JP6448097B2 - 核酸を合成するための方法および装置 - Google Patents
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Description
遺伝子工学は、遺伝物質の内容物を決定するためのツール、ならびに所望の遺伝物質を構築するためのツールを要する。上記遺伝物質の内容物を決定するためのツールは、約1日で、$1,000未満で全ヒトゲノムを配列決定することを可能にした(Life Technologies, Press Release: Benchtop Ion ProtonTM Sequencer, January 10, 2012を参照のこと)。対照的に、所望の遺伝物質を構築するためのツール(例えば、デノボDNA合成)は、同じ速度では改善されてこなかった。評価基準としては、過去25年間にわたって、デノボ低分子核酸合成のコスト(1塩基あたり)は、1/10に低下したが、核酸配列決定のコスト(1塩基あたり)は、1/10,000,000超に低下した。DNA合成における進歩のなさは、いまや、トランスレーショナルゲノミクス(すなわち、これによって、個々の配列バリエーションの役割が決定され、治療処置を開発するために使用される)の速度を制限している。
本発明は、核酸合成のための改善された方法を提供する。本発明の方法は、ポリヌクレオチドのより迅速でかつより長いデノボ合成を提供する。よって、本発明は、カスタム核酸合成のコスト全体を劇的に低下させる。本発明の方法は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用して、未改変3’ヒドロキシルおよび切断可能な末端基を有するヌクレオチドアナログを組み込むことによる、ポリヌクレオチドのテンプレート非依存的合成に関する。上記末端基が原因で、合成は、新たな塩基の各々が付加されると一時停止し、すると末端基が切断され、天然に存在するヌクレオチドに本質的に同一であるポリヌクレオチド(すなわち、さらなるヌクレオチド組み込みのための基質として酵素によって認識される)を残す。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、該方法は、
固体支持体に結合した核酸を、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の存在下でかつ核酸テンプレートの非存在下で、ヌクレオチドアナログに曝す工程、
を包含し、ここで該ヌクレオチドアナログは、非改変3’ヒドロキシルとヌクレオチジルトランスフェラーゼをブロックするが、切断の際にヌクレオチジルトランスフェラーゼのヌクレオチド基質を生じさせる切断可能な末端基とを含む、方法。
(項目2)
前記ヌクレオチドアナログは、リボース糖もしくはデオキシリボース糖を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記ヌクレオチド基質は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される塩基を含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、配列番号1、配列番号3、もしくは配列番号5と少なくとも約90%同一であるタンパク質配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼは生物に由来し、配列番号2、配列番号4、もしくは配列番号6と少なくとも約90%同一であるヌクレオチド配列を有する、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記切断可能な末端基は、第2のヌクレオチドアナログの組み込みを阻害する、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記切断可能な末端基は、荷電した部分を含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記価電した部分は、負に荷電している、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記切断可能な末端基は、アミノ酸を含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造:
を有し、ここでn=2もしくは3であり、−X−は、−O−、−S−、−NH−、もしくは−CH 2 −である、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造:
を有し、ここでn=2もしくは3であり、−X−は、−O−、−S−、−NH−、もしくは−CH2−である、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造:
を有する、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記ヌクレオチドアナログは、以下の構造:
を有する、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記切断可能な末端基は、化学的に切断可能であるか、光分解的に切断可能であるか、電気化学的に切断可能であるか、もしくは生物学的に切断可能である、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記固体支持体に結合した核酸は、約6.5〜8.5の間のpHを有する水性溶液の存在下で、前記ヌクレオチドアナログに曝される、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記固体支持体に結合した核酸は、水性溶液の存在下で約35〜39℃の間の温度で、前記ヌクレオチドアナログに曝される、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記固体支持体は、ビーズ、ウェル、もしくはペグである、項目1に記載の方法。
(項目18)
前記核酸は、1本鎖である、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記切断可能な末端基は、前記ヌクレオチドアナログから切断された場合に、環式副生成物を形成する部分を含む、項目1に記載の方法。
(項目20)
天然のヌクレオチドを生成するために、前記切断可能な末端基を切断する工程;および
該天然のヌクレオチドを、トランスフェラーゼ酵素の存在下でかつ核酸テンプレートの非存在下で第2のヌクレオチドアナログに曝す工程であって、ここで該第2のヌクレオチドアナログは、糖環および切断可能な末端基上に3’ヒドロキシルを含む、工程、
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目21)
前記ヌクレオチドアナログおよび前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を含む水性溶液を提供する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目22)
オリゴヌクレオチドを合成するためのシステムであって、該システムは、
核酸が結合している固体支持体;
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素;
第1のヌクレオチドであって、遊離3’ヒドロキシルと切断可能なリンカーによって該ヌクレオチドに結合したブロッキング基とを含む、第1のヌクレオチド、
を含み、
ここで第2のヌクレオチドは、該ブロッキング基が該切断可能なリンカーによって除去されるまで、該ヌクレオチジルトランスフェラーゼによって該第1のヌクレオチドの3’位を介して該第1のヌクレオチドに連結することができず、
ここで該システムは、核酸テンプレートを含まない、システム。
(項目23)
前記第1のヌクレオチドおよび第2のヌクレオチドは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される塩基を独立して含む、項目22に記載のシステム。
(項目24)
オリゴヌクレオチド合成のための方法であって、該方法は、
核酸テンプレートの非存在下で複数の結合した核酸を含む固体支持体を提供する工程;
該基質を、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ならびに遊離3’ヒドロキシル基および切断可能なリンカーを介して結合しているブロッキング基を有するヌクレオチドアナログに、ただ1個のヌクレオチドアナログが該複数のうちの少なくとも1個のメンバーに付加されるような条件下で曝す工程;
該切断可能なリンカーを切断する工程;ならびに
該曝す工程を反復する工程、
を包含する方法。
(項目25)
前記条件は、約6.5〜8.5の間のpHを有する水性溶液を含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記水性溶液は、約35〜39℃の間の温度にある、項目25に記載の方法。
(項目27)
遊離3’ヒドロキシル基および切断可能なリンカーを介して結合しているブロッキング基を含む前記ヌクレオチドアナログは、溶液として提供される、項目25に記載の方法。
(項目28)
前記溶液を前記基質から除去する工程をさらに包含する、項目27に記載の方法。
(項目29)
オリゴヌクレオチド合成のための方法であって、該方法は、核酸テンプレートを含まない支持体に結合した核酸を、以下:
ヌクレオチドアナログであって、切断可能なリンカーによって該ヌクレオチドアナログに結合した部分を含み、遊離3’ヒドロキシルを有する、ヌクレオチドアナログ、および
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、
に曝す工程、
それによって、該ヌクレオチドアナログを、該固体支持体に結合した核酸に組み込む工程;
該ヌクレオチドアナログを組み込んだ際に該固体支持体を洗浄して、組み込まれていないヌクレオチドアナログを除去する工程;
該切断可能なリンカーを切断する工程;ならびに
該曝す工程、洗浄する工程、および切断する工程を、オリゴヌクレオチドを合成するために反復する工程、
を包含する方法。
(項目30)
前記ヌクレオチドアナログは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される塩基を含む、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記ヌクレオチドアナログおよび前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、同じ溶液中に存在し、該溶液は、前記曝す工程、洗浄する工程、および切断する工程をその後に反復する工程の間に、実質的に再利用される、項目29に記載の方法。
(項目32)
水性環境において所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成するための装置であって、該装置は、
固体支持体と流体連絡状態にある、ヌクレオチドトリホスフェート(NTP)試薬溶液および酵素溶液の第1の、第2の、第3のおよび第4の供給源であって、ここで該第1の、第2の、第3のおよび第4の供給源の中の該試薬溶液は、NTP−アデニン、NTP−グアニン、NTP−シトシン、NTP−チミン、および上記のうちのいずれかの改変物から選択される、第1の、第2の、第3のおよび第4の供給源、を備える装置。
(項目33)
前記ヌクレオチドトリホスフェートのうちの少なくとも一部は、改変されていない3’ヒドロキシルおよび切断の際に天然のヌクレオチドを生じさせる切断可能な末端基を含む、項目32に記載の装置。
(項目34)
前記ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドである、項目32に記載の装置。
(項目35)
前記固体支持体と流体連絡状態にある洗浄リザーバーをさらに備える、項目32に記載の装置。
(項目36)
前記固体支持体と流体連絡状態にある水性脱ブロック化薬剤の供給源をさらに備える、項目32に記載の装置。
(項目37)
前記ヌクレオチドトリホスフェート試薬は、前記固体支持体へと流される、項目32に記載の装置。
(項目38)
前記試薬溶液はまた、前記固体支持体から流し出される、項目37に記載の装置。
(項目39)
前記試薬溶液は、前記固体支持体から流し出された後に、実質的に再使用される、項目38に記載の装置。
(項目40)
前記固体支持体は、ヌクレオチドトリホスフェート試薬溶液/酵素溶液の供給源へと移動させられる、項目32に記載の装置。
(項目41)
前記固体支持体を移動するように構成された、プログラム可能なマニピュレーターをさらに備える、項目40に記載の装置。
(項目42)
ヌクレオチドトリホスフェート試薬/酵素の供給源を保持するためのウェルをさらに備える、項目32に記載の装置。
本発明は、酵素および核酸アナログを使用して、ポリヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)を合成するための改善された方法を提供する。開示される方法を使用すると、ポリヌクレオチドの特定の配列が、1塩基ずつ水性環境において、核酸テンプレートを使用せずにデノボ合成され得る。さらに、上記ヌクレオチドアナログは、非改変3’ヒドロキシル(すなわち、「天然の」デオキシリボースおよびリボース分子において見出されるとおり)を有するので、上記アナログは、切断可能なブロッキング基が上記塩基から除去される場合、「天然の」ヌクレオチドを生じる。他のヌクレオチドアナログもまた使用され得る(例えば、自己削除リンカー(self−eliminating linker)、または改変されたホスフェート基を有するヌクレオチドが挙げられる)。大部分の場合、上記ブロッキング基は、実質的なさらなる分子を後に残さないように設計される、すなわち、上記酵素によって「天然の」ヌクレオチドとして認識される「傷なしの(scarless)」ヌクレオチドを後に残すように設計される。従って、上記合成の結果として、その最後のブロッキング基を除去すると、その合成されたポリヌクレオチドは、同じ配列を有する天然に存在するポリヌクレオチドと化学的にかつ構造的に等価である。上記合成ポリヌクレオチドは、従って、その合成されたポリヌクレオチドが生化学的経路もしくは代謝を妨害するという懸念なく、生体系に組み込まれ得る。
NTP−リンカー−インヒビター
ここでNTPは、ヌクレオチドトリホスフェート(すなわち、dNTPもしくはrNTP)であり、上記リンカーは、塩基のピリジンもしくはピリミジンの間の切断可能なリンカーであり、上記インヒビターは、上記酵素がその後のヌクレオチドを組み込むのを防止する基である。各工程において、新たなヌクレオチドアナログは、その成長しつつあるポリヌクレオチド鎖へと組み込まれ、すると、上記酵素は、上記インヒビター基によって、さらなるヌクレオチドが付加されることからブロックされる。上記酵素がいったん停止すると、過剰なヌクレオチドアナログが、上記成長しつつある鎖から除去され得、上記インヒビターは、上記NTPから切断され得、新たなヌクレオチドアナログが、次のヌクレオチドを上記鎖に付加するために導入され得る。上記工程を連続して反復することによって、所望の長さおよび配列のヌクレオチド配列を迅速に構築することが可能である。ポリヌクレオチド合成のためにヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用することの利点としては、以下が挙げられる:1)テンプレート非依存的重合において1本鎖(ss)開始プライマーを使用する3’−伸長活性、2)数千ものヌクレオチドの付加を生じさせることができる、高効率の様式でプライマーを伸長する能力、および3)有効な基質として広く種々の改変NTPおよび置換NTPの受容。さらに、本発明は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの基質であるイニシエーター配列を利用し得る。上記イニシエーターは、固体支持体に結合し、上記酵素の結合部位として働く。上記イニシエーターは、好ましくは、上記酵素のユニバーサルイニシエーター(例えば、ホモポリマー配列)であり、固体支持体上で再利用可能であり、形成されるオリゴヌクレオチドは、上記イニシエーターから切断可能である。
本発明は、水性環境においてポリヌクレオチドを合成するために、式、NTP−リンカー−インヒビターを有するヌクレオチドアナログを提供する。形態、NTP−リンカー−インヒビターというアナログに関して、NTPは、任意のヌクレオチドトリホスフェートであり得る:例えば、アデノシントリホスフェート(ATP)、グアノシントリホスフェート(GTP)、シチジントリホスフェート(CTP)、チミジントリホスフェート(TTP)、ウリジントリホスフェート(UTP)、ヌクレオチドトリホスフェート、デオキシアデノシントリホスフェート(dATP)、デオキシグアノシントリホスフェート(dGTP)、デオキシシチジントリホスフェート(dCTP)、デオキシチミジントリホスフェート(dTTP)、もしくはデオキシウリジントリホスフェート(dUTP)。
本発明の方法は、ヌクレオチドアナログをポリヌクレオチドへと構築するために、ヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用する。ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、関連トランスフェラーゼおよびポリメラーゼ酵素のいくつかのファミリーを含む。いくつかのヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リボヌクレオチドよりもデオキシリボヌクレオチドを効率的に重合し、いくつかのヌクレオチジルトランスフェラーゼは、デオキシリボヌクレオチドよりもリボヌクレオチドを効率的に重合し、いくつかのヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドをほぼ同じ速度で重合する。
本発明の方法は、種々の反応条件下で実施され得るが、所望のポリヌクレオチドの秩序だった構築および回収は、ほとんどの場合、上記ポリヌクレオチドが成長し得る固体支持体を要する。いくつかの実施形態において、上記方法は、図7に図示されるように、固体支持体上でのポリヌクレオチドの酵素媒介性合成を含む。上記で考察される切断可能なターミネーターヌクレオチドトリホスフェート(NTP)アナログとともに使用される場合、例えば、TdTもしくはポリ(A)ポリメラーゼを水性環境で使用することによって、DNAおよびRNAの特定のポリヌクレオチド配列を構築することが可能である。図13に示されるように、上記TdTを使用して、ポリヌクレオチド配列を段階的様式で伸長することによって、カスタムポリヌクレオチドの段階的な構築をもたらし得る。先で考察されるように、各NTPアナログの上記インヒビター基は、ヌクレオチドの付加により、上記酵素を停止させる。各ヌクレオチド伸長工程の後に、その反応物は、上記リンカーを切断することによって上記インヒビターを除去する前に、上記固体支持体から洗い流され、次いで、新たな反応物が添加され、サイクルが改めて開始させる。伸長−除去−脱ブロック−洗浄のn回のサイクルの結果として、最終の全長1本鎖ポリヌクレオチドが完成し、上記固体支持体から切断され得、DNA配列決定もしくはPCRのような適用においてその後使用するために回収され得る。あるいは、最終の全長1本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション分析、タンパク質もしくはDNAアフィニティー捕捉のような適用におけるその後の使用のために、上記固体支持体に結合したままであり得る。他の実施形態において、部分的に2本鎖のDNAは、イニシエーターとして使用され得、2本鎖ポリヌクレオチドの合成を生じさせる。
開示される方法の効率を利用するために、水相DNA合成機が、実質的な量で所望のポリヌクレオチドを生成するように構築され得る。一実施形態において、合成機は、ポリヌクレオチド成長をもたらすために十分な濃度で、記載されるNTPアナログ試薬、すなわち、dCTP、dATP、dGTP、およびdTTPの4つのウェル、ならびにTdTを含む。複数の開始配列が、例えば、実験ロボットを使用して、上記4つのウェルの各々に反復して浸漬されるように設計される固体支持体に結合し得る。上記ロボットは、ヌクレオチド付加の間に上記固体支持体を洗浄緩衝液中ですすぎ、上記支持体を脱ブロック化薬剤に曝すことによって上記連結基を切断し、そして上記固体支持体を2回洗浄して、その後、上記固体支持体を次の所望のヌクレオチドのウェルに移動させるようにさらにプログラムされ得る。単純なプログラミングにより、ほんの数時間で、かつ有害廃棄物を実質的に減少させて、所望のヌクレオチド配列の有用な量を作ることが可能である。注意深く制御された条件下で進行中の合成は、数千もの塩基対の長さを有するポリヌクレオチドの合成を可能にする。完了すると、その伸長生成物は、上記固体支持体から放出され、すると、それらは、最終的なヌクレオチド配列として使用され得る。
他の文書(例えば、特許、特許出願、特許公報、科学雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ)への参照および引用は、本開示全体を通じてなされた。全てのこのような文書は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書に参照により援用される。
本明細書で示されかつ記載されるものに加えて、本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書で引用される科学文献および特許文献への参照を含め、この文書の全内容から当業者にとって明らかになる。本明細書中の主題は、本発明の実施に対して、その種々の実施形態およびその均等物において適合され得る重要な情報、例示およびガイダンスを含む。
Claims (22)
- オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、該方法は、
固体支持体に結合した核酸を、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素の存在下でかつ核酸テンプレートの非存在下で、ヌクレオチドアナログに曝す工程、
を包含し、ここで該ヌクレオチドアナログは、非改変3’ヒドロキシル基とアミノ酸を含む切断可能な末端基とを含み、該切断可能な末端基が、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性をブロックするが、切断の際にヌクレオチジルトランスフェラーゼのヌクレオチド基質を生じさせる、方法。 - 前記ヌクレオチドアナログは、リボース糖もしくはデオキシリボース糖を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド基質は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される塩基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、配列番号1、配列番号3、もしくは配列番号5と少なくとも90%同一であるタンパク質配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼは生物に由来し、配列番号2、配列番号4、もしくは配列番号6と少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記切断可能な末端基は、第2のヌクレオチドアナログの組み込みを阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記切断可能な末端基は、荷電した部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記価電した部分は、負に荷電している、請求項7に記載の方法。
- 前記切断可能な末端基は、化学的に切断可能であるか、光分解的に切断可能であるか、電気化学的に切断可能であるか、もしくは生物学的に切断可能である、請求項1に記載の方法。
- 前記固体支持体に結合した核酸は、6.5〜8.5の間のpHを有する水性溶液の存在下で、前記ヌクレオチドアナログに曝される、請求項1に記載の方法。
- 前記固体支持体に結合した核酸は、水性溶液の存在下で35〜39℃の間の温度で、前記ヌクレオチドアナログに曝される、請求項1に記載の方法。
- 前記固体支持体は、ビーズ、ウェル、もしくはペグである、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸は、1本鎖である、請求項1に記載の方法。
- 前記切断可能な末端基は、前記ヌクレオチドアナログから切断された場合に、環式副生成物を形成する部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 天然のヌクレオチドを生成するために、前記切断可能な末端基を切断する工程;および
該天然のヌクレオチドを、トランスフェラーゼ酵素の存在下でかつ核酸テンプレートの非存在下で第2のヌクレオチドアナログに曝す工程であって、ここで該第2のヌクレオチドアナログは、糖環および切断可能な末端基上に3’ヒドロキシル基を含む、工程、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記ヌクレオチドアナログおよび前記ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を含む水性溶液を提供する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドを合成するためのシステムであって、該システムは、
核酸が結合している固体支持体;
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素;
第1のヌクレオチドであって、遊離3’ヒドロキシル基と切断可能なリンカーによって該ヌクレオチドに結合した、アミノ酸を含むブロッキング基とを含む、第1のヌクレオチド、
を含み、
ここで第2のヌクレオチドは、該ブロッキング基が該切断可能なリンカーによって除去されるまで、該ヌクレオチジルトランスフェラーゼによって該第1のヌクレオチドの3’位を介して該第1のヌクレオチドに連結することができず、
ここで該システムは、核酸テンプレートを含まない、システム。 - 前記第1のヌクレオチドおよび第2のヌクレオチドは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される塩基を独立して含む、請求項21に記載のシステム。
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