CN117363731A - 血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂中的应用，特点外泌体circRNA为circ_0008103、circ_0079557和circ_0061407中的一种或者多种，circ_000810的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，circ_0079557的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，circ_0061407的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，优选的外泌体circRNA为circ_0079557或者circ_0008103联合circ_0079557，优点是临床血清标本采集便捷，标本检测方便快捷，且特异性强、灵敏性高，与非小细胞肺癌患者患病率呈负相关。
Description
技术领域
本发明涉及一种非小细胞肺癌早期诊断或检测中的应用，尤其是涉及一种血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂中的应用。
背景技术
肺癌是一个全球性的健康问题，它仍然是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(Non-smallcell lungcancer,NSCLC)占80％-85％，其中两种主要分型是肺腺癌(lungadenocarcinoma,LUAD)和肺鳞癌(lungsquamouscellcarcinoma,LUSC)。近年来，我国肺癌发病率和死亡率呈上升趋势，但其整体治愈率甚至不足20％，分析其原因主要归咎于NSCLC早期并不表现有明显症状，发现时多为晚期，且对于放化疗的敏感性很低，因此提高NSCLC的早期诊断率被认为是治疗及提高肺癌患者生存率的关键。
外泌体(exosome)是一种直径范围为30-160纳米的细胞外囊泡，具有脂质双分子层结构，包含有很多生物活性物质，如环状RNA(circularRNA，circRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)、信使RNA(messengerRNA，mRNA)、DNA以及蛋白质等。大量研究表明，绝大多数细胞均可以分泌外泌体至细胞外，并在体液中能够稳定循环，借助于包含物参与机体各种生理病理活动。肿瘤细胞分泌的外泌体中的内含物由肿瘤细胞直接分泌并存储，在一定程度上能够反应肿瘤的进程，因此来源于肿瘤细胞的外泌体及其内含物对于肿瘤的研究具有一定的意义。
环状RNA是一类特殊的非编码RNA分子，呈封闭环状结构，借助于结构特殊性，其不受RNA外切酶的影响，不易降解，具有更高的稳定性。近年来，随着对环状RNA研究的不断深入，人们对环状RNA的功能已经有较为清晰的认识，通过充当miRNA海绵，降低miRNA介导的下游基因表达调控，同时也可以充当蛋白质的海绵，与RNA结合蛋白结合来影响蛋白质的作用，还可以翻译出新的功能性蛋白来发挥作用等等。人们发现环状RNA在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，可以参与肿瘤的增殖、凋亡、耐药和转移等多方面，环状RNA借助于其功能发挥以及表达量的变化来影响着非小细胞肺癌的发生发展。例如，circRNABIRC6通过海绵化microRNA-145促进非小细胞肺癌细胞进展。外泌体递送的circVMP1通过靶向miR-524-5p/METTL3/SOX2轴促进非小细胞肺癌的进展和顺铂耐药性。
迄今为止，组织活检被认为是最常见的癌症诊断方法，然而，提取的小组织并不能代表肿瘤异质性或监测肿瘤动态进展，并且这种侵入性方法可能会增加转移的可能性，最终导致生存和预后差。由于侵入性极小，通过收集血液和尿液等生物体液标本进行液体活检为癌症诊断和实时监测创造了更多机会，而血液作为临床上最常见的检验材料，基于血液标本的外泌体及其内容物的检测，在肿瘤的早期诊断、疾病进展以及预后判断中，已引起临床检验界的关注。
目前，虽然有部分研究已经报道一些可用于非小细胞肺癌早期诊断的生物标志物，但综合考虑，这些生物标志物的特异性和灵敏性较低，可靠性不足，因此，对具有更高特异性和灵敏性的非小细胞肺癌的早期诊断生物标志物的研究仍需努力。血清中外泌体环状RNA，借助于外泌体脂质膜结构和环状RNA稳定环状结构，能够在循环血液中稳定存在，并借助于肿瘤细胞分泌的外泌体和环状RNA的变化能够有效观测肿瘤的进展，而且检测标本易得，是绝佳的肿瘤诊断方法。目前，国内外已有关于血清外泌体环状RNA与非小细胞肺癌诊断相关的研究报道，探索方便检测的用于非小细胞肺癌早期诊断的外泌体circRNA对提高患者早筛率和方便预后判断具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有较高的特异性和灵敏性，与非小细胞肺癌呈负相关的血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂以及肿瘤病理分期中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一组血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂中的应用，所述的外泌体circRNA为circ_0008103、circ_0079557和circ_0061407中的一种或者多种。
进一步，所述的circ_0008103定位于11号染色体上，其核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所示；所述的circ_0079557定位于7号染色体上，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:2所示；所述的circ_0061407定位于21号染色体上，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
进一步，所述的外泌体circRNA为circ_0008103、circ_0079557和circ_0061407三者组合或者circ_0008103和circ_0079557两者组合。
进一步，所述的外泌体circ_0008103、circ_0079557和circ_0061407来对非小细胞肺癌肿瘤病理分期的判断能力。
进一步，所述的circ_0008103的荧光定量PCR特异性扩增上游引物序列为5’-GCCCAGTCAAGACACTGTTG-3’，下游引物序列为5’-AGCATTTGGCAGCTTTGCTAAT-3’；
所述的circ_0079557的荧光定量PCR特异性扩增上游引物序列为5’-AGAGGTGGCATCTGTGAACTG-3’，下游引物序列为5’-TGATAGAGTCAGACTTCCTTGCT-3’；
所述的circ_0061407的荧光定量PCR特异性扩增上游引物序列为5’-CCAGCAACCCAGACACATCA-3’，下游引物序列为5’-TAGATGTCTTCCTCGGGCTGT-3’。利用该引物组可特异性检测所述的三种circRNAs的表达情况，采用常规荧光定量PCR法即可快速、简便、直观、廉价地获得检测结果，从而作出判断。
进一步，所述的外泌体circRNA circ_0008103在非小细胞肺癌TNM分期中I-II期和III-IV期诊断或检测试剂中的应用。
进一步，所述的外泌体circRNAcirc_0061407在非小细胞肺癌M0和M1期诊断或检测试剂中的应用。MO期:无远处转移,M1期：有远处转移。
上述血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂盒中的应用。
上述血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测靶标药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供了一种血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测以及肿瘤病理分期中的应用，首次公开了用于非小细胞肺癌早期诊断或检测的血清外泌体circRNAs:circ_0008103、circ_0079557、circ_0061407，三种circRNA标志物在非小细胞肺癌患者血清外泌体中低表达，其表达量与非小细胞肺癌患病呈负相关。利用便与采集的血清标本，通过对血清中外泌体中的circRNA进行检测可以方便快捷高效地在分子水平上对非小细胞肺癌进行早期诊断和肿瘤病理分期，针对性强，可靠性较好，并且联合使用时会得到更好的特异性和灵敏性，得到更为准确的结果，提高NSCLC早期确诊率，追踪肿瘤进展，为患者早期治疗提供更多机会，具有较大且较为创新的应用前景。
附图说明
图1为三种circRNA的部分测序结果，展示了circRNA特异性的剪接位点。其中A为circ_0008103的部分测序结果，B为circ_0079557的部分测序结果，C为circ_0061407的部分测序结果；
图2为血清外泌体circ_0008103在NSCLC病例与肺炎病例(Pneumonia)、良性肿瘤病例(Benign)、健康人(Healthy)的表达情况；
图3为血清外泌体circ_0008103区分健康人和NSCLC患者的ROC曲线；
图4为血清外泌体circ_0008103在NSCLC I-II期和III-IV期中的表达情况；
图5为血清外泌体circ_0008103区分NSCLC I-II期和III-IV期的ROC曲线；
图6为血清外泌体circ_0079557在NSCLC病例与肺炎病例(Pneumonia)、良性肿瘤病例(Benign)、健康人(Healthy)的表达情况；
图7为血清外泌体circ_0079557区分健康人和NSCLC患者的ROC曲线；
图8为血清外泌体circ_0061407在NSCLC病例与肺炎病例(Pneumonia)、良性肿瘤病例(Benign)、健康人(Healthy)的表达情况；
图9为血清外泌体circ_0061407区分健康人和NSCLC患者的ROC曲线；
图10为血清外泌体circ_0061407在M0期和M1期中的表达情况；
图11为血清外泌体circ_0061407区分NSCLC M0期和M1期的ROC曲线；
图12为采用ROC分析评价单一血清外泌体circ_0008103、circ_0079557、circ_0061407对区分健康人与非小细胞肺癌的诊断能力；
图13为通过ROC分析评估血清外泌体circ_0008103、circ_0079557、circ_0061407联合使用对区分健康人和非小细胞肺癌的诊断能力。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
1、研究对象的收集
随机抽取宁波大学附属第一医院和宁波大学附属李惠利医院临床实验室手术或治疗前NSCLC(n＝122)、肺良性肿瘤(n＝20)、肺炎(n＝40)患者血清。从宁波大学医学部附属宁波市康宁医院取46份无肿瘤病史的健康人血清样本。本研究中，每位受试者均填写知情同意书，要求将其血液用于研究，所有采血均经宁波大学医学部临床研究伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》原则。所有参与研究的患者的临床特征(年龄、性别、是否吸烟、组织学亚型、TNM分期、淋巴结转移、远处转移、肿瘤大小等)见表1。
表1本研究中的血清样本和相应的临床参数
2、引物设计
circRNA引物的设计:我们首先通过circBase(http://circbase.org/)获得circRNA 5'-3'序列cDNA序列，对序列进行以下转换：将3’端150bp的序列移向5’端序列前面，从而形成一段新的序列，新序列的连接处就是环状RNA的连接位点，这样可以保证扩增circRNA产物的环状结构。将新序列导入NCBI BLAST网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在限制条件下(引物长度15-25nt,G+C含量40-60％，qRT-PCR扩增产物约120bp)挑选特异性引物。然后，利用NCBI和circPrimer中的BLAST引物工具初步验证设计引物的特异性。同时使用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)观察circRNA扩增后的熔解曲线以及琼脂糖凝胶电泳来验证circRNA产物的特异性。所有引物均由华大基因(Beijing Genomics institute,China)合成。
表2circRNA荧光定量PCR特异性引物序列
3、血清外泌体提取
为了从血清中提取外泌体，我们首先吸取360μL的血清至2mL无酶的EP管中，在4℃下2000g离心30分钟，离心结束后吸取300μL上清至新的2mL无酶的EP管中，加入60μLTotalExosome Isolation(Thermo Fisher Scientific，美国)，借助涡旋振荡器混匀，4℃孵育30分钟后，室温10000g离心10分钟后去上清，用300μL 1×PBS重悬外泌体，可直接进行后续实验，也可-20℃保存一周。
4、外泌体RNA提取
为了从外泌体提取RNA，我们在提取好的300μL外泌体中加入1.2mLTrizol试剂(Thermo Fisher Scientific，美国)，吹打混匀后加入240μL的氯仿(ChemMall，中国)，4℃静置5分钟后，4℃下12000g离心15分钟后，将上层清液转移到一个新的EP管中，加入600μL的异丙醇(ChemMall,中国)后4℃静置10分钟，然后在4℃下12000g离心10分钟，离心结束后，使用1.2mL 75％乙醇(DEPC水配置)洗涤两次，最后用50μL无核酸酶水溶解，可-80℃保存备用。
5、cDNA合成
按照制造商的建议，使用ReverTraAce qPCR RTMaster Mix和gDNA去除剂(TOYOBO，日本)，使用Life Touch TC-96/G/H(b)b(Bioer，中国)PCR设备上合成cDNA。具体实验步骤如下：
a.在整管4×DN Master Mix(440μl)中添加8.8μl的gDNARemover，颠倒混匀。(此步骤仅在第一次使用时操作)；
b.取提取好的血清外泌体RNA5μL至200μL的无酶EP管，65℃变性5分钟；
c.4℃按下表配置溶液体系进行去除基因组DNA反应：
表3去除基因组DNA反应体系
配置完成后，混匀，37℃孵育5分钟；
d.4℃按下表配置溶液体系进行逆转录反应：
表4逆转录反应体系
配置完成后，混匀，按如下温度进行反应：逆转录反应，37℃，15min；50℃，5min；酶失活反应，98℃，5min。反应结束后，可在4℃或-20℃条件下保存。
6、本研究中选择的circRNA通过qRT-PCR进行定量
qRT-PCR反应体系：SYBR Green缓冲液(Yeasen Biotech，中国)，5μL；10μM上游引物，0.5μL；10μM下游引物，0.5μL；cDNA模板，1μL；无菌无酶水，3μL。
溶液配置完成后，按以下温度进行反应：95℃，10min；95℃15s，60℃30s，72℃30s，循环40次；最后4℃下保存。Mastercycler梯度(Vaudaux-Eppendorf，德国)仪器上进行。
利用熔解曲线评价qRT-PCR产物的特异性。选择GAPDH作为内参基因，对circRNA数据进行规范化处理。circRNA的相对水平用ΔCq方法计算如下:ΔCq＝平均Cq(内参GAPDH)-平均Cq(感兴趣的circRNA)，相对circRNA的水平对应的值为2^(ΔCq)。
7、Sanger测序我们想确认设计的引物所扩增出来的circRNA就是所需要的circRNA，我们将qRT-PCR后的PCR产物送由华大基因(Beijing Genomics institute，China)进行Sanger测序，对比circRNA序列并分析circRNA的剪接位点，以确定circRNA的准确性。
8、统计分析
统计分析采用SPSS26.0软件包(SPSS Inc.，芝加哥，美国)和GraphPad Prism 8.0(GraphPad Software，美国)。将circRNA的相对水平转化为正态分布后，采用ANOVA和Tukey’s HSD检验分析健康组、肺炎组、良性肺肿瘤组和非小细胞肺癌组circRNA水平的统计学差异。为了比较两个亚组(M0和M1，I-II期和III-IV期)之间的circRNAs的水平，我们采用了非参数Mann-Whitney U检验。通过受试者工作特征(ROC)曲线检测circRNAs的诊断能力，并计算曲线下面积(AUC)。选择Logistic回归模型拟合环状RNA，并获得拟合的概率。P<0.05为有统计学意义，P值均为双侧。
9、研究结果
通过对qRT-PCR反应后的PCR产物进行Sanger测序，成功鉴定出扩增后的产物确实是所述的circRNA标志物的片段，测序结果如图1所示，图1A为circ_0008103的部分测序结果，箭头所指位置为circ_0008103的剪接位点，circ_0008103定位于11号染色体上，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；图1B为circ_0079557的部分测序结果，箭头所指位置为circ_0079557的剪接位点，circ_0079557定位于7号染色体上，其核苷酸序列如序列表SEQID NO:2所示；图1C为circ_0061407的部分测序结果，箭头所指位置为circ_0061407的剪接位点，circ_0061407定位于21号染色体上，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
为了研究上述的circRNAs在NSCLC患者中的诊断潜力，我们量化了健康人、肺炎、良性肺肿瘤和非小细胞肺癌这四个样本组中血清外泌体circ_0008103、circ_0079557、circ_0061407的表达水平。然后，比较不同组间(M0和M1，I-II期和III-IV期)circ_0008103、circ_0079557、circ_0061407的表达水平。同时，进行ROC分析以评估circRNAs单一使用和联合使用时鉴别健康人和NSCLC的灵敏性和特异性以及单一使用所述circRNA标志物时对鉴别M0和M1、I-II期和III-IV期的灵敏性和特异性。
结果如图2所示，NSCLC患者血清外泌体中circ_0008103的表达水平明显低于健康人、肺炎患者以及良性肿瘤患者的表达水平，且健康人血清外泌体中circ_0008103的表达水平与肺炎患者和良性肿瘤患者存在有明显差异；对于区分健康人和非小细胞肺癌患者，通过ROC曲线分析发现circ_0008103的基因表达水平的AUC面积为0.923，其灵敏性和特异性分别是0.891和0.861，如图3所示；NSCLC患者血清外泌体中circ_0008103在III-IV期的表达水平明显低于I-II期的表达水平，如图4所示；对于区分非小细胞肺癌I-II期和III-IV期，通过ROC曲线分析发现circ_0008103的基因表达水平的AUC面积为0.688，如图5所示。
结果如图6所示，NSCLC患者血清外泌体中circ_0079557的表达水平明显低于健康人、肺炎患者的表达水平，且健康人血清外泌体中circ_0079557的表达水平与肺炎患者和良性肿瘤患者存在有明显差异，但良性肿瘤患者与NSCLC患者血清外泌体circ_0079557的表达水平并没有明显差异；对于区分健康人和非小细胞肺癌患者，如图7所示，通过ROC曲线分析发现circ_0079557的基因表达水平的AUC面积为0.938，其灵敏性和特异性分别是0.935和0.852。
结果如图8所示，NSCLC患者血清外泌体中circ_0061407的表达水平明显低于健康人、肺炎患者以及良性肿瘤患者的表达水平，同时，健康人与肺炎患者血清外泌体中的circ_0061407表达水平也存在有明显差异；对于区分健康人和非小细胞肺癌患者，通过ROC曲线分析发现circ_0061407的基因表达水平的AUC面积为0.846，其灵敏性和特异性分别是0.804和0.746，如图9所示；NSCLC患者血清外泌体中circ_0061407在M1期的的表达水平明显低于M0期的表达水平，如图10所示；对于区分非小细胞肺癌M0和M1期，通过ROC曲线分析发现circ_0061407的基因表达水平的AUC面积为0.674，如图11所示。
综上所述，如图12所示对于区分健康人和非小细胞肺癌患者，通过ROC曲线分析发现单独circ_0008103、circ_0079557、circ_0061407的基因表达水平的AUC面积分别为0.923，0.938和0.846，单独使用circ_0008103时，其灵敏性和特异性分别是0.891和0.861，单独使用circ_0079557时，其灵敏性和特异性分别是0.935和0.852，单独使用circ_0061407时，其灵敏性和特异性分别是0.804和0.746。
鉴于前期研究结果，上述三种circRNA在非小细胞肺癌患者的表达水平均明显低于健康人中的表达水平，所以我们进一步探索将所述circRNA标志物联合使用时对非小细胞肺癌早期诊断的可靠性。结果如图13所示，当联合使用circ_0008103、circ_0079557、circ_0061407来区分健康人和非小细胞肺癌患者时，可以发现circ_0008103+circ_0079557+circ_0061407，circ_0008103+circ_0079557，circ_0008103+circ_0061407和circ_0079557+circ_0061407的AUC值分别为0.959，0.963，0.920和0.936，联合circ_0008103+circ_0079557+circ_0061407时其灵敏性和特异性分别是0.885和0.957，联合circ_0008103+circ_0079557时其灵敏性和特异性分别是0.852和1.000，联合circ_0008103+circ_0061407时其灵敏性和特异性分别是0.844和0.870，联合circ_0079557+circ_0061407时其灵敏性和特异性分别是0.820和0.935。
因此，我们得到了结论是单独使用单一circRNA对健康人和非小细胞肺癌患者进行区分时，circ_0079557具有最高的AUC值(0.938)，而当联合使用三种circRNA时，可以发现能够提高灵敏性和特异性，其中circ_0008103+circ_0079557的组合具有最高的AUC值(0.963)，其次是circ_0008103+circ_0079557+circ_0061407(AUC值：0.959)。总体来看，表明我们选择的血清外泌体circRNAs在区分健康人和NSCLC患者方面具有较好的灵敏性和特异性。同时，通过对不同亚组(M0和M1，I-II期和III-IV期)的circRNAs的检测，circ_0008103能够对非小细胞肺癌I-II期和III-IV期进行较好的区分，其AUC值为0.688；circ_0061407能够对非小细胞肺癌M0和M1期进行较好的区分，其AUC值为0.674。
综上所述，本研究找到了三种与NSCLC相关的circRNA(circ_0008103、circ_0079557、circ_0061407)。通过qRT-PCR定量circRNA，比较了四个研究队列(健康、肺炎、良性肺肿瘤和非小细胞肺癌)血清外泌体中选定的circRNA的相对水平。我们发现circ_0008103、circ_0079557、circ_0061407在非小细胞肺癌患者血清外泌体中表达异常，具有区分健康人和非小细胞肺癌患者的能力。联合使用所述circRNA时，其AUC值比单一所述circRNA更高。并比较了NSCLC不同亚组中所述circRNAs的表达水平，发现circ_0008103具有区分非小细胞肺癌I-II期和III-IV期的能力，circ_0061407具有区分非小细胞肺癌M0和M1期的能力。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂中的应用，其特征在于：所述的外泌体circRNA为circ_0008103、circ_0079557和circ_0061407中的一种或者多种。
2.根据权利要求1所述的血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂中的应用，其特征在于：所述的circ_0008103的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述的circ_0079557的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；所述的circ_0061407的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求2所述的血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂中的应用，其特征在于：所述的外泌体circRNA为circ_0008103、circ_0079557和circ_0061407三者组合或者circ_0008103和circ_0079557两者组合。
4.根据权利要求2所述的血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂中的应用，其特征在于：
所述的circ_0008103的荧光定量PCR特异性扩增上游引物序列为5’-GCCCAGTCAAGACACTGTTG-3’，下游引物序列为5’-AGCATTTGGCAGCTTTGCTAAT-3’；
所述的circ_0079557的荧光定量PCR特异性扩增上游引物序列为5’-AGAGGTGGCATCTGTGAACTG-3’，下游引物序列为5’-TGATAGAGTCAGACTTCCTTGCT-3’；
所述的circ_0061407的荧光定量PCR特异性扩增上游引物序列为5’-CCAGCAACCCAGACACATCA-3’，下游引物序列为5’-TAGATGTCTTCCTCGGGCTGT-3’。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂中的应用，其特征在于：所述的外泌体circRNA circ_0008103在非小细胞肺癌TNM分期中I-II期和III-IV期诊断或检测试剂中的应用。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂中的应用，其特征在于：所述的外泌体circRNA circ_0061407在非小细胞肺癌M0和M1期诊断或检测试剂中的应用。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测试剂盒中的应用。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的血清外泌体circRNA在非小细胞肺癌早期诊断或检测靶标药物中的应用。
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