KR101722861B1 - 마이크로알엔에이 193a를 포함하는 신경세포 분화 촉진용 조성물 및 방법 - Google Patents

마이크로알엔에이 193a를 포함하는 신경세포 분화 촉진용 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101722861B1
KR101722861B1 KR1020150188634A KR20150188634A KR101722861B1 KR 101722861 B1 KR101722861 B1 KR 101722861B1 KR 1020150188634 A KR1020150188634 A KR 1020150188634A KR 20150188634 A KR20150188634 A KR 20150188634A KR 101722861 B1 KR101722861 B1 KR 101722861B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mir
cells
neural
nucleic acid
composition
Prior art date
Application number
KR1020150188634A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170013799A (ko
Inventor
황도원
이동수
오현정
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Publication of KR20170013799A publication Critical patent/KR20170013799A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101722861B1 publication Critical patent/KR101722861B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/65—MicroRNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본원은 miR-193a 핵산분자를 포함하는 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 신경세포로의 분화 촉진용 조성물 및 방법을 개시한다. 본원에 따른 조성물 또는 이에 의해 분화된 신경세포는 신경세포의 손상으로 인한 다양한 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

마이크로알엔에이 193a를 포함하는 신경세포 분화 촉진용 조성물 및 방법 {Composition and method for enhancing differentiation of neuronal precursor cell comprising miRNA-193a}
본원은 마이크로알엔에이 (miR)를 이용한 신경세포로의 분화 촉진 및 그 용도와 관련된 것이다.
인간의 수명이 길어짐과 동시에 파킨슨 질환, 근위축성측삭경화증, 다발경화증, 헌팅톤 질환, 알츠하이머, 당뇨망막변증, 다발성경색치매, 원반황반변성 등을 포함하는 신경변성 질환의 발생율도 높아지고 있다. 현재 신경변성 질환 환자는 전세계적으로 2천4백만명인 것으로 추정된다. 또한 다른 형태의 신경변성 질환인 뇌졸중 또는 기타 외상 또는 손상에 의해 야기되는 질환은 해마다 증가추세에 있다.
대한민국에서 2003년 말 기준으로 치매, 뇌졸중 등 뇌질환으로 요양이나 부양자의 보호를 받아야 하는 국내 65세 이상 노인은 62만 명에 달해 여기에 소요되는 치료비 등 관리 비용만도 연간 3조 4,000억 원 수준에 이르고 있고, 산술적으로 노인 인구의 비율은 2015년에는 87만 명, 2030년에는 164만 명에 달하게 되고, 이들에 대한 관리 비용 역시 2015년 4조 8천억 원을 넘어 2030년에는 약 9조에 달할 것으로 예상되나 현재까지 근본적인 치료제는 없는 것이 현실이다.
신경퇴행성질환의 근본적 치료는 질병의 원인을 제거하여 환자의 기능을 정상으로 회복시키거나, 초기에 진단하고 치료하여 더 이상의 진행의 억제하는 것을 들 수 있다. 다른 한 가지 방법은 손상된 신경세포의 기능을 일부라도 회복시킬 수 있는 것으로, 근본적 치료제가 부재한 상황에서 신경줄기세포를 이용한 세포치료는 다양한 신경퇴행성 질환 치료에 대안을 제시할 수 있다.
미국특허 제6686198호는 신경세포 유도 및 유지 방법에 관한 것으로, 액티빈 수용체를 갖는 세포를 액티빈으로 활성화하여 분화를 유도하는 방법을 개시하고 있다.
미국특허 제7,368,115호는 신경줄기세포 증식, 분화 및 생존 향상 방법에 관한 것으로, 아데닐레이트 사이클라제 활성 폴리펩타이드를 이용하여 신경줄기세포의 증식 및 분화를 촉진하는 방법을 개시하고 있다.
새로운 기전에 근거한 방식의 신경세포 분화 촉진 기술의 개발이 필요하다.
본원은 분자 생물학적 기전에 근거한 신경세포 분화 촉진 조성물 및 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 miRNA-193a 핵산분자 유래의 5'-ACUGGCC-3' 서열을 포함하는 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 신경세포로의 분화 촉진용 조성물 또는 키트를 제공한다.
일 구현예에서 상기 핵산분자는 길이 7 내지 25mer로, 예를 들면 상기 miR-193a 핵산분자는 5’AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU 3‘이나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 신경세포는 뉴론, 아스트로사이트 또는 올리고덴드로사이트를 포함한다.
일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 콜레시스토키닌 A 수용체(cholecystokinin A receptor (CCKAR)), 시스테닐 류코트리엔 수용체 1(CYSLTR1), 및 갈라닌 수용체 1(GALR1) 유전자의 3’-UTR에의 결합을 통한 것이다.
다른 양태에서 본원은 상술한 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 신경변성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본원에 따른 조성물이 신경변성 질환의 예방 또는 치료용으로 사용되는 경우, 본원에 따른 조성물은 신경세포가 손상된 부위로 투여 또는 뇌혈관 주사에 의한 투여, 비강내 투여, 정맥내 투여, 피하 주사, 경구 투여, 뇌척수강내 주사, 또는 흡입투여될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 miR-193a를 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 처리하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 신경세포로의 분화 방법을 제공한다.
본원에 따른 방법에서 miR-193a 핵산분자 또는 조성물은 신경줄기세포 또는 신경전구세포내의 콜레시스토키닌 A 수용체(cholecystokinin A receptor (CCKAR)), 시스테닐 류코트리엔 수용체 1(CYSLTR1), 및/또는 갈라닌 수용체 1(GALR1) 유전자의 3’-UTR에의 결합을 통해, 분화를 촉진한다.
본원에 따른 miR-193a 핵산분자를 포함하는 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 신경세포로의 분화 촉진용 조성물 및 이에 의해 분화된 신경세포는 신경세포의 손상으로 인한 다양한 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따라, 뉴로게닌1-유도 F11 신경 전구세포에서 증가된 마이크로알엔에이 (miR)의 선택을 나타낸 것이다. (a) miRNA 마이크로어레이를 사용한 F11-Mock 및 F11-Ngn1의 miRNA 발현 프로파일링을 나타낸다. Mock 대 Ngn1-어레이-1(M1, N1), Mock 대 Ngn1 어레이-2 (M2, N2). (b) F11-Mock 및 F11-Ngn1 세포에서 발현되는 miRNA의 정규화 신호 강도에 대한 산점도(scatter plot)를 나타낸 것이다(P<0.05). (c) F11-Ngn1 세포에서 상향조절된 상위 20개의 miRNA를 나타낸 것이다. (d) Ngn1에 의해 상향-조절되고 세포 주기 및 신경활성을 조절하는 후보 miRNA를 요약하여 나타낸 파이 그래프(Pie chart)이다. (e) 유전자 온톨로지(Gene ontology (GO))를 파이 그래프로 나타낸 것이다. (f) qRT-PCR로 측정한, Mock 또는 Ngn1으로 처리한 F11 세포에서 miR-193a의 발현을 나타낸 것이다. 데이터는 세 개의 실험의 대표값이다. 각 바는 평균 ± s.d.로 플롯하였다. *P<0.05.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 miR-193a의 신규한 신경생성 기능을 나타낸 것이다. (a) miR-scr 또는 miR-193-유도 F11 세포의 위상차 이미지(Phase contrast images)를 나타낸 것이다. 스케일 바, 10㎛. (b) miR-scr 또는 miR-193a 처리 3일 후 F11 세포에서 추출한 총 RNA에 대해 수행한 qRT-PCR에서, MAP2를 포함하는 몇몇 뉴런-특이성 마커의 발현을 나타낸 것이다. *P<0.05, *P<0.005. (c) F11-miR-scr 및 F11-miR-193a 세포에서의 면역형광 염색을 나타낸 것이다. 핵은 DAPI(파란색)로 대비염색하였다. 스케일 바, 20㎛. (d) miR-193a의 기능적 작용을 탐지하기 위하여, HeLa 세포를 일시적으로 miR-scr 또는 miR-193a 및 pRV/effLuc/3xPT_miR-193a로 공동-감염시켜 얻은 루시퍼라아제 시그널을 나타낸 것이다. 얻은 수치는 평균 루시퍼라아제 활성 비율 ± sd로 나타내었다. (e) F11 세포에서 1mM db-cAMP 처리 3일 후의 루시퍼라아제 어세이 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 세 개의 독립된 각 실험의 대표값이다. *P<0.005. (f) DAVID v6.7에서 KEGG_경로로 분석한, miR-193a의 타겟 유전자에 대한 시그널 경로 분류를 나타낸 것이다. (g) miR-scr 또는 miR-193a 처리 3일 후, F11 세포에서 추출한 총 RNA에 대해 qRT-PCR을 수행하였다. 데이터는 세 개의 각 실험의 대표값으로 평균 ±s.d로 나타내었다. **P<0.005. (h) miR-193a 타겟인 PLAU, KRAS, CCKAR, CYSLTR1 및 GALR1에 대한 발현에 대한 웨스턴 블랏 분석. 세개의 생물학적으로 독립된 실험의 대표적 데이터를 나타내었다. *P<0.05. (i)는 본원의 일 실시예에 따른 miR-193a의 발현을 확인한 것으로, Ngn1 처리 24시간 후 F11세포에서 내인성 miRNA-193 발현을 탐지하기 위하여, pRV/effluc/3xPT_miR-193a 컨스트럭트를 사용한 루시퍼라아제 리포터 어세이를 수행하였다. *P<0.05.
도 3은 신경 줄기세포 NE-4C 신경 줄기세포 (ATCC? CRL-2925)를 retinoic acid (RA; Sigma Aldrich) 를 처리하여 신경세포로 분화 유도한 뒤 세포 내에서 발현하는 miR-193a (좌) 와 신경세포 분화 후 분비하는 엑소좀 내의 miR-193a의 발현 (우) 을 정량 RT-PCR 로 분석한 결과이다.
본 발명은, 신규한 마이크로알엔에이 (miR)-193a가 타겟 유전자를 하향-조절함으로써 신경 분화를 관리하며 신경 전구세포의 신경세포로의 분화를 촉진한다는 발견에 근거한 것이다.
한 양태에서 본원은 miR-193a 핵산분자를 포함하는 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 신경세포로의 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "miR" 또는 "마이크로 RNA" 또는 “마이크로알엔에이”는 표적 RNA의 분해(degradation)을 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본원에 포함되는 miR-193a 핵산분자의 전구 서열 및 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다. 2012년 8월 현재 miRNA 데이터베이스 (19판, miRBase)에 의하면 193개 종에서 유래한 25,141개의 성숙 miRNA가 등록되어 있다. 일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 마이크로 RNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단과정을 거쳐 최종 성숙 miRNA가 형성된다.
본원의 miR-193a의 서열은 포유류 유래의 서열이며, 예를 들면 인간 또는 마우스 유래의 서열을 포함한다. 일 구현예에서는 인간 유래이다.
본원의 miR-193a 핵산 분자는 일차 miR-193a, pre-miR-193a, 및 성숙 miR-193a, miR-193a-5p, miR-193a-3p를 포함하는 것이다. 또한 본원의 miR-193a는 그 변이체 및 단편을 포함하는 것으로 상기 변이체 및 그 단편은 실질적으로 본원에 따른 miR-193a의 생물학적 효과를 나타낸다. 이러한 miR-193a 핵산 분자 서열은 일차서열 (stemp loop) 5'-GAGAGCUGGGUCUUUGCGGGCAAGAUGAGAGUGUCAGUUCAACUGGCCUACAAAGUCCCAGUCCUC-3‘, 전구서열 5’-UGGGUCUUUGCGGGCAAGAUGAGAGUGUCAGUUCAACUGGCCUACAAAGUCCCAGU-3‘ 및 성숙서열 5’-AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU-3‘를 포함한다.
본원에 사용되는 miR-193a, 그 작용체 (agonist), 또는 그 모방체 (mimic)가 사용될 수 있다. 이들은 성숙 miR-193a, 또는 일차 (primary) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 일 수 있으며, 폴리뉴클레오타이드는 RNA, DNA, 또는 RNA 및 DNA의 하이브리드일 수 있다. 또한 폴리뉴클레오타이드는 단일 또는 이중가닥일 수 있다. miR-193a의 서열은 공지된 것으로 예를 들면 MI0000487, MIMAT0004614, MIMAT0000459, MI0000235, MIMAT0004544 및 MIMAT0000223 등으로 miRBASE에 공지되어 있다.
본원에 따른 핵산분자는 본원에 따른 마이크로알엔에이의 씨드서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 씨드 서열은 miRNA의 표적분자의 인지에 매우 중요한 다양한 종에서 보존된 서열이다(Krenz, M. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 44:2390-2397(2004); H. Kiriazis, et al., Annu. Rev. Physiol.62:321(2000)). miRNA는 씨드서열을 통해 표적과 결합하기 때문에, 씨드서열을 포함하는 한 표적 mRNA의 번역 등을 효과적으로 억제할 수 있다.
일 구현예에서는 본원의 miR-193a는 씨드서열인 5‘- ACUGGCC -3’ 서열을 포함하는 7 내지 25 mer의 핵산 분자이다. 핵산 분자는 예를 들면 RNA, DNA, 앤타고미어, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예에서 miR-193a는 5‘ AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU 3’로 표시된다.
일 구현예에서 본원의 miR-193a 변이체는 또한 대상체 또는 세포에서의 분해를 막기 위해 변형된 것을 포함한다. LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), 2‘-O-알킬 (예를 들면 2’-O -메틸, 2‘-O-메톡시에틸), 2’-플루오로, 및 4‘-티오 변형과 같은 화학적 변형, 포스포로티오에이트, 모르폴리노 또는 포스포노카르복실레이트 연결과 같은 골격의 변형을 갖는 것일 수 있다.
LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2' 내지 4' 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다.
PNA(peptide nucleic acids)는 폴리뉴클레오타이드에서 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2'-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2'-O-C1-3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드이다.
본원에서 신경줄기세포는 미분화된 상태로 계속 증식하는 자가갱신 (self-renew) 특성이 있으며, 다양한 뉴론 및 교세포 (glia)로 분화하는 다능성을 나타내는 세포를 의미한다.
본원에서 신경 전구세포 (progenitor cell)는 줄기세포의 자손세포로서, 미분화된 상태이나 줄기세포와 달리 제한적 증식능을 가지며, 일정 조건하에서 특정 경로로의 분화가 결정되는 세포이다. 신경 전구세포는 뉴론으로 분화되고, 글리알 전구세포는 아스트로사이트 또는 올리고덴드로사이트로 분화된다.
본원의 miR-193a는 신경활성 리간드-수용체 상호작용(6개 유전자), 세포 주기(4개 유전자), 칼슘 시그널링(4개 유전자), 아르기닌 및 프롤린 대사(3개 유전자), 질소 대사(2개 유전자), 소포 수송에서의 SNARE 상호작용(2개 유전자), 및 RNA 분해(2개 유전자)의 경로와 연관된 것으로 나타났다. 특히 콜레시스토키닌 A 수용체(cholecystokinin A receptor (CCKAR)), 시스테닐 류코트리엔 수용체 1(CYSLTR1), 및 갈라닌 수용체 1(GALR1) 유전자의 3’-UTR에의 결합을 통해 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 신경세포로의 분화를 촉진하는 것을 발견하였다.
따라서 본원에 따른 조성물은 신경세포로의 분화를 촉진하여 신경세포의 결실로 인한 질환 예를 들면 급성, 아급성 또는 만성 신경변성 질환을 포함하는 신경변성 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
본원에서“급성 신경변성 질환"은 이로 제한하는 것은 아니나 뇌혈류 부족, 국소적 뇌외상, 뇌손상 및 척수 손상을 포함하는 신경세포의 사멸 또는 손상과 관련된 다양한 유형의 질환을 포함하는 것으로 예를 들면, 색전 폐색 및 혈전 폐색, 급성 허혈, 주산기 저산소-허혈 손상, 심장정지 및 임의의 유형의 두개내 출혈 (예를 들면 경막외, 경막하, 거미막하 및 뇌내 포함) 후의 재관류 및 두개내 및 척추내 병변 (예를 들면, 타박상, 관통상, 압박 및 열상 포함)에 의한 대뇌허혈 또는 뇌경색증을 포함한다. 일 구현예에서 급성 신경변성 질병은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 두부손상 또는 척수손상의 결과이다.
본원에서“아급성 신경변성 질환"은 수일 내지는 수주에 걸쳐서 발생하는 신경계 기능 손상 질환을 의미하며, 이로 제한하는 것은 아니나, 다발성 경화증과 같은 탈수초성 질환, 신경계 부종양증후군, 아급성 연합 변성 (subacute combined degeneration), 아급성 괴사성 뇌염 (subacute necrotizing encephalitis), 아급성 경화성 범뇌염 (subacute sclerosing encephalitis)을 포함한다.
본원에서 "만성 신경변성 질병"은 이로 제한하는 것은 아니나, 노인성 치매, 혈관 치매, 미만성 (diffuse) 백질 질환 (빈스완거 질환), 내분비 또는 대사 기원 치매, 두부외상 및 미만성 뇌손상으로 인한 치매, 권투선수치매 및 전두엽 치매를 포함하는 기억상실증, 알츠하이머 질환, 픽 질환, 미만성 루이소체 질환, 진행성 핵상 마비 (스틸-리차드슨 증후군), 다계통 위축증 (multiple system degeneration) (샤이-드래거 증후군), 신경변성과 관련된 만성 간질 상태, 근위축성측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 조화운동불능, 피질 기저 변성, ALS-파킨슨-치매 복합증 (ALS-Parkinson's-Dementia complex of Guam), 아급성 경화 범뇌염, 헌팅톤 질환, 파킨슨 질환, 시뉴클레이노패씨 (synucleinopathies), 일차 진행성 실어증 (primary progressive aphasia), 선조흑질 변성, 마카도-조셉 질환/척수소뇌성 실조증, 올리브교 변성을 포함하는 운동 신경세포 질환, 질 드 라 뚜렛 질환, 연수 및 거짓연수 마비, 척수 및 척수연수 근육 위축 (케네디 질환), 다발경화증, 원발 측삭 경화증, 유전성 연축성 대마비, 베르드니히-호프만 질환, 쿠겔베르그-웰란더 질환, 테이-삭스 질환, 샌드호프 질환, 유전성 강직성 질환, 올파르트-쿠겔베르그-웰란더 (Wohlfart-Kugelberg-Welander) 질환, 강직성 하반신마비, 진행성다초점백질뇌증, 유전성 자율신경 실조증 (릴리-데이 증후군), 크로이츠펠트-야콥, 게르스트만-스트라우슬러-샤인커 질환, 쿠루병 및 치명적 유전성 불면증을 포함하는 프리온 질환, 또는 뇌성마비를 포함한다. 일 구현예에서 만성 신경변성 질환은 알츠하이머 질환, 헌팅톤 질환, 파킨슨 질환, 다발경화증 또는 뇌성마비를 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 뇌출혈 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료에 사용된다.
본원에 사용된 용어 "치료" , "완화" 또는 "개선" 이란 본 조성물의 투여로 관련 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본원에 사용된 용어 "예방"은 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원의 조성물은 초기 증상, 또는 나타나기 전에 투여할 경우 관련 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본원에 따른 miR-193a는 그 자체로 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 조성물에 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염이란, 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 활성은 유지하면서, 바람직하지 않은 독성은 최소화된 것이다. 이러한 염은 예를 들면 아연, 칼슘, 비스무스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 코퍼, 코발트, 니켈, 카드뮴, 소디움, 포타슘 등과 같은 금속 양이온과 형성된 염기 부가염 및 유기 아미노산과 형성된 염, 또는 암모니아, N,N-디벤질에틸렌디아민 (dibenzylethylene-diamine), D-클루코사민 (glucosamine), 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium), 또는 에틸렌디아민(ethylenediamine) 유래의 양이온과 형성된 염을 포함할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 유효성분은 뉴클레오타이드의 특성상 음으로 하전되어 있다. 세포막은 친지질성 성질로 인해, 폴리뉴클레오타이드의 세포막으로의 흡수가 감소될 수 있다. 이러한 극성으로 인한 흡수 방해는 하기에 기재된 전구약물 접근방식을 통해 해결될 수 있다 (Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140).
본원에 따른 조성물은 또한 인비트로에서 신경줄기세포 또는 신경 전구세포를 뉴론 세포, 글리알 전구세포, 아스트로사이트 또는 올리고덴드로사이트로의 분화를 촉진할 수 있고, 일 구현예에서 이러한 세포 배양물은 대상체에 이식되어 상술한 질환의 치료에 사용될 수 있다. 이식하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들면 미국특허 6,294,346에 기재된 것을 참조할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 세포 배양물은 분석 키트나 연구 도구로서 사용될 수 있다. 이러한 측면에서 본원은 miR-193a를 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 처리하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 miR-193a는 핵산 합성기를 이용하여 올리고뉴클레오타이드로 합성되거나, 또는 프로모터 하에서 miR-193a를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 플라스미드 또는 벡터의 일부로 구축되어 인비보 또는 인비트로에서 전사될 수 있도록 하여 사용될 수 있다. 후자의 경우, 프로모터 하에서 miR-193a를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 플라스미드 자체를 사용할 수도 있으며, 또는 이로부터 전사된 miR-193a를 분리하여 사용할 수도 있다.
발현 벡터는 크로모좀에 편입되는 것 또는 세포질내에 존재하는 벡터를 모두 포함하는 것으로, 예를 들면 박테리아, 박테리오파아지, 이스트, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스와 같은 바이러스 유래의 벡터를 포함한다.
본원에 따른 miR-193a 또는 이를 발현하는 벡터 또는 플라스미드는 칼슘포스페이트법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 지질 매개된 리포좀 전달법, 바이러스를 이용한 감염 또는 전달 (transduction), 전기천공, 또는 전달이입, 또는 마이크로주입과 같은 방법을 통해 목적하는 세포, 조직 또는 장기로 전달될 수 있다.
본원 조성물은 약학조성물로 제공될 수 있으며, 본원의 miR-193a 이외의 질환 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 선택적으로, 화학치료제, 항염증제, 항바이러스제 및/또는 면역조절제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본원의 조성물은 적절한 경로를 통해 중추신경 또는 말초신경으로 도입하는 것이 바람직하다. 적절한 경로는 뇌실내 (intraventricular) 또는 수막내 (intrathecal) 투여를 포함한다. 이러한 투여는 저장고에 연결된 카테터를 이용하여 달성될 수 있다. 또한 에어로졸로 제형화되어 흡입기 또는 분무기를 통해 폐를 통한 투여가 사용될 수 있다. 본원에 따른 효과가 발생되는 한, 정맥내 투여, 피하 주사, 뇌척수강내 주사, 흡입투여, 또는 경구 투여용 제형을 제외하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서는 비강 투여된다. 비강투여시, 후각신경경로를 따라 뇌로 전달됨에 따라 본원 조성물의 효과를 높일 수 있다. 비강은 비중격에 의해 좌우로 구분되는 콧 속의 공간을 지칭하며, 비강내 투여는 본원의 조성물을 비강 상피의 어느 조직으로 전달하는 것을 말한다. 본원의 조성물의 비강내 투여를 위해 비강용으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있는데, 상기 담체는 포유동물, 바람직하게는 인간의 비강 상피의 어느 부분에 투여하기에 적당한 한 종 이상의 적절한 고상 또는 필러 희석제 또는 캡슐화 물질을 말한다. 대표적으로, 상기 담체는 액체, 용액, 현탁액, 겔, 연고, 로션, 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게, 상기 담체는 약학적으로 허용가능한 수성 담체이다. 본 발명의 조성물은 여러 가지 단위 투여 형태로 제조될 수 있다. 이러한 형태로는 점비액(nasal drop), 비강용 스프레이, 비강용 겔, 비강용 연고, 및 비강용 분말이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 담체에는 전달 강화제를 포함할 수 있는데, 비강내 전달 강화제에는, 응집 저해제, 투여량 변경제, pH 제어제, 분해 효소 저해제, 점액질 용해 또는 점액 제거제, 섬모안정 시약들, 막투과 촉진제(예를 들면, 계면 활성제, 담즙산염, 인지질 또는 지방산 첨가제, 혼합 미셀(micelle), 리포솜, 또는 담체, 알콜, 에나민(enamine), 산화질소 공여체 혼합물, 긴 사슬(long-chain) 양친매성 분자, 소형 소수성 침투 강화제, 나트륨 또는 살리실산 유도체, 아세토아세트산의 글리세롤 에스테르, 시클로덱스트린 또는 베타-시클로덱스트린 유도체, 중간 사슬 지방산, 킬레이트 시약, 아미노산 또는 그의 염, N-아세틸아미노산 또는 그의 염, 선택된 막 성분에 대한 분해 효소, 지방산 합성 저해제, 콜레스테롤 합성 저해제 또는 산화질소 자극 물질, 키토산, 그리고 키토산 유도체와 같은 상피 접합 생리학의 조절 약제, 혈관 확장제, 선택적 운반 촉진제 그리고 비내 점막 전달을 강화하기 위해, 본원의 조성물이 효과적으로 조합되고, 결합되고, 보관되고, 캡슐화 되거나 활성 약제를 안정시킬 수 있게 해주는, 안정적 운송체, 담체, 지지 물질 또는 착물 생성종(complex-forming species) 등이 포함될 수 있다.
본원에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적 또는 치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 폴리뉴클레오타이드의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC50을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발 방지를 위해 조성물이 투여될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 상술한 바와 같은 본원에 따른 miR-193a 핵산분자를 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 처리하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 신경세포로의 분화 방법에 관한 것이다. 본원에 따른 방법에서 miR-193a 핵산분자 또는 조성물은 신경줄기세포 또는 신경전구세포내의 콜레시스토키닌 A 수용체(cholecystokinin A receptor (CCKAR)), 시스테닐 류코트리엔 수용체 1(CYSLTR1), 및/또는 갈라닌 수용체 1(GALR1) 유전자의 3’-UTR에의 결합을 통해, 분화를 촉진한다.
본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 miR-193a 핵산분자는 씨드서열을 포함하는 서열, 성숙 서열은 물론, 세포내에서 성숙서열로 될 수 있는 스템루프 구조의 miRNA 및 전구miRNA를 포함하는 것이다. 다른 구현예에서 핵산 분자는 세포 내에서의 반감기 조절 등을 위해 변형된 것일 수 있으며, 이에 대하여는 앞서 언급한 바를 참고할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실 시 예
실시예 1. Ngn1 -과발현된 F11 세포에서 뉴런 분화와 연관된 miR -193a 규명
뉴로게닌1-유도된 F11 신경 전구세포에서 증가된 마이크로RNA를 분석하였다. miRNA 마이크로어레이 (Axon Instruments)를 사용하여 F11-Mock 및 F11-Ngn1의 miRNA 발현 프로파일링을 수행하였다.
종전 연구에서 본 발명자는, 생체 내(in vivo)에서 뉴로게닌 1에 의해 활성화되는 뉴런 전구 세포의 뉴런 분화의 발달을 가시화함으로써 신경조직발달(neurogenesis)를 촉진시키는 데에는 뉴로게닌 1(neurogenin1 (Ngn1)) 전사 인자 단독으로도 충분하다는 것을 입증하였다. 이러한 사실에 기초하여, 본 발명자는 Ngn1-유도 신경조직발달에 의해 활성화되는 주요 마이크로RNA 조절자를 동정하는데에 촛점을 두었다. Ngn1으로 처리한 F11 세포 (서울대 치과대학 오석배 교수님)에서 신경조직발달성 miRNA를 확인하기 위하여, Ngn1 (pNeuroD-Fluc, 아주대 서해영 교수님)으로 24시간동안 처리한 F11 세포를 마이크로어레이분석을 하여 miRNA 발현 프로파일을 조사하였다. Mock- 및 Ngn1-감염된 F11 세포 사이의 배수 변화 및 절대적 시그널 수치에 근거하여, 상기 어레이 칩 상에 있는 1090 종류 miRNA 중에서, 2배 변화(Ngn1/Mock) 및 절대적 시그널 수치(각 수치 > 5)보다 더 큰 것으로 나타나는 240 종류 miRNA를 선택하여 신경 생성 마이크로RNA인 것으로 선별하였다. 신경분화를 거치는 동안 가장 높은 변수를 보여주는 17개의 miRNA를 히트맵에 나타났다(도 1a). 상기 히트맵에 상향-조절된 유전자(적색) 및 하향-조절된 유전자(녹색)를 나타내었다. F11-Mock 및 F11-Ngn1 세포에서 발현되는 miRNA의 정규화 신호 강도에 대한 산점도(scatter plot) 분석을 하였다(도 1b). 1.5배 이상 차이를 나타내는 208개의 상향조절 또는 32개의 하향 조절 마이크로RNA를 분석하였다(P<0.05). 상기 산점도에서, 중앙선 위에 확인된 miRNA는 상향조절된 miRNA이며 중앙선 아래는 하향조절된 것이다. 신경발생 miRNA의 후보자는 산점도 상에서 선택하였으며(파란색 점), F11-Mock 세포와 비교하여 F11-Ngn1 세포에서 2배 발현보다 더 많은 것으로 나타난 상향-조절된 miRNA 상위 20개를 하기 표 1에 기재하였다. 이러한 데이터는, 특이적 miRNA 집단이 뉴런 분화의 초기 과정에서 선택적으로 발현된다는 것을 나타낸다. 도 1c에 F11-Ngn1 세포에서 상당히 변화(2-배 변화 및 절대적 형광 시그널 수치 > 5)한 것을 근거로 하여 상향조절된 상위 20개의 miRNA를 기재하였다. 이 중에서, F11 세포에서 Ngn1에 의해 유도되는 뉴런 분화에 반응하여 높은 배수 변화와 절대적 시그널 수치를 만족시키는 miR-193a에 본 발명자는 촛점을 두었다. miR-193a의 타겟 유전자가 세포 주기 및 뉴런 활성과 연관되어 있기 때문에 miR-193a를 선택하였다. miR-193a의 발현은 Ngn1-유도 F11세포에서 5배 증가를 나타낸 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)로 입증하였다. qRT-PCR로 측정된 miR-193a의 상대적 발현은 마이크로어레이 결과와 일치하는 것으로 나타났다.
[표 1]
Figure 112015128316191-pat00001
본 발명의 실험에 사용된, miR-193a의 뉴런-특이적 유전자 및 타겟 유전자에 대한 qRT-PCR 프라이머 서열 리스트는 하기 표2에 나타나 있다.
[표 2]
Figure 112015128316191-pat00002
도 1d에 파이 그래프(Pie chart)는 Ngn1에 의해 상향-조절되고 세포 주기 및 신경활성을 조절하는 후보 miRNA를 요약하여 나타내었다.
miR-193a의 기능을 연구하기 위하여, F11-Ngn1 세포에서 뉴런 분화후의 miR-193a의 타겟 유전자 발현 프로파일을 조사하였다. miR-193a 타겟의 통합예측은 세 가지의 전통적 방법을 사용하여 수행하였다:TargetScan, microRNA.org 및 마이크로코즘(TargetScan, microRNA.org and microcosm). 유전자 온톨로지(Gene ontology (GO))를 파이 그래프로 나타내었는데, 이는 DAVID v6.7로 분석한 miR-193a의 타겟 유전자의 다양한 생물학적 기능을 나타낸다. 상기 유전자 온톨로지 분석에서, miR-193a 타겟은 세포내 시그널링 캐스캐이드, 특히 세포 증식 조절(15%), 배아 발달(12%) 및 세포 단백질(10%) 및 마크로분자(9%) 로컬화와 밀접하게 연관되어 있다(29%)(도 1f). 이러한 결과는 miR-193a가 다양한 생물학적 진행과 연관된 타겟 유전자를 조절함으로써 뉴런 분화 과정에 영향을 미칠 수 있다는 것을 말한다.
실시예 2. miR -193a의 과발현에 의한 뉴런 분화 증가
뉴런 분화에 대한 miR-193a의 영향을 입증하기 위하여, F11 세포를 50 nM miR-scr(Ambion?, Thermo Fischer Scientific, USA) 또는 miR-193a (Ambion?, Thermo Fischer Scientific, USA)로 감염시키고 나서 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 3일간 배양하여 세포분화를 유도하였다. miR-scr로 처리하였을 때, 정상 F11 세포 형태는 유지되었고 대부분의 F11 세포는 증식을 하였다. 그러나, miR-193a로 감염된 F11 세포는 감염 후 3일째에 상당한 신경돌기 신장(neurite outgrowth) 패턴이 나타났다(도 2a). miR-scr 또는 miR-193a 처리 3일 후 F11 세포에서 추출한 총 RNA에 대하여 qRT-PCR를 수행하여 F11 세포에서 초기 뉴런 마커 Tuj-1, 후기 뉴런 유전자 NeuroD, 및 MAP2 및 시냅스 마커 PSD-95, 및 GAP43와 같은 뉴런-특이성 유전자 발현을 측정하였다. 본 발명자는 시냅스 마커 PSD-95, GAP43의 발현이 아닌 Tuj-1, NeuroD 및 MAP2의 발현이, miR-193a로 처리한 F11 세포에서 상당히 증가하였다는 것을 발견하였다(도 2b). 또한 F11-miR-scr 및 F11-miR-193a 세포에서 miR-193a-유도 신경 분화를 조사하기 위한 면역형광 염색을 수행하였다. 핵은 DAPI(파란색)로 대비 염색하였다. miR-scr로 처리한 F11 세포의 세포질과 비교하여 miR-193a로 감염된 F11 세포의 세포질에서 Tuj-1 (녹색), MAP2 (녹색), NeuroD (녹색), GAP43 (녹색) 및 PDS-95 (녹색)이 높게 발현되는 것으로 나타났다(도 2c).
miR-193a의 내인성 또는 외인성 발현을 탐지하기 위하여, miR-193a에 대한 상보적 결합 서열의 세 개 카피를 함유하도록 effLuc(enhanced firefly luciferase) 리포터 유전자 벡터를 유전자 조작하였다(pRV/effLuc/3xPT_miR-193a로 표기함). 리포터 시스템의 특이성을 연구하기 위하여, HeLa 세포(비-뉴런 세포)를 다양한 농도(0, 5, 10, 20, 40 nM)의 miR-scr 또는 miR-193a 올리고머로 일시적으로 감염시켰다. miR-193a로 처리한 HeLa 세포의 effLuc 활성(루시퍼라아제 시그널)은 용량-의존적으로 감소한 것으로 나타났지만, miR-scr로 처리한 것은 그렇지 않았다(도 2d). F11-Ngn1 세포에서 miR-193a의 내인성 발현을 탐지하기 위하여, F11 세포는 pRV/effLuc/3xPT_miR-193a로 영구적으로 발현시키고 나서 F11 세포/effLuc/3xPT_miR-193a 세포를 Mock 또는 Ngn1로 처리하였다. Ngn1으로 처리한 F11 세포는 F11-Mock 세포 그룹보다 루시퍼라아제 활성이 상당히 더 낮게 나타났다(도 3). F11 세포에서 1mM 디부티릴 사이클릭 AMP(db-cAMP) 처리 3일 후에 신경 분화로서 miR-193a 발현을 입증하기 위하여 루시퍼라아제 어세이를 수행하였다. 1 mM 디부티릴 사이클릭 AMP(db-cAMP)로 처리한 F11 cell/effLuc/3xPT_miR-193a 세포 또한 미분화된 F11 세포(UD-F11 cells)에서보다 분화된 F11 세포(D-F11 cells)에서 루세퍼라아제 활성이 감소된 것으로 나타났다(도 2e).
이러한 결과는, miR-193a가 Ngn1 또는 db-cAMP에 의한 뉴런 분화 후에 높이 발현되며, miR-193a가 신경발생을 조절하는 것을 나타낸다.
신경 전구세포에서 뉴런분화에 대한 miR-193a의 관련성(relevance)을 조사하기 위하여, 본 발명자는 KEGG(KYOTO Encyclopedia of Genes and Genome analysis (GeneSifter software))에 근거하여 기능적 분류를 하였다. 이런 분석을 통해, 상당한 영향을 미치는 대부분의 경로는 신경활성 리간드-수용체 상호작용(6개 유전자), 세포 주기(4개 유전자), 칼슘 시그널링(4개 유전자), 아르기닌 및 프롤린 대사(3개 유전자), 질소 대사(2개 유전자), 소포 수송에서의 SNARE 상호작용(2개 유전자), 및 RNA 분해(2개 유전자)의 경로인 것으로 나타났다(도 2f). 신경활성 리간드-수용체 상호작용에 참여하는 것으로 예측된 miR-193a 타겟이 신경분화에 영향을 미치는 것으로 여겨지기 때문에, 본 발명자는 예측된 타겟이 miR-193a에 의해 직접적으로 조절되는지 여부를 입증하기 위하여 qRT-PCR을 수행하였다. 또한, 본 발명자는 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 콜레시스토키닌 A 수용체(cholecystokinin A receptor (CCKAR)), 시스테닐 류코트리엔 수용체 1(CYSLTR1), 및 갈라닌 수용체 1(GALR1) 유전자의 3’-UTR에 있는 miR-193a의 결합 부위를 확인하였다. miR-193a의 타겟 유전자인 것으로 잘 알려진 PLAU 및 KRAS를 포함한 miR-193a 타겟의 발현에 대한 miR-193a 과발현의 효과를 조사하였다. miR-scr 또는 miR-193a 처리 3일 후 F11세포에서 총 RNA를 분리하여, RT-PCR 기법을 통해 mRNA를 cDNA로 역전사 시킨 후 miR-193a 의 타겟 유전자 조절을 확인 하기 위해 타겟 유전자 서열에 상보적인 프라이머를 이용하여 qRT-PCR을 시행하여 타겟 유전자의 발현을 정량적으로 분석하였다. 도 2g에 나타난 바와 같이, 이들 유전자의 발현은 miR-193a에 의해 상당히 억제되는 것으로 나타났다.
단백질 레벨에서 변화로 번역된 mRNA 발현에서의 변화를 입증하기 위하여, 본 발명자는 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 타겟 유전자 발현을 조사하였다. qRT-PCR 결과에서의 mRNA 레벨 감소와 일치하였으며, 즉 웨스턴 블랏 분석에서 PLAU, KRAS, CCKAR, CYSLTR1 및 GALR1은 miR-193a 처리 3일 후 유사하게 억제된 발현 패턴이 나타났다. 특히, GALR1 발현은 miR-193a에 의해 상당히 감소되었다(도 2h). 이러한 결과는, miR-193a에 의한 신경활성 리간드-수용체 경로의 타겟 유전자 조절에 의하여 뉴런 분화가 영향을 받을 수 있다는 것을 말한다.
상기 결과는 miR-193a가 종전에 세포에 처리하여 신경세포로 분화한다고 알려진 miR-9, miR-124 및 miR-132에 필적하는 신경세포 분화를 유도하는 것을 나타낸다.
실시예 3. 신경 줄기세포에서 miR -193a의 발현 분석
신경 줄기세포 NE-4C (ATCC? CRL-2925)를 retinoic acid (RA; Sigma Aldrich) 를 처리하여 신경세포로 분화 유도한 뒤 세포 내에서 발현하는 miR-193a와 신경세포 분화 후 분비하는 엑소좀 내의 miR-193a의 발현량을 실세예 2에서와 같이 RT-PCR 로 분석하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 신경 줄기세포에서 miR-193a의 발현은 신경세포 분화 후 세포 내에서뿐만 아니라 분화 후 분비되는 엑소좀 내에서 모두 매우 높게 발현되는 것으로 확인 되었으며, 이는 miR-193a가 신경전구세포는 물론 신경전구세포가 유래된 신경 줄기세포에서도 신경분화를 조절할 수 있다는 것을 나타낸다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (9)

  1. 5'-ACUGGCC-3' 서열을 포함하는 길이 7 내지 25mer의 miRNA-193a 핵산분자를 포함하는 신경세포 분화 촉진용 조성물로, 상기 분화는 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 신경세포로의 분화인, 신경세포 분화 촉진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 miR-193a 핵산분자는 5’AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU 3‘인, 신경세포 분화 촉진용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산분자는 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 신경세포 분화 촉진용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 신경세포는 뉴론, 아스트로사이트 또는 올리고덴드로사이트를 포함하는, 신경세포 분화 촉진용 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 신경변성 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 것인, 신경세포 분화 촉진용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 조성물은 신경세포가 손상된 부위로 투여 또는 뇌혈관 주사에 의한 투여, 비강내 투여, 정맥내 투여, 피하 주사, 경구 투여, 뇌척수강내 주사, 또는 흡입투여되는 것인, 신경세포 분화 촉진용 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 처리하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 신경세포로 분화하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 처리하는 단계에 의해, 상기 조성물에 포함된 상기 miR-193a 핵산분자는 상기 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 콜레시스토키닌 A 수용체(cholecystokinin A receptor (CCKAR)), 시스테닐 류코트리엔 수용체 1(CYSLTR1), 및 갈라닌 수용체 1(GALR1) 유전자의 3’-UTR에 결합하는, 방법.
  9. 삭제
KR1020150188634A 2015-07-28 2015-12-29 마이크로알엔에이 193a를 포함하는 신경세포 분화 촉진용 조성물 및 방법 KR101722861B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20150106546 2015-07-28
KR1020150106546 2015-07-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170013799A KR20170013799A (ko) 2017-02-07
KR101722861B1 true KR101722861B1 (ko) 2017-04-03

Family

ID=58108133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150188634A KR101722861B1 (ko) 2015-07-28 2015-12-29 마이크로알엔에이 193a를 포함하는 신경세포 분화 촉진용 조성물 및 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101722861B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI764942B (zh) * 2016-10-10 2022-05-21 德商麥克專利有限公司 電子裝置

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1771563A2 (en) * 2004-05-28 2007-04-11 Ambion, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING MicroRNA

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170013799A (ko) 2017-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. MicroRNA-146a promotes oligodendrogenesis in stroke
Xia et al. MiR-125b expression affects the proliferation and apoptosis of human glioma cells by targeting Bmf
Wang et al. The role of miR-146a in dorsal root ganglia neurons of experimental diabetic peripheral neuropathy
US11542503B2 (en) Uses for prevention or treatment of brain diseases using microRNA
Guo et al. Up-regulation of miR-122 protects against neuronal cell death in ischemic stroke through the heat shock protein 70-dependent NF-κB pathway by targeting FOXO3
US9803200B2 (en) Inhibition of microRNA-134 for the treatment of seizure-related disorders and neurologic injuries
EP2841067A2 (en) A drug screening platform for rett syndrome
US10280422B2 (en) MiR-92 inhibitors and uses thereof
KR101615424B1 (ko) 마이크로알엔에이를 표적으로 하는 신경변성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 방법
JP2013511964A (ja) ｍｉＲＮＡ−１００を含む医薬組成物ならびに血管増殖および内皮炎症を調節するためのその使用
US9028810B2 (en) Composition for inducing migration of neural stem cells containing periostin as effective ingredient
KR101566586B1 (ko) miRNA를 표적으로 하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 방법
US9434945B2 (en) Use of miR-23a-3p and/or miR-27a-3p mimics as therapeutic agents for inhibition of neuronal apoptosis following brain injury
KR101722861B1 (ko) 마이크로알엔에이 193a를 포함하는 신경세포 분화 촉진용 조성물 및 방법
US10537591B2 (en) Method for promoting muscle regeneration
EP2331143B1 (en) Treatment of scleroderma
KR101541974B1 (ko) miR29b를 포함하는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진용 조성물 및 방법
US20230265426A1 (en) Combinatorial inhibition of mirnas for treatment of heart failure
KR101890874B1 (ko) 근육 노화 억제용 또는 근육 노화 관련 질환 치료용 조성물
KR102208777B1 (ko) 마이크로 RNA miR-210 억제제를 유효성분으로 포함하는 노화 관련 대사질환 방지용 조성물 및 miR-210 억제제의 스크리닝 방법
US20200018744A1 (en) METHOD FOR DETECTING miRNA-206 FOR ANALYZING THE DIAGNOSIS OR PROGNOSIS OF A MENTAL ILLNESS BY A MOOD DISORDER, METHOD FOR PROVIDING INFORMATION FOR THE DIAGNOSIS, AND A COMPOSITION FOR TARGETING miRNA-206
EP2843049B1 (en) Neuronal differentiation promoter
KR101611071B1 (ko) 마이크로알엔에이 202를 표적으로 하는 다계통위축증의 치료 또는 예방용 약학 조성물 및 방법
AU2019204230A1 (en) Uses for prevention or treatment of brain diseases using microRNA
EP4185693A1 (en) Combinatorial inhibition of transcription factors for treatment of heart failure

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200302

Year of fee payment: 4