JP6441567B2 - 小胞内のポリヌクレオチドを含む乳がん診断用組成物及びキット、並びにそれを利用した乳がん診断方法 - Google Patents

Description

本発明は、小胞内のポリヌクレオチドを含む乳がん診断用組成物及びキット、並びにそれを利用した乳がん診断方法に関する。

マイクロベシクルは、さまざまな種類の細胞に存在し、または細胞から分泌される、膜構造の微小な小胞である。細胞外に分泌されるマイクロベシクルは、（Ｉ）エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）：直径３０〜１００ｎｍの膜性小胞、（II）エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）（シェディング・マイクロベシクル（ＳＭＶｓ：ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）ともいう）：原形質膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）から直接放出される、直径５０〜１，０００ｎｍの大きい膜性小胞、（III）アポトーシス性水疱（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｌｅｂｓ）：死んで行く細胞から放出される直径５０〜５，０００ｎｍの小胞、を含む。

そのうち、エキソソームは、さまざまな種類の細胞から分泌される膜構造の微小小胞である。エキソソームの直径は、およそ３０〜１００ｎｍである。エキソソームは、電子顕微鏡を用いた研究により、原形質膜から直接放出されるのではなく、多嚢体（ＭＶＢｓ：ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ）と呼ばれる細胞内特定区画に由来することが確認されており、その後、エキソソームとして細胞外に放出される。すなわち、多嚢体と原形質膜との融合が起これば、かような小胞は、細胞外環境に放出されるが、それをエキソソームと呼ぶ。かようなエキソソームが、いかなる分子的メカニズムによって作られるか明確に明らかにされていないが、赤血球だけではなく、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹枝状細胞、血小板、及びマクロファージなどを含む多様な種類の免疫細胞、または腫瘍細胞でさえも、生きている状態でエキソソームを生産して分泌することが知られている。エキソソームは、細胞の状態が正常（ｎｏｒｍａｌ ｓｔａｔｅ）、病的（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｔｅ）または非正常（ａｂｎｏｒｍａｌ ｓｔａｔｅ）であるのかに応じて、多数の他の細胞類型から分離されて放出されると知られている。

また、マイクロベシクルは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）を含むこともある。ｍｉＲＮＡは、それを含む細胞または被験体の状態を確認するのに使用されうる。前記状態は、疾病、例えば、がん、遺伝病、心臓病、または精神分裂のような神経性疾患でもある。

既存組織検査を介した乳がん診断は、侵襲的（ｉｎｖａｓｉｖｅ）方法であるので、被験体の苦痛を伴い、頻繁に検診し難く、費用が高くなるという問題がある。また、既存の血液検査を介した乳がん診断は、正確性が高い血液タンパク質マーカーが今のところなく、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ）は、転移性乳がんにのみ適用が可能であり、初期がんの診断には、適用することができないという問題がある。

従って、乳がんを、できる限り侵襲的でない手段で（ｕｓｉｎｇ ａ ｌｅｓｓ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍａｎｎｅｒ）、早期に診断するために、乳がん特異性血液内マーカーを選別することが必要である。

米国特許第８０２１８４７号明細書

ダグラス ディー． テイラー（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｄ． Ｔａｙｌｏｒ）とシセック ジャーセル−テイラー（Ｃｉｃｅｋ Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ），ガイナコロジック オンコロジー（Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ），１１０（２００８）１３−２１

本発明が解決しようとする課題は、乳がん診断用組成物及びキットを提供することである。本発明が解決しようとする課題はまた、乳がん診断方法及び乳がん診断に必要な情報を得る方法を提供することである。

前記課題を解決するために、本発明は、（ａ）小胞内のｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または該マイクロＲＮＡの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）と、同一または相補的な一つ以上のポリヌクレオチド；及び（ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１つ以上とを含む乳がん診断用の組成物及びキットを提供する；（ｉ）前記小胞に特異的に結合する物質、（ｉｉ）前記小胞の脂質二重層に入り込むことができる物質、（ｉｉｉ）インテグリンタンパク質またはその断片に対して特異的に結合することができる物質；。

前記課題を解決するために、本発明はまた、被験体から得られた小胞を含む生物学的試料を提供する段階と、前記生物学的試料に含有されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の量を測定する段階であり、該マイクロＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択されるいずれか一つ以上である段階と、測定されたマイクロＲＮＡの量を対照群と比較する段階と、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの量の、対照群との比較に基づいて、乳がん診断を提供する段階と、を含む乳がん診断方法及び乳がん診断に必要な情報を得る方法を提供する。

良性腫瘍患者群と乳房がん患者群とで、抗ＣＤ８３抗体が接合された免疫ビーズを使用して分離されたマイクロベシクル量のグラフである。分離されたマイクロベシクル中のＣＤ９タンパク質の量は、抗ＣＤ９抗体によって決定された。任意の単位であるマイクロベシクルの相対強度を、良性腫瘍及び乳房がん患者群それぞれについて、ｙ軸に示した。 良性腫瘍患者群と乳房がん患者群とで、抗ＦＳＡＬ抗体が接合された免疫ビーズを使用して分離されたマイクロベシクル量のグラフである。分離されたマイクロベシクル中のＣＤ９タンパク質の量は、抗ＣＤ９抗体によって決定された。任意の単位であるマイクロベシクルの相対強度を、良性腫瘍及び乳房がん患者群それぞれについて、ｙ軸に示した。 良性腫瘍患者群と乳房がん患者群とで、抗ＥＲＢＢ２抗体が接合された免疫ビーズを使用して分離されたマイクロベシクル量のグラフである。分離されたマイクロベシクル中のＣＤ９タンパク質の量は、抗ＣＤ９抗体によって決定された。任意の単位であるマイクロベシクルの相対強度を、良性腫瘍及び乳房がん患者群それぞれについて、ｙ軸に示した。 良性腫瘍患者群と乳房がん患者群とで、マイクロＲＮＡ量を比較したグラフである。ｘ軸に表示されたマイクロＲＮＡの試料についての、Ｃｐ（ｃｒｏｓｓｉｎｇ−ｐｏｉｎｔ）値、すなわち、サイクル数がｙ軸に表示される。 良性腫瘍患者群と乳房がん患者群とで、マイクロＲＮＡ量を比較したグラフである。ｘ軸に表示されたマイクロＲＮＡの試料についての、Ｃｐ（ｃｒｏｓｓｉｎｇ−ｐｏｉｎｔ）値、すなわち、サイクル数がｙ軸に表示される。 抗ＣＤ８３抗体が接合された免疫ビーズを使用した免疫ブロッティングで得られた、良性腫瘍患者群と乳房がん患者群から分離されたマイクロベシクルの、インテグリンβタンパク質バンドの相対的強度を示すグラフである。 抗ＦＳＡＬ抗体が接合された免疫ビーズを使用した免疫ブロッティングで得られた、良性腫瘍患者群と乳房がん患者群から分離されたマイクロベシクルの、インテグリンβタンパク質バンドの相対的強度を示すグラフである。 抗ＥＲＢＢ２抗体が接合された免疫ビーズを使用した免疫ブロッティングで得られた、良性腫瘍患者群と乳房がん患者群から分離されたマイクロベシクルの、インテグリンβタンパク質バンドの相対的強度を示すグラフである。 良性腫瘍患者群と乳房がん患者群から分離されたマイクロベシクル中の、インテグリンβ及びマイクロＲＮＡのＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅｓ）、並びにインテグリンβとマイクロＲＮＡとが組み合わされたＡＵＣのグラフである。点線は、インテグリンβのＡＵＣを示し、黒色バーは、マイクロＲＮＡのＡＵＣを示し、白色バーは、インテグリンβ及びマイクロＲＮＡが組み合わされたＡＵＣを示す。

以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。

本発明は、乳がん診断用組成物及びキット、並びに乳がん診断方法及び乳がん診断に必要な情報を得る方法を提供するものである。

本発明の一側面によれば、組成物またはキットは、小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）に含有されるｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択されるいずれか１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）または該マイクロＲＮＡの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）と、同一または相補的な一つ以上のポリヌクレオチドを含む。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択されるいずれか１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはその断片と、同一または相補的な配列を有する別々のポリヌクレオチドを、各々が含有する小胞を、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上または１１個、前記組成物は含んでもよい。前記組成物は、異なる核酸または他の物質を含有した他の小胞のような、他の追加的な要素を含んでもよい。

“小胞”または“小嚢”は、脂質二重層で覆い包まれた膜構造をいう。例えば、小胞は、マイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）またはエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）でもある。“マイクロベシクル”は、細胞に由来する膜構造を備えた、小型の小胞をいう。本明細書においては、“マイクロベシクル”は、“循環マイクロベシクル（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）”または“マイクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）”と交換自在に使用される。マイクロベシクルは、細胞に存在し、または細胞から分泌されもする。細胞外に分泌されるマイクロベシクルは、エキソソーム、エクトソーム（シェディング・マイクロベシクル（ＳＭＶｓ）ともいう）またはアポトーシス性水疱（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｌｅｂｓ）でもある。エキソソームは、食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）由来の直径３０〜１００ｎｍの膜性小胞でもある。エクトソームは、原形質膜から直接放出されて、直径５０〜１，０００ｎｍの大きい膜性小胞でもある。アポトーシス性水疱は、死んで行く細胞によって流出する直径５０〜５，０００ｎｍの小胞でもある。生体内マイクロベシクルは、マイクロＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含んでもよい。小胞の表面タンパク質は、病気特異的なマーカーでもある。

前記マイクロＲＮＡは、真核細胞で発見される短いリボ核酸をいう。マイクロＲＮＡは、生体内で遺伝子発現を調節する役目を行い、長さが約１７〜約２５ヌクレオチド（以下、「ｎｔ」という）であり、それらは、ＤＮＡによってコードされる。それらは、ゲノムから転写され、断片化された後に、特定タンパク質の発現を増減させる役割を行う。現在まで、哺乳類で知られたマイクロＲＮＡの機能は、インシュリン分泌調節、リンパ球分化調節、細胞分裂調節、細胞死滅調節、ウイルス複製調節などである。

前記乳がん診断用組成物のうちマイクロＲＮＡは、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、またはこれらの組み合わせでもある。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃは、それぞれヒト（ｈｓａ：ホモサピエンス（ｈｏｍｅ ｓａｐｉｅｎｓ））由来のものである。

ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６は、配列番号１のヌクレオチド配列に相応し、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａは、配列番号２のヌクレオチド配列に相応し、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４は、配列番号３のヌクレオチド配列に相応し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂは、配列番号４のヌクレオチド配列に相応し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３は、配列番号５のヌクレオチド配列に相応し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐは、配列番号６のヌクレオチド配列に相応し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４は、配列番号７のヌクレオチド配列に相応し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａは、配列番号８のヌクレオチド配列に相応し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５は、配列番号９のヌクレオチド配列に相応し、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３は、配列番号１０のヌクレオチド配列に相応し、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃは、配列番号１１のヌクレオチド配列に相応する。

前記マイクロＲＮＡの断片は、連続した塩基配列を有するマイクロＲＮＡのポリヌクレオチドをいう。前記断片の長さは、例えば、２ｎｔ〜２５ｎｔ、３ｎｔ〜２４ｎｔ、４ｎｔ〜２３ｎｔ、５ｎｔ〜２２ｎｔ、６ｎｔ〜２１ｎｔ、７ｎｔ〜２０ｎｔ、８ｎｔ〜１９ｎｔ、９ｎｔ〜１８ｎｔ、１０ｎｔ〜１７ｎｔ、１１ｎｔ〜１６ｎｔ、１２ｎｔ〜１５ｎｔ、または１３ｎｔ〜１４ｎｔでもある。

前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記マイクロＲＮＡまたはその断片と同一の塩基配列を有するものでもある。前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記マイクロＲＮＡまたはその断片に相補的な塩基配列を有するものでもある。前記ポリヌクレオチドは、プライマーまたはプローブでもある。前記ポリヌクレオチドの長さは、例えば、２ｎｔ〜２５ｎｔ、３ｎｔ〜２４ｎｔ、４ｎｔ〜２３ｎｔ、５ｎｔ〜２２ｎｔ、６ｎｔ〜２１ｎｔ、７ｎｔ〜２０ｎｔ、８ｎｔ〜１９ｎｔ、９ｎｔ〜１８ｎｔ、１０ｎｔ〜１７ｎｔ、１１ｎｔ〜１６ｎｔ、１２ｎｔ〜１５ｎｔ、または１３ｎｔ〜１４ｎｔでもある。

前記組成物またはキットは、小胞に特異的に結合することができる物質、小胞の脂質二重層に入り込むことができる物質、インテグリンタンパク質若しくはその断片に対して特異的に結合することができる物質、またはこれらの組み合わせをさらに含んでもよい。すなわち、本発明の乳がん診断用組成物は、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１つ以上を含む；（ｉ）前記小胞に特異的に結合する物質、（ｉｉ）前記小胞の脂質二重層に入り込むことができる物質、（ｉｉｉ）インテグリンタンパク質またはその断片に対して特異的に結合することができる物質。

小胞に特異的に結合することができる物質は、例えば、小胞の表面タンパク質、脂質または糖に結合することができる物質でもある。表面タンパク質は、例えば、ＣＤ８３、ＣＤ９、ＥｐＣＡＭ、カベオリン、ＦａｓＬ（ＦＡＳＬ）、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＣＤ３６、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＭＵＣ１、ＥＲＢＢ４、ＧＰＥＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＬＡＮＡ、ＡＭＨＲ２、またはこれらの組み合わせでもある。小胞に特異的に結合することができる物質は、例えば、タンパク質に対して結合親和性を有する物質、酵素の基質、補酵素、調節因子、受容体と特異的に結合する物質、レクチン、糖、糖蛋白質、抗原、抗体若しくはその抗原結合断片、ホルモン、神経伝達物質、リン脂質結合タンパク質、プレクストリン相同（ＰＨ：ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ、ＰＨ）ドメインを含むタンパク質、コレステロール結合タンパク質、またはこれらの組み合わせでもある。抗原結合断片は、抗原結合部位を含むものであり、例えば、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖでもある。小胞の脂質二重層に入り込むことができる物質は、例えば、親油性モイエティ(ｍｏｉｅｔｙ)、両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）モイエティ、両性イオンモイエティ、またはこれらの組み合わせを含む物質でもある。親油性モイエティは、例えば、脂肪酸、ステロールまたはグリセリドでもある。両親媒性モイエティは、例えば、リン脂質またはスフィンゴ脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）でもある。両性（イオン）モイエティは、例えば、スルホベタイン、カルボキシベタインまたはホスホリルコリンでもある。小胞に特異的に結合することができる物質、または小胞の脂質二重層に入り込むことができる物質は、固体支持体と結合したものでもある。前記固体支持体は、例えば、ポリスチレンプレート、ポリスチレンビーズまたはマグネチックビーズでもある。小胞に特異的に結合する物質は、乳がんではないかまたは良性の乳腺腫瘍を有する被験体のような正常対照群よりも、乳がん患者に由来するマイクロベシクルのような小胞により特異的に結合する物質でもある。小胞に特異的に結合する物質は、ＣＤ８３、ＥＲＢＢ２、ＦＡＳＬ、またはこれらの組み合わせのような乳がん特異性マイクロベシクルマーカーでもある。

前記インテグリンタンパク質は、細胞膜を貫通する受容体タンパク質であり、細胞信号伝達、並びに細胞周期、細胞形状及び細胞移動性の調節に関連する。前記インテグリンタンパク質は、αサブユニットとβサブユニットとのヘテロ二量体である。前記インテグリンタンパク質は、インテグリンαサブユニット、インテグリンβサブユニット、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、前記インテグリンタンパク質は、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、インテグリンα８（ＩＴＧＡ８）、インテグリンα９（ＩＴＧＡ９）、インテグリンα１０（ＩＴＧＡ１０）、インテグリンα１１（ＩＴＧＡ１１）、ＣＤ１１Ｄ、ＣＤ１０３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５１、ＣＤ４１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、インテグリンβ５（ＩＴＧＢ５）、インテグリンβ６（ＩＴＧＢ６）、インテグリンβ７（ＩＴＧＢ７）及びインテグリンβ８（ＩＴＧＢ８）からなる群から選択されるポリペプチドを含んでもよい。前記インテグリンタンパク質の断片は、インテグリンタンパク質の連続アミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。

前記インテグリンタンパク質またはその断片に対して特異的に結合する物質は、インテグリンに特異的に結合する抗体でもある。前記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でもある。前記抗体は、全長抗体または抗原結合断片でもある。抗原結合断片は、抗原結合部位を含むものであり、例えば、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖでもある。前記抗体は、抗インテグリンαサブユニット抗体または抗インテグリンβサブユニット抗体でもある。

他の具体例によれば、被験体から得られた小胞を含む生物学的試料を提供する段階と、前記生物学的試料に含有されたマイクロＲＮＡの量を測定する段階であり、該マイクロＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択されるいずれか一つ以上である段階と、測定されたマイクロＲＮＡの量を対照群と比較する段階（例えば、陽性若しくは陰性対照群試料から分離された小胞中のマイクロＲＮＡの測定量、または、陽性若しくは陰性対照群試料中のマイクロＲＮＡの量を表すデータ）と、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの量の、対照群との比較に基づいて、乳がん診断を提供する段階と、を含む、乳がん診断方法が提供される。

前記方法は、被験体から得られた小胞を含む生物学的試料を提供する段階と、前記生物学的試料に含有されたマイクロＲＮＡの量を測定する段階において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのうち、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上または１１個全てのマイクロＲＮＡの量を測定する段階であってもよい。

前記乳がん診断方法は、被験体から得られた生物学的試料を提供する段階を含む。

前記被験体は、マウス、ラット、ギニアピッグ、ハムスター、猫、犬、豚、牛、馬または類人猿（例えば、ヒト）を含む哺乳動物でもある。

前記生物学的試料は、例えば、尿、粘液、唾液、涙、血液、血漿、血清、痰、脊髄液、胸水、乳頭吸引物、リンパ液、気道液、腸液、泌尿生殖管液、母乳、リンパ系体液、精液、脳脊髄液、気管系内体液、腹水、嚢胞性（ｃｙｓｔｉｃ）腫瘍体液、羊水液、またはこれらの組み合わせでもある。前記生物学的試料は、小胞を含むか、または小胞自体を生物学的資料としてもよい。

生物学的試料を提供する段階は、被験体から試料を採血し、サンプリングし、生検または分離する段階を含んでもよい。前記生物学的試料から小胞を分離する段階は、例えば、固体支持体または遠心力を利用した分離、密度勾配法、超遠心分離、濾過、透析、抗体を利用した免疫親和性クロマトグラフィ、自由流動電気泳動法、またはそれらを混合した方法で行うことができる。前記生物学的試料から小胞を分離する段階は、例えば、小胞に特異的に結合することができる物質、または小胞の脂質二重層に入り込むことができる物質を小胞とをインキュベーションする段階を含んでもよい。インキュベーションは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われることもある。ある実施形態では、生物学的試料からの小胞の分離は、洗浄を含む。

マイクロＲＮＡの量は、小胞内のｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択される少なくとも一つのマイクロＲＮＡまたは該マイクロＲＮＡの断片と、同一または相補的なポリヌクレオチドのプライマーまたはプローブを使って測定され得る。前記ポリヌクレオチドの長さは、例えば、２ｎｔ〜２５ｎｔ、３ｎｔ〜２４ｎｔ、４ｎｔ〜２３ｎｔ、５ｎｔ〜２２ｎｔ、６ｎｔ〜２１ｎｔ、７ｎｔ〜２０ｎｔ、８ｎｔ〜１９ｎｔ、９ｎｔ〜１８ｎｔ、１０ｎｔ〜１７ｎｔ、１１ｎｔ〜１６ｎｔ、１２ｎｔ〜１５ｎｔ、または１３ｎｔ〜１４ｎｔでもある。前記マイクロＲＮＡの量は、例えば、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ）法で測定することができる。

前記乳がん診断方法、または乳がん診断のために情報を得る方法は、生物学的試料中のマイクロＲＮＡの測定量を、対照群（例えば、リファレンス（対照群）試料の小胞中の、マイクロＲＮＡの測定量）と比較する段階を含む。

前記対照群試料は、正常または良性腫瘍患者から由来した試料でもある（陰性対照群）。代案として、前記対照群試料は、乳がん患者から得られた試料でもある（陽性対照群）。前記対照群はまた、正常及び／若しくは良性患者、または、乳がん陽性患者のプール（ｐｏｏｌ）中のｍｉＲＮＡの量を示す、データによって提供される。

前記方法は、前記試料由来のマイクロＲＮＡの量の、対照群との比較に基づいて、乳がん診断を提供する段階を含む。乳がん診断を提供する段階は、前記試料由来のマイクロＲＮＡの測定量が、対照群由来のマイクロＲＮＡの測定量より多いか、または少ないかを決定する段階を含んでもよい。例えば、陰性対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの増加した量は、前記被験体が乳がんである指標である。前記陰性対照群は、乳がんではないかまたは良性の乳腺腫瘍を有する被験体からの生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの量でもある。陰性対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの増加した量は、約０．２，０．４，０．５，０．６，０．８，１．０，１．２，１．４，１．６，１．８、２．０，２．２，２．４，２．６または２．８Ｃｐユニット以上の増加でもある。陽性対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの減少した量は、前記被験体が乳がんではないという指標である。前記陽性対照群は、乳がんを有する被験体からの生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの量でもある。陽性対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの減少した量は、約０．２，０．４，０．５，０．６，０．８，１．０，１．２，１．４，１．６，１．８，２．０，２．２，２．４，２．６または２．８Ｃｐユニット以上の減少でもある。

すなわち、本発明の一実施形態は、被験体から得られた小胞を含む生物学的試料を提供する段階と、前記生物学的試料に含有されたマイクロＲＮＡの量を測定する段階であり、該マイクロＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択されるいずれか一つ以上である段階と、測定されたマイクロＲＮＡの量を対照群と比較する段階と、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの量の、対照群との比較に基づいて、乳がん診断を提供する段階であり、前記乳がん診断を提供する段階は、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの測定量が、対照群由来のマイクロＲＮＡの測定量より多いか、または少ないかを決定し、対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの増加した量は、前記被験体が乳がんである指標であり、該対照群が乳がんではないか若しくは良性の乳腺腫瘍を有する被験体からの生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの量であり、または、対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの減少した量は、前記被験体が乳がんではないという指標であり、該対照群が乳がんを有する被験体からの生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの量である、乳がん診断方法が提供される。 生物学的試料から小胞を分離する段階が含まれる場合において、小胞に特異的に結合することができる物質は、例えば、小胞の表面タンパク質、脂質または糖に結合することができる物質でもある。表面タンパク質は、例えば、ＣＤ８３、ＣＤ９、ＥｐＣＡＭ、カベオリン、ＦａｓＬ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＣＤ３６、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＭＵＣ１、ＥＲＢＢ４、ＧＰＥＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＬＡＮＡ、ＡＭＨＲ２、またはこれらの組み合わせでもある。小胞に特異的に結合することができる物質は、例えば、タンパク質に対して結合親和性を有する物質、酵素の基質、補酵素、調節因子、受容体と特異的に結合する物質、レクチン、糖、糖蛋白質、抗原、抗体若しくはその抗原結合断片、ホルモン、神経伝達物質、リン脂質結合タンパク質、プレクストリン相同ドメインを含むタンパク質、コレステロール結合タンパク質、またはこれらの組み合わせでもある。抗原結合断片は、抗原結合部位を含むものであり、例えば、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖでもある。小胞の脂質二重層に入り込むことができる物質は、例えば、親油性モイエティ、両親媒性モイエティ、両性イオンモイエティ、またはこれらの組み合わせを含む物質でもある。親油性モイエティは、例えば、脂肪酸、ステロールまたはグリセリドでもある。両親媒性モイエティは、例えば、リン脂質またはスフィンゴ脂質でもある。両性（イオン）モイエティは、例えば、スルホベタイン、カルボキシベタインまたはホスホリルコリンでもある。小胞に特異的に結合することができる物質、または小胞の脂質二重層に入り込むことができる物質は、固体支持体と結合したものでもある。前記固体支持体は、例えば、ポリスチレンプレート、ポリスチレンビーズまたはマグネチックビーズでもある。小胞に特異的に結合する物質は、乳がんではないかまたは良性の乳腺腫瘍を有する被験体のような正常対照群よりも、乳がん患者に由来するマイクロベシクルのような小胞により特異的に結合する物質でもある。小胞に特異的に結合する物質は、ＣＤ８３、ＥＲＢＢ２、ＦＡＳＬ、またはこれらの組み合わせのような乳がん特異性マイクロベシクルマーカーでもある。

乳がん診断方法、または乳がん診断のために情報を得る方法は、生物学的試料（例えば、小胞）中のインテグリンタンパク質の量を測定する段階；前記インテグリンタンパク質の量を対照群と比較する段階（例えば、陽性または陰性対照群から分離された小胞中のインテグリンタンパク質の測定量、または、陽性若しくは陰性の対照群患者試料、若しくはそのような試料のプール中に存在するインテグリンのレベルを反映するデータ）；をさらに含んでもよい。前記方法は、生物学的試料由来の小胞中のインテグリンタンパク質の量が、陰性対照群より多いか、または陽性対照群より少ない場合に、前記被験体が、乳がん患者であるか、または乳がんを有する確率が高いと、決定する段階をさらに含んでもよい。前記インテグリンタンパク質は、αサブユニットとβサブユニットとのヘテロ二量体である。前記インテグリンタンパク質は、インテグリンαサブユニット、インテグリンβサブユニット、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、前記インテグリンタンパク質は、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、インテグリンα８（ＩＴＧＡ８）、インテグリンα９（ＩＴＧＡ９）、インテグリンα１０（ＩＴＧＡ１０）、インテグリンα１１（ＩＴＧＡ１１）、ＣＤ１１Ｄ、ＣＤ１０３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５１、ＣＤ４１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、インテグリンβ５（ＩＴＧＢ５）、インテグリンβ６（ＩＴＧＢ６）、インテグリンβ７（ＩＴＧＢ７）及びインテグリンβ８（ＩＴＧＢ８）からなる群から選択されるポリペプチドを含んでもよい。前記インテグリンタンパク質の断片は、インテグリンタンパク質の連続アミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。

すなわち一実施形態では、本発明に係る方法は、前記生物学的試料中のインテグリンタンパク質の量を測定する段階と、前記インテグリンタンパク質の量と、対照群のインテグリンタンパク質の測定量とを比較する段階と、をさらに含み、対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡ及びインテグリンタンパク質の増加した量は、前記被験体が乳がんである指標であり、該対照群が乳がんではないか若しくは良性の乳腺腫瘍を有する被験体からの生物学的試料由来のマイクロＲＮＡ及びインテグリンの量であり、または、対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡ及びインテグリンタンパク質の減少した量は、前記被験体が乳がんではないという指標であり、該対照群は、乳がんを有する被験体からの生物学的試料由来のマイクロＲＮＡ及びインテグリンの量である方法、が提供される。

前記インテグリンタンパク質の量は、電気泳動、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、タンパク質チップ、質量分析器、またはこれらの組み合わせを介して測定することができる。

乳がん診断方法、または乳がん診断のために情報を得る方法は、インビトロ方法でもある。乳がん診断方法は、乳がんを治療するために、乳がんを治療するための乳がん診断方法によって、乳がんにかかるか、あるいは乳がんにかかる可能性が高い確率を有すると診断された被験体に、１個以上の薬物を投与する段階をさらに含んでもよい。薬物は、乳がんに特異的な抗がん薬、または他の抗がん剤との組み合わせでもある。

乳がん診断方法、または乳がん診断のために情報を得る方法は、例えば、カオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｓａｌｔ）、有機溶媒または界面活性剤を含む溶媒で、生物学的試料（例えば、小胞）を溶解させる段階をさらに含んでもよい。生物学的試料の溶解は、例えば、加熱、撹拌、回転、ボルテキシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）、またはこれらの組み合わせでも行われる。

本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。

実施例１．乳がん特異的タンパク質及びｍｉＲＮＡマーカー
（１）乳がん関連マイクロベシクルの表面タンパク質マーカーのスクリーニング
乳がんではない良性腫瘍患者（非乳がん患者）２０人と、乳がん患者（乳がん、第２ステージ内腔（ｌｕｍｉｎａｌ）Ｂ型）２２人から、８ｍｌ〜１０ｍｌの血液をＢＤバキュテイナ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標））プラスプラスチック全血チューブへ採取した。それぞれの血液試料を、４℃で１，３００ｘｇで１０分間遠心分離して血漿を得て、その後に使用する前まで−８０℃で保管した。使用前、血漿を溶かし、約４℃で約３，０００ｘｇで５分間遠心分離し、血漿内脂質及び細胞残余物を除去し、上澄み液を下記実験に使用した。

得られた血漿を良性腫瘍患者群と乳がん患者群とで別々にプールし（ｐｏｏｌｉｎｇ）、血漿試料体積の３倍体積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して希釈した。希釈された血漿は、４℃で２，０００ｘｇで３０分、及び４℃で１２，０００ｘｇで３０分間順に遠心分離した。遠心分離された結果物からペレットを除去し、上澄み液を０．２２μｍフィルタを使用して濾過した。濾過された溶液を、３００ｋＤａカットオフ・メンブレン・カラム（ビバプロダクツ（Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ））を使用し、４℃で１１０，０００ｘｇで２時間超高速遠心分離して濃縮した。

マイクロベシクル中で、ＣＤ８３、ＥＲＢＢ２及びＦＡＳＬタンパク質の量が、正常人と比べ、乳がん患者で増加したか、あるいは減少したかを確認するために、内部標準として、マイクロベシクルマーカーであるＣＤ９の量を測定した。前記で得られた沈殿物、すなわち、マイクロベシクルをＰＢＳに懸濁し、溶解バッファー、及びドデシル硫酸リチウムを含むｐＨ８．４のＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（ライフテクノロジーズ）をチューブに添加し、９５℃で１０分間ヒートブロックで反応物を熱処理し、マイクロベシクルを溶解させた。溶解物を電気泳動し、免疫ブロッティングを行った。一次抗体として、ウサギ抗ＣＤ８３抗体（ＢＤファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））、ウサギ抗ＥＲＢＢ２抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）、ウサギ抗ＦＡＳＬ抗体（ＢＤファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））及びウサギ抗ＣＤ９抗体（ノバスバイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））、及び二次抗体として、ＨＲＰ接合された抗ウサギ抗体を使用し、免疫ブロッティングの検出を行い、発光画像をＬａｓ ｍｉｎ ４０００を使用して分析した。免疫ブロッティングの結果では、ＣＤ８３、ＥＲＢＢ２及びＦＡＳＬタンパク質が、良性腫瘍患者群と乳がん患者群において、量に有意な差があることを確認した。

従って、乳がん特異的マイクロベシクルは、抗ＣＤ８３抗体（ＢＤファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））、抗ＥＲＢＢ２抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）または抗ＦＡＳＬ抗体（ＢＤファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を使用して血液から分離することができる。

（２）表面タンパク質マーカーの確認
それぞれの良性腫瘍保有者及び乳がん患者から得られたされたＣＤ８３、ＥＲＢＢ２またはＦＡＳＬタンパク質発現マイクロベシクルの量を確認するために、抗ＣＤ８３抗体、抗ＥＲＢＢ２抗体または抗ＦＡＳＬ抗体が接合された免疫ビーズを使用して、実施例１（１）の血漿からマイクロベシクルを分離し、分離したマイクロベシクルの量を、ＣＤ９タンパク質（マイクロベシクルマーカー）に特異的に結合する抗ＣＤ９抗体（ノバスバイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））を使用して免疫ブロッティングで確認した。

１００ｍＬのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）Ｍ−２７０アミン溶液（ライフテクノロジーズ）をエッペンドルフチューブに入れ、ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を含むＭＥＳバッファーで洗浄した。ＭＥＳバッファー中でポリアクリルアミド（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））溶液を準備し、カップリング剤として、ＥＤＣ（エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）及びＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を溶液に添加した。ビーズを常温で反応させ、ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）で洗浄した後、ＥＤＣ及びＮＨＳを含むＭＥＳバッファーに再懸濁した。その後、ビーズをＭＥＳバッファーで洗浄し、ＭＥＳバッファー中で、タンパク質Ｇ溶液と反応させた。反応後、１．２ｍｇのスルホベタイン（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））を溶液に加えてインキュベーションした。インキュベーション後、ビーズを、ＰＢＳＴとＰＢＳとで洗浄した。ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中で抗ＣＤ８３ストック溶液を準備し、ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）で希釈した。タンパク質Ｇが結合されたビーズを、８０ｍｇの抗ＣＤ８３溶液とインキュベーションした。ビーズをホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．３）で洗浄し、抗体をピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を使用して、タンパク質Ｇに架橋結合させた。洗浄し、エタノールアミンで免疫ビーズをインキュベーションすることで、反応を終了した。インキュベーション後、免疫ビーズを、ＰＢＳＴとＰＢＳとで洗浄した。準備した免疫ビーズは、ＰＢＳで洗浄し、使用するまでＰＢＳ中に保管した。

実施例１（１）に記載されているように、良性腫瘍患者（乳がん患者ではない）３０人と、乳がん患者３０人（乳がん、第２ステージ内腔（ｌｕｍｉｎａｌ）Ｂ型）とから血液を採取し、血液から血漿を収得した。得られた血漿は、プーリングせずにそれぞれ実験した。

３００μｌのそれぞれ得られた血漿を、試験管（アキシジェン）で、それぞれ３０μｌ（抗体０．８μｇ／ビーズ１μｌ））の前記免疫ビーズと混合し、グラントバイオローテーター（Ｇｒａｎｔ Ｂｉｏ Ｒｏｔａｔｏｒ）で回転させながら、常温で４時間インキュベーションした。反応混合物から上澄み液を除去した後、ビーズをＰＢＳで洗浄した。その後、ビーズをＰＢＳに再懸濁し、３０ｒｐｍで常温で、さらに３時間インキュベーションした。上澄み液を除去した後、ビーズをＬＤＳローディングバッファー（インビロジェン）に再懸濁し、１００℃で１０分間煮沸した。ＣＤ９タンパク質の量は、実施例１（１）に記載されているように、免疫ブロッティング方法で確認した。

抗体を使用して分離された２群間のマイクロベシクルで発現するＣＤ９タンパク質量の差は、ノンパラメトリック方法であるウィルコクソン順位和検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｒａｎｋ ｓｕｍ ｔｅｓｔ）を行って決定した。ウィルコクソン順位和検定の結果、ｐ値が０．０５より小さいとき、統計的に有意であるとみなされる。

図１Ａ〜図１Ｃから分かるように、マイクロベシクルを、抗ＣＤ８３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＥＲＢＢ２抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）または抗ＦＡＳＬ抗体（ＢＤファーミンゲン）で分離し、分離されたマイクロベシクル内のＣＤ９タンパク質量を、抗ＣＤ９抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）で確認した結果、良性腫瘍患者群と乳がん患者群とで、マイクロベシクルの量が、統計的に有意的な差があった。かような結果を基に、ＣＤ８３，ＥＲＢＢ２及びＦＡＳＬタンパク質が、（ｉ）マイクロベシクルの表面に発現しているか、あるいは現れており、（ｉｉ）良性腫瘍患者群より、乳がん関連マイクロベシクルにさらに濃縮されているということを確認した。

（３）乳がん関連マイクロベシクルのマイクロＲＮＡマーカー選別
実施例１（２）に記載されているように、抗ＣＤ８３抗体が接合された免疫ビーズを使用して、血漿からマイクロベシクルを分離し、マイクロベシクルから、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して、メーカーのプロトコルに従ってマイクロＲＮＡを分離した。

分離したＲＮＡは、ユニバーサルｃＤＮＡ合成キット（エキシコン（Ｅｘｉｑｏｎ））を使用して、ｃＤＮＡに逆転写させた。全ての逆転写産物を、最終体積４ｍＬで、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックスと混合した。混合物を、マイクロＲＮＡレディートゥーユーズ（Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ）ＰＣＲヒトパネル（ｈｕｍａｎ ｐａｎｅｌ）Ｉ Ｖ２．Ｒの３８４ウェルプレートにローディングした。マーキュリー（ｍｅｒｃｕｒｙ）ＬＮＡユニバーサルＲＴマイクロＲＮＡ ＰＣＲ（エキシコン（Ｅｘｉｑｏｎ））を使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用して、メーカーの説明書に従って行った：９５℃で１０分、その後、９５℃で１０秒及び６０℃で１分の総４５サイクル。各患者での交差点（Ｃｐ：ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）で示されるマイクロＲＮＡの測定量は、比較のために、ｑＲＴ−ＰＣＲに基づいて補正された。定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を、図２Ａ及び図２Ｂに示し、それを分析した結果を表１に示した。

図２Ａ、図２Ｂ及び表１において、Ｃｐ値が小さいほど、ｍｉＲＮＡが多く発現されるということを意味する。マイクロＲＮＡの量の差は、ウィルコクソン順位和検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｒａｎｋ ｓｕｍ ｔｅｓｔ）で分析し、ウィルコクソン順位和検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｒａｎｋ ｓｕｍ ｔｅｓｔ）の結果、ｐ値が、０．０５より小さければ、統計的に有意であるとみなされる。

図２Ａ、図２Ｂ及び表１に示すように、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３及びｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃが、乳がん関連マイクロベシクルのマーカーであるということを確認した。

（４）乳がん関連マイクロベシクル内の表面タンパク質、及びマイクロＲＮＡの診断正確性（正確度）評価
実施例１（２）及び実施例（３）に記載されているように、マイクロベシクルの表面タンパク質ＣＤ８３及びマイクロＲＮＡの量を利用して、乳がんを診断する場合、予測正確性、ＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ；曲線下面積）及びｐ値計算し、それを表２に示した。良性患者群２０人と、乳がん患者群２２人から収得した試料を使用した。予測正確性（予測正確度）は、乳がんまたは良性腫瘍を有する患者であるとの推定と、乳がんまたは良性腫瘍を有する患者であるとの事実とがどの程度一致するかということを意味する。また、ＡＵＣが０．８以上である場合、特に優秀な効果を提供するとみなされる。

表２から、臨床情報（年齢）を変数として用いた場合に比べて、マイクロベシクルの表面タンパク質やマイクロベシクルのマイクロＲＮＡを変数として用いた場合、予測正確性が高いことが分かる。予測正確性はｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、またはｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａで特に高かった。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６やｈｓａ−ｍｉＲ−２４を変数とし、さらに他のマイクロＲＮＡを変数として加えることで、予測正確性がより向上することが示された。

表２から分かるように、血漿からＣＤ８３をターゲットとして分離されたマイクロベシクルに含まれたｈｓａ−ｍｉＲ−１２６の量が、良性腫瘍と乳がんとを正確性（正確度）８６％で区分することができ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６による予測正確性は、臨床情報（年齢）より２４％向上し、表面タンパク質ＣＤ９の量より１０％向上した。

実施例２．乳がん特異的タンパク質インテグリン−βタンパク質及びマイクロＲＮＡマーカー
（１）得られたマイクロベシクル中のインテグリンβタンパク質の定量及び受信者操作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；ＲＯＣ）分析
実施例１（２）に記載されているように、血漿から分離されたマイクロベシクルをＬＤＳローディングバッファー（インビロジェン）に再懸濁し、１００℃で１０分間加熱し、免疫ビーズに結合されたマイクロベシクルを溶解させた。マイクロベシクルの溶解物を電気泳動し、抗ＣＤ８３抗体、抗ＥＲＢＢ２抗体または抗ＦＡＳＬ抗体と接合された免疫ビーズに結合したマイクロベシクルのタンパク質を分析した。

電気泳動されたゲルを、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写した膜を、１μｌの抗インテグリンβ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）を含むＴＢＳＴ（１％脱脂粉乳を含む）１０ｍｌ、及び１μｌの抗ＣＤ９抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）を含むＴＢＳＴ（１％脱脂粉乳を含む）１０ｍｌに浸漬し、常温で１時間インキュベーションさせた。その後、膜を、２０ｍｌのＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄した。洗浄された膜は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された二次抗体を使用して、前述の方法と同一の方法でインキュベーションさせた後、２０ｍｌのＴＢＳＴで、５分ずつ３回洗浄した。

洗浄された膜に、２ｍｌのスーパーシグナルウェストフェムト最大感度基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））で、常温で５分間インキュベーションさせた。その後、ＬＡＳ画像システム（富士フィルム）を利用して、インテグリンβ及びＣＤ９のバンドを検出し、Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＣＩ）プログラムを利用して、イメージの背景、インテグリンβ及びＣＤ９のバンド強度をそれぞれ定量した。

抗ＣＤ８３抗体、抗ＥＲＢＢ２抗体または抗ＦＡＳＬ抗体が接合された免疫ビーズによって分離されたマイクロベシクルを免疫ブロッティングして得たインテグリンβのバンド強度を、図３Ａ〜図３Ｃに示した（良性腫瘍保有者３０人、乳がん患者３０人）。図３Ａ〜図３Ｃから分かるように、良性腫瘍保有者に比べて乳がん患者で、マイクロベシクルにおいて、インテグリンβタンパク質の量が有意的に増加するということを確認した。

また、インテグリンβのバンド強度を利用して、受信者操作特性（ＲＯＣ；ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）カーブ分析を行った（ｙ軸：感度、ｘ軸：１−特異性）。分析結果から得られたＡＵＣ値を、表３に示した。

（２）インテグリンβとマイクロＲＮＡとの組み合わせＡＵＣ
定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施例１（３）で得られたＣｐ値と、抗ＣＤ８３抗体が接合された免疫ビーズを使用して分離されたマイクロベシクルを免疫ブロッティングにより実施例２（１）で得たインテグリンβ測定バンド強度とを変数として、ロジスティック回帰分析を行い、インテグリンβのＡＵＣと、マイクロＲＮＡのＡＵＣとの組み合わせを得た。

組み合わせを介して得られた結果を、図４及び表４に示した。

図４で点線は、インテグリンβのＡＵＣを示し、黒棒は、マイクロＲＮＡのＡＵＣを示し、白棒は、インテグリンβとマイクロＲＮＡとを組み合わせたＡＵＣを示す。

図４及び表４から分かるように、インテグリンβとマイクロＲＮＡとを組み合わせたＡＵＣは、インテグリンβのＡＵＣに比べ、約０．１８９増加し、マイクロＲＮＡのＡＵＣに比べ、約０．１７２増加した。従って、マイクロベシクルにおいて、インテグリンβと、マイクロＲＮＡとの組み合わせによって、乳がん診断の正確性が向上したということを確認した。

本発明の小胞内のポリヌクレオチドを含む乳がん診断用組成物及びキット、並びにそれを利用した乳がん診断方法は、例えば、乳がん早期診断関連の技術分野に効果的に適用可能である。

Claims (13)

1. （ａ）（ｉ）小胞内のｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４およびｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と、同一または相補的な配列を有する一つ以上のポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）前記小胞に特異的に結合する物質、この際前記小胞に特異的に結合する物質が表面タンパク質に結合できる物質であり、前記表面タンパク質がＣＤ８３である；
   （ｂ）（ｉ）小胞内のｈｓａ−ｍｉＲ−１２６と、同一または相補的な配列からなるポリヌクレオチド、小胞内のｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂと、同一または相補的な配列からなるポリヌクレオチド、小胞内のｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａと、同一または相補的な配列からなるポリヌクレオチド、および小胞内のｈｓａ−ｍｉＲ−２４と、同一または相補的な配列からなるポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）前記小胞に特異的に結合する物質、この際前記小胞に特異的に結合する物質が表面タンパク質に結合できる物質であり、前記表面タンパク質がＣＤ８３である；または
   （ｃ）（ｉ）小胞内のｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、およびｈｓａ−ｍｉＲ−９３からなる群から選択されるマイクロＲＮＡと、同一または相補的な配列からなる少なくとも１つのポリヌクレオチド、（ｉｉ）前記小胞に特異的に結合する物質、この際前記小胞に特異的に結合する物質が表面タンパク質に結合できる物質であり、前記表面タンパク質がＣＤ８３である、ならびに（ｉｉｉ）インテグリンβタンパク質に特異的に結合できる物質、を含む乳がん診断用組成物。
2. 前記小胞は、マイクロベシクルまたはエキソソームである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物が、
   （ｉ）前記（ａ）（ｉ）のマイクロＲＮＡに加えて、小胞内のｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択されるマイクロＲＮＡと、同一または相補的な配列からなる少なくとも１つのポリヌクレオチド；または
   （ｉｉ）前記（ｂ）（ｉ）のマイクロＲＮＡに加えて、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択されるマイクロＲＮＡと、同一または相補的な配列からなる少なくとも１つのポリヌクレオチド；または
   （ｉｉｉ）前記（ｃ）（ｉ）のマイクロＲＮＡに加えて、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃからなる群から選択されるマイクロＲＮＡと、同一または相補的な配列からなる少なくとも１つのポリヌクレオチド；および
   （ｉｖ）前記小胞に特異的に結合する物質、この際前記小胞に特異的に結合する物質が表面タンパク質に結合できる物質であり、前記表面タンパク質がＦａｓＬ、ＥＲＢＢ２、またはこれらの組み合わせである、
   を含む、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記インテグリンβタンパク質は、インテグリンβサブユニットを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記インテグリンβタンパク質は、インテグリンβ５（ＩＴＧＢ５）、インテグリンβ６（ＩＴＧＢ６）、インテグリンβ７（ＩＴＧＢ７）及びインテグリンβ８（ＩＴＧＢ８）からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６は、配列番号：１のヌクレオチド配列を含み、
   ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａは、配列番号：２のヌクレオチド配列を含み、
   ｈｓａ−ｍｉＲ−２４は、配列番号：３のヌクレオチド配列を含み、
   ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂは、配列番号：４のヌクレオチド配列を含み、
   ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３は、配列番号：５のヌクレオチド配列を含み、
   ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐは、配列番号：６のヌクレオチド配列を含み、
   ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４は、配列番号：７のヌクレオチド配列を含み、
   ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａは、配列番号：８のヌクレオチド配列を含み、
   ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５は、配列番号：９のヌクレオチド配列を含み、
   ｈｓａ−ｍｉＲ−９３は、配列番号：１０のヌクレオチド配列を含み、及び
   ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃは、配列番号：１１のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 下記段階を含む乳がん検出方法：
   被験体から得られた生物学的試料から小胞を分離して、生物学的試料として小胞を提供する段階であり、前記生物学的試料からの小胞の分離は、前記小胞に特異的に結合する物質と共に前記生物学的試料をインキュベートすることを含み、この際前記小胞に特異的に結合する物質が表面タンパク質に結合できる物質であり、前記表面タンパク質がＣＤ８３である段階；ならびに
   （ａ）前記生物学的試料に含有されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の量を測定する段階であり、該マイクロＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａからなる群から選択されるいずれか一つ以上である段階、もしくは前記生物学的試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４およびｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂの量を測定する段階；測定されたマイクロＲＮＡの量を対照群と比較する段階；および前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの量の、対照群との比較に基づいて、乳がんを検出する段階であり、前記乳がんを検出する段階は、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの測定量が、対照群由来のマイクロＲＮＡの測定量より多いか、または少ないかを決定し、
   （ｉ）対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの増加した量は、前記被験体が乳がんである指標であり、該対照群が乳がんではないか若しくは良性の乳腺腫瘍を有する被験体からの生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの量であり、もしくは、
   （ｉｉ）対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの減少した量は、前記被験体が乳がんではないという指標であり、該対照群が乳がんを有する被験体からの生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの量である、または
   （ｂ）前記生物学的試料中のマイクロＲＮＡの量およびインテグリンβタンパク質の量を測定する段階であり、前記マイクロＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、およびｈｓａ−ｍｉＲ−９３からなる群から選択される少なくとも１つである段階；測定されたマイクロＲＮＡの量を対照群と比較する段階およびインテグリンβタンパク質の量を対照群の測定されたインテグリンβタンパク質の量と比較する段階；および前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡおよびインテグリンβタンパク質の量の、対照群との比較に基づいて、乳がんを検出する段階であり、前記乳がん診断を提供検出する段階は、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡおよびインテグリンβタンパク質の測定量が、対照群由来のマイクロＲＮＡおよびインテグリンβタンパク質の測定量より多いか、または少ないかを決定し、
   （ｉ）対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡおよびインテグリンβタンパク質の増加した量は、前記被験体が乳がんである指標であり、該対照群が乳がんではないか若しくは良性の乳腺腫瘍を有する被験体からの生物学的試料由来のインテグリンβおよびマイクロＲＮＡの量であり、もしくは、
   （ｉｉ）対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡおよびインテグリンβタンパク質の減少した量は、前記被験体が乳がんではないという指標であり、該対照群が乳がんを有する被験体からの生物学的試料由来のインテグリンβおよびマイクロＲＮＡの量である、方法。
8. 対照群に比べ、前記生物学的試料由来のマイクロＲＮＡの増加または減少した量は、０．５Ｃｐ値以上の増加または減少である、請求項７に記載の方法。
9. 前記生物学的試料は、尿、粘液、唾液、涙、血液、血漿、血清、痰、脊髄液、胸水、乳頭吸引物、リンパ液、気道液、腸液、泌尿生殖管液、母乳、精液、脳脊髄液、気管系内体液、腹水、嚢胞性腫瘍体液、羊水液、またはこれらの組み合わせである、請求項７または８に記載の方法。
10. 前記小胞は、マイクロベシクルまたはエキソソームである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記インテグリンβタンパク質は、インテグリンβサブユニットを含む、請求項７に記載の方法。
12. 前記インテグリンタンパク質は、インテグリンβ５（ＩＴＧＢ５）、インテグリンβ６（ＩＴＧＢ６）、インテグリンβ７（ＩＴＧＢ７）及びインテグリンβ８（ＩＴＧＢ８）からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６は、配列番号：１のヌクレオチド配列を含み、
    ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａは、配列番号：２のヌクレオチド配列を含み、
    ｈｓａ−ｍｉＲ−２４は、配列番号：３のヌクレオチド配列を含み、
    ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂは、配列番号：４のヌクレオチド配列を含み、
    ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３は、配列番号：５のヌクレオチド配列を含み、
    ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐは、配列番号：６のヌクレオチド配列を含み、
    ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４は、配列番号：７のヌクレオチド配列を含み、
    ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａは、配列番号：８のヌクレオチド配列を含み、
    ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５は、配列番号：９のヌクレオチド配列を含み、および
    ｈｓａ−ｍｉＲ−９３は、配列番号：１０のヌクレオチド配列を含む、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。