CN103476931A - Mir-34的合成模拟物 - Google Patents

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Abstract

实施方案关注牵涉miR-34模拟物，包括miR-34a和miR-34c模拟物的方法和组合物。在一些实施方案中，存在有具有经修饰的核苷酸的双链RNA分子，其具有有miR-34a序列的活性链和互补的过客链。在别的实施方案中，存在有具有经修饰的核苷酸的双链RNA分子，其具有有miR-34c序列的活性链和互补的过客链。

Description

MIR-34的合成模拟物
发明背景
本申请要求美国临时专利申请61/439,280的优先权，其在此通过提及并入本文。
I.发明领域
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体而言，提供了用于治疗疾病和/或状况的牵涉RNA分子的方法和组合物，所述RNA分子至少具有miR-34的功能特性，和在一些实施方案中增强的与miR-34相关的特征。在一些实施方案中，在所述范畴内提供了发挥miR-34a或miR-34c功能的RNA分子。
II.背景
在2001年，几个小组使用克隆方法从秀丽隐杆线虫(C.elegans)、果蝇(Drosophila)、和人分离并鉴定一大类“微小RNA”(miRNA)(Lau等,2001;Lee和Ambros,2001;Lagos-Quintana等,2003)。
发表的人成熟微小RNA序列(其记载于数据库miRBase 15.0(Griffths-Jones等,2006))大小范围为长度16-27个核苷酸，并且源自较长的前体。前体形成的结构在自身互补区中自身折回，并且受到核酸酶Dicer(在动物中)或DCL1(在植物中)加工以生成短的双链成熟miRNA。成熟的miRNA链之一掺入蛋白质和miRNA的复合物中，所述复合物称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)。miRNA引导RISC复合物靶向mRNA，然后，该mRNA受到切割或翻译沉默，这取决于miRNA与其靶mRNA的序列互补性程度。目前，认为完全或几乎完全互补性导致mRNA降解，如在植物中最常观察到的。比较而言，不完全碱基配对(如主要在动物中找到的)导致翻译沉默。然而，目前的数据提示额外的复杂性(Bagga等,2005;Lim等,2005)，而且miRNA实现的基因沉默的机制仍然在紧张的研究下。
研究已经显示了众多miRNA的表达水平变化与各种癌症有关(综述见Calin和Croce,2006;Esquela-Kerscher和Slack,2006;Wiemer,2007)。miRNA还已经牵涉调节细胞生长及细胞和组织分化，即与癌症形成有关的细胞过程。
多种miRNA的活性已经得到鉴定和分析。虽然先前在美国专利申请公开文本20080050744(其在此通过提及收录)中已经鉴定有效的miRNA模拟物，但是需要大大改善天然存在的miRNA的一种或多种特性的别的miRNA模拟物，特别在这些分子从实验室移向临床时。
发明概述
治疗性微小RNA应当是稳定的、有活性的、且与正确的mRNA靶物特异性杂交。实施方案关注miR-34a和miR-34c模拟物，其具有维持的和/或增强的对核酸酶消化的抗性、与正确的靶mRNA的杂交能力、和/或功能性。
实施方案关注含有成熟miR-34a序列的不同RNA分子。RNA分子可以是双链的和/或平端的，这意味着该分子整个是双链的和/或在两个末端是平端的。此外，实施方案关注对所述RNA分子的化学修饰以产生具有改善的或增强的特性的miR-34a模拟物或miR-34c模拟物。双链RNA分子的活性链含有成熟miR-34a序列。在某些实施方案中，双链RNA分子的一条链的序列由成熟miR-34a序列组成。在某些实施方案中，双链RNA分子的一条链的序列由成熟miR-34c序列组成。
在一些实施方案中，提供了双链的RNA分子，这意味着该分子由两条可以彼此分开的多核苷酸或链组成。双链分子不包含发夹分子，其是一条链或多核苷酸。在一些实施方案中，RNA分子在一个或两个末端是平端的。在双链RNA分子中，一条或两条链的长度可以是18、19、20、21、22、23、24、或25个核苷酸，或者其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，双链平端分子的长度是22或23个碱基对(bp)。
涵盖的是，在一些实施方案中，双链RNA分子含有两条彼此完全互补的链，这生成必然平端的分子。
在某些实施方案中，RNA分子具有包含成熟人miR-34a序列(5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’)(SEQ ID NO:1)(22聚体)的活性链。在某些实施方案中，成熟miR-34a序列具有SEQ ID NO:1及3’端额外的U的序列(5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU-3’)(SEQ ID NO:2)(23聚体)。如此，在某些实施方案中，RNA分子具有的活性链具有SEQ ID NO:2的核苷酸1到22的序列。进一步涵盖的是，在一些实施方案中，有如下的RNA分子，其具有的活性链具有SEQ ID NO:2的核苷酸1到22的序列，但是RNA分子的长度是23个核苷酸，这是因为在序列的3’端有A、C、G、或U。在一些实施方案中，活性链在一个或多个内部位置处具有经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，RNA分子具有活性链，该活性链包含成熟人miR-34c序列(5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’)(SEQ ID NO:5)(23聚体)。在一些实施方案中，活性链在一个或多个内部位置处具有经修饰的核苷酸。
按照惯例，本文中讨论的序列以5’至3’列出，除非另有规定。此外，含有SEQ ID NO序列的链具有从5’至3’的所述序列，除非另有规定。
术语“内部位置”指在链中既不是第一个也不是最后一个位置的位置。术语“经修饰的核苷酸”意指与未修饰的核苷酸相比具有别的模块(moiety)或替换模块的核苷酸或核苷(若指5’位置处的核碱基的话)。在含有一个或多个经修饰的核苷酸的活性链的情况下，涵盖的是，有不少于，或者有不超过2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,或15个经修饰的核苷酸，或其中可导出的任何范围。明确涵盖的是，在一些实施方案中，活性链中少于每个的核苷酸是经修饰的，并且在某些实施方案中，活性链中少于半数的核苷酸是经修饰的。此外，在一些实施方案中，明确涵盖的是，具有多个经修饰的核苷酸的活性链没有使该活性链中的每个核苷酸或每个核苷酸被修饰。本文中公开的miRNA模拟物是序列和/或位置特异性的。
在一些实施方案中，方法关注miR-34a模拟物；此类模拟物包含具有活性链的RNA分子，所述活性链具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相同或具有90%或更多同一性的序列。在其它实施方案中，方法关注miR-34c模拟物；此类模拟物包含具有活性链的RNA分子，所述活性链具有与SEQ ID NO:5相同或具有90%或更多同一性的序列。在别的实施方案中，方法关注提供miR-34a和miR-34c活性的miRNA模拟物；此类模拟物包含具有活性链的RNA分子，所述活性链具有与SEQ ID NO:7相同或具有90%或更多同一性的序列。
在一些实施方案中，提供了长度为22或23个碱基对的双链平端RNA分子，其包含：a)包含从5’至3’的SEQ ID NO:1的活性链和b)完全互补的过客链，该过客链包含i)所述过客链的前和后两个核苷酸中的经修饰的核苷酸；和ii)在5’端的末端核苷酸修饰。在某些实施方案中，此RNA分子的长度是22个碱基对，而在其它实施方案中，此RNA分子的长度是23个碱基对。在后一种情况中，活性链包含SEQ ID NO:1，但是整个序列是来自SEQ ID NO:2的序列。在别的实施方案中，提供了长度为23或24个碱基对的双链平端RNA分子，其包含：a)活性链，该活性链包含从5’至3’的SEQ ID NO:5和至少一个经修饰的内部核苷酸，和b)完全互补的过客链，该过客链包含i)所述过客链的前和后两个核苷酸中的经修饰的核苷酸；和ii)在5’端的末端核苷酸修饰。在别的实施方案中，进一步涵盖的是，此RNA分子包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、或SEQ ID NO:7代替SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，活性链包含至少两个经修饰的核苷酸。在别的实施方案中，活性链在任一端的前两个位置中没有经修饰的核苷酸。在别的实施方案中，活性链在距离5’端的前四个位置中不包含经修饰的核苷酸。在别的实施方案中，RNA分子具有包含至少两个经修饰的核苷酸的活性链，尽管经修饰的核苷酸不在活性链5’端的前两个位置中。在某些实施方案中，活性链在活性链的后两个位置(即，3’端的后两个位置)中不包含经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的活性链没有任何经修饰的核苷酸，尽管在此类实施方案中，过客链具有至少末端修饰和至少一个其它修饰。在别的实施方案中，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少90%同一性的活性链没有任何经修饰的核苷酸，尽管在此类实施方案中，过客链具有至少末端修饰和至少一个其它修饰。在又一些实施方案中，具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7序列的活性链没有任何经修饰的核苷酸，尽管在此类实施方案中，过客链具有至少末端修饰和至少一个其它修饰。在别的实施方案中，与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的活性链没有任何经修饰的核苷酸，尽管在此类实施方案中，过客链具有至少末端修饰和至少一个其它修饰。
在一些实施方案中，活性链可以包含SEQ ID NO:1(5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’)的成熟miR-34a序列或者包含SEQ ID NO:2(5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU-3’)的核苷酸1到22的序列。SEQ ID NO:2具有SEQ ID NO:1的成熟miR-34a序列以及3’端额外的U。与miRBase16.0数据库中的成熟人miR-34a(Griffths-Jones等,2006)(成熟miR-34a序列是SEQ ID NO:1，而其互补物是SEQ ID NO:3)相比，SEQ IDNO:2具有3’端额外的U。在这些实施方案之任一中，活性链包含相同的序列。在别的实施方案中，活性链具有包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成的序列。在一些实施方案中，活性链可以具有经修饰的核苷酸，其中那些经修饰的核苷酸的身份相对于提及的SEQ ID NO而言。
在具体的实施方案中，活性链中的经修饰的核苷酸是相对于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2位于位置3(G)、4(C)、11(U)、12(U)、13(A)、14(G)、15(C)、16(U)、17(G)、和/或18(G)处的核苷酸(因为这两种序列间仅有的差异是核苷酸23的添加，所有其它位置在这两种序列中是相同的)，包括其经修饰的核苷酸的任何组合。这意味着它们是与所述SEQ ID NO中所述位置中的那些核苷酸对应的核苷酸。
明确涵盖的是，本文中在特定核苷酸和位置背景中讨论的实施方案也可以仅就位置(距离5’端)而言实现。例如，在位置3(G)处具有经修饰的核苷酸的活性链也可以在距离活性链5’端的位置3处具有经修饰的核苷酸的活性链的背景中实现。
在关注RNA分子的具体实施方案中，活性链中的经修饰的核苷酸是相对于SEQ ID NO:5(其含有成熟的人miR-34c序列)位于位置3(G)、4(C)、11(G)、12(U)、13(U)、14(A)、15(G)、16(C)、17(U)、和/或18(G)处的核苷酸。
在特定核苷酸碱基命名(为“A”、“C”、“G”、或“U”)并描述为“相对”于序列(诸如SEQ ID NO:2)中的位置时，这意味着在链中涵盖所述特定命名的核苷酸的修饰，即使其位置变化1或2个位置(±1或±2个位置)(由于相对于参照序列的缺失或插入)。在其它实施方案中，经修饰的核苷酸相对于链中的位置描述，而不描述为相对于特定的SEQ ID NO:2；在所述情况中，位置指链中的位置，其中链的5’端以位置1开始，并且继续到2、3、4，等等，直到达到3’端的核苷酸位置。
包含SEQ ID NO:1序列，但不由SEQ ID NO:1组成的活性链相对于SEQID NO:1可以具有核苷酸添加或插入。这意味着如果此类活性链相对于SEQID NO:1在位置5处具有经修饰的核苷酸，那么此链具有链中位置5处或链中位置6处经修饰的A(取决于插入或添加在何处)。换言之，除非另有规定，SEQID NO背景中的经修饰的核苷酸是核苷酸特异性的。例如，若活性链包含SEQID NO:1，并且其长度是23个核苷酸，这意味着它相对于SEQ ID NO:1具有插入，因为SEQ ID NO:1的长度是22个核苷酸。在一些实施方案中，如果此类活性链包含相对于SEQ ID NO:1在位置5处的经修饰的核苷酸，那么所述活性链在插入在位置5后时在链中的位置5处会具有经修饰的A，或者它在插入在位置5前或位置5处时在链中的位置6处会具有经修饰的A。
在某些实施方案中，活性链包含SEQ ID NO:5的序列。在别的实施方案中，活性链具有由SEQ ID NO:5中的序列组成的序列。在具体的实施方案中，活性链包含SEQ ID NO:5的序列，但是其序列不由SEQ ID NO:5中的序列组成的序列。
在一些实施方案中，活性链包含至少两个经修饰的核苷酸，尽管经修饰的核苷酸不在活性链5’端的前两个位置中。在某些实施方案中，活性链不包含在活性链的后两个位置(即，3’端的后两个位置)中的经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，活性链包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置15(C)和16(U)处的经修饰的核苷酸。在具体的实施方案中，替代位置15(C)和16(U)处的修饰或在位置15(C)和16(U)处的修饰外，活性链包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置3(G)和4(C)处的经修饰的核苷酸。在别的实施方案中，活性链包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置11(U)和12(U)处的经修饰的核苷酸，其可以代替位置3(G)、4(C)、15(C)和/或16(U)处的修饰或者在位置3(G)、4(C)、15(C)和/或16(U)处的修饰外。在具体的实施方案中，活性链包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的位置11(U)、12(U)、13(A)、和14(G)处的经修饰的核苷酸，其可以代替相对于SEQ ID NO:1和/或SEQ IDNO:2在位置3(G)、4(C)、11(U)、12(U)、15(C)和/或16(U)处的修饰，或者在相对于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2在位置3(G)、4(C)、11(U)、12(U)、15(C)和/或16(U)处的修饰外。在别的实施方案中，活性链包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的位置17(G)和18(G)处的经修饰的核苷酸，其可以代替在上文讨论的位置3、4、11、12、13、14、15和/或16处的修饰，或者在在上文讨论的位置3、4、11、12、13、14、15和/或16处的修饰外。
在一些实施方案中，活性链具有相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在位置11(U)、12(U)、15(C)、和16(U)处的经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，此活性链进一步包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在位置13(A)、14(G)、17(G)、和18(G)处的经修饰的核苷酸。
在具体的实施方案中，活性链包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在位置3(G)、4(C)、15(C)、和16(U)处的经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的活性链没有任何经修饰的核苷酸，尽管在此类实施方案中，过客链具有至少末端修饰和至少一个其它修饰。
在某些实施方案中，活性链是下文所描述的下列一项：
i)包含至少两个经修饰的核苷酸的活性链，其中所述经修饰的核苷酸不在5’端的前两个位置中；
ii)在距离末端的前或后两个位置中包含至少两个经修饰的核苷酸的活性链；
iii)包含相对于SEQ ID NO:5在位置3(G)、4(C)、11(G)、12(U)、13(A)、14(G)、15(C)、16(C)、17(U)、和/或18(G)处的经修饰的核苷酸的活性链；
iv)包含相对于SEQ ID NO:5在位置11(G)和12(U)处的经修饰的核苷酸的活性链；
v)包含相对于SEQ ID NO:5在位置17(U)和18(G)处的经修饰的核苷酸的活性链；
vi)包含相对于SEQ ID NO:5在位置11(G)、12(U)、17(U)、和18(G)处的经修饰的核苷酸的活性链；
vii)包含相对于SEQ ID NO:5在位置3(G)和4(C)处及至少一个在位置11(G),12(U),13(A),14(G),15(C),16(C),17(U),和/或18(G)处的经修饰的核苷酸的活性链；或
viii)包含相对于SEQ ID NO:5在位置3(G)、4(C)、11(G)、12(U)、13(A)、14(G)、15(C)、16(C)、17(U)、和18(G)处的经修饰的核苷酸的活性链.
在一些实施方案中，双链的RNA分子含有包含整个或部分的成熟miRNA序列的活性链和与活性链完全或部分互补的过客链两者。在一些实施方案中，过客链与活性链是，至少是，或者至多是80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,或100%互补的，或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，活性和过客链彼此完全互补。
在含有一个或多个经修饰的核苷酸的过客链的情况下，涵盖的是，有不少于，或有不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个经修饰的核苷酸，或其中可导出的任何范围。明确涵盖的是，在一些实施方案中，过客链中少于每个的核苷酸是经修饰的，并且过客链中少于半数的核苷酸在某些实施方案中是经修饰的。此外，在一些实施方案中，明确涵盖的是，具有多个经修饰的核苷酸的过客链没有使该过客链中的每个或每隔一个核苷酸被修饰。
在此类实施方案中，过客链包含5’端的核苷酸修饰，其可以称为5’端修饰。此类末端修饰可以就5’端的核苷酸(或核苷，若其缺乏磷酸根基团的话)而言。此末端修饰在一些实施方案中明确预期为不是糖分子(sugar molecule)修饰的修饰。明确涵盖的是，此修饰可以是下列一项：NH2、生物素、胺基团、低级烷基胺基团、NHCOCH3、乙酰基基团、2’O-Me、DMTO、荧光素、硫醇、吖啶、间隔物18(PEG)酰胺酯(amidite)(DMT-六(乙二醇))，或具有此类官能性的任何其它基团。在具体的实施方案中，过客链上的5’端修饰是C6胺接头。在其它实施方案中，过客链5’端的核苷酸可以具有非糖修饰和糖修饰两者。
在一些实施方案中，过客链在过客链的前两个或后两个核苷酸中含有至少一个经修饰的核苷酸。在某些实施方案中，过客链在前两个和两个核苷酸两者中包含经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，过客链具有，具有至少，或具有至多1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15或更多个经修饰的核苷酸，或其中可导出的任何范围。明确涵盖的是，在一些实施方案中，过客链中少于每个的核苷酸是经修饰的，而且在某些实施方案中，过客链中少于半数的核苷酸是经修饰的。此外，在一些实施方案中，明确涵盖的是，具有多个经修饰的核苷酸的过客链中没有使过客链中的每个一个核苷酸被修饰。
在某些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:4(5’-AACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’)(23聚体)位于位置1(A),2(A),3(C),4(A),5(A),6(C),9(G),10(C),11(U),12(A),13(A),14(G),17(A),18(C),19(U),20(G),21(C),22(C),和/或23(A)及其任何组合处的经修饰的核苷酸。SEQ ID NO:4包含与SEQ ID NO:3(5’-ACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’)(22聚体)相同的序列，只是SEQID N0:4在5’端具有额外的A。在一些实施方案中，过客链由SEQ ID NO:3组成或者包含SEQ ID NO:3，但是不由SEQ ID NO:4组成或不包含SEQ IDNO:4。相对于SEQ ID NO:4的经修饰的核苷酸在SEQ ID NO:3中与那些在位置1(A)、2(C)、3(A)、4(A)、5(C)、8(G)、9(C)、10(U)、11(A)、12(A)、13(G)、16(A)、17(C)、18(U)、19(G)、20(C)、21(C)、和/或22(A)处的核苷酸对应(5’-GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3’)。
在一些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置i)1(A)和2(A)和/或ii)22(C)和23(A)处的经修饰的核苷酸。在某些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置1(A)、2(A)、22(C)、和23(A)处的经修饰的核苷酸。在别的实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置i)3(C)和4(A)和/或ii)19(U)和20(G)处的经修饰的核苷酸，其可以在相对于SEQ IDNO:4在位置iii)1(A)、2(A)和/或iv)22(C)和23(A)处的修饰外或者代替相对于SEQ ID NO:4在位置iii)1(A)、2(A)和/或iv)22(C)和23(A)处的修饰。在某些实施方案中，过客链具有SEQ ID NO:4中在位置i)3(C)和4(A)或ii)19(U)和20(G)处，但不在位置i)和ii)两者处的经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，过客链具有相对于SEQ ID NO:4在3(C)、4(A)、19(U)、和20(G)处的经修饰的核苷酸。在某些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置5(A)和6(C)处的经修饰的核苷酸，其可以代替本文中讨论的其它过客链修饰或者在本文中讨论的其它过客链修饰外。
在其它实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置9(G)和10(C)处的经修饰的核苷酸，其可以代替本文中讨论的其它过客链修饰或者在本文中讨论的其它过客链修饰外。在别的实施方案中，过客链包含相对于SEQ IDNO:4在位置11(U)和12(A)处的经修饰的核苷酸，其可以代替本文中讨论的其它过客链修饰或者在本文中讨论的其它过客链修饰外。在一些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置13和14处的经修饰的核苷酸，其可以代替本文中讨论的其它过客链修饰或者在本文中讨论的其它过客链修饰外。在别的实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置17(A)和18(C)处的经修饰的核苷酸，其可以代替本文中讨论的其它过客链修饰或者在本文中讨论的其它过客链修饰外。
在具体的实施方案中，过客链没有相对于SEQ ID NO:4位于位置7(C)、8(A)、9(G)、15(A)、和16(C)处的经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置1(A)、2(A)、20(G)、21(C)、22(C)、和23(A)处的经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，过客链包含相对于SEQID NO:4在位置1(A)、2(A)、3(C)、4(A)、22(C)、和23(A)处的经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置1(A)、2(A)、19(U)、20(G)、22(C)、和23(A)处的经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:6(5’-GCAAUCAGCUAACUACACUGCCU-3’)(23聚体)位于位置1(G),2(C),3(A),4(A),7(A),8(G),9(C),10(U),aa(A),12(A),13(C),14(U),19(U),21(C),22(C),和/或23(U)及其任何组合处的经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO:6(5’-GCAAUCAGCUAACUACACUGCCU-3’)(23聚体)位于位置1(G),2(C),3(A),4(A),7(A),8(G),9(C),10(U),11(A),12(A),13(C),14(U),19(U),21(C),22(C),和/或23(U)及其任何组合处的经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，过客链没有相对于SEQ ID NO:6位于位置5(U),6(C),15(A),和/或16(C)处的经修饰的核苷酸。
涵盖特定活性链和特定过客链的组合。涵盖的是，本文中描述的任何活性链可以与部分或完全互补的过客链组合以形成双链RNA分子。在某些实施方案中，提供了RNA分子，该RNA分子具有包含SEQ ID NO:5(或与SEQ IDNO:5具有至少90%同一性的序列)和一个或多个经修饰的核苷酸的活性链，和下列过客链之一：
i)除了5’端的末端修饰外不包含任何经修饰的核苷酸的过客链；
ii)包含相对于SEQ ID NO:6在位置1(G),2(C),3(A),21(C),22(C),和/或23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链；
iii)包含位于子集位置处的经修饰的核苷酸的过客链，其中所述子集是相对于SEQ ID NO:6的a)1(G),2(C),3(A)和/或b)22(C),和23(U)；
iv)包含相对于SEQ ID NO:6位于位置1(G),2(C),和3(A)处的经修饰的核苷酸的过客链；
v)包含相对于SEQ ID NO:6位于位置22(C)和23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链；
vi)包含相对于SEQ ID NO:6位于位置1(G),2(C),3(A),22(C)和23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链；
vii)在下组位置a)和/或b)中包含经修饰的核苷酸的过客链，其中a)是相对于SEQ ID NO:6的位置1(G)、2(C)、和3(A)；而b)是位置22(C)和23(U)，尽管在一些实施方案中，经修饰的核苷酸不位于组a)和b)两者中；
viii)包含相对于SEQ ID NO:6位于位置4(A),7(A),8(G),9(C),10(U),11(A),12(A),13(C),14(U),19(U),和/或21(C)处的经修饰的核苷酸的过客链；
ix)包含相对于SEQ ID NO:6位于位置1(G),2(C),3(A),4(A),7(A),8(G),9(C),10(U),11(A),12(A),13(C),14(U),19(U),和/或21(C)处的经修饰的核苷酸的过客链；
x)包含相对于SEQ ID NO:6位于位置4(A),7(A),8(G),9(C),10(U),11(A),12(A),13(C),14(U),19(U),21(C)22(C)和/或23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链；
xi)包含相对于SEQ ID NO:6位于位置1(G),2(C),3(A),4(A),7(A),8(G),9(C),10(U),11(A),12(A),13(C),14(U),19(U),21(C)22(C)和/或23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链；
xii)包含相对于SEQ ID NO:6在位置1(G),2(C),3(A),17(A),18(C),21(C),22(C),和23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链；
xiii)包含相对于SEQ ID NO:6在位置1(G),2(C),3(A),17(A),18(C),21(C),22(C),和23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链；
xiv)包含相对于SEQ ID NO:6在位置1(G),2(C),3(A),11(A),12(A),13(C),14(U),21(C),22(C),和23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链；或
xv)包含相对于SEQ ID NO:6在位置1(G),2(C),3(A),11(A),12(A),13(C),14(U),17(A),18(C),21(C),22(C),和23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链。
涵盖特定活性链和特定过客链的组合。涵盖的是，本文中所描述的任何活性链可以与本文中所描述的任何过客链组合以形成双链RNA分子。
在一些实施方案中，对具有miR-34a活性的RNA分子涵盖活性和过客链的特定组合。
在某些实施方案中，提供了RNA分子，其具有包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在位置11(U),12(U)15(C),和16(U)处的经修饰的核苷酸的活性链和下列过客链之一：i)除了5’端的末端修饰外不包含任何经修饰的核苷酸的过客链；
ii)包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1(A),2(A),20(G),21(C),22(C),和23(A)处的经修饰的核苷酸的过客链；
iii)包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1(A),2(A),3(C),4(A),22(C),和23(A)处的经修饰的核苷酸的过客链；或
iv)包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1(A),2(A),19(U),20(G),22(C),和23(A)处的经修饰的核苷酸的过客链。
在别的实施方案中，提供了RNA分子，其具有包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在位置11(U),12(U),13(A),14(G),15(C),16(U),17(G),和18(G)处的经修饰的核苷酸的活性链和下列过客链之一：
i)包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1(A),2(A),20(G),21(C),22(C),和23(A)处的经修饰的核苷酸的过客链；
ii)包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1(A),2(A),3(C),4(A),22(C),和23(A)处的经修饰的核苷酸的过客链；
iii)包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1(A),2(A),19(U),20(G),22(C),和23(A)处的经修饰的核苷酸的过客链；或
iv)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的过客链，其中除了5’末端修饰外，它不包含任何经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，提供了RNA分子，其具有包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在位置3,4,15,和16处的经修饰的核苷酸的活性链和下列过客链之一：
i)包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1,2,21,22,和23处的经修饰的核苷酸的过客链；
ii)包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1,2,3,4,22,和23处的经修饰的核苷酸的过客链；
iii)包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1,2,19,20,22,和23处的经修饰的核苷酸的过客链；
在其它实施方案中，对具有miR-34c活性的RNA分子涵盖活性和过客链的特定组合。在某些实施方案中，提供了双链RNA分子，其包含a)包含SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:6中在位置1(G),2(C),3(A),17(A),18(C),21(C),22(C),和23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链和b)包含SEQ ID NO:5和相对于SEQID NO:5在位置11(G),12(U),17(U),和18(G)处的经修饰的核苷酸的活性链。
在具体的实施方案中，提供了双链RNA分子，其包含a)包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:6中在位置1(G),2(C),3(A),11(A),12(A),13(C),14(U),21(C),22(C),和23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链和b)包含SEQ ID NO:5和相对于SEQ ID NO:5在位置11(G),12(U),17(U),和18(G)处的经修饰的核苷酸的活性链。
在其它实施方案中，提供了双链RNA分子，其包含a)包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:6中在位置1(G),2(C),3(A),11(A),12(A),13(C),14(U),17(A),18(C),21(C),22(C),和23(U)处的经修饰的核苷酸的过客链和b)包含SEQ ID NO:5和相对于SEQ ID NO:5在位置11,12,17,和18处的经修饰的核苷酸的活性链。
在别的实施方案中，提供了长度为22或23个碱基对的双链RNA分子，其中RNA分子在两端是平端的，包含具有SEQ ID NO:5序列的活性链和在5’端具有经修饰的核苷酸的分开的且完全互补的过客链，其中所述活性链包含至少一个经修饰的内部核苷酸，且其中与缺乏任何内部核苷酸修饰的双链平端RNA分子相比，所述双链RNA分子更稳定。
在某些实施方案中，提供了miR-34模拟物。在一些实施方案中，模拟物是长度为22或23个碱基对的双链平端RNA分子，其包含：a)活性链，该活性链包含i)5’至3’的SEQ ID NO:7(N1GGCAGUGUN2N3UUAGCUGN4UUGN5N6，其中N1是A、C、G、或U；N2是A、C、G、或U；N3是A、C、G、U，或无；N4是A、C、G、或U；N5是A、C、G、或U；而N6是A、C、G、U、或无)和ii)至少一个经修饰的内部核苷酸；和b)包含5’端的末端核苷酸修饰的完全互补的过客链。在具体的实施方案中，分子的长度是23个碱基对。
在别的实施方案中，包含SEQ ID NO:7的RNA分子具有在位置3,4,11,12,13,14,15,16,17,和/或18处具有经修饰的核苷酸的活性链。此名称就活性链而言是位置特异性的(不是核苷酸特异性的)。就SEQ ID NO:2(mir-34a)和SEQ ID NO:5(miR-34c)而言，在一些实施方案中，RNA分子具有下列活性链之一：
i)包含至少两个经修饰的核苷酸的活性链，其中经修饰的核苷酸不在5’端的前两个位置中；
ii)在距离末端的前或后两个位置中包含至少两个经修饰的核苷酸的活性链；
iii)包含在位置3,4,11,12,13,14,15,16,17,和/或18处经修饰的核苷酸的活性链；
iv)包含在位置11和12处经修饰的核苷酸的活性链；
v)包含在位置17和18处经修饰的核苷酸的活性链；
vi)包含在位置11,12,17,和18处经修饰的核苷酸的活性链；
vii)包含在位置3(G)和4(C)处经修饰的核苷酸和至少一个在位置11,12,13,14,15,16,17,和/或18处经修饰的核苷酸的活性链；
viii)包含在位置3,4,11,12,13,14,15,16,17,和18处经修饰的核苷酸的活性链；或
ix)包含不超过11个经修饰的内部核苷酸的活性链。
在别的实施方案中，在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:9的背景中讨论的核苷酸修饰可以在SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:9的任何其它背景中实现。可以在这些这些SEQ ID NO之一的背景中实现的这些实施方案可以描述基于核苷酸或基于位置的核苷酸修饰。SEQ ID NO:9包含SEQ ID NO:7，其包含SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:5。所有这些关注本文中讨论的活性链。
在某些实施方案中，活性链包含SEQ ID NO:5。在包括具有包含SEQ IDNO:7的活性链的RNA分子的某些实施方案中，在末端核苷酸/核苷修饰外，过客链包含至少一个经修饰的内部核苷酸。在一些实施方案中，过客链包含在位置1,2,3,4,9,10,11,12,13,14,19,21,和/或22处的经修饰的核苷酸。在某些实施方案中，过客链没有位置15和/或16处的经修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，过客链包含SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，过客链包含过客链中位置1,2,3,5,6,9,10,11,12,13,14,17,18,19,20,21,和/或22处经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，过客链包含SEQ ID NO:4。在别的实施方案中，过客链包含位置1,2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,19,21,22,和/或23处的经修饰的核苷酸。
在别的实施方案中，在SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,或SEQ ID NO:10的背景中讨论的核苷酸修饰可以在SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:6,SEQ ID NO:8,或SEQ ID NO:10的任何其它背景中实现。可以在这些这些SEQ ID NO之一的背景中实现的这些实施方案可以描述基于核苷酸或基于位置的核苷酸修饰。SEQ ID NO:10包含SEQ ID NO:8，其包含SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:6。所有这些关注本文中讨论的过客链。
在某些实施方案中，提供了具有SEQ ID NO:7的miR-34模拟物。在此类RNA分子中，提供了实施方案，其中活性链具有一个或多个经修饰的核苷酸，其中经修饰的核苷酸鉴定为是核苷酸特异性的。在此类实施方案中，提供了包含相对于SEQ ID NO:7在位置3(G),4(C),11(G),12(U),13(A),14(G),15(C),16(C),17(U),和/或18(G)处经修饰的核苷酸的活性链；在其它实施方案中，活性链包含相对于SEQ ID NO:7在位置11(G)和12(U)处经修饰的核苷酸；在别的实施方案中，活性链包含相对于SEQ ID NO:7在位置17(U)和18(G)处经修饰的核苷酸；在别的实施方案中，活性链包含相对于SEQ ID NO:7在位置11(G),12(U),17(U),和18(G)处经修饰的核苷酸；在别的实施方案中，活性链包含相对于SEQ ID NO:7在位置3(G)和4(C)处经修饰的核苷酸和至少一个在位置11(G),12(U),13(A),14(G),15(C),16(C),17(U),和/或18(G)处经修饰的核苷酸；以及在又一些实施方案中，活性链包含相对于SEQ IDNO:7在位置3(G),4(C),11(G),12(U),13(A),14(G),15(C),16(C),17(U),和18(G)处经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，活性和过客链的此组合具有过客链的5’端修饰，其中末端修饰是烷基胺诸如C6胺接头，并且核苷酸修饰在糖上在2’位置处。在具体的实施方案中，糖修饰是2’OMe。
在别的实施方案中，提供了长度为22或23个碱基对的双链RNA分子，其中RNA分子在两端是平端的，包含具有SEQ ID NO:1序列的活性链和在5’端具有经修饰的核苷酸的分开的且完全互补的过客链，其中活性链包含至少一个经修饰的内部核苷酸，且与缺乏任何内部核苷酸修饰的双链平端RNA分子相比，双链RNA分子在存在核酸酶的情况下更稳定。
在一些实施方案中，RNA分子具有用糖修饰修饰的核苷酸。在具体的实施方案中，糖修饰是2’-OMe。
具体的实施方案包括含有一种或多种能够起miRNA模拟物作用的不同RNA分子的药物组合物；差异可以涉及序列和/或修饰的类型或位置。在某些实施方案中，RNA分子包含在脂质配制剂中。在其它实施方案中，可以用脂质体、基于聚合物的纳米颗粒、胆固醇偶联物、环糊精(cyclodextran)复合物、聚乙烯亚胺聚合物和/或蛋白质复合物配制RNA分子。
实施方案中还列出用于对细胞提供miR-34a活性的方法。在一些实施方案中，提供了用于对细胞提供miR-34a活性的方法，包括对细胞施用有效量的具有miR-34a活性的RNA分子。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。此类RNA分子遍及此公开内容讨论。
其它方法包括用于降低细胞增殖的方法，包括对细胞施用有效量的miR-34a模拟物。其它实施方案包括用于在细胞中诱导凋亡的方法，包括对细胞施用有效量的miR-34a模拟物。其它实施方案关注用于治疗患者中的癌症的方法，包括对患者施用包含一种或多种具有miRNA功能的RNA分子的药物组合物。其它实施方案关注抑制行进通过细胞周期的方法，其通过施用有效量的本文中讨论的miR-34a模拟物进行。在一些实施方案中，方法进一步包括对患者施用别的癌症疗法。在一些实施方案中，已经对患者测试癌症和/或诊断为患有癌症。此类方法可以牵涉本文中讨论的双链RNA分子。此外，涵盖的是，可以在本文中讨论的方法和组合物中采用多种不同miR-34a模拟物。
其它实施方案关注RNA分子用于处理癌细胞的用途，或其在降低细胞增殖、诱导凋亡或对细胞提供miR-34a功能中的用途。
实施方案中还列出用于对细胞提供miR-34c活性的方法。在一些实施方案中，提供了用于对细胞提供miR-34c活性的方法，包括对细胞施用有效量的具有miR-34c活性的RNA分子。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。此类RNA分子遍及此公开内容讨论。
其它方法包括用于降低细胞增殖的方法，包括对细胞施用有效量的miR-34c模拟物。其它实施方案包括用于在细胞中诱导凋亡的方法，包括对细胞施用有效量的miR-34c模拟物。其它实施方案关注用于治疗患者中的癌症的方法，包括对患者施用包含一种或多种具有miRNA功能的RNA分子的药物组合物。在一些实施方案中，方法进一步包括对患者施用别的癌症疗法。在一些实施方案中，已经对患者测试癌症和/或诊断为患有癌症。此类方法可以牵涉本文中讨论的双链RNA分子。此外，涵盖的是，可以在本文中讨论的方法和组合物中采用多种不同miR-34c模拟物。
其它实施方案关注RNA分子用于处理癌细胞的用途，或其在降低细胞增殖、诱导凋亡或对细胞提供miR-34c功能中的用途。
在miR-34a模拟物的背景中讨论的方法可以在miR-34c模拟物的情况下实现，且反之亦然。
组合物及其使用方法可以“包含”遍及整个说明书公开的任何分子或步骤，“基本上由”或“由”遍及整个说明书公开的任何分子或步骤“组成”。就过渡相“基本上由…组成”而言，且在一个非限制性方面，本说明书中公开的组合物和方法的基本且新颖特征包括miRNA模拟物活性。
在权利要求书和/或说明书中与术语“包含/包括”一起使用时使用词语“一个”或“一种”可以意指“一个/种”，但是它也与“一或多个/种”、“至少一个/种”、和“一或超过一个/种”的意义一致。
涵盖的是，本文中讨论的任何实施方案可以就本发明的任何方法或组合物而言实现，且反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可以用于实现本发明的方法。
贯穿本说明书，术语“约”用于指数值包括用于测定该数值的装置或方法的误差的标准差。
在权利要求书中使用术语“或”用于指“和/或”，除非明确指示指仅备选或者备选是相互排他的，尽管公开内容支持指仅备选及“和/或”的定义。还涵盖的是，也可以明确排除使用术语“或”列出的任何内容。
本发明的其它目的、特征和优点通过以下详细描述会变得显而易见。然而，应当理解虽然详细描述和具体例子指示本发明的具体实施方案，但是其仅作为例示给出，因为本发明精神和范围内的各种变化和修改从本详细描述看对于本领域技术人员会变得显而易见。
发明详述
实施方案涉及与miRNA相关的组合物和方法、以及miRNA模拟物的用途。方法包括制备此类模拟物，并使用此类模拟物来对细胞提供miRNA活性或功能。在某些实施方案中，miRNA模拟物用于治疗、预后、和诊断应用，特别是那些涉及牵涉miRNA活性或功能的状况或疾病的治疗性应用的方法和组合物。
I.核酸
核酸包括作为与成熟微小RNA(“miRNA”或“miR”)分子相同或完全或部分互补的序列的序列或序列区段。一般地，成熟miRNA分子的长度是21至22个核苷酸，尽管已经报告了16和多至27个核苷酸的长度。miRNA各自从较长的前体RNA分子(“前体miRNA”)加工。前体miRNA自非蛋白质编码基因转录。前体miRNA具有两个使得它们能够形成茎-环或折回样结构的互补性区，其在动物中受到称作Dicer的核糖核酸酶III样核酸酶酶切割。经加工的miRNA通常是茎的一部分。
经加工的miRNA(又称为“成熟miRNA”)变为较大的复合物的一部分以下调特定的靶基因。动物miRNA的例子包括那些与靶物不完全碱基配对的miRNA，其使翻译停止(Olsen等,1999;Seggerson等,2002)。siRNA分子也受到Dicer加工，但是从较长的双链RNA分子加工。siRNA不天然存在于动物细胞中，但是它们可以经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)指导对mRNA靶物的序列特异性切割(Denli等,2003)。
A.miR-34a和miR-34c
先前证明了miR-34涉及调节众多细胞活性，其代表用于癌症疗法和用于其它疾病和病症的疗法的干预点(2005年5月31日提交的美国专利申请流水号11/141,707和2005年11月14日提交的流水号11/273,640，在此每篇通过提及并入)。
发明人还证明了miR-34经由其调节许多关键癌基因表达的能力发挥肿瘤阻抑物的功能(2008年6月6日提交的美国专利申请流水号12/134,932，其在此通过提及并入)。受到miR-34直接或间接调节的癌症相关基因包括血管生成素、极光激酶B、BCL10、BRCA1、BRCA2、BUB1、细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白D1,细胞周期蛋白D3、CDK-4、CDK抑制剂2C、FAS、forkhead框M1、HDAC-1、c-Jun、MCAM、Mcl-1、c-Met、Myb L2、NF1、NF2、PI3-激酶、polo样激酶1、R-RAS、SMAD3、TGF beta受体、TPD52肿瘤蛋白D52、和Wnt-7b。
总之，miR-34控制作为细胞增殖和存活的重要调节物的蛋白质的活性。这些靶物在人癌症中经常脱调节。
B.寡聚化合物
实施方案关注miRNA模拟物，其含有能够模拟RNA分子活性的分子。RNA分子含有核苷，其是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基模块。最常见的两类所述杂环碱基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸根的核苷。对于那些包含戊呋喃糖基糖的核苷，磷酸基团可以与糖的2’、3’或5’羟基模块连接。涵盖的是，RNA链会由核苷酸(核糖核苷酸)组成，并且5’端可以是核苷酸或核苷。换言之，可以有与核苷的糖部分连接的磷酸基团或者可以仅有替代磷酸基团的羟基基团。如本文中讨论的，在一些实施方案中，有末端核苷或核苷酸的修饰，其中化学模块或基团经由目前是或先前是羟基或磷酸基团的结构而附接于所述糖。
在形成寡核苷酸时，磷酸基团将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。可以通过杂交或通过形成共价键连接此线性聚合结构的相应末端以形成环形结构。另外，线性化合物可以具有内部核碱基互补性，并且因此可以以如下的方式折叠，使得生成完全或部分双链的结构。在寡核苷酸结构内，磷酸基团通常称为形成寡核苷酸的核苷间连接。RNA和DNA的正常核苷间连接是3’至5’磷酸二酯连接。
在一些实施方案中，提供了具有介于17和130个残基之间的长度的RNA、RNA分子、或RNA类似物。实施方案关注合成的miRNA分子，其长度是，至少是，或者至多是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40或更多个残基，包括其中可导出的任何整数或任何范围。双链RNA分子中的每条链或RNA分子可以是如上文所述的此类长度。在一些实施方案中，RNA分子在一个或两个末端上具有平端。在某些实施方案中，RNA分子在具有活性链5’端的一侧具有平端。在其它实施方案中，RNA分子在具有过客链5’端的一侧具有平端。
本文中所描述的RNA分子可以具有一条或两条链。在具有两条链的分子中，两条链可以彼此杂交，但是它们不通过核苷间连接彼此连接。
在某些实施方案中，包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:9或者由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:9组成(或者由与所述SEQ ID NO之一具有至少90%同一性的序列组成)的此类RNA分子具有位于活性链中位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、和/或23处的经修饰的核苷酸或核苷(位置1是5’端)。在其它实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷位于过客链中的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、和/或23(位置1是5’端)，所述过客链包含SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQID NO:8,或SEQ ID NO:10或者由SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:6,SEQ ID NO:8,或SEQ ID NO:10组成(或者由与所述SEQ ID NO之一具有至少90%同一性的序列组成)。对修饰的核苷酸的命名是位置特异性的，而不是核苷酸特异性的。因而，讨论核苷酸特异性修饰的实施方案，例如，“包含相对于SEQ ID NO:4在位置11(G)和12(U)处的经修饰的核苷酸的活性链”可以在其它实施方案中针对位置而执行；因此，在其它实施方案中，RNA分子可以包括例如在位置11和12处有修饰的核苷酸的链。
在一些实施方案中，miRNA模拟物或RNA分子在两侧都是平端的。涵盖的是，在双链RNA模拟物或分子的过客或活性链的3’或5’端可以有1、2、3、4、5、或6个碱基的突出物。
在一些实施方案中，过客链和活性链不是完全互补的。涵盖的是，两条链间可以有不互补的1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸。在一些实施方案中，这些核苷酸在过客链5’端的前10个核苷酸内。
涵盖的是，RNA模拟物具有经过或未经修饰的RNA碱基。因而，RNA模拟物是RNA或RNA分子。此外，理解的是，核酸(包括RNA)可以具有超过一条链。如本文中讨论的，在一些实施方案中，miRNA模拟物或RNA分子是双链的。除非另有规定，双链RNA分子或miRNA模拟物会理解为具有两条可以彼此分开并且不仅仅是通过发夹接头彼此连接的链。发夹分子具有一条能够分子内杂交的链。在一些实施方案中，miRNA模拟物是发夹分子。在其它实施方案中，miRNA模拟物是双链RNA分子。
在某些实施方案中，治疗性双链核酸具有第一活性链和第二过客链，所述第一活性链具有(a)“miRNA区”，其从5’至3’的序列与成熟miRNA序列的整个或区段相同，所述第二过客链具有(b)“互补区”，其从5’至3’的序列与miRNA序列是60%-100%互补的。在某些实施方案中，如下文限定的，还将这些合成的miRNA分离，或者纯化。术语“miRNA区”指合成的miRNA上与成熟的天然存在的miRNA序列的整个序列至少75、80、85、90、95、或100%相同(包括其间的所有整数)的区域。在某些实施方案中，miRNA区与天然存在的miRNA序列，诸如人miRNA序列是或至少是90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%相同的。或者，如通过本领域中公知的序列比对算法和方法比较的，miRNA区可以包含与天然存在的miRNA共同的18、19、20、21、22,、23、24或更多个核苷酸位置。
术语“互补区”指合成的miRNA中与成熟天然miRNA序列相同或至少是60%互补的区域。互补区是或至少是60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%互补的，或其中可导出的任何范围。在单一多核苷酸序列的情况中，由于miRNA区和互补区之间的化学键合而可以有发夹环结构。在其它实施方案中，互补区在与所述miRNA区不同的另一核酸链上，在该情况中互补区在过客链上，而miRNA区在活性链上。
术语“寡核苷酸”在本领域中理解为指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物，通常长度为不超过100个碱基或碱基对的。涵盖的是，寡核苷酸可以在5’端具有核苷。此术语包括寡核苷酸，其由天然存在的核碱基、糖和共价的核苷间连接组成。术语“寡核苷酸类似物”指具有一个或多个以与寡核苷酸类似的方式发挥功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。与天然存在的寡核苷酸相比，此类非天然存在的寡核苷酸可以具有期望的特性，诸如例如本文中公开的那些特性，包括但不限于升高的生理学活性、在存在核酸酶的情况下的稳定性升高、和/或升高的药动学特性。
术语“寡核苷”指经由没有磷原子的核苷间连接而化学连接的核苷。核苷间连接包括短链烷基、环烷基、混合的杂原子烷基、混合的杂原子环烷基、一个或多个短链杂原子的和一个或多个短链杂环的。这些核苷间连接包括但不限于硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、乙酰基、formacetyl、硫代formacetyl、亚甲基formacetyl、硫代formacetyl、烯基(alkeneyl)、氨基磺酸盐；亚甲基亚氨基、亚甲基肼基、磺酸盐、磺酰胺、酰胺和其它具有混合的N、O、S和CH2组分部分的连接。在上文所描述的修饰外，本发明的寡聚化合物的核苷可以具有多种其它修饰。适合于具有经修饰的碱基模块和或经修饰的糖模块的实施方案的其它核苷披露于美国专利No.6,383,808和PCT申请PCT/US89/02323，两篇在此通过提及而收录。
改变的碱基模块或改变的糖模块还包括与miRNA模拟物的目的一致的其它修饰。此类寡聚化合物最佳地记载为与天然存在的或合成的未修饰的寡核苷酸在结构上可区别，但在功能上可互换。本发明包括所有此类寡聚化合物，只要它们有效发挥功能以模拟期望的RNA或DNA寡核苷酸链的结构或功能。
在一些实施方案中，RNA模拟物包括碱基修饰或取代。RNA中的天然的或未修饰的碱基是腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，及嘧啶碱基胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)(DNA具有胸腺嘧啶(T))。比较而言，经修饰的碱基，又称为杂环碱基模块，包括其它合成的和天然的核碱基诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(包括5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶)、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
可以使用一种或多种碱基或糖修饰来诱导3’-内糖构象。核苷可以掺入杂环碱基、糖模块或两者的合成修饰以诱导期望的3’-内糖构象。使用这些经修饰的核苷来模拟RNA样核苷，从而可以在维持期望的3’-内构象几何学的情况下增强寡聚化合物的特定特性(参见美国专利申请公开文本2005/0261218的方案1，在此通过提及而将其收录)。
在一些实施方案中，RNA模拟物具有特别对具体是具有与成熟miRNA互补的序列的RNA模拟物链的5’端残基的修饰。此链在本文中称为“过客”链。不限于理论，互补链的5’端存在与磷酸根或羟基不同的稳定模块似乎损害或消除miRNA途径复合物对过客链的摄取，随后促进miRNA蛋白质复合物对活性链的摄取。5’修饰包括但不限于NH2、生物素、胺基团、低级烷基胺基团、低级烷基基团、NHCOCH3、乙酰基基团、2’氧-甲基(2’O-Me)、DMTO、荧光素、硫醇、或吖啶或任何其它具有此类官能性的基团。在其它实施方案中，提供了间隔物18(PEG)酰胺酯(DMT-六(乙二醇))。在其它实施方案中，提供了40个或更少碳的烷基胺或烷基基团。在牵涉“低级”烷基胺或烷基基团的实施方案中，“低级”会理解为指具有20或更少个碳的分子。
在具体的实施方案中，在过客链的5’端上有C4-C12胺接头。在具体的实施方案中，在过客链的第一个核苷酸的末端磷酸根上有C6胺：
Figure BDA0000389807070000221
在具体的实施方案中，在过客链的5’端上有C12胺接头。在其它实施方案中，在过客链的第一个核苷酸的末端磷酸根上有C8胺接头。
在本文中讨论的不同miRNA模拟物中，这些RNA分子可以具有的核苷酸具有与天然存在的糖或经修饰的糖对应的糖部分。代表性的经修饰的糖包括碳环或无环糖、在其2’、3’或4’位置之一或多处具有取代基基团的糖和具有替换糖的一个或多个氢原子的取代基的糖。在某些实施方案中，通过在2’位置处具有取代基基团修饰糖。在其它实施方案中，通过在3’位置处具有取代基基团修饰糖。在其它实施方案中，通过在4’位置处具有取代基基团修饰糖。还涵盖的是，糖可以在超过一个的那些位置处具有修饰，或者RNA分子可以具有一个或多个在一个位置处具有糖修饰的核苷酸及还有一个或多个在不同位置处具有糖修饰的核苷酸。
miRNA模拟物中涵盖的糖修饰包括但不限于选自下组的糖取代基基团：OH；F；O—、S—、或N-烷基；O—、S—、或N-烯基；O—、S—或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。在一些实施方案中，这些基团可以选自：O(CH2)xOCH3、O((CH2)xO)yCH3、O(CH2)xNH2、O(CH2)xCH3、O(CH2)xONH2、和O(CH2)xON((CH2)xCH3)2，其中x和y是1至10。
在一些实施方案中，miRNA模拟物具有选自下组的糖取代基基团：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、OCN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、插入剂、用于改善模拟物的药动学特性的基团、或用于改善模拟物的药效学特性的基团、和其它具有类似特性的取代基。在一个实施方案中，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，其又称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等,1995)，即烷氧基烷氧基基团。另一种修饰包括2’-二甲基氨基氧乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，又称为2’-DMAOE和2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中又称为2’-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O--CH2--O--CH2--N(CH3)2。
别的糖取代基基团包括烯丙基(—CH2—CH==CH2)、—O-烯丙基(—O—CH2—CH==CH2)、甲氧基(—O—CH3)、氨基丙氧基(--OCH2CH2CH2NH2)、和氟(F)。2’位置(2’-)上的糖取代基基团可以在阿拉伯糖(向上)位置或核糖(向下)位置中。一种2’-阿拉伯糖修饰是2’-F。也可以在寡聚化合物上的其它位置，特别是3’端核苷上或2’-5’连接的寡核苷酸中的糖的3’位置和5’端核苷酸的5’位置进行其它类似的修饰。寡聚化合物也可以具有糖模拟物，例如环丁基模块，替换戊呋喃糖基糖。披露制备经修饰的糖结构的美国专利的例子包括但不限于美国专利No.4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;5,792,747;及5,700,920，其通过提及完整并入本文。
代表性的糖取代基基团包括记载于美国专利申请公开文本2005/0261218(其在此通过提及收录)中的基团。在具体的实施方案中，糖修饰是在位置6’与碳连接的羧基基团上的2’O-Me修饰、2’F修饰、2’H修饰、2’氨基修饰、4’硫核糖修饰或硫代磷酸酯修饰，或其组合。
别的修饰披露于美国专利申请公开文本2010/0267814，其在此通过提及收录。虽然此参考文献披露了可以进行的一般修饰，但是它没有披露本文中所列的内容，即可以在特定核苷酸处和/或在特定且选择的位置中在特定序列的背景中进行修饰。
在一些实施方案中，治疗性核酸含有一个或多个设计元件。这些设计元件包括但不限于：(i)在互补区5’端的分别用于核苷酸或核苷的磷酸根或羟基的替换基团；(ii)在互补区的前或后1至6个残基中的一处或多处糖修饰；或者(iii)在互补区3’端的后1至5个残基中的一个或多个核苷酸与miRNA区的相应核苷酸之间的非互补性。
在某些实施方案中，合成的miRNA在其互补区的5’端具有核苷酸，其中磷酸根和/或羟基基团已经用另一个化学基团(称为“替换设计”)替换。在一些情况中，磷酸根基团用别的模块替换或添加到别的模块上，而在其它情况中，羟基基团已经用别的模块诸如上文在C6胺接头情况中描述的模块替换或添加至所述别的模块。在具体的实施方案中，模块是生物素、胺基团、低级烷基胺基团、乙酰基基团、2’O-Me(2’氧甲基)、DMTO(含氧的4,4’-二甲氧三苯甲基)、荧光素、硫醇、或吖啶，尽管其它模块是本领域技术人员公知的，并且也可以使用。
在本发明的其它实施方案中，提供了合成的miRNA，其中互补区3’端的最后1至5个残基中的一个或多个核苷酸与miRNA区的相应核苷酸不是互补的(“非互补性”)(称为“非互补性设计”)。非互补性可以在互补miRNA的最后1、2、3、4、和/或5个残基中。在某些实施方案中，提供了在互补区中具有至少2个核苷酸的非互补性。
涵盖的是，本发明的合成miRNA具有替换、糖修饰、或非互补性设计中的一项或多项。在某些情况中，合成的RNA分子具有其中两项，而在其它情况中，这些分子具有所有三种设计且是在适当位置。
miRNA区和互补区可以在同一或分开的多核苷酸上。在它们包含在同一多核苷酸之上或之中的情况中，会认为miRNA分子是单一多核苷酸。在不同区在分开的多核苷酸上的实施方案中，会认为合成的miRNA由两个多核苷酸构成。
在RNA分子是单一多核苷酸时，miRNA区和互补区之间有接头区。在一些实施方案中，单一多核苷酸由于miRNA区和互补区之间的键合而能够形成发夹环结构。接头构成发夹环。涵盖的是，在一些实施方案中，接头区的长度是，至少是，至多是2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,或40个残基，或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，接头的长度是3-30个残基(包括端点)。
在具有miRNA区和互补区外，在该区域的5’或3’端也可以有侧翼序列。在一些实施方案中，在这些区域的一侧或两侧侧翼有或至少有1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个核苷酸或更多个，或其中可导出的任何范围。
具有miRNA功能的RNA分子的长度可以是，至少是，或者至多是3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690,700,710,720,730,740,750,760,770,780,790,800,810,820,830,840,850,860,870,880,890,900,910,920,930,940,950,960,970,980,990,或1000个核苷酸，或其中可导出的任何范围。此类长度涵盖经加工的miRNA、miRNA探针、前体miRNA，含有miRNA的载体、对照核酸、和其它探针和引物的长度。在许多实施方案中，miRNA的长度是19-24个核苷酸，而miRNA探针的长度是5,10,15,20,25,30,至35个核苷酸，包括其间的所有数值和范围，这取决于经加工的miRNA和添加的任何侧翼区的长度。miRNA前体在人类中一般是62-110个核苷酸。
本发明的核酸可以具有与另一核酸的同一性或互补性的区域。涵盖的是，互补性或同一性区域可以是至少5个连续残基，尽管明确涵盖的是该区域是，至少是，或者至多是6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,或110个连续的核苷酸。进一步理解的是，前体miRNA内或miRNA探针和miRNA或miRNA基因之间的互补性长度是此类长度。此外，互补性可以以百分比表示，意味着探针与其靶物之间的互补性在探针的长度里是90%相同的或更大。在一些实施方案中，互补性是或至少是90%、95%或100%相同的。具体地，此类长度可以应用于包含本文中公开的任何SEQ ID NO中鉴定的核酸序列的任何核酸。
术语“重组”可以进行使用，并且这一般指已经在体外操作或者作为此类分子的复制或表达产物的分子。
术语“miRNA”一般指具有miRNA分子的序列和功能的RNA分子。在具体的实施方案中，本发明中的分子还会涵盖，与相同单链分子的另一区域或与另一核酸，部分地(在链长度间10-50%互补的)、基本上地(在链长度间大于50%，但小于100%互补的)或完全地互补的区域或别的链。如此，核酸可以涵盖包含一个或多个含有特定序列的分子的互补或自身互补链或“互补物”的分子。例如，前体miRNA可以具有自身互补区，其是多至100%互补的。本发明的miRNA探针或核酸可以包括，可以是或者可以至少是60,65,70,75,80,85,90,95,96,97,98,99或100%与其靶物互补的。
可以通过本领域普通技术人员已知的任何技术，诸如例如化学合成、酶促生成或生物学生成制备本发明的核酸。明确涵盖的是，化学合成本发明的miRNA探针。
在本发明的一些实施方案中，从生物学样品回收或分离miRNA。miRNA可以是重组的或者它对于细胞而言可以是天然的或内源的(自细胞基因组生成)。涵盖的是，可以以如下的方式处理生物学样品，使得增强小RNA分子诸如miRNA的回收。美国专利申请流水号10/667,126描述了此类方法，并且其通过提及明确并入本文。一般地，方法牵涉用具有胍盐和去污剂的溶液裂解细胞。
在某些方面，合成的miRNA是RNA或RNA类似物。miRNA模拟物可以是DNA和/或RNA，或其类似物。具有化学修饰的miRNA模拟物可以统称为“合成的核酸”。
在一些实施方案中，治疗性核酸可以具有10-200至17-130个残基，包括其间的所有数值和范围的miRNA或合成的miRNA序列。本发明关注miRNA或合成的miRNA分子，其长度是，至少是，或至多是10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,140,150,160,170,180,190,200或更多个残基，包括其间的任何整数或任何范围。
在某些方面，合成的核酸具有(a)“miRNA区”，其从5’至3’的序列或结合区与成熟miRNA序列的整个或区段是相同的或互补的，和(b)“互补区”，其从5’至3’的序列与(a)中的miRNA序列是60%-100%互补的。在某些实施方案中，还分离这些合成的核酸，如下文限定的。术语“miRNA区”指合成核酸上与成熟的天然存在的miRNA序列或其互补物的整个序列至少75,80,85,90,95,或100%相同(包括其间的所有整数)的区域。在某些实施方案中，miRNA区与天然存在的miRNA、或其区段、或其互补物的序列是或至少是90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,99.1,99.2,99.3,99.4,99.5,99.6,99.7,99.8,99.9或100%相同的。
本文中讨论了牵涉miR-34模拟物，包括具体的miR-34a和miR-34c模拟物的实施方案。这些模拟物的不同活性链和过客链遍及整个公开内容描述。涵盖的是，针对特定SEQ ID NO而讨论的实施方案可以与讨论相同SEQ ID NO的其它实施方案并存或替代讨论相同SEQ ID NO的其它实施方案实施。例如，与SEQ ID NO:5有至少90%同一性且有一个核苷酸/核苷取代的活性链可以与牵涉SEQ ID NO:5且在该序列中有插入的活性链的实施方案组合；因而，与SEQ ID NO:5具有至少90%同一性的活性链相对于SEQ ID NO:5会具有取代和插入两者。
在关注miRNA-34a模拟物的实施方案中，涵盖的是，RNA分子可以含有与SEQ ID NO:1是或至少是90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或100%相同或其中可导出的任何范围的活性链。在其它实施方案中，活性链与SEQ ID NO:2是或至少是90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或100%相同的，或其中可导出的任何范围。
在一些实施方案中，活性链与SEQ ID NO:2(5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU-3’)(23聚体)是95%相同的。在某些实施方案中，活性链具有从5’至3’的下列序列，其中来自SEQ ID NO:2的一个核苷酸是缺失的：
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:1)(先前在位置23处的U是缺失的)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:1)(先前在位置22处的U是缺失的)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUUU(SEQ ID NO:11)(先前在位置21处的G是缺失的)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUGUU(SEQ ID NO:12)(先前在位置20处的U是缺失的)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUGUU(SEQ ID NO:12)(先前在位置19处的U是缺失的)
UGGCAGUGUCUUAGCUGUUGUU(SEQ ID NO:13)(先前在位置18处的G是缺失的)
UGGCAGUGUCUUAGCUGUUGUU(SEQ ID NO:13)(先前在位置17处的G是缺失的)
UGGCAGUGUCUUAGCGGUUGUU(SEQ ID NO:14)(先前在位置16处的U是缺失的)
UGGCAGUGUCUUAGUGGUUGUU(SEQ ID NO:15)(先前在位置15处的C是缺失的)
UGGCAGUGUCUUACUGGUUGUU(SEQ ID NO:16)(先前在位置14处的G是缺失的)
UGGCAGUGUCUUGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:17)UGGCAGUGUCUUACUGGUUGUU(SEQ ID NO:16)(先前在位置13处的A是缺失的)
UGGCAGUGUCUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:18)(先前在位置12处的U是缺失的)
UGGCAGUGUCUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:18)(先前在位置11处的U是缺失的)
UGGCAGUGUUUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:19)(先前在位置10处的C是缺失的)
UGGCAGUGCUUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:20)(先前在位置9处的U是缺失的)
UGGCAGUUCUUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:21)(先前在位置8处的G是缺失的)
UGGCAGGUCUUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:22)(先前在位置7处的U是缺失的)
UGGCAUGUCUUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:23)(先前在位置6处的G是缺失的)
UGGCGUGUCUUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:24)(先前在位置5处的A是缺失的)
UGGAGUGUCUUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:25)(先前在位置4处的C是缺失的)
UGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:26)(先前在位置3处的G是缺失的)
UGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:26)(先前在位置2处的G是缺失的)
GGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU(SEQ ID NO:27)(先前在位置1处的U是缺失的)
在相对于SEQ ID NO:2已经删除核苷酸的实施方案中，涵盖的是，可以相应地调节经修饰的核苷酸的命名。
在一些实施方案中，涵盖的是，具有与SEQ ID NO:1至少95%相同的序列的活性链相对于链的5’或3’端在下列一个或多个位置处具有核苷酸修饰：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,或22。在其它实施方案中，涵盖的是，活性链的下列核苷酸可以被修饰：相对于SEQ ID NO:1在位置1处的U；相对于SEQ ID NO:1在位置2处的G；相对于SEQ ID NO:1在位置3处的G；相对于SEQ ID NO:1在位置4处的C；相对于SEQ ID NO:1在位置5处的A；相对于SEQ ID NO:1在位置6处的G；相对于SEQ ID NO:1在位置7处的U；相对于SEQ ID NO:1在位置8处的G；相对于SEQ ID NO:1在位置9处的U；相对于SEQ ID NO:1在位置10处的C；相对于SEQ ID NO:1在位置11处的U；相对于SEQ ID NO:1在位置12处的U；相对于SEQ ID NO:1在位置13处的A；相对于SEQ ID NO:1在位置14处的G；相对于SEQ ID NO:1在位置15处的C；相对于SEQ ID NO:1在位置16处的U；相对于SEQ ID NO:1在位置17处的G；相对于SEQ ID NO:1在位置18处的G；相对于SEQ ID NO:1在位置19处的U；相对于SEQ ID NO:1在位置20处的U；相对于SEQ ID NO:1在位置21处的G；和/或相对于SEQ ID NO:1在位置22处的U。这意味着活性链可以不再具有所述位置处的核苷酸，但是在SEQ ID NO:1序列的背景中，活性链中的特定核苷酸是经修饰的。这意味着其位置可以改变±1或±2；例如，相对于SEQ ID NO:1在位置7处的U可以在活性链中的位置8或位置9处，因为已经有影响其位置编号的插入。
在一些实施方案中，涵盖的是，具有与SEQ ID NO:2至少95%相同的序列的活性链相对于链的5’或3’端在下列一个或多个位置处具有核苷酸修饰：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,或23。在其它实施方案中，涵盖的是，活性链的下列核苷酸可以被修饰：相对于SEQID NO:2在位置1处的U；相对于SEQ ID NO:2在位置2处的G；相对于SEQ IDNO:2在位置3处的G；相对于SEQ ID NO:2在位置4处的C；相对于SEQ IDNO:2在位置5处的A；相对于SEQ ID NO:2在位置6处的G；相对于SEQ IDNO:2在位置7处的U；相对于SEQ ID NO:2在位置8处的G；相对于SEQ IDNO:2在位置9处的U；相对于SEQ ID NO:2在位置10处的C；相对于SEQ IDNO:2在位置11处的U；相对于SEQ ID NO:2在位置12处的U；相对于SEQ IDNO:2在位置13处的A；相对于SEQ ID NO:2在位置14处的G；相对于SEQ IDNO:2在位置15处的C；相对于SEQ ID NO:2在位置16处的U；相对于SEQ IDNO:2在位置17处的G；相对于SEQ ID NO:2在位置18处的G；相对于SEQ IDNO:2在位置19处的U；相对于SEQ ID NO:2在位置20处的U；相对于SEQ IDNO:2在位置21处的G；相对于SEQ ID NO:2在位置22处的U；和/或相对于SEQID NO:2在位置23处的U。这意味着活性链可以不再具有所述位置处的核苷酸，但是在SEQ ID NO:2序列的背景中，活性链中的特定核苷酸是经修饰的。这意味着其位置可以改变±1或±2；例如，相对于SEQ ID NO:1在位置10处的C可以在活性链中的位置8或位置12处，因为已经(分别)有影响其位置编号的缺失或插入。
在一些实施方案中，活性链与SEQ IDΝΟ:1(5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’)是95%相同的。在某些实施方案中，此类活性链具有从5’至3’的下列序列，其中一个核苷酸用不同核糖核苷酸(A,C,G,或U)取代，如以N表示的：
NGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:27)
UNGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:28)
UGNCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:29)
UGGNAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:30)
UGGCNGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:31)
UGGCANUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:32)
UGGCAGNGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:33)
UGGCAGUNUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:34)
UGGCAGUGNCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:35)
UGGCAGUGUNUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:36)
UGGCAGUGUCNUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:37)
UGGCAGUGUCUNAGCUGGUUGU(SEQ ID NO:38)
UGGCAGUGUCUUNGCUGGUUGU(SEQ ID NO:39)
UGGCAGUGUCUUANCUGGUUGU(SEQ ID NO:40)
UGGCAGUGUCUUAGNUGGUUGU(SEQ ID NO:41)
UGGCAGUGUCUUAGCNGGUUGU(SEQ ID NO:42)
UGGCAGUGUCUUAGCUNGUUGU(SEQ ID NO:43)
UGGCAGUGUCUUAGCUGNUUGU(SEQ ID NO:44)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGNUGU(SEQ ID NO:45)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUNGU(SEQ ID NO:46)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUNU(SEQ ID NO:47)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGN(SEQ ID NO:48)
在一些实施方案中，活性链与SEQ ID NO:2(5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU-3’)是至少95%相同的，具有相对于SEQ ID NO:2的核苷酸的取代。在此类实施方案中，除了它在SEQ ID NO:2中具有3’端添加的U或最后一个U具有取代外，活性链的序列包含上文公开的序列之一。在其它实施方案中，除了相对于SEQ ID NO:2有两个核苷酸的取代外，提供了与SEQ ID NO:2至少90%相同的活性链。在此类实施方案中，除了SEQ ID NO:2中有添加的U或最后一个U具有取代外，上文公开的序列中有额外的取代。
在一些实施方案中，活性链与SEQ ID NO:1是95-100%相同的，其应当包括上文公开的序列。此类活性链的其它例子包括具有单核苷酸插入的活性链，如下文讨论的，其中从5’至3’的下列序列具有称为N(其可以是A,C,G,或U)的核苷酸插入：
NUGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：49)
UNGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：50)
UGNGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：51)
UGGNCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：52)
UGGCNAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：53)
UGGCANGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：54)
UGGCAGNUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：55)
UGGCAGUNGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：56)
UGGCAGUGNUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：57)
UGGCAGUGUNCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：58)
UGGCAGUGUCNUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：59)
UGGCAGUGUCUNUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：60)
UGGCAGUGUCUUNAGCUGGUUGU(SEQ ID NO：61)
UGGCAGUGUCUUANGCUGGUUGU(SEQ ID NO：62)
UGGCAGUGUCUUAGNCUGGUUGU(SEQ ID NO：63)
UGGCAGUGUCUUAGCNUGGUUGU(SEQ ID NO：64)
UGGCAGUGUCUUAGCUNGGUUGU(SEQ ID NO：65)
UGGCAGUGUCUUAGCUGNGUUGU(SEQ ID NO：66)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGNUUGU(SEQ ID NO：67)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUNUGU(SEQ ID NO：68)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUNGU(SEQ ID NO：69)
UGGCAGUGUCUUAGC UGGUUGNU(SEQ ID NO：70)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUN(SEQ ID NO：71)
在一些实施方案中，在上文显示的单一插入外，相对于SEQ ID NO：1在序列中的别处有第二处插入或添加。涵盖的是，第二处插入可以在新近或先前位于位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，或23处的核苷酸后面。此外，在一些实施方案中，活性链与SEQ ID NO：2(5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU-3’)是95％相同的，其包括相对于SEQ ID NO：2的核苷酸的插入。在此类实施方案中，除了它具有3’端添加的U外(除了就添加的U而言在3’端有插入的情况外)，活性链的序列包括上文公开的序列之一。实施方案包括那些相对于SEQ ID NO:2具有一处或两处插入的。
在一些实施方案中，活性链与SEQ ID NO:2是95-100%相同的，其应当包括上文公开的序列。此类活性链会包含在可以充当miR-34a模拟物的RNA分子中。此类活性链的其它例子包含具有单核苷酸对SEQ ID NO:2序列的插入的活性链。
在某些实施方案中，活性链具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2是或至少是95%相同的序列。SEQ ID NO:1(长度为22个核苷酸)与SEQ ID NO:2(长度为23个核苷酸)是95.7%相同的，并且SEQ ID NO:2中的22个连续核苷酸的片段与SEQ ID:1是100%相同的。
注意到，在一些实施方案中，活性链的序列由SEQ ID NO:1组成，这意味着活性链具有的序列与SEQ ID NO:1是100%相同的。在其它实施方案中，活性链的序列由SEQ ID NO:2组成，这意味着活性链具有的序列与SEQ IDNO:2是100%相同的。在任何这些实施方案中，涵盖的是，活性链可以包含相对于活性链5’端位于位置1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,171,18,19,20,21,22和/或23(其中位置1是链的5’端)处的核苷酸的修饰。这意味着所述位置处的核苷酸是经修饰的，并且此名称不依赖于所述位置处的特定核苷酸的身份。与基于核苷酸的形成对比，此名称是基于位置的。在其它实施方案中，名称是基于核苷酸的。在某些实施方案中，名称可以是相对于活性链3’端基于位置的；在此类情况中，活性链可以包括距离活性链的3’端1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,171,18,19,20,21,22和/或23个核苷酸定位的核苷酸修饰。在一些实施方案中，基于核苷酸的名称列出活性链可以在下列核苷酸处修饰：SEQ ID NO:2中位置1处的U；SEQ ID NO:1中位置1处且SEQ ID NO:2中位置2处的U；SEQ ID NO:1中位置2处且SEQ IDNO:2中位置3处的A；SEQ ID NO:1中位置3处且SEQ ID NO:2中位置4处的A；SEQ ID NO:1中位置4处且SEQ ID NO:2中位置5处的G；SEQ ID NO:1中位置5处且SEQ ID NO:2中位置6处的G；SEQ ID NO:1中位置6处且SEQ ID NO:2中位置7处的C；SEQ ID NO:1中位置7处且SEQ ID NO:2中位置8处的A；SEQ ID NO:1中位置8处且SEQ ID NO:2中位置9处的C；SEQ ID NO:1中位置9处且SEQ ID NO:2中位置10处的G；SEQ ID NO:1中位置10处且SEQ IDNO:2中位置11处的C；SEQ ID NO:1中位置11处且SEQ ID NO:2中位置12处的G；SEQ ID NO:1中位置12处且SEQ ID NO:2中位置13处的G；SEQ ID NO:1中位置13处且SEQ ID NO:2中位置14处的U；SEQ ID NO:1中位置14处且SEQ ID NO:2中位置15处的G；SEQ ID NO:1中位置15处且SEQ ID NO:2中位置16处的A；SEQ ID NO:1中位置16处且SEQ ID NO:2中位置17处的A；SEQID NO:1中位置17处且SEQ ID NO:2中位置18处的U；SEQ ID NO:1中位置18处且SEQ ID NO:2中位置19处的G；SEQ ID NO:1中位置19处且SEQ ID NO:2中位置20处的C；SEQ ID NO:1中位置20处且SEQ ID NO:2中位置21处的C；和/或SEQ ID NO:2中位置22处的A。
在关注miRNA-34c模拟物的实施方案中，涵盖的是，RNA分子可以含有活性链，该活性链与SEQ ID NO:5是或至少是90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或100%相同的，或其中可导出的任何范围。
在一些实施方案中，活性链与SEQ ID NO:5(5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’)(23聚体)是95%相同的。在某些实施方案中，活性链具有从5’至3’的下列序列，其中来自SEQ ID NO:5的一个核苷酸是缺失的：
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUG(SEQ ID NO:72)(先前在位置23处的C是缺失的)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUC(SEQ ID NO:73)(先前在位置22处的G是缺失的)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUGC(SEQ ID NO:74)(先前在位置21处的U是缺失的)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUGC(SEQ ID NO:74)(先前在位置20处的U是缺失的)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGUUGC(SEQ ID NO:75)(先前在位置19处的A是缺失的)
AGGCAGUGUAGUUAGCUAUUGC(SEQ ID NO:76)(先前在位置18处的G是缺失的)
AGGCAGUGUAGUUAGCGAUUGC(SEQ ID NO:77)(先前在位置17处的U是缺失的)
AGGCAGUGUAGUUAGUGAUUGC(SEQ IDNO:78)(先前在位置16处的C是缺失的)
AGGCAGUGUAGUUACUGAUUGC(SEQ ID NO:79)(先前在位置15处的G是缺失的)
AGGCAGUGUAGUUGCUGAUUGC(SEQ ID NO:80)(先前在位置14处的A是缺失的)
AGGCAGUGUAGUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:81)(先前在位置13处的U是缺失的)
AGGCAGUGUAGUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:81)(先前在位置12处的U是缺失的)
AGGCAGUGUAUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:82)(先前在位置11处的G是缺失的)
AGGCAGUGUGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:83)(先前在位置10处的A是缺失的)
AGGCAGUGAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:84)(先前在位置9处的U是缺失的)
AGGCAGUUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:85)(先前在位置8处的G是缺失的)
AGGCAGGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:86)(先前在位置7处的U是缺失的)
[00264AGGCAUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:87)(先前在位置6处的G是缺失的)
AGGCGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:88)(先前在位置5处的A是缺失的)
AGGAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:89)(先前在位置4处的C是缺失的)
AGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:90)(先前在位置3处的G是缺失的)
AGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:90)(先前在位置2处的G是缺失的)
GGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO:91)(先前在位置1处的A是缺失的)
在已经相对于SEQ ID NO:5删除核苷酸的实施方案中，涵盖的是，可以相应地调节经修饰的核苷酸的名称。
在一些实施方案中，涵盖的是，具有与SEQ ID NO:5至少95%相同的序列的活性链相对于链的5’或3’端在下列一个或多个位置处具有核苷酸修饰：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,或23。在其它实施方案中，涵盖的是，活性链的下列核苷酸可以被修饰：相对于SEQID NO:5在位置1处的A；相对于SEQ ID NO:5在位置2处的G；相对于SEQ IDNO:5在位置3处的G；相对于SEQ ID NO:5在位置4处的C；相对于SEQ IDNO:5在位置5处的A；相对于SEQ ID NO:5在位置6处的G；相对于SEQ IDNO:5在位置7处的U；相对于SEQ ID NO:5在位置8处的G；相对于SEQ IDNO:5在位置9处的U；相对于SEQ ID NO:5在位置10处的A；相对于SEQ IDNO:5在位置11处的G；相对于SEQ ID NO:5在位置12处的U；相对于SEQ IDNO:5在位置13处的U；相对于SEQ ID NO:5在位置14处的A；相对于SEQ IDNO:5在位置15处的G；相对于SEQ ID NO:5在位置16处的C；相对于SEQ IDNO:5在位置17处的U；相对于SEQ ID NO:5在位置18处的G；相对于SEQ IDNO:5在位置19处的A；相对于SEQ ID NO:5在位置20处的U；相对于SEQ IDNO:5在位置21处的U；相对于SEQ ID NO:5在位置22处的G；和/或相对于SEQID NO:5在位置23处的C。这意味着活性链可以不再具有所述位置处的核苷酸，但是在SEQ ID NO:5序列的背景中，活性链中的特定核苷酸是经修饰的。这意味着其位置可以改变±1或±2；例如，相对于SEQ ID NO:5在位置7处的U可以在活性链中的位置7或位置8处，因为已经分别有影响其位置编号的缺失或插入。
在一些实施方案中，活性链与SEQ ID NO:5(5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’)是至少95%相同的。在某些实施方案中，此类活性链具有从5’至3’的下列序列，其中一个核苷酸用不同核糖核苷酸(A,C,G或U)取代，如以N表示的：
NGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：92)
ANGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：93)
AGNCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：94)
AGGNAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：95)
AGGCNGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：96)
AGGCANUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：97)
AGGCAGNGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：98)
AGGCAGUNUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：99)
AGGCAGUGNAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：100)
AGGCAGUGUNGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：101)
AGGCAGUGUANUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：102)
AGGCAGUGUAGNUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：103)
AGGCAGUGUAGUNAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：104)
AGGCAGUGUAGUUNGCUGAUUGC(SEQ ID NO：105)
AGGCAGUGUAGUUANCUGAUUGC(SEQ ID NO：106)
AGGCAGUGUAGUUAGNUGAUUGC(SEQ ID NO：107)
AGGCAGUGUAGUUAGCNGAUUGC(SEQ ID NO：108)
AGGCAGUGUAGUUAGCUNAUUGC(SEQ ID NO：109)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGNUUGC(SEQ ID NO：110)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGANUGC(SEQ ID NO：111)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUNGC(SEQ ID NO：112)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUNC(SEQ ID NO：113)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGN(SEQ ID NO：114)
在一些实施方案中，活性链与SEQ ID NO：5是至少90％相同的。在此类实施方案中，活性链的序列包含上文公开的序列之一，并且在上文显示的取代外，可以有一处其它插入、缺失、或取代(诸如本文中讨论的那些)。
在一些实施方案中，活性链与SEQ ID NO：5是95-100％相同的。此类活性链的例子包括具有单核苷酸插入的活性链，如下文讨论的，其中从5’至3’的下列序列具有称为N(其可以是A，C，G或U)的核苷酸插入：
NAGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：115)
ANGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：116)
AGNGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：117)
AGGNCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：118)
AGGCNAGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：119)
AGGCANGUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：120)
AGGCAGNUGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：121)
AGGCAGUNGUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：122)
AGGCAGUGNUAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：123)
AGGCAGUGUNAGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：124)
AGGCAGUGUANGUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：125)
AGGCAGUGUAGNUUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：126)
AGGCAGUGUAGUNUAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：127)
AGGCAGUGUAGUUNAGCUGAUUGC(SEQ ID NO：128)
GGCAGUGUAGUUANGCUGAUUGC(SEQ ID NO：129)
AGGCAGUGUAGUUAGNCUGAUUGC(SEQ ID NO：130)
AGGCAGUGUAGUUAGCNUGAUUGC(SEQ ID NO：131)
AGGCAGUGUAGUUAGCUNGAUUGC(SEQ ID NO：132)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGNAUUGC(SEQ ID NO：133)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGANUUGC(SEQ ID NO：134)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUNUGC(SEQ ID NO：135)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUNGC(SEQ ID NO：136)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGNC(SEQ ID NO：137)
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGCN(SEQ ID NO：138)
在一些实施方案中，在上文显示的单一插入外，相对于SEQ ID NO：5在序列中的别处有第二处插入或添加。涵盖的是，第二处插入可以在新近或先前位于位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，或23处的核苷酸后面。
在牵涉miR-34a模拟物的某些实施方案中，过客链具有与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4是或至少是95％相同的序列。SEQ ID NO：3(长度是20个核苷酸)与SEQ ID NO：4(长度是22个核苷酸)是90.9％相同的，并且SEQ ID NO：4中的20个连续核苷酸的片段与SEQ ID：3是100％相同的。
注意到，在一些实施方案中，过客链的序列由SEQ ID NO：3组成，这意味着过客链具有的序列与SEQ ID NO：3是100％相同的。在其它实施方案中，过客链的序列由SEQ ID NO：4组成，这意味着过客链具有的序列与SEQ IDNO：4是100％相同的。在任何这些实施方案中，涵盖的是，过客链可以包含相对于过客链5’端位于位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，171，18，19，20，21，和/或22(其中位置1是链的5’端)处的核苷酸的修饰。这意味着所述位置处的核苷酸是经修饰的，并且此名称不依赖于所述位置处的特定核苷酸的身份。与基于核苷酸的形成对比，此名称是基于位置的。在其它实施方案中，名称是基于核苷酸的。在某些实施方案中，名称可以是相对于过客链3’端基于位置的；在此类情况中，过客链可以包括距离过客链的3’端1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，171，18，19，20，21，和/或22个核苷酸定位的核苷酸修饰。
涵盖的是，RNA分子可以含有过客链，该过客链与SEQ ID NO：3是或至少是90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％相同的，或其中可导出的任何范围。在其它实施方案中，过客链与SEQ ID NO：4是或至少是90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100％相同的，或其中可导出的任何范围。
在一些实施方案中，过客链与SEQ ID NO:3(5’-ACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’)(22聚体)是95%相同的。在某些实施方案中，活性链具有从5’至3’的下列序列，其中来自SEQ ID NO:3的一个核苷酸是缺失的：
ACAACCAGCUAAGACACUGCC(SEQ ID NO:139)(先前在位置22处的A是缺失的)
ACAACCAGCUAAGACACUGCA(SEQ ID NO:140)(先前在位置21处的C是缺失的)
ACAACCAGCUAAGACACUGCA(SEQ ID NO:140)(先前在位置20处的C是缺失的)
ACAACCAGCUAAGACACUCCA(SEQ ID NO:141)(先前在位置19处的G是缺失的)
ACAACCAGCUAAGACACGCCA(SEQ ID NO:142)(先前在位置18处的U是缺失的)
ACAACCAGCUAAGACAUGCCA(SEQ ID NO:143)(先前在位置17处的C是缺失的)
ACAACCAGCUAAGACCUGCCA(SEQ ID NO:144)(先前在位置16处的A是缺失的)
ACAACCAGCUAAGAACUGCCA(SEQ ID NO:145)(先前在位置15处的C是缺失的)
ACAACCAGCUAAGCACUGCCA(SEQ ID NO:146)(先前在位置14处的A是缺失的)
ACAACCAGCUAAACACUGCCA(SEQ ID NO:147)(先前在位置13处的G是缺失的)
ACAACCAGCUAGACACUGCCA(SEQ ID NO:148)(先前在位置12处的A是缺失的)
ACAACCAGCUAGACACUGCCA(SEQ ID NO:148)(先前在位置11处的A是缺失的)
ACAACCAGCAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:149)(先前在位置10处的U是缺失的)
ACAACCAGUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:150)(先前在位置9处的C是缺失的)
ACAACCACUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:151)(先前在位置8处的G是缺失的)
ACAACCGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:152)(先前在位置7处的A是缺失的)
ACAACAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:153)(先前在位置6处的C是缺失的)
ACAACAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:153)(先前在位置5处的C是缺失的)
ACACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:154)(先前在位置4处的A是缺失的)
ACACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:154)(先前在位置3处的A是缺失的)
AAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:155)(先前在位置2处的C是缺失的)
CAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:156)(先前在位置1处的A是缺失的)
在已经相对于SEQ ID NO:3删除核苷酸的实施方案中，涵盖的是，可以相应地调节经修饰的核苷酸的名称。
在一些实施方案中，涵盖的是，具有与SEQ ID NO:3至少95%相同的序列的活性链相对于该链的5’或3’端在下列一个或多个位置处具有核苷酸修饰：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,或22：相对于SEQ ID NO:3在位置1处的A；相对于SEQ ID NO:3在位置2处的C；相对于SEQ ID NO:3在位置3处的A；相对于SEQ ID NO:3在位置4处的A；相对于SEQ ID NO:3在位置5处的C；相对于SEQ ID NO:3在位置6处的C；相对于SEQID NO:3在位置7处的A；相对于SEQ ID NO:3在位置8处的G；相对于SEQ IDNO:3在位置9处的C；相对于SEQ ID NO:3在位置10处的U；相对于SEQ IDNO:3在位置11处的A；相对于SEQ ID NO:3在位置12处的A；相对于SEQ IDNO:3在位置13处的G；相对于SEQ ID NO:3在位置14处的A；相对于SEQ IDNO:3在位置15处的C；相对于SEQ ID NO:3在位置16处的A；相对于SEQ IDNO:3在位置17处的C；相对于SEQ ID NO:3在位置18处的U；相对于SEQ IDNO:3在位置19处的G；相对于SEQ ID NO:3在位置20处的C；相对于SEQ IDNO:3在位置21处的C；和/或相对于SEQ ID NO:3在位置22处的A。这意味着过客链可以不再具有所述位置处的核苷酸，但是在SEQ ID NO:3序列的背景中，活性链中的特定核苷酸是经修饰的。这意味着其位置可以改变-1或+1；例如，相对于SEQ ID NO:3在位置11处的G可以在过客链中的位置10或位置12处，因为已经有影响其位置编号的插入或缺失。
在一些实施方案中，过客链与SEQ ID NO:4(5’-AACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’)是95%相同的，其比SEQ IDNO:2长2个碱基。在某些实施方案中，过客链具有从5’至3’的下列序列，其中来自SEQ ID NO:4的一个核苷酸是缺失的：
AACAACCAGCUAAGACACUGCC(SEQ ID NO:157)(先前在位置23处的A是缺失的)
AACAACCAGCUAAGACACUGCA(SEQ ID NO:158)(先前在位置22处的C是缺失的)
AACAACCAGCUAAGACACUGCA(SEQ ID NO:158)(先前在位置21处的C是缺失的)
AACAACCAGCUAAGACACUCCA(SEQ ID NO:159)(先前在位置20处的G是缺失的)
AACAACCAGCUAAGACACGCCA(SEQ ID NO:160)(先前在位置19处的U是缺失的)
AACAACCAGCUAAGACAUGCCA(SEQ ID NO:161)(先前在位置18处的C是缺失的)
AACAACCAGCUAAGACCUGCCA(SEQ ID NO:162)(先前在位置17处的A是缺失的)
AACAACCAGCUAAGAACUGCCA(SEQ ID NO:163)(先前在位置16处的C是缺失的)
AACAACCAGCUAAGCACUGCCA(SEQ ID NO:164)(先前在位置15处的A是缺失的)
AACAACCAGCUAAACACUGCCA(SEQ ID NO:165)(先前在位置14处的G是缺失的)
AACAACCAGCUAGACACUGCCA(SEQ ID NO:166)(先前在位置13处的A是缺失的)
AACAACCAGCUAGACACUGCCA(SEQ ID NO:166)(先前在位置12处的A是缺失的)
AACAACCAGCAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:167)(先前在位置11处的U是缺失的)
[00365AACAACCAGUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:168)(先前在位置10处的C是缺失的)
AACAACCACUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:169)(先前在位置9处的G是缺失的)
AACAACCGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:170)(先前在位置8处的A是缺失的)
AACAACAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:171)(先前在位置7处的C是缺失的)
AACAACAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:171)(先前在位置6处的C是缺失的)
AACACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:172)(先前在位置5处的A是缺失的)
AACACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:173)(先前在位置4处的A是缺失的)
AAAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:174)(先前在位置3处的C是缺失的)
ACAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:175)(先前在位置2处的A是缺失的)
ACAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO:175)(先前在位置1处的A是缺失的)
在相对于SEQ ID NO:4已经删除核苷酸的实施方案中，涵盖的是，可以相应地调节经修饰的核苷酸的命名。在一些实施方案中，涵盖的是，具有与SEQ ID NO:4至少95%相同的序列的活性链相对于链的5’或3’端在下列一个或多个位置处具有核苷酸修饰：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21或22。
在其它实施方案中，涵盖的是，活性链的下列核苷酸可以被修饰：相对于SEQ ID NO:4在位置1处的A；相对于SEQ ID NO:4在位置2处的A；相对于SEQ ID NO:4在位置3处的C；相对于SEQ ID NO:4在位置4处的A；相对于SEQ ID NO:4在位置5处的A；相对于SEQ ID NO:4在位置6处的C；相对于SEQID NO:4在位置7处的C；相对于SEQ ID NO:4在位置8处的A；相对于SEQ IDNO:4在位置9处的G；相对于SEQ ID NO:4在位置10处的C；相对于SEQ IDNO:4在位置11处的U；相对于SEQ ID NO:4在位置12处的A；相对于SEQ IDNO:4在位置13处的A；相对于SEQ ID NO:4在位置14处的G；相对于SEQ IDNO:4在位置15处的A；相对于SEQ ID NO:4在位置16处的C；相对于SEQ IDNO:4在位置17处的A；相对于SEQ ID NO:4在位置18处的C；相对于SEQ IDNO:4在位置19处的U；相对于SEQ ID NO:4在位置20处的G；相对于SEQ IDNO:4在位置21处的C；相对于SEQ ID NO:4在位置23处的C；和/或相对于SEQID NO:4在位置23处的A。这意味着活性链可以不再具有所述位置处的核苷酸，但是在SEQ ID NO:2序列的背景中，活性链中的特定核苷酸是经修饰的。这意味着其位置可以改变-1或-2；例如，相对于SEQ ID NO:2在位置11处的C可以在活性链中的位置10处，因为已经有影响其位置编号的缺失。
在一些实施方案中，过客链与SEQ ID NO:3(5’-ACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’)是95%相同的。在某些实施方案中，此类过客链具有从5’至3’的下列序列，其中一个核苷酸用不同核糖核苷酸(A,C,G,或U)取代，如以N表示的：
NCAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：176)
ANAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：177)
ACNACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：178)
ACANCCAGCUAAGACACUGCCA(S EQ ID NO：179)
ACAANCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：180)
ACAACNAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：181)
ACAACCNGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：182)
ACAACCANCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：183)
ACAACCAGNUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：184)
ACAACCAGCNAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：185)
ACAACCAGCUNAGACACUGCCA(SEQ ID NO：186)
ACAACCAGCUANGACACUGCCA(SEQ ID NO：187)
ACAACCAGCUAANACACUGCCA(SEQ ID NO：188)
ACAACCAGCUAAGNCACUGCCA(SEQ ID NO：189)
ACAACCAGCUAAGANACUGCCA(SEQ ID NO：190)
ACAACCAGCUAAGACNCUGCCA(SEQ ID NO：191)
ACAACCAGCUAAGACANUGCCA(SEQ ID NO：192)
ACAACCAGCUAAGACACNGCCA(SEQ ID NO：193)
ACAACCAGCUAAGACACUNCCA(SEQ ID NO：194)
ACAACCAGCUAAGACACUGNCA(SEQ ID NO：195)
ACAACCAGCUAAGACACUGCNA(SEQ ID NO：196)
ACAACCAGCUAAGACACUGCCN(SEQ ID NO：197)
在一些实施方案中，在上文显示的单一取代外，相对于SEQ ID NO：3在序列中的别处有第二处取代。进一步涵盖的是，可以有第二处取代及上文所描述的过客链中描述的取代之一，或在上文所描述的取代外的一处或两处核苷酸缺失。
在一些实施方案中，过客链与SEQ ID NO：3是95-100％相同的，其应当包括上文公开的序列。此类过客链的其它例子包括具有单一核苷酸插入的过客链，如下文讨论的，其中从5’至3’的下列序列具有称为N(其可以是A、C、G、或U)的核苷酸插入：
NACAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：198)
ANCAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：199)
ACNAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：200)
ACANACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：201)
ACAANCCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：202)
ACAACNCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：203)
ACAACCNAGCUAAGACACUGCCA(SEQ IDNO：204)
ACAACCANGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：205)
ACAACCAGNCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：206)
ACAACCAGCNUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：207)
ACAACCAGCUNAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：208)
ACAACCAGCUANAGACACUGCCA(SEQ ID NO：209)
ACAACCAGCUAANGACACUGCCA(SEQ ID NO：210)
ACAACCAGCUAAGNACACUGCCA(SEQ ID NO：211)
ACAACCAGCUAAGANCACUGCCA(SEQ ID NO：212)
ACAACCAGCUAAGACNACUGCCA(SEQ ID NO：213)
ACAACCAGCUAAGACANCUGCCA(SEQ ID NO：214)
ACAACCAGCUAAGACACNUGCCA(SEQ ID NO：215)
ACAACCAGCUAAGACACUNGCCA(SEQ ID NO：216)
ACAACCAGCUAAGACACUGNCCA(SEQ ID NO：217)
ACAACCAGCUAAGACACUGCNCA(SEQ ID NO：218)
ACAACCAGCUAAGACACUGCCNA(SEQ ID NO：219)
ACAACCAGCUAAGACACUGCCAN(SEQ ID NO：220)
在一些实施方案中，在上文相对于SEQ ID NO：3显示的过客链中的插入外，在链中的别处可以有第二处插入。别的过客链还涵盖上文显示的过客链中的插入组合。
在一些实施方案中，过客链与SEQ ID NO：4(5’-AACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’)是或至少是90％相同的。在某些实施方案中，此类过客链具有从5’至3’的下列序列，其中一个或两个核苷酸用不同核糖核苷酸取代。在某个实施方案中，提供了如以N表示的一处取代：
NAACAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：221)
ANACAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：222)
AANCAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：223)
AACNAACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：224)
AACANACCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：225)
AACAANCCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：226)
AACAACNCAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：227)
AACAACCNAGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：228)
AACAACCANGCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：229)
AACAACCAGNCUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：230)
AACAACCAGCNUAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：231)
AACAACCAGCUNAAGACACUGCCA(SEQ ID NO：232)
AACAACCAGCUANAGACACUGCCA(SEQ ID NO：233)
AACAACCAGCUAANGACACUGCCA(SEQ ID NO：234)
AACAACCAGCUAAGNACACUGCCA(SEQ ID NO：235)
AACAACCAGCUAAGANCACUGCCA(SEQ ID NO：236)
AACAACCAGCUAAGACNACUGCCA(SEQ ID NO：237)
AACAACCAGCUAAGACANCUGCCA(SEQ ID NO：238)
AACAACCAGCUAAGACACNUGCCA(SEQ ID NO：239)
AACAACCAGCUAAGACACUNGCCA(SEQ ID NO：240)
AACAACCAGCUAAGACACUGNCCA(SEQ ID NO：241)
AACAACCAGCUAAGACACUGCNCA(SEQ ID NO：242)
AACAACCAGCUAAGACACUGCCNA(SEQ ID NO：243)
AACAACCAGCUAAGACACUGCCAN(SEQ ID NO：244)
在一些实施方案中，在上文显示的单一取代外，相对于SEQ ID NO：4在序列中的别处有第二处取代。此外，涵盖过客链中上文显示的取代的任何组合。
在一些实施方案中，过客链与SEQ ID NO：4是95-100％相同的，其应当包括上文公开的序列。此类过客链的其它例子包括具有单核苷酸对SEQ IDNO:4序列的插入的过客链。
注意到，在一些实施方案中，过客链的序列由SEQ ID NO:3组成，这意味着过客链具有的序列与SEQ ID NO:3是100%相同的。在其它实施方案中，过客链的序列由SEQ ID NO:4组成，这意味着过客链具有的序列与SEQ IDNO:4是100%相同的。在任何这些实施方案中，涵盖的是，过客链可以包含相对于过客链5’端位于位置1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,171,18,19,20,21,和/或22(其中位置1是链的5’端)处的核苷酸的修饰。这意味着所述位置处的核苷酸是经修饰的，并且此名称不依赖于所述位置处的特定核苷酸的身份。与基于核苷酸的形成对比，此名称是基于位置的。在其它实施方案中，名称是基于核苷酸的。在某些实施方案中，名称可以是相对于过客链3’端基于位置的；在此类情况中，过客链可以包括距离过客链的3’端1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,171,18,19,20,21,和/或22个核苷酸定位的核苷酸修饰。
在经修饰的核苷酸鉴定为基于核苷酸的本文中讨论的任何实施方案可以在使用鉴定核苷酸的位置基于位置的经修饰的核苷酸的其它实施方案中实施。这适用于活性链以及过客链。
在一些实施方案中，基于核苷酸的命名提出可以在下列核苷酸处修饰过客链：SEQ ID NO:4中在位置1处的A；SEQ ID NO:4中在位置2处的A；SEQ IDNO:4中在位置3处的C；SEQ ID NO:4中在位置4处的A；SEQ ID NO:4中在位置5处的A；SEQ ID NO:4中在位置6处的C；SEQ ID NO:4中在位置7处的C；SEQ ID NO:4中在位置8处的A；SEQ ID NO:4中在位置9处的G；SEQ ID NO:4中在位置10处的C；SEQ ID NO:4中在位置11处的U；SEQ ID NO:4中在位置12处的A；SEQ ID NO:4中在位置13处的A；SEQ ID NO:4中在位置14处的G；SEQ ID NO:4中在位置15处的A；SEQ ID NO:4中在位置16处的C；SEQ IDNO:4中在位置17处的A；SEQ ID NO:4中在位置18处的C；SEQ ID NO:4中在位置19处的U；SEQ ID NO:4中在位置20处的G；SEQ ID NO:4中在位置21处的C；SEQ ID NO:4中在位置22处的C；和/或SEQ ID NO:4中在位置23处的A。
在牵涉miR-34c模拟物的某些实施方案中，过客链具有与SEQ ID NO:6是或至少是95%相同的序列。
注意到，在一些实施方案中，过客链的序列由SEQ ID NO:6组成，这意味着过客链具有的序列与SEQ ID NO:6是100%相同的。在任何这些实施方案中，涵盖的是，过客链可以包含相对于过客链5’端位于位置1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,171,18,19,20,21,22和/或23(其中位置1是链的5’端)处的核苷酸修饰。这意味着所述位置处的核苷酸是经修饰的，并且此名称不依赖于所述位置处的特定核苷酸的身份。与基于核苷酸的形成对比，此名称是基于位置的。在其它实施方案中，名称是基于核苷酸的。在某些实施方案中，名称可以是相对于过客链3’端基于位置的；在此类情况中，过客链可以包括距离过客链3’端1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,171,18,19,20,21,和/或22个核苷酸定位的核苷酸修饰。
涵盖的是，RNA分子可以含有过客链，其与SEQ ID NO:6是或至少是90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或100%，或在其中可导出的任何范围相同的。
在一些实施方案中，过客链与SEQ ID NO:6(5’-GCAAUCAGCUAACUACACUGCCU-3’)(23聚体)是95%相同的。在某些实施方案中，过客链具有从5’至3’的下列序列，其中来自SEQ ID NO:6的一个核苷酸是缺失的：
GCAAUCAGCUAACUACACUGCC(SEQ ID NO:245)(先前在位置23处的U是缺失的)
GCAAUCAGCUAACUACACUGCU(SEQ ID NO:246)(先前在位置22处的C是缺失的)
GCAAUCAGCUAACUACACUGCU(SEQ ID NO:247)(先前在位置21处的C是缺失的)
GCAAUCAGCUAACUACACUCCU(SEQ ID NO:248)(先前在位置20处的G是缺失的)
GCAAUCAGCUAACUACACGCCU(SEQ ID NO:249)(先前在位置19处的U是缺失的)
GCAAUCAGCUAACUACAUGCCU(SEQ ID NO:250)(先前在位置18处的C是缺失的)
GCAAUCAGCUAACUACCUGCCU(SEQ ID NO:251)(先前在位置17处的A是缺失的)
GCAAUCAGCUAACUAACUGCCU(SEQ ID NO:252)(先前在位置16处的C是缺失的)
GCAAUCAGCUAACUCACUGCCU(SEQ ID NO:253)(先前在位置15处的A是缺失的)
GCAAUCAGCUAACACACUGCCU(SEQ ID NO:254)(先前在位置14处的U是缺失的)
GCAAUCAGCUAAUACACUGCCU(SEQ ID NO:255)(先前在位置13处的C是缺失的)
GCAAUCAGCUACUACACUGCCU(SEQ ID NO:256)(先前在位置12处的A是缺失的)
GCAAUCAGCUACUACACUGCCU(SEQ ID NO:257)(先前在位置11处的A是缺失的)
GCAAUCAGCAACUACACUGCCU(SEQ ID NO:258)(先前在位置10处的U是缺失的)
GCAAUCAGUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO:259)(先前在位置9处的C是缺失的)
GCAAUCACUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO:260)(先前在位置8处的G是缺失的)
GCAAUCGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO:261)(先前在位置7处的A是缺失的)
GCAAUAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO:262)(先前在位置6处的C是缺失的)
GCAACAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO:263)(先前在位置5处的U是缺失的)
GCAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO:264)(先前在位置4处的A是缺失的)
GCAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO:265)(先前在位置3处的A是缺失的)
GAAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO:266)(先前在位置2处的C是缺失的)
CAAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO:267)(先前在位置1处的G是缺失的)
在相对于SEQ ID NO:6已经删除核苷酸的实施方案中，涵盖的是，可以相应地调节经修饰的核苷酸的命名。在一些实施方案中，涵盖的是，具有与SEQ ID NO：6至少95％相同的序列的活性链相对于链的5’或3’端在下列一个或多个位置处具有核苷酸修饰：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21：相对于SEQ ID NO：6在位置1处的G；相对于SEQ IDNO：6在位置2处的C；相对于SEQ ID NO：6在位置3处的A；相对于SEQ IDNO：6在位置4处的A；相对于SEQ ID NO：6在位置5处的U；相对于SEQ IDNO：6在位置6处的C；相对于SEQ ID NO：6在位置7处的A；相对于SEQ IDNO：6在位置8处的G；相对于SEQ ID NO：6在位置9处的C；相对于SEQ IDNO：6在位置2处的U；相对于SEQ ID NO：6在位置11处的A；相对于SEQ IDNO：6在位置12处的A；相对于SEQ ID NO：6在位置13处的C；相对于SEQ IDNO：6在位置14处的U；相对于SEQ ID NO：6在位置15处的A；相对于SEQ IDNO：6在位置16处的C；相对于SEQ ID NO：6在位置17处的A；相对于SEQ IDNO：6在位置18处的C；相对于SEQ ID NO：6在位置19处的U；相对于SEQ IDNO：6在位置20处的G；相对于SEQ ID NO：6在位置21处的C；相对于SEQ IDNO：6在位置22处的C；和/或相对于SEQ ID NO：6在位置23处的U。在这些实施方案中，这意味着过客链可以不再具有所述位置处的核苷酸，但是在SEQID NO：6序列的背景中，过客链中的特定核苷酸是经修饰的。这意味着其位置可以改变-1或+1；例如，相对于SEQ ID NO：6在位置11处的A可以在过客链中的位置10或位置12处，因为已经有影响其位置编号的插入或缺失。
在一些实施方案中，过客链与SEQ ID NO：6(5’-GCAAUCAGCUAACUACACUGCCU-3’)是95％相同的。在某些实施方案中，此类过客链具有从5’至3’的下列序列，其中一个核苷酸用不同核糖核苷酸(A，C，G，或U)取代，如以N表示的：
NCAAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：268)
GNAAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：269)
GCNAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：270)
GCANUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：271)
GCAANCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：272)
GCAAUNAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：273)
GCAAUCNGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：274)
GCAAUCANCUAACUACACUGCCU(SEQID NO：275)
GCAAUCAGNUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：276)
GCAAUCAGCNAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：277)
GCAAUCAGCUNACUACACUGCCU(SEQ ID NO：278)
GCAAUCAGCUANCUACACUGCCU(SEQ ID NO：279)
GCAAUCAGCUAANUACACUGCCU(SEQ ID NO：280)
GCAAUCAGCUAACNACACUGCCU(SEQ ID NO：281)
GCAAUCAGCUAACUNCACUGCCU(SEQ ID NO：282)
GCAAUCAGCUAACUANACUGCCU(SEQ ID NO：283)
GCAAUCAGCUAACUACNCUGCCU(SEQID NO：284)
GCAAUCAGCUAACUACANUGCCU(SEQ ID NO：285)
GCAAUCAGCUAACUACACNGCCU(SEQ ID NO：286)
GCAAUCAGCUAACUACACUNCCU(SEQ ID NO：287)
GCAAUCAGCUAACUACACUGNCU(SEQ ID NO：288)
GCAAUCAGCUAACUACACUGCNU(SEQ ID NO：289)
GCAAUCAGCUAACUACACUGCCN(SEQ ID NO：290)
在一些实施方案中，在上文显示的单一取代外，相对于SEQ ID NO：6在序列中的别处有第二处取代。进一步涵盖的是，可以有第二处取代及上文所描述的过客链中描述的取代之一，或在上文所描述的取代外的一处或两处核苷酸缺失或插入。
在一些实施方案中，过客链与SEQ ID NO：6是95-100％相同的，其应当包括上文公开的序列。此类过客链的其它例子包括具有单一核苷酸插入的过客链，如下文讨论的，其中从5’至3’的下列序列具有称为N(其可以是A、C、G、或U)的核苷酸插入：
NGCAAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：291)
GNCAAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：292)
GCNAAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：293)
GCANAUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：294)
GCAANUCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：295)
GCAAUNCAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：296)
GCAAUCNAGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：297)
GCAAUCANGCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：298)
GCAAUCAGNCUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：299)
GCAAUCAGCNUAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：300)
GCAAUCAGCUNAACUACACUGCCU(SEQ ID NO：301)
GCAAUCAGCUANACUACACUGCCU(SEQ ID NO：302)
GCAAUCAGCUAANCUACACUGCCU(SEQ ID NO：303)
GCAAUCAGCUAACNUACACUGCCU(SEQ ID NO：304)
GCAAUCAGCUAACUNACACUGCCU(SEQ ID NO：305)
GCAAUCAGCUAACUANCACUGCCU(SEQ ID NO：306)
GCAAUCAGCUAACUACNACUGCCU(SEQ ID NO：307)
GCAAUCAGCUAACUACANCUGCCU(SEQ ID NO：308)
GCAAUCAGCUAACUACACNUGCCU(SEQ ID NO：309)
GCAAUCAGCUAACUACACUNGCCU(SEQ ID NO：310)
GCAAUCAGCUAACUACACUGNCCU(SEQ ID NO：311)
GCAAUCAGCUAACUACACUGCNCU(SEQ ID NO：312)
GCAAUCAGCUAACUACACUGCCNU(SEQ ID NO：313)
GCAAUCAGCUAACUACACUGCCUN(SEQ ID NO：314)
在一些实施方案中，在上文相对于SEQ ID NO:6显示的过客链中的插入外，在链中的别处可以有第二处插入。别的过客链还涵盖上文显示的过客链中的插入组合。
一些实施方案关注具有包含SEQ ID NO:7的活性链的RNA分子。在具体的实施方案中，活性链包含SEQ ID NO:9。在上文在具有包含与SEQ ID NO:1、2、或5的某一百分比同一性，由与SEQ ID NO:1、2、或5的某一百分比同一性组成、或者与SEQ ID NO:1、2、或5是某一百分比同一性的序列的活性链或链的背景中讨论的任何实施方案可以在包含与SEQ ID NO:7或9的某一百分比同一性，由与SEQ ID NO:7或9的某一百分比同一性组成、或者与SEQ ID NO:7或9是某一百分比同一性的链的背景中实施。SEQ ID NO:7和9包含SEQ ID NO:1,2,和5中每一项。
某些实施方案关注具有包含SEQ ID NO:8的过客链的RNA分子。在具体的实施方案中，过客链包含SEQ ID NO:10。在上文在具有包含与SEQ ID NO:3、4、或6的某一百分比同一性，由与SEQ ID NO:3、4、或6的某一百分比同一性组成、或者与SEQ ID NO:3、4、或6是某一百分比同一性的序列的过客链或链的背景中讨论的任何实施方案可以在包含与SEQ ID NO:8或10的某一百分比同一性，由与SEQ ID NO:8或10的某一百分比同一性组成、或者与SEQ ID NO:8或10具有某一百分比同一性的链的背景中实施。SEQ ID NO:8和10包含SEQ ID NO:3,4,和6中每一项。
术语“互补区”或“互补物”指核酸或模拟物中与成熟的天然存在的miRNA序列是或至少是60%互补的区域。互补区是或至少是60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,99.1,99.2,99.3,99.4,99.5,99.6,99.7,99.8,99.9或100%互补的，或在其中可导出的任何范围内互补。在单一多核苷酸序列的情况中，由于miRNA区和互补区之间的化学键合而可以有发夹环结构。在其它实施方案中，互补区在与miRNA区不同的核酸分子上，在该情况中互补区在互补链上，而miRNA区在活性链上。
在RNA分子是单一多核苷酸时，miRNA区和互补区之间可以有接头区。在一些实施方案中，单一多核苷酸由于miRNA区和互补区之间的键合而能够形成发夹环结构。接头构成发夹环。涵盖的是，在一些实施方案中，接头区的长度是，至少是，至多是2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,或40个残基，或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，接头的长度是3-30个残基(包括端点)。
A.核酸的分离
可以使用本领域技术人员公知的技术分离核酸，尽管在具体的实施方案中，可以采用用于分离小核酸分子和/或分离RNA分子的方法。层析是一种经常用于将核酸与蛋白质或与其它核酸分开或分离的方法。此类方法可以牵涉用凝胶基质的电泳、过滤柱、毛细管电泳、乙醇沉淀、和/或其它层析。若要使用或评估来自细胞的miRNA，则方法一般牵涉用促溶剂(例如，异硫氰酸胍)和/或去污剂(例如，N-月桂酰肌氨酸)裂解细胞，之后实施用于分离特定RNA群的方法。
在用于将miRNA与其它核酸分开的具体方法中，使用聚丙烯酰胺制备凝胶基质，尽管也可以使用琼脂糖。凝胶可以以浓度分级或者它们可以是一致的。可以使用板或管道保持凝胶基质用于电泳。通常，采用一维电泳进行核酸分离。使用板来制备板状凝胶，而可以使用管道(通常是玻璃或橡胶)来制备管状凝胶。短语“管式电泳”指使用管或管道代替平板来形成凝胶。用于执行管式电泳的材料可以是本领域技术人员容易制备的或购买的，诸如购自C.B.S.Scientific Co.,Inc.或Scie-Plas。
方法可以牵涉使用有机溶剂和/或醇来分离核酸，特别是本发明的方法和组合物中使用的miRNA。一些实施方案记载于美国专利申请流水号10/667,126，其在此通过提及收录。一般地，本公开内容提供了用于从细胞有效分离小RNA分子的方法，包括：对细胞裂解物添加醇溶液，并对固体支持物应用醇/裂解物混合物，之后从固体支持物洗脱RNA分子。在一些实施方案中，对细胞裂解物添加的醇量达到约55%至60%的醇浓度。虽然可以采用不同醇，乙醇较好地起作用。固体支持物可以是任何结构，并且它包括珠、滤器、和柱，其可以包括具有负电性基团的矿物或聚合物支持物。玻璃纤维滤器或柱对于此类分离规程特别良好地起作用。
在具体的实施方案中，miRNA分离方法包括：a)用包含胍盐的裂解溶液裂解样品中的细胞，其中生成具有至少约1M胍盐浓度的裂解物；b)用包含酚的提取溶液从裂解物提取miRNA分子；c)对裂解物添加醇溶液以形成裂解物/醇混合物，其中混合物中的醇浓度是约35%至约70%；d)对固体支持物应用裂解物/醇混合物；e)用离子溶液从固体支持物洗脱miRNA分子；并f)捕获miRNA分子。通常，将样品干燥，并在适合于后续操作的液体和体积中重悬。
B.核酸的制备
或者，依照标准方法实施核酸合成。参见例如Itakura and Riggs(1980)。另外，美国专利4,704,362、5,221,619、和5,583,013各自描述了多种用于制备合成核酸的方法。合成核酸(例如，合成寡核苷酸)的非限制性例子包括使用磷酸三酯、亚磷酸酯、或亚磷酰胺化学和固相技术(诸如记载于EP266,032的，其通过提及并入本文)，或者经由脱氧核苷H-膦酸盐中间体(如由Froehler等,1986和美国专利5,705,629描述的，每篇通过提及并入本文)通过体外化学合成生成的核酸。在本文中描述的方法中，可以使用一种或多种寡核苷酸。寡核苷酸合成是本领域技术人员公知的。寡核苷酸合成的各种不同机制已经披露于例如美国专利4,659,774,4,816,571,5,141,813,5,264,566,4,959,463,5,428,148,5,554,744,5,574,146,5,602,244，每篇通过提及并入本文。
酶促生成的核酸的非限制性例子包括在扩增反应诸如PCRTM(参见例如美国专利4,683,202和4,682,195，每篇通过提及并入本文)，或者记载于美国专利5,645,897(其通过提及并入本文)的寡核苷酸合成中由酶生成的核酸。生物学生成的核酸的非限制性例子包括活细胞中生成(即，复制)的重组核酸，诸如细菌中复制的重组DNA载体或病毒中复制的重组RNA或RNA载体(参见例如Sambrook等,2001，其通过提及并入本文)。
用于在细胞中生成核酸的重组方法是本领域技术人员公知的。这些包括使用载体(病毒的和非病毒的)、质粒、粘粒、和其它用于将核酸递送到细胞的媒介物，所述细胞可以是靶细胞(例如癌细胞)或仅是宿主细胞(以生成大量期望的RNA分子)。或者，此类媒介物可以在无细胞系统的背景中使用，只要存在用于生成RNA分子的试剂。此类方法包括那些记载于Sambrook,2003,Sambrook,2001和Sambrook,1989的方法，其在此通过提及收录。
在某些实施方案中，本发明关注非合成的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子具有天然存在的核酸的化学结构和天然存在的核酸的序列，诸如单链初级miRNA(参见Lee,2002)、单链前体miRNA、或单链成熟miRNA的精确且整个的序列。
II.治疗方法
某些实施方案关注在导入细胞中时实施内源miR-34a或miR-34c活性的核酸。在某些方面，治疗性核酸(又称为核酸)可以是合成的、非合成的、或合成的和非合成的miRNA序列的组合。在某些方面，实施方案关注发挥miR-34a或miR-34c功能的短核酸分子(治疗性核酸)。核酸分子通常是合成的。术语“合成的”指通过仪器或装置化学合成而不是在细胞中天然生成的核酸分子。
在某些方面，RNA分子可以没有与天然存在的成熟miRNA的序列相同或互补的整个序列。此类分子可以涵盖整个或部分的天然存在的序列或其互补物。例如，合成的核酸可以具有与成熟的miRNA序列不同的序列，但是该改变的序列可以提供一项或多项可以用天然序列实现的功能。
术语“分离的”意指最初将核酸分子与不同分子(就序列或结构而言)和不想要的核酸分子分开，使得分离的核酸群体是至少约90%同质的，并且相对于其它多核苷酸分子可以是至少约95,96,97,98,99,或100%同质的。在本发明的许多方面，核酸依靠其已经与细胞中的内源核酸分开在体外合成分离。然而，应当理解，随后，可以将分离的核酸混合或合并在一起。
在某些方法中，有进一步的步骤，即对需要与调控靶定miRNA相关的治疗或需要本文中讨论的生理学或生物学结果(诸如就特定的细胞途径或结果而言，例如细胞存活力降低)的细胞、组织、器官、或生物体(统称“生物学物质”)施用选择的miRNA模拟物或RNA分子。因此，在一些方法中，有如下的步骤，即鉴定需要可以通过miRNA模拟物提供的治疗的患者。涵盖的是，在一些实施方案中可以施用有效量的miRNA模拟物。在具体的实施方案中，提供了对生物学物质赋予的治疗性益处，其中“治疗性益处”指一种或多种与疾病或状况有关的状况或症状的改善或就疾病而言的预后、持续时间、或状态的改善。涵盖的是，治疗性益处包括但不限于疼痛减轻、发病率降低、症状减少。例如，就癌症而言，涵盖的是，治疗性益处可以是对肿瘤生长的抑制、转移的预防、转移数目减少、对癌细胞增殖的抑制、对癌细胞增殖的抑制、癌细胞中细胞死亡的诱导、对癌细胞附近的血管发生的抑制、癌细胞凋亡的诱导、癌细胞存活力或活癌细胞数目的降低、疼痛减轻、复发风险降低、癌细胞中化学或放射敏感性的诱导、寿命延长、和/或与癌症直接或间接相关的死亡延迟。
在某些实施方案中，使用miRNA模拟物治疗癌症。癌症包括但不限于恶性癌症、肿瘤、转移性癌症、不可切除的癌症、化学和/或放射抗性癌症、和晚期癌症。
可以通过本发明的方法和组合物评估、诊断和/或治疗的癌症包括来自下列各项的癌细胞：膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、心血管系统、宫颈、结肠、结缔组织、子宫内膜、上皮、食管、脂肪、胃肠、腺、齿龈、头、肾、肝、肺、脑膜、肌肉、鼻咽、颈、神经元、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、视网膜、皮肤、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、或子宫。另外，癌症可以明确是下列组织学类型的，尽管它不限于这些：新生物，恶性的；癌瘤；癌瘤，未分化的；巨细胞和纺锤形细胞癌；小细胞癌(small cell carcinoma)；乳头状癌(papillary carcinoma)；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌(lymphoepithelialcarcinoma)；基底细胞癌；毛基质癌(pilomatrix carcinoma)；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性的；胆管(cholangiocarcinoma)；肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)；组合的肝细胞癌和胆管癌；小梁性腺癌(trabecular adenocarcinoma)；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性的；细支气管腺泡状腺癌(branchiolo-alveolar adenocarcinoma)；乳头腺癌(papillary adenocarcinoma)；嫌色细胞癌(chromophobe carcinoma)；嗜酸细胞癌(acidophil carcinoma)；嗜酸性腺癌(oxyphilic adenocarcinoma)；嗜碱细胞癌(basophil carcinoma)；透明细胞腺癌(clear cell adenocarcinoma)；颗粒细胞腺癌(granular cell carcinoma)；滤泡腺癌(follicular adenocarcinoma)；乳头状和滤泡状腺癌(papillary andfollicular adenocarcinoma)；非包围性硬化性癌(nonencapsulating sclerosingcarcinoma)；肾上腺皮质细胞癌(adrenal cortical carcinoma)；内膜样癌(endometroid carcinoma)；皮肤附属器癌(skin appendage carcinoma)；大汗腺腺癌(apocrine adenocarcinoma)；皮脂腺癌(sebaceous adenocarcinoma)；盯聍腺腺癌(ceruminous adenocarcinoma)；粘液表皮样癌(mucoepidermoidcarcinoma)；囊腺癌(cystadeno carcinoma)；乳头状囊腺癌(papillarycystadenocarcinoma)；乳头状重度囊腺癌(papillary serous cystadenocarcinoma)；粘液性囊腺癌(mucinous cystadenocarcinoma)；粘液腺癌(mucinousadenocarcinoma;印戒细胞癌(signet ring cell carcinoma)；浸润性导管癌(infiltrating duct carcinoma)；髓样癌(medullary carcinoma)；小叶癌(lobularcarcinoma)；炎性癌(inflammatory carcinoma)；佩吉特病(paget's disease)，乳房的；腺泡细胞癌(acinar cell carcinoma)；腺鳞癌(adenosquamous carcinoma)；腺癌w/鳞状化生(adenocarcinoma w/squamous metaplasia)；胸腺瘤(thymoma)，恶性的；卵巢基质肿瘤(ovarian stromal tumor)，恶性的；泡膜细胞瘤(thecoma)，恶性的；粒层细胞瘤(granulosa cell tumor)，恶性的；睾丸母细胞瘤(androblastoma)，恶性的；塞托利细胞癌(Sertoli cell carcinoma)；莱迪希细胞瘤(leydig cell tumor)，恶性的；脂质细胞瘤(lipid cell tumor)，恶性的；神经节细胞瘤(paraganglioma)，恶性的；乳房外副神经节瘤(extra-mammaryparaganglioma)，恶性的；嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤(malignant melanoma)；无黑色素性恶性黑素瘤(amelanotic melanoma)；浅表扩散性黑素瘤(superficial spreadingmelanoma)；巨大色素痣中的恶性黑素瘤(malig melanoma in giant pigmentednevus)；上皮样细胞黑素瘤(epithelioid cell melanoma)；蓝痣，恶性的；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤(fibrous histiocytoma)，恶性的；粘液肉瘤(myxosarcoma)；脂肪肉瘤(liposarcoma)；平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)；横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)；环胎性横纹肌肉瘤(embryonalrhabdomyosarcoma)；小泡型横纹肌肉瘤(alveolar rhabdomyosarcoma)；基质肉瘤(stromal sarcoma)；混合瘤(mixed tumor)，恶性的；米勒(mullerian)混合瘤；肾胚细胞瘤(nephroblastoma)；肝母细胞瘤(hepatoblastoma)；癌肉瘤(carcinosarcoma)；间充质瘤(mesenchymoma)，恶性的；布伦纳瘤(brennertumor)，恶性的；叶状肿瘤(phyllodes tumor)，恶性的；滑膜肉瘤(synovialsarcoma)；间皮瘤(mesothelioma)，恶性的；无性细胞瘤(dysgerminoma)；胚胎癌性细胞(embryonal carcinoma)；畸胎瘤(teratoma)，恶性的；卵巢甲状腺肿样瘤(struma ovarii)，恶性的；绒毛膜癌(choriocarcinoma)；中肾瘤(mesonephroma)，恶性的；血管肉瘤(hemangiosarcoma)；血管内皮瘤(hemangioendothelioma)，恶性的；卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)；血管外皮细胞瘤(hemangiopericytoma)，恶性的；淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)；骨肉瘤osteosarcoma)；皮质旁骨肉瘤(juxtacortical osteosarcoma)；软骨肉瘤(chondrosarcoma)；软骨母细胞瘤(chondroblastoma,恶性的)；间质软骨肉瘤(mesenchymal chondrosarcoma)；骨巨细胞瘤(giant cell tumor of bone)；尤因肉瘤(ewing's sarcoma)；牙源性肿瘤(odontogenic tumor)，恶性的；成釉细胞牙肉瘤(ameloblastic odontosarcoma)；成釉细胞瘤(ameloblastoma)，恶性的；成釉细胞纤维肉瘤(ameloblastic fibrosarcoma)；松果体瘤(pinealoma)，恶性的；脊索瘤(chordoma)；胶质瘤(glioma)，恶性的；室管膜瘤(ependymoma)；星形细胞瘤(astrocytoma)；原浆性星形细胞瘤(protoplasmic astrocytoma)；纤维性星形细胞瘤(fibrillary astrocytoma)；星形母细胞瘤(astroblastoma)；成胶质细胞瘤(glioblastoma)；少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)；成少突神经胶质细胞瘤(oligodendroblastoma)；原始神经外胚层(primitive neuroectodermal)；小脑肉瘤(cerebellar sarcoma)；成神经节细胞瘤(ganglioneuroblastoma)；成神经细胞瘤(neuroblastoma)；视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)；嗅神经源性肿瘤olfactory neurogenic tumor)；脑膜瘤(meningioma)，恶性的；神经纤维肉瘤neurofibrosarcoma)；神经鞘瘤(neurilemmoma)，恶性的；颗粒细胞瘤(granularcell tumor)，恶性的；恶性淋巴瘤；霍奇金(Hodgkin)氏病；霍奇金氏淋巴瘤；类肉芽肿(paragranuloma)；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿病(mycosis fungoides)；其它规定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病(histiocytosis)；多发性骨髓瘤(multiple myeloma)；肥大细胞肉瘤(mast cell sarcoma)；免疫增殖性小肠疾病(immunoproliferative small intestinal disease)；白血病；淋巴样白血病(lymphoid leukemia)；浆细胞性白血病(plasma cell leukemia)；红白血病(erythroleukemia)；淋巴肉瘤细胞性白血病(lymphosarcoma cell leukemia)；髓样白血病(myeloid leukemia)；嗜碱细胞性白血病(basophilic leukemia)；嗜酸细胞性白血病(eosinophilic leukemia)；单核细胞性白血病(monocyticleukemia)；肥大细胞白血病(mast cell leukemia)；巨核母细胞白血病(megakaryoblastic leukemia)；髓样肉瘤(myeloid sarcoma)；和毛细胞性白血病(hairy cell leukemia)。此外，miRNA模拟物可以用于癌前细胞，诸如化生、发育异常、和增生中的那些细胞。
方法包括在细胞中供应或增强一种或多种miRNA的活性。方法还关注诱导某些细胞特征，其通过对细胞提供特定的核酸，诸如特定的治疗性核酸分子，即miRNA模拟物分子进行。治疗性miRNA模拟物可以具有与天然存在的miRNA相同且具有一个或多个设计修饰的序列。
在某些方面，对细胞提供的特定的核酸分子理解为对应于细胞中特定的miRNA，并且如此，细胞中的miRNA称为“相应的miRNA”。在将指定的miRNA分子导入细胞中的情况中，相应的miRNA会理解为提供miRNA功能。然而，涵盖的是，在一些实施方案中，导入细胞中的治疗性核酸不是成熟的miRNA，但是能够在适当的生理学条件下变为成熟的miRNA或者发挥成熟的miRNA的功能。在通过miRNA模拟物靶向特定的相应基因或基因转录物的情况中，特定的基因或基因转录物会称为“靶定基因”。涵盖的是，可以通过一种或多种不同miRNA模拟物靶向多种相应的基因。在具体的实施方案中，将超过一种治疗性核酸导入细胞中。此外，在其它实施方案中，将超过一种miRNA模拟物导入细胞中。此外，可以将治疗性核酸的组合导入细胞中。发明人设想治疗性核酸的组合可以在细胞的细胞途径中的一个或多个点处起作用，并且此类组合对靶细胞可以具有升高的效力而没有不利地影响正常的或非靶定的细胞。如此，治疗性核酸的组合在提供足够治疗效果，诸如状况的改善、细胞的生长抑制、靶定细胞的死亡、细胞表型或生理学的改变、细胞生长的减缓、对第二疗法的致敏、对特定疗法的致敏等的情况下对受试者或患者可以具有最小程度的不利效应。
方法包括鉴定需要诱导那些治疗学效应或细胞特征的细胞或患者。还有，应当理解，对细胞或生物体提供的治疗性核酸的量是“有效量”，其指实现期望的目的，诸如诱导特定治疗效果或细胞特征或降低癌症生长或杀死癌细胞或减轻与癌症关联的症状需要的量(或足够量)。
在某些方面，方法可以包括以有效实现期望的生理学结果的量对细胞提供或导入核酸分子，该核酸分子对应于细胞中的成熟miRNA。此外，方法可以牵涉提供多种合成的治疗性核酸。涵盖的是，在这些实施方案中，方法可以限于或不限于仅提供一种或多种合成的分子。在此情况中，可以给一个或多个细胞提供与特定miRNA对应的合成分子和与不同miRNA对应的合成分子。此外，用一批miRNA靶物以马库什(Markush)语言表述的任何方法可以用不含马库什语言的形式表述，而是用隔断的表述形式(即，或)，反之亦然。
在一些实施方案中，提供了用于在细胞中降低或抑制细胞增殖、繁殖、或更新的方法，包括对细胞导入或提供有效量的(i)治疗性核酸或(ii)与miRNA序列对应的合成分子。在某些实施方案中，方法牵涉对细胞导入有效量的(i)miRNA模拟物分子，其具有与一种或多种成熟miRNA的5’至3’序列至少90%相同的5’至3’序列。
本发明的某些方面包括治疗病理状况，诸如癌症或癌前状况的方法。在一个方面，方法包括使靶细胞与一种或多种核酸接触，所述核酸包含至少一种具有整个或部分的miRNA序列或其互补物的核酸区段。该区段可以是5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,30或更多个核苷酸或核苷酸类似物，包括其间的所有整数。一些实施方案包括调控靶细胞，诸如癌细胞内的基因表达、miRNA表达或功能或mRNA表达或功能。
通常，在细胞中调控内源基因、miRNA或mRNA。在某些方面，治疗性核酸序列包含至少一个在核酸序列上与一种或多种miRNA或基因序列或其互补物至少70,75,80,85,90,95,或100%相同的区段。可以经由调控核酸的加工调控细胞或病毒的基因、miRNA、或mRNA的表达或加工，此类加工包括细胞内的转录、转运和/或翻译。也可以通过抑制或增强细胞、组织、或器官内的miRNA活性实现调控。此类加工可以影响编码产物的表达或mRNA的稳定性。
在本发明的方法中应当理解，可以对细胞或其它生物学物质诸如生物体(包括患者)提供对应于或靶向特定miRNA的治疗性核酸，其通过对细胞或生物体施用核酸分子进行，所述核酸分子一旦在细胞内部发挥相应的miRNA功能。如此，涵盖的是，提供核酸，使得一旦它到达细胞加工机器，它被加工成成熟的且有活性的miRNA。在某些方面，明确涵盖的是，提供的miRNA分子不是成熟的分子，但是一旦核酸分子可接近加工机器，它可以被加工成成熟的miRNA或其功能等同物。
术语“非合成的”在miRNA背景中意指miRNA不是“合成的”，如本文中定义的。此外，涵盖的是，在关注使用合成的miRNA的本发明实施方案中，相应的非合成miRNA的使用也认为是本发明的一个方面，且反之亦然。应当理解，术语“提供”药剂用于包括对患者“施用”药剂。
在某些实施方案中，方法还包括靶向细胞或生物体中的miRNA。术语“对应于miRNA”意指会采用核酸，从而模拟选定的miRNA(通过其活性或功能)。在一些实施方案中，用合成的或非合成的对应于靶定miRNA的核酸实现调节，所述核酸对细胞或组织有效提供靶定miRNA的功能(正调节)。
此外，涵盖的是，可以与传统疗法或预防剂一起提供核酸组合物作为患者疗法的一部分。此外，涵盖的是，在疗法背景中讨论的任何方法可以预防性应用，特别是在鉴定为潜在需要该疗法或有需要的疗法针对的状况或疾病的风险的患者中。
另外，本发明的方法关注采用一种或多种与miRNA对应的核酸和治疗性药物。核酸可以增强药物的效果或效力，降低任何副作用或毒性，修改其生理利用度，和/或降低需要的剂量或频率。在某些实施方案中，治疗性药物是癌症治疗剂。因此，在一些实施方案中，提供了治疗患者中的前期癌(precancer)或癌症的方法，包括对患者施用癌症治疗剂(即，第二治疗剂)和有效量的至少一种核酸分子，其改善癌症治疗剂的效力或保护非癌细胞。治疗疗法还包括多种用化学和基于放射的治疗两者的联合疗法。
一般地，可以给予miRNA模拟物以降低由miRNA靶定的核酸的活性。一般涵盖的方法包括提供或导入一种或多种与一种或多种不同基因对应的不同核酸分子。涵盖的是，可以检测、评估、提供或导入下列、至少下列、或至多下列数目的不同核酸或miRNA分子：1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,或更多种，包括其间可导出的任何数值或范围。
III.药用配制剂和递送
方法包括递送有效量的治疗性核酸，其包含成熟的miRNA序列或基本上由成熟的miRNA序列组成。药物组合物的“有效量”一般定义为足以可检出且可重复实现叙述的期望结果，例如减轻、降低、最小化或限制疾病程度或其症状的量。其它更严格的定义可以适用，包括消除、根治或治愈疾病。
在某些实施方案中，期望杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、降低肿瘤或组织大小、和/或反转或降低细胞的恶性或疾病表型。施用路径自然会随要靶向的损伤或部位的位置和性质而变化，并且包括例如皮内、皮下、局部、胃肠外、静脉内、肌肉内、鼻内、系统性、和口服施用和配制剂。离散的、实体、易接近的前癌或癌症，或其它易接近的靶区域明确涵盖治疗性核酸的注射或灌注。局部的、区域的、或系统性施用也可以是合适的。
在手术干预的情况中，可以在术前使用本发明，以使不能手术的损伤进行切除术。或者，可以在手术时和/或此后使用本发明，以治疗残留的或转移的疾病。例如，可以给经切除的肿瘤床注射或灌注包含治疗性核酸或其组合的配制剂。例如，可以通过留下在手术部位植入的导管在切除后继续施用。还涵盖定期术后治疗。还涵盖核酸的连续灌注。
也可以在适当的情况下应用连续施用，例如在切除肿瘤或其它不想要的受累区，并且靶向肿瘤床或靶定部位以消除残留的微观疾病的情况下。涵盖经由注射器或导管化(catherization)的递送。此类连续灌注在启动治疗后可以发生约1-2小时，至约2-6小时、至约6-12小时、至约12-24小时、至约1-2天、至约1-2周或更长的时段。一般地，经由连续灌注的治疗性组合物的剂量会等同于通过单次或多次注射给予的、在发生灌注的时间段里调节的剂量。
治疗方案也会有所变化，并且经常取决于损伤的类型和/或位置、靶部位、疾病进展、和患者的健康、免疫状况、和年龄。某些肿瘤类型会需要更加攻击性的治疗。基于治疗性配制剂的已知效力和毒性(若有的话)，临床医生会最适合做出此类决定。
在某些实施方案中，治疗的损伤或受累区至少最初可以不是可切除的。用本发明的组合物治疗可以由于边缘的收缩或者通过消除某些特别侵入性的损伤而提高损伤的可切除性。在治疗后，切除可以是有可能的。在切除后的别的治疗可以用来消除肿瘤或靶定部位处微观的残留疾病。
治疗可以包括多个“单位剂量”。单位剂量定义为含有预定量的治疗性组合物。要施用的量，和特定的路径和配制剂在临床领域技术人员的技术内。单位剂量不需要以单次注射施用，但是可以包含在设置的时间段里的连续输注。单位剂量可以按ng、μg、或mg miRNA或miRNA模拟物方便地描述。或者，规定的量可以是以每天平均、每周平均、或每月平均剂量施用的量。
可以以约或至少约0.5,1,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690,700,710,720,730,740,750,760,770,780,790,800,810,820,830,840,850,860,870,880,890,900,910,920,930,940,950,960,970,980,990,1000ng、μg或mg，或更多，或其中可导出的任何范围的一剂或多剂对患者施用治疗性核酸。或者，规定的量可以是以每天平均、每周平均、或每月平均剂量施用的量，或者它可以以mg/kg计表示，其中kg指患者的重量，而mg是上文规定的。在其它实施方案中，规定的量是上文讨论的但以mg/m(就肿瘤大小或患者表面积而言)表示的任何数目。在一些实施方案中，可以每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24小时，和/或1,2,3,4,5,6,7天，和/或1,2,3,4周，及其中可导出的任何范围对需要治疗的患者施用剂量或方案。
在一些实施方案中，用于递送治疗性核酸的方法经由局部或系统性施用进行。然而，本文中公开的药物组合物也可以胃肠外、皮下、气管内、静脉内、皮内、肌肉内、或甚至腹膜内施用，如记载于美国专利5,543,158;5,641,515和5,399,363的(每篇明确通过提及完整并入本文)。
核酸注射液可以通过注射器或任何其它用于注射溶液的方法递送，只要核酸和任何关联的组分可以通过注射需要的特定号的针。也已经描述了用于基因疗法的注射器系统，其容许正好在任何深度多次注射预定量的溶液(美国专利5,846,225)。
作为游离碱或药理学可接受盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂，诸如羟基丙基纤维素适当混合的水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、其混合物中及在油中制备。在惯常的贮存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。适合于可注射使用的药用形式包括无菌水性溶液或分散体和无菌粉末，用于即时制备无菌可注射溶液或分散体(美国专利5,466,468，其明确通过提及完整并入本文)。通常，所述形式必须是无菌的，而且必须有存在容易的可注射性的程度的流动性。它在制造和贮存条件下必须是稳定的，并且针对微生物诸如细菌和真菌的污染作用提供防护。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用涂层材料，诸如卵磷脂，通过维持需要的粒度(在分散体的情况中)及通过使用表面活性剂维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等防止微生物作用。在许多情况中，会优选包括等张剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶引起可注射组合物的吸收延迟。
在某些配制剂中，采用基于水的配制剂，而在其它配制剂中，它可以是基于脂质的。在本发明的具体实施方案中，包含本发明核酸的组合物在基于水的配制剂中。在其它实施方案中，配制剂是基于脂质的。
对于水性溶液中的胃肠外施用，例如，溶液在必要时应当适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂为等张的。这些特定的水性溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内、损伤内、和腹膜内施用。在此背景中，根据本公开内容，本领域技术人员会知道可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一剂在1ml等张NaCl溶液中溶解，并添加到1000ml皮下灌注术液体或在提出的输注部位注射(参见例如“Remington’s PharmaceuticalSciences”第15版,页1035-1038和1570-1580)。剂量的某种变化必然会随治疗的受试者的状况而发生。负责施用的人员在任何事件中会为个体受试者决定适合的剂量。此外，对于人施用，制剂应当满足无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准，如FDA生物制剂局(Office of Biologics)标准要求的。
如本文中使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、涂层材料、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体，等等。对药用活性物质使用此类介质和药剂是本领域中公知的。除非任何常规的介质或药剂与活性成分不相容，涵盖其在治疗性组合物中的使用。还可以将补充的活性成分掺入组合物中。
短语“药学可接受的”指在对人施用时不产生过敏性或类似的不想要的反应的分子实体和组合物。
以与剂量配制剂相容的方式，且以诸如会是治疗有效的量施用核酸。要施用的量取决于要治疗的受试者，包括例如疾病或癌症的攻击性、任何肿瘤或损伤的大小、先前的或其它治疗过程。需要施用的活性成分的精确量取决于从业人员的判断。适合于初始施用和后续施用的方案也是可变的，但是以初始施用，接着是其它施用为典型。此类施用可以是系统性的、以单剂、在跨越10,20,30,40,50,60分钟，和/或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或更多个小时，和/或1,2,3,4,5,6,7天或更多的时间段里连续的。此外，施用可以经由时间释放或持续释放机制进行，其通过施用的配制剂和/或模式实现。
其它合适的递送系统包括但不限于时间释放、延迟释放、持续释放、或受控释放递送系统。此类系统在许多情况中可以避免重复施用，提高受试者和内科医生的便利性。许多类型的释放递送系统是本领域普通技术人员可用且已知的。它们包括例如基于聚合物的系统，诸如聚乳酸和/或聚乙醇酸、聚酐、聚己酸内酯、共聚草酸酯(copolyoxalates)、聚酯酰胺、聚正酯(polyorthoesters)、聚羟丁酸、和/或这些的组合。含有核酸的前述聚合物的微囊剂记载于例如美国专利No.5,075,109。其它例子包括基于脂质的非聚合物系统，包括固醇诸如胆固醇、胆固醇酯、和脂肪酸或中性脂肪诸如甘油单酯、二酯和三酯；水凝胶释放系统；基于脂质体的系统；基于磷脂的系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡涂层材料；使用常规粘合剂和赋形剂得到的压缩片剂；或部分融合的植入物。具体的例子包括但不限于侵蚀系统，其中RNA分子包含在基质内的配制剂中(例如，如记载于美国专利No.4,452,775,4,675,189,5,736,152,4,667,013,4,748,034和5,239,660，其在此通过提及并入)，或活性组分控制释放率的扩散系统(例如，如记载于美国专利No.3,832,253,3,854,480,5,133,974和5,407,686，其在此通过提及并入)。配制剂可以作为例如微球、水凝胶、聚合储器、胆固醇基质、或聚合系统。在一些实施方案中，系统可以容许发生组合物的持续或受控释放，例如经由控制含有RNA分子的配制剂的扩散或侵蚀/降解率进行。另外，可以使用基于泵的硬件递送系统来陈述一种或多个实施方案。
爆发中发生释放的系统的例子包括例如，在包囊于聚合物基质中的脂质体中俘获组合物的系统(所述脂质体对特定的刺激物，例如温度、pH、光照或降解酶敏感)，和具有微囊剂核心降解酶的离子包被微囊剂包囊组合物的系统。抑制剂释放是逐渐的且连续的系统的例子包括例如在基质内以某种形式含有组合物的侵蚀系统和组合物以受控速率透过例如聚合物的流出系统。例如，此类持续释放系统可以为片剂或胶囊形式。
可以使用组合物和方法来增强RNA分子的递送(关于综述，参见Shim andKwon(2010)，其通过提及并入本文)。用于增强的递送的组合物和方法可以提供经由循环的有效递送、合适的生物分布、有效的细胞转运、有效的胞内加工，等等。配制剂和组合物可以包括但不限于下列一项或多项：RNA分子的化学修饰、RNA分子或RNA前体掺入病毒或非病毒载体中、RNA分子递送的靶向、和/或将RNA分子与细胞递送增强剂偶联。
在某些方面，经化学修饰的RNA分子可以包括在有或没有上文讨论的化学修饰的情况下，将RNA分子与载体分子偶联。在某些方面，载体分子是天然的或合成的聚合物。例如，载体分子可以是胆固醇或RNA适体，等等。可以将载体分子在活性或过客链的5’和/或3’端，或者在内部核苷酸位置处与RNA分子偶联。可以在RNA分子的任一条链偶联载体。
在又一个方面，RNA分子的一条或两条链可以由病毒载体编码或用病毒载体递送。本领域中已知的多种病毒载体可以修饰为表达或携带靶细胞中的RNA分子，例如已经使用单纯疱疹病毒-1或慢病毒载体来增强siRNA的递送。
在又一个实施方案中，RNA分子可以与非病毒载体结合。可以将非病毒载体与靶向和投递增强模块，诸如抗体、各种聚合物(例如PEG)、促融合肽、接头、细胞穿透肽，等等偶联。非病毒载体包括但不限于脂质体和lipoplex、聚合物和肽、合成颗粒，等等。在某些方面，脂质体或lipoplex具有中性、负或正电荷，并且可以包含心磷脂(cardolipin)、偶联有茴香酰胺的聚乙二醇、二油酰基磷酸卵磷酯、或多种其它中性、阴离子、或阳离子脂质或脂质偶联物。可以将siRNA与阳离子聚合物(例如，聚氮丙啶(PEI))、生物可降解的阳离子多糖(例如，壳聚糖)、或阳离子多肽(例如，去端肽胶原(atelocollagen)、聚赖氨酸、和鱼精蛋白)复合。
在某些方面，可以通过将RNA靶向至细胞增强RNA递送。靶向模块可以与多种递送组合物偶联，并且提供对靶细胞的选择性或特异性结合。靶向模块可以包括但不限于结合细胞表面受体、细胞特异性胞外多肽、糖类或脂质等的模块。例如，可以使用小分子诸如叶酸、肽诸如含有RGD的肽、和抗体诸如针对表皮生长因子受体的抗体来靶向特定细胞类型。
在又一个方面，可以通过与细胞机制和机器，诸如摄取和胞内运输相互作用的模块增强递送。在某些方面，可以将细胞穿透肽(CPP)(例如，来自HIV-1的MPG和TAT、penetratin、多聚精氨酸)与siRNA或递送载体偶联以增强对细胞的递送。也可以使用促融合肽(例如，HIV-1包膜(HGP)或流感促融合肽(diINF-7)的内域(endodomain)衍生物)来增强细胞递送。
已经使用多种递送系统诸如胆固醇-siRNA、RNA适体-siRNA、腺病毒载体、慢病毒载体、稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)、基于心磷脂类似物的脂质体、DSPE-聚乙二醇-DOTAP-胆固醇脂质体、透明质烷-DPPE脂质体、中性DOPC脂质体、去端肽胶原、壳聚糖、聚氮丙啶、多聚赖氨酸、鱼精蛋白、RGD-聚乙二醇-聚氮丙啶、具有组氨酸-赖氨酸肽的HER-2脂质体、HIV抗体-鱼精蛋白、精氨酸、偶联有寡精氨酸(9R)的水溶性脂质聚合物(lipopolymer)(WSLP)、寡精氨酸(15R)、TAT-PAMAM、胆固醇-MPG-8、DOPE-阳离子脂质体、GALA肽-PEG-MMP-2可切割肽-DOPE，等等来增强siRNA的递送。
癌症患者中miRNA模拟物的最佳治疗剂量范围考虑为每kg患者体重0.01-5.0mg(mg/kg)miRNA。在一些实施方案中，涵盖的是，可以在组合物中配制和/或对患者施用约、至少约、或至多约0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7.3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0mg RNA分子，或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，可以按剂量或方案(其可以每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24小时，和/或1,2,3,4,5,6,7天，和/或1,2,3,4周，及其中可导出的任何范围施用)对患者施用0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7.3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0mg/kg RNA分子，或其中可导出的任何范围施用。
注射可以是静脉内(IV)、腹膜内(IP)、肌肉内(IM)、肿瘤内(IT)、气管内(对于肺部递送)、玻璃体内(对于眼病)、或皮下的，它们都已经确定为有效作为本文中所描述的RNA分子的递送方法。明确涵盖几种递送技术，包括但不限于中性脂质乳剂(NLE)、去端肽胶原、SNALP、DiLA、和环糊精，其在下文更为详细讨论。
中性脂质乳剂(NLE)是一种组合中性脂质、油、和乳化剂与miRNA模拟物以生成复合物的配制剂的集合，所述复合物在静脉内(IV)注射后实现对肿瘤和其它组织投递miRNA。一种此类配制剂以1:2.6:53.4:0.1(w/w)的比率组合l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、鲨烯、聚山梨酯20(Tween-20)、和抗坏血酸。将NLE组分在溶剂如氯仿中混合，然后使用旋转蒸发仪除去溶剂，留下粘性溶液。将PBS中溶解的miRNA模拟物以1:2(w/w)的比率添加到DOPC。在某些实施方案中，RNA分子与DOPC的比率是约、至少约、或至多约0.1:1,0:2:1,0.3:1,0.4:1,0.5:1,0.6:1,0.7:1,0.8:1,0.9:1,1:1,1:0.9,1:0.8,1:0.7,1:0.6,1:0.5,1:0.4;1:0.3,1:0.2,1:0.1及其中可导出的任何范围。超声处理产生颗粒+miRNA，其在人中可以以约0.01-1mg/kg的速率IV注射。在某些实施方案中，按剂量或方案(其可以每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24小时，和/或1,2,3,4,5,6,7天，和/或1,2,3,4周，及其中可导出的任何范围施用)以0.005,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7.3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0mg/kg的量对患者提供所述量的此配制剂。
去端肽胶原/miRNA复合物如下制备，即混合等体积的去端肽胶原(于pH7.4，在PBS中的0.1%)(Koken Co.,Ltd.;Tokyo,Japan)和miRNA溶液(20μΜmiRNA)，并于4℃将混合物旋转1小时。将所得的miRNA/去端肽胶原复合物在PBS中稀释至0.05%的去端肽胶原终浓度。在某些实施方案中，去端肽胶原终浓度是约、约至少、或约至多0.01%,0.02%,0.03%,0.04%,0.05%,0.06%,0.07%,0.08%,0.09%,0.10%,0.11%,0.10%,0.11%,0.12%,0.13,0.14%,0.15%,0.16%,0.17%,0.18%,0.19%,0.20%，及其中可导出的任何范围。
SNALP分类由Tekmira Pharmaceutical Corp.(Burnaby,BC,CA)开发用于核酸的系统性投递的配制剂集合。发表最多的配制剂以2:40:10:48摩尔百分比比率含有脂质3-N-[(甲氧基聚(qmethoxypoly)(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧-丙胺(PEG-CDMA)、1,2-二亚油酰基(linoleyl)氧-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇。脂质配制剂与siRNA/miRNA混合，并使用乙醇稀释法(Jeffs2005，其在此通过提及并入)形成颗粒。在一些实施方案中，脂质与核酸的比率(w:w)是，至少是，或至多是约0.001:1,0.002:1,0.003:1,0.004:1,0.005:1,0.006:1,0.007:1,0.008:1,0.009:1,0.01:1,0.02:1,0.03:1,0.04:1,0.05:1,0.06:1,0.07:1,0.08:1,0.09:1,0.1:1,0.2:1,0.3:1,0.4:1,0.5:1,0.6:1,0.7:1,0.8:1,0.9:1,1:1,1:0.9,1:0.8,1:0.7,1:0.6,1:0.5,1:0.4;1:0.3,1:0.2,1:0.1,1:0.09,1:0.08,1:0.07,1:0.06,1:0.05,1:0.04,1:0.03,1:0.02,1:0.01,1:0.009,1:0.008,1:0.007,1:0.006,1:0.005,1:0.004,1:0.003,1:0.002,1:0.001，或其中可导出的任何范围。
Tekmira声称实现大于90%包囊效率。粒径是约110nm。
DiLA2描述了一组多种由Marina Biotech Inc.(Bothell,WA,USA)开发用于小dsRNA的系统性递送的配制剂。一种配制剂以50:28:20:2的比率(w/w)组合C18:1-norArg-NH3Cl-C16、胆固醇基半琥珀酸酯(CHEMS,Anatrace,CH210)、胆固醇(Anatrace CH200)、和DMPE-PEG2k(Genzyme)。以1.7:1至5:1(w/w)的RNA:脂质比率将小dsRNA与脂质配制剂组合。在一些实施方案中，RNA:脂质比率是约，至少约，或至多约0.001:1,0.002:1,0.003:1,0.004:1,0.005:1,0.006:1,0.007:1,0.008:1,0.009:1,0.01:1,0.02:1,0.03:1,0.04:1,0.05:1,0.06:1,0.07:1,0.08:1,0.09:1,0.1:1,0.2:1,0.3:1,0.4:1,0.5:1,0.6:1,0.7:1,0.8:1,0.9:1,1:1,1:0.9,1:0.8,1:0.7,1:0.6,1:0.5,1:0.4;1:0.3,1:0.2,1:0.1,1:0.09,1:0.08,1:0.07,1:0.06,1:0.05,1:0.04,1:0.03,1:0.02,1:0.01,1:0.009,1:0.008,1:0.007,1:0.006,1:0.005,1:0.004,1:0.003,1:0.002,1:0.001，及其中可导出的任何范围。将两种组分经由碰撞流混合，并温育1小时以生成具有约125nm直径的稳定颗粒。
Calando Pharmaceuticals,Inc.(Pasadena,CA,USA)已经开发出一种以基于环糊精的颗粒为特征的递送平台，称作RONDELTM。环糊精聚阳离子(CDP)与金刚烷-PEG5000(AD-PEG)偶联物以1:1AD:CDP(mol/mol)比率混合(Hu-Lieskovan2005，其在此通过提及并入)。可以以1:1,000AD-PEG-转铁蛋白:AD-PEG(w/w)比率添加经转铁蛋白修饰的AD-PEG(AD-PEG-转铁蛋白)以提供靶向模块，从而改善对具有升高的转铁蛋白水平的癌细胞的递送。以电荷比(来自CDP的正电荷与来自miRNA主链的负电荷)为3:1(+/-)将混合物添加至等体积的RNA分子。在某些实施方案中，混合物和RNA分子之间的电荷比是约，至少约，或至多约5:1,4:1,3:1,2:1,1:1,1:2,1:3,1:4,1:5，或其中可导出的任何范围。将等体积的在水中的10%(w/v)葡萄糖添加至所得的polyplex以给出适合于注射的在5%(w/v)葡萄糖(D5W)中的最终polyplex配制剂。
在一些实施方案中，使用颗粒递送治疗性核酸。在一些实施方案中，粒径是约，至少约，或至多约10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250nm，或其中可导出的任何范围。
A.联合治疗
在某些实施方案中，组合物和方法牵涉治疗性核酸。这些组合物可以与第二疗法组合使用以增强miRNA疗法的效果，或提高采用的另一种疗法的治疗效果。这些组合物会以有效实现期望的效果，诸如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增殖的组合量提供。此方法可以牵涉在相同或不同时间时使细胞与治疗性核酸或第二疗法接触。这可以如下实现，即使细胞与一种或多种包含一种或多种药剂的组合物或药理学配制剂接触，或者使细胞与两种或更多种独特的组合物或配制剂接触，其中一种组合物提供(1)治疗性核酸；和/或(2)第二疗法。可以施用第二组合物或方法，其包括化学疗法、放射疗法、手术疗法、免疫疗法或基因疗法。
涵盖的是，可以在彼此的约12-24小时内，且更优选地，在彼此的约6-12小时内给患者提供miRNA疗法和第二疗法。然而，在一些情况中，可以期望显著延长治疗的时间段，其中各次施用之间经过几天(2,3,4,5,6或7)至几周(1,2,3,4,5,6,7或8)。
在某些实施方案中，治疗过程会持续1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90天或更多。涵盖的是，一种药剂可以在第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,和/或90天，其任何组合给予，而另一种药剂在第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,和/或90天，或其任何组合给予。在一天(24小时时段)内，可以对患者给予药剂的一次或多次施用。此外，在治疗过程后，涵盖的是，提供了不施用治疗的时间段。此时间段可以持续1,2,3,4,5,6,7天，和/或1,2,3,4,5周，和/或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个月或更多，这取决于患者的状况，诸如其预后、意志力、健康，等等。
考虑载体或任何蛋白质或其它药剂的毒性(若有的话)，对患者施用本发明的任何化合物或疗法会遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，提供了如下的步骤，即监测可归因于联合疗法的毒性。预期会在必要时重复治疗周期。还涵盖的是，多种标准疗法，以及手术干预可以与描述的疗法组合应用。
在具体的方面，涵盖的是第二疗法，诸如化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法或其它基因疗法与miRNA疗法组合材料，如本文中描述的。
化学治疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；磺酸烃基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；隐藻素类(cryptophycin)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括蒽环类抗生素A；二膦酸盐(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)（包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、GEMZAR和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2’-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)（“Ara-C”）；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)、和多西他塞(doxetaxel);苯丁酸氮芥(chloranbucil);吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂配位复合物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoicacid)；卡培他滨(capecitabine)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
放射疗法，又称作辐射疗法，是用电离辐射治疗癌症和其它疾病。电离辐射放置能量，其通过损害细胞的遗传材料，使这些细胞不可能继续生长来损伤或破坏治疗区域中的细胞。虽然辐射损害癌细胞和正常细胞两者，但是后者能够自身修复并正确发挥功能。放射疗法可以用于治疗局部化的实体瘤，诸如皮肤、舌、喉、脑、乳腺、或宫颈癌。它也可以用于治疗白血病和淋巴瘤(分别是血液形成细胞和淋巴系统的癌症)。
依照本发明使用的辐射疗法可以包括但不限于使用γ-射线、X-射线、和/或放射性同位素对肿瘤细胞的定向投递。还涵盖其它形式的DNA损害因素，诸如微波、质子束照射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV照射。最可能的是，所有这些因素对DNA、对DNA前体、对DNA的复制和修复、以及对染色体的装配和维持实现一大批损伤。X-射线的剂量范围范围为50至200伦琴的每日剂量持续延长的一段时间(3至4周)，至2000至6000伦琴的单一剂量。放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于同位素的半衰期、发射的放射的强度和类型、和新生物细胞的摄取。放射疗法可以包括使用经放射性标记的抗体以将放射剂量直接递送到癌症部位(放射性免疫疗法)。一旦注射入身体中，抗体选择性挑出癌细胞，其受到放射的细胞杀伤(细胞毒性)作用破坏。此办法可以使对健康细胞的放射损害风险最小化。
用于脑和其它肿瘤的趋实体性放射性手术(γ刀)不使用刀，而是来自数百个不同角度的非常精确靶向的γ放射疗法束。仅需要一段时间的放射疗法，花费约4至5小时。对于此治疗，专门制备的金属框架附着于头部。然后，实施几次扫描和x-射线以找到需要治疗的精确区域。在针对脑肿瘤的放射疗法期间，患者在其头部在较大头盔中的情况下躺下，所述头盔具有其中的数百个孔以容许放射疗法束通过。相关办法容许治疗身体其它区域中的肿瘤的定位。
在癌症治疗的背景中，免疫治疗剂一般依赖于免疫效应细胞和分子的使用以靶向和破坏癌细胞。曲妥单抗(Trastuzumab)(HerceptinTM)是此类例子。免疫效应器可以例如是对肿瘤细胞表面上的某种标志物特异性的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应器或者它可以募集其它细胞以实际影响细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素，等等)偶联，并且仅充当靶向剂。或者，效应器可以是携带与肿瘤细胞靶物直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。治疗形式的组合，即直接的细胞毒性活性和抑制或降低ErbB2会在ErbB2过表达癌症的治疗中提供治疗益处。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤或疾病细胞必须携带适合于靶向，即不存在于大多数其它细胞上的某种标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些中的任一种可以适合于在本发明的背景中靶向。常见的肿瘤标志物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤关联抗原、胎儿抗原,酪氨酸酶(p97),gp68,TAG-72,HMFG,唾液酸路易士抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个备选方法是组合抗癌效应与免疫刺激效应。也存在免疫刺激分子，包括：细胞因子(诸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、gamma-IFN)、趋化因子(诸如MIP-1、MCP-1、IL-8)和生长因子(诸如FLT3配体)。已经显示了与肿瘤阻抑物诸如MDA-7组合以蛋白质或通过基因递送组合免疫刺激分子增强抗肿瘤效应(Ju等,2000)。此外，针对任何这些化合物的抗体可以用于靶向本文中讨论的抗癌剂。
目前所调查或使用中的免疫疗法的例子是免疫佐剂，例如牛型结核菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169;Hui and Hashimoto,1998;Christodoulides等,1998)、细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ；IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等,1998;Davidson等,1998;Hellstrand等,1998)，基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2、p53(Qin等,1998;Austin-Ward and Villaseca,1998;美国专利5,830,880和5,846,945)和单克隆抗体，例如，抗神经节苷脂GM2、抗HER-2、抗pl85；Pietras等,1998;Hanibuchi等,1998;美国专利5,824,311)。Herceptin(曲妥单抗)是一种阻断HER2-neu受体的嵌合(小鼠-人)单克隆抗体。它拥有抗肿瘤活性，并且已经批准用于治疗恶性肿瘤(Dillman,1999)。非限制性的一批几种已知的抗癌免疫治疗剂及其靶物包括(通称/靶物)西妥昔单抗(Cetuximab)/EGFR、Panitumuma/EGFR、曲妥单抗/erbB2受体、贝伐单抗(Bevacizumab)/VEGF、阿仑单抗(Alemtuzumab)/CD52、Gemtuzumabozogamicin/CD33、利妥昔单抗(Rituximab)/CD20、托西莫单抗(Tositumomab)/CD20、Matuzumab/EGFR、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)/CD20、托西莫单抗/CD20、HuPAM4/MUC1、MORAb-009/Mesothelin、G250/碳酸酐酶IX、单抗8H9/8H9抗原、M195/CD33、Ipilimumab/CTLA4、HuLuc63/CS1、阿仑单抗/CD53、依帕珠单抗(Epratuzumab)/CD22、BC8/CD45、HuJ591/前列腺特异性膜抗原、hA20/CD20、Lexatumumab/TRAIL受体-2、Pertuzumab/HER-2受体、Mik-beta-1/IL-2R、RAV12/RAAG12、SGN-30/CD30、AME-133v/CD20、HeFi-1/CD30、BMS-663513/CD137、Volociximab/抗α5β1整联蛋白、GC1008/TGFβ、HCD122/CD40、Siplizumab/CD2、MORAb-003/叶酸盐受体α、CNTO328/IL-6、MDX-060/CD30、Ofatumumab/CD20、和SGN-33/CD33。涵盖的是，一种或多种这些疗法可以与本文中描述的miRNA疗法一起采用。
存在许多用于癌症的被动性免疫治疗的不同办法。它们可以广泛分成下列各项：仅注射抗体；注射与毒素或化学治疗剂偶联的抗体；注射与放射性同位素偶联的抗体；注射抗独特型抗体；及最终，在消除骨髓中的肿瘤细胞。
约60%患有癌症的对象会经历某种类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性疗法。治愈性疗法是一种可以与其它疗法，诸如本发明的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法一起使用的癌症治疗。
治愈性疗法包括切除，其中将整个或部分的癌性组织物理除去、切除、和/或破坏。肿瘤切除指物理除去肿瘤的至少一部分。在肿瘤切除外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科、和显微镜控制的手术(Mohs手术)。进一步涵盖的是，本发明可以与表面癌症、前期癌、或附带量的正常组织的除去结合使用。
在切除整个癌性细胞、组织、或肿瘤的部分后，在身体中可以形成空穴。可以通过用别的抗癌疗法对该区域灌注、直接注射或局部应用实现治疗。此类治疗可以例如每1,2,3,4,5,6,或7天、或每1,2,3,4和5周或每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,或12个月重复。这些治疗也可以是不同剂量的。
激素疗法也可以与本发明一起或与先前描述的任何其它癌症疗法组合使用。可以在某些癌症诸如乳腺、前列腺、卵巢、或宫颈癌的治疗中采用激素的用途以降低某些激素诸如睾酮或雌激素的水平或阻断其效果。此治疗经常与至少一种其它癌症疗法组合使用，作为治疗选项或以降低转移风险。
IV.实施例
包括以下实施例以演示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当领会，以下实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明的实践中较好运行的技术，并且如此可以认为构成其实施的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当领会可以在不偏离本发明精神和范围的前提下对公开的具体实施方案做出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1：
MIR-34a的过客或活性链中的核苷酸修饰对于抗细胞增殖活性的影响
miRNA的活性取决于其与RNA诱导的沉默复合物(RISC)的蛋白质相互作用的能力和其经由杂交与mRNA靶物相互作用的能力两者。为了测定双链miR-34a中的哪些核苷酸可以在不破坏细胞内miRNA活性的情况下修饰，我们使用一系列双链miR-34a模拟物，其具有在该双链miRNA的活性链上或过客链上的两个相邻位置处掺入的经2氧-甲基(2’O-Me)修饰的核苷酸(表1)。在2’O-Me修饰外，每条过客链具有5’端修饰，其由5’氨基C6核苷酸(附接于6-碳间隔物的伯胺基团)构成。
表1：miR-34a模拟物的序列和修饰样式。经2’O-Me修饰的核苷酸的核苷酸位置标示为粗体的、斜体的、且加下划线的。
Figure BDA0000389807070000801
发明人检查寡核苷酸修饰对miR-34a模拟物活性的影响。将具有5’-氨基C6修饰而没有2’O-Me修饰的合成的过客链寡核苷酸与每个合成的、经修饰的活性链寡核苷酸(表1)退火。将合成的、未修饰的活性链寡核苷酸与每个合成的、经修饰的过客链寡核苷酸(表1)退火。用所得的双链寡核苷酸或用阴性对照miRNA(Life Technologies,Inc./Ambion,Inc;Austin,TX,USA;产品目录编号AM17103)以终浓度30nM反转染肺癌细胞系(H460)。使用Lipofectamine2000(Life Technologies,Inc./Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)依照制造商的推荐使用下列参数瞬时转染细胞系：在100μl总体积培养基中，96孔板中每孔5,000个细胞，0.1-0.2μl Lipofectamine2000(细胞系特异性优化的)。在转染后第3天、第4天和第7天使用
Figure BDA0000389807070000802
试剂(Invitrogen Corp.;Carlsbad,CA,USA;产品目录编号DAL1100)依照制造商的方案实施细胞存活力测定法。使用荧光读板仪测量试卤灵(resorufin,560nm激发，590nm发射)的积累，所述试卤灵是
Figure BDA0000389807070000803
的还原底物。试卤灵积累指示每孔的活细胞数目。用具有2’O-Me修饰的双链miR-34a转染的每个细胞群体的增殖细胞的相对数目如下计算，即用经未修饰的miR-34a模拟物转染的细胞的荧光除以用经2’O-Me修饰的双链miR-34a模拟物转染的细胞的荧光，并将结果乘以100。表2中显示了相对的抗增殖数值。
表2：miR-34a中的经2’O-Me修饰的核苷酸对H460肺癌细胞增殖的影响。没有2’O-Me修饰的合成的双链miR-34a的抗细胞增殖活性设置为100%。大于100的百分比抗细胞增殖数值指示比未修饰的miR-34a对照的抗增殖活性高的抗增殖活性。所指示的修饰只是在过客链或活性链中。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。ND，未测定。
Figure BDA0000389807070000811
如表2中显示的，在过客链中在位置1+2;3+4;9+10;11+12;13+14;17+18;19+20;和21+22处及在活性链中在位置3+4;11+12;13+14;和15+16处的2’O-Me修饰导致比对未修饰的对照miR-34a观察到的抗增殖活性升高的抗增殖活性。在与没有2’O-Me修饰的miR-34a模拟物相比时，过客链的位置15+16处及活性链的位置7+8;9+10;18+19;19+20;3+4+18+19;3+4+11+12+18+19;3+4+11+12+15+16+18+19;和3+4+11+12+15+16+19+20处的2’O-Me修饰导致实质性受损的抗增殖活性。对过客或活性链的其它位置的修饰名义上影响模拟物的抗增殖活性。
实施例2：
miR-34a的过客和活性链中组合的核苷酸修饰对于抗细胞增殖活性的影响
发明人评估在过客和活性链两者中具有经修饰的核苷酸的miR-34a模拟物的抗细胞增殖活性。将多种经修饰的过客和活性链寡核苷酸退火以形成在两条链上都具有修饰的miR-34a模拟物。以终浓度30nM用多种模拟物及用阴性对照miRNA(Ambion,产品目录编号AM17103)反转染肺癌(H460)、前列腺癌(PC3)和肝癌(C3A)细胞系。依照制造商的推荐使用下列参数使用Lipofectamine2000(Invitrogen)：96孔板每孔的100μl总体积培养基中5,000个细胞，0.1-0.2μl Lipofectamine2000(细胞系优化的)。在转染后第6天依照制造商的方案对细胞实施
Figure BDA0000389807070000821
测定法(Invitrogen,产品目录编号DAL1100)。使用荧光读板仪测量试卤灵(560nm激发，590nm发射)的积累，所述试卤灵是
Figure BDA0000389807070000822
的还原底物。试卤灵荧光与每孔的活细胞数目相关联。每个经转染的细胞群的增殖细胞的相对数目如下计算，即用经未修饰的miR-34a模拟物转染的细胞的荧光除以用经2’O-Me修饰的双链miR-34a转染的细胞的荧光，并将结果乘以100。表3中显示了结果。
表3：双链miR-34a模拟物中的核苷酸修饰对肺癌细胞(H460)、前列腺癌细胞(PC3)和肝癌细胞(C3A)的抗细胞增殖活性的影响。抗细胞增殖活性的百分比数值代表对所有三种细胞系观察到的抗细胞增殖活性的平均值。大于100的数值指示用经修饰的miR-34a模拟物比用未修饰的miR-34a观察到的抗增殖活性高的抗增殖活性。
标示的修饰在过客链、活性链、或这两条链中。所有过客链具有5’氨基C6修饰。
Figure BDA0000389807070000831
如表3中显示的，仅在过客链中具有2’O-Me修饰的所有测试miR-34a模拟物比未修饰的miR-34模拟物具有更高的抗细胞增殖活性。在活性和过客链两者中都具有修饰的几种模拟物具有抗细胞增殖活性，这提示这几种修饰的协同效应。例如，具有与经1、2、20、21、22、23；1、2、3、4、22、23；1、2、5、6、22、23；1、5、6、22、23；和1、2,、19、20、22、232’O-Me修饰的过客链组合的经11,12,15,162’O-Me修饰的活性链的模拟物比仅具有一条经修饰的链的模拟物大很多的抗增殖性。具有活性链上位置3、4、11、12处的2’O-Me修饰及过客链上位置1、2、20、21、22、23；1、2、3、4、22、23；1、2、5、6、22、23；1、5、6、22、23；和1、2、19、20、22、23处的2’O-Me修饰的组合的miR-34a模拟物表明比仅具有活性链修饰的模拟物大的抗增殖活性。这些数据提示2’O-Me修饰不仅增强miR-34a模拟物的抗增殖活性，而且某些修饰组合可以应用于显著增强miR-34c模拟物的活性。
实施例3：
活性和过客链两者中的核苷酸修饰有助于MIRNA模拟物的稳定性
由于2’OΗ是核糖核酸酶切割RNA分子需要的，将2’修饰的核苷酸掺入RNA分子中可以使它们对核酸酶消化更具抗性。发明人使用体外稳定性测定法和纯化的RNA酶A(Ambion,产品目录编号AM2270)来比较经修饰的和未修饰的miR-34a模拟物的稳定性。
如下制备miR-34a模拟物，即杂交在多个位置处具有经2’O-Me修饰的核苷酸的互补寡核苷酸，并于25℃将杂合物与RNA酶A(20μg/ml)一起温育60分钟。60分钟温育后，将二硫苏糖醇(DTT)添加到终浓度10mM，并于60℃加热混合物达10分钟以使RNA酶活性失活。使用hsa-miR-34a
Figure BDA0000389807070000841
微小RNA测定法RT引物(Applied Biosystems Inc.;产品目录编号4427975,测定法ID000425)用MMLV-RT(Invitrogen,产品目录编号28025-021)逆转录RNA。在7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)中用对hsa-miR-34a特异性的引物和Platinum Taq聚合酶(Invitrogen,产品目录编号10966-083)使用
Figure BDA0000389807070000842
微小RNA测定法对cDNA实施qRT-PCR。表4显示了核苷酸修饰对各种miR-34a模拟物稳定性的影响。
表4：在与RNA酶A一起温育后，链修饰对双链miR-34a模拟物稳定性的影响。显示了过客和活性链序列。粗体、斜体、加下划线的字母指示经2’O-Me修饰的核苷酸。所有过客链具有5’-氨基C6修饰。将每行内的活性和过客链杂交，并在RNA酶A溶液中温育。如下计算在RNA酶A处理后剩余的双链模拟物的相对百分比，即测定剩余的双链模拟物的百分比，并除以剩余的未修饰的双链标准模拟物的百分比。大于1.00的数值指示比未修饰的模拟物更具稳定性的经修饰的模拟物。表中数值100会指示经修饰的miR-34a模拟物比未修饰的miR-34a模拟物稳定100倍。A-ID，活性链ID号；P-ID，过客链ID号；ds，双链。
Figure BDA0000389807070000851
具有活性和过客链组合A150/P211的模拟物比未修饰的模拟物稳定超过2000倍。模拟物的稳定性升高可以大大改善用miRNA治疗期间的药效学特性。
在缺乏这些数据的情况中，可以预测具有最多2’O-Me修饰的核苷酸的模拟物会是最稳定的，因为它具有最少的核酸酶敏感性位点。令人惊讶地，在我们的测定法中，最多修饰的模拟物之一(A206/P210)仅比未修饰的模拟物略稳定。这些数据提示了仅计算2’O-Me修饰的数目不是确定经修饰的双链miR-34a模拟物稳定性的准确反映或可预测方式。
实施例4：
活性和过客链两者中的核苷酸修饰有助于MIRNA模拟物的活性
评估miR-34a模拟物的抗增殖活性，并将其与没有2’O-Me修饰的miR-34a模拟物比较。以终浓度1、3、和10nM用4种不同双链miR-34a模拟物和阴性对照miRNA(Ambion,产品目录编号AM17103)反转染肺癌细胞(H460)。依照制造商的推荐使用下列参数使用Lipofectamine2000(Invitrogen)：96孔板每孔的100μl总体积培养基中5,000个细胞，0.1-0.2μl Lipofectamine2000(细胞系特异性优化的)。在转染后3天依照制造商的方案对细胞实施
Figure BDA0000389807070000861
测定法(Invitrogen,产品目录编号DAL1100)。使用荧光读板仪测量试卤灵(560nm激发，590nm发射)的积累，所述试卤灵是
Figure BDA0000389807070000862
的还原底物。试卤灵荧光与每孔的活细胞数目相关联。每个经转染的细胞群的活细胞的相对百分比如下计算，用来自用给定浓度的miR-34a模拟物转染的细胞的荧光除以来自用相同浓度的阴性对照miRNA转染的细胞的荧光，并将结果乘以100。小于100%的数值指示，相对于用阴性对照miRNA转染的细胞群，这些miR-34a模拟物降低群体中活细胞的数目。表5中显示了结果。
表5：在转染H460肺癌细胞后，2’-O Me修饰对miR-34a模拟物的抗细胞增殖活性的影响。显示了过客和活性链序列。粗体、斜体、加下划线的字母指示经2’O-Me修饰的核苷酸。将每行内的活性和过客链杂交，并以显示的浓度转染到H460细胞中。A-ID，活性链ID号；P-ID，过客链ID号。百分比活细胞是用miR-34a模拟物转染后仍是活的细胞的百分比。阴性对照miRNA的数值设置为100%。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
Figure BDA0000389807070000871
相对于未修饰的模拟物，经2’-O Me修饰的模拟物对都表明增强的核酸酶稳定性(表4)，而且几种经双重链修饰的模拟物还展现出升高的抗增殖活性(表5)。最感兴趣的是经双重链修饰的mir-34a模拟物，其在以三分之一剂量使用时与标准的miR-34a模拟物具有类似的抗增殖活性，因为它指示经修饰的miR-34a模拟物比标准miR-34a模拟物有超出大约3倍的活性。就稳定性数据而言，不可能预测哪些修饰组合会生成最具活性的miRNA模拟物。
实施例5：
通过经修饰的MIR-34a模拟物进行的基因调节
miRNA发挥指导序列功能，用于对mRNA翻译进行的被RNA诱导的沉默复合物(RISC)的调节。在进入RISC后，miRNA模拟物可以改变经转染细胞的mRNA谱，其是通过：(1)诱导RISC切割与该miRNA结合的mRNA，(2)通过防止结合的mRNA与核糖体相互作用而改变结合的mRNA的半衰期，和/或(3)改变受所述miRNA模拟物调节的基因所调节的mRNA的量。
为了解决经修饰的miR-34a模拟物是否具有未修饰的miR-34a模拟物具有的对mRNA表达的相同影响，我们使用mRNA阵列形成H460肺癌细胞中的基因转录谱，所述H460肺癌细胞用阴性对照miRNA(Ambion,产品目录编号AM17111)、未修饰的miR-34a模拟物(P140/A150)、或5种不同的经修饰的miR-34a模拟物(P210/A150,P211/A150,P215/A150,P211/A200,和P211/A206)(表5)转染。将3nM或10nM的miRNA模拟物与0.2μl Lipofectamine2000复合，并添加到96孔板每孔的100μl总体积RPMI培养基中5,000个的H460细胞中。在转染后3天收获细胞，并使用mirVanaTMPARISTM试剂盒(Ambion,产品目录编号AM1556)遵循制造商的推荐方案提取总RNA。
mRNA阵列分析由Asuragen,Inc.(Austin,TX,USA)，依照公司的标准操作规程实施。使用MessageAmpTMII-96aRNA扩增试剂盒(Ambion,产品目录编号1819)，用生物素标记200ng的输入总RNA。使用Agilent2100Bioanalyzer毛细管电泳仪(Agilent Technologies,Inc.)量化cRNA产量。使用制造商的推荐和下列参数将经标记的靶物与Affymetrix mRNA阵列(人HG-U133A2.0阵列)杂交。于45℃在Affymetrix640型杂交炉中实施杂交达16小时。运行清洗脚本Midi_euk2v3_450，将阵列清洗，并在Affymetrix FS450流控技术(Fluidics)站上染色。在Affymetrix GeneChip Scanner 3000上扫描阵列。使用Affymetrix统计学算法MAS5.0(GCOS v1.3)产生阵列上每个基因的图像信号数据、群平均值、具有显著性标记的p值、对数比(log ratio)和基因注释的汇总。报告的数据含有Affymetrix数据和结果文件(cabinet文件)，并且含有阵列的初始图像和经加工的室强度(.eel)。
比较各个样品的mRNA阵列概况以测定其相似性。计算样品(完整探针集)间的Pearson积矩相关系数(product-moment correlation coefficient)，并且显示于表6和7中。观察到所有样品的相关系数大于0.987。
表6：在用3nM指定miRNA模拟物转染肺癌细胞后在对基因表达的阵列分析后的Pearson积矩相关系数。表5中显示了P-过客和A-活性链的序列和2’-O Me修饰。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
Figure BDA0000389807070000891
表7：在用10nM指定miRNA模拟物转染肺癌细胞后在对基因表达的阵列分析后的Pearson积矩相关系数。表5中显示了P-过客和A-活性链的序列和2’-O Me修饰。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
将分析限于那些其中的表达水平受到最少两种miR-34a模拟物改变至少2倍的mRNA，在用经2’-O Me修饰的miR-34a模拟物和未修饰的miR-34a模拟物转染的细胞之间观察到强烈关联(表8)。这些数据揭示经修饰的miR-34a模拟物的靶物特异性与未修饰的miR-34a模拟物相似。
表8：在用10nM或3nM不含经修饰的核苷酸的miR-34a模拟物(P140/A150)和含有2’-O Me修饰的miR-34a模拟物(P210/A150,P211/A150,P215/A150,P211/A200,P211/A206)转染肺癌细胞后，对改变至少2倍的基因表达进行阵列分析后的Pearson积矩相关系数。表5中显示了P-过客和A-活性链的序列和2’-O Me修饰。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
Figure BDA0000389807070000901
在全局表达谱外，我们比较了经2’O-Me修饰的和未修饰的miR-34a模拟物对已知的miR-34a靶基因的活性。阵列数据揭示了，在与用阴性对照miRNA转染的细胞相比时，miR-34a的两种直接mRNA靶物MET和SIRT1的水平在所有用10nM miR-34a模拟物处理的细胞群中显著降低(表9)。
表9：以浓度3nM或10nM用指定的miR-34a模拟物转染H460细胞后的MET或SIRT1mRNA水平。数值代表与用阴性对照miRNA转染细胞后观察到的百分比表达(100%)相比的百分比表达。表5中显示了P-过客和A-活性链的序列和2’-O Me修饰。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
Figure BDA0000389807070000902
实施例7：
MIR-34c的过客或活性链中的核苷酸修饰对于抗细胞增殖活性的影响
miRNA的活性取决于其与RNA诱导的沉默复合物(RISC)的各个蛋白质相互作用的能力和其经由杂交与mRNA靶物相互作用的能力两者。为了测定mir-34c的双链RNA模拟物中的哪些核苷酸可以在不破坏细胞内miRNA活性的情况下修饰，我们使用一系列双链miR-34c模拟物，其具有在该双链miRNA的活性链上或过客链上的两个相邻位置处掺入的经2’O-Me修饰的核苷酸(表10)。除2’O-Me修饰外，每条过客链具有5’端C6修饰。
表10：mir-34c模拟物的序列和修饰样式。经2’O-Me修饰的核苷酸的位置标示为粗体的、斜体的、且加下划线的。
Figure BDA0000389807070000911
发明人检查寡核苷酸修饰对mir-34c模拟物活性的影响。将具有5’-氨基C6修饰而没有2’O-Me修饰的合成的过客链寡核苷酸与每个合成的、经修饰的活性链寡核苷酸退火(表10、11)。将合成的、未修饰的活性链寡核苷酸与每个合成的、经修饰的过客链寡核苷酸退火(表10、11)。用所得的双链寡核苷酸或用阴性对照miRNA(Life Technologies,Inc./Ambion,Inc;Austin,TX,USA;产品目录编号AM17103)以终浓度30nM反转染肺癌细胞系(H460)。使用Lipofectamine 2000(Life Technologies,Inc./Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)依照制造商的推荐使用下列参数瞬时转染细胞系：在96孔板中每孔100μl总体积培养基中，5,000个细胞，0.1-0.2μl Lipofectamine 2000(细胞系特异性优化的)。在转染后第3天、第4天和第7天使用试剂(InvitrogenCorp.;Carlsbad,CA,USA;产品目录编号DAL1100)依照制造商的方案实施细胞存活力测定法。使用荧光读板仪测量试卤灵(560nm激发，590nm发射)的积累，所述试卤灵是的还原底物。试卤灵积累指示每孔的活细胞数目。用具有2’O-Me修饰的双链mir-34c转染的每个细胞群体的增殖细胞的相对数目如下计算，即用经未修饰的mir-34c模拟物转染的细胞的荧光除以用经2’O-Me修饰的mir-34c模拟物转染的细胞的荧光，并将结果乘以100。表11中显示了相对的抗增殖数值。
表11：双链miR-34c模拟物中的核苷酸修饰对肺癌细胞(H460)增殖的影响。大于100的百分比抗细胞增殖数值指示比用在任一条链中没有2’O-Me修饰的miR-34c对照观察到的抗增殖活性高的抗增殖活性。指定的修饰仅在过客链或活性链中。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
Figure BDA0000389807070000921
如表11中显示的，在过客链中在位置1、2；3、4；5、6、7、8；9、10；11、12；13、14；17、18；19、20；1、2、22、23；和1、2、3、21、22、23处及在活性链中在位置1、2；3、4；5、6；9、10；11、12；13、14；15、16；17、18；和1、2、22、23处的2’O-Me修饰导致相对于对未修饰的对照mir-34c观察到的抗增殖活性类似的或升高的抗增殖活性。在与没有2’O-Me修饰的mir-34c模拟物相比时，过客链的位置15+16处及活性链的位置7、8；19、20；和1、2、3、21、22、23处的2’O-Me修饰导致实质性受损的抗增殖活性。
实施例8：
miR-34c的过客和活性链中组合的核苷酸修饰对于抗细胞增殖活性的影响
发明人评估在过客和活性链两者中具有经修饰的核苷酸的mir-34c模拟物的抗细胞增殖活性。将多种经修饰的过客和活性链寡核苷酸退火以形成在两条链上都具有修饰的mir-34c模拟物。以终浓度30nM用多种模拟物或用阴性对照miRNA(Ambion,产品目录编号AM17103)反转染H460肺癌细胞。依照制造商的推荐使用下列参数使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)：96孔板每孔的100μl总体积培养基中5,000个细胞，0.1-0.2μl Lipofectamine2000(细胞系优化的)。在转染后第6天依照制造商的方案对细胞实施
Figure BDA0000389807070000931
测定法(Invitrogen,产品目录编号DAL1100)。使用荧光读板仪测量试卤灵(560nm激发，590nm发射)的积累，所述试卤灵是
Figure BDA0000389807070000932
的还原底物。试卤灵荧光与每孔的活细胞数目相关联。每个经转染的细胞群中增殖细胞的相对数目如下计算，即用经修饰的mir-34c模拟物转染的细胞的荧光除以用经2’O-Me修饰的mir-34c模拟物转染的细胞的荧光，并将结果乘以100。表12中显示了结果。
表12：双链miR-34c模拟物中的核苷酸修饰对肺癌细胞(H460)增殖的影响。大于100的百分比抗细胞增殖数值指示比用在任一条链中不含2’O-Me修饰的miR-34c对照观察到的抗增殖活性高的抗增殖活性。标示的修饰仅仅是在过客链、或活性链中。所有过客链具有5’氨基C6修饰。
Figure BDA0000389807070000941
如表12中显示的，在过客链中具有2’O-Me修饰的所有模拟物与未修饰的mir-34c模拟物具有至少相似的抗细胞增殖活性。在活性和过客链两者中都具有修饰的几种模拟物具有的抗细胞增殖活性提示这些修饰的协同效应。例如，具有11、12、17、18处经2’O-Me修饰的活性链及17、18；1、2、3、21、22、23；或1、2、3、11、12、13、14、17、18、21、22、23处经2’O-Me修饰的过客链组合的模拟物比仅具有一条修饰链的模拟物更具抗增殖性。这些数据提示2’O-Me修饰不仅增强mir-34c模拟物的抗增殖活性，而且一些修饰组合可以应用于显著增强mir-34c模拟物的活性。
实施例9：
活性和过客链两者中的核苷酸修饰有助于MIRNA模拟物的稳定性
由于2’OΗ是核糖核酸酶切割RNA分子需要的，将2’修饰的核苷酸掺入RNA分子中可以使它们对核酸酶消化更具抗性。发明人使用体外稳定性测定法和纯化的RNA酶A(Ambion,产品目录编号AM2270)来比较经修饰的和未修饰的mir-34c模拟物的稳定性。
如下制备mir-34c模拟物，即杂交在多个位置处具有经2’O-Me修饰的核苷酸的互补寡核苷酸，并于25℃将杂合物与RNA酶A(20μg/ml)一起温育120分钟。120分钟温育后，将二硫苏糖醇(DTT)添加到终浓度10mM，并于60℃加热混合物达10分钟以使RNA酶活性失活。使用hsa-mir-34c
Figure BDA0000389807070000952
微小RNA测定法RT引物(Applied Biosystems Inc.;产品目录编号4427975,测定法ID000428)用MMLV-RT(Invitrogen,产品目录编号28025-021)逆转录RNA。在7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)中用对hsa-mir-34c特异性的引物和Platinum Taq聚合酶(Invitrogen,产品目录编号10966-083)使用
Figure BDA0000389807070000953
微小RNA测定法对cDNA实施qRT-PCR。表13显示了核苷酸修饰对各种mir-34c模拟物稳定性的影响。
表13：在与RNA酶A一起温育后，链修饰对双链mir-34c模拟物稳定性的影响。显示了过客和活性链序列。粗体、斜体、加下划线的字母指示经2’O-Me修饰的核苷酸。所有过客链具有5’-氨基C6修饰。将每行内的活性和过客链杂交在一起，然后在RNA酶A溶液中温育。如下计算在RNA酶A处理后剩余的双链模拟物的相对百分比，即确定剩余的双链模拟物的百分比，并除以剩余的未修饰的双链标准模拟物的百分比。大于1.00的数值指示比未修饰的模拟物更具稳定性的经修饰的模拟物。表中数值100会指示经修饰的mir-34c模拟物比未修饰的mir-34c模拟物稳定100倍。A-ID，活性链ID号；P-ID，过客链ID号。
Figure BDA0000389807070000951
具有活性和过客链组合A133/P129的模拟物比未修饰的模拟物稳定超过2700倍。模拟物的稳定性升高可以大大改善用miRNA治疗期间的药效学特性。
在缺乏这些数据的情况中，可以预测具有最多经2’O-Me修饰的核苷酸的模拟物会是最稳定的，因为它具有最少的核酸酶敏感性位点。令人惊讶地，在我们的测定法中，没有观察到具有10个经2’O-Me修饰的核苷酸的模拟物组合A130/P126比具有8个经2’O-Me修饰的核苷酸的A130/P125模拟物更稳定。这些数据指示，仅计算2’O-Me修饰的数目不是确定经修饰的双链mir-34c模拟物稳定性的准确反映或可预测方式。
实施例10：
活性和过客链两者中的核苷酸修饰有助于MIRNA模拟物的活性
评估最具核酸酶抗性的mir-34c模拟物中4种的抗增殖活性，并将其与没有2’O-Me修饰的mir-34c模拟物比较。以终浓度3、10、和30nM用4种不同双链mir-34c模拟物和阴性对照miRNA(Ambion,产品目录编号AM17103)反转染肺癌细胞(H460)。依照制造商的推荐使用下列参数使用Lipofectamine2000(Invitrogen)：96孔板每孔的100μl总体积培养基中5,000个细胞，0.1-0.2μlLipofectamine 2000(细胞系特异性优化的)。在转染后3天依照制造商的方案对细胞实施
Figure BDA0000389807070000961
测定法(Invitrogen,产品目录编号DAL1100)。使用荧光读板仪测量试卤灵(560nm激发，590nm发射)的积累，所述试卤灵是
Figure BDA0000389807070000962
的还原底物。试卤灵荧光与每孔的活细胞数目相关联。每个经转染的细胞群的活细胞的相对百分比如下计算，用来自用给定浓度的mir-34c模拟物转染的细胞的荧光除以来自用相同浓度的阴性对照miRNA转染的细胞的荧光，并将结果乘以100。小于100%的数值指示相对于用阴性对照miRNA转染的细胞群，mir-34c模拟物降低群体中活细胞的数目。表14中显示了结果。
表14：在转染H460肺癌细胞后2’-O Me修饰对mir-34c模拟物的抗细胞增殖活性的影响。显示了过客和活性链序列。粗体、斜体、加下划线的字母指示经2’O-Me修饰的核苷酸。将每行内的活性和过客链杂交，并以显示的终浓度转染到H460细胞中。A-ID，活性链ID号；P-ID，过客链ID号。百分比活细胞代表用mir-34c模拟物转染后仍是活的细胞的百分比。阴性对照miRNA的数值设置为100%。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
所有模拟物对都表明，相对于未修饰的模拟物有增强的核酸酶稳定性(表13)，并且在两条链中都具有2’O-Me修饰的模拟物还展现出升高的抗增殖活性(表14)。在两条链中都具有修饰的模拟物在以十分之一剂量使用时展示与对照模拟物的抗增殖活性相似的抗增殖活性。
实施例11：
通过经修饰的MIR-34c模拟物进行的基因调节
miRNA发挥RNA诱导的沉默复合物(RISC)的指导序列功能，用以调节mRNA翻译。在进入RISC后，miRNA模拟物可以改变经转染细胞的mRNA谱，其通过：(1)诱导RISC切割与miRNA结合的mRNA，(2)通过防止结合的mRNA与核糖体相互作用而改变结合的mRNA的半衰期，和/或(3)改变受所述miRNA模拟物调节的基因所调节的mRNA的量。
为了研究经修饰的mir-34c模拟物是否具有未修饰的mir-34c模拟物具有的对mRNA表达的相同影响，我们使用mRNA阵列形成H460肺癌细胞中的基因转录谱，所述H460肺癌细胞用两种不同阴性对照miRNA(Ambion,产品目录编号AM17111;Ambion,产品目录编号AM17103)、未修饰的mir-34c模拟物(P121/A130)、或4种不同的经修饰的mir-34c模拟物(P125/A130,P126/A130,P129/A130,和P129/A133)(表14)转染。将3、10或30nM的miRNA模拟物与0.2μl Lipofectamine2000复合，并添加到96孔板每孔的100μl总体积RPMI培养基中的5,000个H460细胞中。在转染后3天收获细胞，并使用mirVanaTMPARISTM试剂盒(Ambion,产品目录编号AM1556)遵循制造商的推荐方案提取总RNA。
mRNA阵列分析由Asuragen,Inc.(Austin,TX,USA)，依照公司的标准操作规程实施。使用MessageAmpTMII-96aRNA扩增试剂盒(Ambion,产品目录编号1819)，用生物素标记200ng的输入总RNA。使用Agilent2100Bioanalyzer毛细管电泳仪(Agilent Technologies，Inc.)量化cRNA产量。使用制造商的推荐和下列参数将经标记的靶物与Affymetrix mRNA阵列(人HG-U133A 2.0阵列)杂交。于45℃在Affymetrix 640型杂交炉中实施杂交达16小时。运行清洗脚本Midi_euk2v3_450，将阵列清洗，并在Affymetrix FS450流控技术(Fluidics)站上染色。在Affymetrix GeneChip Scanner 3000上扫描阵列。使用Affymetrix统计学算法MAS5.0(GCOS v1.3)产生阵列上每个基因的图像信号数据、群平均值、具有显著性标记的p值、对数比(log ratio)和基因注释的汇总。报告的数据含有Affymetrix数据和结果文件(cabinet文件)，并且含有阵列的初始图像和经加工的室强度(.eel)。
比较各个样品的mRNA阵列谱以测定其相似性。计算样品(完整探针集)间的Pearson积矩相关系数，并且显示于表15、16、和17中。观察到所有样品的相关系数大于0.9934。
表15：在用3nM指定miRNA模拟物转染肺癌细胞后在对基因表达的阵列分析后的Pearson积矩相关系数。表14中显示了过客(P)和活性(A)链的序列和2’-OMe修饰。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
P121/A130 P125/A130 P126/A130 P129/A130 P129/A133
1.000 0.9984 0.9987 0.9982 0.9968 P121/A130
1.000 0.9982 0.9979 0.9978 P125/A130
1.000 0.9986 0.9969 P126/A130
1.000 0.9969 P129/A130
1.000 P129/A133
表16：在用10nM指定miRNA模拟物转染肺癌细胞后在对基因表达的阵列分析后的Pearson积矩相关系数。表14中显示了过客(P)和活性(A)链的序列和2’-O Me修饰。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
P121/A130 P125/A130 P126/A130 P129/A130 P129/A133
1.000 0.9972 0.9980 0.9962 0.9968 P121/A130
1.000 0.9973 0.9952 0.9978 P125/A130
1.000 0.9968 0.9965 P126/A130
1.000 0.9934 P129/A130
1.000 P129/A133
表17：在用30nM指定miRNA模拟物转染肺癌细胞后在对基因表达的阵列分析后的Pearson积矩相关系数。表14中显示了过客(P)和活性(A)链的序列和2’-O Me修饰。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
P121/A130P125/A130 P126/A130 P129/A130 P129/A133
1.0000.9961 0.9963 0.9982 0.9955 P121/A130
1.000 0.9965 0.9962 0.9971 P125/A130
1.000 0.9973 0.9960 P126/A130
1.000 0.9956 P129/A130
1.000 P129/A133
将分析限于那些相对于阴性对照的表达水平受到最少两种mir-34c模拟物改变至少2倍的mRNA，用经2’-O Me修饰的mir-34c模拟物和未修饰的mir-34c模拟物转染的细胞间观察到强烈关联(表18)。这些数据揭示经修饰的mir-34c模拟物的靶物特异性与未修饰的mir-34c模拟物相同。
表18：用30、10、或3nM不含经修饰的核苷酸的mir-34c模拟物(P121/A130)和含有2’O-Me修饰的mir-34c模拟物(P125/A130、P126/A130、P129/A133、P129/A133)转染肺癌细胞后，对改变至少2倍的基因表达进行阵列分析后的Pearson积矩相关系数。表14中显示了过客(P)和活性(A)链的序列和2’-O Me修饰。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
Figure BDA0000389807070000991
在全局表达谱外，我们比较经2’O-Me修饰的和未修饰的mir-34c模拟物对预测的mir-34c靶基因的活性。阵列数据揭示了在与用阴性对照miRNA转染的细胞相比时，mir-34c的两种预测mRNA靶物NR4A2和SYT1的水平在经mir-34c处理的细胞群中显著降低(表19)。
表19：以浓度3、10、或30nM用指定的mir-34c模拟物转染H460细胞后的NR4A2或SYT1mRNA水平。数值代表与用阴性对照miRNA转染细胞后观察到的百分比表达(100％)相比的百分比表达。表14中显示了过客(P)和活性(A)链的序列和2’-O Me修饰。所有过客链都具有5’-氨基C6修饰。
Figure BDA0000389807070001001
参考文献
通过提及将以下参考文献明确并入本文，其程度使得它们对本文中所列的规程提供补充的例示性规程或其它详情。
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Claims (108)

1.一种长度为22或23个碱基对的双链平端RNA分子，其包含：
a)活性链，该活性链包含从5’至3’的SEQ ID NO:1，和
b)完全互补的过客链，该过客链包含：
i)所述过客链的前和后两个核苷酸中的经修饰的核苷酸；和
ii)在5’端的末端核苷酸修饰。
2.权利要求1的RNA分子，其中所述分子长度是23个碱基对，并且所述活性链包含SEQ ID NO:2。
3.权利要求1的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、22、和/或23处的经修饰的核苷酸，其中所述过客链中少于总数一半的核苷酸是经修饰的核苷酸。
4.权利要求1-3中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID NO:4位于位置i)1和2和/或ii)22和23处的经修饰的核苷酸。
5.权利要求2-3中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID NO:4位于位置i)1和2和ii)22和23处的经修饰的核苷酸。
6.权利要求1-5中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID NO:4位于位置i)3和4和/或ii)19和20处的经修饰的核苷酸。
7.权利要求6的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:4位于位置i)3和4或ii)19和20处，但不在位置i)和ii)两者处的经修饰的核苷酸。
8.权利要求4-7中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID NO:4在位置5和6处的经修饰的核苷酸。
9.权利要求4-7中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID NO:4在位置9和10处的经修饰的核苷酸。
10.权利要求4-7中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID NO:4在位置11和12处的经修饰的核苷酸。
11.权利要求4-7中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID NO:4在位置13和14处的经修饰的核苷酸。
12.权利要求4-7中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID NO:4在位置17和18处的经修饰的核苷酸。
13.权利要求4的RNA分子，其中所述过客链中经修饰的核苷酸的数目是4至8。
14.权利要求13的RNA分子，其中所述过客链中经修饰的核苷酸的数目是5至7。
15.权利要求14的RNA分子，其中所述过客链中经修饰的核苷酸的数目是6。
16.权利要求1-15中任一项的RNA分子，其中所述过客链没有相对于SEQ ID NO:4位于位置7、8、9、15、和16处的经修饰的核苷酸。
17.权利要求1-16中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、21、22、和23处的经修饰的核苷酸。
18.权利要求1-16中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、3、4、22、和23处的经修饰的核苷酸。
19.权利要求1-16中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、19、20、22、和23处的经修饰的核苷酸。
20.权利要求1-19中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含至少两个经修饰的核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸不在5’端的前两个位置中。
21.权利要求1-19中任一项的RNA分子，其中所述活性链在5’端的前两个位置中没有经修饰的核苷酸。
22.权利要求1的RNA分子，其中所述活性链在距离末端的前或后两个位置中不包含经修饰的核苷酸。
23.权利要求20-22中任一项的RNA分子，其中所述活性链具有相对于SEQ ID NO:2在位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、和/或18处的经修饰的核苷酸。
24.权利要求23的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:2在位置15和16处的经修饰的核苷酸。
25.权利要求23的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:2在位置3和4处的经修饰的核苷酸。
26.权利要求23的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:2在位置11和12处的经修饰的核苷酸。
27.权利要求23的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:2在位置11、12、13、和14处的经修饰的核苷酸。
28.权利要求23的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:2在位置17和18处的经修饰的核苷酸。
29.权利要求23-28中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:2在位置11、12、15、和16处的经修饰的核苷酸。
30.权利要求29的RNA分子，其中所述活性链进一步包含相对于SEQ IDNO:2在位置13、14、17、和18处的经修饰的核苷酸。
31.权利要求23-28中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:2在位置3、4、15、和16处的经修饰的核苷酸。
32.权利要求1-19中任一项的RNA分子，其中所述活性链没有任何经修饰的核苷酸。
33.权利要求29的RNA分子，其中除了5’端修饰外，所述过客链不包含任何经修饰的核苷酸。
34.权利要求29的RNA分子，其中所述过客链包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、20、21、22、和23处的经修饰的核苷酸。
35.权利要求29的RNA分子，其中所述过客链包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、3、4、22、和23处的经修饰的核苷酸。
36.权利要求29的RNA分子，其中所述过客链包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、19、20、22、和23处的经修饰的核苷酸。
37.权利要求30的RNA分子，其中除了5’端修饰外，所述过客链不包含任何经修饰的核苷酸。
38.权利要求30的RNA分子，其中所述过客链包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、20、21、22、和23处的经修饰的核苷酸。
39.权利要求30的RNA分子，其中所述过客链包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、3、4、22、和23处的经修饰的核苷酸。
40.权利要求30的RNA分子，其中所述过客链包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、19、20、22、和23处的经修饰的核苷酸。[A-ID206/P-ID 215]
41.权利要求31的RNA分子，其中除了5’端修饰外，所述过客链不包含任何经修饰的核苷酸。
42.权利要求31的RNA分子，其中所述过客链包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、21、22、和23处的经修饰的核苷酸。
43.权利要求31的RNA分子，其中所述过客链包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、3、4、22、和23处的经修饰的核苷酸。
44.权利要求31的RNA分子，其中所述过客链包含SEQ ID NO:4和相对于SEQ ID NO:4在位置1、2、19、20、22、和23处的经修饰的核苷酸。
45.权利要求1-44中任一项的RNA分子，其中所述过客链的末端修饰包含低级烷基胺基团。
46.权利要求1-45中任一项的RNA分子，其中所述经修饰的核苷酸具有糖修饰。
47.权利要求46的RNA分子，其中所述糖修饰是2’-OMe。
48.一种长度为20-23个碱基对的双链RNA分子，其中所述RNA分子在两端都是平端的，包含具有SEQ ID NO:2序列的活性链和在5’端具有经修饰的核苷酸的分开的且完全互补的过客链，其中所述活性链包含至少一个经修饰的内部核苷酸，且其中与缺乏任何内部核苷酸修饰的双链平端RNA分子相比，所述双链RNA分子更稳定。
49.一种药物组合物，其包含权利要求1-48中任一项的RNA分子。
50.一种用于对细胞提供miR-34a活性的方法，其包括对所述细胞施用权利要求1-48中任一项的RNA分子。
51.一种用于降低细胞增殖的方法，其包括对所述细胞施用有效量的权利要求1-48中任一项的RNA分子。
52.一种用于在细胞中诱导凋亡的方法，其包括对所述细胞施用有效量的权利要求1-48中任一项的RNA分子。
53.一种用于治疗患者中的癌症的方法，其包括对所述患者施用包含权利要求1-48中任一项的RNA分子的药物组合物。
54.权利要求54的方法，其进一步包括对所述患者施用别的癌症疗法。
55.权利要求53的方法，其中所述患者已经诊断为患有癌症。
56.一种长度为23或24个碱基对的双链平端RNA分子，其包含：
a)活性链，该活性链包含：
i)从5’至3’的SEQ ID NO:5，和
ii)至少一个经修饰的内部核苷酸；和
b)完全互补的过客链，该过客链包含5’端的末端核苷酸修饰。
57.权利要求56的RNA分子，其中所述分子的长度是23个碱基对。
58.权利要求56的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:6在位置1(G)、2(C)、3(A)、21(C)、22(C)、和/或23(U)处的经修饰的核苷酸。
59.权利要求56-58中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含位于子集位置处的经修饰的核苷酸，其中所述子集是相对于SEQ ID NO:6的i)1(A)、2(A)、和3(C)和/或ii)22(C)、和23(A)。
60.权利要求56-59中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:6位于位置i)1(A)、2(A)、和3(C)处的经修饰的核苷酸。
61.权利要求56-60中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:6位于位置ii)22(C)、和23(A)处的经修饰的核苷酸。
62.权利要求59的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:6位于位置1(A)、2(A)、3(C)、22(C)、和23(A)处的经修饰的核苷酸。
63.权利要求59的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:6位于位置i)或ii)处，但不在位置i)和ii)两者处的经修饰的核苷酸。
64.权利要求56-63中任一项的RNA分子，其中所述过客链进一步包含相对于SEQ ID NO:6位于位置4(A)、7(A)、8(G)、9(C)、10(U)、11(A)、12(A)、13(C)、14(U)、19(U)、和/或21(C)处的经修饰的核苷酸。
65.权利要求56的RNA分子，其中所述过客链没有相对于SEQ ID NO:6位于位置5(U)、6(C)、15(A)、和/或16(C)处的经修饰的核苷酸。
66.权利要求56的RNA分子，其中所述过客链中经修饰的核苷酸的数目是2至8。
67.权利要求66的RNA分子，其中所述过客链中经修饰的核苷酸的数目是3至5。
68.权利要求56的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:6在位置1(A)、2(A)、3(C)、17(A)、18(C)、21(C)、22(C)、和23(A)处的经修饰的核苷酸。
69.权利要求56的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:6在位置1(A)、2(A)、3(C)、11(A)、12(A)、13(C)、14(U)、21(C)、22(C)、和23(A)处的经修饰的核苷酸。
70.权利要求56的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQ ID NO:6在位置1(A)、2(A)、3(C)、11(A)、12(A)、13(C)、14(U)、17(A)、18(C)、21(C)、22(C)、和23(A)处的经修饰的核苷酸。
71.权利要求56-70中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含至少两个经修饰的核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸不在5’端的前两个位置中。
72.权利要求56-70中任一项的RNA分子，其中所述活性链在5’端的前两个位置中没有经修饰的核苷酸。
73.权利要求56的RNA分子，其中所述活性链在距离末端的前或后两个位置中不包含经修饰的核苷酸。
74.权利要求71-73中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:5在位置3(G)、4(C)、11(G)、12(U)、13(A)、14(G)、15(C)、16(C)、17(U)、和/或18(G)处的经修饰的核苷酸。
75.权利要求74的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:5在位置11(G)和12(U)处的经修饰的核苷酸。
76.权利要求74的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:5在位置17(U)和18(G)处的经修饰的核苷酸。
77.权利要求74的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:5在位置11(G)、12(U)、17(U)、和18(G)处的经修饰的核苷酸。
78.权利要求77的RNA分子，其中所述活性链进一步包含相对于SEQ IDNO:5在位置3(G)、4(C)、13(A)、14(G)、15(C)、和/或16(C)处的经修饰的核苷酸。
79.权利要求74-78中任一项的RNA分子，其中所述过客链不包含任何经修饰的核苷酸。
80.权利要求68的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:5在位置11(G)、12(U)、17(U)、和18(G)处的经修饰的核苷酸。
81.权利要求69的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:5在位置11(G)、12(U)、17(U)、和18(G)处的经修饰的核苷酸。
82.权利要求70的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQ ID NO:5在位置11(G)、12(U)、17(U)、和18(G)处的经修饰的核苷酸。
83.权利要求56-82中任一项的RNA分子，其中所述过客链的末端修饰包含低级烷基胺基团。
84.权利要求56-83中任一项的RNA分子，其中所述经修饰的核苷酸具有经修饰的糖。
85.权利要求84的RNA分子，其中所述糖修饰是2’-OMe。
86.一种长度为23或24个碱基对的双链平端RNA分子，其包含：
a)活性链，该活性链包含：
i)从5’至3’的SEQ ID NO:5，和
ii)至少一个经修饰的内部核苷酸；和
b)完全互补的过客链，其包含5’端的末端核苷酸修饰和相对于SEQ IDNO:6在位置1(G)、2(C)、3(A)、21(C)、22(C)和/或23(U)处的至少一个糖修饰。
87.一种长度为23或24个碱基对的双链平端RNA分子，其包含：
a)活性链，该活性链至少包含从5’至3’的SEQ ID NO:5的碱基1-23；和
b)完全互补的过客链，该过客链包含：
i)在5’端的末端核苷酸修饰；
ii)在前三个和后三个核苷酸中的糖修饰；和
iii)相对于SEQ ID NO:6在位置11(A)、12(A)、13(C)、14(U)、17(A)、和/或18(C)之一处或多处的核苷酸的糖修饰。
88.一种药物组合物，其包含权利要求56-87中任一项的RNA分子。
89.一种用于对细胞提供miR-34c活性的方法，其包括对所述细胞施用权利要求56-86中任一项的RNA分子。
90.一种用于降低细胞增殖的方法，其包括对所述细胞施用有效量的权利要求56-86中任一项的RNA分子。
91.一种用于在细胞中诱导凋亡的方法，其包括对所述细胞施用有效量的权利要求56-86中任一项的RNA分子。
92.一种用于治疗患者中的癌症的方法，其包括对所述患者施用包含权利要求56-86中任一项的RNA分子的药物组合物。
93.权利要求92的方法，其进一步包括对所述患者施用别的癌症疗法。
94.权利要求92的方法，其中所述患者已经诊断为患有癌症。
95.一种长度为22或23个碱基对的双链平端RNA分子，其包含：
a)活性链，该活性链包含：
i)从5’至3’的SEQ ID NO:7，和
ii)至少一个经修饰的内部核苷酸；和
b)完全互补的过客链，该过客链包含在5’端的末端核苷酸修饰。
96.权利要求95的RNA分子，其中所述分子的长度是23个碱基对。
97.权利要求95-96中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含所述活性链中在位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、和/或18处的经修饰的核苷酸。
98.权利要求95-97中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含至少两个经修饰的内部核苷酸。
99.权利要求98的RNA分子，其中所述活性链包含不超过11个经修饰的内部核苷酸。
100.权利要求95-99中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含至少一个经修饰的内部核苷酸。
101.权利要求100的RNA分子，其中所述过客链包含所述过客链中在位置1、2、3、4、9、10、11、12、13、14、19、21、和/或22处的经修饰的核苷酸。
102.权利要求95-101中任一项的RNA分子，其中所述过客链没有位置15和/或16处的经修饰的核苷酸。
103.权利要求95-102中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含SEQID NO:3。
104.权利要求103的RNA分子，其中所述过客链包含所述过客链中在位置1、2、3、5、6、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、和/或22处的经修饰的核苷酸。
105.权利要求95-102中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含SEQID NO:5。
106.权利要求105的RNA分子，其中所述过客链包含所述过客链中在位置1、2、3、4、7、8、9、10、11、12、13、14、19、21、22、和/或23处的经修饰的核苷酸。
107.权利要求95-106中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含SEQID NO:9的序列。
108.一种长度为22或23个碱基对的双链平端RNA分子，其包含：
a)活性链，该活性链包含：
i)从5’至3’的SEQ ID NO:9，和
ii)在位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、和/或18处的经修饰的核苷酸；
b)完全互补的过客链，其包含在5’端的末端核苷酸修饰。
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