KR20150007878A - 소포 중 폴리뉴클레오티드 및 인테그린 단백질의 용도 - Google Patents

소포 중 폴리뉴클레오티드 및 인테그린 단백질의 용도 Download PDF

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Abstract

소포에 함유된 마이크로RNA 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 인테그린 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 유방암 진단용 조성물 및 키트, 이를 이용한 유방암 진단 방법 및 유방암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법을 이용하면, 최소 침습적으로 유방암을 조기에 진단할 수 있고 환자의 편이성을 향상시킬 수 있다.

Description

소포 중 폴리뉴클레오티드 및 인테그린 단백질의 용도{Use of a polynucleotide and a integrin protein within a vesicle}
소포 중 폴리뉴클레오티드 및 인테그린 단백질의 용도에 관한 것이다.
생체 내 마이크로베지클은 여러 종류의 세포들에 존재하거나 세포로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포이다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 (ⅰ)엑소좀: 식균 기원의 직경 30 내지 100 ㎚의 막성 소포, (ⅱ)엑토좀(쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함): 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1000 ㎚의 큰 막성 소포, (ⅲ) 세포자살성 수포(apoptotic blebs): 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5000 ㎚의 소포를 포함한다.
그 중 엑소좀 (exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포이다. 엑소좀의 직경은 대략 30 내지 100 nm일 수 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하며 세포밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소포들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 엑소좀은 정상 상태, 병적 상태, 또는 이 두 상태하에서 다수의 다른 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다.
또한, 엑소좀의 표면 단백질 또는 마이크로RNA(microRNA: miRNA)는 그를 포함하는 세포 또는 개체의 상태를 확인하는데 사용될 수 있다. 상기 상태는 질병, 예를 들면 암, 유전병, 심장병, 또는 정신분열과 같은 신경성 질환일 수 있다.
기존 조직 검사를 통한 유방암 진단은 침습적 방법이기 때문에 환자의 고통을 수반하고, 자주 검진하기 어려우며, 고비용이 소요되는 문제가 있다. 또한 기존 혈액 검사를 통한 유방암 진단은 정확도가 높은 혈액 단백질 마커가 아직 없고, 순환 종양 세포(circulating tumor cell; CTC)는 전이성 유방암에만 적용이 가능하여, 초기 암의 진단에는 적용할 수 없는 문제가 있다.
따라서, 유방암을 최소 침습적으로 조기에 진단하기 위해 높은 정확도를 가지는 유방암 특이적 혈액 내 마커를 선별하는 것이 필요하다.
유방암 진단 방법을 제공한다.
개체의 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양에 대한 정보를 얻는 방법을 제공한다.
유방암 진단용 조성물을 제공한다.
유방암 진단용 키트를 제공한다.
개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 소포를 분리하는 단계;
생물학적 시료로부터 분리된 소포에 함유된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 측정하는 단계로서, 상기 마이크로RNA는 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA인 것인 단계;
측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양과 대조군 시료로부터 분리된 소포로부터 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 비교하는 단계; 및
측정된 마이크로RNA의 양및 인테그린 단백질의 양이 대조군 시료로부터 분리된 소포로부터 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양보다 증가한 경우, 상기 개체를 유방암 환자 또는 유방암에 걸릴 확률이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 유방암 진단 방법이 제공된다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 소포를 분리하는 단계를 포함한다.
상기 개체는 예를 들면 인간을 포함한 포유 동물일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 생물로부터 수득된 시료를 말한다. 생물학적 시료는 예를 들면 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 소포는 소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 마이크로베지클 또는 엑소좀일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포를 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클(circulating microvesicle) 또는 마이크로입자(microparticles)와 교환가능하게 사용될 수 있다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀(exosome), 엑토좀(쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 또는 세포자살성 수포(apoptotic blebs)일 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100 ㎚의 막성 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 단백질, 마이크로RNA(microRNA: miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다.
상기 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 소포를 분리하는 단계는 예를 들면 고체 지지체 또는 원심력을 이용한 분리, 밀도구배법, 초원심분리, 여과, 투석, 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피, 자유 유동 전기이동법 또는 이들을 혼합한 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 소포를 분리하는 단계는 예를 들면 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 소포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질을 소포와 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다. 인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 상기 생물학적 시료로부터 소포를 분리하는 단계는 예를 들면 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 예를 들면 소포의 표면 단백질, 지질, 또는 당에 결합할 수 있는 물질일 수 있다. 표면 단백질은 예를 들면 CD83, CD9, EpCAM, 카베올린, FasL, HLA-DRA, CD36, CD63, CD81, MUC1, ERBB4, GPER, ERBB2, MLANA, AMHR2, 또는 이들의 조합일 수 있다. 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 예를 들면, 단백질에 결합 친화도를 갖는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 당, 당단백질, 항원, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 호르몬, 신경 전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린 상동성(pleckstrin homology: PH) 도메인을 포함하는 단백질, 콜레스테롤-결합 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다. 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 것으로, 예를 들면 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab'또는 scFv일 수 있다. 소포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 예를 들면 친지성 모이어티, 양친매성 모이어티, 양쪽성 이온 모이어티, 또는 이들의 조합을 포함하는 물질일 수 있다. 친지성 모이어티는 예를 들면, 지방산, 스테롤, 또는 글리세리드일 수 있다. 양친매성 모이어티는 예를 들면, 인지질 또는 스핑고리피드일 수 있다. 양쪽성 이온 모이어티는 예를 들면, 술포베타인, 카르복시베타인, 또는 포스포릴콜린일 수 있다. 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 소포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 고체 지지체와 결합한 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 구형, 다각면체, 플레이트, 선형 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 고체 지지체는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 자성 입자 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 방법은 생물학적 시료로부터 분리된 소포에 함유된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 측정하는 단계로서, 상기 마이크로RNA는 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA인 것인 단계를 포함한다.
상기 마이크로RNA (microRNA: miRNA)는 진핵 세포에서 발견되는 짧은 리보핵산을 말한다. 마이크로RNA는 생체 내에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 하고, 길이가 약 17 내지 약 25 뉴클레오티드(이하 "nt"라고 한다)이며, 이들은 DNA에 의해 암호화된다. 이들은 게놈으로부터 전사 후, 단편으로 잘려서 특정 단백질의 발현을 증가시키거나 감소시키는 역할을 한다. 현재까지 포유류에서 알려진 마이크로RNA의 기능은 인슐린 분비 조절, 임파구 분화 조절, 세포분열 조절, 세포사멸 조절, 바이러스 복제 조절 등이다. 마이크로RNA는 예를 들면, hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93, hsa-miR-30c 또는 이들의 조합일 수 있다. hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c는 각각 인간(Home sapiens) miR-126, 인간 miR-23a, 인간 miR-24, 인간 miR-19b, 인간 miR-103, 인간 miR-142-3p, 인간 miR-144, 인간 miR-15a, 인간 miR-185, 인간 miR-93 및 인간 miR-30c일 수 있다. hsa-miR-126은 예를 들면, 서열번호 1의 염기 서열을 갖는다. hsa-miR-23a는 예를 들면, 서열번호 2의 염기 서열을 갖는다. hsa-miR-24는 예를 들면, 서열번호 3의 염기 서열을 갖는다. hsa-miR-19b는 예를 들면, 서열번호 4의 염기 서열을 갖는다. hsa-miR-103은 예를 들면, 서열번호 5의 염기 서열을 갖는다. hsa-miR-142-3p는 예를 들면, 서열번호 6의 염기 서열을 갖는다. hsa-miR-144는 예를 들면, 서열번호 7의 염기 서열을 갖는다. hsa-miR-15a는 예를 들면, 서열번호 8의 염기 서열을 갖는다. hsa-miR-185는 예를 들면, 서열번호 9의 염기 서열을 갖는다. hsa-miR-93은 예를 들면, 서열번호 10의 염기 서열을 갖는다. hsa-miR-30c는 예를 들면, 서열번호 11의 염기 서열을 갖는다.
상기 마이크로RNA의 양은 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA(microRNA: miRNA), 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 프라이머 또는 프로브로 사용하여 측정할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 길이는 예를 들면 2 nt 내지 25 nt, 3 nt 내지 24 nt, 4 nt 내지 23 nt, 5 nt 내지 22 nt, 6 nt 내지 21 nt, 7 nt 내지 20 nt, 8 nt 내지 19 nt, 9 nt 내지 18 nt, 10 nt 내지 17 nt, 11 nt 내지 16 nt, 12 nt 내지 15 nt, 또는 13 nt 내지 14 nt일 수 있다. 상기 마이크로RNA의 양은 예를 들면 정량적 RT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction: qRT-PCR) 방법으로 측정할 수 있다.
상기 인테그린 단백질은 세포막을 관통하는 수용체 단백질로서 세포 신포 전달, 및 세포 주기, 모양 및 이동성의 전달에 관련된다. 상기 인테그린 단백질은 알파 서브유닛과 베타 서브유닛의 헤테로이량체이다. 상기 인테그린 단백질은 테그린 알파 서브유닛, 인테그린 베타 서브유닛 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인테그린 단백질은 CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, 인테그린 알파 8(ITGA8), 인테그린 알파 9(ITGA9), 인테그린 알파 10(ITGA10), 인테그린 알파 11(ITGA11), CD11D, CD103, CD11a, CD11b, CD51, CD41, CD11c, CD29, CD18, CD61, CD104, 인테그린 베타 5(ITGB5), 인테그린 베타 6(ITGB6), 인테그린 베타 7(ITGB7), 및 인테그린 베타 8(ITGB8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
상기 인테그린 단백질의 양은 전기영동, 웨스턴 블로팅, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 단백질 칩, 질량 분석기 또는 이들의 조합을 통해 측정할 수 있다.
상기 방법은 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양과 대조군 시료로부터 분리된 소포로부터 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 비교하는 단계를 포함한다.
상기 대조군 시료는 유방암 환자가 아닌 개체, 양성 종양을 갖는 개체 또는 유방암에 걸릴 위험이 없는 개체로부터 수득된 시료일 수 있다.
상기 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양과 대조군 시료로부터 분리된 소포로부터 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 비교하여 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양이 대조군의 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양에 비하여 증가 또는 감소하였는지 결정할 수 있다.
상기 방법은 측정된 마이크로RNA의 양및 인테그린 단백질의 양이 대조군 시료로부터 분리된 소포로부터 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양보다 증가한 경우, 상기 개체를 유방암 환자 또는 유방암에 걸릴 확률이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 생물학적 시료로부터 분리된 소포를 세척시키는 단계, 생물학적 시료로부터 분리된 소포를 용해시키는 단계 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 소포의 용해는 예를 들면, 카오트로픽 염(chaotropic salt), 유기 용매 또는 계면 활성제를 포함하는 용매의 존재 하에 수행될 수 있다. 소포의 용해는 예를 들면, 가열, 교반, 회전, 볼텍싱, 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다.
개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 소포를 분리하는 단계;
분리된 소포에 함유된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 측정하는 단계로서, 상기 마이크로RNA는 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA인 것인 단계; 및
측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양과 대조군 시료로부터 분리된 소포로부터 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 비교하는 단계를 포함하는 개체의 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양에 대한 정보를 얻는 방법이 제공된다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 소포를 분리하는 단계를 포함한다.
상기 개체, 생물학적 시료, 소포 및 분리는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 분리된 소포에 함유된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 측정하는 단계로서, 상기 마이크로RNA는 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA인 것인 단계를 포함한다.
상기 마이크로RNA, 마이크로RNA의 양, 인테그린 단백질, 및 인테그린 단백질의 양은 전술한 바와 같다.
상기 방법은 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양과 대조군 시료로부터 분리된 소포로부터 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 비교하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 생물학적 시료로부터 분리된 소포를 세척시키는 단계, 생물학적 시료로부터 분리된 소포를 용해시키는 단계 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 소포의 용해는 전술한 바와 같다.
소포에 함유된 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 인테그린 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 유방암 진단용 조성물이 제공된다.
상기 소포, 마이크로RNA, 및 인테그린 단백질은 전술한 바와 같다.
상기 마이크로RNA의 단편은 마이크로RNA의 연속된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 상기 단편의 길이는 예를 들면 2 nt 내지 25 nt, 3 nt 내지 24 nt, 4 nt 내지 23 nt, 5 nt 내지 22 nt, 6 nt 내지 21 nt, 7 nt 내지 20 nt, 8 nt 내지 19 nt, 9 nt 내지 18 nt, 10 nt 내지 17 nt, 11 nt 내지 16 nt, 12 nt 내지 15 nt, 또는 13 nt 내지 14 nt일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 상기 마이크로RNA 또는 그의 단편과 동일한 염기 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 상기 마이크로RNA 또는 그의 단편에 상보적인 염기 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 길이는 예를 들면 2 nt 내지 25 nt, 3 nt 내지 24 nt, 4 nt 내지 23 nt, 5 nt 내지 22 nt, 6 nt 내지 21 nt, 7 nt 내지 20 nt, 8 nt 내지 19 nt, 9 nt 내지 18 nt, 10 nt 내지 17 nt, 11 nt 내지 16 nt, 12 nt 내지 15 nt, 또는 13 nt 내지 14 nt일 수 있다.
상기 인테그린 단백질의 단편은 인테그린 단백질의 연속된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 말한다.
상기 인테그린 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질은 인테그린에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 항체일 수 있다. 상기 인테그린에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, VCAM-1, 프로티나제, ICAM, 혈장 단백질, 피브리노겐, 비트로넥틴, 오스테오폰틴, Cyr61, 및 TGF 베타로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다. 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 것으로, 예를 들면 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab'또는 scFv일 수 있다. 상기 항체는 항-인테그린 알파 서브유닛 항체, 또는 항-인테그린 베타 서브유닛 항체일 수 있다.
상기 조성물은 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 소포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 및 소포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 전술한 바와 같다.
소포에 함유된 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 인테그린 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 유방암 키트가 제공된다.
상기 소포, 마이크로RNA, 마이크로RNA의 단편, 폴리뉴클레오티드, 인테그린 단백질, 인테그린 단백질의 단편, 인테그린 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질은 전술한 바와 같다.
상기 키트는 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 소포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 및 소포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 전술한 바와 같다.
소포에 함유된 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 인테그린 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 유방암 진단용 조성물 및 키트, 이를 이용한 유방암 진단 방법 및 유방암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법을 이용하면, 최소 침습적으로 유방암을 조기에 진단할 수 있고 환자의 편이성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 항-CD83 항체가 코팅된 비드를 사용하여 양성 종양 보유자 및 유방암 환자의 혈장으로부터 분리된 마이크로베지클을 전기영동한 이미지이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 분리된 마이크로베지클의 웨스턴 블로팅 데이터로부터 얻은 인테그린-β 단백질의 밴드 강도 및 ROC 커브를 나타낸 그래프이다.
도 3은 분리된 마이크로베지클에 대해 정량적 RT-PCR 데이터로부터 얻은 ROC 커브를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 분리된 마이크로베지클에 대해 인테그린-β의 AUC와 마이크로RNA의 AUC를 조합하여 얻은 AUC를 나타낸 그리프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 혈장으로부터 마이크로베지클의 준비
유방암이 아닌 양성 종양 보유자 30명과 유방암 환자 30명(유방암 2기, Luminar B 타입)으로부터 혈액을 채취하고 혈액으로부터 혈장을 수득하였다. 수득된 혈장은 스풀링하지 않고 각각 실험하였다.
폴리아크릴산(Aldrich)와 양쪽성이온(술포베타인)을 사용하여 Dynabeads® M-270 Amine (Invitrogen)에 항-CD83 항체(BD Pharmingen)를 코팅시켜 항-CD83 항체가 코팅된 비드를 제조하였다.
300 ㎕의 각각의 수득된 혈장을 각각 30 ㎕의 상기 항-CD83 항체가 코팅된 비드와 혼합하고, 상온에서 4 시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응물을 300 ㎕의 PBS로 2회 세척한 다음, 다시 300 ㎕의 PBS로 상온에서 3 시간 동안 비드를 세척하였다.
실시예 2. 수득된 마이크로베지클로부터 인테그린 -β 단백질의 정량 및 ROC 커브 분석
실시예 1에서 세척된 비드에 15 ㎕의 LSD 버퍼(Invitrogen)을 가하고 100℃에서 10분 동안 가열하여 비드에 결합된 마이크로베지클로부터 단백질을 수득하였다. 수득된 단백질을 전기영동하고 그 이미지를 도 1에 나타내었다.
전기영동된 겔을 PVDF 막으로 트랜스퍼시켰다. 트랜스퍼된 막을 1 ㎕의 항-인테그린-β 항체(R&D systems)가 포함된 TBST(1% 탈지분유 포함) 10 ㎖ 및 1 ㎕의 항-CD9 항체 (R&D systems)가 포함된 TBST(1% 탈지분유 포함) 10 ㎖에 담그고, 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 막을 20 ㎖의 TBST로 5분씩 3회 세척하였다. 세척된 막은 호스래디쉬 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase: HRP)가 결합된 2차 항체를 사용하여 전술한 방법과 동일한 방법으로 인큐베이션시킨 다음, 세척하였다.
세척된 막에 2 ㎖의 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity substrate(Pierce)로 상온에서 5분 동안 인큐베이션 시켰다. 그 후, LAS(Fujifilm) 장비를 이용하여 인테그린-β 및 CD9의 밴드를 검출하고, Image J(NCI) 프로그램을 이용하여 이미지의 배경, 인테그린-β 및 CD9 의 밴드 강도를 각각 정량하였다.
정량된 인테그린-β의 밴드 강도를 도 2a의 그래프로 나타내었다(양성 보유자 30명, 유방암 환자 30명). 도 2a에 나타난 바와 같이, 양성 종양 보유자에 비해 유방암 환자에서 마이크로베지클 중 인테그린-β 단백질의 양이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이 때의 p-value는 2.32x10-4였다.
또한, 인테그린-β의 밴드 강도를 이용하여 ROC(receiver operating characteristic) 커브 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 2b의 그래프로 나타내었다. ROC 커브의 민감도는 0.667, 특이도는 0.733이었고, AUC(Area Uder the Curve)는 0.690이었다.
실시예 3. 수득된 마이크로베지클로부터 마이크로 RNA 의 정량적 RT - PCR 및 ROC 커브 분석
마이크로RNA 추출 키트(QIAGEN)를 사용하여 실시예 1에서 세척된 비드에 결합한 마이크로베지클로부터 Qiagen 사의 키트를 사용하여 마이크로RNA를 분리하였다,
분리된 마이크로RNA는 Exiqon LNA™ miRNA qRT-PCR 패널(Exiqon)을 사용하여 정량적 RT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction: qRT-PCR)을 수행하였다. 정량적 RT-PCR를 수행한 결과를 이용하여 ROC 커브 분석을 수행하였다. ROC 커브 분석의 결과를 도 3의 그래프로 나타내고, 이때의 p-value를 표 1에 나타내었다.
마이크로RNA p-value
hsa-miR-103 1.39x10-4
hsa-miR-142-3p 4.03x10-5
hsa-miR-144 8.23x10-6
hsa-miR-15a 1.20x10-5
hsa-miR-185 2.18x10-5
hsa-miR-93 1.65x10-5
hsa-miR-126 1.36x10-8
hsa-miR-24 2.96x10-3
hsa-miR-19b 8.61x10-5
hsa-miR-23a 1.41x10-4
또한, 마이크로RNA의 양을 이용하여 ROC 커브 분석을 수행하여 수득된 마이크로RNA의 AUC 값을 표 2에 나타내었다.
마이크로RNA AUC
hsa-miR-103 0.741
hsa-miR-142-3p 0.741
hsa-miR-144 0.690
hsa-miR-15a 0.810
hsa-miR-185 0.776
hsa-miR-93 0.759
실시예 4. 수득된 인테그린 -β의 AUC 와 마이크로 RNA 의 AUC 의 조합
실시예 2에서 정량된 인테그린-β의 밴드 강도와 실시예 3에서 정량적 RT-PCR을 통해 수득된 Cp 값을 변수로 하여 로지스틱 회귀분석을 수행하여,인테그린-β의 AUC와 마이크로RNA의 AUC를 조합하였다.
조합을 통하여 수득된 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 점선은 인테그린-β의 AUC을 나타내고, 검정 막대는 마이크로RNA의 AUC를 나타내고, 흰색 막대는 인테그린-β의 AUC와 마이크로RNA의 AUC를 조합한 AUC를 나타낸다.
도 4에서 나타낸 바와 같이, 인테그린-β의 AUC와 마이크로RNA의 AUC를 조합한 AUC는 인테그린-β의 AUC에 비하여 약 0.189 증가하였고, 마이크로RNA의 AUC에 비하여 약 0.172 증가하였다. 따라서, 마이크로베지클 중 인테그린-β와 마이크로RNA의 조합에 의해서 유방암 진단의 정확도가 향상된 것을 확인하였다.
<110> SAM SUNG ELECTRONICS <120> Use of a polynucleotide and a integrin protein within a vesicle <130> PN101022 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-126 <400> 1 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-23a <400> 2 aucacauugc cagggauuuc c 21 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-24 <400> 3 uggcucaguu cagcaggaac ag 22 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-19b <400> 4 ugugcaaauc caugcaaaac uga 23 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-103 <400> 5 agcagcauug uacagggcua uga 23 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-142-3p <400> 6 uguaguguuu ccuacuuuau gga 23 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-144 <400> 7 uacaguauag augauguacu 20 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-15a <400> 8 uagcagcaca uaaugguuug ug 22 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-185 <400> 9 uggagagaaa ggcaguuccu ga 22 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-93 <400> 10 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 11 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30c <400> 11 uguaaacauc cuacacucuc agc 23

Claims (20)

  1. 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 소포를 분리하는 단계;
    생물학적 시료로부터 분리된 소포에 함유된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 측정하는 단계로서, 상기 마이크로RNA는 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA인 것인 단계;
    측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양과 대조군 시료로부터 분리된 소포로부터 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 비교하는 단계; 및
    측정된 마이크로RNA의 양및 인테그린 단백질의 양이 대조군 시료로부터 분리된 소포로부터 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양보다 증가한 경우, 상기 개체를 유방암 환자 또는 유방암에 걸릴 확률이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 유방암 진단 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 시료는 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 소포는 마이크로베지클 또는 엑소좀인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 소포를 분리하는 단계는 개체로부터 분리된 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 소포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질을 소포와 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 소포의 표면 단백질, 지질, 또는 당에 결합할 수 있는 물질인 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 표면 단백질은 CD83, CD9, EpCAM, 카베올린, FasL, HLA-DRA, CD36, CD63, CD81, MUC1, ERBB4, GPER, ERBB2, MLANA, AMHR2, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 인테그린 단백질은 인테그린 알파 서브유닛, 인테그린 베타 서브 유닛 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 인테그린 단백질은 CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, 인테그린 알파 8(ITGA8), 인테그린 알파 9(ITGA9), 인테그린 알파 10(ITGA10), 인테그린 알파 11(ITGA11), CD11D, CD103, CD11a, CD11b, CD51, CD41, CD11c, CD29, CD18, CD61, CD104, 인테그린 베타 5(ITGB5), 인테그린 베타 6(ITGB6), 인테그린 베타 7(ITGB7), 및 인테그린 베타 8(ITGB8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  9. 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 소포를 분리하는 단계;
    분리된 소포에 함유된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 측정하는 단계로서, 상기 마이크로RNA는 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA인 것인 단계; 및
    측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양과 대조군 시료로부터 분리된 소포로부터 측정된 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양을 비교하는 단계를 포함하는 개체의 마이크로RNA의 양 및 인테그린 단백질의 양에 대한 정보를 얻는 방법.
  10. 소포에 함유된 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 인테그린 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 유방암 진단용 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 소포는 마이크로베지클 또는 엑소좀인 것인 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 인테그린 단백질은 인테그린 알파 서브유닛, 인테그린 베타 서브 유닛 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 인테그린 단백질은 CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, 인테그린 알파 8(ITGA8), 인테그린 알파 9(ITGA9), 인테그린 알파 10(ITGA10), 인테그린 알파 11(ITGA11), CD11D, CD103, CD11a, CD11b, CD51, CD41, CD11c, CD29, CD18, CD61, CD104, 인테그린 베타 5(ITGB5), 인테그린 베타 6(ITGB6), 인테그린 베타 7(ITGB7), 및 인테그린 베타 8(ITGB8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 인테그린 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질은 인테그린 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 항체인 것인 조성물.
  15. 청구항 10에 있어서, 상기 조성물은 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 소포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질을 더 포함하는 것인 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 소포의 표면 단백질, 지질, 또는 당에 결합할 수 있는 물질인 것인 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 표면 단백질은 CD83, CD9, EpCAM, 카베올린, FasL, HLA-DRA, CD36, CD63, CD81, MUC1, ERBB4, GPER, ERBB2, MLANA, AMHR2, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 소포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 단백질에 결합 친화도를 갖는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 당, 당단백질, 항원, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 호르몬, 신경 전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린 상동성(pleckstrin homology: PH) 도메인을 포함하는 단백질, 콜레스테롤-결합 단백질, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  19. 청구항 15에 있어서, 상기 소포의 지질 이중층에 끼어들 수 있는 물질은 친지성 모이어티, 양친매성 모이어티, 양쪽성 이온 모이어티, 또는 이들의 조합을 포함하는 물질인 조성물.
  20. 소포에 함유된 hsa-miR-126, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-19b, hsa-miR-103, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-15a, hsa-miR-185, hsa-miR-93 및 hsa-miR-30c로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마이크로RNA 또는 그의 단편과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 인테그린 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 유방암 키트.
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