KR20210091153A - 효소적 rna 합성 - Google Patents

효소적 rna 합성 Download PDF

Info

Publication number
KR20210091153A
KR20210091153A KR1020217014145A KR20217014145A KR20210091153A KR 20210091153 A KR20210091153 A KR 20210091153A KR 1020217014145 A KR1020217014145 A KR 1020217014145A KR 20217014145 A KR20217014145 A KR 20217014145A KR 20210091153 A KR20210091153 A KR 20210091153A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polymerase
poly
pombe
triphosphate
oligonucleotide
Prior art date
Application number
KR1020217014145A
Other languages
English (en)
Inventor
조지 엠 처치
다니엘 제이. 비간트
리처드 이. 코먼
에르킨 쿠루
조나단 리티차이어
니콜라스 콘웨이
Original Assignee
프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 filed Critical 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
Publication of KR20210091153A publication Critical patent/KR20210091153A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1282—RNA uridylyltransferase (2.7.7.52)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07052—RNA uridylyltransferase (2.7.7.52)

Abstract

효소 촉매작용을 이용하는 RNA 올리고뉴클레오티드의 제어된 신생 합성 방법이 본원에 기재된다. 예를 들어, 효소 촉매작용 (말단 트랜스퍼라제 활성으로도 공지됨)을 통한 개시자 올리고뉴클레오티드 3'-말단에의 뉴클레오티드의 제어된 주형-비의존성 부가를 통해 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 합성될 때까지 단일 뉴클레오티드가 적합성 폴리머라제 (예를 들어, 폴리(N) 폴리머라제, 예컨대 폴리(U) 폴리머라제)에 의해 반복적으로 부가될 수 있다. 본원에 기재된 방법에서 유용한 뉴클레오티드 및 폴리머라제 또한 제공된다.

Description

효소적 RNA 합성
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2018년 10월 12일에 출원한 미국 가출원 U.S.S.N. 62/745,136을 우선권 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국 에너지부에 의해 수여된 허가 번호 DE-FG02-02ER63445하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
합성 올리고뉴클레오티드는 학술적 및 산업적 환경 모두에서 생명공학 연구의 여러 측면에서 중요하다. 더 길고 더 저렴하며 오류가 없는 올리고뉴클레오티드에 대한 높은 수요에도 불구하고, 현재의 산업 리더는 수십년 전에 개발된 전통적인 화학적 합성 방법의 여러 한계를 해결하지 못하였다. 이는 특히 신생 RNA 올리고뉴클레오티드 합성의 경우에 그러하며, 게놈 조작 기술, RNA-기반 진단제 및 치료제, RNA-기반 시퀀싱 기술, 고밀도 핵산-기반 정보 저장, 및 생물학적 컴퓨팅을 발전시키는데 많이 투자한 사람들이 거의 접근하지 못한채 남아 있다 (Kaczmarek, Kowalski, and Anderson 2017). RNA 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성을 위해 이용된 방법에 대한 일부 개선이 있었지만, 1970년대 후반 이래로 전반적인 화학이 거의 변하지 않았다 (Hughes and Ellington 2017). 화학적 합성은 가혹한 화학적 시약 및 생물학적으로 비적합성인 유기 용매 둘 다를 필요로 하는 여러 복잡한 반응 단계로 인해 어려움이 있다. 이들 반응 조건은 뉴클레오티드 염기의 탈퓨린화, 전체 서열로부터의 예상치 못한 삽입 또는 결실, 및 올리고뉴클레오티드의 선제적인 비가역적인 캡핑을 유도하여, 원치않는 말단절단된 생성물을 생성한다. 이는 합성의 전체 오류율을 크게 증가시키고, RNA 올리고뉴클레오티드의 최대 길이를 120개 미만의 뉴클레오티드로 제한하고, 원하는 생성물의 적절한 수율을 수득하기 위해 더 긴 소요 시간을 필요로 한다. 추가로, RNA 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 비용이 매우 많이 들며; 염기당 $0.1인 DNA 올리고뉴클레오티드의 현재 합성 비용과 비교하여 (Carlson 2018), RNA 합성은 길거나 복잡한 RNA 올리고뉴클레오티드를 고려하지 않고도 거의 100배 더 높다. 따라서, RNA 올리고뉴클레오티드 합성의 현재의 한계를 해결하는 것이 중요하다.
효소 촉매작용을 이용하는 RNA 올리고뉴클레오티드의 제어된 신생 합성을 위한 화합물, 효소, 조성물, 시스템, 키트 및 방법이 본원에 기재된다. 예를 들어, 효소 촉매작용 (말단 트랜스퍼라제 활성으로도 공지됨)을 통한 개시자 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에의 뉴클레오티드의 제어된 주형-비의존성 부가를 통해 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 합성될 때까지 단일 뉴클레오티드가 적합성 폴리머라제 (예를 들어, 폴리(N) 폴리머라제, 예컨대 폴리(U) 폴리머라제)에 의해 반복적으로 부가될 수 있다.
본 개시내용은 특정 폴리머라제 효소가 다양한 변형된 및 비변형된 뉴클레오티드와의 주형-비의존성 말단 트랜스퍼라제 반응을 효과적으로 촉매할 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 한 측면에서, RNA 올리고뉴클레오티드의 합성 방법이 본원에 제공되며, 폴리(N) 폴리머라제는 개시자 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 1개 이상의 뉴클레오티드를 혼입시킨다. 특정 폴리머라제, 예컨대 무엇보다도 폴리(U) 및 폴리(A) 폴리머라제가 다양한 뉴클레오티드, 예컨대 변형된 뉴클레오티드와의 말단 트랜스퍼라제 반응을 촉매할 수 있다는 것이 확인되었다. 폴리(N) 폴리머라제가 말단 트랜스퍼라제를 통해 1개 이상의 뉴클레오티드를 혼입시킨 후에, 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 수득될 때까지, 임의적으로 상이한 뉴클레오티드를 사용하여 상기 과정을 반복적인 단계에서 1회 이상 반복할 수 있다. 본원에 기재된 방법에서 유용한 새로운 폴리(N) 폴리머라제 효소 (예를 들어, 돌연변이 폴리(U) 폴리머라제)가 또한 제공된다.
한 측면에서, 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(N) 폴리머라제 (예를 들어, 폴리(U) 폴리머라제), 및 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 조합하여 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함하는, RNA 올리고뉴클레오티드의 제조 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 수득될 때까지 반복적인 단계에서 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드에 1개 이상의 추가의 뉴클레오티드 (변형된 또는 비변형된)를 부가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법에서 유용한 화합물 (예를 들어, 변형된 뉴클레오티드)이 또한 본원에 제공된다.
제어된 신생 RNA 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 다른 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 또 다른 측면에서, 폴리머라제 (예를 들어, 폴리(N) 폴리머라제, 예컨대 폴리(U))의 결합 친화도를 가역적으로 변경시키는 변형된 뉴클레오티드 (즉, "가역적인 종결자 올리고뉴클레오티드", 예를 들어, 2'- 또는 3'-O-보호된 뉴클레오티드)를 연장된 개시자 올리고뉴클레오티드에 혼입시키는 방법이 본원에 제공된다. 결합 친화도에서의 이러한 변화는 추가의 뉴클레오티드 부가를 종료시켜, 변형된 기가 온화한 탈보호 화학을 통해 그의 천연 상태 (예를 들어, 2'- 또는 3'-OH 기)로 복원된 후에 추가로 연장될 수 있는 (n+1) 올리고뉴클레오티드 생성물을 생성한다. "(n+1) 올리고뉴클레오티드"는 단일 뉴클레오티드가 개시자 서열에 부가되어 있는 생성물이다. 이들 방법은 도 2에 도시된 반응식에서 예시된다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 2'- 또는 3'-변형된 가역적인 종결자 올리고뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(N) 폴리머라제 (예를 들어, 폴리(U) 폴리머라제), 및 가역적인 종결자 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'- 또는 3'-변형된 가역적인 종결자 올리고뉴클레오티드)를 조합한 후에; 가역적인 종결자 뉴클레오티드의 보호된 위치에서 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드를 탈보호시키는 단계를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오티드의 합성 방법이 본원에 제공된다. 탈보호되면, 생성된 (n+1) 연장된 RNA 올리고뉴클레오티드는 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 수득될 때까지 1개 이상의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드를 수반하는 후속적인 말단 트랜스퍼라제 반응을 겪을 수 있다. 본원에 기재된 방법에서 유용한 2'- 또는 3'-변형된 가역적인 종결자 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 2'- 또는 3'-O-보호된 뉴클레오티드) 또한 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드를 이용하는 RNA 올리고뉴클레오티드 합성 방법이 본원에서 제공된다. 이들 방법에서, 폴리머라제가 개시자 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에서 뉴클레오티드를 혼입시키는 속도는 효소의 활성 부위에 대해 경쟁하는 비-가수분해성 뉴클레오티드를 도입시킴으로써 제어된다. 이들 방법은 도 1에 도시된 반응식에서 예시된다. 올리고뉴클레오티드 합성 속도는 경쟁 억제를 통한 가수분해성 뉴클레오티드 및 비-가수분해성 뉴클레오티드의 비에 의해 직접적인 영향을 받는다. 이들 뉴클레오티드의 비 외에도, 제어된 합성을 위한 반응 속도를 조절하기 위해 다른 반응 파라미터가 미세하게 조정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 적어도 1개의 가수분해성 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(N) 폴리머라제 (예를 들어, 폴리(U) 폴리머라제), 1개 이상의 뉴클레오티드, 및 1개 이상의 비-가수분해성 뉴클레오티드를 조합하고, 여기서 비-가수분해성 뉴클레오티드의 농도는 폴리(N) 폴리머라제에 의한 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가 속도를 억제하는데 충분하고; 이로써 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함하는, RNA 올리고뉴클레오티드의 합성 방법이 본원에서 제공된다. 상기 방법은 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 수득될 때까지 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드에 1개 이상의 추가의 뉴클레오티드 (변형된 또는 비변형된)를 부가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법에서 유용한 비-가수분해성 뉴클레오티드 또한 본원에 제공된다.
추가로, 2개의 올리고뉴클레오티드를 라이게이션하여 RNA 올리고뉴클레오티드를 수득하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 제1 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 제1 올리고뉴클레오티드는 5'-트리포스페이트 기를 포함하는 것이 단계; 제2 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계; 폴리(U) 폴리머라제를 제공하는 단계; 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 제1 올리고뉴클레오티드를 라이게이션하는데 충분한 조건하에 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 및 폴리(U) 폴리머라제를 조합하는 단계를 포함한다. 이 실시양태는 3'-위치에서 올리고뉴클레오티드를 갖는 5'-트리포스페이트 뉴클레오티드가 본원에 기재된 폴리(N) 폴리머라제 (예를 들어, 야생형 및 돌연변이된 폴리(U) 폴리머라제)에 대한 생존가능한 기질이라는 발견으로 인해 가능하다.
추가로, 이들 방법에 의해 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드가 역전사 (RT)를 거쳐 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 DNA 폴리머라제에 의해 증폭될 수 있는 상보성 DNA (예를 들어, cDNA)를 수득할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드 및 DNA 올리고뉴클레오티드 또한 본원에 제공된다.
본원에 기재된 방법은 효소 촉매작용을 수반한다. 효소 촉매작용이 생물학적으로 적합성인 반응 조건하에 발생하기 때문에, 화학적 합성에 의해 현재 겪게 되는 RNA 분자의 원치않는 분해가 제거될 수 있다. 본 방법은 종종 가혹한 반응 조건하에 포스포르아미다이트 화학에 의해 수행되는 신생 RNA 올리고뉴클레오티드 합성의 현재 상태를 개선시킨다. 화학적 RNA 올리고뉴클레오티드 합성의 가혹한 반응 조건은 긴 RNA 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 >100개 뉴클레오티드 길이를 생성하는 것을 어렵게 만들고 비용이 많이 들며, 화학적 합성을 통해 상당한 수율의 긴 RNA 올리고뉴클레오티드가 생성된다면, 올리고뉴클레오티드의 오류율이 매우 높을 가능성이 있다. 본원에 기재된 효소적 접근법을 이용함으로써, 긴 RNA 올리고뉴클레오티드 합성과 연관된 현재의 여러 문제가 해결된다. 본원에 기재된 방법의 적용에는 RNA의 직접적인 합성, 뿐만 아니라 핵산 나노기술, 게놈 조작 기술, 및 신규한 RNA 및 DNA 치료제를 위한 물질 생성이 포함된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 미세유체 형식으로 소형화되거나 또는 미세-액적 인쇄와 같은 고도로 병렬화된 방식으로 수행되는 능력을 갖는다. 본원에 제공된 방법은 또한 고체 상에서 수행될 수 있다.
본원에 기재된 폴리(N) 폴리머라제 및/또는 뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물 및 키트 또한 본원에 제공된다.
본 발명의 특정 실시양태의 상세한 내용은 하기 기재된 바와 같이 특정 실시양태의 상세한 설명에서 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 정의, 실시예, 도면 및 청구항에서 자명할 것이다.
정의
일반 정의
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리머라제"는 일반적으로 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 주형-의존성 방식으로 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리머라제는 주형-비의존성 방식으로 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 RNA 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 DNA 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 역전사 효소이다. 폴리머라제는 임의의 공급원, 예를 들어 재조합 폴리머라제, 박테리아 폴리머라제로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 폴리(N) 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 폴리(U), 폴리(A), 폴리(C), 또는 폴리(G) 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 뉴클레오티드, 예를 들어 뉴클레오티드를 부가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 단일 뉴클레오티드 종, 예를 들어 폴리(U) 폴리머라제의 경우 우라실 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 선택적으로 부가한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RNA 올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체의 중합체를 지칭한다. RNA 올리고뉴클레오티드는 임의의 서열을 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, RNA 올리고뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 관련 기술분야의 기술자에게 공지되거나 또는 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. RNA 올리고뉴클레오티드는 천연 발생 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 리보자임, 재조합 올리고뉴클레오티드, 분지형 올리고뉴클레오티드, 임의의 서열의 단리된 또는 합성 RNA 올리고뉴클레오티드, 프로브 및/또는 프라이머일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 천연 발생 염기, 예를 들어 아데닌 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 비-천연 발생 또는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 당 변형, 염기 변형, 예를 들어 퓨린 또는 피리미딘 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 천연, 비-천연 발생 및 변형된 뉴클레오티드의 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 적어도 1개의 변형된 백본 또는 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 백본 또는 연결을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥이다. 다른 실시양태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥이다. 일부 실시양태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 주형-비의존성 합성을 통해 합성된다. 일부 실시양태에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 DNA 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체의 중합체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, DNA 올리고뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 관련 기술분야의 기술자에게 공지되거나 또는 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 천연 발생 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 올리고뉴클레오티드는 엑손, 인트론, cDNA 서열, 재조합 올리고뉴클레오티드, 분지형 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 및/또는 임의의 서열의 단리된 DNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 올리고뉴클레오티드는 천연 발생 염기, 예를 들어 아데닌, 시토신, 구아닌, 또는 티민을 포함하는 DNA 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 올리고뉴클레오티드는 비-천연 발생 또는 변형된 DNA 뉴클레오티드, 예를 들어 당 변형, 퓨린 또는 피리미딘 변형을 포함하는 DNA 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 올리고뉴클레오티드는 천연, 비-천연 발생, 및 변형된 DNA 뉴클레오티드의 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 뉴클레오티드는 적어도 1개의 변형된 백본 또는 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 백본 또는 연결을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥이다. 다른 실시양태에서, DNA 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥이다. 일부 실시양태에서, DNA 올리고뉴클레오티드는 역전사를 통해 합성된다. 일부 실시양태에서, DNA 올리고뉴클레오티드는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200개 DNA, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500개 DNA 뉴클레오티드 길이이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드" 또는 "리보뉴클레오티드"는 일반적으로 리보스 당, 포스페이트 기, 및 핵염기를 포함하는 뉴클레오티드 단량체를 지칭한다. 뉴클레오티드는 천연 발생, 비-천연 발생, 또는 변형된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 핵염기 또는 염기, 예를 들어 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기는 천연 발생 염기, 예를 들어, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우라실, 또는 이노신이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 비-천연 발생 핵염기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 예를 들어 2' 위치에서 리보스 당의 변형, 예를 들어 2'-F, 2'-O-알킬, 2'-아미노, 또는 2'-아지도를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 비-가수분해성 뉴클레오티드이며, 예를 들어 변형된 트리포스페이트 기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 가역적인 종결자 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 2'- 또는 3'-OH-보호된 뉴클레오티드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "개시자 올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 주형-비의존성 합성을 개시할 수 있는 짧은 단일-가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 20개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 20개 미만, 18개 미만, 15개 미만, 12개 미만, 10개 미만, 8개 미만 또는 5개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단에서 표지되고, 예를 들어 형광단으로 표지된다. 일부 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단에서 기질에 부착된다. 일부 실시양태에서, 기질은 유리 표면, 비드, 생체분자, 또는 주형-비의존성 합성에 적합한 임의의 가능한 기질일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "주형-비의존성"은 일반적으로 주형 DNA 올리고뉴클레오티드를 필요로 하지 않는 RNA 올리고뉴클레오티드의 합성을 지칭한다. 주형-비의존성 합성은 일반적으로 개시자 올리고뉴클레오티드 및 폴리머라제, 예를 들어 폴리(N) 폴리머라제의 사용을 포함할 것이다. 주형-비의존성 합성을 이용하여 합성된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 RNA 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 기존 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 뉴클레오티드, 예를 들어 뉴클레오티드를 부가함으로써 합성된다.
화학적 정의
구체적인 관능기 및 화학적 용어의 정의가 하기에 더욱 상세하게 기재된다. 화학 원소는 [Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed., inside cover]에 따라 확인되고, 구체적인 관능기는 일반적으로 그에 기재된 바와 같이 정의된다. 추가로, 유기 화학, 뿐만 아니라 구체적인 관능적 모이어티 및 반응성의 일반적인 원리는 [Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; 및 Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있고, 따라서 다양한 입체 이성질체 형태, 예를 들어 거울상 이성질체 및/또는 부분입체 이성질체로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 화합물은 개별 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 또는 기하 이성질체의 형태일 수 있거나, 또는 라세미 혼합물, 및 하나 이상의 입체 이성질체가 강화된 혼합물을 비롯하여 입체 이성질체의 혼합물의 형태일 수 있다. 이성질체는 키랄 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 키랄 염의 형성 및 결정화를 비롯하여 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있거나; 또는 바람직한 이성질체는 비대칭 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 [Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); 및 Wilen, S.H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)]를 참고한다. 본 발명은 추가로 다른 이성질체가 실질적으로 없는 개별 이성질체로서 및 대안적으로 다양한 이성질체의 혼합물로서의 화합물을 포함한다.
달리 나타내지 않는다면, 본원에 도시된 구조는 하나 이상의 동위원소적으로 강화된 원자의 존재에서만 상이한 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 수소가 중수소 또는 삼중수소로 대체, 19F가 18F로 대체, 또는 12C가 13C 또는 14C로 대체된 것 외에는 본 발명의 구조를 갖는 화합물이 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이러한 화합물은 예를 들어 생물학적 검정에서 분석 도구 또는 프로브로서 유용하다.
값의 범위가 나열되는 경우, 이는 범위 내의 각각의 값 및 하위 범위를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어 "C1-6 알킬"은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5 및 C5-6 알킬을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "알킬"은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄형 또는 분지형 포화 탄화수소 기의 라디칼 ("C1-10 알킬")을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-9 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-8 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-7 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-6 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-5 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-4 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-3 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-2 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-6 알킬"). C1-6 알킬 기의 예에는 메틸 (C1), 에틸 (C2), 프로필 (C3) (예를 들어, n-프로필, 이소프로필), 부틸 (C4) (예를 들어, n-부틸, tert-부틸, sec-부틸, 이소-부틸), 펜틸 (C5) (예를 들어, n-펜틸, 3-펜타닐, 아밀, 네오펜틸, 3-메틸-2-부타닐, 3급 아밀), 및 헥실 (C6) (예를 들어, n-헥실)이 포함된다. 알킬 기의 추가의 예에는 n-헵틸 (C7), n-옥틸 (C8) 등이 포함된다. 달리 명시하지 않는다면, 각각의 경우의 알킬 기는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 알킬") 또는 1개 이상의 치환기 (예를 들어, 할로겐, 예컨대 F)로 치환된다 ("치환된 알킬"). 특정 실시양태에서, 알킬 기는 비치환된 C1-10 알킬 (예컨대 비치환된 C1-6 알킬, 예를 들어, -CH3 (Me), 비치환된 에틸 (Et), 비치환된 프로필 (Pr, 예를 들어, 비치환된 n-프로필 (n-Pr), 비치환된 이소프로필 (i-Pr)), 비치환된 부틸 (Bu, 예를 들어, 비치환된 n-부틸 (n-Bu), 비치환된 tert-부틸 (tert-Bu 또는 t-Bu), 비치환된 sec-부틸 (sec-Bu), 비치환된 이소부틸 (i-Bu))이다. 특정 실시양태에서, 알킬 기는 치환된 C1-10 알킬 (예컨대 치환된 C1-6 알킬, 예를 들어, -CF3, Bn)이다.
용어 "할로알킬"은 수소 원자 중 1개 이상의 독립적으로 할로겐, 예를 들어, 플루오로, 브로모, 클로로, 또는 아이오도로 대체된 것인 치환된 알킬 기이다. 일부 실시양태에서, 할로알킬 모이어티는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-8 할로알킬"). 일부 실시양태에서, 할로알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-6 할로알킬"). 일부 실시양태에서, 할로알킬 모이어티는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-4 할로알킬"). 일부 실시양태에서, 할로알킬 모이어티는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-3 할로알킬"). 일부 실시양태에서, 할로알킬 모이어티는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-2 할로알킬"). 할로알킬 기의 예에는 -CHF2, -CH2F, -CF3, -CH2CF3, -CF2CF3, -CF2CF2CF3, -CCl3, -CFCl2, -CF2Cl 등이 포함된다.
용어 "헤테로알킬"은 모 쇄의 내에 (즉, 그의 인접한 탄소 원자들 사이에 삽입된) 및/또는 모 쇄의 하나 이상의 말단 위치(들)에 위치한 산소, 질소 또는 황으로부터 선택된 적어도 1개의 헤테로원자 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자)를 추가로 포함하는 알킬 기를 지칭한다.
용어 "알케닐"은 2 내지 10개의 탄소 원자 및 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 이중 결합)을 갖는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 기의 라디칼을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-9 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-8 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-7 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-6 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-5 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-4 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-3 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 2개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2 알케닐"). 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합은 내부에 (예컨대 2-부테닐) 또는 말단에 (예컨대 1-부테닐) 있을 수 있다. C2-4 알케닐 기의 예에는 에테닐 (C2), 1-프로페닐 (C3), 2-프로페닐 (C3), 1-부테닐 (C4), 2-부테닐 (C4), 부타디에닐 (C4) 등이 포함된다. C2-6 알케닐 기의 예에는 상기 언급된 C2-4 알케닐 기 뿐만 아니라 펜테닐 (C5), 펜타디에닐 (C5), 헥세닐 (C6) 등이 포함된다. 알케닐의 추가의 예에는 헵테닐 (C7), 옥테닐 (C8), 옥타트리에닐 (C8) 등이 포함된다. 달리 명시하지 않는다면, 각각의 경우의 알케닐 기는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 알케닐") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 알케닐"). 특정 실시양태에서, 알케닐 기는 비치환된 C2-10 알케닐이다. 특정 실시양태에서, 알케닐 기는 치환된 C2-10 알케닐이다. 알케닐 기에서, 입체화학이 명시되지 않은 C=C 이중 결합 (예를 들어, -CH=CHCH3 또는
Figure pct00001
)은 (E)- 또는 (Z)-이중 결합일 수 있다.
용어 "헤테로알케닐"은 모 쇄의 내에 (즉, 그의 인접한 탄소 원자들 사이에 삽입된) 및/또는 모 쇄의 하나 이상의 말단 위치(들)에 위치한 산소, 질소 또는 황으로부터 선택된 적어도 1개의 헤테로원자 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자)를 추가로 포함하는 알케닐 기를 지칭한다.
용어 "알키닐"은 2 내지 10개의 탄소 원자 및 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 삼중 결합)을 갖는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 기의 라디칼 ("C2-10 알키닐")을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-9 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-8 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-7 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-6 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-5 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-4 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-3 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 2개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2 알키닐"). 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합은 내부에 (예컨대 2-부티닐) 또는 말단에 (예컨대 1-부티닐) 있을 수 있다. C2-4 알키닐 기의 예에는 비제한적으로 에티닐 (C2), 1-프로피닐 (C3), 2-프로피닐 (C3), 1-부티닐 (C4), 2-부티닐 (C4) 등이 포함된다. C2-6 알케닐 기의 예에는 상기 언급된 C2-4 알키닐 기 뿐만 아니라 펜티닐 (C5), 헥시닐 (C6) 등이 포함된다. 알키닐의 추가의 예에는 헵티닐 (C7), 옥티닐 (C8) 등이 포함된다. 달리 명시하지 않는다면, 각각의 경우의 알키닐 기는 독립적으로 비치환되거나 ( "비치환된 알키닐") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 알키닐"). 특정 실시양태에서, 알키닐 기는 비치환된 C2-10 알키닐이다. 특정 실시양태에서, 알키닐 기는 치환된 C2-10 알키닐이다.
용어 "헤테로알키닐"은 모 쇄의 내에 (즉, 그의 인접한 탄소 원자들 사이에 삽입된) 및/또는 모 쇄의 하나 이상의 말단 위치(들)에 위치한 산소, 질소 또는 황으로부터 선택된 적어도 1개의 헤테로원자 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자)를 추가로 포함하는 알키닐 기를 지칭한다.
용어 "카르보시클릴" 또는 "카르보시클릭"은 비-방향족 고리계에 3 내지 14개의 고리 탄소 원자 ("C3-14 카르보시클릴") 및 0개의 헤테로원자를 갖는 비-방향족 시클릭 탄화수소 기의 라디칼을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 카르보시클릴 기는 3 내지 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C3-10 카르보시클릴"). 일부 실시양태에서, 카르보시클릴 기는 3 내지 8개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C3-8 카르보시클릴"). 일부 실시양태에서, 카르보시클릴 기는 3 내지 7개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C3-7 카르보시클릴"). 일부 실시양태에서, 카르보시클릴 기는 3 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C3-6 카르보시클릴"). 일부 실시양태에서, 카르보시클릴 기는 4 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C4-6 카르보시클릴"). 일부 실시양태에서, 카르보시클릴 기는 5 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C5-6 카르보시클릴"). 일부 실시양태에서, 카르보시클릴 기는 5 내지 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C5-10 카르보시클릴"). 예시적인 C3-6 카르보시클릴 기에는 비제한적으로 시클로프로필 (C3), 시클로프로페닐 (C3), 시클로부틸 (C4), 시클로부테닐 (C4), 시클로펜틸 (C5), 시클로펜테닐 (C5), 시클로헥실 (C6), 시클로헥세닐 (C6), 시클로헥사디에닐 (C6) 등이 포함된다. 예시적인 C3-8 카르보시클릴 기에는 비제한적으로 상기 언급된 C3-6 카르보시클릴 기 뿐만 아니라 시클로헵틸 (C7), 시클로헵테닐 (C7), 시클로헵타디에닐 (C7), 시클로헵타트리에닐 (C7), 시클로옥틸 (C8), 시클로옥테닐 (C8), 비시클로[2.2.1]헵타닐 (C7), 비시클로[2.2.2]옥타닐 (C8) 등이 포함된다. 예시적인 C3-10 카르보시클릴 기에는 비제한적으로 상기 언급된 C3-8 카르보시클릴 기 뿐만 아니라 시클로노닐 (C9), 시클로노네일 (C9), 시클로데실 (C10), 시클로데세닐 (C10), 옥타히드로-1H-인데닐 (C9), 데카히드로나프탈레닐 (C10), 스피로[4.5]데카닐 (C10) 등이 포함된다. 상기 예에서 나타낸 바와 같이, 특정 실시양태에서, 카르보시클릴 기는 모노시클릭 ("모노시클릭 카르보시클릴") 또는 폴리시클릭 (예를 들어, 융합된, 가교 또는 스피로 고리계, 예컨대 비시클릭 시스템 ("비시클릭 카르보시클릴") 또는 트리시클릭 시스템 ("트리시클릭 카르보시클릴")을 함유함)이고, 포화일 수 있거나 또는 1개 이상의 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 함유할 수 있다. "카르보시클릴"은 상기 정의된 카르보시클릴 고리가 1개 이상의 아릴 또는 헤테로아릴 기와 융합되고, 부착점이 카르보시클릴 고리 상에 있는 것인 고리계 또한 포함하고, 이러한 예에서 탄소의 개수는 카르보시클릭 고리계에 있는 탄소의 개수를 계속해서 지정한다. 달리 명시하지 않는다면, 각각의 경우의 카르보시클릴 기는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 카르보시클릴") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 카르보시클릴"). 특정 실시양태에서, 카르보시클릴 기는 비치환된 C3-14 카르보시클릴이다. 특정 실시양태에서, 카르보시클릴 기는 치환된 C3-14 카르보시클릴이다.
일부 실시양태에서, "카르보시클릴"은 3 내지 14개의 고리 탄소 원자를 갖는 모노시클릭, 포화 카르보시클릴 기이다 ("C3-14 시클로알킬"). 일부 실시양태에서, 시클로알킬 기는 3 내지 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C3-10 시클로알킬"). 일부 실시양태에서, 시클로알킬 기는 3 내지 8개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C3-8 시클로알킬"). 일부 실시양태에서, 시클로알킬 기는 3 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C3-6 시클로알킬"). 일부 실시양태에서, 시클로알킬 기는 4 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C4-6 시클로알킬"). 일부 실시양태에서, 시클로알킬 기는 5 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C5-6 시클로알킬"). 일부 실시양태에서, 시클로알킬 기는 5 내지 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C5-10 시클로알킬"). C5-6 시클로알킬 기의 예에는 시클로펜틸 (C5) 및 시클로헥실 (C5)이 포함된다. C3-6 시클로알킬 기의 예에는 상기 언급된 C5-6 시클로알킬 기 뿐만 아니라 시클로프로필 (C3) 및 시클로부틸 (C4)이 포함된다. C3-8 시클로알킬 기의 예에는 상기 언급된 C3-6 시클로알킬 기 뿐만 아니라 시클로헵틸 (C7) 및 시클로옥틸 (C8)이 포함된다. 달리 명시하지 않는다면, 각각의 경우의 시클로알킬 기는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 시클로알킬") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 시클로알킬"). 특정 실시양태에서, 시클로알킬 기는 비치환된 C3-14 시클로알킬이다. 특정 실시양태에서, 시클로알킬 기는 치환된 C3-14 시클로알킬이다.
용어 "헤테로시클릴" 또는 "헤테로시클릭"은 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 3 내지 14원 비-방향족 고리계의 라디칼을 지칭하며, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택된다 ("3-14원 헤테로시클릴"). 1개 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로시클릴 기에서, 부착점은 원자가가 허용되는 대로 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로시클릴 기는 모노시클릭 ("모노시클릭 헤테로시클릴") 또는 폴리시클릭 (예를 들어, 융합된, 가교 또는 스피로 고리계, 예컨대 비시클릭 시스템 ("비시클릭 헤테로시클릴") 또는 트리시클릭 시스템 ("트리시클릭 헤테로시클릴"))일 수 있고, 포화일 수 있거나 또는 1개 이상의 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 함유할 수 있다. 헤테로시클릴 폴리시클릭 고리계는 1개의 또는 둘 다의 고리에 1개 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있다. "헤테로시클릴"은 또한 상기 정의된 헤테로시클릴 고리가 1개 이상의 카르보시클릴 기와 융합되고, 부착점이 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴 고리 상에 있는 것인 고리계, 또는 상기 정의된 헤테로시클릴 고리가 1개 이상의 아릴 또는 헤테로아릴 기와 융합되고, 부착점이 헤테로시클릴 고리 상에 있는 것인 고리계를 포함하고, 이러한 예에서, 고리 구성원의 개수는 헤테로시클릴 고리계에 있는 고리 구성원의 개수를 계속해서 지정한다. 달리 명시하지 않는다면, 각각의 경우의 헤테로시클릴은 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 헤테로시클릴") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 헤테로시클릴"). 특정 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 비치환된 3-14원 헤테로시클릴이다. 특정 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 치환된 3-14원 헤테로시클릴이다.
일부 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 고리 탄소 원자 및 1-4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5-10원 비-방향족 고리계이며, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택된다 ("5-10원 헤테로시클릴"). 일부 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 고리 탄소 원자 및 1-4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5-8원 비-방향족 고리계이며, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택된다 ("5-8원 헤테로시클릴"). 일부 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 고리 탄소 원자 및 1-4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5-6원 비-방향족 고리계이며, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택된다 ("5-6원 헤테로시클릴"). 일부 실시양태에서, 5-6원 헤테로시클릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1-3개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 5-6원 헤테로시클릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1-2개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 5-6원 헤테로시클릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1개의 고리 헤테로원자를 갖는다.
용어 "아릴"은 방향족 고리계에 제공된 6-14개의 고리 탄소 원자 및 0개의 헤테로원자를 갖는 ("C6-14 아릴") 모노시클릭 또는 폴리시클릭 (예를 들어, 비시클릭 또는 트리시클릭) 4n+2 방향족 고리계의 라디칼 (예를 들어, 시클릭 어레이에서 공유된 6, 10 또는 14 π 전자를 가짐)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아릴 기는 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C6 아릴"; 예를 들어, 페닐). 일부 실시양태에서, 아릴 기는 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C10 아릴"; 예를 들어 나프틸, 예컨대 1-나프틸 및 2-나프틸). 일부 실시양태에서, 아릴 기는 14개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C14 아릴"; 예를 들어, 안트라실). "아릴"은 또한 상기 정의된 아릴 고리가 1개 이상의 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴 기와 융합되고, 부착 라디칼 또는 부착점이 아릴 고리 상에 있는 것인 고리계를 포함하며, 이러한 예에서 탄소 원자의 개수는 아릴 고리계에 있는 탄소 원자의 개수를 계속해서 지정한다. 달리 명시하지 않는다면, 각각의 경우의 아릴 기는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 아릴") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 아릴"). 특정 실시양태에서, 아릴 기는 비치환된 C6-14 아릴이다. 특정 실시양태에서, 아릴 기는 치환된 C6-14 아릴이다.
용어 "헤테로아릴"은 방향족 고리계에 제공된 고리 탄소 원자 및 1-4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5-14원 모노시클릭 또는 폴리시클릭 (예를 들어, 비시클릭, 트리시클릭) 4n+2 방향족 고리계의 라디칼 (예를 들어, 시클릭 어레이에서 공유된 6, 10 또는 14 π 전자를 가짐)을 지칭하며, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택된다 ("5-14원 헤테로아릴"). 1개 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로아릴 기에서, 부착점은 원자가가 허용되는 대로 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로아릴 폴리시클릭 고리계는 1개의 또는 둘 다의 고리에 1개 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로아릴"은 상기 정의된 헤테로아릴 고리가 1개 이상의 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴 기와 융합되고, 부착점이 헤테로아릴 고리 상에 있는 것인 고리계를 포함하고, 이러한 예에서 고리 구성원의 개수는 헤테로아릴 고리계에 있는 고리 구성원의 개수를 계속해서 지정한다. "헤테로아릴"은 또한 상기 정의된 헤테로아릴 고리가 1개 이상의 아릴 기와 융합되고, 부착점이 아릴 또는 헤테로아릴 고리 상에 있는 것인 고리계를 포함하며, 이러한 예에서 고리 구성원의 개수는 융합된 폴리시클릭 (아릴/헤테로아릴) 고리계에 있는 고리 구성원의 개수를 지정한다. 1개의 고리가 헤테로원자를 함유하지 않는 것인 폴리시클릭 헤테로아릴 기 (예를 들어, 인돌릴, 퀴놀리닐, 카르바졸릴 등)에서 부착점은 어느 하나의 고리, 즉, 헤테로원자를 보유하는 고리 (예를 들어, 2-인돌릴) 또는 헤테로원자를 함유하지 않는 고리 (예를 들어, 5-인돌릴) 상에 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 방향족 고리계에 제공된 고리 탄소 원자 및 1-4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5-10원 방향족 고리계이고, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택된다 ("5-10원 헤테로아릴"). 일부 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 방향족 고리계에 제공된 고리 탄소 원자 및 1-4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5-8원 방향족 고리계이며, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택된다 ("5-8원 헤테로아릴"). 일부 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 방향족 고리계에 제공된 고리 탄소 원자 및 1-4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5-6원 방향족 고리계이며, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택된다 ("5-6원 헤테로아릴"). 일부 실시양태에서, 5-6원 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1-3개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 5-6원 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1-2개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 5-6원 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 달리 명시하지 않는다면, 각각의 경우의 헤테로아릴 기는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 헤테로아릴") 또는 1개 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 헤테로아릴"). 특정 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 비치환된 5-14원 헤테로아릴이다. 특정 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 치환된 5-14원 헤테로아릴이다.
기는 달리 명시적으로 제공되지 않는다면 임의적으로 치환된다. 용어 "임의적으로 치환된"은 치환된 또는 비치환된을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴 기는 임의적으로 치환된다. "임의적으로 치환된"은 치환될 수 있거나 또는 비치환될 수 있는 기를 지칭한다. 일반적으로, 용어 "치환된"은 기 상에 존재하는 적어도 1개의 수소가 허용가능한 치환기, 예를 들어 치환시 안정한 화합물, 예를 들어 자발적으로 예컨대 재배열, 환형화, 제거 또는 다른 반응에 의해 변환되지 않는 화합물을 생성하는 치환기로 대체되는 것을 의미한다. 달리 나타내지 않는다면, "치환된" 기는 기의 1개 이상의 치환가능한 위치에서 치환기를 가지며, 임의의 주어진 구조에서 1개 초과의 위치가 치환될 때, 치환기는 각각의 위치에서 동일하거나 또는 상이하다. 용어 "치환된"은 유기 화합물의 허용가능한 모든 치환기에 의한 치환을 포함하는 것으로 고려되고, 안정한 화합물을 형성하는 본원에 기재된 임의의 치환기를 포함한다. 본 발명은 안정한 화합물에 도달하기 위해 임의의 모든 이러한 조합을 고려한다. 본 발명의 목적을 위해, 헤테로원자, 예컨대 질소는 수소 치환기, 및/또는 헤테로원자의 원자가를 충족시키고 안정한 모이어티를 형성하는 본원에 기재된 임의의 적합한 치환기를 가질 수 있다. 본 발명은 본원에 기재된 예시적인 치환기에 의해 어떠한 방식으로도 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
예시적인 치환기에는 할로겐, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -ORaa, -ON(Rbb)2, -N(Rbb)2, -N(Rbb)3 +X-, -N(ORcc)Rbb, -SH, -SRaa, -SSRcc, -C(=O)Raa, -CO2H, -CHO, -C(ORcc)3, -CO2Raa, -OC(=O)Raa, -OCO2Raa, -C(=O)N(Rbb)2, -OC(=O)N(Rbb)2, -NRbbC(=O)Raa, -NRbbCO2Raa, -NRbbC(=O)N(Rbb)2, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRbb)ORaa, -OC(=NRbb)Raa, -OC(=NRbb)ORaa, -C(=NRbb)N(Rbb)2, -OC(=NRbb)N(Rbb)2, -NRbbC(=NRbb)N(Rbb)2, -C(=O)NRbbSO2Raa, -NRbbSO2Raa, -SO2N(Rbb)2, -SO2Raa, -SO2ORaa, -OSO2Raa, -S(=O)Raa, -OS(=O)Raa, -Si(Raa)3, -OSi(Raa)3 -C(=S)N(Rbb)2, -C(=O)SRaa, -C(=S)SRaa, -SC(=S)SRaa, -SC(=O)SRaa, -OC(=O)SRaa, -SC(=O)ORaa, -SC(=O)Raa, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)(ORcc)2, -OP(=O)(Raa)2, -OP(=O)(ORcc)2, -P(=O)(N(Rbb)2)2, -OP(=O)(N(Rbb)2)2, -NRbbP(=O)(Raa)2, -NRbbP(=O)(ORcc)2, -NRbbP(=O)(N(Rbb)2)2, -P(Rcc)2, -P(ORcc)2, -P(Rcc)3 +X-, -P(ORcc)3 +X-, -P(Rcc)4, -P(ORcc)4, -OP(Rcc)2, -OP(Rcc)3 +X-, -OP(ORcc)2, -OP(ORcc)3 +X-, -OP(Rcc)4, -OP(ORcc)4, -B(Raa)2, -B(ORcc)2, -BRaa(ORcc), C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴이 포함되나 이로 제한되지 않고, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 Rdd 기로 독립적으로 치환되고; X-는 반대 이온이거나;
또는 탄소 원자 상의 2개의 같은 자리 수소는 기 =O, =S, =NN(Rbb)2, =NNRbbC(=O)Raa, =NNRbbC(=O)ORaa, =NNRbbS(=O)2Raa, =NRbb, 또는 =NORcc로 대체되고;
각각의 경우의 Raa는 독립적으로 C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 또는 2개의 Raa 기는 연결되어 3-14원 헤테로시클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하고;
각각의 경우의 Rbb는 독립적으로 수소, -OH, -ORaa, -N(Rcc)2, -CN, -C(=O)Raa, -C(=O)N(Rcc)2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C(=NRcc)ORaa, -C(=NRcc)N(Rcc)2, -SO2N(Rcc)2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C(=S)N(Rcc)2, -C(=O)SRcc, -C(=S)SRcc, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)(ORcc)2, -P(=O)(N(Rcc)2)2, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 또는 2개의 Rbb 기는 연결되어 3-14원 헤테로시클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하고;
각각의 경우의 Rcc는 독립적으로 수소, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 또는 2개의 Rcc 기는 연결되어 3-14원 헤테로시클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하고;
각각의 경우의 Rdd는 독립적으로 할로겐, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -OC1-6 알킬, -ON(C1-6 알킬)2, -N(C1-6 알킬)2, -N(C1-6 알킬)3 +X-, -NH(C1-6 알킬)2 +X-, -NH2(C1-6 알킬)+X-, -NH3 +X-, -N(OC1-6 알킬)(C1-6 알킬), -N(OH)(C1-6 알킬), -NH(OH), -SH, -SC1-6 알킬, -SS(C1-6 알킬), -C(=O)(C1-6 알킬), -CO2H, -CO2(C1-6 알킬), -OC(=O)(C1-6 알킬), -OCO2(C1-6 알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)N(C1-6 알킬)2, -OC(=O)NH(C1-6 알킬), -NHC(=O)(C1-6 알킬), -N(C1-6 알킬)C(=O)(C1-6 알킬), -NHCO2(C1-6 알킬), -NHC(=O)N(C1-6 알킬)2, -NHC(=O)NH(C1-6 알킬), -NHC(=O)NH2, -C(=NH)O(C1-6 알킬), -OC(=NH)(C1-6 알킬), -OC(=NH)OC1-6 알킬, -C(=NH)N(C1-6 알킬)2, -C(=NH)NH(C1-6 알킬), -C(=NH)NH2, -OC(=NH)N(C1-6 알킬)2, -OC(=NH)NH(C1-6 알킬), -OC(=NH)NH2, -NHC(=NH)N(C1-6 알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -NHSO2(C1-6 알킬), -SO2N(C1-6 알킬)2, -SO2NH(C1-6 알킬), -SO2NH2, -SO2(C1-6 알킬), -SO2O(C1-6 알킬), -OSO2(C1-6 알킬), -SO(C1-6 알킬), -Si(C1-6 알킬)3, -OSi(C1-6 알킬)3 -C(=S)N(C1-6 알킬)2, C(=S)NH(C1-6 알킬), C(=S)NH2, -C(=O)S(C1-6 알킬), -C(=S)SC1-6 알킬, -SC(=S)SC1-6 알킬, -P(=O)(OC1-6 알킬)2, -P(=O)(C1-6 알킬)2, -OP(=O)(C1-6 알킬)2, -OP(=O)(OC1-6 알킬)2, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 헤테로C1-6 알킬, 헤테로C2-6 알케닐, 헤테로C2-6 알키닐, C3-10 카르보시클릴, C6-10 아릴, 3-10원 헤테로시클릴, 5-10원 헤테로아릴이거나;
또는 2개의 같은 자리 Rdd 치환기는 연결되어 =O 또는 =S를 형성할 수 있다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 플루오린 (플루오로, -F), 염소 (클로로, -Cl), 브로민 (브로모, -Br), 또는 아이오딘 (아이오도, -I)을 지칭한다.
용어 "히드록실" 또는 "히드록시"는 기 -OH를 지칭한다. 더 나아가 용어 "치환된 히드록실" 또는 "치환된 히드록실"은 모 분자에 직접적으로 부착된 산소 원자가 수소 이외에 기로 치환된 것인 히드록실 기를 지칭하며, -ORaa, -ON(Rbb)2, -OC(=O)SRaa, -OC(=O)Raa, -OCO2Raa, -OC(=O)N(Rbb)2, -OC(=NRbb)Raa, -OC(=NRbb)ORaa, -OC(=NRbb)N(Rbb)2, -OS(=O)Raa, -OSO2Raa, -OSi(Raa)3, -OP(Rcc)2, -OP(Rcc)3 +X-, -OP(ORcc)2, -OP(ORcc)3 +X-, -OP(=O)(Raa)2, -OP(=O)(ORcc)2, 및 -OP(=O)(N(Rbb)2)2로부터 선택된 기를 포함하고, X-, Raa, Rbb 및 Rcc는 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "아미노"는 기 -NH2를 지칭한다. 더 나아가 용어 "치환된 아미노"는 일치환된 아미노, 이치환된 아미노 또는 삼치환된 아미노를 지칭한다. 특정 실시양태에서, "치환된 아미노"는 일치환된 아미노 또는 이치환된 아미노 기이다. 용어 "일치환된 아미노"는 모 분자에 직접적으로 부착된 질소 원자가 1개의 수소 및 수소 이외의 1개의 기로 치환된 것인 아미노 기를 지칭하며, -NH(Rbb), -NHC(=O)Raa, -NHCO2Raa, -NHC(=O)N(Rbb)2, -NHC(=NRbb)N(Rbb)2, -NHSO2Raa, -NHP(=O)(ORcc)2, 및 -NHP(=O)(N(Rbb)2)2로부터 선택된 기를 포함하고, Raa, Rbb 및 Rcc는 본원에 정의된 바와 같으며, 기 -NH(Rbb)의 Rbb는 수소가 아니다. 용어 "이치환된 아미노"는 모 분자에 직접적으로 부착된 질소 원자가 수소 이외의 2개의 기로 치환된 것인 아미노 기를 지칭하며, -N(Rbb)2, -NRbbC(=O)Raa, -NRbbCO2Raa, -NRbbC(=O)N(Rbb)2, -NRbbC(=NRbb)N(Rbb)2, -NRbbSO2Raa, -NRbbP(=O)(ORcc)2, 및 -NRbbP(=O)(N(Rbb)2)2로부터 선택된 기를 포함하고, Raa, Rbb 및 Rcc는 본원에서 정의된 바와 같되, 단, 모 분자에 직접적으로 부착된 질소 원자는 수소로 치환되지 않는다. 용어 "삼치환된 아미노"는 모 분자에 직접적으로 부착된 질소 원자가 3개의 기로 치환된 것인 아미노 기를 지칭하며, -N(Rbb)3 및 -N(Rbb)3 +X-로부터 선택된 기를 포함하고, Rbb 및 X-는 본원에서 정의된 바와 같다.
용어 "티오" 또는 "티올"은 기 -SH를 지칭한다. 더 나아가 용어 "치환된 티오" 또는 "치환된 티올"은 모 분자에 직접적으로 부착된 황 원자가 수소 이외의 기로 치환된 것인 티올 기를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 황 원자 상의 치환기는 황 보호기 ("티올 보호기"로도 지칭됨)이다. 황 보호기에는 -Raa, -N(Rbb)2, -C(=O)SRaa, -C(=O)Raa, -CO2Raa, -C(=O)N(Rbb)2, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRbb)ORaa, -C(=NRbb)N(Rbb)2, -S(=O)Raa, -SO2Raa, -Si(Raa)3, -P(Rcc)2, -P(Rcc)3 +X-, -P(ORcc)2, -P(ORcc)3 +X-, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)(ORcc)2, 및 -P(=O)(N(Rbb)2)2가 포함되나 이로 제한되지 않고, Raa, Rbb 및 Rcc는 본원에서 정의된 바와 같다.
용어 "아실"은 일반 화학식 -C(=O)RX1, -C(=O)ORX1, -C(=O)-O-C(=O)RX1, -C(=O)SRX1, -C(=O)N(RX1)2, -C(=S)RX1, -C(=S)N(RX1)2, -C(=S)O(RX1), -C(=S)S(RX1), -C(=NRX1)RX1, -C(=NRX1)ORX1, -C(=NRX1)SRX1, 및 -C(=NRX1)N(RX1)2를 갖는 기를 지칭하며, RX1은 수소; 할로겐; 치환된 또는 비치환된 히드록실; 치환된 또는 비치환된 티올; 치환된 또는 비치환된 아미노; 치환된 또는 비치환된 아실, 시클릭 또는 아시클릭, 치환된 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 지방족; 시클릭 또는 아시클릭, 치환된 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족; 시클릭 또는 아시클릭, 치환된 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 알킬; 시클릭 또는 아시클릭, 치환된 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 알케닐; 치환된 또는 비치환된 알키닐; 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 지방족옥시, 헤테로지방족옥시, 알킬옥시, 헤테로알킬옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 지방족티옥시, 헤테로지방족티옥시, 알킬티옥시, 헤테로알킬티옥시, 아릴티옥시, 헤테로아릴티옥시, 모노- 또는 디- 지방족아미노, 모노- 또는 디- 헤테로지방족아미노, 모노- 또는 디- 알킬아미노, 모노- 또는 디- 헤테로알킬아미노, 모노- 또는 디-아릴아미노, 또는 모노- 또는 디-헤테로아릴아미노이거나; 또는 2개의 RX1 기는 함께 5 내지 6원 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 예시적인 아실 기에는 알데히드 (-CHO), 카르복실산 (-CO2H), 케톤, 아실 할라이드, 에스테르, 아미드, 이민, 카르보네이트, 카르바메이트, 및 우레아가 포함된다. 아실 치환기에는 안정한 모이어티를 형성하는 본원에 기재된 임의의 치환기 (예를 들어, 지방족, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로지방족, 헤테로시클릭, 아릴, 헤테로아릴, 아실, 옥소, 이미노, 티오옥소, 시아노, 이소시아노, 아미노, 아지도, 니트로, 히드록실, 티올, 할로, 지방족아미노, 헤테로지방족아미노, 알킬아미노, 헤테로알킬아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 알킬아릴, 아릴알킬, 지방족옥시, 헤테로지방족옥시, 알킬옥시, 헤테로알킬옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 지방족티옥시, 헤테로지방족티옥시, 알킬티옥시, 헤테로알킬티옥시, 아릴티옥시, 헤테로아릴티옥시, 아실옥시 등, 이들 각각은 추가로 치환될 수 있거나 치환되지 않을 수 있음)가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
용어 "아미노산"은 아미노 기 및 카르복실 기 둘 다를 함유하는 분자를 지칭한다. 아미노산에는 알파-아미노산 및 베타-아미노산이 포함되며, 그의 구조는 하기에 도시된다. 특정 실시양태에서, 아미노산은 알파 아미노산이다.
Figure pct00002
적합한 아미노산에는 비제한적으로 천연 알파-아미노산, 예컨대 펩티드에서 발견되는 20개의 일반적인 천연 발생 알파-아미노산 (예를 들어, 하기 제공되는 바와 같이 A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V)의 D- 및 L-이성질체, 비천연 알파-아미노산, 천연 베타-아미노산 (예를 들어, 베타-알라닌), 및 비천연 베타-아미노산이 포함된다. 예시적인 천연 알파-아미노산에는 L-알라닌 (A), L-아르기닌 (R), L-아스파라긴 (N), L-아스파르트산 (D), L-시스테인 (C), L-글루탐산 (E), L-글루타민 (Q), 글리신 (G), L-히스티딘 (H), L-이소류신 (I), L-류신 (L), L-리신 (K), L-메티오닌 (M), L-페닐알라닌 (F), L-프롤린 (P), L-세린 (S), L-트레오닌 (T), L-트립토판 (W), L-티로신 (Y), 및 L-발린 (V)이 포함된다. 예시적인 비천연 알파-아미노산에는 D-아르기닌, D-아스파라긴, D-아스파르트산, D-시스테인, D-글루탐산, D-글루타민, D-히스티딘, D-이소류신, D-류신, D-리신, D-메티오닌, D-페닐알라닌, D-프롤린, D-세린, D-트레오닌, D-트립토판, D-티로신, D-발린, D-비닐, α-메틸-알라닌 (Aib), α-메틸-아르기닌, α-메틸-아스파라긴, α-메틸-아스파르트산, α-메틸-시스테인, α-메틸-글루탐산, α-메틸-글루타민, α-메틸-히스티딘, α-메틸-이소류신, α-메틸-류신, α-메틸-리신, α-메틸-메티오닌, α-메틸-페닐알라닌, α-메틸-프롤린, α-메틸-세린, α-메틸-트레오닌, α-메틸-트립토판, α-메틸-티로신, α-메틸-발린, 노르류신, 말단 불포화된 알파-아미노산 및 비스 알파-아미노산 (예를 들어, 변형된 시스테인, 변형된 리신, 변형된 트립토판, 변형된 세린, 변형된 트레오닌, 변형된 프롤린, 변형된 히스티딘, 변형된 알라닌 등)이 포함된다. 여러 공지된 비천연 아미노산이 있으며, 이 중 임의의 것은 본 발명의 펩티드에 포함될 수 있다. 예를 들어, [S. Hunt, The Non-Protein Amino Acids: In Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, edited by G. C. Barrett, Chapman and Hall, 1985]를 참고한다.
특정 실시양태에서, 질소 원자 상의 치환기는 질소 보호기 (본원에서 "아미노 보호기"로도 지칭됨)이다. 질소 보호기에는 -OH, -ORaa, -N(Rcc)2, -C(=O)Raa, -C(=O)N(Rcc)2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C(=NRcc)Raa, -C(=NRcc)ORaa, -C(=NRcc)N(Rcc)2, -SO2N(Rcc)2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C(=S)N(Rcc)2, -C(=O)SRcc, -C(=S)SRcc, C1-10 알킬 (예를 들어, 아르알킬, 헤테로아르알킬), C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴 기가 포함되나 이로 제한되지 않고, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아르알킬, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 Rdd 기로 독립적으로 치환되고, Raa, Rbb, Rcc 및 Rdd는 본원에서 정의된 바와 같다. 질소 보호기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, [Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에 상세하게 기재된 것들을 포함하며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
예를 들어, 보호기 (예를 들어, 질소 또는 산소 보호기), 예컨대 아미드 기 (예를 들어, -C(=O)Raa)에는 포름아미드, 아세트아미드, 클로로아세트아미드, 트리클로로아세트아미드, 트리플루오로아세트아미드, 페닐아세트아미드, 3-페닐프로판아미드, 피콜린아미드, 3-피리딜카르복스아미드, N-벤조일페닐알라닐 유도체, 벤즈아미드, p-페닐벤즈아미드, o-니트로페닐아세트아미드, o-니트로페녹시아세트아미드, 아세토아세트아미드, (N'-디티오벤질옥시아실아미노)아세트아미드, 3-(p-히드록시페닐)프로판아미드, 3-(o-니트로페닐)프로판아미드, 2-메틸-2-(o-니트로페녹시)프로판아미드, 2-메틸-2-(o-페닐아조페녹시)프로판아미드, 4-클로로부탄아미드, 3-메틸-3-니트로부탄아미드, o-니트로신나미드, N-아세틸메티오닌 유도체, o-니트로벤즈아미드 및 o-(벤조일옥시메틸)벤즈아미드가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
보호기 (예를 들어, 질소 또는 산소 보호기), 예컨대 카르바메이트 기 (예를 들어, -C(=O)ORaa)에는 메틸 카르바메이트, 에틸 카르바메이트, 9-플루오레닐메틸 카르바메이트 (Fmoc), 9-(2-술포)플루오레닐메틸 카르바메이트, 9-(2,7-디브로모)플루오레닐메틸 카르바메이트, 2,7-디-t-부틸-[9-(10,10-디옥소-10,10,10,10-테트라히드로티옥산틸)]메틸 카르바메이트 (DBD-Tmoc), 4-메톡시펜아실 카르바메이트 (Phenoc), 2,2,2-트리클로로에틸 카르바메이트 (Troc), 2-트리메틸실릴에틸 카르바메이트 (Teoc), 2-페닐에틸 카르바메이트 (hZ), 1-(1-아다만틸)-1-메틸에틸 카르바메이트 (Adpoc), 1,1-디메틸-2-할로에틸 카르바메이트, 1,1-디메틸-2,2-디브로모에틸 카르바메이트 (DB-t-BOC), 1,1-디메틸-2,2,2-트리클로로에틸 카르바메이트 (TCBOC), 1-메틸-1-(4-비페닐릴)에틸 카르바메이트 (Bpoc), 1-(3,5-디-t-부틸페닐)-1-메틸에틸 카르바메이트 (t-Bumeoc), 2-(2'- 및 4'-피리딜)에틸 카르바메이트 (Pyoc), 2-(N,N-디시클로헥실카르복스아미도)에틸 카르바메이트, t-부틸 카르바메이트 (BOC 또는 Boc), 1-아다만틸 카르바메이트 (Adoc), 비닐 카르바메이트 (Voc), 알릴 카르바메이트 (Alloc), 1-이소프로필알릴 카르바메이트 (Ipaoc), 신나밀 카르바메이트 (Coc), 4-니트로신나밀 카르바메이트 (Noc), 8-퀴놀릴 카르바메이트, N-히드록시피페리디닐 카르바메이트, 알킬디티오 카르바메이트, 벤질 카르바메이트 (Cbz), p-메톡시벤질 카르바메이트 (Moz), p-니트로벤질 카르바메이트, p-브로모벤질 카르바메이트, p-클로로벤질 카르바메이트, 2,4-디클로로벤질 카르바메이트, 4-메틸술피닐벤질 카르바메이트 (Msz), 9-안트릴메틸 카르바메이트, 디페닐메틸 카르바메이트, 2-메틸티오에틸 카르바메이트, 2-메틸술포닐에틸 카르바메이트, 2-(p-톨루엔술포닐)에틸 카르바메이트, [2-(1,3-디티아닐)]메틸 카르바메이트 (Dmoc), 4-메틸티오페닐 카르바메이트 (Mtpc), 2,4-디메틸티오페닐 카르바메이트 (Bmpc), 2-포스포니오에틸 카르바메이트 (Peoc), 2-트리페닐포스포니오이소프로필 카르바메이트 (Ppoc), 1,1-디메틸-2-시아노에틸 카르바메이트, m-클로로-p-아실옥시벤질 카르바메이트, p-(디히드록시보릴)벤질 카르바메이트, 5-벤즈이속사졸릴메틸 카르바메이트, 2-(트리플루오로메틸)-6-크로모닐메틸 카르바메이트 (Tcroc), m-니트로페닐 카르바메이트, 3,5-디메톡시벤질 카르바메이트, o-니트로벤질 카르바메이트, 3,4-디메톡시-6-니트로벤질 카르바메이트, 페닐(o-니트로페닐)메틸 카르바메이트, t-아밀 카르바메이트, S-벤질 티오카르바메이트, p-시아노벤질 카르바메이트, 시클로부틸 카르바메이트, 시클로헥실 카르바메이트, 시클로펜틸 카르바메이트, 시클로프로필메틸 카르바메이트, p-데실옥시벤질 카르바메이트, 2,2-디메톡시아실비닐 카르바메이트, o-(N,N-디메틸카르복스아미도)벤질 카르바메이트, 1,1-디메틸-3-(N,N-디메틸카르복스아미도)프로필 카르바메이트, 1,1-디메틸프로피닐 카르바메이트, 디(2-피리딜)메틸 카르바메이트, 2-푸라닐메틸 카르바메이트, 2-아이오도에틸 카르바메이트, 이소보리닐 카르바메이트, 이소부틸 카르바메이트, 이소니코티닐 카르바메이트, p-(p'-메톡시페닐아조)벤질 카르바메이트, 1-메틸시클로부틸 카르바메이트, 1-메틸시클로헥실 카르바메이트, 1-메틸-1-시클로프로필메틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(3,5-디메톡시페닐)에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(p-페닐아조페닐)에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-페닐에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(4-피리딜)에틸 카르바메이트, 페닐 카르바메이트, p-(페닐아조)벤질 카르바메이트, 2,4,6-트리-t-부틸페닐 카르바메이트, 4-(트리메틸암모늄)벤질 카르바메이트, 및 2,4,6-트리메틸벤질 카르바메이트가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
보호기 (예를 들어, 질소 또는 산소 보호기), 예컨대 술폰아미드 기 (예를 들어, -S(=O)2Raa)에는 p-톨루엔술폰아미드 (Ts), 벤젠술폰아미드, 2,3,6-트리메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mtr), 2,4,6-트리메톡시벤젠술폰아미드 (Mtb), 2,6-디메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Pme), 2,3,5,6-테트라메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mte), 4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mbs), 2,4,6-트리메틸벤젠술폰아미드 (Mts), 2,6-디메톡시-4-메틸벤젠술폰아미드 (iMds), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술폰아미드 (Pmc), 메탄술폰아미드 (Ms), β-트리메틸실릴에탄술폰아미드 (SES), 9-안트라센술폰아미드, 4-(4',8'-디메톡시나프틸메틸)벤젠술폰아미드 (DNMBS), 벤질술폰아미드, 트리플루오로메틸술폰아미드, 및 펜아실술폰아미드가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
다른 보호기 (예를 들어, 질소 또는 산소 보호기)에는 페노티아지닐-(10)-아실 유도체, N'-p-톨루엔술포닐아미노아실 유도체, N'-페닐아미노티오아실 유도체, N-벤조일페닐알라닐 유도체, N-아세틸메티오닌 유도체, 4,5-디페닐-3-옥사졸린-2-온, N-프탈이미드, N-디티아숙신이미드 (Dts), N-2,3-디페닐말레이미드, N-2,5-디메틸피롤, N-1,1,4,4-테트라메틸디실릴아자시클로펜탄 부가물 (STABASE), 5-치환된 1,3-디메틸-1,3,5-트리아자시클로헥산-2-온, 5-치환된 1,3-디벤질-1,3,5-트리아자시클로헥산-2-온, 1-치환된 3,5-디니트로-4-피리돈, N-메틸아민, N-알릴아민, N-[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸아민 (SEM), N-3-아세톡시프로필아민, N-(1-이소프로필-4-니트로-2-옥소-3-피로올린-3-일)아민, 4급 암모늄 염, N-벤질아민, N-디(4-메톡시페닐)메틸아민, N-5-디벤조수베릴아민, N-트리페닐메틸아민 (Tr), N-[(4-메톡시페닐)디페닐메틸]아민 (MMTr), N-9-페닐플루오레닐아민 (PhF), N-2,7-디클로로-9-플루오레닐메틸렌아민, N-페로세닐메틸아미노 (Fcm), N-2-피콜릴아미노 N'-옥시드, N-1,1-디메틸티오메틸렌아민, N-벤질리덴아민, N-p-메톡시벤질리덴아민, N-디페닐메틸렌아민, N-[(2-피리딜)메시틸]메틸렌아민, N-(N',N'-디메틸아미노메틸렌)아민, N,N'-이소프로필리덴디아민, N-p-니트로벤질리덴아민, N-살리실리덴아민, N-5-클로로살리실리덴아민, N-(5-클로로-2-히드록시페닐)페닐메틸렌아민, N-시클로헥실리덴아민, N-(5,5-디메틸-3-옥소-1-시클로헥세닐)아민, N-보란 유도체, N-디페닐보린산 유도체, N-[페닐(펜타아실크로뮴- 또는 텅스텐)아실]아민, N-구리 킬레이트, N-아연 킬레이트, N-니트로아민, N-니트로소아민, 아민 N-옥시드, 디페닐포스핀아미드 (Dpp), 디메틸티오포스핀아미드 (Mpt), 디페닐티오포스핀아미드 (Ppt), 디알킬 포스포르아미데이트, 디벤질 포스포르아미데이트, 디페닐 포스포르아미데이트, 벤젠술펜아미드, o-니트로벤젠술펜아미드 (Nps), 2,4-디니트로벤젠술펜아미드, 펜타클로로벤젠술펜아미드, 2-니트로-4-메톡시벤젠술펜아미드, 트리페닐메틸술펜아미드, 및 3-니트로피리딘술펜아미드 (Npys)가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 보호기 (예를 들어, 질소 또는 산소 보호기)는 벤질 (Bn), tert-부틸옥시카르보닐 (BOC), 카르보벤질옥시 (Cbz), 9-플루레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc), 트리플루오로아세틸, 트리페닐메틸, 아세틸 (Ac), 벤조일 (Bz), p-메톡시벤질 (PMB), 3,4-디메톡시벤질 (DMPM), p-메톡시페닐 (PMP), 2,2,2-트리클로로에틸옥시카르보닐 (Troc), 트리페닐메틸 (Tr), 토실 (Ts), 브로실 (Bs), 노실 (Ns), 메실 (Ms), 트리플릴 (Tf), 또는 단실 (Ds)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "염"은 임의의 모든 염을 지칭하며, 제약상 허용가능한 염을 포함한다. 용어 "제약상 허용가능한 염"은 건전한 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 이들 염을 지칭한다. 제약상 허용가능한 염은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Berge 등은 본원에 참고로 포함된 [J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19]에서 제약상 허용가능한 염을 상세하게 기재한다. 본 발명의 화합물의 제약상 허용가능한 염에는 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된 것들이 포함된다. 제약상 허용가능한 무독성 산 부가 염의 예는 무기 산, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 함께 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산과 함께, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법, 예컨대 이온 교환을 이용하여 형성된 아미노 기의 염이다. 다른 제약상 허용가능한 염에는 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 비술페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로아이오다이드, 2-히드록시-에탄술포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 술페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔술포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등이 포함된다. 적절한 염기로부터 유래된 염에는 알칼리 금속, 알칼리토 금속, 암모늄, 및 N+(C1-4 알킬)4 - 염이 포함된다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리토 금속 염에는 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등이 포함된다. 추가로 제약상 허용가능한 염에는 적절한 경우 무독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 반대 이온, 예컨대 할라이드, 히드록시드, 카르복실레이트, 술페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 술포네이트 및 아릴 술포네이트를 이용하여 형성된 아민 양이온이 포함된다.
본 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명의 몇몇 실시양태를 예시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1. 방해하는 반응 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에서 천연 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (rNTP)의 제어된 혼입에 대한 반응 다이어그램. rNTP 혼입 속도 (Kn)는 가수분해성 뉴클레오티드 혼입의 경쟁적 억제제로서 작용하는 비-가수분해성 또는 비적합성 뉴클레오티드, 예컨대 트리포스페이트의 α-, β- 또는 γ-포스페이트의 변형을 갖는 것들의 부가를 통해 제어된다. 혼입 사건의 수 (여기서, n = 0개 내지 수백개)는 연장 반응에 존재하는 비-가수분해성 또는 비적합성 뉴클레오티드의 백분율 (0% - 100%)에 의해 결정되고, 그에 따라 경쟁적 억제제 뉴클레오티드의 더 높은 백분율은 반응에 의해 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드의 길이를 제한한다. 개시자 올리고뉴클레오티드가 절단가능한 공유 연결 (X)을 통해 표면에 부착될 때, RNA 올리고뉴클레오티드 염기 조성은 반응 조건의 급속한 전환을 통해 가변적일 수 있다.
도 2. 1개 뉴클레오티드의 부가만으로 연장 반응을 제한하는, 개시자 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 변형된 rNTP의 혼입에 대한 반응 다이어그램. 연장된 올리고뉴클레오티드가 순한 RNA 내성 탈보호제로 처리되어 천연 히드록실 기를 생성할 때까지, 변형된 rNTP의 혼입은 추가의 연장 사건을 가역적으로 방지한다. 개시자 올리고뉴클레오티드가 절단가능한 공유 연결 (X)을 통해 표면에 부착될 때, 성장하는 RNA 올리고뉴클레오티드는 이전의 혼입 사건으로부터의 뉴클레오티드를 제거하기 위해 정제할 필요없이 반복적으로 연장될 수 있다. 가역적인 종결자 rNTP는 예를 들어 뉴클레오티드 (예를 들어, 뉴클레오티드 염기) 상의 다른 부위에 대한 변형 외에도 뉴클레오티드의 2'-, 3'-, 또는 2'- 및 3'-위치 (R 및 R')에서 비-천연 화학적 도메인을 가질 수 있다. 각각의 변형은 효소 촉매작용 이후에 순한 탈보호 처리 및 후속적인 연장 이전에 (n+1) 혼입 사건을 광학적으로 증명하기 위해 링커 및 형광단을 포함하도록 추가로 유도체화될 수 있다.
도 3a 내지 3c. 도 3a는 200 μM dNTP에 의해 감소하는 농도에서 다양한 2가 양이온 및 2가 양이온의 조합물을 갖는 폴리머라제 μ R387K의 초기 활성 스크린의 막대 플롯을 도시한다. dATP 및 rATP에 대해 각각 200-50 μM 및 5.0-0.62 mM의 뉴클레오티드 농도에서 dATP 혼입 (도 3b) 및 rATP 혼입 (도 3c)의 변성 겔 전기영동 분석. 이들 반응은 0.25 mM Mn2+ 및 Mg2+에 의해 보충되었다. 대조군 반응은 뉴클레오티드를 제외한 모든 반응 성분으로 구성되었다. 모든 반응의 경우, 개시자 올리고뉴클레오티드는 HPLC-정제된 폴리 dT-15량체였다.
도 4a 및 4b. 도 4a는 에스. 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제에 의한 변형된 뉴클레오티드 (2'-아미노-rATP, 2'-O-메틸-rATP 2'-F-rATP, & 2'-아지도-rATP) 혼입의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 모든 2'- 변형된 리보뉴클레오티드는 2.5 mM의 최종 농도였고, 37℃에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 대조군 반응은 뉴클레오티드를 제외한 모든 반응 성분으로 구성되었다. 도 4b는 37℃에서 60 분 동안 인큐베이션한 뉴클레오티드 농도 범위에 걸쳐 (250 μM 내지 4000 μM) 에스. 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제에 의한 가역적인 종결자 2'-O-알릴-ATP 혼입의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 음성 반응은 뉴클레오티드를 제외한 모든 반응 성분으로 구성되었다.
도 5a 및 5b. 도 5a는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의한 천연 리보뉴클레오티드 혼입의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 모든 천연 리보뉴클레오티드는 1.0 mM의 최종 농도였고, 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 대조군 반응은 뉴클레오티드를 제외한 모든 반응 성분으로 구성되었다. 도 5b는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의한 천연 리보뉴클레오티드 혼입의 동역학적 분석을 도시하며; 시간의 함수로서 단일-가닥 RNA의 총 농도를 측정한다. 오차 막대는 N=3에서 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 6. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의한 변형된 리보뉴클레오티드 (2'-O-메틸) 혼입의 변성 겔 전기영동 분석. 모든 변형된 리보뉴클레오티드는 2.5 mM의 최종 농도였고, 37℃에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 대조군 반응은 뉴클레오티드를 제외한 모든 반응 성분으로 구성되었다.
도 7a 및 7b. 도 7a는 2가지 상이한 개시자 올리고뉴클레오티드 (5'-FAM-rA-15량체 및 5'-Cy5-rU-15량체)의 존재하에 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의한 천연 리보뉴클레오티드 혼입의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 4가지 모든 천연 리보뉴클레오티드는 1.0 mM의 최종 농도였고, 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 대조군 반응은 각각의 개시자 올리고뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드를 제외한 모든 반응 성분으로 구성되었다. 도 7b는 강한 헤어핀 형성을 통해 이차 구조를 갖는 개시자 올리고뉴클레오티드를 사용하여 가역적인 종결자 2'-O-알릴-ATP 또는 -UTP 혼입의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 3'-말단과 비교하여 헤어핀의 위치를 변경시켜 하기를 생성하도록 하는 것을 제외하고는 유사한 서열을 갖는다: 3'-말단으로부터 1개 염기 (H1), 3'-말단으로부터 5개 염기 (H5), 3'-말단으로부터 10개 염기 (H10), 및 3'-말단으로부터 20개 염기. 서열 염기 조성이 도시된다. 효소적 연장 전에 올리고뉴클레오티드의 헤어핀이 정확하게 형성되도록 보장하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 95℃로 가열한 다음, 열순환기 상에서 적절한 효소적 반응 완충제 중에서 0.1℃/분의 속도로 15℃로 천천히 냉각시켰다. 냉각시킨 후, 나머지 반응 성분을 헤어핀 개시자 올리고뉴클레오티드에 첨가하였고, 연장 반응을 37℃에서 5 분 동안 수행하였다.
도 8a 내지 8c. 도 8a는 각각의 천연 리보뉴클레오티드에 대해 무기 피로포스파타제 (PPi-ase)와 함께 (+) 및 없이 (-) 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 RNA 합성 반응의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 대조군 반응은 뉴클레오티드를 제외한 모든 반응 성분으로 구성되었다. PPi-ase의 존재하에 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의한 ATP (도 8b) 및 UTP (도 8c) 혼입의 증가된 속도를 입증하는 동역학 분석.
도 9a 및 9b. 도 9a는 뉴클레오티드의 다양한 농도에서 비변형된 rUTP 및 염기-변형된 수도우리딘 (PsUTP)과의 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 RNA 합성 반응의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 반응을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 도 9b는 변형된 아데노신, 우리딘, 시티딘, 구아노신, 또는 보편적인 염기 이노신을 갖는 뉴클레오시드 트리포스페이트의 어레이에 의해 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 RNA 합성 반응의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 나타낸 목록 번호는 겔 레인에 상응하고, 폴리(U) 폴리머라제의 활성을 1 mM의 각각의 개별 뉴클레오티드의 존재하에 분석하였다. 비교 목적을 위해, 천연 뉴클레오시드 트리포스페이트를 인큐베이션하고, 동시에 분석하였다. 겔 상에 "C"로 표시된 대조군 반응은 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제외한 모든 RNA 합성 반응 성분과의 이들 반응을 나타낸다. 개시자 올리고뉴클레오티드는 5'-Cy5 형광단을 갖는 폴리-rU-15량체였다. 모든 반응을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
도 10. 증가하는 농도의 비-가수분해성 리보뉴클레오티드 우리딘-5'-[(α,β)-이미도]트리포스페이트 및 UTP와 함께 인큐베이션된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 RNA 합성 반응의 변성 겔 전기영동 분석. 반응을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였고, 대조군 반응은 비-가수분해성 리보뉴클레오티드를 제외하고는 모든 반응 성분으로 구성되었다.
도 11a 내지 11e. 도 11a는 폴리-rU-15량체 또는 폴리-rA-15량체 개시자 올리고뉴클레오티드와 함께 농도 1 mM에서 2'-O-알릴-ATP, 2'-차단된 가역적인 종결자와 함께 인큐베이션된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 RNA 합성 반응의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 효소 활성을 입증하기 위해, 2'-O-메틸-ATP로 보충된 대조군 반응 (에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의해 혼입되는 것으로 이전에 확인됨)이 도시된다. 추가로, 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제외한 모든 반응 성분으로 보충된 음성 대조군 반응이 변성 겔 상에 포함되었다. 가역적인 종결자 반응의 경우, 두번째 밴드는 음성 대조군 반응과 비교하여 (n+1) 연장 사건을 일으키는 양성 혼입을 나타낸다. 모든 RNA 합성 반응을 10 pmol의 개시자 올리고뉴클레오티드와 함께 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 도 11b는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의한 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자 혼입의 동역학의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 반응을 0.5, 5, 10, 30 및 60 분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 시점의 경우, 음성 대조군은 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자를 제외하고 모든 반응 성분에 포함되었고, 겔 상에 마이너스 (-) 기호로 표시된다. 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자와 함께 인큐베이션된 반응은 겔 상에 플러스 (+) 기호로 표시된다. 모든 반응의 경우, 개시자 올리고뉴클레오티드는 5'-Cy5 형광단으로 표지된 폴리-rU-15량체였다. 도 11c는 혼입된 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자의 생체적합성 탈차단에서 완충제 조성 및 pH의 최적화의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 탈차단 반응을 50℃에서 10 분 동안 인큐베이션한 다음, 올리고뉴클레오티드 물질을 정제하고, 농축시킨 다음, 폴리(U) 폴리머라제 최상 반응 조건을 이용하여 추가로 연장시켰다. 각각의 완충제의 경우, 음성 대조군은 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자를 제외한 모든 반응 성분에 포함되었고, 겔 상에 마이너스 (-) 기호로 표시된다. 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자와 함께 인큐베이션된 반응은 겔 상에 플러스 (+) 기호로 표시된다. 전체 합성 주기를 시각화하기 위해 (S)로 표시된 출발 물질이 포함되었다. 출발 물질 (S 또는 n+0)에서 (n+2)까지의 합성 주기의 고해상도 변성 겔 전기영동 분석이 도 11d에 도시된다. 이전과 마찬가지로, 음성 대조군은 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자를 제외한 모든 반응 성분에 포함되었고, 겔 상에 마이너스 (-) 기호로 표시된다. 도 11e는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 및 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자를 사용하는 (n+5) 올리고뉴클레오티드 합성의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 각각의 주기는 37℃에서 1 분 동안 벌크 용액 연장 반응 및 50℃에서 10 분 동안 최적화된 조건을 이용하는 벌크 용액 탈차단 반응으로 구성되었다. 각각의 주기 후에, 적은 분취량의 물질을 겔 분석을 위해 따로 두었다. (n+0) 출발 물질은 20-nt 길이였고, (n+5) 최종 생성물은 25-nt 길이였다.
도 12a 및 12b. 도 12a는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제를 사용하는 2'-O-알릴-ATP, -UTP, -CTP, 및 -GTP 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트의 (n+1) 혼입의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 모든 연장 반응은 유사하게 처리하였고, 37℃에서 1 분 동안 1 mM 뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하였다. 대조군 반응은 뉴클레오티드를 제외한 모든 반응 성분을 함유하였다. 도 12b는 2'-O-알릴-ATP 및 -UTP 가역적인 종결자의 조합물을 사용하는 이원 (n+2) 합성의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 하기 조합물을 시험하였다: 벌크 용액 중에서 최적화된 효소적 연장 및 탈차단 반응 조건을 이용하여 (n+2) A-A, (n+2) A-U, (n+2) U-A, 및 (n+2) U-U. 2'-O-알릴-ATP 및 -UTP 가역적인 종결자에 대한 (n+1) 반응은 비교를 위해 도시된다.
도 13a 및 13b. 도 13a는 "정제된" 레인 아래에서 사각형으로 표시된 밝은 밴드에 의해 나타낸 바와 같이 N-말단 His6-태그 부착된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제의 발현 및 정제의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 발현된 N-말단 His6-태그 부착된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제의 예상 분자량은 대략 45 kDa이다. 도 13b는 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트의 혼입을 통해 N-말단 His6-태그 부착된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 활성의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 농축된 N-말단 His6-태그 부착된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의해 수행되는 바와 같이 개시자 올리고뉴클레오티드 물질의 함수로서 상대적인 전환율을 결정하기 위해 증가하는 양의 개시자 올리고뉴클레오티드 (20 pmol 내지 1000 pmol)로 반응을 보충하였다. 모든 반응 부피는 10 μL였고, 개시자 올리고뉴클레오티드는 5'-Cy5 형광단으로 표지된 폴리-rU-15량체였다. 반응을 37℃에서 30 초 동안 인큐베이션하였다. 대조군 반응은 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 제외한 모든 반응 성분 (개시자 올리고뉴클레오티드는 20 pmol이었음)을 함유하였다.
도 14a 및 14b. 도 14a는 효소적 RNA 올리고뉴클레오티드 시스템을 위한 고체-상 지지체 시스템의 개발을 도시한다. 5'-아민 개시자 올리고뉴클레오티드를 비오틴-PEG-NHS 링커로 표지하였고, 이는 개시자 올리고뉴클레오티드가 용기, 예컨대 마이크로플레이트 웰, 비드, 유리 슬라이드 등에서 스트렙타비딘 표면에 고정되게 한다. 올리고뉴클레오티드 표지화의 변성 겔 전기영동 분석이 도시되고, 스트렙타비딘 관능화된 비드를 사용하여 품질 제어를 수행하였다. 결합된 올리고뉴클레오티드는 형광 현미경을 이용하여 시각화될 수 있는 내부 Cy5 염료를 포함하였다. 도 14b는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제를 사용하는 고체-상 RNA 올리고뉴클레오티드 합성의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 합성은 (n+1), (n+2) 및 (n+3)에 대해 하나씩 별도의 반응 용기에서 비드 상에서 수행되었다. 합성된 서열은 (n+3) 예에서 +ACU였다. 연장 반응을 37℃에서 1 분 동안 수행하였고, 탈차단 반응을 50℃에서 10 분 동안 수행하였다. 연장과 탈차단 사이에 비드를 10 mM 트리스-HCl (pH 6.5)로 세척하였다.
도 15a 내지 15d. 도 15a는 효소적 RNA 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 재사용가능한 고체-상 지지체 시스템의 생성 및 사용에 대한 예시적인 도식을 도시한다. 간략히, 고체 지지체, 예컨대 비드, 웰 또는 슬라이드는 바람직하게는 3'-말단에서 리보이노신 (rI) 또는 데옥시이노신 (dI)을 함유하는 개시자 올리고뉴클레오티드에 결합된 적절한 링커에 의해 공유적으로 유도체화된다. 고체-상 효소적 RNA 올리고뉴클레오티드 합성을 수행하여, 원하는 생성물을 생성한 다음, 엔도뉴클레아제 V를 전체 올리고뉴클레오티드 (개시자 + 생성물)와 함께 인큐베이션하게 한다. 이는 고체-지지체로부터 올리고뉴클레오티드 생성물을 절단하여, 고체-지지체 상에서 리보이노신 (rI) 또는 데옥시이노신 (dI)을 온전하게 남겨둘 것이며, 이는 추후 합성 반응에 재사용될 수 있다. 원하는 경우, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제를 사용하여, 이 핵염기의 2'-O-알릴 버전을 사용하여 고정된 개시자 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 리보이노신 (rI)을 도입시킬 수 있다. 도 15b는 벌크의 및 아민 관능화된 실리카 비드의 표면으로부터의 데옥시이노신 (dI)을 함유하는 개시자 RNA 올리고뉴클레오티드의 엔도뉴클레아제 V 절단의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 예시적인 올리고뉴클레오티드 개시자 서열 뿐만 아니라 이중 NHS-PEG 링커가 도시되며, 이를 사용하여 5'-아민 올리고뉴클레오티드를 아민 실리카 비드의 표면에 공유적으로 고정시켰다. 엔도뉴클레아제 V 절단은 적절한 완충제를 사용하여 37℃에서 1 시간 동안 수행하였고, 즉시 변성 겔 상에서 작동시켰다. 도 15c는 새로운 비-절단된 고체-상 지지체 및 엔도뉴클레아제 V 절단된 고체-상 지지체 상에서 각각 가역적인 종결자 2'-O-알릴-ATP 및 rNTP 혼합물을 사용하여 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 제어된 및 비제어된 연장의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 연장 반응을 1 mM의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 혼합물로 보충하였고, 37℃에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 엔도뉴클레아제 V 절단 이전에 비드를 10 mM 트리스-HCl (pH 6.5)로 세척하였다. 엔도뉴클레아제 V 절단은 적절한 완충제를 사용하여 37℃에서 1 시간 동안 수행하였고, 즉시 변성 겔 상에서 작동시켰다. 도 15d는 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트를 갖는 공유적으로 결합된 엔도뉴클레아제 V 절단가능한 개시자 올리고뉴클레오티드를 사용하여 (n+2) 생성물의 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 제어된 합성의 변성 겔 전기영동 분석을 도시한다. 연장 반응을 1 mM의 뉴클레오티드로 보충하였고, 37℃에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 탈차단 반응을 50℃에서 10 분 동안 수행하였다. 비드를 10 mM 트리스-HCl (pH 6.5)로 세척하였다. 엔도뉴클레아제 V 절단은 적절한 완충제를 사용하여 37℃에서 1 시간 동안 수행하였고, 즉시 변성 겔 상에서 작동시켰다. 대조군 반응은 (n+2)로 연장되고, 엔도뉴클레아제 V의 존재하에 인큐베이션되었지만, 리보이노신 (rI) 또는 데옥시이노신 (dI)을 보유하지 않은 고정된 Cy5 개시자 올리고뉴클레오티드를 함유하였다. 이를 사용하여, 올리고뉴클레오티드가 엔도뉴클레아제 V 절단 동안에 달라붙지 않았음을 입증하였다. Cy5 개시자 올리고뉴클레오티드를 갖는 비드는 각각의 합성 주기 후에 청색으로 남아 있는다.
도 16a 및 16b. 도 16a는 고체-상 지지체, 예컨대 개시자 올리고뉴클레오티드 유도체화된 실리카 또는 자성 비드를 사용하여 대규모 반응에서 4x 올리고뉴클레오티드를 동시에 합성하는 능력을 갖는 프로토타입 효소적 RNA 올리고뉴클레오티드 합성기를 도시한다. 시린지 배럴은 합성 작업의 원하는 규모 요건을 충족시키는데 충분한 고체 지지체로 충전된다. 고체-상 지지체를 로딩하기 전에, 여과기를 시린지 배럴의 바닥에 두고, 그 자리에서 결합시킨다. 이 여과기는 고체-상 지지체가 그 자리에 있게 하면서, 시린지 배럴로부터 액체를 제거할 수 있다. 전형적인 합성 주기는 연장 반응, 세척 단계, 탈차단 반응, 이어서 최종 세척 단계로 이루어진다. 원하는 올리고뉴클레오티드가 완성될 때까지 이 과정을 반복한다. 고체 지지체로부터 최종 생성물을 절단하기 위해, 화학적 또는 생물학적 절단 시약을 각각의 시린지 배럴에 첨가하고, 필요한 경우 예정된 시간 동안 인큐베이션하고, 용리시키고, 여과를 통해 수집한다. 고체-상 지지체가 재사용되는 경우, 예를 들어 최종 올리고뉴클레오티드 생성물을 절단시키기 위해 엔도뉴클레아제 V를 사용하는 경우, 이를 시린지 배럴에 남겨두고, 다음 합성 작업을 위해 프라이밍한다. 반응기를 가열하기 위해, 시린지 배럴을 제거하고, 양 말단을 캡핑하고, 원하는 시간 동안 인큐베이터에 둘 수 있다. 대안적으로, 가열된 재킷을 시린지 배럴 주변에 배치할 수 있다. 효소적 기반 RNA 올리고뉴클레오티드 합성의 주요 이점은 물질 (효소, 뉴클레오티드 등)의 재활용이다. 도 16b는 시린지 배럴의 액체를 폐기물 수집 또는 재활용 수집으로 보내기 위해 제어할 수 있는 이중 밸빙 시스템을 도시한다. 재활용된 성분을 올리고뉴클레오티드 합성의 다음 주기에 직접적으로 적용할 수 있거나 또는 추후 합성 작업을 위해 정제하고 보관할 수 있다. 산업적 수준의 올리고뉴클레오티드 제조를 수용하도록 유사한 설정 및 합성 반응기를 확장시킬 수 있다.
도 17. 도 17은 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트 2'-O-알릴-ATP의 합성을 위한 예시적인 도식을 도시한다. 출발 물질 뉴클레오시드는 임의의 천연 염기 (U, T, G, C) 및/또는 원하는 변형된 염기로 교체될 수 있다. 트리포스페이트 또한 알파 포스페이트에서 포스포로티오에이트로 교체될 수 있다.
도 18a 내지 18d는 천연 뉴클레오티드 GTP - "G" 및 CTP - "C"를 혼입시키는 H336 돌연변이체의 능력의 겔 전기영동 분석을 도시한다. 블랭크 반응은 효소 및 뉴클레오티드를 제외한 모든 성분으로 보충되었다. 모든 반응을 1 mM 뉴클레오티드, 5 pmol 개시자 올리고뉴클레오티드, 및 1 μg의 효소와 함께 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 15% TBE-우레아 변성 겔을 연장 반응 분석을 위해 사용하였다.
도 19a 내지 19f는 야생형 폴리(U) 폴리머라제와 비교하여 천연 및 유사 뉴클레오티드의 어레이를 혼입시키는 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체 H336R 능력의 겔 전기영동 분석을 도시한다. 도 19a, 19d는 각각 야생형 및 H336R 돌연변이체에 대한 ATP 기반 뉴클레오티드에 대한 연장 결과를 도시한다. 도 19b, 19e는 각각 야생형 및 H336R 돌연변이체에 대한 UTP 및 ITP 기반 뉴클레오티드에 대한 연장 결과를 도시한다. 도 19c, 19f는 각각 야생형 및 H336R 돌연변이체에 대한 CTP 및 GTP 기반 뉴클레오티드에 대한 연장 결과를 도시한다. 모든 반응을 1 mM 뉴클레오티드, 5 pmol 개시자 올리고뉴클레오티드, 및 1 μg의 효소와 함께 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 15% TBE-우레아 변성 겔은 연장 반응 분석을 위해 사용하였다.
도 20은 구체적으로 위치 H336에서 다양한 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체에 의한 2'-메톡시-아데노신 트리포스페이트 (2'-O-Me-ATP)의 비제어된 혼입을 도시하며; 여기서 단일 돌연변이체는 야생형 (WT)과 비교하여 도시된다. 블랭크 반응은 효소를 제외한 모든 성분을 함유한다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔에 의해 분석하였다.
도 21은 구체적으로 위치 N171에서 다양한 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체에 의한 2'-플루오로-아데노신 트리포스페이트 (2'-F-ATP)의 비제어된 혼입을 도시하며; 여기서 단일 돌연변이체는 돌연변이체 H336R과 비교하여 도시된다. 블랭크 반응은 효소를 제외한 모든 반응 성분을 함유하였다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔에 의해 분석하였다.
도 22는 구체적으로 위치 N171에서 다양한 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체에 의한 3'-메톡시-아데노신 트리포스페이트 (3'-O-Me-ATP)의 제어된 혼입 (캡핑)을 도시하며; 여기서 단일 돌연변이체는 돌연변이체 H336R 및 야생형과 비교하여 도시된다. 상단 밴드는 (n+1) 생성물을 나타낸다. 참고: 야생형 샘플은 양성 혼입을 나타내지만, 심각한 가피로인산분해가 발생한다. 음성 반응은 효소를 제외한 모든 반응 성분을 함유하였다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였다.
도 23은 다양한 에스. 폼베 돌연변이체에 의한 가역적인 종결자 3'-O-알릴 아데노신 트리포스페이트 (3'-(O-알릴)-ATP)의 제어된 혼입을 도시한다. 음성 반응은 효소를 제외한 모든 반응 성분을 함유하였다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였다.
도 24는 폴리(U) 폴리머라제 이중 돌연변이체 H336R-N171A에 의한 가역적인 종결자 3'-O-알릴 카르보네이트 데옥시아데노신 트리포스페이트 (3'-(O-알릴 카르보네이트)-dATP)의 제어된 혼입을 도시한다. 겔 영상은 정제된 효소 스톡 (2 μL, 4 μL 및 6 μL)의 양이 증가함에 따라 개시자 올리고뉴클레오티드 (2 pmol/rxn, 5 pmol/rxn, 및 10 pmol/rxn)의 투입량이 달라짐을 나타낸다. 상단 밴드는 (n+1) 생성물을 나타낸다. 블랭크 반응은 효소를 제외한 모든 성분을 함유한다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔에 의해 분석하였다.
도 25는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 단일 돌연변이체 H336R에 의한 가역적인 종결자 3'-O-아지도메틸카르보네이트 데옥시티미딘 트리포스페이트 (3'-(O-아지도메틸 카르보네이트)-dTTP)의 제어된 혼입에 대한 반응 보정을 도시한다. 반응을 다양한 효소 스톡 농도 및 뉴클레오티드 농도에서 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 문자 "E"는 첨가된 정제된 효소 스톡의 양 (μL)을 나타내고, 문자 "N"은 연장 반응에서 뉴클레오티드의 최종 농도 (mM)를 나타낸다. 대조군 반응은 뉴클레오티드 이외의 모든 성분을 함유하였다. 반응 인큐베이션 후에, 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔에 의해 분석하였다. 하단 밴드는 연장되지 않은 출발 물질을 나타내고, 상단 밴드는 양성으로 연장된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
도 26은 가역적인 종결자 3'-O-알릴 아데노신 트리포스페이트 3'-(O-알릴)-ATP)와 함께 정제된 폴리(U) 폴리머라제 스톡 H336R의 반응 보정 평가를 도시한다. 겔은 개시자 올리고뉴클레오티드의 투입량이 증가함에 따라 주어진 (n+1) 연장 반응을 나타낸다. 반응은 1 mM 가역적인 종결자 뉴클레오티드 및 1 uL의 정제된 효소 스톡으로 보충된다. 반응을 37℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 상단 밴드는 (n+1) 생성물을 나타낸다. 블랭크 반응은 효소를 제외한 모든 성분을 함유한다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔에 의해 분석하였다. 이는 반응 확장성의 예시이다.
도 27은 벌크 용액 중에서 3'-O-알릴 아데노신 트리포스페이트 (3'-O-알릴-ATP)를 갖는 가역적인 종결자와 함께 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체 H336R을 사용하는 제어된 효소적 합성의 입증을 도시한다. 여기서 벌크 용액 중에서 (n+5) 합성이 도시된다. 합성 후에, 반응을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였다.
도 28은 효소적 혼입을 위한 3'-가역적인 종결자 뉴클레오티드의 예시적인 구조를 도시한다. 3' 히드록시를 위한 보호기의 다양한 예. 표지된 바와 같이, 이들은 산화환원 화학, 빛, 플루오라이드 음이온 및 촉매를 통해 제거될 수 있다.
도 29는 푸라닐 고리가 산소를 보유하는 3' 보호기 선택을 도시한다. 2'는 결합, 약동학, 약력학, 일반적인 안정성 및 프로브 태그를 촉진시키는 천연 리보, 데옥시 또는 다양한 모이어티일 수 있다.
도 30은 비-가교 및 가교 뉴클레오시드 트리포스페이트 둘 다에 대한 비가역적인 (캡핑) 종결자 및 에스테라제 민감성 종결자인 추가의 3'-보호기의 예를 도시한다. 비-가교의 경우, 2'-은 결합, 약동학, 약력학, 일반적인 안정성 및 프로브 태그를 촉진시키는 천연 리보, 데옥시 또는 다양한 모이어티일 수 있다. 이들 3'-보호기는 다른 중요한 모이어티, 예컨대 아미노산, 올리고뉴클레오티드, 또는 합성된 올리고뉴클레오티드의 3'-말단의 추가의 관능성을 부여할 수 있고 임의의 공지된 탈보호 방법에 대해 민감하지 않다면 최종의 비가역적인 캡으로서 사용될 수 있는 큰 화학적 도메인으로 추가로 유도체화될 수 있다.
도 31은 뉴클레오티드 트리포스페이트에 대한 3' 아지도메틸 에테르의 제조를 위한 예시적인 도식을 도시하며, 2'는 천연 OH 또는 다양한 변형, 예컨대 -F, -OMe, -OCH2CH2CH3 등일 수 있고, 이는 표적 올리고의 생물학적 활성에 유익한 것으로 입증되거나 또는 더 광범위한 과학의 영향에 기여한다.
도 32는 잠금 뉴클레오티드 트리포스페이트에 대한 3' 아지도메틸 에테르의 제조를 위한 예시적인 도식을 도시한다.
도 33은 뉴클레오티드 트리포스페이트에 대한 3' 알릴 에테르의 제조를 위한 예시적인 도식을 도시하며, 2'는 천연 OH 또는 다양한 변형, 예컨대 F, OMe, OCH2CH2CH3 등일 수 있으며, 이는 표적 올리고의 생물학적 활성에 유익한 것으로 입증되거나 또는 다른 적용에 기여한다.
도 34는 잠금 뉴클레오티드 트리포스페이트에 대한 3' 아지도메틸 에테르의 제조를 위한 예시적인 도식을 도시한다.
효소 촉매작용을 이용하는 RNA 올리고뉴클레오티드의 신생 합성 방법이 본원에 기재된다. 예를 들어, RNA 올리고뉴클레오티드의 합성 방법이 본원에 제공되며, 말단 트랜스퍼라제 효소 (예를 들어, 폴리(N) 폴리머라제)는 개시자 올리고뉴클레오티드 상에 1개 이상의 뉴클레오티드를 혼입시킨다. 예를 들어, RNA 올리고뉴클레오티드의 제조 방법이 본원에 제공되며, 폴리(U) 폴리머라제는 말단 트랜스퍼라제를 통해 개시자 올리고뉴클레오티드 상에 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 혼입시킨다.
한 측면에서, 연장된 개시자 올리고뉴클레오티드에 대한 폴리머라제 (예를 들어, 폴리(U) 폴리머라제)의 결합 친화도를 가역적으로 변경시키는 변형된 뉴클레오티드 (즉, 2'- 또는 3'-변형된 가역적인 종결자 올리고뉴클레오티드)가 혼입되는 것인 방법이 본원에서 제공되며, 이에 따라 (n+1) 연장된 RNA 올리고뉴클레오티드가 생성되고, 이는 탈보호된 다음 추가로 연장될 수 있다.
또 다른 측면에서, RNA 올리고뉴클레오티드 합성 방법이 본원에 제공되며, 비-가수분해성 뉴클레오티드를 사용하여, 폴리머라제 (예를 들어, 폴리(U) 폴리머라제)가 가수분해성 뉴클레오티드를 개시자 올리고뉴클레오티드에 혼입시키는 속도를 조절한다.
또 다른 측면에서, 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드를 수득하기 위해 본원에 기재된 폴리(N)폴리머라제 (예를 들어, 본원에 기재된 야생형 또는 돌연변이된 폴리(U) 폴리머라제)를 사용하여 2개의 올리고뉴클레오티드를 라이게이션하는 방법이 본원에 제공된다.
추가로, 이들 방법에 의해 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드는 역전사 (RT)를 거쳐 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 고충실도 DNA 폴리머라제에 의해 증폭될 수 있는 상보성 DNA (예를 들어, cDNA)를 수득할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드 및 DNA 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
본원에 기재된 방법에서 유용한 변형된 뉴클레오티드, 뿐만 아니라 본원에 기재된 방법에서 유용한 폴리(N) 폴리머라제 효소 (예를 들어, 돌연변이 폴리(U) 폴리머라제) 또한 본원에 제공된다.
본원에 기재된 폴리(N) 폴리머라제 및/또는 뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물 및 키트가 또한 본원에 제공된다. 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 반응 혼합물 및 시스템이 본원에 제공된다.
RNA 올리고뉴클레오티드 합성
RNA 올리고뉴클레오티드의 합성 방법이 본원에 제공되며, 폴리(N) 폴리머라제는 말단 트랜스퍼라제 (예를 들어, 폴리(N) 폴리머라제)를 통해 개시자 올리고뉴클레오티드에 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 혼입시킨다. 특정 실시양태에서,
(a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
(b) 폴리(N) 폴리머라제를 제공하는 단계;
(c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(N) 폴리머라제, 및 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 조합하는 단계를 포함하는,
RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법이 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 폴리(U) 폴리머라제이다. 따라서, 특정 실시양태에서,
(a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
(b) 폴리(U) 폴리머라제를 제공하는 단계;
(c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(U) 폴리머라제, 및 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 조합하는 단계를 포함하는,
RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법이 본원에 제공된다.
1개 이상의 변형된 뉴클레오티드가 개시자 올리고뉴클레오티드에 부가되면, 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 1개 이상의 추가의 뉴클레오티드 (변형된 또는 비변형된)가 후속적으로 부가될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 상기 방법은 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드 (즉, 단계 (c)에서 형성된 RNA 올리고뉴클레오티드)의 3' 말단에 1개 이상의 천연 또는 변형된 뉴클레오티드를 부가하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 추가의 변형된 뉴클레오티드가 부가된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (d) 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 단계 (a)-(c)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다.
폴리(N) 폴리머라제
본원에 기재된 바와 같이, 1개 이상의 뉴클레오티드를 혼입시키는 효소는 RNA 폴리머라제, 예컨대 폴리(N) 폴리머라제이다. 본원에 기재된 방법에서 유용한 폴리(N) 폴리머라제, 예를 들어, 돌연변이체 (즉, 돌연변이된) 폴리(U) 폴리머라제가 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 폴리(U) 폴리머라제, 폴리(A) 폴리머라제, 폴리(C) 폴리머라제, 또는 폴리(G) 폴리머라제이다. RNA 폴리머라제는 야생형 폴리머라제, 또는 돌연변이체 (즉, 돌연변이된), 변이체, 또는 그의 상동체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 야생형 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리머라제는 폴리(N) 폴리머라제의 돌연변이체이다. 특정 실시양태에서, 폴리머라제는 폴리(N) 폴리머라제의 변이체이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 또는 변이체는 야생형 폴리머라제와 대략 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리머라제는 폴리(N) 폴리머라제의 상동체이다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 폴리(U) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리(U) 폴리머라제는 야생형 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 폴리(U) 폴리머라제, 또는 그의 돌연변이체, 또는 그의 상동체이다. 특정 실시양태에서, 폴리(U) 폴리머라제는 야생형 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리(U) 폴리머라제는 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제의 돌연변이체이다. 특정 실시양태에서, 폴리(U) 폴리머라제는 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제의 변이체이다. 특정 실시양태에서, 폴리(U) 폴리머라제는 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제의 상동체이다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 폴리(A) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리(A) 폴리머라제는 야생형 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 폴리(A) 폴리머라제, 또는 그의 돌연변이체이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 야생형 사카로마이세스 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 사카로마이세스 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제의 돌연변이체이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 사카로마이세스 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제의 변이체이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 사카로마이세스 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제의 상동체이다.
폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체
본원에 기재된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 폴리(N) 폴리머라제의 돌연변이체 (즉, 돌연변이된 폴리(N) 폴리머라제)이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336, N171, 및 T172로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 돌연변이를 포함하는 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) (에스. 폼베 폴리(u)) 폴리머라제이다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336 돌연변이 (즉, 위치 336의 아미노산 H가 또 다른 아미노산으로 대체됨)를 포함하는 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) (에스. 폼베 폴리(u)) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, H336 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호(SEQ ID NO):3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 H336 돌연변이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336R 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, H336R 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호:3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, 1개의 돌연변이: H336R을 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 N171 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 N171 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, N171 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호:3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 N171 돌연변이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 N171A 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, N171A 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호:3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, 1개의 돌연변이: N171A를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 N171T 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, N171T 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호:3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, 1개의 돌연변이: N171T를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 T172 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, T172 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호:3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 T172 돌연변이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336 및 N171 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; 및 N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 N171 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, H336 및 N171 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호:3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 H336 돌연변이; 및 N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 N171 돌연변이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336R 및 N171A 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, H336R 및 N171A 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호:3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, 2개의 돌연변이: H336R 및 N171A를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336R 및 N171T 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, H336R 및 N171T 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호:3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, 2개의 돌연변이: H336R 및 N171T를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336 및 T172 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, H336 및 T172 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호:3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 H336 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 T172 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, H336 돌연변이는 H336R이다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336, N171, 및 T172 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 N171 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 에스. 폼베 폴리(u) 폴리머라제이다. 특정 실시양태에서, H336, N171, 및 T172 돌연변이가 유일한 돌연변이이다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 1개 이상의 부가 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호:3과 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 서열식별번호:3과 동일하지만, H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 H336 돌연변이; N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 N171 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 T172 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, H336 돌연변이는 H336R이다. 특정 실시양태에서, N171 돌연변이는 N171A 또는 N171T이다.
변형된 RNA 뉴클레오티드
본원에 기재된 바와 같이, 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드에 혼입될 수 있다. 맞춤형 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 변형된 뉴클레오티드가 혼입될 수 있다. 다른 실시양태에서, (즉, 본원에 기재된 "가역적인 종결자"의 사용을 통해) 후속적인 뉴클레오티드의 혼입을 차단하기 위해 변형된 뉴클레오티드가 혼입될 수 있다. 본원에 기재된 방법 뿐만 아니라 다른 적용 (예를 들어, 화학적 올리고뉴클레오티드 합성, 치료적 적용 등)에서 유용한 변형된 뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
"변형된 뉴클레오티드" 1개 이상의 비-천연 변형을 포함하는 뉴클레오티드 단량체 (예를 들어, 리보스 당, 포스페이트 기, 및 핵염기를 포함함)이다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 천연 발생 RNA 또는 DNA 뉴클레오티드 (즉, 구아닌 (G), 우라실 (U), 아데닌 (A), 시토신 (C))의 구조적 등가물이지만 1개 이상의 비-천연 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 천연 발생 뉴클레오티드의 등가물이며, 1개 이상의 위치가 치환되거나, 또는 1개 이상의 치환기 또는 기가 제거되거나 또는 대체된다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 당, 변형된 염기, 변형된 포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. "변형된 뉴클레오티드"는 본원에 기재된 2'- 및 3'-가역적인 종결자 뉴클레오티드를 포함한다.
하기 화학식은 뉴클레오티드 상에서 가능한 변형 부위를 도시하기 위해 의도된다. 다른 변형이 고려된다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 하기 화학식의 것 또는 그의 염이다:
Figure pct00003
상기 식에서:
"염기" (또한 본원에서 "B")는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 염기이고;
R 및 R'는 독립적으로 수소, 또는 천연 또는 비-천연 당 치환기이다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 하기 화학식의 것 또는 그의 염이다:
Figure pct00004
상기 식에서:
X는 O 또는 S이고;
Y는 O 또는 S이고;
"염기" (또한 본원에서 "B")는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 염기이고;
R 및 R'는 독립적으로 수소, 또는 천연 또는 비-천연 당 치환기이다.
특정 실시양태에서, Y는 O이다. 특정 실시양태에서, Y는 S이다. 특정 실시양태에서, X는 O이다. 특정 실시양태에서, X는 S이다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 염기-변형된 뉴클레오티드이다. "염기-변형된"은 G, U, A 또는 C 염기가 치환되거나 변형된 것인, 또는 G, U, A 또는 C 염기가 상이한 기로 대체된 것인 (예를 들어, 히포크산틴) 뉴클레오티드를 포함한다.
변형된 염기의 비제한적인 예에는 5-메틸시토신, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 수도우라실, 3-메틸 우라실, 디히드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘, 5-알킬우리딘, 5-할로우리딘, 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘, 프로핀, 퀘소신, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 4-아세틸티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, β-D-갈락토실케오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카르보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, β-D-만노실케오신, 우리딘-5-옥시아세트산, 2-티오시티딘, 및 트레오닌 유도체가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
염기의 다른 비제한적인 예에는 천연 또는 비-천연 피리미딘 또는 퓨린이 포함되나 이로 제한되지 않고; N1-메틸-아데닌, N6-메틸-아데닌, 8'-아지도-아데닌, N,N-디메틸-아데노신, 아미노알릴-아데노신, 5'-메틸-우리딘, 수도우리딘, N1-메틸-수도우리딘, 5'-히드록시-메틸-우리딘, 2'-티오-우리딘, 4'-티오-우리딘, 히포크산틴, 크산틴, 5'-메틸-시티딘, 5'-히드록시-메틸-시티딘, 6'-티오-구아닌, 및 N7-메틸-구아닌이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 염기-변형된 뉴클레오티드는 N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸-2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, N1-메틸수도우리딘-5'-트리포스페이트, 수도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-히드록시메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-히드록시메틸시티딘-5'-트리포스페이트, N7-메틸구아노신-트리포스페이트, 8'-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 이노신 5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 6-티오구아노신-5'-트리포스페이트, 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 및 크산토신-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 당-변형된 뉴클레오티드이다. "당-변형된"은 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티가 치환된 것인, 또는 리보스 또는 데옥시리보스가 상이한 당 모이어티로 대체된 것인 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리보스 또는 데옥시리보스는 1', 2', 3', 4' 및/또는 5' 위치에서 변형된다 (예를 들어, 치환된다). 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 2' 위치에서 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 3' 위치에서 변형될 수 있다.
특정 실시양태에서, 당의 2' 및/또는 3' 위치는 천연 또는 비-천연 "당 치환기" R 또는 R'로 치환된다. 특정 실시양태에서, R 및 R'는 독립적으로 수소, 할로겐, -CN, -NO2, -N3, 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 알케닐, 임의적으로 치환된 알키닐, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, 임의적으로 치환된 카르보시클릴, 임의적으로 치환된 헤테로시클릴, 임의적으로 치환된 아실, 임의적으로 치환된 히드록실, 임의적으로 치환된 아미노, 또는 임의적으로 치환된 티올로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, R 및/또는 R'는 독립적으로 -ORP이고, 각각의 경우의 RP는 독립적으로 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이다. 특정 실시양태에서, R 및/또는 R'는 생체접합을 위한 반응성 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 핸들, 예를 들어, 아지드 또는 알킨), 형광단, 촉매적 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 리포팅 태그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 당, 예를 들어 리보스의 2' 위치는 할로겐, 예를 들어 플루오린 기; 알킬 기, 예를 들어 메틸 또는 에틸 기; 메톡시 기; 아미노 기; 티오 기; 아미노프로필 기; 디메틸아미노에틸; 디메틸아미노프로필 기; 디메틸아미노에틸옥시에틸 기; 아지도 기; 실릴 기; 시클릭 알킬 기; 또는 N-메틸아세트아미도 기로 변형될 수 있다.
특정 실시양태에서, 당, 예를 들어 리보스의 2' 위치는 히드록실 (-OH), 수소 (-H), 플루오로 (-F), 아민 (-NH3), 아지도 (-N3), 티올 (-SH), 메톡시 (-OCH3), 또는 메톡시에탄올 (-OCH2CH2OCH3)로 변형된다.
특정 실시양태에서, 2' 위치는 또한 산화환원-활성, 형광원성 또는 본질적으로 형광성인 모이어티, 천연 및 비-천연 아미노산, 펩티드, 단백질, 단당류 또는 올리고당류, 기능적/리간드 결합 글리칸, 및 중합체 또는 거대 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 당, 예를 들어 리보스의 3' 위치는 할로겐, 예를 들어 플루오린 기; 알킬 기, 예를 들어 메틸 또는 에틸 기; 메톡시 기; 아미노 기; 티오 기; 아미노프로필 기; 디메틸아미노에틸; 디메틸아미노프로필 기; 디메틸아미노에틸옥시에틸 기; 아지도 기; 실릴 기; 시클릭 알킬 기; 또는 N-메틸아세트아미도 기로 변형될 수 있다.
특정 실시양태에서, 당, 예를 들어 리보스의 3' 위치는 히드록실 (-OH), 수소 (-H), 플루오로 (-F), 아민 (-NH3), 아지도 (-N3), 티올 (-SH), 메톡시 (-OCH3), 또는 메톡시에탄올 (-OCH2CH2OCH3)로 변형된다.
특정 실시양태에서, 3' 위치는 또한 산화환원-활성, 형광원성 또는 본질적으로 형광성인 모이어티, 천연 및 비-천연 아미노산, 펩티드, 단백질, 단당류 또는 올리고당류, 기능적/리간드 결합 글리칸, 및 중합체 또는 거대 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 치환될 수 있다.
특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-위치에서 변형된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-F, 2'-O-알킬, 2'-아미노, 또는 2'-아지도 변형된 뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-F 변형된 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-플루오로-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로-2'-데옥시구아노신-5'-트리포스페이트, 및 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 및 2'-O-메틸이노신-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-O-아미노 변형된 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-아미노-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트, 및 2'-아미노-2'-데옥시구아노신-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-O-아지도 변형된 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-아지도-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-아지도-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-아지도-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트, 및 2'-아지도-2'-데옥시구아노신-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트는 캡핑 뉴클레오티드로도 공지된 비가역적인 종결자, 예컨대 3'-O-메틸-NTP, 3'-O-메틸-dNTP, 3'-아지도-dNTP, 3'-아지도-NTP, 3'-아민-dNTP, 3'-아민-NTP 등이다.
특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 2'-변형된 가역적인 종결자 RNA 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드)이다. 2'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 2'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 변형된 염기 모이어티 또한 포함한다.
특정 실시양태에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 3'-변형된 가역적인 종결자 RNA 뉴클레오티드 (예를 들어, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드)이다. 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 변형된 염기 모이어티 또한 포함한다.
당에 대한 다른 변형이 고려된다. 이들 변형에는 고리의 산소를 황으로 대체하는 것이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 2'-탄소와 4'-탄소 사이에 가교가 도입된다 (예를 들어, 고리 형태를 제한하기 위해). 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 가교 뉴클레오티드, 예를 들어 잠금 핵산 (LNA); 속박된 에틸 뉴클레오티드 (cEt), 또는 에틸렌 가교 핵산 (ENA) 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드, 예를 들어 뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 기, 예를 들어 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트 기의 비제한적인 예에는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 알킬, 헤테로시클릭, 아미드, 모르폴리노, 펩티드 핵산 (PNA), 및 다른 공지된 인-함유 기가 포함된다. 특정 실시양태에서, 트리포스페이트의 알파 (α) 포스페이트에 대해 변형이 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드는 (α) 티오포스포네이트이다. 특정 실시양태에서, 트리포스페이트의 베타 (β) 및/또는 감마 (γ) 포스페이트에 대한 변형.
특정 실시양태에서, 형광단으로 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 각각의 반복적인 혼입 사건의 성공을 증명할 수 있으며, 그에 따라 일부 실시양태에서 사실상 오류가 없는 RNA 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 형광단을 포함한다.
변형된 뉴클레오티드는 1개 초과의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 염기 변형 및 당 변형을 포함할 수 있다.
가역적인 종결자에 의한 RNA 올리고뉴클레오티드 합성
가역적인 종결자 뉴클레오티드를 사용하여 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법 또한 본원에 제공된다. "가역적인 종결자 뉴클레오티드"는 2'- 및/또는 3'-위치에서 제거될 수 있는 비-천연 화학적 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드이다. 가역적인-종결자 뉴클레오티드를 개시자 올리고뉴클레오티드에 부가한 후, 비-천연 화학적 모이어티 2'- 및/또는 3'-위치는 예를 들어 올리고뉴클레오티드와 폴리머라제의 결합을 방해함으로써 두번째 뉴클레오티드의 혼입을 차단한다. 이어서, 비-천연 화학적 모이어티 2'- 및/또는 3'-위치를 제거하여, 추가의 뉴클레오티드의 부가를 위해 3'-위치가 개방되게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 "(n+1)" 부가로도 지칭되는 한번에 1개의 뉴클레오티드의 제어된 부가를 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 2'- 및/또는 3'-히드록실 기에서 보호된다 (즉, "2'- 및/또는 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드").
(a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
(b) 폴리(N) 폴리머라제를 제공하는 단계;
(c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(N) 폴리머라제, 및 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 조합하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 형성된 RNA 올리고뉴클레오티드를 가역적인 종결자 뉴클레오티드의 보호된 위치 (예를 들어, 2' 및/또는 3' 위치)에서 탈보호시키는 단계;
(e) 임의적으로, 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 단계 (a)-(c)를 반복하는 단계를 포함하는,
RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법이 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 폴리(U) 폴리머라제이다.
(a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
(b) 폴리(U) 폴리머라제를 제공하는 단계;
(c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 2'- 및/또는 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(U) 폴리머라제, 및 2'- 및/또는 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 조합하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 형성된 RNA 올리고뉴클레오티드를 2'- 및/또는 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드의 보호된 2'- 및/또는 3'-O-위치에서 탈보호시키는 단계;
(e) 임의적으로, 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 단계 (a)-(c)를 반복하는 단계를 포함하는,
RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 바와 같이, 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드 또한 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 폴리(U) 폴리머라제이다.
(a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
(b) 폴리(U) 폴리머라제를 제공하는 단계;
(c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(U) 폴리머라제, 및 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 조합하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 형성된 RNA 올리고뉴클레오티드를 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드의 보호된 2'-O-위치에서 탈보호시키는 단계;
(e) 임의적으로, 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 단계 (a)-(c)를 반복하는 단계를 포함하는,
RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 바와 같이, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드 또한 사용될 수 있다.
(a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
(b) 폴리(U) 폴리머라제를 제공하는 단계;
(c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(U) 폴리머라제, 및 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 조합하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 형성된 RNA 올리고뉴클레오티드를 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드의 보호된 3'-O-위치에서 탈보호시키는 단계;
(e) 임의적으로, 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 단계 (a)-(c)를 반복하는 단계를 포함하는,
RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 임의의 폴리(N) 폴리머라제가 상기 기재된 가역적인 종결자 방법에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 돌연변이 폴리(U) 폴리머라제를 사용하여 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 혼입시킨다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 돌연변이 폴리(U) 폴리머라제를 사용하여 본원에 기재된 3'-가역적인 종결자 뉴클레오티드를 혼입시킨다.
본원에 기재된 방법을 이용하여 임의의 특정한 서열의 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
가역적인 종결자 RNA 뉴클레오티드
본원에 기재된 일부 방법은 가역적인 종결자 RNA 올리고뉴클레오티드를 사용한다. "가역적인 종결자 뉴클레오티드"는 2'- 및/또는 3'-위치에서 제거될 수 있는 비-천연 화학적 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 2'-O- 및/또는 3'-O-위치에서 산소 보호기로 보호된다. 새로운 가역적인 종결자 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드 및 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드) 또한 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 2'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 2'-O-위치에서 산소 보호기로 보호된다 ("2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드"). 특정 실시양태에서, 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 3'-O-위치에서 산소 보호기로 보호된다 ("3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드").
예를 들어, 특정 실시양태에서, 가역적인 종결자 뉴클레오티드 (즉, 2'- 및/또는 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드)는 하기 화학식의 것 또는 그의 염이다:
Figure pct00005
상기 식에서:
각각의 경우의 RP는 수소, 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이거나, 또는 2개의 RP는 개재 원자와 함께 결합되어 임의적으로 치환된 헤테로시클릴을 형성하며; 단, 적어도 1개의 RP는 산소 보호기 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이고;
"염기" (또한 본원에서 "B")는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 (예를 들어, 변형된) 염기이다. 뉴클레오티드의 다른 부분은 본원에서 상기 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 가역적인 종결자 뉴클레오티드 (즉, 2'- 및/또는 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드)는 하기 화학식의 것 또는 그의 염이다:
Figure pct00006
상기 식에서:
Y는 O 또는 S이고;
X는 O 또는 S이고;
각각의 경우의 RP는 수소, 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이거나, 또는 2개의 RP는 개재 원자와 함께 결합되어 임의적으로 치환된 헤테로시클릴을 형성하며; 단, 적어도 1개의 RP는 산소 보호기 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이고;
"염기" (또한 본원에서 "B")는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 (예를 들어, 변형된) 염기이다.
특정 실시양태에서, 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드 (즉, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드)는 하기 화학식의 것 또는 그의 염이다:
Figure pct00007
상기 식에서:
Y는 O 또는 S이고;
X는 O 또는 S이고;
RP는 산소 보호기이고;
R은 수소, 또는 본원에 기재된 천연 또는 비-천연 당 치환기이고;
"염기" (또한 본원에서 "B")는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 (예를 들어, 변형된) 염기이다.
임의적으로, 특정 실시양태에서, 연결기는 2' 탄소를 4' 탄소에 연결한다 (예를 들어, 기 R'를 통해)
특정 실시양태에서, 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 잠금 또는 가교 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드 (즉, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드)는 하기 화학식의 것 또는 그의 염이다:
Figure pct00008
상기 식에서:
Y는 O 또는 S이고;
X는 O 또는 S이고;
RP는 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이고;
R은 수소, 또는 본원에 기재된 천연 또는 비-천연 당 치환기이고;
"염기" (또한 본원에서 "B")는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 (예를 들어, 변형된) 염기이다.
특정 실시양태에서, Y는 O이다. 특정 실시양태에서, Y는 S이다. 특정 실시양태에서, X는 O이다. 특정 실시양태에서, X는 S이다.
본원에 기재된 바와 같이, "염기" (또한 본원에서 "B")는 임의의 천연 또는 비-천연 발생 핵염기일 수 있다. 천연 발생 염기에는 G, U, A 및 C가 포함된다. 비-천연 (예를 들어, 변형된) 염기에는 G, U, A 및 C의 치환된 또는 변형된 변이체가 포함된다. 변형된 염기의 비제한적인 예에는 5-메틸시토신, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 수도우라실, 3-메틸 우라실, 디히드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘, 5-알킬우리딘, 5-할로우리딘, 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘, 프로핀, 퀘소신, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 4-아세틸티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, β-D-갈락토실케오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카르보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, β-D-만노실케오신, 우리딘-5-옥시아세트산, 2-티오시티딘, 및 트레오닌 유도체가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
염기의 다른 비제한적인 예에는 천연 또는 비-천연 피리미딘 또는 퓨린이 포함되나 이로 제한되지 않고; N1-메틸-아데닌, N6-메틸-아데닌, 8'-아지도-아데닌, N,N-디메틸-아데노신, 아미노알릴-아데노신, 5'-메틸-우리딘, 수도우리딘, N1-메틸-수도우리딘, 5'-히드록시-메틸-우리딘, 2'-티오-우리딘, 4'-티오-우리딘, 히포크산틴, 크산틴, 5'-메틸-시티딘, 5'-히드록시-메틸-시티딘, 6'-티오-구아닌, 및 N7-메틸-구아닌이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 당은 천연 또는 비-천연 "당 치환기" R로 치환된다. 특정 실시양태에서, R은 수소, 할로겐, -CN, -NO2, -N3, 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 알케닐, 임의적으로 치환된 알키닐, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, 임의적으로 치환된 카르보시클릴, 임의적으로 치환된 헤테로시클릴, 임의적으로 치환된 아실, 임의적으로 치환된 히드록실, 임의적으로 치환된 아미노, 또는 임의적으로 치환된 티올이다. 특정 실시양태에서, R은 수소이다. 특정 실시양태에서, R은 할로겐이다. 특정 실시양태에서, R은 -CN이다. 특정 실시양태에서, R은 -NO2이다. 특정 실시양태에서, R은 -N3이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 알킬이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 알케닐이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 알키닐이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 아릴이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 헤테로아릴이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 카르보시클릴이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 아실이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 히드록실이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 아미노이다. 특정 실시양태에서, R은 임의적으로 치환된 티올이다.
특정 실시양태에서, R은 -ORP이고, RP는 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이다.
특정 실시양태에서, R은 생체접합을 위한 반응성 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 핸들, 예를 들어, 아지드 또는 알킨), 형광단, 촉매적 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 리포팅 태그를 포함한다.
일부 실시양태에서, R은 할로겐, 예를 들어 플루오린 기; 알킬 기, 예를 들어 메틸 또는 에틸 기; 메톡시 기; 아미노 기; 티오 기; 아미노프로필 기; 디메틸아미노에틸; 디메틸아미노프로필 기; 디메틸아미노에틸옥시에틸 기; 아지도 기; 실릴 기; 시클릭 알킬 기; 또는 N-메틸아세트아미도 기이다.
특정 실시양태에서, R은 히드록실 (-OH), 수소 (-H), 플루오로 (-F), 아민 (-NH3), 아지도 (-N3), 티올 (-SH), 메톡시 (-OCH3), 또는 메톡시에탄올 (-OCH2CH2OCH3)이다.
특정 실시양태에서, R은 산화환원-활성, 형광원성 또는 본질적으로 형광성인 모이어티, 천연 및 비-천연 아미노산, 펩티드, 단백질, 단당류 또는 올리고당류, 기능적/리간드 결합 글리칸, 또는 중합체 또는 거대 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서 정의된 바와 같이, 각각의 RP는 독립적으로 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이다. 특정 실시양태에서, RP는 산소 보호기이다. 특정 실시양태에서, RP는 임의적으로 치환된 아실이다. 특정 실시양태에서, RP는 아미노산이다. 특정 실시양태에서, RP는 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 에스테라제에 의해 절단될 수 있는 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 광화학적 조건하에 탈보호될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 가역적인 종결자 RNA 올리고뉴클레오티드는 2'-O- 및/또는 3'-O-위치에서 광불안정성 산소 보호기로 보호된다. 특정 실시양태에서, 2'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 2'-O 위치에서 광불안정성 보호기로 보호된다. 특정 실시양태에서, 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 3'-O 위치에서 광불안정성 보호기로 보호된다.
특정 실시양태에서, 2'- 또는 3'-O-보호기 (예를 들어, RP)는 하기 화학식 중 하나이다:
Figure pct00009
.
특정 실시양태에서, 2'- 또는 3'-O-보호기 (예를 들어, RP)는 하기 화학식 중 하나이다:
Figure pct00010
.
특정 실시양태에서, 2'- 또는 3'-O-보호기 (예를 들어, RP)는 하기 화학식 중 하나이다:
Figure pct00011
.
특정 실시양태에서, 2'- 또는 3'-O-보호기 (예를 들어, RP)는 하기 화학식의 것이다:
Figure pct00012
.
특정 실시양태에서, 2'- 또는 3'-O-보호기 (예를 들어, RP)는 하기 화학식의 아미노산이다:
Figure pct00013
.
특정 실시양태에서, 각각의 경우의 RP는 독립적으로 알킬, 실릴, 알릴, 아지도메틸, 벤질, 코우마리닐, 또는 카르보네이트이다.
특정 실시양태에서, 2'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 2'-O-알킬, 2'-O-실릴, 2'-O-알릴, 2'-O-아지도메틸, 2'-O-벤질, 2'-O-코우마리닐, 또는 2'-O-카르보네이트 변형된 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 2'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 2'-O-알릴옥시카르보닐 및 2'-O-(2-옥소-2H-크로멘-4-일)메틸옥시카르보닐로부터 선택된 2'-O-카르보네이트 변형된 뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 2'-O-보호된 가역적인 종결자는 2'-O-알릴-NTP 또는 2'-O-아지도메틸-NTP이다.
특정 실시양태에서, 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 3'-O-알킬, 3'-O-실릴, 3'-O-알릴, 3'-O-아지도메틸, 3'-O-벤질, 3'-O-코우마리닐, 또는 3'-O-카르보네이트 변형된 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드는 3'-O-알릴옥시카르보닐 및 3'-O-(2-옥소-2H-크로멘-4-일)메틸옥시카르보닐로부터 선택된 3'-O-카르보네이트 변형된 뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 3'-O-보호된 가역적인 종결자는 3'-O-알릴-NTP, 3'-O-아지도메틸-NTP, 3'-O-알릴 카르보네이트-NTP, 3'-O-알릴 카르보네이트-dNTP, 3'-O-아지도메틸 카르보네이트-NTP, 또는 3'-O-아지도메틸 카르보네이트-dNTP이다.
특정 실시양태에서, 3'-O-보호된 가역적인 종결자는 3'-O-알릴-NTP, 3'-(O-알릴-카르보네이트)-dNTP (예를 들어, 3'-(O-알릴-카르보네이트)-dATP 등), 3'-(O-아지도메틸 카르보네이트)-dNTP, 3'-(O-아세테이트)-dNTP, 3'-(O-아실 아미노산)-dNTP, 3'-(O-3-메틸코우마린)-dNTP, 3'-(O-(4-메틸코우마린 카르보네이트)-dNTP, 3'-(O-(2-니트로벤질)-dNTP, 3'-(O-(2-니트로벤질 카르보네이트)-dNTP, 3'-(O-TMS)-dNTP, 또는 3'-(O-Teoc)-dNTP이다.
3'-보호된 뉴클레오티드의 특정 실시양태를 비롯하여 가역적인 종결자 뉴클레오티드의 다른 특정 실시양태가 도 28-34에 도시된다.
본원에 기재된 바와 같이, 가역적인 종결자 올리고뉴클레오티드는 산소 보호기 (예를 들어, RP 기)로 보호될 수 있다. 산소 보호기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 본원에 참고로 포함된 [Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에 상세하게 기재된 것들이 포함된다. 예시적인 산소 보호기에는 메틸, 메톡실메틸 (MOM), 메틸티오메틸 (MTM), t-부틸티오메틸, (페닐디메틸실릴)메톡시메틸 (SMOM), 벤질옥시메틸 (BOM), p-메톡시벤질옥시메틸 (PMBM), (4-메톡시페녹시)메틸 (p-AOM), 구아이아콜메틸 (GUM), t-부톡시메틸, 4-펜테닐옥시메틸 (POM), 실록시메틸, 2-메톡시에톡시메틸 (MEM), 2,2,2-트리클로로에톡시메틸, 비스(2-클로로에톡시)메틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 (SEMOR), 테트라히드로피라닐 (THP), 3-브로모테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 1-메톡시시클로헥실, 4-메톡시테트라히드로피라닐 (MTHP), 4-메톡시테트라히드로티오피라닐, 4-메톡시테트라히드로티오피라닐 S,S-디옥시드, 1-[(2-클로로-4-메틸)페닐]-4-메톡시피페리딘-4-일 (CTMP), 1,4-디옥산-2-일, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오푸라닐, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로-7,8,8-트리메틸-4,7-메타노벤조푸란-2-일, 1-에톡시에틸, 1-(2-클로로에톡시)에틸, 1-메틸-1-메톡시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시-2-플루오로에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-트리메틸실릴에틸, 2-(페닐셀레닐)에틸, t-부틸, 알릴, p-클로로페닐, p-메톡시페닐, 2,4-디니트로페닐, 벤질 (Bn), p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, o-니트로벤질, p-니트로벤질, p-할로벤질, 2,6-디클로로벤질, p-시아노벤질, p-페닐벤질, 2-피콜릴, 4-피콜릴, 3-메틸-2-피콜릴 N-옥시도, 디페닐메틸, p,p'-디니트로벤즈히드릴, 5-디벤조수베릴, 트리페닐메틸, α-나프틸디페닐메틸, p-메톡시페닐디페닐메틸, 디(p-메톡시페닐)페닐메틸, 트리(p-메톡시페닐)메틸, 4-(4'-브로모펜아실옥시페닐)디페닐메틸, 4,4',4"-트리스(4,5-디클로로프탈이미도페닐)메틸, 4,4',4"-트리스(레불리노일옥시페닐)메틸, 4,4',4"-트리스(벤조일옥시페닐)메틸, 3-(이미다졸-1-일)비스(4',4"-디메톡시페닐)메틸, 1,1-비스(4-메톡시페닐)-1'-피레닐메틸, 9-안트릴, 9-(9-페닐)크산테닐, 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴, 1,3-벤조디티올란-2-일, 벤즈이소티아졸릴 S,S-디옥시도, 트리메틸실릴 (TMS), 트리에틸실릴 (TES), 트리이소프로필실릴 (TIPS), 디메틸이소프로필실릴 (IPDMS), 디에틸이소프로필실릴 (DEIPS), 디메틸헥실실릴, t-부틸디메틸실릴 (TBDMS), t-부틸디페닐실릴 (TBDPS), 트리벤질실릴, 트리-p-크실릴실릴, 트리페닐실릴, 디페닐메틸실릴 (DPMS), t-부틸메톡시페닐실릴 (TBMPS), 포르메이트, 벤조일포르메이트, 아세테이트, 클로로아세테이트, 디클로로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 메톡시아세테이트, 트리페닐메톡시아세테이트, 페녹시아세테이트, p-클로로페녹시아세테이트, 3-페닐프로피오네이트, 4-옥소펜타노에이트 (레불리네이트), 4,4-(에틸렌디티오)펜타노에이트 (레불리노일디티오아세탈), 피발로에이트, 아다만토에이트, 크로토네이트, 4-메톡시크로토네이트, 벤조에이트, p-페닐벤조에이트, 2,4,6-트리메틸벤조에이트 (메시토에이트), 메틸 카르보네이트, 9-플루오레닐메틸 카르보네이트 (Fmoc), 에틸 카르보네이트, 2,2,2-트리클로로에틸 카르보네이트 (Troc), 2-(트리메틸실릴)에틸 카르보네이트 (TMSEC), 2-(페닐술포닐) 에틸 카르보네이트 (Psec), 2-(트리페닐포스포니오) 에틸 카르보네이트 (Peoc), 이소부틸 카르보네이트, 비닐 카르보네이트, 알릴 카르보네이트, t-부틸 카르보네이트 (BOC 또는 Boc), p-니트로페닐 카르보네이트, 벤질 카르보네이트, p-메톡시벤질 카르보네이트, 3,4-디메톡시벤질 카르보네이트, o-니트로벤질 카르보네이트, p-니트로벤질 카르보네이트, S-벤질 티오카르보네이트, 4-에톡시-1-나프틸 카르보네이트, 메틸 디티오카르보네이트, 2-아이오도벤조에이트, 4-아지도부티레이트, 4-니트로-4-메틸펜타노에이트, o-(디브로모메틸)벤조에이트, 2-포르밀벤젠술포네이트, 2-(메틸티오메톡시)에틸, 4-(메틸티오메톡시)부티레이트, 2-(메틸티오메톡시메틸)벤조에이트, 2,6-디클로로-4-메틸페녹시아세테이트, 2,6-디클로로-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페녹시아세테이트, 2,4-비스(1,1-디메틸프로필)페녹시아세테이트, 클로로디페닐아세테이트, 이소부티레이트, 모노숙시노에이트, (E)-2-메틸-2-부테노에이트, o-(메톡시아실)벤조에이트, α-나프토에이트, 니트레이트, 알킬 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미데이트, 알킬 N-페닐카르바메이트, 보레이트, 디메틸포스피노티오일, 알킬 2,4-디니트로페닐술페네이트, 술페이트, 메탄술포네이트 (메실레이트), 벤질술포네이트, 및 토실레이트 (Ts)가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 산소 보호기는 실릴이다. 특정 실시양태에서, 산소 보호기는 t-부틸디페닐실릴 (TBDPS), t-부틸디메틸실릴 (TBDMS), 트리이소프로필실릴 (TIPS), 트리페닐실릴 (TPS), 트리에틸실릴 (TES), 트리메틸실릴 (TMS), 트리이소프로필실록시메틸 (TOM), 아세틸 (Ac), 벤조일 (Bz), 알릴 카르보네이트, 2,2,2-트리클로로에틸 카르보네이트 (Troc), 2-트리메틸실릴에틸 카르보네이트, 메톡시메틸 (MOM), 1-에톡시에틸 (EE), 2-메티옥시-2-프로필 (MOP), 2,2,2-트리클로로에톡시에틸, 2-메톡시에톡시메틸 (MEM), 2-트리메틸실릴에톡시메틸 (SEM), 메틸티오메틸 (MTM), 테트라히드로피라닐 (THP), 테트라히드로푸라닐 (THF), p-메톡시페닐 (PMP), 트리페닐메틸 (Tr), 메톡시트리틸 (MMT), 디메톡시트리틸 (DMT), 알릴, p-메톡시벤질 (PMB), t-부틸, 벤질 (Bn), 알릴, 또는 피발로일 (Piv)이다.
특정 실시양태에서, 3'-가역적인 종결자는 3'-O-아미노산 (예를 들어, 임의의 표준 또는 비-표준 아미노산을 포함함)이다. 특정 실시양태에서, 아미노산은 에스테라제를 사용하여 제거될 수 있다.
본원에서 일반적으로 정의된 바와 같이, R''는 수소, 할로겐, -CN, -NO2, -N3, 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 알케닐, 임의적으로 치환된 알키닐, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, 임의적으로 치환된 카르보시클릴, 임의적으로 치환된 헤테로시클릴, 임의적으로 치환된 아실, 임의적으로 치환된 히드록실, 임의적으로 치환된 아미노, 또는 임의적으로 치환된 티올이다. 특정 실시양태에서, R''는 수소이다. 특정 실시양태에서, R''는 할로겐이다. 특정 실시양태에서, R''은 -CN이다. 특정 실시양태에서, R''는 -NO2이다. 특정 실시양태에서, R''는 -N3이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 알킬이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 알케닐이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 알키닐이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 아릴이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 헤테로아릴이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 카르보시클릴이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 아실이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 히드록실이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 아미노이다. 특정 실시양태에서, R''는 임의적으로 치환된 티올이다.
특정 실시양태에서, R''는 생체접합을 위한 반응성 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 핸들, 예를 들어, 아지드 또는 알킨), 형광단, 촉매적 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 리포팅 태그를 포함한다.
본원에서 일반적으로 정의된 바와 같이, R'''는 수소, 할로겐, -CN, -NO2, -N3, 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 알케닐, 임의적으로 치환된 알키닐, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, 임의적으로 치환된 카르보시클릴, 임의적으로 치환된 헤테로시클릴, 임의적으로 치환된 아실, 임의적으로 치환된 히드록실, 임의적으로 치환된 아미노, 임의적으로 치환된 티올, 또는 산소 보호기이다. 특정 실시양태에서, R'''는 수소이다. 특정 실시양태에서, R'''는 할로겐이다. 특정 실시양태에서, R'''는 -CN이다. 특정 실시양태에서, R'''는 -NO2이다. 특정 실시양태에서, R'''는 -N3이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 알킬이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 알케닐이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 알키닐이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 아릴이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 헤테로아릴이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 카르보시클릴이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 아실이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 히드록실이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 아미노이다. 특정 실시양태에서, R'''는 임의적으로 치환된 티올이다.
특정 실시양태에서, R'''는 생체접합을 위한 반응성 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 핸들, 예를 들어, 아지드 또는 알킨), 형광단, 촉매적 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 리포팅 태그를 포함한다.
본원에서 일반적으로 정의된 바와 같이, RN은 수소, 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 아실, 또는 질소 보호기이다. 특정 실시양태에서, RN은 수소이다. 특정 실시양태에서, RN은 임의적으로 치환된 알킬이다. 특정 실시양태에서, RN은 임의적으로 치환된 아실이다. 특정 실시양태에서, RN은 질소 보호기이다.
특정 실시양태에서, RN은 생체접합을 위한 반응성 모이어티 (예를 들어, 클릭 화학 핸들, 예를 들어, 아지드 또는 알킨), 형광단, 촉매적 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 리포팅 태그를 포함한다.
비-가수분해성 RNA 뉴클레오티드에 의한 RNA 올리고뉴클레오티드 합성
비-가수분해성 뉴클레오티드를 사용하여 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법 또한 본원에 제공된다. 본원에 기재된 바와 같이, 폴리머라제가 개시자 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에서 뉴클레오티드 (즉, 가수분해성 뉴클레오티드)를 혼입시킬 수 있는 속도는 효소의 활성 부위에 대해 경쟁하는 비-가수분해성 뉴클레오티드를 도입시킴으로써 제어될 수 있다. 비-가수분해성 뉴클레오티드는 혼입되지 않고, 가수분해성 뉴클레오티드의 혼입 속도는 경쟁적 억제를 통해 가수분해성 뉴클레오티드 및 비-가수분해성 뉴클레오티드의 비에 의해 직접적으로 영향을 받는다. 궁극적으로, 뉴클레오티드의 혼입 개수는 반응 혼합물에서 비-가수분해성 뉴클레오티드의 농도에 의해 결정된다. 폴리(N) 폴리머라제가 말단 트랜스퍼라제를 통해 1개 이상의 뉴클레오티드를 혼입시킨 후에, 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 수득될 때까지, 임의적으로 상이한 뉴클레오티드를 사용하여 상기 과정을 반복적인 단계에서 1회 이상 반복할 수 있다.
(a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
(b) 폴리(N) 폴리머라제를 제공하는 단계;
(c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 적어도 1개의 가수분해성 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(N) 폴리머라제, 1개 이상의 뉴클레오티드, 및 1개 이상의 비-가수분해성 뉴클레오티드를 조합하는 단계이며, 여기서 비-가수분해성 뉴클레오티드의 농도는 폴리(N) 폴리머라제에 의한 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가 속도를 억제하는데 충분한 것인 단계를 포함하는,
RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 폴리(N) 폴리머라제는 폴리(U) 폴리머라제이다.
(a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
(b) 폴리(U) 폴리머라제를 제공하는 단계;
(c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 적어도 1개의 가수분해성 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(U) 폴리머라제, 1개 이상의 뉴클레오티드, 및 1개 이상의 비-가수분해성 뉴클레오티드를 조합하는 단계이며, 여기서 비-가수분해성 뉴클레오티드의 농도는 폴리(U) 폴리머라제에 의한 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가 속도를 억제하는데 충분한 것인 단계를 포함하는,
RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법이 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드의 농도는 1-100개의 뉴클레오티드가 혼입되도록 하는 것이다. 특정 실시양태에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드의 농도는 1-50개의 뉴클레오티드가 혼입되도록 하는 것이다. 특정 실시양태에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드의 농도는 1-20개의 뉴클레오티드가 혼입되도록 하는 것이다. 특정 실시양태에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드의 농도는 100개 미만, 90개 미만, 80개 미만, 70개 미만, 60개 미만, 50개 미만, 40개 미만, 30개 미만, 20개 미만, 10개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만 또는 2개 미만의 가수분해성 뉴클레오티드가 혼입되도록 하는 것이다.
1개 이상의 뉴클레오티드가 개시자 올리고뉴클레오티드에 부가되면, 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 1개 이상의 추가의 뉴클레오티드가 후속적으로 부가될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 상기 방법은 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드 (즉, 단계 (c)에서 형성된 RNA 올리고뉴클레오티드)의 3' 말단에 1개 이상의 천연 또는 변형된 뉴클레오티드를 부가하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (d) 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 단계 (a)-(c)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다.
비-가수분해성 RNA 뉴클레오티드
본원에 제공된 방법은 비-가수분해성 뉴클레오티드를 사용한다. "비-가수분해성" 뉴클레오티드는 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있지만, 개시자 올리고뉴클레오티드에 대한 (예를 들어, 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 대한) 효소-촉매된 부가 (즉, 말단 트랜스퍼라제 반응)를 겪을 수는 없는 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드는 포스페이트-변형된 뉴클레오티드이다 (즉, 변형된 트리포스페이트 기를 포함함). 본원에 기재된 방법에 유용한 비-가수분해성 뉴클레오티드 또한 본원에 제공된다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드는 하기 화학식의 것 또는 그의 염이다:
Figure pct00014
상기 식에서:
각각의 Y는 독립적으로 -O-, -NRN-, -C(RC)2-, 또는 -S-이며; 단, 적어도 1개의 Y는 -O-가 아니고;
R 및 R'는 독립적으로 수소 또는 본원에서 정의된 당 치환기이고;
"염기"는 본원에서 정의된 천연 또는 비-천연 (예를 들어, 변형된) 뉴클레오티드 염기이고;
RN은 수소, 임의적으로 치환된 알킬, 또는 질소 보호기이고;
각각의 경우의 RC는 독립적으로 수소, 할로겐, 또는 임의적으로 치환된 알킬이다. 특정 실시양태에서, -NRN-은 -NH-이다. 특정 실시양태에서, -C(RC)2-는 -CH2-이다.
특정 실시양태에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드는 변형된 트리포스페이트 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드는 우리딘-5'-[(α,β)-이미도]트리포스페이트, 아데노신-5'-[(α,β)-이미도]트리포스페이트, 구아노신-5'-[(α,β)-메틸레노]트리포스페이트, 시티딘-5'-[(α,β)-메틸레노]트리포스페이트, 아데노신-5'-[(β,γ)-이미도]트리포스페이트, 구아노신-5'-[(β,γ)-이미도]트리포스페이트, 및 우리딘-5'-[(β,γ)-이미도]트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 트리포스페이트 기는 임의의 다른 변형을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드는 3'-변형된 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 비-가수분해성 뉴클레오티드는 3'-O-메틸아데노신-5'-트리포스페이트 및 3'-O-메틸우리딘-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
비-가수분해성 뉴클레오티드는 본원에서 상기 기재된 임의의 다른 뉴클레오티드 변형을 추가로 포함할 수 있다.
RNA 올리고뉴클레오티드 합성 반응
본원에 기재된 말단 트랜스퍼라제 반응 (즉, 본원에 기재된 임의의 방법의 단계 (c))은 폴리머라제 효소 (예를 들어, 폴리(N) 폴리머라제)의 존재하에 수행된다. 특정 실시양태에서, 단계 (c)는 1종 이상의 추가의 효소의 존재하에 수행된다. 특정 실시양태에서, 단계 (c)는 2종 이상의 상이한 효소의 혼합물의 존재하에 수행된다. 효소의 혼합물은 1개 초과의 별개의 폴리(N) 폴리머라제 (예를 들어, 2 또는 3가지 상이한 폴리(N) 폴리머라제)를 포함할 수 있다. 폴리(N) 폴리머라제 효소의 혼합물은 야생형 및 돌연변이 폴리(N) 폴리머라제 (예를 들어, 본원에 제공된 돌연변이된 폴리(U) 폴리머라제) 둘 다를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 단계 (c)는 폴리(N) 폴리머라제 외에도 1종 이상의 추가의 포스파타제의 존재하에 수행된다. 특정 실시양태에서, 단계 (c)는 폴리(N) 폴리머라제 외에도 효모 무기 피로포스파타제 (PPI-ase)의 존재하에 수행된다.
특정 실시양태에서, 단계 (c)에서 말단 트랜스퍼라제 반응은 1종 이상의 추가의 첨가제의 존재하에 수행된다. 특정 실시양태에서, 단계 (c)는 크라우딩제(crowding agent)의 존재하에 수행된다. 특정 실시양태에서, 크라우딩제는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 피콜(Ficoll)이다. 특정 실시양태에서, 크라우딩제는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 특정 실시양태에서, 단계 (c)는 RNase 억제제의 존재하에 수행된다. 특정 실시양태에서, 단계 (c)는 비-가수분해성 뉴클레오티드의 존재하에 수행된다.
개시자 올리고뉴클레오티드
본원에 기재된 방법은 개시자 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 개시자 올리고뉴클레오티드는 임의의 서열일 수 있고, 임의의 개수의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 20개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 5-20개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 20개 초과의 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 폴리-rN 올리고뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 폴리-rU, 폴리-rC, 폴리-rG, 또는 폴리-rA이다.
개시자 올리고뉴클레오티드는 또한 고체 지지체에 공유 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 수득된 후에, 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체로부터 절단된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 절단가능한 링커를 통해 고체 지지체에 공유 연결된다.
개시자 올리고뉴클레오티드는 다른 변형, 예컨대 형광단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 5'-형광단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 형광단은 Cy5 또는 FAM이다. 개시자 올리고뉴클레오티드는 또한 생체접합을 위해 1개 이상의 추가의 관능기 또는 핸들을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 비오틴으로 관능화된다.
특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 5'-포스페이트 (예를 들어, 5'-모노-, 디- 또는 트리포스페이트)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 5'-모노포스페이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 5'-디포스페이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 5'-트리포스페이트를 포함한다.
특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 5'-캡핑 기 (즉, 5' 캡)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 5' 캡은 모노-뉴클레오티드 (1-nt), 디-뉴클레오티드 (2-nt), 트리-뉴클레오티드 (3-nt), 또는 N-뉴클레오티드 (즉, 유용한 임의의 올리고뉴클레오티드 길이)일 수 있다. 5' 캡은 또한 본원에 기재된 것들을 비롯하여 1개 이상의 천연 및 비-천연 (예를 들어, 변형된) 뉴클레오시드 염기의 조합물을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 5' 캡은 구아닌 캡이다. 특정 실시양태에서, 5' 캡은 7-메틸구아닐레이트 캡 (m7G)이다. 특정 실시양태에서, 구아닌 또는 m7G 캡은 5' 대 5' 트리포스페이트 연결을 통해 올리고뉴클레오티드에 연결된 구아닌 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 5' 캡은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 제1 및/또는 제2의 2 리보스 당의 2' 히드록시 기의 메틸화를 포함한다.
특정 실시양태에서, 5'-캡은 5'-트리메틸구아노신 캡 또는 5'-모노메틸포스페이트 캡이다. 다른 실시양태에서, 5' 캡은 NAD+, NADH, 또는 3'-데포스포-조효소 A 캡이다.
특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 합성된 RNA 올리고뉴클레오티드의 역전사를 위해 프라이머 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개시자 올리고뉴클레오티드는 PCR 증폭을 위한 프라이머 부위를 포함한다.
5'-삼인산화 올리고뉴클레오티드와 함께 RNA 단편의 스플라이싱
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 긴 RNA (예를 들어, > 100-nt 길이) 분자를 생성하기 위해 주형-비의존성 폴리머라제에 의해 5'-트리포스페이트 기를 사용하여 올리고뉴클레오티드 단편을 함께 스플라이싱 (즉, 라이게이션)하는데 적용될 수 있다.
개시자 올리고뉴클레오티드로서 또는 제어된 주형-비의존성 효소적 합성 (예를 들어, 본원에 기재된 방법)의 생성물로서 합성된 5'-트리포스페이트 올리고뉴클레오티드는 폴리머라제, 예컨대 폴리(U) 폴리머라제 또는 그의 돌연변이된 변이체 (예를 들어, 본원에 기재된 돌연변이된 변이체)의 기질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리(U) 폴리머라제 또는 그의 돌연변이된 변이체는 큰 3'-변형을 수용한다. 일부 예에서, 3'-변형은 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 보호기 대신에 일련의 핵산 (즉, 올리고뉴클레오티드)이다.
따라서,
(a) 제1 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 제1 올리고뉴클레오티드는 5'-트리포스페이트 기를 포함하는 것이 단계;
(b) 제2 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;
(c) 폴리(U) 폴리머라제를 제공하는 단계;
(d) 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 제1 올리고뉴클레오티드를 라이게이션하는데 충분한 조건하에 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 및 폴리(U) 폴리머라제를 조합하는 단계를 포함하는,
RNA 올리고뉴클레오티드의 합성 방법이 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 제2 올리고뉴클레오티드는 3'-OH 올리고뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 5'-트리포스페이트 올리고뉴클레오티드는 알파 (α)-포스페이트에서 포스포로티오에이트를 포함하도록 변형된다.
특정 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 5'-삼인산화 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 핵염기, 당 또는 백본에 대해 1개 이상의 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 핵염기, 당 또는 백본에 1개 이상의 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 주형-비의존성 라이게이션은 본원에 기재된 크라우딩제 등의 첨가와 같이 라이게이션 활성을 증강시키는 반응 조건에서 발생한다.
RNA 올리고뉴클레오티드의 역전사 및 증폭
본원에 제공된 방법은 DNA 올리고뉴클레오티드의 합성에 적용될 수 있다. 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드가 본원에 기재된 방법을 통해 수득된 후, 하나 이상의 추가의 역전사 및/또는 증폭 단계를 수행하여 DNA (예를 들어, cDNA, ssDNA, 이중 가닥 DNA)를 수득할 수 있다. 최종 결과는 DNA 올리고뉴클레오티드의 제어된 주형-비의존성 합성 방법이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
(f) 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드 상에서 역전사 프라이밍 부위, 프라이머, 및 역전사 효소를 사용하여 역전사를 수행하여, 상보성 단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계. 특정 실시양태에서, 역전사 효소는 고충실도 역전사 효소이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
(g) 단계 (f)에서 역전사를 통해 합성된 RNA 올리고뉴클레오티드로부터 생성된 상보성 단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 cDNA를 DNA 폴리머라제에 의해 증폭시켜, 이중-가닥 DNA를 생성하는 단계. 특정 실시양태에서, DNA 폴리머라제는 고충실도 DNA 폴리머라제이다.
실시예
서론
올리고뉴클레오티드-기반 치료제는 의약의 합리적으로 설계되고 개인화되고 포스트게놈 시대에 떠오르는 양식이다 (Khvorova et al. 2017). 천연 및/또는 비-천연의 변형된 핵산 빌딩 블록의 짧은 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 치료제는 최적의 약동학 프로파일을 유지하면서 최대 효능으로 표적에 영향을 미치도록 특이적으로 조정될 수 있다 (Deleavey et al. 2012). 이는 올리고뉴클레오티드의 당 고리, 핵염기, 및 포스페이트 백본 뿐만 아니라 전반적인 3차원 구조에 대해 주의깊게 선택된 변형의 조합을 포함할 수 있는 올리고뉴클레오티드 치료제의 화학적 및 구조적 아키텍쳐에 의해 주로 정의된다 (Cummins et al. 1995, Eckstein 2014, Watts et al. 2008, Wilson et al. 2006). 핵산 빌딩 블록이 조립되는 화학적 조성 및 서열은 올리고뉴클레오티드 치료제의 전체 성질을 부여하고; 약간의 재배열 또는 상이한 화학적 모이어티는 잠재적으로 그의 치료 능력을 개선시킬 수 있다 (Khvorova et al. 2017, Koch et al. 2014, Bohr et al. 2017). 이는 최적화를 위해 대대적인 재설계가 필요할 수 있는 전통적인 소분자 치료제에 비해 분명한 주요 이점이다. 짧은 (< 50-nt) 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO) (Goyal et al. 2018, Uhlmann et al. 1990), 짧은-간섭 RNA (siRNA) (Dana et al. 2017), 마이크로RNA (miRNA) (Rupaimoole et al. 2017) 등 뿐만 아니라 더 긴 (> 100-nt) 메신저 RNA (mRNA) (Pardi et al. 2018) 및 긴-비코딩 RNA (lncRNA) (Arun et al. 2018)와 같이 성공적인 올리고뉴클레오티드 치료제 부류의 다양한 어레이가 있지만, 이들 각각에서 하나의 통합 주제는 특히 대규모로 그들의 생성이 현재 상태의 올리고뉴클레오티드 합성 기술에 의해 크게 제한된다는 것이다 (Ma et al. 2012).
포스포르아미다이트 화학을 이용하는 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드의 합성은 1970년대 이후 과학 연구의 주요소였다 (Beaucage et al. 1992). 포스포르아미다이트 화학은 4개의 천연 핵염기로 구성된 짧고 복잡하지 않은 DNA 올리고뉴클레오티드의 합성을 위해 매우 신뢰할만 하고 저렴하다. 그러나, 대규모의 병렬화된 합성 및 자동화 기술의 출현을 제외하고는, 포스포르아미다이트-기반 올리고뉴클레오티드 합성의 핵심 방법론에 대해 약간의 점진적인 개선만이 있었다 (Beaucage et al. 1992, Kosuri et al. 2014). 이는 특히 RNA 및 고도로 변형된 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성에 해당되며, 이는 여전히 매우 고가이고, 수율이 낮으며, 종종 적당한 양의 원하는 생성물을 단리하기 위해서는 소요 시간을 크게 증가시키는 합성 후 여러 번의 정제를 필요로 한다 (Baronti et al. 2018). 추가로, 유기 용매 및 가혹한 조건은 예를 들어 전달 또는 리간드 결합 목적을 위해 올리고뉴클레오티드에 독특한 성질을 부여할 수 있는 불안정한 모이어티를 위한 추가의 보호기를 필요로 함으로써 합성 계획을 복잡하게 만들기 때문에 (Baronti et al. 2018), 포스포르아미다이트 화학은 여러 현재의 올리고뉴클레오티드 치료제를 위해 필요한 화학적 변형의 큰 레퍼토리에 특히 도움이 되지 않는다 (Khvorova et al. 2017). 시험관 내 전사 (IVT) 전략은 이들 제한 중 일부; 특히 현재로서는 포스포르아미다이트 화학에 의해 불가능한 긴 RNA 올리고뉴클레오티드 (> 120-nt)의 생성을 개선시켰다 (Pardi et al. 2018, Milligan et al. 1987, Sahin et al. 2014). 그러나, IVT는 올리고뉴클레오티드의 부위-특이적인 표지화를 허용하지 않고, 적절한 효소 촉매작용을 위해서는 DNA 주형을 사용하는 것 외에도 특정한 염기 교체를 필요로 한다. 불행하게도, 고비용의 어려운 합성, 및 다양한 핵산 빌딩 블록의 접근 불가능성의 조합은 연구자들이 쇠약하게 하는 질환과 싸우기 위한 혁신적인 올리고뉴클레오티드 치료제를 개발하는 것을 힘들게 한다.
올리고뉴클레오티드 합성 및 올리고뉴클레오티드-기반 치료제 개발의 상기 언급된 제한을 해결하기 위한 하나의 잠재적인 해결책은 포스포르아미다이트 화학의 사용을 완전히 우회하는 것이다. 현재, 올리고뉴클레오티드 신생 합성을 위해 짧은 개시자 서열의 3'-말단에 뉴클레오시드 모노포스페이트를 부가하는 것을 촉매하는 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제로 공지된 폴리머라제의 부류를 사용하는데 큰 관심이 있다 (Perkel 2019, Pratt et al., 2008). 여러 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제는 주형 서열의 사용을 필요로 하지 않고, 그들의 반응은 수성 조건하에 수행될 수 있으며, 이는 핵염기 탈퓨린화, 원치않는 삽입 또는 결실, 및 비가역적으로 캡핑된 말단절단 생성물의 축적을 비롯하여 화학적 올리고뉴클레오티드 합성의 여러 부정적인 측면을 피하게 한다. 주형-비의존성 신생 올리고뉴클레오티드 합성을 가능하게 하는 일부 주목할만한 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제에는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (TdT) (Motea et al. 2010), Cid1 폴리(U) 폴리머라제 (PuP) (Munoz-Tello et al. 2012), 폴리(A) 폴리머라제 (PaP) (Balbo et al. 2007), 폴리(G) 폴리머라제 (PgP), 폴리(C) 폴리머라제 (PcP), CCD-부가 효소 (Cho et al. 2007), 폴리머라제 뮤 (μ) (Dominguez et al. 2000), 및 폴리머라제 쎄타 (Θ) (Thomas et al. 2019)가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 상기 언급된 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 중에서, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제만이 효소적 올리고뉴클레오티드 합성의 성공적인 입증에서 사용되었다 (Palluk et al. 2019). 그러나, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제가 제어하기 어렵고, 천연 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트에 대해 강한 선호도를 가지며, 무엇보다도 특정 핵염기 및 개시자 조합에 대해 지나치게 편향되어 있기 때문에, 지금까지 DNA 데이터 저장에서의 적용만이 가능하며, 이는 저장된 데이터를 검색하기 위해 합성 후에 계산적으로 정확할 수 있는 속성이다 (Ceze et al. 2019, Anavy et al. 2019, Lee et al. 2019). 따라서, (1) 가역적인 차단된 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용하여 성장하는 서열을 단일 염기 (n+1)만큼 연장시킬 수 있고, (2) 올리고뉴클레오티드에 치료적 또는 다른 가치를 부여하는 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트의 어레이를 혼입시킬 수 있고, (3) 산업적으로 적절한 산출로 확장될 수 있는 효소적 올리고뉴클레오티드 합성 플랫폼의 개발이 특히 중요하다.
RNA 올리고뉴클레오티드의 제어된 효소적 합성
효소 촉매작용을 통한 RNA 올리고뉴클레오티드의 제어된 신생 합성을 위한 몇몇 방법이 개발되었다. 주형 서열 없이도 천연 및 변형된 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (rNTP)를 효율적으로 혼입시키는 능력을 갖는 조작된 및 야생형 폴리머라제를 사용하여, 개시자 올리고뉴클레오티드 서열의 3'-OH에 뉴클레오티드를 반복적으로 부가할 수 있다. 그들의 부가는 단일 또는 다중 혼입 사건을 통한 것일 수 있다. 효소 기능을 위해 필요한 생물학적으로 적합성인 반응 조건은 화학적 합성과 일반적으로 연관이 있는 분해에 대한 RNA 올리고뉴클레오티드의 민감성을 크게 감소시킨다. 이들 방법은 미세유체 또는 어레이-기반 포맷에 통합되어, 여러 RNA 올리고뉴클레오티드를 높은 비용 효율성으로 동시에 합성할 수 있다. 이 방법에 의해 합성된 RNA 올리고뉴클레오티드는 낮은 오류율로 생성될 수 있고, 하류 생명공학 적용에 대해 생물학적으로 적합성일 것이다.
DNA/RNA-지정 폴리머라제, 폴리머라제 μ, 및 RNA-지정 폴리머라제, 폴리(A) 폴리머라제 (PAP) 및 폴리(U) 폴리머라제는 상기 언급된 RNA 합성 계획에 적합성인 폴리머라제의 3가지 예이다. 그러나, 주형 서열을 필요로 하지 않고 개시자 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 뉴클레오티드를 부가시키는 능력을 갖는 임의의 다른 폴리머라제 또는 효소, 예컨대 CCA-부가 효소가 사용될 수 있다. 이는 제어된 신생 RNA 합성을 위해 유사한 또는 증가된 능력을 나타내는 가능한 기능적 돌연변이체를 포함한다.
본 발명의 일부 가능한 적용에는 하기가 포함된다: (1) 100-nt보다 긴 RNA 올리고뉴클레오티드의 비용 효율적인 고충실도 신생 합성, (2) 합성된 RNA 올리고뉴클레오티드는 생물학적 물질, 예컨대 합성 전달 RNA, 리보솜 RNA, 자가-폴딩 RNA 구조체, 신규한 리보자임, 단백질 결합 복합체, RNA 치료제, CRISPR/Cas9 가이드 RNA, 및 RNA 시퀀싱 프로브 (예컨대 동일계 내 시퀀싱을 위한 패드록 프로브)의 저렴하고 고품질인 공급원으로 사용될 수 있음, (3) 역전사에 의한 전환을 통해 유용하고 PCR 증폭가능한 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 유전자 서열의 생성, 및 (4) RNA 합성에 사용되는 효소, 예컨대 Pol(μ) (DNA/RNA-지정 폴리머라제)는 생물학적으로 적합성인 반응 조건하에 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 유전자 서열의 제어된 효소적 합성을 위한 추가의 후보임.
방해하는 반응 조건에 의한 rNTP 혼입 속도 제어
RNA 올리고뉴클레오티드 합성은 천연 뉴클레오티드 혼입 촉매작용 속도를 크게 방해하고 원하는 길이의 생성물을 최대화시키는 반응 성분을 선택함으로써, 예컨대 비-가수분해성 또는 비적합성 뉴클레오티드의 부가에 의해 제어될 수 있다 (도 1). 천연 rNTP는 예정된 조성 및 길이를 갖는 개시 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드 이종- 또는 단독중합체 서열의 3'-말단에 부가된다. 개시자 올리고뉴클레오티드는 20-nt 미만일 수 있다. 개시 올리고뉴클레오티드는 또한 화학적 변형, 예컨대 광불안정성이거나, 또는 효소적 합성 후에 전장 RNA 올리고뉴클레오티드 생성물로부터 절단 및 분리를 가능하게 하는 전기화학적 성질을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 혼입 사건의 수는 천연 뉴클레오티드 대 반응 용기에 또한 존재하는 비-가수분해성 또는 비적합성 뉴클레오티드의 농도 비에 비례한다. 올리고뉴클레오티드 합성 속도는 경쟁적 억제를 통해 이러한 비에 의해 직접적으로 영향을 받으며, 낮은 농도의 비-가수분해성 또는 비적합성 뉴클레오티드에서는 더 높은 반응 속도에서 더 긴 RNA 올리고뉴클레오티드가 수득되고, 높은 농도의 비-가수분해성 또는 비적합성 뉴클레오티드에서는 더 느린 반응 속도에서 작은 RNA 올리고뉴클레오티드가 수득된다. 비-가수분해성 뉴클레오티드에는 효소에 대한 뉴클레오티드의 결합 친화도에 영향을 미치지 않는 트리포스페이트의 α-, β- 또는 γ-포스페이트에 대해 변형을 갖는 것들이 포함된다. 비적합성 뉴클레오티드에는 효소에 대한 뉴클레오티드의 결합 친화도를 유의하게 변경시키지 않고 비반응성을 일으키는 2'- 및/또는 3'-모이어티, 또는 뉴클레오티드 염기에 대한 변형을 갖는 것들이 포함된다. 한 실시양태에서, 이 합성 계획은 다중 염기가 표면 결합된 개시자 올리고뉴클레오티드에 혼입될 수 있도록 상이한 천연 뉴클레오티드가 신속하게 전환될 수 있는 미세유체 설정에서 수행될 수 있다.
변형된 rNTP 혼입 가역성은 추가의 혼입 사건을 방지한다
RNA 올리고뉴클레오티드 합성은 또한 연장 반응을 단지 하나의 혼입 사건 (n+1)으로 제한하기 위해 개시자 올리고뉴클레오티드에 대한 폴리머라제의 결합 친화도를 일시적으로 변경시키는 변형된 뉴클레오티드를 혼입시킴으로써 제어될 수 있다 (도 2). 변형된 rNTP는 예정된 조성 및 길이를 갖는 개시 올리고뉴클레오티드 서열의 3'-말단에 부가된다. 개시자 올리고뉴클레오티드는 20-nt 미만일 수 있다. 개시 올리고뉴클레오티드는 또한 화학적 변형, 예컨대 광불안정성이거나, 또는 효소적 합성 후에 전장 RNA 올리고뉴클레오티드 생성물로부터 절단 및 분리를 가능하게 하는 전기화학적 성질을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 단일 변형된 뉴클레오티드의 혼입은 효소가 (n+1)를 넘는 추가의 뉴클레오티드를 더 이상 혼입시킬 수 없도록 개시 올리고뉴클레오티드에 대한 효소의 결합 친화도를 변경시킨다. 변형된 뉴클레오티드는 예를 들어 뉴클레오티드의 2'-, 3'- 또는 2'- & 3'-위치에서 비-천연 화학적 도메인을 가질 수 있다 (도 2). 변형된 rTNP가 혼입되면, 생물학적으로 적합성인 조건하에 최적으로 기능하는 온화한 탈보호 반응이 이용되어, 천연 화학적 도메인을 드러내도록 상기 변형을 제거한다. 탈보호시, 효소는 올리고뉴클레오티드에 대한 친화도를 회복하고, 서열의 다음 염기에 상응하는 추가의 변형된 뉴클레오티드를 혼입시킬 수 있다 ((n+1)+1). 원하는 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 생성될 때까지, 변형된 뉴클레오티드 혼입, 탈보호, 및 효소 결합 친화도 회복의 과정은 반복적으로 수행된다. 이 계획의 요건은, n에서 n+1로의 전환율이 매우 효율적이어서, 효소가 이러한 능력을 갖도록 보장하는 단계가 취해질 것이라는 것이다. 한 실시양태에서, 성공적인 혼입 사건은 혼입 후에 형광단 또는 형광단 부착을 위한 반응성 도메인을 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 선택함으로서 광학적으로 모니터링될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이 합성 계획은 미사용 뉴클레오티드를 세척해 내고, 다음 연장 라운드를 위한 연장된 RNA 올리고뉴클레오티드를 준비하는 미세유체 설정에서 수행될 수 있다.
제어된 RNA 합성을 위한 폴리머라제 효소
패밀리 X 폴리머라제
패밀리 X로부터의 폴리머라제, 예컨대 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (TdT), 폴리머라제 뮤 (Pol μ), 폴리머라제 베타 (Pol β), 및 폴리머라제 람다 (Pol λ)는 RNA 올리고뉴클레오티드의 제어된 주형-비의존성 합성을 위한 후보이다 (Fowler 및 Suo 2006). 이들 고도로 특수화된 폴리머라제는 중요한 DNA 복구 경로, 예컨대 V(D)J 재조합 동안에 비-상동성 말단 결합 (NHEJ) 및 항체의 생성 및 T-세포 수용체 다양성에서 핵심적인 추진력인 것으로 나타났다 (Moon et al. 2007, 2014; Nick McElhinny 및 Ramsden 2004; Bertocci et al. 2006). 이러한 생물학적 과정에서 패밀리 X 폴리머라제의 관여는, 가변성이 필요할 때 주형과는 무관하게 프라이머 서열에 뉴클레오티드를 무차별적으로 부가하는 능력을 유지하면서, 주형-의존성 방식으로 천연 뉴클레오티드를 혼입시키는데 있어서 그들의 정밀성에 기여한다 (J. F. Ruiz et al. 2001; Dominguez et al. 2000; Motea 및 Berdis 2010). 단백질 진화 계획의 필요없이 패밀리 X 폴리머라제와 연관된 천연적인 유연성의 큰 한계가 있다는 점에서, 이러한 독특한 능력은 RNA의 효소적 합성에 이상적이다. TdT가 DNA 뉴클레오티드 외에도 천연 뉴클레오티드를 혼입시키는 능력을 갖는다는 것이 이전에 확인되었다 (Roychoudhury 1972). 패밀리 X 폴리머라제는 제안된 RNA 합성 계획에 더욱 적합성이도록 추가로 조작될 수 있다.
폴리머라제 뮤 (Pol μ)
Pol μ는 최적의 반응 조건하에 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTPS) 및 rNTP 둘 다를 DNA, RNA, 및 DNA-RNA 혼성체 올리고뉴클레오티드 기질에 효율적으로 혼입시키는 것으로 확인된 패밀리 X 폴리머라제이다 (Jose F. Ruiz et al. 2003; Agrawal et al. 2003). 효소의 일차 구조, 촉매 포켓, 및 다양한 촉매 상태에 대한 몇몇 연구는 rNTP 결합과 연관된 아미노산 잔기 및 그들의 혼입의 동역학을 결정하였다 (Moon et al. 2014; Jamsen et al. 2017; Moon et al. 2017). 흥미롭게도, 야생형 Pol μ는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 뉴클레오티드 구조를 왜곡시키지 않을 뿐만 아니라 정상적인 구성에서 활성 부위의 기하학을 유지하면서 rNTP를 혼입시키는 능력을 가지며; 이는 다른 패밀리 X 폴리머라제가 임의의 유용한 능력 또는 속도로 rNTP를 수용하는 능력에 큰 영향을 미칠 수 있는 현상이다 (Moon et al. 2017). 추가로, Pol μ가 다른 패밀리 X 폴리머라제와 비교하여 DNA 기질에 대한 그의 선호도에서 덜 차별적인 것으로 언급된 것은 가치가 있다 (Moon et al. 2015).
Pol μ 돌연변이 생성
한 연구에서, 2가지 종양 연관된 인간 Pol μ 점 돌연변이, (G174S) 및 (R175H)의 발현은 NHEJ에서 감소된 효율 및 충실도를 갖는 효소를 생성하였다. 이들 돌연변이체는 DNA 복구 과정을 가이드하는 주형 서열을 가짐에도 불구하고 뉴클레오티드를 무작위로 혼입시켜 예상된 오류율을 상당히 변경시키는 것으로 언급되었다 (Sastre-Moreno et al. 2017). 다른 그룹은 많은 비율의 Pol μ, 예컨대 N-말단 BRCT 도메인 (전형적으로 다른 DNA 복구 경로 핵심 인자와 회합됨)의 제거가 활성 효소를 생성한다는 것을 입증하였다 (Moon et al. 2014). 이들 말단절단된 변이체는 야생형 활성, 및 비-가수분해성 뉴클레오티드에 결합하는 능력을 보유하는 것으로 나타났지만, 잠재적으로 변형된 또는 벌크한 뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 더 많은 물리적인 공간을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 야생형 Pol μ는 주로 주형-의존성 폴리머라제를 특징으로 하지만; 인간 야생형 Pol μ에 대한 점 돌연변이 (R387K)는 유의한 증가된 주형-비의존성 활성을 갖는 효소를 생성하였다 (Andrade et al. 2009). 이 점 돌연변이 (R387K)는 주형-비의존성 신생 RNA 올리고뉴클레오티드 합성에서 Pol μ를 사용하는 가능성에 대해 매우 중요하고, 다시 그의 유연성의 엄청난 가치를 반복한다. Pol μ는 주형-의존성 및 주형-비의존성 활성 둘 다를 나타내는, 패밀리 X 및 그 외에서 현재 유일하게 공지된 폴리머라제이다 (Dominguez et al. 2000; Juarez et al. 2006). 야생형 또는 돌연변이된 Pol μ 외에도, 긴 RNA 올리고뉴클레오티드 신생 합성을 위해 잠재적으로 사용될 수 있는 다른 폴리머라제가 있다.
폴리(A) 폴리머라제, 폴리(U) 폴리머라제, & 다른 RNA 폴리머라제
리보뉴클레오티드를 갖는 단일-가닥 RNA의 3'-테일 부착은 2가지 상이한 맥락에서 중요하다: (1) 천연 생물학적 또는 생화학적 과정 및 (2) 생체 내에서 또는 시험관 내에서 이들 과정의 연구 (Proudfoot 2011; Strauss et al. 2012). 후자의 경우, 몇몇 그룹은 주형-비의존성 방식으로 시험관 내에서 RNA 올리고뉴클레오티드의 3'-말단을 직접적으로 표지화하기 위해 야생형 RNA 폴리머라제, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 폴리(A) 폴리머라제 (PAP), 스키조사카로마이세스 폼베 Cid 1 폴리(U) 폴리머라제 (PUP)를 사용하였다 (G. Martin 및 Keller 1998; Munoz-Tello, Gabus, 및 Thore 2012; Kwak 및 Wickens 2007; Winz et al. 2012). 최적의 조건하에, 이들 효소 패밀리, 특히 PAP가 당의 2'- 및 3'-위치 뿐만 아니라 아데노신 염기의 8'-위치에서 변형을 갖는 변형된 리보뉴클레오티드를 수용할 수 있는 것으로 나타났다 (Winz et al. 2012). 전반적인 혼입 효율이 변형된 위치, 뉴클레오티드 염기, 및 시험한 효소에 따라 달랐지만, 평균적으로 1-3개의 뉴클레오티드 혼입 사건이 발생하여, 생물직교 클릭 화학을 통해 염료와 부착되는 3'- 또는 내부 아지드 관능기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 수득되었다 (Winz et al. 2012).
변형된 뉴클레오티드 혼입의 메카니즘을 연구하는 것 외에도, 다른 그룹은 PAP의 기질 결합 및 촉매작용을 위한 생화학적 및 구조적 메카니즘 둘 다를 시험하였다 (Georges Martin et al. 2004; Bard et al. 2000). 촉매 포켓에서 여러 잔기의 부위-지정 돌연변이 생성 및 정상-상태 동역학의 철저한 분석을 포함하는 이들 연구를 통해, 혼입이 다른 뉴클레오티드 염기에 비해 ATP에 대해 크게 편향되었음이 명백하였다 (Georges Martin et al. 2004). 그러나, 또 다른 그룹은 박테리아 PAP에 대한 단일 점 돌연변이 (R215A)가 이러한 편향을 완전히 역전시켜서, 모든 뉴클레오티드 염기의 무작위 혼입을 가능하게 한다고 결정하였다 (Just et al. 2008). 이 결과는 또 다른 주형-비의존성 RNA 폴리머라제인 CCA-부가 효소에 대한 것과 유사하였다 (Just et al. 2008; Xiong 및 Steitz 2004). 이들 연구는 RNA 폴리머라제, 예컨대 PAP가 제어된 신생 RNA 올리고뉴클레오티드에 대한 계획 II 실행에 매우 적합성이게 만든다. 야생형 및 돌연변이된 RNA 폴리머라제 둘 다 효소 결합 친화도를 회복하기 위해 온화한 반응 조건하에 탈보호되거나 또는 변경될 수 있는 U, A, G 또는 C 당-변형된 뉴클레오티드 염기 (2'-,3'-, 또는 둘 다)를 혼입시키는데 충분히 유연한 것으로 보인다.
결과: RNA 올리고뉴클레오티드의 합성
1. 정제된 인간 폴리머라제 μ R387K는 주형-비의존성 말단 트랜스퍼라제 활성을 나타낸다
인간 폴리머라제 μ R387K는 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 발현되고 정제되었다. 어떤 반응 조건하에 폴리머라제 μ R387K가 최적으로 기능하는지 공지되지 않았기 때문에, 몇몇 반응 파라미터를 초기에 평가하였다. 인큐베이션 온도 37℃ 및 반응 완충제 조건: 10 mM 아세트산마그네슘, 50 mM 아세트산칼륨, 및 20 mM 트리스-아세테이트는 dNTP 혼입의 측면에서 충분한 효소 활성을 나타내었음이 확인되었다. 추가로, 반응을 일반적인 2가 금속 보조인자 (Mn2+, Mg2+, Co2+ 등)로 보충한 후에 폴리머라제 μ 활성을 평가하였고, 0.25 mM의 농도에서 Mn2+ 및 Mg2+의 조합물이 ~650 RFU/분에서 ssDNA 생성의 최고 속도를 수득한 반면에, 0.25 mM Co2+는 ~100 RFU/분에서 최악의 속도를 수득한 것으로 확인되었다 (도 3a). 다음으로, 폴리머라제 μ R387K가 유사한 반응 조건하에 rNTP를 혼입시킬 수 있는지를 결정하고자 하였다. 변성 겔 전기영동은 폴리머라제 μ R387K가 천연 dATP (도 3b) 및 rATP (도 3c) 둘 다를 도입시킬 수 있음을 나타내었지만; 200 μM의 dATP와 유사한 반응을 생성하기 위해서는 5 mM 농도의 rATP가 필요하였다. 이들 결과는 폴리머라제 μ R387K가 다른 폴리머라제 X 패밀리 구성원과 마찬가지로 말단-트랜스퍼라제 활성을 나타내고, 주형 서열과 무관하게 기능하고, dNTP 및 rNTP 둘 다를 수용할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 확인된 DNA/RNA-지정 폴리머라제인 폴리머라제 μ R387K는 제어된 효소적 RNA 합성에 유용하다.
2. 에스. 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제는 2'-변형된 ATP 뉴클레오티드 및 2'-차단된 가역적인 종결자를 혼입시킨다
몇몇 2'-변형된 것을 혼입시키는 것에 대한 에스. 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제 (써모(Thermo) 74225Z25KU)의 효율을 평가하였다. 평가된 변형된 뉴클레오티드는 하기를 포함하였다: 2'-F-rATP (트리링크(Trilink) N-1007), 2'-아지도-rATP (트리링크 N-1045), 2'-아미노-rATP (트리링크 N-1046), 및 2'-O-메틸 rATP (트리링크 N-1015). 0.5 mM Mn2+, 200 pmol의 개시자 RNA 올리고뉴클레오티드, 2.5 mM 변형된 뉴클레오티드, 및 900 단위의 효소를 포함한 적절한 완충제로 연장 반응을 보충하였다. 변성 겔 전기영동에 의해 분석하기 전에 반응을 37℃에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 겔에 따라 (도 4a), 이들 반응 조건하에 에스. 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제는 모든 2'-변형된 뉴클레오티드 (2'-아미노-, 2'-O-메틸-, 2'-F-, 및 2'-아지도- rATP)를 혼입시킨다. 이들 결과는 에스. 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제가 뉴클레오티드 당의 2'-모이어티 상에서 상이한 화학적 변형에 대해 내성이고, 2'-가역적인 종결자 화학과 적합성일 것임을 나타낸다. 동일한 반응 조건하에, 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트, 2'-O-알릴-rATP를 에스. 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제에 의한 제어된 혼입을 위해 시험하였다. 생성된 변성 겔 (도 4b)은 효소 및 뉴클레오티드 이외의 모든 성분을 함유한 음성 대조군 반응과 비교하여 뉴클레오시드 트리포스페이트 농도의 범위에 걸쳐 (250 μM 내지 4000 μM) 양성 (n+1) 혼입을 나타내었다. 이는 에스. 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제 및 2'-O-알릴을 보유하는 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트의 조합이 RNA 올리고뉴클레오티드의 제어된 효소적 합성을 위해 사용될 수 있음을 나타낸다.
3. 에스. 폼베 Cid1 폴리(U) 폴리머라제는 보편적으로 천연 뉴클레오티드를 혼입시킨다
천연 리보뉴클레오티드를 혼입시키기 위한 에스. 폼베 Cid1 폴리(U) 폴리머라제 (NEB M0337)의 효율을 평가하였다. 동역학 분석을 위해, 연장 반응을 적절한 완충제, 10 pmol의 표지된 개시자 RNA 올리고뉴클레오티드 (5'-Cy5-폴리 rU-15량체), 1.0 mM 천연 뉴클레오티드 (ATP, UTP, GTP, 또는 CTP), RNA의 경우 1x SYBR 그린 II (써모), 및 2 단위의 폴리(U) 폴리머라제로 보충하였다. 반응을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였고, 실시간으로 모니터링하였다. 이어서, 2 μL의 각각의 연장 반응을 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였고, EX: 649 nm 및 EM: 666 nm에 의해 타이푼(Typhoon) FLA 9500 시스템 상에 영상화하였다. 겔로부터, 폴리(U) 폴리머라제가 대조군과 비교하여 모든 천연 리보뉴클레오티드를 혼입시키는 능력을 가짐이 명백하였지만; 얼마나 많은 연장이 발생하는지에 대한 편향은 다소 있다 (도 5a). 폴리(U) 폴리머라제가 이들 뉴클레오티드에 의해 활성을 거의 내지 전혀 나타내지 않는다고 이전에 나타났다는 점에서 rGTP 및 rCTP를 제외하고는, 이들 결과는 이전의 연구와 일치한다 (Munoz-Tello, Gabus, 및 Thore 2012; Lunde, Magler, 및 Meinhart 2012). 그러나, 폴리(U) 폴리머라제가 겔 전기영동 및 RNA 동역학 검정으로부터의 결과를 이용하여 rGTP 및 rCTP에 의해 활성을 갖는다는 것이 확인되었다 (도 5b).
4. 에스. 폼베 Cid1 폴리(U) 폴리머라제는 보편적으로 2'-변형된 뉴클레오티드를 혼입시킨다
에스. 폼베 Cid1 폴리(U) 폴리머라제가 보편적으로 4가지 모든 천연 리보뉴클레오티드를 혼입시키는 능력을 갖고 있음을 알고, 이러한 보편성이 2'-변형된 뉴클레오티드로 확장될 수 있는지 결정하고자 하였다. 동일한 반응 파라미터를 이용하여, 폴리(U) 폴리머라제를 2.5 mM 2'-O-메틸- rATP, rUTP, rCTP 또는 rGTP와 함께 37℃에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 2 μL의 각각의 연장 반응을 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였고, EX: 649 nm 및 EM: 666 nm에 의해 타이푼 FLA 9500 시스템 상에 영상화하였다. 겔은 에스. 폼베 Cid1 폴리(U) 폴리머라제가 보편적으로 2'-변형된 뉴클레오티드를 혼입시키고, 매우 높은 효율성으로 개시자 올리고뉴클레오티드를 단지 +1-2 뉴클레오티드만큼 연장시킴을 나타낸다 (도 6). 이전과 마찬가지로, 뉴클레오티드 선택에 일부 편향이 있지만; 60 분 인큐베이션 후에 모든 연장 생성물이 매우 유사하기 때문에 이는 전반적으로 무시할만 하다. 이 결과는 제어된 RNA 합성에 매우 이상적이며, 에스. 폼베 Cid1 폴리(U) 폴리머라제는 (1) 현재 공지된 다른 효소가 보편적으로 변형된 뉴클레오티드를 혼입시킬 수 없고, (2) 연장 생성물이 단지 +1-2 뉴클레오티드라는 점에서 독특하다. 에스. 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제와 마찬가지로, 에스. 폼베 Cid1 폴리(U) 폴리머라제는 뉴클레오티드 당의 2'-모이어티에 대한 화학적 변형에 대해 내성이고, 2'-가역적인 종결자 화학과 적합성일 것이다.
5. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제는 개시자 올리고뉴클레오티드 서열 조성 및 이차 구조/헤어핀에 의해 최소한의 영향을 받는다
여러 말단 트랜스퍼라제는 개시자 올리고뉴클레오티드의 서열 조성에 대해 매우 민감하며, 3'-OH 말단에서 상이한 염기는 뉴클레오티드가 혼입되는 속도에 큰 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 조성이 상이한 2가지 5'-표지된 개시자 올리고뉴클레오티드의 존재하에 4가지 모든 천연 리보뉴클레오티드에 대한 연장 반응을 수행함으로써 이러한 방식으로 영향을 받는지 여부를 연구하였다. 반응을 1 mM 리보뉴클레오티드 및 10 pmol의 5'-표지된 개시자 올리고뉴클레오티드에 의해 수행하였다. 이어서, 2 μL의 각각의 연장 반응을 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였고, 5'-Cy5-폴리 rA-15량체의 경우 EX: 649 nm 및 EM: 666 nm 및 EX: 495 nm 및 EM: 520 nm에 의해 타이푼 FLA 9500 시스템 상에 영상화하였다. 변성 겔 전기영동에 의해 나타난 바와 같이 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 개시자 올리고뉴클레오티드 서열 조성 편향에 의해 최소한의 영향을 받음이 확인되었다 (도 7a). 두 개시자 올리고뉴클레오티드 모두에 의해 보편적인 리보뉴클레오티드 혼입이 수득되는 것으로 관찰되었지만; 30 분 인큐베이션 후에 더 적은 출발 생성물이 존재하였기 때문에 5'-Cy5-폴리 rA-15량체가 약간 더 효율적인 것으로 보였다. 서열 조성 외에도, 강한 이차 구조를 갖는 개시자 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제어된 효소적 연장의 효과를 연구하였다. 이를 하기 위해, 반응 조건하에 (Mg2+, 뉴클레오티드 농도, DNA/RNA 올리고뉴클레오티드 등을 고려하여) 강한 헤어핀 구조를 유도하기 위해 IDT 올리고애널라이저 툴(Oligoanalyzer Tool)™을 사용하여 몇몇 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 3'-말단과 비교하여 헤어핀의 위치가 변경되어 하기를 생성하도록 한 것을 제외하고는 서열에서 유사하였다: 3'-말단으로부터 1개 염기 (H1), 3'-말단으로부터 5개 염기 (H5), 3'-말단으로부터 10개 염기 (H10), 및 3'-말단으로부터 20개 염기. 효소적 연장 전에 올리고뉴클레오티드의 헤어핀이 정확하게 형성되도록 보장하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 95℃로 가열한 다음, 열순환기 상에서 적절한 효소적 반응 완충제 중에서 0.1℃/분의 속도로 15℃로 천천히 냉각시켰다. 냉각시킨 후, 나머지 반응 성분을 헤어핀 개시자 올리고뉴클레오티드에 첨가하였고, 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트 2'-O-알릴-ATP 또는 -UTP를 사용하여 연장 반응을 37℃에서 5 분 동안 수행하였다. 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔을 이용하여 각각의 헤어핀 개시자 올리고뉴클레오티드에 대한 연장 효율을 결정하였다. 전반적으로, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제는 강한 이차 구조를 갖는 헤어핀 개시자 올리고뉴클레오티드를 (n+1)로 연장시킬 수 있었지만; 헤어핀 뒤에 1개 염기만이 있는 H1 올리고뉴클레오티드에서는 일부 어려움이 있었고 (도 7b) - 약 10% 연장이 수득된다. 어려운 이차 구조는 잠재적으로 합성 계획에 문제가 될 수 있지만, 높은 반응 온도 또는 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체 외에도 추가의 반응 성분, 예컨대 DMSO 또는 베타인을 첨가하여 도움이 될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 결과는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제의 독특한 유연성을 추가로 강조한다.
6. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 활성은 무기 피로포스파타제의 첨가에 의해 증강된다
높은 말단 트랜스퍼라제 활성의 결과는 DNA- 및 RNA-지정 폴리머라제의 공지된 억제제인 무기 피로포스페이트의 빠른 축적이다. 무기 피로포스페이트의 축적을 감소시키기 위해, 반응을 진행하는 동안에 무기 피로포스파타제 (PPi-ase)를 사용하여 피로포스페이트를 2개의 단일 포스페이트로 절단할 수 있다. 따라서, 피로포스파타제의 보충이 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제의 말단 트랜스퍼라제 활성을 증강시킬 수 있는지를 결정하고자 하였다. 반응을 1 mM의 각각의 리보뉴클레오티드, 10 pmol의 5'-Cy5-폴리-rU-15량체 개시자 올리고뉴클레오티드, 및 0.1 단위의 효모 무기 피로포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) M2403)와 함께 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 2 μL의 각각의 연장 반응을 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였고, EX: 649 nm 및 EM: 666 nm에 의해 타이푼 FLA 9500 시스템 상에 영상화하였다. 무기 피로포스파타제의 보충이 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 RNA를 합성하는 속도를 증강시키고, 합성된 RNA의 최대 길이를 증가시키는 것으로 확인되었다 (도 8a 내지 8c). 가장 큰 증강은 천연 리보뉴클레오티드 rUTP 및 rATP에 대해 관찰된 반면에, rGTP 및 rCTP는 최소한의 영향을 받았다. 이러한 관찰은 주로 긴 RNA 가닥을 합성하는데 있어서 rUTP 및 rATP에 대한 야생형 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제의 선호로 인한 것이고, 따라서 무기 피로포스페이트가 더 많이 축적된다. rGTP 및 rCTP가 여전히 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의해 혼입될 수 있지만, 혼입 사건의 총 수가 더 적어서 무기 피로포스페이트가 덜 축적된다. 그럼에도 불구하고, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 RNA 합성 반응에 무기 피로포스파타제의 첨가는 유익하며, 권고되고 상업적으로 표준화된 반응 조건에 대한 변형을 포함한다.
7. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 활성은 천연적으로 염기-변형된 리보뉴클레오티드를 혼입시킬 수 있다
본원에 제공된 방법의 적용은 생물학적으로 활성인 분자, 예컨대 합성 전달 RNA (tRNA) 또는 리보솜 RNA (rRNA)의 합성이다. 종종 tRNA 및 rRNA를 포함하는 리보뉴클레오티드 염기는 천연적으로 염기 변형되어, 예를 들어 최적의 기능성을 위해 생체 내에서 이차 구조를 유도한다. 추가로, RNA 올리고뉴클레오티드에 변형된 염기의 혼입은 그들의 안정성을 크게 증강시킬 수 있고, 원치않는 뉴클레아제 소화에 대해 보호할 수 있다. 따라서, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 tRNA 및 rRNA에서 가장 흔히 발견되는 변형된 리보뉴클레오티드 염기 중 하나인 수도우리딘을 혼입시키는 능력을 갖는지를 결정하고자 하였다. 반응을 2 mM, 1 mM, 또는 0.5 mM rUTP 또는 수도우리딘 (트리링크 N-1019), 10 pmol의 5'-Cy5-폴리-rU-15량체 개시자 올리고뉴클레오티드, 및 0.1 단위의 효모 무기 피로포스파타제와 함께 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 2 μL의 각각의 연장 반응을 15% TBE-우레아 겔을 이용하여 분석하였고, EX: 649 nm 및 EM: 666 nm에 의해 타이푼 FLA 9500 시스템 상에 영상화하였다. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제는 수도우리딘을 혼입시켜서 염기-변형된 RNA 올리고뉴클레오티드 대략 30-45-nt 길이를 생성하는 본래의 능력을 갖고 있는 것으로 확인되었다 (도 9a). 생성된 폴리-수도우리딘 RNA 올리고뉴클레오티드는 비변형된 rUTP 올리고뉴클레오티드보다 더 짧았지만; 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 이러한 뉴클레오티드를 혼입시킬 수 있음을 입증하는 첫번째 공지된 예이다. 이들 결과로부터, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 다른 염기 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 뉴클레오티드 염기 상의 다양한 위치에서 메틸화 또는 다른 변형을 갖는 것들을 혼입시키는 능력을 가질 가능성이 가장 높을 것임이 명백하다. 따라서, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제를 4가지 모든 천연 염기에 대한 변형을 갖는 염기 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트의 어레이와 함께 인큐베이션하였다. 이들에는 이노신 5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸-2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 8'-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, N1-메틸수도우리딘-5'-트리포스페이트, 수도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-히드록시메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-히드록시메틸시티딘-5'-트리포스페이트, N7-메틸구아노신-트리포스페이트, 본질적으로 형광성 뉴클레오티드, 예컨대 3'/2'-O-(N-메틸-안트라닐로일)-트리포스페이트 및 포스페이트 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 α-, β-, γ-티오 트리포스페이트가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 변성 겔 전기영동은 다양한 수의 혼입 사건으로 시험한 각각의 염기 변형된 리보뉴클레오티드의 혼입을 나타내었다 (도 9b). 시험한 것들과 같이 염기 변형된 리보뉴클레오티드는 2'-차단기에 의해 합성되어, 이들을 가역적인 종결자로서 적합성이게 만들 수 있다. 이들 결과는 중요한 생물학적 분자, 예컨대 그들의 기능에 따라 크게 염기 변형될 수 있는 tRNA 또는 rRNA, 또는 특이적인 이차 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드, 또는 분해에 대해 증가된 내성을 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드의 신생 합성에 대한 기반을 형성한다.
8. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의한 RNA 합성은 경쟁적 억제제 뉴클레오티드에 의해 제어될 수 있다
도 1에 예시된 바와 같이, RNA 올리고뉴클레오티드 합성 속도는 경쟁적 억제를 통해 반응에 존재하는 가수분해성 뉴클레오티드 및 비-가수분해성 뉴클레오티드의 비에 의해 직접적으로 영향을 받는다. 억제제는 효소의 활성 부위를 점유하지만 혼입되지 않으며, RNA 합성 반응을 늦추고, 후속적으로 주어진 반응 시간 내에서 혼입 사건의 수를 늦춘다. 이를 입증하기 위해, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 RNA 합성 반응을 비-가수분해성 리보뉴클레오티드 우리딘-5'-[(α,β)-이미도]트리포스페이트 (제나 바이오사이언시즈(Jena Biosciences))의 농도를 증가시키면서 인큐베이션하였다. 더 높은 농도의 비-가수분해성 리보뉴클레오티드는 가수분해성 rUTP 혼입의 총 수를 유의하게 제한하였음이 확인되었다 (도 10). RNA 합성 반응을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 다음, 2 μL의 각각의 연장 반응을 15% TBE-우레아 겔을 이용하여 분석하였고, EX: 649 nm 및 EM: 666 nm에 의해 타이푼 FLA 9500 시스템 상에 영상화하였다. 0.8 mM 미만인 비-가수분해성 리보뉴클레오티드 우리딘-5'-[(α,β)-이미도]트리포스페이트의 농도는 RNA 합성 반응을 제어하는데 거의 영향을 미치지 않았고; 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 대한 우리딘-5'-[(α,β)-이미도]트리포스페이트의 결합 친화도 역치로 인한 것일 가능성이 있다. 다른 비-가수분해성 리보뉴클레오티드는 이러한 방식으로 이용될 수 있으며, 이들이 우리딘 염기 또는 폴리머라제 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제일 필요는 없다.
9. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의한 RNA 합성은 2'-O-차단된 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트에 의해 제어될 수 있다
도 2에 예시된 바와 같이, RNA 합성은 2'-O-차단된 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트를 혼입시킴으로써 제어될 수 있고, 그에 따라 단일 혼입 사건 후에 합성이 일시적으로 종결되어 (n+1) 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 이어서, 순한 탈보호 계획을 이용하여 차단기를 제거하여, 폴리(U) 폴리머라제와 같은 효소에 대한 인식가능한 기질로서 성장하는 올리고뉴클레오티드를 재확립시킨다. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 가역적인 종결자 2'-변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 혼입시키는 능력을 갖는지 결정하기 위해, 2'-O-알릴-ATP를 RNA 합성 반응에서 최상의 반응 조건에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. RNA 합성 반응의 결과 분석은 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 대조군 반응과 비교하여 단일 2'-O-알릴-ATP만을 혼입시켰고, 개시자 올리고뉴클레오티드를 1개 염기만큼 연장시켰음을 나타낸다 (도 11a). 이 결과는 여러 다른 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트 (예컨대 2'-, 염기 등)가 다중 연장 생성물을 생성하는 반면에, 2'-O-알릴-ATP만이 1개 연장 생성물을 생성하기 때문에 특히 주목할만 하다. 반응 조건 및 성분 화학량론의 추가의 최적화에 의해, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 >99% 전환율로 개시자 올리고뉴클레오티드 (+0)를 연장 생성물 (+1)로 완전히 전환시키기 위해 0.5 분 이하가 필요하다는 것을 결정하였다 (도 11b). 인큐베이션 시간에서 추가의 증가는 RNA 합성 반응에 대한 임의의 상당한 효과를 갖지 않았다. 가역적인 종결자 2'-변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트 2'-O-알릴-ATP의 탈차단 및 추가의 연장은 정제된 (n+1) 올리고뉴클레오티드를 이나트륨 테트라클로로팔라데이트 (Na2PdCl4) 및 3,3',3''-포스판트리일트리스(벤젠술폰산) 삼나트륨 염 (TPPTS)의 혼합물과 함께 다양한 pH의 트리스-HCl 완충제 중에서 50℃에서 10 분 동안 인큐베이션함으로써 입증되었다. 이어서, 생성된 탈차단된 올리고뉴클레오티드를 정제한 다음, 1 mM 가역적인 종결자 2'-O-알릴-ATP를 포함하는 최적화된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 반응 조건에서 연장시켜, (n+2) 생성물을 수득하였다. 변성 겔 전기영동 분석은 탈차단 완충제 조성 및 pH의 최적화 후에 정제된 (n+1) 올리고뉴클레오티드가 높은 효율로 (n+2) 생성물로 전환되었음을 나타내었다 (도 11c). 2'-가역적인 종결자 기의 성공적인 탈차단은 8.5가 아니라 pH 7.5, 6.5, 5.5, 4.5를 갖는 트리스-HCl 완충제 중에서 관찰되었다. 더 낮은 pH 완충제는 RNA 안정성을 증강시키기 위해 관련 기술분야에 익숙한 사람들에게 공지되어 있고, 최소 완충제 조성은 RNA 올리고뉴클레오티드가 탈차단 성분 (Pd & TPPTS)에 의해 접근가능하도록 보장한다. (n+2) 생성물을 보여주는 고해상도 변성 겔이 도 11d에 도시된다. 추가로, 5'-형광단의 안정성 및 기능성은 탈차단 과정 내내 유지되었고, 화학이 생체적합성임을 입증하는 최소 올리고뉴클레오티드 분해가 관찰되었다. 2'-O-알릴 가역적인 종결자 전략이 더 긴 RNA 올리고뉴클레오티드 단편의 합성에 도움이 되었는지를 결정하기 위해, 벌크 용액 중에서 최적화된 반응 조건 및 2'-O-알릴-ATP를 사용하여 (n+5) 생성물에 도달하기 위해 효소적 연장 및 탈차단의 과정을 반복하였다. 합성 동안에, 각각의 연장/탈차단 사건 (합성 주기로도 공지됨)의 적은 분취량을 분석을 위해 따로 두었다. 겔 전기영동 분석은 20-nt 개시자 올리고뉴클레오티드로부터 출발하여 25-nt 단편의 성공적인 합성을 나타내었다 (도 11e). 샘플 손실이 각각의 정제 및 탈차단 단계 동안에 발생하였음을 주목하며, 이는 겔 상에서 감소하는 신호에 의해 나타난다. 전반적으로, 이들 결과는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 도 2에 설명된 바와 같이 반복적인 염기-대-염기 방식으로 효소적 RNA 합성을 수행하는 본래의 능력을 가짐을 나타낸다. 다른 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트 또한 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의해 혼입될 수 있다. 여기에는 2'-O-아지도-메틸-NTP가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
10. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제는 4가지 모든 천연 핵염기를 갖는 2'-가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리스포스페이트를 효율적으로 혼입시킨다
이전에, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 비교적 동등한 효율을 갖는 4가지 천연 RNA 핵염기 (A, U, G, C)를 보유하는 2'-변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트 (2'-메톡시)를 혼입시키는 능력을 갖는 것으로 결정되었다 (도 6). 이것이 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트에 대한 경우였는지 여부를 결정하기 위해, 2'-O-알릴-ATP, -UTP, -CTP, 및 -GTP를 합성하였다. 최적화된 조건을 이용하여, 연장 반응을 열순환기에서 1 mM의 2'-O-알릴-ATP, -UTP, -CTP, 또는 -GTP 가역적인 종결자와 함께 37℃에서 1 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 반응을 15% TBE-우레아 변성 겔을 이용하여 분석하여, 단일 (n+1) 연장 사건에 의해 나타난 바와 같이 2'-O-알릴 가역적인 종결자의 각각의 핵염기 버전이 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의해 효율적으로 혼입됨을 확인하였다 (도 12a). 대조군 반응은 뉴클레오티드 이외의 모든 반응 성분을 가졌다. 이 결과가 다중-핵염기 RNA 올리고뉴클레오티드 합성에 도움이 되었는지 추가로 증명하기 위해, 2'-O-알릴-ATP 및 -UTP의 조합물을 사용하는 이원 합성을 수행하였다. 하기 조합물을 시험하였다: 벌크 용액 중에서 최적화된 효소적 연장 및 탈차단 반응 조건을 이용하여 (n+1) A, (n+1) U, (n+2) A-A, (n+2) A-U, (n+2) U-A, 및 (n+2) U-U. 생성된 물질을 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였고, 이는 (n+0) 예를 수득하는 블랭크 반응 (뉴클레오티드를 제외한 모든 성분)과 비교하여 단일 (n+1) 시험 조건의 경우 양성 혼입 및 이중 (n+2) 시험 조건의 경우 양성 혼입 및 탈차단을 나타내었다 (도 12b).
11. 활성 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제는 대규모 생성 및 정제를 위해 N-말단 His 6 -태그에 의해 박테리아에서 발현될 수 있다
에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 대한 일차 서열 (UniProtKB - O13833)을 효소의 N-말단에 아미노산 "MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH"를 부가함으로써 변형시켰다. 이들 아미노산은 적절한 링커와 함께 N-말단 His6-태그를 코딩한다. 물질 및 방법 섹션에 설명된 프로토콜을 이용하여, N-말단 His6-태그 부착된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제를 발현시키고, 정제하고, 적은 부피로 농축시켰다. 변성 겔 전기영동은 N-말단 His6-태그 부착된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 적절하게 발현되었고, 박테리아 용해물로부터 단리되었음을 나타낸다. N-말단 His6-태그에 의해, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제의 예상 분자량은 대략 45 kDa이었고, 이는 겔 상에서 강한 밴드에 상응한다 (도 13a). 정제되고 농축된 N-말단 His6-태그 부착된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제의 활성을 결정하기 위해, 1 mM 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자 뉴클레오티드 및 증가하는 양의 개시자 올리고뉴클레오티드로 보충된 연장 반응을 발현된 효소와 함께 인큐베이션하였다. N-말단 His6-태그 부착된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제를 사용하여, 대략 100 pmol의 개시자 올리고뉴클레오티드가 >99%의 전환율로 (+1) 생성물로 전환될 수 있음을 결정하였다 (도 13b). 100 pmol 초과로 보충된 반응은 더 높은 전환율을 위해 추가의 최적화를 필요로 할 수 있다. 이들 결과는 N-말단 His6-태그 부착된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 매우 낮은 비용으로 용이하게 발현될 수 있고, RNA 합성을 위해 적당한 양의 효소를 수득하기 위해 확장될 수 있음을 나타낸다. 추가로, 정제되고 농축된 N-말단 His6-태그 부착된 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제는 다량의 RNA 올리고뉴클레오티드 물질을 전환시켜서, 원하는 RNA 서열을 높은 수율로 수득하기 위해 반복된 합성 반응의 필요성을 감소시킬 수 있다. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 발현되고 정제된 박테리아 용해물로부터 RNase 잔재가 관찰되지 않았다.
12. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제를 사용하는 제어된 RNA 올리고뉴클레오티드 합성은 고체-상 표면 상에서 수행될 수 있다
제어된 RNA 올리고뉴클레오티드 합성은 벌크 용액을 이용하여 용이하게 수행될 수 있지만; 각각의 합성 주기에서 연장 및 탈차단 단계 후에 성장하는 올리고뉴클레오티드를 정제하여 간섭 성분을 제거해야 한다. 현대적인 방법으로 효율적으로 회수하면서 다중 정제는 궁극적으로 합성의 몇몇 주기 후에 주요 샘플 손실을 초래한다. 따라서, 고체-상 지지체, 예컨대 관능화된 비드, 웰, 슬라이드 등 상에서 올리고뉴클레오티드 합성을 수행하는 것은 더 긴 올리고뉴클레오티드 단편 및 큰 산업적으로 적절한 양의 물질의 합성에 유의하게 더 도움이 된다. 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 표면에 고정된 올리고뉴클레오티드를 연장하는 능력을 평가하기 위해, 먼저 5'-아민 기를 갖는 개시자 올리고뉴클레오티드 및 내부 Cy5 염료를 사용하여 5'- 비오틴-PEG-NHS 링커 (이지-링크(EZ-Link) #A35389 써모)를 부착시켰다. 표지화 반응의 효율은 15% TBE-우레아 겔을 사용하는 분석을 통해 >90%로 결정되었다 (벌크한 PEG 기의 첨가는 비-표지된 올리고뉴클레오티드와 비교하여 올리고뉴클레오티드가 상이하게 작동하게 만들 것임) (도 14a). 스트렙타비딘 관능화된 자성 비드 (스페로테크(Spherotech) #SVM-20-10)를 사용하여 추가의 품질 제어를 수행하였고, 형광 현미경에 의해 결정된 바와 같이 내부 Cy5 염료에 의해 표지된 개시자 올리고뉴클레오티드의 양성 비-공유 고정이 발생한 것으로 관찰되었다 (도 14a). 이어서, 효소적 올리고뉴클레오티드 합성의 3 주기는 고정된 개시자 올리고뉴클레오티드 및 2'-O-알릴 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용하여 최적화된 연장 및 탈차단 반응 조건을 이용하여 수행하였다. (n+3) 생성물이 합성되었고, 주기 1은 "A"를 부가하고, 주기 2는 "C"를 부가한 다음, 주기 3은 "U"를 부가하였다. 합성 후에, 비드를 열순환기에서 물 중 90% 포름아미드의 용액과 함께 50℃에서 10 분 동안 인큐베이션함으로써 고정된 올리고뉴클레오티드를 스트렙타비딘 비드의 표면으로부터 제거하였다. 수집된 물질을 정제하고, 15% TBE-우레아 겔을 이용하여 분석하였고, 이는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의해 촉매되는 바와 같이 다중 핵염기에 의해 매우 효율적인 올리고뉴클레오티드 합성을 나타내었다 (도 14b). 벌크 합성에 비한 고체-상 합성의 주요 이점은, 반응이 정제에 의해 완전히 완료되는 것을 보장하도록 연장 및 탈차단 반응이 반복될 수 있다는 것이다. 이는 연장 반응 동안에 피로포스페이트의 생성을 모니터링하거나, 염료-표지된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용하는 경우에는 고체-지지체를 측정하거나, 또는 탈차단 반응의 비색 모니터를 이용함으로써 시각화되거나 또는 측정될 수 있다.
13. 공유 링커를 갖는 재사용가능한 고체-상 지지체는 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 매개된 제어된 효소적 RNA 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 사용될 수 있다
제어된 효소적 RNA 올리고뉴클레오티드 합성의 전체 비용에 대한 주요 기여 인자는 올리고뉴클레오티드 개시자 서열이다. 벌크 합성의 이전의 예에서는, 올리고뉴클레오티드 개시자 서열이 소모되고, 전형적으로 재사용 불가능하다. 추가로, 원하는 경우 최종 생성물로부터 올리고뉴클레오티드 개시자 서열을 제거하는 것이 어렵다. 이 문제를 극복하기 위해, 단일 가닥 RNA, DNA, 또는 이들의 조합물에서 엔도뉴클레아제 V에 의한 리보이노신 (rI) 및/또는 데옥시이노신 (dI)의 부위-특이적인 절단을 이용하여, 최종 올리고뉴클레오티드 생성물로부터 원치않는 개시자 서열을 제거할 수 있다. 엔도뉴클레아제 V는 리보이노신 (rI) 및 데옥시이노신 (dI)에 대해 매우 특이적이며, 올리고뉴클레오티드 개시자 서열에서 다른 염기를 파괴하지 않을 것이다. 이 개념을 고체-상 올리고뉴클레오티드 합성으로 확장하면, 이는 벌크 용액 합성과 비교하여 긴 RNA 올리고뉴클레오티드 합성 및 산업적으로 적절한 합성 규모에 더욱 도움이 되고, 재사용가능한 집합의 비드, 웰, 슬라이드 등이 반복적이고 잠재적으로 무제한의 합성 작동을 위해 생성될 수 있다. 이 과정의 간략한 개요가 도 15a에 제공된다. 첫째, 고체 지지체는 바람직하게는 3'-말단에서 리보이노신 (rI) 또는 데옥시이노신 (dI)을 함유하는 개시자 올리고뉴클레오티드에 결합된 적절한 링커 (예컨대 긴 PEG 쇄)에 의해 공유적으로 유도체화된다. 고체-상 효소적 RNA 올리고뉴클레오티드 합성을 수행하여, 원하는 생성물을 생성한 다음, 엔도뉴클레아제 V를 전체 올리고뉴클레오티드 (개시자 + 생성물)와 함께 인큐베이션되게 한다. 이는 고체-지지체로부터 올리고뉴클레오티드 생성물을 절단하여, 고체-지지체 상에서 리보이노신 (rI) 또는 데옥시이노신 (dI)을 온전하게 남겨둘 것이며, 이는 추후 합성 반응에 재사용될 수 있다. 엔도뉴클레아제 V는 리보이노신 (rI) 또는 데옥시이노신 (dI)의 하류에 있는 2개의 염기를 절단하며, 따라서 원하는 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 설계할 때 고려하는 것이 중요하다. 최종 생성물은 또한 5'-인산화되고, 이는 포스파타제를 사용하여 용이하게 제거될 수있거나 또는 이는 다른 분자 생물학 또는 시퀀싱 적용을 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제를 사용하여, 이 핵염기의 2'-O-알릴 버전을 사용하여 고정된 개시자 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 리보이노신 (rI)을 도입시킬 수 있다.
이 계획이 의도된 대로 작동하는지 결정하기 위해, 엔도뉴클레아제 V 소화하에 2개의 동등한 크기를 갖는 단편을 생성하는 5'-아민 기 및 데옥시이노신 (dI)에 의해 개시자 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 올리고뉴클레오티드의 5'-아민 및 실리카 비드 상의 아민과 반응하는 이중-NHS-PEG9 링커를 도입시킴으로써 아민 관능화된 실리카 비드의 표면 상에 개시자 올리고뉴클레오티드를 고정시켰다. 유도체화된 비드를 엔도뉴클레아제 V (물질 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 발현되고 정제됨)와 함께 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 추가로, 비교를 위해 동일한 소화 반응을 벌크 상에서 수행하였다. 고체-상 및 벌크 소화 반응 둘 다의 경우, 엔도뉴클레아제 V를 함유하지 않는 반응인 대조군 샘플을 배치하였다. 1 시간 인큐베이션 후에, 소화 반응을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였다. 겔을 1x SYBR 겔스타(GelStar) 핵산 염색에 의해 실온에서 진탕시키면서 15 분 동안 염색하였다. 엔도뉴클레아제 V가 의도된 대로 작동하여 벌크 및 고체-상 반응 둘 다에서 소화 단편을 생성하는 것이 관찰되었다 (도 15b). 벌크 대조군 반응의 경우, 전장의 소화되지 않은 단편이 관찰되었다. 고체-상 대조군 소화 반응의 경우 식별가능한 단편이 관찰되지 않았고, 이는 올리고뉴클레오티드가 실리카 비드의 표면 상에 온전하게 남아 있음을 시사한다. 이 결과는 공유 결합된 올리고뉴클레오티드가 표면으로부터 달라붙지 않음을 증명하기 때문에 추가로 중요하다.
기재된 고체-지지체 시스템이 효소적 합성에 대해 기능적이고, 개시자 올리고뉴클레오티드가 엔도뉴클레아제 V 소화 후에 표면 상에 온전하게 남아 있는 데옥시이노신 핵 염기를 통해 재사용가능하다는 것을 입증하기 위해, 최적화된 반응 조건을 이용하여 소화된 개시자 올리고뉴클레오티드를 보유하는 세척된 실리카 비드를 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 및 천연 rNTP (비제어된 연장) 뿐만 아니라 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자 (제어된 연장)와 함께 인큐베이션하였다. 비교를 위해, 새로 고정되고 소화되지 않은 개시자 올리고뉴클레오티드를 갖는 비드를 유사하게 연장시켰다. 이어서, 모든 비드를 10 mM 트리스-HCl (pH 6.5)로 세척하고, 엔도뉴클레아제 V의 존재하에 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 표면으로부터 연장 및 절단의 효율을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔을 이용하여 분석하였고, 1X SYBR 겔스타 핵산 염색에 의해 실온에서 진탕시키면서 15 분 동안 염색하였다. 겔은 모든 조건하에 재사용된 및 새로 유도체화된 비드 둘 다에 대해 양성 연장 및 절단을 나타내었다 (도 15c). 생존력에 대한 최종 입증으로서, 2'-O-알릴-ATP 가역적인 종결자 뉴클레오시드 트리포스페이트를 갖는 공유 결합된 엔도뉴클레아제 V 절단가능한 개시자 올리고뉴클레오티드를 사용하는 (n+2) 생성물의 제어된 합성을 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제에 의해 수행하였다. 연장 반응을 1 mM의 뉴클레오티드로 보충하였고, 37℃에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 탈차단 반응을 50℃에서 10 분 동안 수행하였다. 비드를 10 mM 트리스-HCl (pH 6.5)로 세척하였다. 엔도뉴클레아제 V 절단을 적절한 완충제를 사용하여 37℃에서 1 시간 동안 수행하였고, 즉시 변성 겔 상에서 작동시켰다. 대조군 반응은 (n+2)로 연장되었고, 엔도뉴클레아제 V의 존재하에 인큐베이션하였지만, 리보이노신 (rI) 또는 데옥시이노신 (dI)을 보유하지 않는 고정된 Cy5 개시자 올리고뉴클레오티드를 함유하였다. 이를 이용하여, 올리고뉴클레오티드가 엔도뉴클레아제 V 절단 동안에 달라붙지 않았음을 입증하였다. Cy5 개시자 올리고뉴클레오티드를 갖는 비드는 각각의 합성 주기 후에 시각적으로 청색으로 남아 있었다.
14. 3'-차단된 가역적인 종결자 뉴클레오티드의 개발 및 올리고뉴클레오티드 합성에서의 사용
RNA 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성을 위한 새로운 뉴클레오시드 트리포스페이트를 개발하였다. RNA 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 치료제를 비롯한 다양한 적용에서 사용할 수 있다. 뉴클레오시드 트리포스페이트는 당 고리의 3'-위치에서 차단기에 의해 가역적으로 종결되고, 이는 성장하는 올리고뉴클레오티드의 (n+1) 연장만을 부여하며; 연장 반응은 3'-위치에서 추가 연장이 가능할 수 있는 유리 히드록실 기 (-OH)를 생성하지 않는다. 차단기는 온화한 생체적합성 탈보호제에 의해 제거될 수 있다. 이 전략은 2' 위치 또는 염기에서 가상 차단을 보완하며, 성장하는 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 차단되는 것이 아니라 입체적으로 차단된다 (이들은 또한 "가상 종결자"로도 공지됨).
일부 예에서, 3'-차단 전략은 차단 화학적 도메인을 수용하는 적합성 효소 (예를 들어, 본원에 기재된 돌연변이된 폴리(U) 폴리머라제)를 필요로 한다. 하기 나열된 3'-차단 전략을 위해 사용될 수 있는 수많은 화학적 도메인이 있다. 일부 예에는 3'-O-알릴 트리포스페이트 (3'-O-알릴-NTP) 및 3'-O-아지도메틸 트리포스페이트 (3'-O-아지도메틸-NTP)가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
새로운 3'-가역적으로 종결된 뉴클레오시드 트리포스페이트는 전체 올리고뉴클레오티드에 치료적 또는 다른 기능적 가치를 부여하는 다중 변형을 비롯한 이점을 가질 수 있다. 뉴클레오시드 트리포스페이트는 3'-가역적인 종결기 외에도 단일 또는 다중 변형을 가질 수 있다. 변형은 추가의 보호기없이 올리고뉴클레오티드에 부위-특이적으로 도입될 수 있다. 이들 뉴클레오시드 트리포스페이트는 그들의 혼입을 위해 적합성 효소를 필요로 하며, 이는 사용된 각각의 변형된 뉴클레오티드의 돌연변이 코돈의 독특한 서열 또는 집합을 보유할 수 있다. 변형은 화학적 핸들, 리간드 결합 도메인, 올리고뉴클레오티드 뉴클레아제 내성을 부여하는 방식, 입체적으로 순수한 티오포스포네이트 올리고뉴클레오티드, 원하는 올리고뉴클레오티드 이차 구조를 형성하는 성향을 부여하는 방식, 또는 원치않는 올리고뉴클레오티드 이차 구조를 형성하기 위해 내성을 부여하는 방식 등으로 나타난다. 여기에는 하기가 포함된다:
i. 푸라노스 고리의 2'-도메인에 대한 변형, 이는 히드록실 (-OH), 수소 (-H), 플루오로 (-F), 아민 (-NH3), 아지도 (-N3), 티올 (-SH), 메톡시 (-OCH3), 메톡시에탄올 (-OCH2CH2OCH3), 산화환원-활성, 형광원성 또는 본질적으로 형광성인 모이어티, 천연 및 비-천연 아미노산, 펩티드, 단백질, 단당류 또는 올리고당류, 기능적/리간드 결합 글리칸, 및 큰/벌크한 기, 예컨대 폴리-에텐-글리콜 (PEG)일 수 있으나 이로 제한되지 않음.
ii. 트리포스페이트의 알파 (α) 포스페이트에 대한 변형, 티오포스포네이트 R 또는 S 이성질체는 올리고뉴클레오티드에 부위-특이적으로 도입되어 입체적으로 순수한 올리고뉴클레오티드를 생성함.
iii. 트리포스페이트의 베타 (β) 및 감마 (γ) 포스페이트에 대한 변형: 두 변형 중 하나 및/또는 둘 다는 효소적 올리고뉴클레오티드 합성 계획에 가치를 부여하며; 예를 들어 피로포스페이트 생성의 결과로서 원치않는 가피로인산분해를 예방하거나 또는 제한함,
iv. 푸라노스 고리에 대한 변형, 이는 고리의 산소를 황으로 대체, 또는 고리 형태를 제한하는 2'-산소와 4'-탄소 사이에 가교의 도입일 수 있으나 이로 제한되지 않음.
v. 핵염기에 대한 변형, 염기는 천연 또는 비-천연 피리미딘 또는 퓨린이고, N1-메틸-아데닌, N6-메틸-아데닌, 8'-아지도-아데닌, N,N-디메틸-아데노신, 아미노알릴-아데노신, 5'-메틸-우리딘, 수도우리딘, N1-메틸-수도우리딘, 5'-히드록시-메틸-우리딘, 2'-티오-우리딘, 4'-티오-우리딘, 히포크산틴, 크산틴, 5'-메틸-시티딘, 5'-히드록시-메틸-시티딘, 6'-티오-구아닌, 및 N7-메틸-구아닌이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않음.
합성의 완료시에, 올리고뉴클레오티드는 추가의 기능적 또는 치료적 가치를 부여할 수 있는 최종 3'-차단된 뉴클레오시드 트리포스페이트로 비가역적으로 캡핑될 수 있다. 이는 또한 적합성 효소 (예를 들어, 돌연변이된 폴리(U) 폴리머라제 효소)의 사용을 필요로 할 수 있고, 본원에 기재된 변형 기일 수 있다. 추가로, 푸라노스 고리의 경우 3'- 및 2'-도메인 둘 다 동일한 또는 상이한 기로 비가역적으로 차단될 수 있다.
모노-뉴클레오시드 트리포스페이트 외에도, 디-뉴클레오시드 트리포스페이트, 트리-뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 N-뉴클레오시드 트리포스페이트 (여기서, N = N 길이의 삼인산화 올리고뉴클레오티드)가 적합성 효소 촉매를 사용하여 혼입을 위한 기질로서 사용될 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오티드 리가제를 효과적이게 만든다.
일부 경우에, 새로운 뉴클레오시드 트리포스페이트의 첨가는 합성 후 가공 및 정제를 위한 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 작용될 수 있는 절단가능한 핸들을 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 히포크산틴 (이노신) 기를 보유하는 올리고뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제 V에 의해 부위-특이적으로 절단될 수 있다. 이는 올리고뉴클레오티드의 고체-상 합성에 특히 유용하고, 결합된 올리고뉴클레오티드 개시자는 무한하게 재사용될 수 있다.
야생형 및 돌연변이된 폴리(N) 폴리머라제에 의한 효소적 올리고뉴클레오티드 합성
천연 뉴클레오티드 GTP - "G" 및 CTP - "C"를 혼입시키는 H336 돌연변이체의 능력의 겔 전기영동 분석이 도 18a 내지 18d에 도시된다. 블랭크 반응은 효소 및 뉴클레오티드를 제외한 모든 성분으로 보충되었다. 모든 반응을 1 mM 뉴클레오티드, 5 pmol 개시자 올리고뉴클레오티드, 및 1 μg의 효소와 함께 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 15% TBE-우레아 변성 겔을 연장 반응 분석을 위해 사용하였다.
야생형 폴리(U) 폴리머라제와 비교하여 천연 및 유사 뉴클레오티드의 어레이를 혼입시키는 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체 H336R 능력의 겔 전기영동 분석이 도 19a 내지 19f에 도시된다. 도 19a, 19d는 각각 야생형 및 H336R 돌연변이체에 대한 ATP 기반 뉴클레오티드에 대한 연장 결과를 도시한다. 도 19b, 19e는 각각 야생형 및 H336R 돌연변이체에 대한 UTP 및 ITP 기반 뉴클레오티드에 대한 연장 결과를 도시한다. 도 19c, 19f는 각각 야생형 및 H336R 돌연변이체에 대한 CTP 및 GTP 기반 뉴클레오티드에 대한 연장 결과를 도시한다. 모든 반응을 1 mM 뉴클레오티드, 5 pmol 개시자 올리고뉴클레오티드, 및 1 μg의 효소와 함께 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 15% TBE-우레아 변성 겔을 연장 반응 분석을 위해 사용하였다.
구체적으로 위치 H336에서 다양한 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체에 의한 2'-메톡시-아데노신 트리포스페이트 (2'-O-Me-ATP)의 비제어된 혼입이 도 20에 도시되며; 여기서 단일 돌연변이체는 야생형 (WT)과 비교하여 도시된다. 블랭크 반응은 효소를 제외한 모든 성분을 함유한다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔에 의해 분석하였다.
구체적으로 위치 N171에서 다양한 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체에 의한 2'-플루오로-아데노신 트리포스페이트 (2'-F-ATP)의 비제어된 혼입이 도 21에 도시되며; 여기서 단일 돌연변이체는 돌연변이체 H336R과 비교하여 도시된다. 블랭크 반응은 효소를 제외한 모든 반응 성분을 함유하였다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔에 의해 분석하였다.
구체적으로 위치 N171에서 다양한 에스. 폼베 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체에 의한 3'-메톡시-아데노신 트리포스페이트 (3'-O-Me-ATP)의 제어된 혼입 (캡핑)이 도 22에 도시되며; 여기서 단일 돌연변이체는 돌연변이체 H336R 및 야생형과 비교하여 도시된다. 상단 밴드는 (n+1) 생성물을 나타낸다. 참고: 야생형 샘플은 양성 혼입을 나타내지만, 심각한 가피로인산분해가 발생한다. 음성 반응은 효소를 제외한 모든 반응 성분을 함유하였다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였다.
다양한 에스. 폼베 돌연변이체에 의한 가역적인 종결자 3'-O-알릴 아데노신 트리포스페이트 (3'-(O-알릴)-ATP)의 제어된 혼입이 도 23에 도시된다. 음성 반응은 효소를 제외한 모든 반응 성분을 함유하였다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였다.
폴리(U) 폴리머라제 이중 돌연변이체 H336R-N171A에 의한 가역적인 종결자 3'-O-알릴 카르보네이트 데옥시아데노신 트리포스페이트 (3'-(O-알릴 카르보네이트)-dATP)의 제어된 혼입이 도 24에 도시된다. 겔 영상은 정제된 효소 스톡 (2 μL, 4 μL 및 6 μL)의 양이 증가함에 따라 개시자 올리고뉴클레오티드 (2 pmol/rxn, 5 pmol/rxn, 및 10 pmol/rxn)의 투입량이 달라짐을 나타낸다. 상단 밴드는 (n+1) 생성물을 나타낸다. 블랭크 반응은 효소를 제외한 모든 성분을 함유한다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔에 의해 분석하였다.
가역적인 종결자 3'-O-알릴 아데노신 트리포스페이트 3'-(O-알릴)-ATP)와 함께 정제된 폴리(U) 폴리머라제 스톡 H336R의 반응 보정 평가가 도 26에 도시된다. 겔은 개시자 올리고뉴클레오티드의 투입량이 증가함에 따라 주어진 (n+1) 연장 반응을 나타낸다. 반응은 1 mM 가역적인 종결자 뉴클레오티드 및 1 μL의 정제된 효소 스톡으로 보충된다. 반응을 37℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 상단 밴드는 (n+1) 생성물을 나타낸다. 블랭크 반응은 효소를 제외한 모든 성분을 함유한다. 샘플을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔에 의해 분석하였다. 이는 반응 확장성의 예시이다.
벌크 용액 중에서 3'-O-알릴 아데노신 트리포스페이트 (3'-O-알릴-ATP)를 갖는 가역적인 종결자와 함께 폴리(U) 폴리머라제 돌연변이체 H336R을 사용하는 제어된 효소적 합성의 입증을 도 27에 도시한다. 여기서 벌크 용액 중에서 (n+5) 합성이 도시된다. 합성 후에, 반응을 변성 조건하에 15% TBE-우레아 겔을 사용하여 분석하였다.
3'-가역적인 종결자 구조 & 합성
효소적 혼입을 위한 3'-가역적인 종결자 뉴클레오티드의 예시적인 구조를 도 28에 도시한다. 3' 히드록시를 위한 보호기의 다양한 예. 표지된 바와 같이, 이들은 산화환원 화학, 빛, 플루오라이드 음이온 및 촉매를 통해 제거될 수 있다.
푸라닐 고리가 산소를 보유하는 3' 보호기 선택이 도 29 및 30에 도시된다. 2'는 결합, 약동학, 약력학, 일반적인 안정성 및 프로브 태그를 촉진시키는 천연 리보, 데옥시 또는 다양한 모이어티일 수 있다.
뉴클레오티드 트리포스페이트에 대한 3' 아지도메틸 에테르의 제조를 위한 예시적인 도식이 도 31에 도시되며, 2'는 천연 OH 또는 다양한 변형, 예컨대 -F, -OMe, -OCH2CH2CH3 등일 수 있고, 이는 표적 올리고의 생물학적 활성에 유익한 것으로 입증되거나 또는 더 광범위한 과학의 영향에 기여한다.
잠금 뉴클레오티드 트리포스페이트에 대한 3' 아지도메틸 에테르의 제조를 위한 예시적인 도식을 도 32에 도시한다.
뉴클레오티드 트리포스페이트에 대한 3' 알릴 에테르의 제조를 위한 예시적인 도식이 도 33에 도시하며, 2'는 천연 OH 또는 다양한 변형, 예컨대 F, OMe, OCH2CH2CH3 등일 수 있으며, 이는 표적 올리고의 생물학적 활성에 유익한 것으로 입증되거나 또는 더 광범위한 과학의 영향에 기여한다.
잠금 뉴클레오티드 트리포스페이트에 대한 3' 아지도메틸 에테르의 제조를 위한 예시적인 도식을 도 34에 도시한다.
서열
인간 폴리머라제 뮤 R387K (서열식별번호:1)
Figure pct00015
사카로마이세스 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제 (서열식별번호:2)
Figure pct00016
스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제 (서열식별번호:3)
Figure pct00017
물질 & 방법
효소 발현 및 정제
관심 야생형 또는 돌연변이체 효소의 일차 서열은 맞춤형 최적화 알고리즘을 이용하여 이. 콜라이(E. coli) 발현을 위해 코돈 최적화되었고, pET-28-c-(+) His-태그 발현 벡터 (이엠디 밀리포어(EMD Millipore) 69866-3)로의 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly)를 위해 20-nt 오버랩 서열을 갖는 지블록스(gBlocks)® (IDT)로서 주문되었다. IDT로부터의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여, 지블록스®를 퓨전 하이 피델리티(Phusion High Fidelity) (HF) 폴리머라제 (NEB M05030)에 의해 PCR 증폭시켰다. PCR 열순환을 다음과 같이 수행하였다: 98℃에서 30 초 동안 초기 변성, 98℃에서 10 초 동안 변성, 68℃에서 10 초 동안 어닐링, 및 72℃에서 60 초 동안 연장 (18 주기 동안) 후에, 72℃에서 5 분 동안 최종 연장. PCR 반응을 정제하고, 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트 (퀴아젠(Qiagen) 28106)를 사용하여 농축시켰다.
500 ng 벡터당 40U의 NDeI (NEB R0111)에 의해 37℃에서 90 분 동안 원형 DNA를 소화시킴으로써 pET-28-c-(+) 발현 벡터를 지블록스® 삽입을 위해 준비하였다. 선형 DNA를 2% 아가로스 겔 전기영동에 의해 소화되지 않은 물질로부터 분리하고, 2 시간 동안 1000 RPM에서 회전시키면서 55℃에서 완충제 QG (퀴아젠 19063) 중에서 선형 DNA에 상응하는 밴드를 함유하는 아가로스를 인큐베이션함으로써 추출하였다. 생성된 혼합물을 세척하고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트로 농축시켰다. PCR 증폭된 삽입 및 벡터 서열을 1:3의 비로 0.1 pmol의 총 물질과 조합하였고, 깁슨 어셈블리 마스터 믹스 (NEB E5510S)에 의해 50℃에서 1 시간 동안 조립하였다. T7 발현 화학적으로 적격성인 이. 콜라이 (NEB C2566I)를 제조자의 지침에 따라 완전히 조립된 플라스미드에 의해 형질전환시키고, 양성 형질전환체를 LB-카나마이신 플레이트 (50 ug/mL 카나마이신) 상에서 선택하였다.
박테리아 콜로니를 시퀀싱하였고 (진위즈(Genewiz), T7 - 정방향 프라이머, T7 Term - 역방향 프라이머), 완벽한 매칭을 갖는 것들을 액체 LB-카나마이신 배지 (50 μg/mL 카나마이신)에서 밤새 성장시키고, 신선한 액체 LB-카나마이신 중에서 1:400로 희석시키고, 1 mM IPTG (시그마(Sigma) I6758)에 의해 대략 OD600 = 0.8에서 유도하였다. 유도된 액체 배양물을 250 RPM에서 진탕시키면서 15℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 배양물을 3500 x g에서 10 분 동안 펠렛화한 다음, 제조자의 지침 (클론텍(Clontech) 635654)에 따라 히스탈론(HisTalon) 수지 키트를 사용하여 His-태그 정제하였다. 이어서, 4℃에서 15 분 동안 5000 x G에서 원심분리함으로써 15-mL 여과기 컬럼 (밀리포어)을 사용하여 적절한 MWCO에서 용리된 효소 샘플을 최적의 2X 단백질 보관 완충제로 완충제 교환하였다. 이 과정을 2회 반복하였다. 세번째 회전시에, 샘플을 30 분 동안 회전시켜, 단백질을 더 적은 부피로 농축시켰다.
2개의 적은 분취량을 취하여, 환원제 적합성 마이크로BCA 키트 (써모 23252)를 사용하여 전체 단백질 농도를 결정하고, 10-250 kDa 단백질 래더에 의해 (써모 26619) 16% 트리스-Gly 변성 겔 (써모 XP00165)을 사용하여 His-태그 정제된 단백질의 크기를 결정하였다. 겔-전기영동 후에, 겔을 쿠마씨 오렌지 플루오르(Coomassie Orange Fluor) (써모 C33250)에 의해 실온에서 20 분 동안 부드러운 진탕하에 염색하였고, 겔독(GelDoc) 영상 스테이션 (바이오라드(Biorad))을 이용하여 시각화하였다. 남아있는 농축된 단백질 스톡을 멸균 글리세롤에 의해 1:2로 희석하고, -20℃에서 보관하였다.
RNA 합성을 개선시키기 위해 표적 단백질의 부위-지정 돌연변이 생성
단일 또는 다중 아미노산은 합리적인 설계에 의해 또는 고처리량 방법, 예컨대 오류-유발 PCR에 의해 RNA 올리고뉴클레오티드 합성 계획에서의 개선을 위해 돌연변이될 수 있다. 미니프렙(MiniPrep) 키트 (퀴아젠 27104)를 사용하여 LB-카나마이신 배지 중에서 37℃에서 밤새 성장된 서열 검증된 액체 박테리아 배양물로부터 표적 단백질을 보유하는 플라스미드를 수확하고 정제하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 IDT로부터 주문하고, 예정된 위치에서 플라스미드를 동시에 돌연변이시키면서 단백질 발현 플라스미드를 PCR 증폭시키도록 설계하여, 선형화된 DNA를 수득하였다. Q5 부위-지정 돌연변이 생성 키트 (NEB E0554S)로부터의 시약을 사용하여, 단백질 발현 플라스미드를 하기 열순환 조건에 의해 Q5 핫 스타트(Hot Start) 고충실도 2x 마스터 믹스를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 98℃에서 30 초 동안 초기 변성, 98℃에서 10 초 동안 변성, 68℃에서 10 초 동안 어닐링, 및 72℃에서 120 초 동안 연장 (25 주기 동안) 후에, 72℃에서 2 분 동안 최종 연장. 이어서, 1 μL의 생성된 PCR 증폭 반응을 키트의 효소 반응 칵테일로 처리하여, 반응 혼합물에 남아 있는 비치환된 플라스미드 서열을 소화시키면서 단백질 발현 플라스미드를 재순환시켰다. 박테리아 형질전환 및 서열 검증 후에, 완벽한 서열 매칭을 갖는 콜로니를 사용하여, 이전에 설명된 방법에 따라 부위-지정 돌연변이체 단백질을 발현시키고 분석하였다. 생성된 정제되고 돌연변이된 단백질을 농축시키고, 이전에 언급된 바와 같이 적절한 2X 보관 완충제로 완충제 교환하고, 멸균 글리세롤에 의해 1:2로 희석하고, -20℃에서 보관하였다.
천연 rNTP에 의한 초기 활성 스크린
천연 rNTP와의 인큐베이션 후에 단백질에 의해 생성된 총 RNA 농도 및 RNA의 길이/분포의 측면에서 RNA 생성 속도를 결정함으로써 말단 트랜스퍼라제 활성을 갖는 발현된 단백질을 스크리닝할 수 있다. RNA 생성 속도를 측정하기 위해, 10 pmol의 짧은 5'-Cy5 표지된 개시자 올리고뉴클레오티드 (15-20-nt), 100 μM의 rNTP, 0.25 mM 2가 양이온 보조인자 (예컨대 Co2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, 또는 이들의 조합물), 1x 반응 완충제, 1x SYBR 염료 (겔스타 (론자(Lonza) 50535), 퀴빗(Qubit) ssDNA 염료 (써모 Q10212), 또는 SYBR 그린 II RNA 겔 염색 (써모 S7564), 및 1 μL의 정제된 효소로 이루어진 10 μL 벌크 연장 반응을 37℃에서 30 분에 걸쳐 플레이트 판독기 (EX:598 nm, EM:522 nm)에서 1 분마다 3중으로 (N=3) 신호 판독함으로써 모니터링하였다. 맞춤형 R 스크립트를 사용하여, RNA 생성 속도 및 후속적으로 효소 초기 활성 (Vo)을 시간의 함수로서 플롯팅된 평균 RFU의 최적 맞춤 곡선의 기울기로부터 결정하였다. 이들 반응에서 생성된 RNA의 길이는 제조자의 프로토콜에 따라 15% TBE-우레아 변성 겔 (써모 EC6885)을 사용하여 생성물을 100-nt ssDNA 래더 (심플렉스 바이오사이언시즈(Simplex Biosciences))와 비교함으로써 결정하였다. 달리 명시하지 않는다면 대략 8 μL의 초기 활성 스크린 반응 부피를 겔 상에 로딩하고, 185V에서 60 분 동안 작동시켰다. 이어서, 겔을 부드럽게 진탕하면서 1x 겔스타 핵산 염색 또는 SYBR 그린 II RNA 겔 염색의 용액을 이용하여 15 분 동안 염색하였다. 이어서, 생성된 겔을 SYBR 골드에 대한 영상화 파라미터를 이용하여 타이푼 FLA 9500 시스템 (지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences)) 상에 영상화하였다. 5'-형광단, 예컨대 FAM, Cy5, Cy3 등으로 표지된 개시자 올리고뉴클레오티드를 사용하는 연장 반응의 경우, 겔을 염색하지 않고, 적절한 파라미터를 사용하여 직접적으로 영상화하였다.
효소 활성 검정 - 천연 & 유사 뉴클레오티드에 의한 비제어된 연장
비제어된 연장 반응은 5 pmol의 개시자 올리고뉴클레오티드, 1 mM 천연 또는 유사 뉴클레오티드, 1X 폴리(U) 폴리머라제 반응 완충제 (10 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25C에서 pH 7.9), 및 1 μg의 정제된 효소로 구성되었다. 천연 및 유사 뉴클레오티드를 상업적인 공급원으로부터 구입하거나, 또는 사내에서 맞춤형으로 합성하였다. 반응을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 제조자의 지침에 따라 즉시 15% TBE-우레아 변성 겔 (써모 EC6885)을 사용하여 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 이들 반응에서 생성된 올리고뉴클레오티드의 길이는 생성물을 100-nt ssDNA 래더 (심플렉스 바이오사이언시즈)와 비교함으로써 결정되었다. 이어서, 겔을 부드럽게 진탕시키면서 1x 겔스타 핵산 염색 또는 SYBR 그린 II RNA 겔 염색의 용액으로 15 분 동안 염색하였다. 이어서, 생성된 겔을 SYBR 골드에 대한 영상화 파라미터를 사용하여 타이푼 FLA 9500 시스템 (지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈) 상에 영상화하였다. 5'-형광단, 예컨대 FAM, Cy5, Cy3 등으로 표지된 개시자 올리고뉴클레오티드를 사용하는 연장 반응의 경우, 겔을 염색하지 않고, 적절한 파라미터를 사용하여 직접적으로 영상화하였다.
효소 활성 검정 - 천연 & 유사 가역적인 종결자 뉴클레오티드에 의한 제어된 연장
제어된 연장 반응은 5 pmol의 개시자 올리고뉴클레오티드, 1 mM 차단된 가역적인 종결자 뉴클레오티드, 1X 폴리(U) 폴리머라제 반응 완충제 (10 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25C에서 pH 7.9), 및 1 μg의 정제된 효소로 구성되었다. 반응을 37℃에서 1 분 동안 인큐베이션하였고, 제조자의 지침에 따라 즉시 15% TBE-우레아 변성 겔 (써모 EC6885)을 사용하여 겔 전기영동에 의해 분석하였다. (N+1) 사건의 성공은 뉴클레오티드 또는 효소가 보충되지 않은 블랭크 연장 반응을 작동시킴으로써 결정되었다. 이어서, 겔을 부드럽게 진탕시키면서 1x 겔스타 핵산 염색 또는 SYBR 그린 II RNA 겔 염색의 용액으로 15 분 동안 염색하였다. 이어서, 생성된 겔을 SYBR 골드에 대한 영상화 파라미터를 사용하여 타이푼 FLA 9500 시스템 (지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈) 상에 영상화하였다. 5'-형광단, 예컨대 FAM, Cy5, Cy3 등으로 표지된 개시자 올리고뉴클레오티드를 사용하는 연장 반응의 경우, 겔을 염색하지 않고, 적절한 파라미터를 사용하여 직접적으로 영상화하였다.
효소 활성 검정 - 표면 상에서 비제어된 또는 제어된 연장 반응
비제어된 및 제어된 연장 반응 둘 다 표면 결합된 개시자 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행하였다. 표면 결합된 개시자 올리고뉴클레오티드를 5'-아민 C6 스페이서 기 및 내부 Cy5 형광단과 함께 IDT로부터 입수하였다. 이어서, 이 올리고뉴클레오티드를 제조자의 지침에 따라 EZ 링크 NHS-PEG12-비오틴 키트 (써모 A35389)를 사용하여 비오틴화하고 PEG화한 다음, 올리고뉴클레오티드 세척 및 농축기 스핀-컬럼 키트 (자이모(Zymo) D4060)를 사용하여 세척하고 농축시켰다. 이어서, 플레이트 웰에서 부드럽게 진탕시키면서 (300 RPM) 2X 결합 및 세척 완충제 (10 mM 트리스-HCl, 2M NaCl, 1 mM EDTA, 25℃에서 pH 7.5) 중에서 1 시간 동안 올리고뉴클레오티드를 인큐베이션함으로써 유도체화된 개시자 올리고뉴클레오티드를 스트렙타비딘 코팅된 PCR 플레이트 (바이오테즈(BioTez), 독일)의 표면에 결합시켰다. 이어서, 웰을 흡인한 다음, 1X 결합 및 세척 완충제로 1회 세척하였다. 연장 반응 칵테일을 이전에 기재된 바와 같이 구성하고, 표면 결합된 올리고뉴클레오티드와 함께 예정된 시간 동안 (비제어된 경우 30 분 & 제어된 경우 1 분) 37℃에서 900 RPM에서 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 이어서, 웰을 1X 결합 및 세척 완충제를 사용하여 다시 세척하였다. 표면으로부터 연장된 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위해, 웰을 스트립핑 용액 (95% 포름아미드, 10 mM EDTA, 25℃에서 pH 6.0)과 함께 65℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 스트립핑 용액에 현탁된 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 스핀-컬럼을 사용하여 세척하고 정제하였고, 6 μL diH20에 용해시켰다. 이어서, 표면 연장 반응을 이전에 기재된 바와 같이 겔 전기영동을 이용하여 분석하였다.
참고문헌
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
등가물 및 범위
청구항에서 단수 표현은 달리 나타내지 않는다면 또는 문맥으로부터 달리 명백하지 않다면 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원들 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 명세서는, 달리 나타내지 않는다면 또는 문맥으로부터 달리 명백하지 않다면 그룹 구성원 중 하나, 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 그에 사용되거나, 또는 그와 달리 관련있는 경우에 충족되는 것으로 고려된다. 본 발명은 정확하게 그룹의 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 그에 사용되거나, 또는 그와 달리 관련있는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 그룹 구성원 중 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 그에 사용되거나, 또는 그와 달리 관련있는 실시양태를 포함한다.
추가로, 본 발명은 모든 변형, 조합 및 순열을 포함하며, 여기서 나열된 청구항 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 절 및 설명적 용어는 또 다른 청구항에 도입된다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속된 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속된 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소들이 예를 들어 마쿠쉬 그룹 형식으로 목록으로 제시되는 경우에는, 요소들의 각각의 하위 그룹 또한 개시되고, 임의의 요소(들)이 그룹으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특정한 요소 및/또는 특징을 포함하는 것으로 언급된 경우에는, 본 발명 또는 본 발명의 측면의 특정 실시양태가 이러한 요소 및/또는 특징으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어진다는 것을 이해해야 한다. 간결함을 위해, 이들 실시양태는 본원에서 상세하게 설명되지 않았다.
용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적인 것으로 의도되고, 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용한다. 범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 추가로, 달리 나타내지 않는다면 또는 문맥으로부터 및 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 달리 명백하지 않다면, 범위로 표현된 값은 본 발명의 상이한 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 구체적인 값 또는 하위 범위를 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는다면 범위의 하한의 단위의 1/10까지 가정할 수 있다.
본 출원은 다양한 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 저널 기사 및 다른 공보를 인용하며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다. 임의의 포함된 참고문헌과 본 명세서 사이에 분쟁이 있는 경우에는, 본 명세서가 우선한다. 추가로, 선행 기술 내에 속하는 본 발명의 임의의 특정한 실시양태는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명시적으로 제외될 수 있다. 이러한 실시양태가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이들은 제외하는 것으로 명시적으로 설명되지 않은 경우에도 제외될 수 있다. 본 발명의 임의의 특정한 실시양태는 선행 기술의 존재와 관련이 있건 없건 간에 어떠한 이유로든 임의의 청구항으로부터 제외될 수 있다.
관련 기술분야의 기술자는 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 대한 여러 등가물을 일상적인 실험만으로도 인지할 것이고 또는 확인할 수 있다. 본원에 기재된 실시양태의 범위는 상기 명세서를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 오히려 첨부된 청구항에 기재된 바와 같다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하기 청구항에서 정의된 바와 같이 본 발명의 개념 또는 범위를 벗어나지 않고 본 명세서에 대한 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> President and Fellow of Harvard College <120> ENZYMATIC RNA SYNTHESIS <130> H0824.70287WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/745,136 <151> 2018-10-12 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 494 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Pro Lys Arg Arg Arg Ala Arg Val Gly Ser Pro Ser Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ser Thr Pro Pro Ser Thr Arg Phe Pro Gly Val Ala Ile 20 25 30 Tyr Leu Val Glu Pro Arg Met Gly Arg Ser Arg Arg Ala Phe Leu Thr 35 40 45 Gly Leu Ala Arg Ser Lys Gly Phe Arg Val Leu Asp Ala Cys Ser Ser 50 55 60 Glu Ala Thr His Val Val Met Glu Glu Thr Ser Ala Glu Glu Ala Val 65 70 75 80 Ser Trp Gln Glu Arg Arg Met Ala Ala Ala Pro Pro Gly Cys Thr Pro 85 90 95 Pro Ala Leu Leu Asp Ile Ser Trp Leu Thr Glu Ser Leu Gly Ala Gly 100 105 110 Gln Pro Val Pro Val Glu Cys Arg His Arg Leu Glu Val Ala Gly Pro 115 120 125 Arg Lys Gly Pro Leu Ser Pro Ala Trp Met Pro Ala Tyr Ala Cys Gln 130 135 140 Arg Pro Thr Pro Leu Thr His His Asn Thr Gly Leu Ser Glu Ala Leu 145 150 155 160 Glu Ile Leu Ala Glu Ala Ala Gly Phe Glu Gly Ser Glu Gly Arg Leu 165 170 175 Leu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ala Leu Pro Ser Pro 180 185 190 Val Thr Thr Leu Ser Gln Leu Gln Gly Leu Pro His Phe Gly Glu His 195 200 205 Ser Ser Arg Val Val Gln Glu Leu Leu Glu His Gly Val Cys Glu Glu 210 215 220 Val Glu Arg Val Arg Arg Ser Glu Arg Tyr Gln Thr Met Lys Leu Phe 225 230 235 240 Thr Gln Ile Phe Gly Val Gly Val Lys Thr Ala Asp Arg Trp Tyr Arg 245 250 255 Glu Gly Leu Arg Thr Leu Asp Asp Leu Arg Glu Gln Pro Gln Lys Leu 260 265 270 Thr Gln Gln Gln Lys Ala Gly Leu Gln His His Gln Asp Leu Ser Thr 275 280 285 Pro Val Leu Arg Ser Asp Val Asp Ala Leu Gln Gln Val Val Glu Glu 290 295 300 Ala Val Gly Gln Ala Leu Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Thr Gly Gly 305 310 315 320 Phe Arg Arg Gly Lys Leu Gln Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr 325 330 335 His Pro Lys Glu Gly Gln Glu Ala Gly Leu Leu Pro Arg Val Met Cys 340 345 350 Arg Leu Gln Asp Gln Gly Leu Ile Leu Tyr His Gln His Gln His Ser 355 360 365 Cys Cys Glu Ser Pro Thr Arg Leu Ala Gln Gln Ser His Met Asp Ala 370 375 380 Phe Glu Lys Ser Phe Cys Ile Phe Arg Leu Pro Gln Pro Pro Gly Ala 385 390 395 400 Ala Val Gly Gly Ser Thr Arg Pro Cys Pro Ser Trp Lys Ala Val Arg 405 410 415 Val Asp Leu Val Val Ala Pro Val Ser Gln Phe Pro Phe Ala Leu Leu 420 425 430 Gly Trp Thr Gly Ser Lys Leu Phe Gln Arg Glu Leu Arg Arg Phe Ser 435 440 445 Arg Lys Glu Lys Gly Leu Trp Leu Asn Ser His Gly Leu Phe Asp Pro 450 455 460 Glu Gln Lys Thr Phe Phe Gln Ala Ala Ser Glu Glu Asp Ile Phe Arg 465 470 475 480 His Leu Gly Leu Glu Tyr Leu Pro Pro Glu Gln Arg Asn Ala 485 490 <210> 2 <211> 568 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Ser Ser Gln Lys Val Phe Gly Ile Thr Gly Pro Val Ser Thr Val 1 5 10 15 Gly Ala Thr Ala Ala Glu Asn Lys Leu Asn Asp Ser Leu Ile Gln Glu 20 25 30 Leu Lys Lys Glu Gly Ser Phe Glu Thr Glu Gln Glu Thr Ala Asn Arg 35 40 45 Val Gln Val Leu Lys Ile Leu Gln Glu Leu Ala Gln Arg Phe Val Tyr 50 55 60 Glu Val Ser Lys Lys Lys Asn Met Ser Asp Gly Met Ala Arg Asp Ala 65 70 75 80 Gly Gly Lys Ile Phe Thr Tyr Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Val His Gly 85 90 95 Pro Gly Ser Asp Ile Asp Thr Leu Val Val Val Pro Lys His Val Thr 100 105 110 Arg Glu Asp Phe Phe Thr Val Phe Asp Ser Leu Leu Arg Glu Arg Lys 115 120 125 Glu Leu Asp Glu Ile Ala Pro Val Pro Asp Ala Phe Val Pro Ile Ile 130 135 140 Lys Ile Lys Phe Ser Gly Ile Ser Ile Asp Leu Ile Cys Ala Arg Leu 145 150 155 160 Asp Gln Pro Gln Val Pro Leu Ser Leu Thr Leu Ser Asp Lys Asn Leu 165 170 175 Leu Arg Asn Leu Asp Glu Lys Asp Leu Arg Ala Leu Asn Gly Thr Arg 180 185 190 Val Thr Asp Glu Ile Leu Glu Leu Val Pro Lys Pro Asn Val Phe Arg 195 200 205 Ile Ala Leu Arg Ala Ile Lys Leu Trp Ala Gln Arg Arg Ala Val Tyr 210 215 220 Ala Asn Ile Phe Gly Phe Pro Gly Gly Val Ala Trp Ala Met Leu Val 225 230 235 240 Ala Arg Ile Cys Gln Leu Tyr Pro Asn Ala Cys Ser Ala Val Ile Leu 245 250 255 Asn Arg Phe Phe Ile Ile Leu Ser Glu Trp Asn Trp Pro Gln Pro Val 260 265 270 Ile Leu Lys Pro Ile Glu Asp Gly Pro Leu Gln Val Arg Val Trp Asn 275 280 285 Pro Lys Ile Tyr Ala Gln Asp Arg Ser His Arg Met Pro Val Ile Thr 290 295 300 Pro Ala Tyr Pro Ser Met Cys Ala Thr His Asn Ile Thr Glu Ser Thr 305 310 315 320 Lys Lys Val Ile Leu Gln Glu Phe Val Arg Gly Val Gln Ile Thr Asn 325 330 335 Asp Ile Phe Ser Asn Lys Lys Ser Trp Ala Asn Leu Phe Glu Lys Asn 340 345 350 Asp Phe Phe Phe Arg Tyr Lys Phe Tyr Leu Glu Ile Thr Ala Tyr Thr 355 360 365 Arg Gly Ser Asp Glu Gln His Leu Lys Trp Ser Gly Leu Val Glu Ser 370 375 380 Lys Val Arg Leu Leu Val Met Lys Leu Glu Val Leu Ala Gly Ile Lys 385 390 395 400 Ile Ala His Pro Phe Thr Lys Pro Phe Glu Ser Ser Tyr Cys Cys Pro 405 410 415 Thr Glu Asp Asp Tyr Glu Met Ile Gln Asp Lys Tyr Gly Ser His Lys 420 425 430 Thr Glu Thr Ala Leu Asn Ala Leu Lys Leu Val Thr Asp Glu Asn Lys 435 440 445 Glu Glu Glu Ser Ile Lys Asp Ala Pro Lys Ala Tyr Leu Ser Thr Met 450 455 460 Tyr Ile Gly Leu Asp Phe Asn Ile Glu Asn Lys Lys Glu Lys Val Asp 465 470 475 480 Ile His Ile Pro Cys Thr Glu Phe Val Asn Leu Cys Arg Ser Phe Asn 485 490 495 Glu Asp Tyr Gly Asp His Lys Val Phe Asn Leu Ala Leu Arg Phe Val 500 505 510 Lys Gly Tyr Asp Leu Pro Asp Glu Val Phe Asp Glu Asn Glu Lys Arg 515 520 525 Pro Ser Lys Lys Ser Lys Arg Lys Asn Leu Asp Ala Arg His Glu Thr 530 535 540 Val Lys Arg Ser Lys Ser Asp Ala Ala Ser Gly Asp Asn Ile Asn Gly 545 550 555 560 Thr Thr Ala Ala Val Asp Val Asn 565 <210> 3 <211> 405 <212> PRT <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 3 Met Asn Ile Ser Ser Ala Gln Phe Ile Pro Gly Val His Thr Val Glu 1 5 10 15 Glu Ile Glu Ala Glu Ile His Lys Asn Leu His Ile Ser Lys Ser Cys 20 25 30 Ser Tyr Gln Lys Val Pro Asn Ser His Lys Glu Phe Thr Lys Phe Cys 35 40 45 Tyr Glu Val Tyr Asn Glu Ile Lys Ile Ser Asp Lys Glu Phe Lys Glu 50 55 60 Lys Arg Ala Ala Leu Asp Thr Leu Arg Leu Cys Leu Lys Arg Ile Ser 65 70 75 80 Pro Asp Ala Glu Leu Val Ala Phe Gly Ser Leu Glu Ser Gly Leu Ala 85 90 95 Leu Lys Asn Ser Asp Met Asp Leu Cys Val Leu Met Asp Ser Arg Val 100 105 110 Gln Ser Asp Thr Ile Ala Leu Gln Phe Tyr Glu Glu Leu Ile Ala Glu 115 120 125 Gly Phe Glu Gly Lys Phe Leu Gln Arg Ala Arg Ile Pro Ile Ile Lys 130 135 140 Leu Thr Ser Asp Thr Lys Asn Gly Phe Gly Ala Ser Phe Gln Cys Asp 145 150 155 160 Ile Gly Phe Asn Asn Arg Leu Ala Ile His Asn Thr Leu Leu Leu Ser 165 170 175 Ser Tyr Thr Lys Leu Asp Ala Arg Leu Lys Pro Met Val Leu Leu Val 180 185 190 Lys His Trp Ala Lys Arg Lys Gln Ile Asn Ser Pro Tyr Phe Gly Thr 195 200 205 Leu Ser Ser Tyr Gly Tyr Val Leu Met Val Leu Tyr Tyr Leu Ile His 210 215 220 Val Ile Lys Pro Pro Val Phe Pro Asn Leu Leu Leu Ser Pro Leu Lys 225 230 235 240 Gln Glu Lys Ile Val Asp Gly Phe Asp Val Gly Phe Asp Asp Lys Leu 245 250 255 Glu Asp Ile Pro Pro Ser Gln Asn Tyr Ser Ser Leu Gly Ser Leu Leu 260 265 270 His Gly Phe Phe Arg Phe Tyr Ala Tyr Lys Phe Glu Pro Arg Glu Lys 275 280 285 Val Val Thr Phe Arg Arg Pro Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Gln Glu Lys 290 295 300 Gly Trp Thr Ser Ala Thr Glu His Thr Gly Ser Ala Asp Gln Ile Ile 305 310 315 320 Lys Asp Arg Tyr Ile Leu Ala Ile Glu Asp Pro Phe Glu Ile Ser His 325 330 335 Asn Val Gly Arg Thr Val Ser Ser Ser Gly Leu Tyr Arg Ile Arg Gly 340 345 350 Glu Phe Met Ala Ala Ser Arg Leu Leu Asn Ser Arg Ser Tyr Pro Ile 355 360 365 Pro Tyr Asp Ser Leu Phe Glu Glu Ala Pro Ile Pro Pro Arg Arg Gln 370 375 380 Lys Lys Thr Asp Glu Gln Ser Asn Lys Lys Leu Leu Asn Glu Thr Asp 385 390 395 400 Gly Asp Asn Ser Glu 405 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 4 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His 20 <210> 5 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 5 uuuuuuuuuu uuuuuuccgg uaaccgguuu uu 32 <210> 6 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 6 uuuuuuuuuu uccgguaacc gguuuuuuuu uu 32 <210> 7 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 7 uccgguaacc gguuuuuuuu uuuuuuuuuu uu 32 <210> 8 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> modified by 5AmMC12 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is ideoxyl <400> 8 ucuaccauau aunacaaaac aaaauaaauu 30

Claims (122)

  1. (a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
    (b) 폴리(N) 폴리머라제를 제공하는 단계;
    (c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(N) 폴리머라제, 및 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 조합하는 단계를 포함하는,
    RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법.
  2. 제1항에 있어서, (d) 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 단계 (a)-(c)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 1개 이상의 천연 또는 변형된 뉴클레오티드를 부가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(N) 폴리머라제가 폴리(U) 폴리머라제, 폴리(A) 폴리머라제, 폴리(C) 폴리머라제, 또는 폴리(G) 폴리머라제; 또는 그의 돌연변이체, 또는 그의 상동체인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(N) 폴리머라제가 폴리(A) 폴리머라제, 또는 그의 돌연변이체, 또는 그의 상동체인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 폴리(A) 폴리머라제가 야생형 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 폴리(A) 폴리머라제, 또는 그의 돌연변이체, 또는 그의 상동체인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 폴리(A) 폴리머라제가 야생형 사카로마이세스 세레비지아에 폴리(A) 폴리머라제인 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(N) 폴리머라제가 폴리(U) 폴리머라제, 또는 그의 돌연변이체, 또는 그의 상동체인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 폴리(U) 폴리머라제가 야생형 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 폴리(U) 폴리머라제, 또는 그의 돌연변이체, 또는 그의 상동체인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 폴리(U) 폴리머라제가 야생형 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드 중 적어도 1개가 염기-변형된 뉴클레오티드인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 염기-변형된 뉴클레오티드가 5-메틸시토신, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 수도우라실, 3-메틸 우라실, 디히드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘, 5-알킬우리딘, 5-할로우리딘, 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘, 프로핀, 퀘소신, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 4-아세틸티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, β-D-갈락토실케오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카르보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, β-D-만노실케오신, 우리딘-5-옥시아세트산, 2-티오시티딘, N1-메틸-아데닌, N6-메틸-아데닌, 8'-아지도-아데닌, N,N-디메틸-아데노신, 아미노알릴-아데노신, 5'-메틸-우리딘, 수도우리딘, N1-메틸-수도우리딘, 5'-히드록시-메틸-우리딘, 2'-티오-우리딘, 4'-티오-우리딘, 히포크산틴, 크산틴, 5'-메틸-시티딘, 5'-히드록시-메틸-시티딘, 6'-티오-구아닌, 및 N7-메틸-구아닌, 트레오닌 유도체, 피리미딘 유도체, 및 퓨린 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 염기를 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 염기-변형된 뉴클레오티드가 N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸-2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, N1-메틸수도우리딘-5'-트리포스페이트, 수도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-히드록시메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-히드록시메틸시티딘-5'-트리포스페이트, N7-메틸구아노신-트리포스페이트, 8'-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 이노신 5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 6-티오구아노신-5'-트리포스페이트, 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 및 크산토신-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드 중 적어도 1개가 당-변형된 뉴클레오티드인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 당-변형된 뉴클레오티드가 2'-위치에서 변형되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 당-변형된 뉴클레오티드가 2'-F, 2'-O-알킬, 2'-아미노, 또는 2'-아지도 변형된 뉴클레오티드인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 당-변형된 뉴클레오티드가 2'-플루오로-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로-2'-데옥시구아노신-5'-트리포스페이트, 및 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 2'-F 변형된 뉴클레오티드인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 당-변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 및 2'-O-메틸이노신-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 당-변형된 뉴클레오티드가 2'-아미노-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트, 및 2'-아미노-2'-데옥시구아노신-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 2'-O-아미노 변형된 뉴클레오티드인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 당-변형된 뉴클레오티드가 2'-아지도-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-아지도-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-아지도-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트, 및 2'-아지도-2'-데옥시구아노신-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 2'-O-아지도 변형된 뉴클레오티드인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드 중 적어도 1개가 변형된 트리포스페이트인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드 중 적어도 1개가 가교 또는 잠금 뉴클레오티드인 방법.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 당-변형된 뉴클레오티드가 2'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드인 방법.
  24. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 당-변형된 뉴클레오티드가 3'-변형된 가역적인 종결자 뉴클레오티드인 방법.
  25. (a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
    (b) 폴리(U) 폴리머라제를 제공하는 단계;
    (c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 2'- 및/또는 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(U) 폴리머라제, 및 2'- 및/또는 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드를 조합하는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 형성된 RNA 올리고뉴클레오티드를 2'- 및/또는 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드의 보호된 2'- 및/또는 3'-O-위치에서 탈보호시키는 단계;
    (e) 임의적으로, 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 단계 (a)-(c)를 반복하는 단계를 포함하는,
    RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법.
  26. 제25항에 있어서, 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 산소 보호기에 의해 2'-O 위치에서 보호된 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 광불안정성 보호기에 의해 2'-O 위치에서 보호되는 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 2'-O-알킬, 2'-O-실릴, 2'-O-알릴, 2'-O-아지도메틸, 2'-O-벤질, 2'-O-코우마리닐, 또는 2'-O-카르보네이트 변형된 뉴클레오티드인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 2'-O-알릴옥시카르보닐 및 2'-O-(2-옥소-2H-크로멘-4-일)메틸옥시카르보닐로부터 선택된 2'-O-카르보네이트 변형된 뉴클레오티드인 방법.
  30. 제25항 또는 제26항에 있어서, 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 2'-O-알릴-NTP 또는 2'-O-아지도메틸-NTP인 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 변형된 염기 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 2'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 1개 이상의 추가의 변형을 포함하는 것인 방법.
  33. 제25항에 있어서, 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 산소 보호기에 의해 3'-O 위치에서 보호된 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 광불안정성 보호기에 의해 3'-O 위치에서 보호되는 것인 방법.
  35. 제32항 또는 제34항에 있어서, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 3'-O-알킬, 3'-O-실릴, 3'-O-알릴, 3'-O-아지도메틸, 3'-O-벤질, 3'-O-코우마리닐, 또는 3'-O-카르보네이트 변형된 뉴클레오티드인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 3'-O-알릴옥시카르보닐 및 3'-O-(2-옥소-2H-크로멘-4-일)메틸옥시카르보닐로부터 선택된 3'-O-카르보네이트 변형된 뉴클레오티드인 방법.
  37. 제25항 또는 제33항에 있어서, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 3'-O-알릴-NTP, 3'-O-아지도메틸-NTP, 3'-O-알릴 카르보네이트-NTP, 3'-O-알릴 카르보네이트-dNTP, 3'-O-아지도메틸 카르보네이트-NTP, 또는 3'-O-아지도메틸 카르보네이트-dNTP인 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 변형된 염기 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 1개 이상의 추가의 변형을 포함하는 것인 방법.
  40. 제25항에 있어서, 2'- 및/또는 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 하기 화학식의 것 또는 그의 염인 방법:
    Figure pct00023

    상기 식에서:
    Y는 O 또는 S이고;
    X는 O 또는 S이고;
    각각의 경우의 RP는 수소, 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이거나, 또는 2개의 RP는 개재 원자와 함께 결합되어 임의적으로 치환된 헤테로시클릴을 형성하며; 단, 적어도 1개의 RP는 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이고;
    "염기"는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 염기이다.
  41. 제33항에 있어서, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 하기 화학식의 것 또는 그의 염인 방법:
    Figure pct00024

    상기 식에서:
    Y는 O 또는 S이고;
    X는 O 또는 S이고;
    RP는 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이고;
    R은 수소, 할로겐, -CN, -NO2, -N3, 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 알케닐, 임의적으로 치환된 알키닐, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, 임의적으로 치환된 카르보시클릴, 임의적으로 치환된 헤테로시클릴, 임의적으로 치환된 아실, 임의적으로 치환된 히드록실, 임의적으로 치환된 아미노, 또는 임의적으로 치환된 티올이고;
    "염기"는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 염기이다.
  42. 제33항에 있어서, 3'-O-보호된 가역적인 종결자 뉴클레오티드가 하기 화학식의 것 또는 그의 염인 방법:
    Figure pct00025

    상기 식에서:
    Y는 O 또는 S이고;
    X는 O 또는 S이고;
    RP는 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이고;
    "염기"는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 염기이다.
  43. (a) 개시자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 개시자 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA인 단계;
    (b) 폴리(U) 폴리머라제를 제공하는 단계;
    (c) 개시자 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 적어도 1개의 가수분해성 뉴클레오티드를 부가하는데 충분한 조건하에 개시자 올리고뉴클레오티드, 폴리(U) 폴리머라제, 1개 이상의 뉴클레오티드, 및 1개 이상의 비-가수분해성 뉴클레오티드를 조합하는 단계이며, 여기서 비-가수분해성 뉴클레오티드의 농도는 폴리(U) 폴리머라제에 의한 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가 속도를 억제하는데 충분한 것인 단계를 포함하는,
    RNA 올리고뉴클레오티드의 주형-비의존성 합성 방법.
  44. 제43항에 있어서, (d) 원하는 RNA 서열이 수득될 때까지 단계 (a)-(c)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 비-가수분해성 뉴클레오티드가 변형된 트리포스페이트 기를 포함하는 것인 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 비-가수분해성 뉴클레오티드가 우리딘-5'-[(α,β)-이미도]트리포스페이트, 아데노신-5'-[(α,β)-이미도]트리포스페이트, 구아노신-5'-[(α,β)-메틸레노]트리포스페이트, 시티딘-5'-[(α,β)-메틸레노]트리포스페이트, 아데노신-5'-[(β,γ)-메틸레노]트리포스페이트, 아데노신-5'-[(β,γ)-이미도]트리포스페이트, 구아노신-5'-[(β,γ)-이미도]트리포스페이트, 및 우리딘-5'-[(β,γ)-이미도]트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  47. 제43항 또는 제44항에 있어서, 비-가수분해성 뉴클레오티드가 3'-변형된 뉴클레오티드인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 비-가수분해성 뉴클레오티드가 3'-O-메틸아데노신-5'-트리포스페이트 및 3'-O-메틸우리딘-5'-트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 1-100개의 뉴클레오티드가 혼입되는 것인 방법.
  50. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 1-50개의 뉴클레오티드가 혼입되는 것인 방법.
  51. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 1-20개의 뉴클레오티드가 혼입되는 것인 방법.
  52. (a) 제1 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 제1 올리고뉴클레오티드는 5'-트리포스페이트 기를 포함하는 것이 단계;
    (b) 제2 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    (c) 폴리(U) 폴리머라제를 제공하는 단계;
    (d) 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 제1 올리고뉴클레오티드를 라이게이션하는데 충분한 조건하에 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 및 폴리(U) 폴리머라제를 조합하는 단계를 포함하는,
    RNA 올리고뉴클레오티드의 합성 방법.
  53. 제25항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(U) 폴리머라제가 야생형 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제, 또는 그의 돌연변이체인 방법.
  54. 제25항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(U) 폴리머라제가 야생형 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제인 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (f) 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드 상에서 역전사 프라이밍 부위, 프라이머, 및 역전사 효소를 사용하여 역전사를 수행하여, 상보성 단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 cDNA를 생성하는 단계.
  56. 제55항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (g) 단계 (f)에서 생성된 상보성 단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 cDNA를 DNA 폴리머라제에 의해 증폭시켜, 이중-가닥 DNA를 생성하는 단계.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)를 크라우딩제의 존재하에 수행하는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 크라우딩제가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)를 1종 이상의 추가의 효소의 존재하에 수행하는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 단계 (c)를 추가의 폴리(N) 폴리머라제의 존재하에 수행하는 것인 방법.
  61. 제59항에 있어서, 단계 (c)를 효모 무기 피로포스파타제 (PPI-ase)의 존재하에 수행하는 것인 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)를 RNase 억제제의 존재하에 수행하는 것인 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)를 비-가수분해성 뉴클레오티드의 존재하에 수행하는 것인 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 개시자 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 공유 연결되는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 개시자 올리고뉴클레오티드가 절단가능한 링커를 통해 고체 지지체에 공유 연결되는 것인 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 개시자 올리고뉴클레오티드가 5-20개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 개시자 올리고뉴클레오티드가 폴리-rU, 폴리-rC, 폴리-rG, 또는 폴리-rA인 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 개시자 올리고뉴클레오티드가 생체접합을 위한 형광단 또는 핸들을 포함하는 것인 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 개시자 올리고뉴클레오티드가 역전사를 위한 프라이머 부위 또는 PCR을 위한 프라이머를 포함하는 것인 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 개시자 올리고뉴클레오티드가 5' 캡을 포함하는 것인 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  72. 제8항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(U) 폴리머라제가 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336R 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, H336R 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  76. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 N171 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 N171A 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, N171A 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  79. 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336 및 N171 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336R 및 N171A 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, H336R 및 N171A 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  82. 제79항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336R 및 N171T 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  83. 제80항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, H336R 및 N171T 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  84. 제72항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  86. 제72항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336 및 T172 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  87. 제86항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  89. 제72항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336, N171, 및 T172 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  90. 제85항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 N171 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  91. 제79항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 실질적으로 동일하고, H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 N171 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  92. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 RNA 올리고뉴클레오티드.
  93. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 염:
    Figure pct00026

    상기 식에서:
    Y는 O 또는 S이고;
    X는 O 또는 S이고;
    각각의 경우의 RP는 수소, 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이거나, 또는 2개의 RP는 개재 원자와 함께 결합되어 임의적으로 치환된 헤테로시클릴을 형성하며; 단, 적어도 1개의 RP는 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이고;
    "염기"는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 염기이다.
  94. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 염:
    Figure pct00027

    상기 식에서:
    Y는 O 또는 S이고;
    X는 O 또는 S이고;
    RP는 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이고;
    R은 수소, 할로겐, -CN, -NO2, -N3, 임의적으로 치환된 알킬, 임의적으로 치환된 알케닐, 임의적으로 치환된 알키닐, 임의적으로 치환된 아릴, 임의적으로 치환된 헤테로아릴, 임의적으로 치환된 카르보시클릴, 임의적으로 치환된 헤테로시클릴, 임의적으로 치환된 아실, 임의적으로 치환된 히드록실, 임의적으로 치환된 아미노, 또는 임의적으로 치환된 티올이고;
    "염기"는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 염기이다.
  95. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 염:
    Figure pct00028

    상기 식에서:
    Y는 O 또는 S이고;
    X는 O 또는 S이고;
    RP는 산소 보호기, 임의적으로 치환된 아실, 또는 아미노산이고;
    "염기"는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 염기이다.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에서, RP가 산소 보호기인 화합물.
  97. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에서, RP가 아미노산인 화합물.
  98. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에서, RP가 알릴, 아지도메틸, 알릴 카르보네이트, 또는 아지도메틸 카르보네이트인 화합물.
  99. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에서, 화합물이 3'-O-알릴-NTP, 3'-O-아지도메틸-NTP, 3'-O-알릴 카르보네이트-NTP, 3'-O-알릴 카르보네이트-dNTP, 3'-O-아지도메틸 카르보네이트-NTP, 또는 3'-O-아지도메틸 카르보네이트-dNTP인 화합물.
  100. 제93항에 있어서, 화합물이 2'-O-알릴-NTP 또는 2'-O-아지도-메틸-NTP인 화합물.
  101. 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에서, 화합물이 도 28-34에 도시된 화학식 중 어느 하나인 화합물.
  102. H336, N171, 및 T172로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제인 폴리머라제.
  103. 제102항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  104. 제103항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336R 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  105. 제104항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, H336R 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  106. 제102항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 N171 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  107. 제106항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 N171A 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  108. 제107항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, N171A 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  109. 제102항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336 및 N171 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  110. 제109항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336R 및 N171A 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  111. 제110항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, H336R 및 N171A 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  112. 제109항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336R 및 N171T 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  113. 제112항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, H336R 및 N171T 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  114. 제102항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  115. 제114항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  116. 제102항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336 및 T172 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  117. 제116항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  118. 제117항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  119. 제102항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336, N171, 및 T172 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  120. 제119항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 N171 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  121. 제120항에 있어서, 돌연변이된 스키조사카로마이세스 폼베 폴리(U) 폴리머라제가 서열식별번호:3과 동일하지만, H336A, H336C, H336D, H336E, H336F, H336G, H336I, H336K, H336L, H336M, H336T, H336V, H336W, H336Y, H336N, H336P, H336Q, H336R, H336S, 및 H336W로 이루어진 군으로부터 선택된 H336 돌연변이; N171E, N171L, N171Q, N171S, N171M, N171D, N171G, N171C, N171A, N171W, N171T, N171I, N171V, N171P, N171R, N171H, 및 N171K로 이루어진 군으로부터 선택된 N171 돌연변이; 및 T172E, T172L, T172Q, T172S, T172M, T172D, T172G, T172C, T172A, T172W, T172T, T172I, T172V, T172P, T172R, T172H, 및 T172K로 이루어진 군으로부터 선택된 T172 돌연변이를 포함하는 것인 폴리머라제.
  122. 제93항 내지 제101항 중 어느 한 항의 화합물 및/또는 제102항 내지 제122항 중 어느 한 항의 폴리머라제를 포함하는 키트.
KR1020217014145A 2018-10-12 2019-10-11 효소적 rna 합성 KR20210091153A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862745136P 2018-10-12 2018-10-12
US62/745,136 2018-10-12
PCT/US2019/055870 WO2020077227A2 (en) 2018-10-12 2019-10-11 Enzymatic rna synthesis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210091153A true KR20210091153A (ko) 2021-07-21

Family

ID=69232884

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217014145A KR20210091153A (ko) 2018-10-12 2019-10-11 효소적 rna 합성

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220145295A1 (ko)
EP (1) EP3864151A2 (ko)
JP (1) JP2022504712A (ko)
KR (1) KR20210091153A (ko)
CN (1) CN113195720A (ko)
WO (1) WO2020077227A2 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210125496A (ko) * 2019-02-12 2021-10-18 디엔에이 스크립트 폴리뉴클레오티드의 주형-유리 효소 합성에서 효율적 생성물 절단
US20220403434A1 (en) * 2019-07-30 2022-12-22 Dna Script Sas Template-Free Enzymatic Synthesis of Polynucleotides Using Poly(A) and Poly(U) Polymerases
EP4182472A1 (en) 2020-07-15 2023-05-24 DNA Script Massively parallel enzymatic synthesis of polynucleotides
EP4334330A1 (en) 2021-05-07 2024-03-13 Helix Nanotechnologies, Inc. Modified ribonucleic acids and uses thereof
CN116732020A (zh) * 2022-03-02 2023-09-12 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 提高rna分子的胞内翻译效率和/或稳定性的方法
WO2023183569A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Molecular Assemblies, Inc. Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2290071B1 (en) * 2004-05-28 2014-12-31 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
US20130053252A1 (en) * 2009-09-25 2013-02-28 President & Fellows Of Harvard College Nucleic acid amplification and sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides
EP2551354A1 (en) * 2011-07-25 2013-01-30 Universität Heidelberg Functionalization of RNA oligonucleotides
US10683536B2 (en) * 2013-04-02 2020-06-16 Molecular Assemblies, Inc. Reusable initiators for synthesizing nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020077227A3 (en) 2020-08-27
JP2022504712A (ja) 2022-01-13
WO2020077227A2 (en) 2020-04-16
US20220145295A1 (en) 2022-05-12
CN113195720A (zh) 2021-07-30
EP3864151A2 (en) 2021-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210091153A (ko) 효소적 rna 합성
AU2020256391B2 (en) A method for the site-specific enzymatic labelling of nucleic acids in vitro by incorporation of unnatural nucleotides
Chelliserrykattil et al. Evolution of a T7 RNA polymerase variant that transcribes 2′-O-methyl RNA
Fauster et al. 2′-Azido RNA, a versatile tool for chemical biology: synthesis, X-ray structure, siRNA applications, click labeling
CN106661621A (zh) 用于增强rna产生的方法和工具
CA2908690A1 (en) Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids
JP6448097B2 (ja) 核酸を合成するための方法および装置
JP2022538784A (ja) 半合成生物における複製、転写および翻訳のための試薬ならびに方法
US20200031861A1 (en) Biconjugatable labels and methods of use
Okauchi et al. Continuous cell-free replication and evolution of artificial genomic DNA in a compartmentalized gene expression system
Shivalingam et al. Synthesis of chemically modified DNA
Nelissen et al. Stable isotope labeling methods for DNA
Srivatsan et al. Using an emissive uridine analogue for assembling fluorescent HIV-1 TAR constructs
Nainytė et al. Synthesis of an acp 3 U phosphoramidite and incorporation of the hypermodified base into RNA
JP2022547918A (ja) 光開裂性結合を用いる鋳型なし酵素的ポリヌクレオチド合成
WO2014078652A1 (en) Heavy atom labeled nucleosides, nucleotides, and nucleic acid polymers, and uses thereof
Dantsu et al. Derivatization of Mirror‐Image l‐Nucleic Acids with 2′‐OMe Modification for Thermal and Structural Stabilization
Sammons et al. Efficient synthesis of the 2-aminoimidazolium-bridged diguanosyl intermediate for nonenzymatic primer extension
Wu Synthetic Nucleic Acid Capable of Post-Polymerization Functionalization and Evolution
Chakrapani Bioorthogonal reactions on DNA for regulation of transcription
JP2023533484A (ja) 蛍光シトシンアナログならびに転写および翻訳へのその適用
EP4225922A1 (en) Process for selection of aptamers, riboswitches and desoxyriboswitches
Ren Enzymatic synthesis of chemically modified DNA for analytical and diagnostic applications
Lam Increasing the chemical functionality of DNA enzymes
Peewasan Postsynthetic fluorescent labeling of COMBO-and 1, 2, 4-Triazine-modified DNA as bioorthogonal tools for live cell imaging