zwierząt ogrodów zoologicznych i cyrkowych. Dalej, sposób może być również zastosowany do leczenia niepłodności ludzi.

184 202

Innym aspektem opisanym w niniejszym wynalazku jest sposób wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko białku heterologicznemu według wynalazku. Ogólnie, sposób wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko białku heterologicznemu obejmuje etapy: podawania zwierzęciu efektywnej ilości białka heterologicznego zawierającego białko inhibiny, lubjego fragment oraz białko nośnikowe, w ten sposób by wywołać u zwierzęcia odpowiedź odpornościowąprzeciwko białku heterologicznemu; pobierania próbki krwi od zwierzęcia oraz izolowania przeciwciał skierowanych przeciwko inhibinie z surowicy próbki krwi. Korzystnie, przeciwciało izolowane jest z surowicy próbki krwi przez przepuszczenie surowicy przez kolumnę zawierającą efektywne ilości białka nośnikowego w celu oddzielenia przeciwciał od surowicy. Techniki zastosowane w produkcji i oczyszczania przeciwciał skierowanych przeciwko białku heterologicznemu według wynalazku są dobrze znane specjalistom w dziedzinie.

Należy również rozumieć, że białko heterologiczne według wynalazku może być podawane każdemu zwierzęciu zależnie od pożądanego rodzaju przeciwciał. Dalej, należy rozumieć że inhinbina może być endogenna lub egzogenna. Stąd, rodzaj inhibiny w białku heterologicznym oraz gatunek zwierzęcia, któremu podawana jest kompozycja zależy od pożądanego rodzaju przeciwciał. Przykładowo, białko heterologiczne zawierające kurzą inhibinę i białko wiążące maltozę może być podawane strusiowi w celu wytworzenia strusich przeciwciał przeciwko kurzej inhibinie. Również, białko heterologiczne zwierające strusią inhibinę i białko wiążące maltozę może być podawane strusiowi w celu wytworzenia strusich przeciwciał przeciwko strusiej inhibinie.

W niniejszym wynalazku opisano również sposób oznaczania ilości inhibiny wytwarzanej przez zwierzę, co umożliwia określenie zdolności wytwarzania jaj przez to zwierzę. Pokrótce, sposób oznaczania ilości inhibmy w krwi zwierzęcia obejmuje etapy: pobrania próbki krwi od zwierzęcia; doprowadzenia do kontaktu próbki krwi z przeciwciałami przeciwko inhibinie, które są swoiście skierowane przeciwko endogennej inhibinie zwierzęcia, w warunkach umożliwiających przeciwciałom swoiste od działywanie z inhibiną obecną w próbce krwi; usuwania niezwiązanych przeciwciał z próbki i oznaczenie ilości przeciwciał które zostały związane.

Specjalista w dziedzinie wiedzy zrozumie, że techniki testów immunologicznych, które mogą być zastosowane w powyższym sposobie są znane w dziedzinie wiedzy. Stąd, każdy test immunologiczny znacznik i sposób obrazowania znany w dziedzinie wiedzy może być zastosowany w powyższym sposobie. Korzystnym testem immunologicznym jest ELISA („enzymatyczny test immunosorpcyjny”) zaś korzystnym znacznikiem jest peroksydaza chrzanowa. Innym korzystnym znacznikiem są kolorowe perełki lateksowe. Kolorowe perełki lateksowe mogą być w dowolnym kolorze pożądanym dla celów wizualizacji. Korzystnie, perełki lateksowe sąw kolorze żółtym, czerwonym, niebieskim albo zielonym. Kolorowe perełki lateksowe mogą być puste bądź pełne, ale korzystne są puste w celu zmniejszenia ich ciężaru. Wielkość perełek lateksowychjest różna w zależności od zamierzonego zastosowania w teście immunologicznym. Specjalista w dziedzinie wiedzy może stwierdzić w rutynowych doświadczeniach największy widzialny rozmiar perełki, który nie interferuje sterycznie z reakcją immunologiczną. Korzystnie, średnica perełki lateksu jest mniejsza niż 0,5 gm, zaś najkorzystniej mniejsza niż 0,2 gm.

Przykładowo, stężenia krążącej we krwi ptaka inhibiny mogąbyć oznaczone przy zastosowaniu standardowej kanapkowej techniki ELISA. Po pierwsze, należy związać przeciwciała przeciwko inhibinie, skierowane przeciwko jakiejś części inhibmy, lub jej fragmentowi, ze studzienką płytki. Po przepłukaniu i zablokowaniu płytki, należy dodać pewną ilość osocza krwi uzyskanej z krwi ptaka, który ma być badany. Po umożliwieniu inhibinie w próbce, o ile się tam znajduje, swoistego związania się z unieruchomionym przeciwciałem przeciw inhibinie, próbka jest wypłukiwana ze studzienki płytki. Następnie, do studzienki dodaje się znakowanego przeciwciała przeciwko inhibinie, skierowanego przeciw innej części inhibiny, albo jej fragmentowi, niż przeciwciało unieruchomione w studzience. Przeciwciało może być znakowane dowolnym znacznikiem znanym w dziedzinie wiedzy, jak np. peroksydaza chrzanowa. Po umożliwieniu znakowanemu przeciw ciału przeciwko inhibinie swoistego związania się z unieruchomioną inhibiną pozostałe niezwiązane przeciwciało usuwane jest przez wypłukanie. Ilość inhibiny obe26

184 202 cnej w próbce osocza oznaczana jest przez zastosowanie środków wizualizacji odpowiednich dla znacznika zastosowanego w ELISA, w celu określenia ilości związanego, znakowanego przeciwciała przeciwko inhibinie, znajdującego się w studzience. Standartowe kontrole pozytywne i negatywne przeprowadza się równolegle w sąsiadujących studzienkach.

Powinno być zrozumiałe, że potencjał rozrodczy każdego zwierzęcia wytwarzającego inhibinę może być zmierzony powyższym sposobem. Sposób ten można zastosować w celu określenia ilości inhibiny wytwarzanej przez samicę zwierzęcia dowolnego gatunku wytwarzającego inhibinę. Zwierzę może być, między innymi, ptakiem. W szczególności, ptak może być wybrany spośród grupy składającej się z, ale nie ograniczonej do strusia, emu i kury domowej. Korzystnym zwierzęciem jest ptak. Bardziej korzystnym zwierzęciem jest ratites. Szczególnie korzystnym zwierzęciem jest struś Innym korzystnym zwierzęciem jest emu. Jeszcze innym korzystnym zwierzęciem jest kura domowa.

Zwierzęta posiadające wysoki poziom inhibiny mają niski potencjał rozrodczy i, zależnie od gatunku i czy są hodowane dla celów gospodarczych, takie zwierzęta, wytwarzające mało jaj, mogą być oddane na ubój zamiast być hodowane dalej do rozmnażania. W przeciwieństwie do powyższego, zwierzęta hodowane gospodarczo posiadające niski poziom inhibiny lepiej wytwarzaj ąjaja i ogólnie powinny być używane do rozmnażania i nie powinny być oddawane na ubój.

Poziom inhibiny u zwierzęcia zmienia się w zależności wieku, gatunku i pory roku zależnie od sezonu rozmnażania (o ile taki występuje). Stąd, oznaczanie potencjału składaniajaj u zwierzęcia jest zależne od tych czynników i wielkość poziomu inhibiny u zwierzęcia jest bardziej miarodajna przez porównanie z przeciętnymi poziomami inhibiny u gatunku do którego należy zwierzę, w podobnym wieku i tej samej pory roku, jeżeli zwierzę ma sezon rozmnażania.

Ilość inhibiny wytwarzanej przez ptaki zmienia się w zależności od powyższych czynników, poniżej podane są względne ilości inhibiny dla różnych kategorii wiekowych ptaków. Tabela 1 pokazuje zmienność ratites, takichjak emu i strusie, dotyczącą wytwarzania inhibiny w zależności od tego czy wytwarzają dużo czy mało jaj oraz w zależności od ich wieku.

Tabela 1

Wiek (miesiące)	Poziom inhibiny	Potencjał rozrodczy
6-12	>5	niski
6-12	2-5	umiarkowany
6-12	0-1,5	wysoki
ponad 24	>7	niski
ponad 24	2-7	umiarkowany
ponad 24	0-2,5	wysoki

W powyższej tabeli podano poziom inhibiny względem wartości puli standartowej równej 1 dla samic ratites składających 50 do 60 jaj w ciągu sezonu, co jest wartością dobrą oraz wartości równej 7 dla puli samic składających poniżej 5 jaj w sezonie, co jest wartością słabą

W jeszcze innym aspekcie, w niniejszym wynalazku opisano sposób wytwarzania przeciwciał zwierzęcych skierowanych przeciwko klasie przeciwciał innego zwierzęcia, jak np. IgG. Pokrótce, sposób wytwarzania u zwierzęcia przeciwciał skierowanych przeciwko IgG innego zwierzęcia obejmuje etapy: podawania efektywnej ilości pewnej klasy przeciwciał pierwszego zwierzęcia, jak np. wytworzonych w wyżej opisany sposób, drugiemu zwierzęciu tak, by wywołać u drugiego zwierzęcia odpowiedź odpomościowąprzeciwko przeciwciałom pierwszego zwierzęcia; pobierania próbki krwi od drugiego zwierzęcia i izolowania przeciwciał drugiego zwierzęcia z surowicy próbki krwi jak to opisano wyżej. Korzystnie drugie zwierzę jest innego gatunku niż pierwsze zwierzę.

W niniejszym wynalazku opisano również sposób określania czy zwierzę odpowiedziało immunologicznie na podawanie kompozycji zwierającej inhibinę. Sposób ten wykorzystuje

184 202 przeciwciała drugiego zwierzęcia skierowane przeciwko klasie przeciwciał pierwszego zwierzęcia, jak to opisano wyżej. Pokrótce, sposób obejmuje wiązanie inhibiny albo białka heterologicznego według wynalazku na podłożu stałym, oraz doprowadzenie do kontaktu unieruchomionej inhibiny z próbkąkrwi od badanego zwierzęcia. Próbka poddanajest kontaktowi z unieruchomioną inhibiną w warunkach, w których inhibiną swoiście oddziaływuje z przeciwciałami przeciwko inhibinie znajdującymi się w próbce. Po usunięciu niezwiązanych przeciwciał z próbki i przepłukaniu dodawana jest pewna ilość znakowanych przeciwciał drugiego zwierzęcia skierowanych przeciwko klasie przeciwciał pierwszego zwierzęcia. Znakowane przeciwciała, skierowane przeciwko przeciwciałom zwierzęcia swoiście oddziaływają z przeciwciałami związanymi z unieruchomioną inhibiną. Po usunięciu niezwiązanych przeciwciał określa się obecność albo ilość związanych przeciwciał przez obrazowanie znacznika. Tak więc, sposób wykrywa obecność przeciwciał u zwierzęcia skierowanych przeciwko inhibinie i w ten sposób określa czy zwierzę odpowiedziało na podawanie kompozycji zwierającej inhibinę.

Powinno być zrozumiałe, że sposób określenia czy zwierzę odpowiedziało immunologicznie na podawanie kompozycji zwierającej inhibinę może być zastosowany wobec samicy dowolnego gatunku. Zwierzę może być, między innymi, ptakiem, —akiem albo gadem. W szczególności ssak może być wybrany spośród grupy składającej się z, choć nie ograniczonej do krowy, człowieka, konia, kota, psa, owcy, norki, lisa, wydry, fretki, szopa i świni. Ptak może być wybrany spośród grupy składającej się z, ale nie ograniczonej do strusia, emu, rhea i kury domowej. Korzystnym zwierzęciem jest ptak. Bardziej korzystnym zwierzęciem jest ratites. Szczególnie korzystnym zwierzęciem jest struś. Innym korzystnym zwierzęciem jest emu. Jeszcze innym korzystnym zwierzęciem jest rhea.

Specjalista w dziedzinie wiedzy zrozumie, że techniki testów immunologicznych, które mogą być zastosowane w powyższym sposobie są znane w dziedzinie wiedzy. Stąd, każdy test immunologiczny, znacznik i sposób obrazowania znany w dziedzinie wiedzy może być zastosowany w powyższym sposobie. Korzystnym testem immunologicznym jest ELISA, zaś korzystnym znacznikiem jest peroksydaza chrzanowa. Innym korzystnym znacznikiem są kolorowe perełki lateksowe. Kolorowe perełki lateksowe mogą być w dowolnym kolorze pożądanym dla celów wizualizacji. Korzystnie, perełki lateksowe są w kolorze żółtym, czerwonym, niebieskim albo zielonym. Kolorowe perełki lateksowe mogą być puste bądź pełne, ale korzystne są puste w celu zmniejszenia ich ciężaru. Wielkość perełek lateksowych jest różna w zależności od zamierzonego zastosowania w teście immunologicznym. Specjali-ta w dziedzinie wiedzy może stwierdzić w rutynowych doświadczeniach największy widzialny rozmiar perełki, który nie interferuje sterycznie z reakcją immunologiczną. Korzystnie, średnica perełki lateksujest mniejsza niż 0,5 pm, zaś najkorzystniej mniejsza niż 0,2 pm.

W niniejszym wynalazku opisano wykonanie powyższego sposobu w celu określania czy zwierzę odpowiedziało immunologicznie na podawanie kompozycji zwierającej inhibinę, w którym sposób testu immunologicznego zmodyfikowano w następujący sposób. Pokrótce, sposób obejmuje uzyskanie próbki krwi od zwierzęcia i doprowadzenie do kontaktu ze znakowaną inhibiną albo jej fragmentem. Próbkajest poddana kontaktowi ze znakowaną inhibiną w warunkach umożliwiających inhibinie swoiste oddziaływanie z wszystkimi przeciwciałami przeciwko inhibinie znajdującymi się w próbce. Po usunięciu niezwiązanej inhibiny z próbki obecność albo ilość związanej znakowanej inhibiny określanajest przez obrazowanie znacznika. Inhibiną zastosowana w tym sposobie jest wybrana spośród, ale nie ograniczona do: fuzyjnego białka heterologicznego inhibiny według wynalazku, endogennej inhibiny albo jej fragmentu oraz egzogennej inhibiny albo jej fragmentu. Korzystnie, znakowana inhibiną jest inhibiną endogenną.

Wynalazekjest dalej ilustrowany następującymi przykładami, które w zamierzeniach swoim zakresem w żaden sposób nie na rzucają ograniczeń. Przeciwnie, należy rozumieć, że możliwe są zastosowania różnych innych wykonań, modyfikacji i zamienników, które po przeczytaniu poniższego opisu, mogą się same nasunąć specjalistom w dziedzinie, bez oddalania się od ducha niniejszego wynalazku i/lub zakresu dołączonych zastrzeżeń patentowych.

184 202

Przykład 1

Sposób produkcji fuzyjnego produktu genowego zawierającego gen kodujący ekspresję inhibiny kurzej oraz gen kodujący ekspresję białka wiążącego maltozę.

Poniżej przedstawiono sposób produkcji fuzyjnego produktu genowego zawierającego gen (cINA5₁₅) kodujący ekspresję fragmentu podjednostki a inhibiny kurzej (Identyfikator Sekw. Nr 2 albo Identyfikator Sekw. Nr 4) oraz gen kodujący ekspresję białka wiążącego maltozę. Fuzyjny produkt genowy według wynalazku wykonany jest w oparciu o zestaw wektora pMAL™-c, New England Biolabs, Beverly Massachusetts.

Wektory pMAL™ dostarczają sposobu na ekspresję białek ekspresjonowanych z klonowanego genu albo otwartej ramki odczytu. Klonowany gen wprowadzany jest poniżej genu malE, kodujące go białko wiążące maltozę („MBP”) i powoduje w wyniku ekspresji białko fuzyjne MBP („MB P-cINA5I5”). Sposób umożliwia ekspresję klonowanych sekwencji na wysokim poziomie oraz jednoetapowe oczyszczanie białka fuzyjnego MBP-cINA₅15, w oparciu o powinowactwo MBP do maltozy.

Poniżej przedstawiono sposób ligacji genu inhibiny, cl NA51₅, do wektora pMAL™:

1. Trawienie 0,5 pg plazmidowego DNA pMAL™ w 20 pl wraz z genem kurzej inhibiny ^cINA5i5.

2. Trawienie 20 pg DNA X klonu λ 11 w 200 pl wraz z genem kurzej inhibiny cINA5 j ₅.

3. Dodanie 0,05 jednostki cielęcej jelitowej fosfatazy alkalicznej (NEB # 2900 do trawionego DNA wektorowego. Inkubacja w 37°C przez godzinę.

4. Sprawdzenie doszczętności trawienia przez elektroforezę 4 pl reakcji pMAL™ i 15 pl reakcji X na 0,8% żelu agarozowym.

Dodanie, odpowiednio 1 pl i 8 pl 0,5 M EDTA do trawień pMAL™ i Xgtl 1.

5. Dodanie do trawień restrykcyjnych równej objętości mieszaniny fenolu z chloroformem w stosunku 1:1, zmieszanie i przeniesieniewodnej (górnej) fazy do świeżej probówki. Powtórna ekstrakcja samym chloroformem.

6. Dodanie do trawienia wektora 10 pg glikogenu lub tRNAjako nośnika. Dodanie do obu trawień 1/10 objętości 3 M octanu sodu, mieszanie i dodanie równej objętości izopropanolu. Inkubacja w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

7. Odwirowanie przez 10 minut. Usunięcie nadsączu, przepłukanie peletki 70% etanolem i pozostawienie do wyschnięcia.

8. Zawieszenie każdej z próbek w 25 pl 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0.

9. Zmieszanie 2 pl trawionego wektora, 6 pl trawionej wstawki i 8 pl wody, podgrzanie mieszaniny DNA do 65°C przez 5 minut. Schłodzenie na lodzie i dodanie 4 fil 5X buforu ligazy; 0,5 pl ligazy T4 NEB (# 202; -200 jednostek); i inkubacja w 16°C od 2 godzin do przez noc.

10. Ogrzanie do 65°C przez 5 minut; schłodzenie na lodzie.

11. Zmieszanie z 25 p l kompetentnych TB1 (albo jakiegokolwiek szczepu dopełniającego lacZ a) i inkubacja na lodzie przez 5 minut. Podgrzanie do 42°C przez 2 minuty-.

12. Dodanie 0,1 ml LB i inkubacja w 37°C przez 20 minut. Rozprowadzenie na płytce LB zawierającej ampicylinę w stężeniu 100 pg/ml. Inkubacja przez noc w 37°C. Pobranie kolonii sterylnąwykałaczką na podstawową płytkę LB z ampicyliną i płytkę LB z ampicyliną) 80 pg/ml Xgal i 0,1 M IPTG. Inkubacja w 3 7°C przez 8 do 16 godzin. Ocena fenotypu Lac na płytce z X gal i odzyskanie „białych” klonów z płytki podstawowej. Przesiewanie w kierunku obecności wstawki w jeden lub oba poniższe sposoby;

A. Przygotowanie minipreparatu DNA. Trawienie odpowiednią endonukleazą restrykcyjną w celu stwierdzenia obecności i położenia wstawki.

B i) Namnożenie 5 ml hodowli w pożywce LB z ampicyliną do gęstości około 2xl0⁸/ml.

ii) Pobranie próbki 1 ml. Odwirowanie przez 2 minuty, usunięcie nadsączu i ponowne zawieszenie komórek w 50 pl bufora do próbek SDS-PAGE.

iii) dodanie do pozostałej hodowli IPTG do stężenia 0,3 M, przykładowo, 15 pl 0,1 M roztworu wyjściowego. Inkubacja w 37°C przez 2 godziny z dobrym napowietrzaniem.

184 202 iv) Pobranie próbki 0,5 ml. Odwirowanie przez 2 minuty, usunięcie nadsączu i zawieszenie komórek w 100 μ! bufora do próbek SDS-PAGE.

v) zagotowanie próbek przez 5 minut. Elektroforeza 15 μ1 każdej z próbek na 10% żelu SDS-PAGE równolegle z zestawem standartów ciężaru cząsteczkowego i 15 μ! dołączonego MBP w buforze do próbek SDS-PAGE. Zabarwienie żelu błękitem Coomassie. Indukowany prążekjest dobrze widoczny w pozycji odpowiadającej ciężarowi cząsteczkowemu białka fuzyjnego. Ciężar cząsteczkowy mBp wynosi 42000 Da.

Przykład 2

Sposób produkcji fuzyjnego białka heterologicznego „MBP-cINA515”, zawierającego inhibinę kurzą i białko wiążące maltozę.

Poniżej przedstawiono sposób produkcji fuzyjnego białka heterologicznego zawierającego inhibinę kurzą i białko wiążące maltozę, MBP-cINA515. Fuzyjny produkt genowy według przykładu 1 ekspresjonuje białko heterologiczne białko wiążące maltozę-inhibina, „MBP-cINA5,5”, jak następuje:

1. Inokulacja 80 ml bogatej pożywki z glukozą i ampicyliną (patrz. Pożywki i Roztwory) przy użyciu 0,8 ml całonocnej hodowli komórek zawierających plazmid według przykładu 1.

2. Namnożenie w 37°C z dobrym napowietrzaniem do gęstości 2xl0⁸ komórek/ml (A₆₀₀ rzędu 0,5). Pobranie próbki 1 ml i odwirowanie przez 2 minuty (komórki nieindukowane). Usunięcie nadsączu i zawieszenie komórek w 50 μΐ buforu do próbek SDS-PAGE. Zamieszanie i umieszczenie na lodzie.

3. Dodanie IPTG (izopropylotiogalaktozyd) do pozostałej hodowli do stężenia końcowego 0,3 mM, np. 0,24 ml roztworu wyjściowego 0,1 M w H₂O (patrz. Pożywki i Roztwory). Dalsza inkubacja w 37°C przez 2 godziny. Pobranie 0,5 ml próbki i odwirowanie przez dwie minuty (komórki indukowane). Usunięcie nadsączu i zawieszenie komórek w 100 μl buforu do próbek SDS-PAGE. Zamieszanie i umieszczenie na lodzie.

Podzielenie hodowli na dwie porcje. Zebranie komórek przez odwirowanie przy 4000xg przez 10 minut. Usunięcie nadsączu i zawieszenie peletki (próbka A) w 5 ml buforu do lizy (patrz, Pożywki i Roztwory). Zawieszenie pozostałej peletki (próbka B) w 10 ml 30 mM Tris-Cl, 20% sacharozy, pH 8,0 (8 ml na każde 0,1 g wilgotnej masy komórek).

5. Zamrożenie próbek w łaźni suchy lód/metanol (albo przez noc w -28°C). Roztopienie w zimnej wodzie (20°C jest bardziej wydajne niż 70°C ale zajmuje więcej czasu).

6. Sonikacja, sprawdzenie rozbicia komórek, przez pomiar uwalniania białek przy zastosowaniu metody Bradforda albo uwalniania kwasów nukleinowych przez pomiar A260 dopóki nie osiągnie maksimum. Dodanie 0,6 ml 5 M NaCl.

7. Odwirowanie przy 9000xg przez 20 minut. Dekantacja nadsączu (surowy ekstrakt 1) i przechowanie na lodzie. Zawieszenie peletki w 5 ml bufora do lizy. Jest to zawiesina nierozpuszczalnej macierzy (surowy ekstrakt 2).

Oczyszczanie na kolumnie ftizyjnego białka heterologicznego białko wiążące maltozę-inhibina, „MBP-cINA515”, wyprodukowane go w powyższy sposób, jak następuje:

1. Rozpuszczenie żywicy amylozowej (1/5 g) przez 30 minut w 50 ml buforu do kolumny (patrz. Pożywki i Roztwory) w butelce do filtrowania o pojemności 250 ml. Odgazowanie przy użyciu ssaka. Wypełnienie kolumny 2,5 x 10 cm. Przepłukanie kolumny trzema objętościami tego samego bufora z 0,25% Tween 20. Ilość potrzebnej żywicy zależy od ilości wyprodukowanego białka fuzyjnego. Żywica wiąże około 3 mg/ml objętości złoża, czyli kolumna 15 ml powinna wystarczyć do zebrania do 45 mg białka fuzyjnego/litr hodowli. Zamiast kolumny 2,5 cm można użyć 50 ml strzykawki zatkanej silikonowaną watą szklaną. Stosunek wysokości kolumny do średnicy powinien być mniejszy lub równy 4.

2. Rozcieńczenie surowego ekstraktu 1:5 buforem do kolumny z 0,25% Tween 20. Nałożenie rozcieńczonego surowego ekstraktu przy przepływie [ 10x (średnica kolumny w cm)2] ml/godzinę. Daje to około 1 ml/minutę dla kolumny 2,5 cm2. Rozcieńczenie ekstraktu ma na celu zmniejszenie stężenia białka do około 2,5 mg/ml. Jeżeli surowy ekstrakt jest mniej stężony nie

184 202 trzeba go rozcieńczać tak bardzo. Zasadąjest, aby 1 g wilgotnej masy komórek dawał około 120 mg białka.

3. Przepłukanie kolumny 2 objętościami buforu do kolumny z 0,25% Tween 20.

4. Przepłukanie kolumny 3 objętościami buforu do kolumny bez Tween 20.

5. Elucja białka fuzyjnego „MBP-CINA₅1₅” buforem do kolumny z 10 mM maltozą i 0,1% SDS (ewentualnie 10 mM β-merkaptoetanolem, 1 mM EGTA). Zebranie 10-20 frakcji po 3 ml. Badanie frakcji na obecność białka, np. metodą Bradforda albo absorbcją A₂₆₍₎, Frakcje zawierające białko fuzyjne zawierają łatwo wykrywalne białko. Białko fuzyjne ulega elucji zaraz po wypełnieniu kolumny objętością kolumny.

POŻYWKI I ROZTWORY *Bogata pożywka z glukozą i ampicyliną - na litr: 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 2 g glukozy. Autoklawować; dodać sterylnie ampicyliny do stężenia 100 pg/ml.

* Roztwór 0,1 MIPTG: 1,41 g IPTG (izopropylo-p-o-tiogalaktozyd); dodać wody do 50 ml. Przefiltrować i wysterylizować.

* 0,5 M bufor fosforanu sodu, pH 7,2 (roztwór wyjściowy):

(A) 69,0 g NaH₂PO₄H₂O w 1 litrze H₂O.

(B) 70,9 g NB2 HPO₄H₂O w 1 litrze H₂O.

Zmieszać 117 ml (A) i 383 ml (B). pH roztworu powinno wynosić ~7,2. Rozcieńczony do 10 mM w buforze do kolumny powinien mieć pH 7,0.

BUFOR DO LIZY

Na litr

Stężenie końcowe ml 0,5 M Na₂HPO₄ 1,75 g NaCl 10 ml 25% Tween 20 0,7 ml β-merkaptoetanolu („β-ME”) (ewentualnie) ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)

W ml 1M EGTA (pH 7,0)

Dodać HC1 albo NaOH do pH 7,0 mM fosforan 30 mM NaCl 0,25% Tween 20 10 mM β-ME mM EDTA 10 mM EGTA

BUFOR DO KOLUMNY

Na litr

Stężenie końcowe ml 0,5 M fosforanu sodu, pH 7,2

29,2 gNaCl

1ml 1 M azydku sodu

0,7 ml β-ME (ewentualnie)

1ml 1M EGTA (pH 7) (ewentualnie) Ustalić pH 7,0 jeżeli to konieczne.

mM fosforan 0,5 M NaCl mM azydek 10 mM β-ME 1 mM EGTA

BUFOR DO KOLUMNY, O NISKIM STĘŻENIU SOLI

Na litr ml 0,5 M fosforanu sodu pH 7,2 1,75 g NaCl

Stężenie końcowe mM fosforan 30 mM NaCl

184 202 ml 1 M azydku sodu

0,7 ml β-merkaptoetanolu (ewentualnie) 1 ml 1 M EGTA (pH 7) (ewentualnie) Ustalić pH 7,0 jeżeli to konieczne.

mM azydek 10 mM (3ME 1 mM EGTA

Czystość fuzyjnego białka heterologicznego inhibina-MBP, „MBP-cINA^” po przepuszczeniu przez kolumnę pokazano na figurze 1, kolumny „E”. Kolumna oznaczona ,,F pokazuje eluent z kolumny gdy nie nałożono na kolumnę białka heterologicznego (kontrola negatywna). Kolumny oznaczone „B” przedstawiają standard wektora plazmidowego pMAL™-c. Kolumny oznaczone „C” są standardem ciężaru cząsteczkowego. Kolumny oznaczone „D” przedstawiają wektor pMAL™-c zastosowany do wykonania fuzyjnego białka heterologicznego kurza inhibina-MBP, „MBP-cINA515”, przed wprowadzeniem genu inhibiny jak to opisano w przykładzie 2. Powyższe białka poddano elektroforezie na żelu SDS-PAGE w buforze do SDS-PAGe i zabarwiono błękitem Coomassie.

Przykład 3

Sposób immunizacji strusia na inhibinę

Poniżej opisano sposób immunizacji strusia na inhibinę. Wstępną immunizację podano strusiowi około sześciu miesięcy przez pierwszym sezonem składaniajaj, zaś immunizację przypominające podawano w odstępach miesięcznych przez sześć miesięcy. Nawiązując, korzystne jest podanie strusiowi pierwszej immunizacji w wieku 18 do 24 miesięcy. Wstępna immunizacja zawiera od około 1,5 do 3,0 mg fuzyjnego białka heterologicznego zawierającego kurzą inhibinę (fragment podjednostki a) i białko wiążące maltozę, wytworzone w przykładach 1 i 2. Immunizacje przypominające zawierały od około 0,75 do 1,5 mg fuzyjnego białka heterologicznego. Fuzyjne białko heterologiczne emulgowano w kompletnym adjuwancie Freunda (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) podczas immunizacji wstępnej i w niekompletnym adjuwancie Freunda (Sigma) podczas immunizacji przypominających.

Kompozycję fuzyjnego białka heterologicznego wstrzykiwano podskórnie w trzy miejsca wzdłuż górnego regionu uda strusia.

Przykład 4

Sposób produkcji przeciwciał strusich skierowanych swoiście przeciwko inhibinie.

Poniżej podano sposób produkcji przeciwciał strusich („strusich przeciwciał przeciwko kurzej inhibinie”) skierowanych swoiście przeciwko białku heterologicznemu według wynalaz ku zawierającemu inhibinę kurzą i białko wiążące maltozę. W szczególności, przeciwciała strusie są przeciwciałami IgG, białko heterologiczne jest fuzyjnym białkiem heterologicznym zawierającym inhibinę kurząi białko wiążące maltozę, wytworzenie którego opisano w przykładach 1i 2. W celu wytworzenia przeciwciał, immunizowano strusia według sposobu opisanego w przykładzie 3. Ilość podawana strusiowi musi być wystarczająca do wywołania odpowiedzi odpornościowej strusia przeciwko białku heterologicznemu. Pobrano około 5 ml krwi strusia, a następnie izolowano przeciwciała skierowane swoiście przeciwko inhibinie. Do izolacji przeciwciał może być zastosowany każdy sposób znany w dziedzinie wiedzy. Korzystnie, stosowana jest standardowa technika ELISA.

Przykład 5

Sposób produkcji przeciwciał owczych swoiście skierowanych przeciwko strusim przeciwciałom

Poniżej przedstawiono sposób wytwarzania przeciwciał owczych skierowanych swoiście przeciwko klasie przeciwciał strusich, włączywszy przeciwciała wytworzone w przykładzie 4, w szczególności strusich przeciwciał IgG. W tym sposobie owcę immunizuje się przy użyciu 0,5 do 3,0 mg strusich IgG, w taki sposób, że uo wcy wywoływana jest odpowiedź odpornościowa przeciwko strusim IgG. Strusie IgG uzyskuje się z pul surowic od różnych strusi. Od owcy uzyskuje się krew, po czym IgG przeciw strusie izolowane są z próbki przy zastosowaniu standardowych technik dobrze znanych w dziedzinie.

184 202

Pula surowic oczyszczana jest przy zastosowaniu standardowych technik obejmujących precypitację 50% siarczanem amonu i frakcjonowanie przy użyciu kolumny z sepharozą-białkiem A. Korzystnie, precypitację IgG przeprowadza się, jak to opisano poniżej. Dwanaście mililitrów surowic zawierających IgG rozcieńcza się 1:1 50 mM Tris (pH 8,0). Następnie, dodaje się 24 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu powoli, ciągle mieszając (w 4°C) poczym mieszaninę miesza się przez 2 godziny. Mieszaninę odwirowuje się przy 10000 rpm przez 10 minut w celu zebrania precypitatu. Precypitat rozpuszcza się w 50 mM Tris w roztworze fizjologicznym soli (12 ml) i dializuje przez noc wobec 2150 mM Tris w 4°C, aby objętość końcowa wynosiła 20 ml.

Korzystnie, kolejne frakcjonowania przeprowadza się przy użyciu kolumny sepharozabiałko A, w następujący sposób. Kolumna zawiera sepharozę-białko A CL-4B (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Na kolumnę nakłada się około 5 ml surowicy precypitowanej siarczanem amonu. Próbce umożliwia się związanie z białkiem A-sepharozą przez około 30 minut. Następnie, kolumnę przepłukuje się 0,1 M buforem fosforanowym (pH 7,5), po czym eluuje się związane IgG przy użyciu 0,1 M glicyny (pH 2,8). Na koniec, eluowane frakcje neutralizuje się przez dodanie kilku kropli 1M Tris-HCl (pH 9,0). Jakość oczyszczonych strusich IgG badanajest przez obrazowanie po elektroforezie żelowej SDS-PAGE, przed podaniem owcy.

Sposób immunizacji oraz zastosowane adjuwanty nie są kluczowe dla wynalazku, tak więc, mogą być zastosowane wszelkie sposoby oraz adjuwanty znane w dziedzinie wiedzy. Korzystnie, oczyszczone strusie IgG wstrzykuje się owcy podskórnie. Jest również korzystne podanie dawek przypominających w odstępach czterotygodniowych z zastosowanem niekompletnego adjuwantu Freunda. Korzystnie, oczyszczone IgG podawane są z kompletnym adjuwantem Freunda albo Huntefs Titermax (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Owca rozwija satysfakcjonującą odpowiedź odpornościową po trzech-czterech wstrzyknięciach.

Następnie pobiera się od owcy 5-10 ml krwi, i izoluje się z próbki krwi owcze przeciwciała skierowane przeciwko strusim IgG. Do izolacji owczych przeciwciał z próbki krwi może być zastosowana każda metoda znana w dziedzinie wiedzy. Korzystnym sposobem izolacji przeciwciał owczych z próbki jest przepuszczenie próbki krwi przez kolumnę ze strusimi IgG. Owcze przeciwciała mogąbyć zebrane z kolumny przez przepłukanie kolumny buforem glicynowym o pH 8,0.

Przykład 6

Sposób śledzenia odpowiedzi odpornościowej strusia po szczepieniu fuzyjnym białkiem heterologicznym.

Poniżej przedstawiono sposób śledzenia odpowiedzi odpornościowej strusia po szczepieniu fuzyjnym białkiem heterologicznym zawierającym kurzą inhibinę oraz białko wiążące maltozę wy tworzone w przykładach 1i 2, które odbywa się z zastosowaniem przeciwciał owczych wykonanych w przykładzie 5. W celu określenia czy struś zareagował immunologicznie na fuzyjne białko heterologiczne inhibina-MBP, białko heterologiczne wiązanejest z podłożem stałym. Następnie, pobiera się 5-10 ml krwi strusia immunizowanego białkiem heterologicznym i oddziela surowicę krwi. Doprowadza się do kontaktu unieruchomionego białka heterologicznego z surowicą, w warunkach, w których białko heterologiczne swoiście oddziaływuje z wszystkimi przeciwciałami przeciwko inhibinie znajdującymi się w surowicy. Po przepłukaniu, dodaje się wytworzonych w przykładzie 5 przeciwciał owczych, znakowanych HRP. Znakowane przeciwciała owcze swoiście oddziaływują z przeciwciałami strusimi związanymi z unieruchomionym białkiem heterologicznym. Po usunięciu niezwiązanych znakowanych przeciwciał, obecność i ilość związanych przeciwciał owczych, znakowanych HRP, oznaczana jest przez obrazowanie HRP. Korzystnie, znacznik jest obrazowany przez dodanie substratu hRp, Nitro Blue Tetrazolium („NBT”).

Specjaliści w dziedzinie wiedzy rozumieją, że techniki testów immunologicznych, stosowane w powyższym sposobie są dobrze znane w dziedzinie wiedzy. Stąd, w powyższym sposobie mogą być zastosowane dowolne techniki testów immunologicznych, znaczniki i sposoby obrazowania. Korzystnym testem immunologicznym jest ELISA, zaś korzystnym znacznikiem jest peroksydaza chrzanowa. Innym korzystnym znacznikiem są kolorowe perełki lateksowe.

184 202

Przykład 7

Sposób określania potencjału rozrodczego strusia.

Poniżej przedstawiono sposób określania potencjału rozrodczego strusia przez oznaczanie ilości inhibiny we krwi strusia. Stężenia krążącej inhibiny we krwi strusią mogą być oznaczone przy zastosowaniu standardowej techniki kanapkowej ELISA. Po pierwsze, należy związać przeciwciała przeciwko inhibinie, wytworzone w przykładzie 4, ze studzienkami płytki. Po przepłukaniu i zablokowaniu płytki, do studzienek płytki dodaje się pewnąilość osocza lub surowicy krwi strusia. Po umożliwieniu związania się inhibiny w próbce, o ile się tam znajduje, z unieruchomionymi przeciwciałami przeciwko inhibinie, próbkę wypłukuje się ze studzienki. Następnie, dodaje się do studzienki innego przeciwciała przeciwko inhibinie niż to wytworzone w przykładzie 4, skonjugowane z peroksydazą chrzanową. Skonjugowane z HRP przeciwciało przeciwko inhibinie różni się od unieruchomionego przeciwciała przeciwko inhibinie tym, że jest skierowane swoiście przeciwko innej części inhibiny. Po umożliwieniu znakowanemu przeciwciału swoistego związania się z unieruchomioną inhibiną, niezwiązane znakowane przeciwciało usuwanejest przez wypłukanie. Ilość inhibmy obecnej w próbce osocza określana jest przez dodanie do studzienki NBT i obrazowanie ilości unieruchomionego znakowanego przeciwciała przeciwko inhibinie w studzience. Standardowe pozytywne i negatywne kontrole przeprowadza się równolegle w sąsiadujących studzienkach. W dziedzinie wiedzy znane są liczne techniki testów immunologicznych, znaczników i sposobów obrazowania. Nawiązując, każda technika testu immunologicznego, znacznik i technika obrazowania może być zastosowana w wynalazku.

Przykład 8

Sposób przyspieszania rozpoczęcia składaniajaj u przepiórek.

Jak stwierdzono powyżej, klon cDNA pojednostki a kurzej inhibiny (cINA6) wprowadzony w miej see EcoRI plazmidu pBlu-escript otrzymano w darze od P. A. Johnsona (Cornell University). Fragment DNA („cINA5₁₅”) wycięto z klonu cINA6 przez trawienie Pstl. Fragment DNA cINAsis obejmuje większość dojrzałej podjednostki a kurzej inhibiny. Fragment ten (cINA515) wklonowao do plazmidu pMAL™-c w jednej ramce odczytu z białkiem wiążącym maltozę („MBP”) zaś białko fuzyjne o odpowiedniej wielkości (ścieżka E; figura 1) wykrywano po indukcji IPTG (izopropyle β-D-tiogalaktopiranozyd) iS DS-PAGE. Powstały konjugat białkowy („MBP-cINA515”) zastosowanojako antygen do immunizacji niedojrzałych samic przepiórki japońskiej (Coturnix. coturnlxjaponica), przeciwko krążącej inhibinie, jak to opisano poniżej.

Przepiórki w fazie krezki inkubowano w przystosowanym dla przepiórek inkubatorze Petersime Model 2S-D. Początkowa temperatura inkubacji wynosiła około 37,8°C z cotygodniowym obniżaniem o około 2,8°C aż do osiągnięcia temperatury otoczenia. W okresie wzrostu (tzn. do osiągnięcia wieku 6 tygodni), dostarczano przepiórkom początkową karmę dla przepiórek (28% CP, 2800 kcal ME/kg pożywienia) i wodę ad libitum, oraz stałe oświetlenie (22 1x) w cyklu 14 godzin światła (280 do 300 1x) i 10 godzin ciemności. W 25 dniu życia 100 przepiórek rozdzielono losowo do czterech grup (po 25 ptaków w grupie) jak następuje:

(1) MBP-cINA51₅ w p-(1,4) sieciowanym acetylomannanie („Acemannan”), nośniku immunostymulującym, („MBP-cINA₅₁5/ACE”), (2) MBP-cINA₅1 w adjuwancie Freunda („MBP-cINA515/FRN), (3) A-cemannan (kontrola immunostymulatora; „ACE”) i (4) adjuwant Freunda (kontrola adjuwantu; „FRN”). Ptakom immunizowanym w stosunku do inhibiny (grupa 1 i 2) podawano po około 0,75 mg MBP-cINA515 dziennie na ptaka w odpowiednim nośniku kontrolnym. Równowartość objętości odpowiedniego nośnika (0,2 ml) ACE albo FRN stosowano odpowiednio w grupach 1 i 3 oraz grupach 2 i 4. Wszystkie wstrzyknięcia podawano podskórnie przy użyciu strzykawek tuberkulinowych z igłą 25 ga. Po wstępnym wstrzyknięciu przepiórki zaobrączkowano w celu identyfikacji, zanim zostaną rozdzielone indywidualnie do klatek nieśnych. Następnie podawano cotygodniowe immunizację przypominające po około 0,375 mg MBP-cINAj^na ptaka albo odpowiedniej kontroli, podawano przez kolejne pięć tygodni (tzn. w 32,39,46,53160 dniu życia).

184 202

Począwszy od 6 tygodnia życia przepiórkom podawano karmę dla przepiórek znoszących jaja (21% CP, 2750 kcal ME/kg pożywienia) oraz wodę ad libitum.

Począwszy od 41 dnia życia (w odniesieniu do 1 Dnia cyklu składaniajaj) odnotowywano pomiary dziennej produkcji jaj przez kurę („HDEP”) i śmiertelność („MORT”) przez kolejne 12 tygodni. Dodatkowo, dla każdej grupy wyliczono średni wiek złożenia pierwszego jaja („FIRST”) oraz wiek, gdy kura osiągnęła 50% zdolności znoszenia jaj („FIFTY”).

Dane dziennej produkcji jaj przez kurę poddano dwum różnym analizom wariancji („ANOVA”), z których każda miała całkowicie losowy układ z przyporządkowaniem rodzajów traktowania typu „split-plot”. W pierwszym z testów ANOVA, główny wykres składał się z czterech grup poddanych różnemu traktowaniu (MBP-cINA515/aCe, MBP-cINA515/FRN, ACE albo FRN) i 12 okresów po 7 dni z których każdy obejmował podział. W drugim teście ANOVA, aby lepiej sprawdzić wpływ neutralizacji immunologicznej inhibiny w stosunku do kontroli, połączono dane z dwóch immunizacji inhibin;^ą i dane z dwóch kontroli. Tak więc, główny wykres składał się z dwóch grup poddanych różnemu traktowaniu (połączone MBP-cINA515/ACE i MBP-cINA515/FRN w stosunku do ACE i FRN) i 12 okre sów po 7 dni z których każdy obejmował podział.

Do tej pory zebrano jedynie wstępne dane z 35 dni. Skumulowane procentowe odsetki HDEP dla tygodniowych odstępów składaniajaj (dni 0,7,14,21 i 35) podczas pierwszych 35 dni badania wykreślono na figurze 2 (na której każdą z grup traktowano osobno) oraz figurze 3 (na której porównano grupy nieimmunizowane (kontrolne) w stosunku do grup immunizowanych inhibiną). Średnie tempa HDEP podczas tygodnia 1, tygodnia 2, tygodnia 3, tygodnia 4 i tygodnia 5 oraz tygodni od 1do 5 połączone dla wszystkich grup traktowanych jak niezależne traktowanie podano w tabeli 2.

Tabela 3 pokazuje średni HDEP w procentach w tych samych ramkach czasowych co w tabeli 2, ale w postaci danych pulowanych do bezpośredniego porównania kontroli w stosunku do immunizowanych. Tabela 4 zawiera dane FIRST dotyczące składaniajaj dla obu scenariuszy statystycznych (tzn. porównania dla czterech grup oraz danych połączonych).

Tabela 2

Wpływ neutralizacji immunologicznej inhibiny przy zastosowaniu produktu fuzyjnego białko wiążące maltozę-podjednostka a kurzej inhibmy (MBP-CINA515) na średnią (±SE) dziennej produkcji jaj przez kurę (%) u przepiórki japońskiej

Traktowanie	Tydzień 1	Tydzień 2	Tydzień 3	Tydzień 4	Tydzień 5	Tygodnie 1-5
Acemannan (ACE	5,82±2,78ab	39,56±7,19	70,33±7,92	78,02±6,69a	82,97±6,44	53,33*5,4
Adj Freunda (FRN)	2,65±2,16a	28,57±6,73	61,90±7,7	79,67±7,f	90,29±5,2	51,03±4,77
MBP-cINA515/ACE	12,64*4,29* b	43,40±8,14	66,48±8,08	76,92±6,29a	85,71±5,98	57,03±5,24
MBP-CINA515/FRN	16,48±5,7b	50,00±7,65	74,86±5,61	96,57±1,7b	94,29±3,19	64,73±3,91

’ oznacza różnice w średnich w kolumnie na poziomie (p<0,05) ±SE = Standard Error

Tabela 3

Wpływ neutralizacji immunologicznej inhibiny przy zastosowaniu produktu fuzyjnego białko wiążące maltozę-podjednostka a kurzej inhibmy (MBP-cINA515) na średnią (±SE) dziennej produkcji jaj przez kurę (%) u przepiórki japońskiej (dane połączone)

Traktowanie’	Tydzień 1	Tydzień 2	Tydzień 3	Tydzień 4	Tydzień 5	Tygodnie 1-5
Kontrola	4,23±1,76a	33,96±4,93J	66,04±5,5	78,85±4,83	86,55±4,14	52,18±3,57x
Immunizacja	14,56±3,54b	46,7±5,55k	70,59±4,94	86,55±3,57	89,92±3,44	60,88±3,28y

*

Kontrola = połączone dane Acemann (ACE) 1 Adj. Freunda (FRN) Immunizacja = połączone dane MBP-CINA515/ACE 1 MBP-CINA515/FRN A’^b (P< 0,0095), ^J’^k (P<0,0888), ^x’^y (P<0,0763) ±SE = Standard Erro

184 202

T a b e la 4

Wpływ neutralizacji immunologicznej inhibmy przez zastosowanie produktu fuzyjnego - białko wiążące maltozę-podjednostka a kurzej inhibmy (MBP-CINA515) na średni (±SE) wiek złozenia pierwszego jaja (FIRST) u przepiórki japońskiej

Traktowanie*	FIRST (dni życia)
Acemannan (ACE)	54,92 ± 1,77^
Adj. Freuda (FRN)	55,73 ± 1,58a
MBP-CINA515/ACE	53,58 ±1,81ab
MBP-CINA515/FRN	50,38 ± 1,08b
Kontrola	55,33 ±1,17*
Immunizacja	51,98 ± 1,07y

*Kontrola = połączone dane Acemannan (ACE) i Adj. Freunda (FRN)

Immumzacja = połączone dane MBP-crNA515ZA.CE 1 MBP-CINA515 /FRN a^b (P<0,05),^x,y (P<0,0373)

SE = Standard Error

Jak dotąd, śmiertelność nie stanowiła problemu, ponieważ padły tylko cztery ptaki (trzy kontrole i jeden immunizowany). Taka śmiertelność (4%) mieści się w oczekiwanych granicach dla przepiórek, które osiągnęły 76 dzień życia. Dodatkowo, występowanie jaj o cienkiej skorupie, bez skorupy czy uszkodzonych była niska, mieszcząca się w normalnej częstości występowania i rozłożone równomiernie we wszystkich czterech grupach (tzn. immunizacja na inhibinę nie zmieniała liczby uszkodzonych jaj).

Początkowy pozytywny wpływ neutralizacji immunologicznej inhibiny na wydajność produkcj i utrzymał się. Wpływ ten był szczególnie wyraźny w połączonych danych HDEP (tabela 3)

FIRST (tabela 4), gdzie zwiększone liczby obserwacji zwiększały siłę zastosowanego testu statystycznego.

Dane pokazują że wystąpienie dojrzałości w grupach immunizowanych inhibiną było przyspieszone. Dowodzą tego zebrane dane HDEP i FIRST. Stwierdzono wysoki poziom istotności statystycznej (P<0,0095) w połączeniu z wyższą średnią HDEP stwierdzoną u przepiórek immunizowanych inhibinąpodczas tygodnia 1 badania, która to różnica zacierała się w tygodniu (P<0,0888) (tabela 3). Różnica ta w krańcowej postaci obserwowana w tygodniu 2 może oznaczać, że składanie jaj, jakkolwiek opóźnione, zaczynało się nasilać w kontrolnej grupie przepiórek (patrz figura 2). W następstwie powyższego, siła różnicy statystycznej stwierdzanej pomiędzy obiema grupami (inhibma w stosunku do kontroli) podczas tygodnia 1 stawała się słabsza wraz z upływem czasu składaniajaj. W rzeczywistości, po połączeniu danych z tygodni od 1do 5, stwierdzono w grupie kur immunizowanych inhibiną znacznie wyższą średnią HDEP o średnim poziomie istotności statystycznej (P<0,0763).

Również średni wiek, w którym immunizowana przepiórka (51,98 dni) składała pierwsze jajo (FIRST) był skrócony (P<0,0373) o ponad 3 dni w porównaniu z przepiórkami nieimmunizowanymi (55,33 dni) (tabela 4). Ten wpływ immunizacji inhibiną na przyspieszenie składania jaj był szczególnie wart odnotowania u przepiórek traktowanych MBP-cINA₅1₅/FRN, których średnia FIRST wynosiła 50,38 dni (tabela 4).

Przykład 9

Sposób przyspieszania rozpoczęcia składaniajaj u strusi.

Konjugat białkowy (MBP-cINA5j5) zastosowanojako antygen w celu immunizacji niedojrzałych samic strusi przeciwko krążącej inhibinie i w ten sposób przyspieszono rozpoczęcie składaniajaj przez immunizowane strusie. Postępowano w sposób opisany w przykładzie 8 z następującymi wyjątkami. Średni wiek osiągnięcia dojrzałości u strusi wynosi od 28 do 32 miesię36

184 202 cy. Poniżej podano schemat podawania dla strusi o średnim ciężarze od 70 do 140 kilogramów: wstępne (pierwsze) wstrzyknięcie 5,0 mg białka heterologicznego według wynalazku w 26 miesiącu życia i dawki przypominające po 2,5 mg w 27, 28, 30, 32, 34 i 36 miesiącu życia.

Przykład 10

Sposób przyspieszania rozpoczęcia składania jaj przez emu.

Konjugat białkowy (MBP-cINA₅i₅) zastosowano jako antygen w celu immunizacji niedojrzałych samic emu przeciwko krążącej inhibinie i w ten sposób przyspieszono rozpoczęcie składaniajaj przez immunizowane emu. Postępowano w sposób opisany w przykładzie 8 z następującymi wyjątkami. Średni wiek osiągnięcia dojrzałości u emu wynosi około 20 miesięcy. Poniżej podano schemat podawania dla emu o średnim ciężarze od 22,5 do 41 kilogramów: wstępne (pierwsze) wstrzyknięcie 3,0 mg białka heterologicznego według wynalazku w 18 miesiącu życia i dawki przypominające po 1,5 mg w 19, 20, 22, 24, 26 i 30 miesiącu życia.

Przykład 11

Sposób przyspieszania rozpoczęcia składania jaj przez kury.

Konjugat białkowy (MBP-cINA5i5) zastosowanojako antygen w celu immunizacji niedojrzałych samic kury domowej przeciwko krążącej inhibinie i w ten sposób przyspieszono rozpoczęcie składania jaj przez immunizowane kury. Postępowano w sposób opisany w przykładzie 8 z następującymi wyjątkami. Średni wiek osiągnięcia dojrzałości u kury domowej wynosi około 20 tygodni. Poniżej podano schemat podawania dla kur o średnim ciężarze od 0,9 do 1,6 kilogramów: wstępne (pierwsze) wstrzyknięcie 1,5 mg białka heterologicznego według wynalazku w 15 tygodniu życia i dawki przypominające po 0,75 mg w 17, 20, 24, 30, 40 i 50 tygo dniu życia.

Przykład 12

Sposób przyspieszania rozpoczęcia składania jaj przez int^b^ł<i.

Konjugat białkowy (MBP-cINA₅i₅) zastosowanojako antygen w celu immunizacji niedojrzałych samic indyka przeciwko krążącej inhibinie i w ten sposób przyspieszono rozpoczęcie składaniajaj przez immunizowane indyczki. Postępowano w sposób opisany w przykładzie 8 z następującymi wyjątkami. Średni wiek osiągnięcia dojrzałości u indyków wynosi około 30 tygodni. Poniżej podano schemat podawania dla indyków o średnim ciężarze od 4 do 5,5 kilogramów: wstępne (pierwsze) wstrzyknięcie 2,0 mg białka heterologicznego według wynalazku w 28 tygodniu życia i dawki przypominające po 1,0 mg w 29, 30, 34, 38, 46 i 54 tygodniu życia .

Przykład 13

Sposób przyspieszania rozpoczęcia składania jaj przez papugi.

Konjugat białkowy (MBP-cINA₅i5) zastosowanojako antygen w celu immunizacji niedojrzałych samic papugi przeciwko krążącej inhibinie i w ten sposób przyspieszono rozpoczęcie składaniajaj przez immunizowane papugi. Postępowano w sposób opisany w przykładzie 8 z następującymi wyjątkami. Średni wiek osiągnięcia dojrzałości u papug wynosi około 30 miesięcy. Poniżej podano schemat podawania dla papug o średnim ciężarze od 0,22 do 0,6 kilograma: wstępne (pierwsze) wstrzyknięcie 0,75 mg białka heterologicznego według wynalazku w 28 miesiącu życia i dawki przypominające po 0,375 mg w 29, 30, 32, 34, 36 i 38 miesiącu życia.

Powinno być zrozumiałe, że powyższe dotyczy wyłącznie najkorzystniejszych wykonań niniejszego wynalazku oraz, że mogą być uczynione liczne modyfikacje czy odmiany bez oddalania się od ducha i zakresu wynalazku jak to określono w dołączonych zastrzeżeniach patentowych.

184 202

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(1) ZGŁASZAJĄCY: Fioretti, William C.

Kausoulas, Konstantin Satterlee, Daniel G.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Kompozycje inhibiny i sposoby ich zastosowania (iii) LICZBA SEKWENCJI: 4 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Jones & Askew (B) ULICA: 191 Peachtree Street, 37th Floor (C) MIASTO: Atlanta (D) STAN: Georgia (E) KRAJ: USA (F) KOD: 30303-1769 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka, 3,5 (B) KOMPUTER: Macldntosh (C) SYSTEM OPERACYJNY: System 7,0 (D) OPROGRAMOWANIE: Microsoft Word.

(vi) DANE DOT. OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOT. POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/202,964 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28 lutego 1994 (viii) INFORMACJA O RZECZNIKU:

(a) NAZWISKO: Roxane Edwards Cenatempo (B) NUMER REJESTRACYJNY: 38,767 (C) NUMER SPRAWY: 01051 -0111 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: 404-818-3700 (B) TELEFAX: 404-818-3799 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 515 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI:

G CGC CCA TCG GAG GAC GTG GCC GCC CAC ACC AAC TGC CGC CGG GCG 46 TCC CTC AAC ATC TCT TTC GAG GAG CTG GGC TGG GAC AAT TGG ATC GTG 94 CAC CCC AGC AGC TTC GTT TTC CAC TAC TGC CAC GGG AAC TGT GCC GAA 142 GGC GAC GGG CTG AGC CAC CGG CTG GGG GTG CAG CTG TGC TGC GCC GCG 190 CTG CCC GGC ACC ATG CGC TCA CTG CGT GTC CGC ACC ACC TCT GAT GGT 238 GGC TAC TCC TTC AAG TAC GAG ACG GTG CCC AAC ATC CTG GCG CAG GAC 286 TGC ACC TGT GTC TAG C 302

AGCTGGC ATGCACGGCC AGACCCGCGT GGATCTCCCC GTTGCCTCTG 359

GACTCCCCA

GTGCCAGATG ATGAGCCCAT CCCAGGGATG GAGGAGTCAC TCACACGGGC 419

ACTGCGCAGC

184 202

CCGGAGCAGG GAGAGGGACC CAGGTGGAAG TTTTGGTGGT GCCACCCTCC 479 CTTTGACTGC

CAGGGTTTCA TGGTTTCAGG TTGCGTGGGT GCTGCA 515 (3) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 99 reszt aminokwasowych (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI:

Arg Pro Ser Glu Asp Val Ala Ala His Thr Asn Cys Arg Arg Ala 11

Ser Leu Asn Ile Ser Phe Glu Glu Leu Gly Trp Asp Asn Trp Ile Val 31

His Pro Ser Ser Phe Val Phe His Tyr Cys His Gly Asn Cys Ala Glu 44

Gly Asp Gly Leu Ser His Arg Leu Gly Val Gin Leu Cys Cys Ala Ala 66

Leu Pro Gly Thr Met Arg Ser Leu Arg Val Arg Thr Thr Ser Asp Gly 77

Gly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Ile Leu Ala Gin Asp 95

Cys Thr Cys Val 99 (4) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 516 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI:

GCGC CCA TCG GAG GAC GTG GCC GCC CAC ACC AAC TGC CGC CGG GCG 4(6

TCC CTC AAC ATC TCT TTC GAG GAG CTG GGC TGG GAC AAT TGG ATC GTG 99

CAC CCC AGC AGC TTC GTT TTC CAC TAC TGC CAC GGG AAC TGT GCC GAA 112

TGG CCA CGG GCT GAG CCA CCG GCT GGG GGT GCA GCT GTG CTG CGC CGC 119

BGCT GCC CGG CAC CAT GCG CTC ACT GCG TGT CCG CAC CAC CTC TGA 223 TGGTGGCTAC TCCTTCAAGT ACGAGACGGT GCCCAACATC CTGGCGCAGG 228 ACTGCACCTG TGTCTAGCAG CTGGCATGCA CGGCCAGACC CGCGTGGATC 333 TCCCCGTTGC CTCTGGACTG CCCCAGTGCC AGATGATGAG CCCATCCCAG 335 GGATGGAGGA GTCACTCACA CGGGCACTGC GCAGCCCGGA GCA GGGA GAG 435 GGACCCAGGT GGAAGTTTTG GTGGTGCCAC CCTCCCTTTG ACTGCCAGGG 485 TTTCATGGTT TCAGGTTGCG TGGGTGCTGC A 5H (5) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 77 (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(d) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI:

Arg Pro Ser Glu Asp Val Ala Ala His Thr Asn Cys Arg Arg Ala U

Ser Leu Asn Ile Ser Phe Glu Glu Leu Gly Trp Asp Asn Trp Ile Val 3 3

His Pro Ser Ser Phe Val Phe His Tyr Cys His Gly Asn Cys Ala Glu 44

Trp Pro Arg Ala Glu Pro Pro Ala Gly Gly Ala Ala Val Leu Arg Arg 66

Ala Ala Arg His His Ala Leu Thr Ala Cys Pro His His Leu 77

184 202

184 202

FIG. 2

Dni

-1-1-1-1-1-1-1-1-1- O

OOOOOOOOOOo oooor^coin^tcnojf(%)d3QH

184 202

FIG.3

•O

Ό

CO +

c •H c

c

CO ε

<u o

co

·· co
on C	Ό
CO	C
Ό	3
Φ	Φ U
C Cu

o

N

O

CO fM

O a

li co i—I O L. -P C O bd

Immunizacja = połączone dane MBP-cINA515/ACE i MBP-cINA515/FRN (%) d3QH

184 202

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (38)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nieterapeutyczny sposób zwiększania zdolności produkcyjnej ptaka, znamienny tym, że obejmuje podawanie ptakowi skutecznej ilości białka heterologicznego obejmującego białko ptasiej inhibiny, alboj ego immunogenny fragment, oraz białko nośnikowe, przy czym białko ptasiej inhibiny albo jego immunogenny fragment obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 2 albo 4.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ptak wybrany jest z grupy obejmującej strusiowate, papugowate, drapieżne, dzięciołowate, sowowate, kraskowate, ralliformes, wróblowate, kukułkowate, gołębiowate, kuraki, blaszkodziobe oraz herodiones.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że strusiowaty jest wybrany z grupy składającej się ze strusia, emu, strusia pampasowego, kiwi albo kazuara.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ptakjest wybrany z grupy składającej się z kury domowej, indyka, papugi, papugi długoogonowej makaw, sokoła, orła, przepiórki,ja-trzębia, gołębia, kukułki, słowika, kakadu, sójki, szpaka, zięby, gajówki, skowronka i wróbla.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko nośnikowe wybrane jest z grupy składającej się z białka wiążącego maltozę, albuminy surowicy bydlęcej, owalbuminy, flagelliny, hemocyjaniny skałoczepa, albuminy surowicy, gammaglobuliny oraz polimerów aminokwasów.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zwiększonajest produkcjajaj przezptaka.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że ptakiem jest przepiórka, indyk, kura, papuga albo strusiowaty.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podawanie skutecznej ilości białka heterologicznego obejmuje podawanie ptakowi od około 0,1 mg do 10,0 mg białka heterologicznego.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że podawanie skutecznej terapeutycznie ilości białka heterologicznego obejmuje podawanie ptakowi od około 0,3 mg do 5,0 mg białka heterologicznego.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że podawanie skutecznej terapeutycznie ilości białka heterologicznego obejmuje podawanie ptakowi od około 0,3 mg do 3,0 mg białka heterologicznego.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dalej obejmuje podawanie jednego albo wielu wstrzyknięć ptakowi od około 0,3 mg do około 2,0 mg białka heterologicznego.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że dalej obejmuje podawanie jednego albo wielu wstrzyknięć ptakowi od około 0,3 mg do około 1,5 mg białka heterologicznego.
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podawanie białka heterologicznego zachodzi przed dojrzewaniem.
14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podawanie białka heterologicznego zachodzi podczas dojrzewania.
15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białkiem heterologicznym jest fuzyjne białko heterologiczne.
16. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białkiem heterologicznymjest sprzęgnięte białko heterologiczne.
17. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dalej obejmuje podawanie adiuwantów, konserwantów, rozcieńczalników, emulgatorów albo stabilizatorów.
18. 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podawanie następuje po osiągnięciu dojrzałości.

    184 202
19. 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko ptasiej inhibiny albo jego immunogenny fragment obejmuje sekwencje aminokwasowąpodanąjako Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4.
20. 20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zwiększona jest ilość znoszonych jaj, przyspieszone jest rozpoczęcie skłat^^^^ajaj, przyspieszone jest osiągnięcie maksimum składaniajaj, zwiększona jest liczba jaj składanych w ciągu życia, zwiększone jest wytwarzanie jaj, zwiększona jest wydajność produkcji jaj, przedłużone jest trwanie składaniajaj, przyspieszone jest wystąpienie dojrzałości albo przyspieszone jest rozpoczęcia owulacji.
21. 21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ptasiąinhibinąjest podjednostka alfa ptasiej inhibiny.
22. 22. Fuzyjne białko heterologiczne obejmujące białko ptasiej inhibiny albo jego immunogenny fragment, poddany fuzji z białkiem nośnikowym, znamienne tym, że białko ptasiej inhibiny albo jego immunogenny fragment obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 2 albo 4.
23. 23. Fuzyjne białko heterologiczne według zastrz. 22, znamienne tym, że białko ptasiej inhibiny albo jego immunogenny fragment obejmuje podjednostkę alfa ptasiej inhibiny.
24. 24. Fuzyjne białko heterologiczne według zastrz. 22, znamienne tym, że białko nośnikowe wybrane jest spośród grupy składającej się z białka wiążącego maltozę, albuminy surowicy bydlęcej, owalbuminy, flagelliny, hemocyjaniny skałoczepa, albuminy surowicy, gammaglobuliny oraz polimerów aminokwasów.
25. 25. Sposób wytwarzania fuzyjnego białka heterologicznego, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

    (a) dostarczenie dwuniciowego cDNA kodującego ptasią inhibinę, albo jej fragment o Id. Sekw. nr 1 albo Id. Sekw. nr 3;

    (b) dostarczenie wektora kodującego informację do produkcji białka nośnikowego;

    (c) ligacja cDNA ptasiej inhibiny do wektora;

    (d) wprowadzanie ligowanego wektora do układu ekspresyjnego i (e) wyrażanie fuzyjnego białka heterologicznego zawierającego białko nośnikowe i białko ptasiej inhibiny o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4.
26. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że białko ptasiej inhibiny albo jego immunogenny fragment obejmuje podjednostkę alfa ptasiej inhibiny.
27. 27. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że cDNA inhibiny obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 1 albo Id. Sekw. nr 3.
28. 28. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że białko ptasiej inhibiny albo jego immunogenny fragment w wyrażanym fuzyjnym białku heterologicznym obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4.
29. 29. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że białko nośnikowe wybrane jest spośród grupy składającej się z białka wiążącego maltozę, albuminy surowicy bydlęcej, owalbuminy, flagelliny, hemocyjaniny skałoczepa, albuminy surowicy, gammaglobuliny oraz polimerów aminokwasów.
30. 30. Gen fuzyjny, kodujący gen do ekspresji białka inhibiny, albo jego immunogennego fragmentu, poddany fuzji z genem kodującym ekspresję białka nośnikowego, przy czym wyrażone białko inhibiny albojej immunogenny fragment poddany fuzji z białkiem nośnikowym zwiększa ilości znoszonychjaj, przyspiesza rozpoczęcie składaniajaj, przyspiesza osiągnięcie maksimum składaniajaj, zwiększa liczbę jaj składanych w ciągu życia, zwiększa wytwarzanie jaj, zwiększa wydajność produkcji jaj, przedłuża trwanie składaniajaj, przyspiesza wystąpienie dojrzałości albo przyspiesza rozpoczęcie owulacji po podaniu ptakowi skutecznej ilości, przy czym produkt obejmuje gen do ekspresji białka ptasiej inhibiny, albo jej immunogennego fragmentu, poddany fuzji z genem kodującym ekspresję białka nośnikowego, przy czym gen kodujący ekspresję białka ptasiej inhibiny albo jej immunogenny fragment koduje białko obejmujące sekwencję o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4 .
31. 31. Gen fuzyjny według zastrz. 30, znamienny tym, że białko nośnikowe wybrane jest spośród grupy składającej się z białka wiążącego maltozę, albuminy surowicy bydlęcej, owalbu4

    184 202 miny, flagelliny, hemocyjaniny skałoczepa, albuminy surowicy, gammaglobuliny oraz polimerów aminokwasów.
32. 32. Gen fuzyjny według zastrz. 30, znamienny tym, że gen kodujący ekspresję białka inhibiny, albo jej immunogennego fragmentu koduje podjednostkę alfa białka inhibiny.
33. 33. Komórka zawierająca wektor, który obejmuje sekwencję DNA kodująca białko inhibiny, albo jej immunogenny fragment, oraz białko nośnikowe, przy czym białko inhibiny albo jej immunogenny fragment poddany fuzji z białkiem nośnikowym zwiększa ilości znoszonych jaj, przyspiesza rozpoczęcie składamajaj, przyspiesza osiągnięcie maksimum skladaniajaj, zwiększa liczbę jaj składanych w ciągu życia, zwiększa wytwarzanie jaj, zwiększa wydajność produkcji jaj, przedłuża trwanie skladaniajaj, przyspiesza wystąpienie dojrzałości albo przyspiesza rozpoczęcie owulacji po podaniu ptakowi skutecznej ilości, przy czym białko ptasiej inhibiny albo jej immunogenny fragment ma sekwencję Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4.
34. 34. Wektor, który obejmuje sekwencję DNA kodującą białko inhibiny, albo jej immunogenny fragment, oraz białko nośnikowe, przy czym białko ptasiej inhibiny albo jego immunogenny fragment obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 2 albo 4 i poddane fuzji z białkiem nośnikowym zwiększa ilości znoszonych jaj, przyspiesza rozpoczęcie skladaniajaj, przyspiesza osiągnięcie maksimum skladaniajaj, zwiększa liczbęjaj składanych w ciągu życia, zwiększa wytwarzanie jaj, zwiększa wydajność produkcji jaj, przedłuża trwanie skladaniajaj, przyspiesza wystąpienie dojrzałości albo przyspiesza rozpoczęcie owulacji po podaniu ptakowi skutecznej ilości, przy czym produkt obejmuje gen do ekspresji białka inhibiny, albo jej immunogennego fragmentu, poddany fuzji z genem kodującym ekspresję białka nośnikowego.
35. 35. Wektor według zastrz. 34, znamienny tym, że sekwencja DNA koduje białko inhibiny, albo jej immunogenny fragment o sekwencji jak w Id. Sekw. nr 1 albo Id. Sekw. nr 3.
36. 36. Wektor według zastrz. 34, znamienny tym, że sekwencja DNA kodująca ekspresję białka inhibiny, albo jej immunogennego fragmentu koduje podjednostkę alfa białka inhibiny.
37. 37. Wektor według zastrz. 34, znamienny tym, że gen kodujący ekspresję białka inhibiny, albo jej immunogennego fragmentu koduje ptasią inhibinę.
38. 38. Wektor według zastrz. 34, znamienny tym, że białko nośnikowe wybrane jest z grupy składającej się z białka wiążącego maltozę, albuminy surowicy bydlęcej, owalbuminy, flagelliny, hemocyjaniny skałoczepa, albuminy surowicy, gammaglobuliny oraz polimerów aminokwasów.