CN109402202A - 核酸合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸合成领域。具体地，本发明涉及使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有起始核酸分子的固体支持物依次浸泡在含有反应试剂、终止试剂、切除试剂、洗涤试剂的不同的反应容器中以实现核酸合成。

Description

核酸合成方法

技术领域

本发明涉及核酸合成领域。具体地，本发明涉及使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有起始核酸分子的固体支持物依次浸泡在不同的反应容器中以实现核酸合成。

背景技术

随着基因组研究的深入，从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。近来，核酸合成技术越来越受到人们的重视。目前，基本上所有的人工合成DNA都是使用30多年前开创的核苷亚磷酰胺方法生产。经过数十年的液体处理的微调和改进之后，实践中亚磷酰胺基寡核苷酸合成的上限现在约为200-300nt。在此基础上，各大商业公司开发了各自不同的技术，并推出了一些商业化的机器。这些合成仪大体可以分为两种：柱式合成仪和微阵列合成仪。柱式合成仪以Dr.oligo 192和mermade为代表,通过电磁阀控制试剂的添加，在尺寸为厘米级别的多孔反应柱上进行固相合成反应。该方法错误率较低，但是合成通量不高而且所需物料也较多。微阵列合成仪以CustomArray合成仪为代表，是将合成反应缩小到微米级别的反应孔内，一张芯片上有上万个反应孔，这样虽然提高了合成通量也一定程度上减少了原料的消耗，然而产量低，电化学反应不易控制，且错误率较高。另外，从进样方式上看，柱式和微阵列核酸合成仪均为将合成试剂通过预先铺设的管线加到合成柱或者合成芯片上，且加入的试剂大大过量，这就造成了试剂的极大浪费和低物料使用率。

近期，科学家们描述了使用模板非依赖性聚合酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的寡核苷酸合成策略(见WO2017223517A1)，其方法为：每个TdT分子与单个可掺入起始核酸分子的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)分子偶联形成TdT-dNTP conjugates，TdT分子与dNTP通过一个可切割的基团连接。在延伸过程中，起始核酸分子的3'末端保持与TdT-dNTP共价结合并且不能与其他TdT-dNTP分子接触。在去保护过程中，用切除试剂切割TdT和掺入的核苷酸之间的连接子，从而释放合成的核酸分子并允许继续进行随后的延伸。

在现有的固相核酸合成方法中，是将合成试剂通过预设的合成柱、合成芯片或者合成磁珠上，需要加入过量的试剂，反应不完全，会造成试剂的极大浪费。因此，本领域迫切需要新的高通量的、低成本的核酸合成方法。

发明内容

针对现有核酸合成方法存在的问题，本发明提供了使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有起始核酸分子的固体支持物依次浸泡在含有不同试剂的反应容器中以实现核酸合成。本发明通过生化试剂重复利用、大幅度提高了通量，从而降低了核酸合成的成本。

如本文所用的术语“浸泡式反应方案”意指在核酸合成的过程中，固定有起始核酸分子的固体支持物移动至与反应试剂接触，而非使用流动通道使反应试剂移动至与固定在固相载体上的核酸接触。所述浸泡式反应方案至少具有以下优势：1.生化试剂重复利用；2.扩展性好，使用灵活，能够大幅提高通量；3.不需要复杂的温度和流体控制系统，反应较均匀；4.显著降低核酸合成成本。

在本文所述的方法中，核酸合成可以利用多种固体支持物(即固相载体)实现，其实例包括但不限于芯片、磁珠、柱。在一些实施方案中，核酸合成的过程可以是自动化过程。应当理解，任何已知的固相核酸合成过程都可以结合到本文所述的浸泡式反应方案中。

在一个实施方案中，本发明提供了使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，包括以下步骤：

a.提供其上固定有起始核酸分子的固体支持物，

b.将所述固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dNTP的第一反应容器中，使所述起始核酸分子与TdT-dNTP充分反应，生成第一延伸产物；

c.将固体支持物浸泡在置于第二反应容器中的终止试剂中，以终止反应；

d.将固体支持物浸泡在置于第三反应容器中的切除试剂中，或将固体支持物暴露于光，以从第一延伸产物上切除TdT；

e.将固体支持物浸泡在置于第四反应容器中的洗涤试剂中进行洗涤、纯化得到延伸后的核酸分子；

f.任选地，重复步骤b至e。

在另一个实施方案中，本发明提供了使用浸泡式反应方案同时进行多个核酸分子合成的方法，包括以下步骤：

a.提供其上固定有起始核酸分子的多个固体支持物，

b.将所述多个固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dNTP的第一反应容器中，使所述起始核酸分子与TdT-dNTP充分反应，生成第一延伸产物；

c.将所述多个固体支持物浸泡在置于第二反应容器中的终止试剂中，以终止反应；

d.将所述多个固体支持物浸泡在置于第三反应容器中的切除试剂中，或将所述多个固体支持物暴露于光，以从第一延伸产物上切除TdT；

e.将所述多个固体支持物浸泡在置于第四反应容器中的洗涤试剂中进行洗涤、纯化得到延伸后的核酸分子；

f.任选地，重复步骤b至e。

如本文所使用的，“含有反应试剂TdT-dNTP的第一反应容器”意指含有反应试剂TdT-dATP、TdT-dTTP、TdT-dCTP、TdT-dGTP、TdT-dUTP中的任一种的第一反应容器。即，在合成DNA/RNA分子的过程中，需至少准备4种含有反应试剂TdT-dNTP的反应容器。根据意欲合成的核酸分子的序列，在步骤b中将所述固体支持物浸泡在含有相应反应试剂TdT-dNTP的反应容器中。例如，意欲合成的核酸分子的第一个核苷酸是A，则在步骤b中将所述固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dATP的反应容器中；意欲合成的核酸分子的第二个核苷酸是T，则在第二次进行步骤b时将所述固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dTTP的反应容器中，以此类推。

在一个实施方案中，步骤b至e可重复一次或多次，例如重复1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多次。

在某些实施方案中，洗涤通过将固体支持物浸泡在包含洗涤溶液的反应容器中进行。

如本文所用，所述“浸泡”包括使得固体支持物上固定的核酸分子与反应容器中的试剂或溶液接触的任何方式。固体支持物可以例如以垂直、倾斜或水平的方式部分或全部浸泡在反应容器中，条件是固体支持物上固定的所有核酸分子与反应容器中的试剂充分接触。

如本文所用的“起始核酸分子”是指用于核酸固相合成的起始分子。如本领域技术人员理解，核酸固相合成需要至少3-5个碱基的起始核酸分子(或称为“起始底物”，“起始引物”)来启动合成。然后可以将该初始分子逐个核苷酸延伸，生成所需核酸产物。在一些实施方案中，起始核酸分子可以是使用亚磷酰胺方法合成的寡核苷酸引物。在一些情况下，起始核酸分子的特定序列可用于合成的核酸的下游应用。在一些实施方案中，可以在合成完成后从合成的核酸中除去起始核酸分子的序列，特别是如果起始核酸分子在其3'末端附近包含可切割的连接。例如，如果起始核酸分子是具有3'末端脱氧尿苷的引物，则通过将延伸后的引物暴露于USER Enzyme(即尿嘧啶DNA糖基化酶和内切核酸酶VIII的混合物)可将合成的序列从起始引物切割下来。可以使用其他可切割的连接，例如，引物中的桥接硫代磷酸酯，可用银或汞离子切割。

本申请中使用的术语“核酸”可以是任何类型的核酸，例如核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物，其可以与“多核苷酸”互换使用。核酸可以是单链的、双链的或含有单链和双链序列两者。核酸分子可以来源于双链DNA(dsDNA)形式(例如，基因组DNA、PCR和扩增产物等)，或者可以来源于如DNA(ssDNA)或RNA的单链形式并且其可以转化为dsDNA形式，并且反之亦然。在一些实施方案中，核酸可以是单分子的形式(可以是天然分子、修饰分子如标记的分子，或包括核苷酸类似物的核酸)、序列的多联体(例如DNA纳米球)，等等)，可以扩增(例如扩增为多联体、扩增为多个具有相同或相似序列的个体分子，等等)，和/或可以为任何其它形式。核酸分子的准确序列可以是已知的或未知的。以下是核酸的示例性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、基因组DNA、基因组DNA片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、核酸文库、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、任何上述序列的核酸探针、引物或扩增拷贝。

核酸可以包括核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸通常含有糖、核碱基和至少一个磷酸基。核苷酸可以是无碱基的(即，缺少核碱基)。核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、修饰磷酸盐糖主链核苷酸及其混合物。核苷酸的实例包括(例如)腺苷一磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、胸苷一磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、胞苷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷一磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、脱氧腺苷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸腺嘧啶核苷一磷酸(dTMP)、脱氧胸腺嘧啶核苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、去氧胞二磷(dCDP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷一磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)和脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。还可以在本文所述的方法中使用包含修饰的核碱基的核苷酸类似物。无论是具有天然主链还是类似结构，可以包含在多核苷酸中的示例性修饰的核碱基包括(例如)肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、15-卤代脲嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤素取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鸟嘌呤、3-去氮腺嘌呤等。如本领域中已知的，某些核苷酸类似物不能引入多核苷酸，例如，核苷酸类似物，如腺苷5′-磷酰硫酸。

如本文所用的，术语“固定”意指经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。在本公开内容的某些实施方案中，可以使用共价附接，但是通常仅需要的是在期望使用固体支持物的条件下(例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中)核酸保持固定或附接至固体支持物。通常，待用作捕获引物或扩增引物的寡核苷酸(例如本发明的具有部分双链结构的引物)被固定，使得3'末端对于延伸是可利用的并且该引物序列的至少一部分能够杂交至互补核酸序列。固定可以经由杂交至表面附接的寡核苷酸发生，在这种情况下固定的寡核苷酸或多核苷酸可以为3'-5'方向。另一种非共价附接的方式可以是通过氨基化修饰将核酸结合蛋白质结合在固体支持物上，并通过核酸结合蛋白质捕获核酸分子。可选地，固定可以通过除碱基配对杂交之外的其他方式发生，例如上文描述的共价附接。核酸与固体支持物附接方式的非限制性示例包括核酸杂交、生物素链霉亲和素结合、巯基结合、光活化结合、共价结合、抗体-抗原、经由水凝胶或其他多孔聚合物的物理限制等。用于将核酸固定在固体支持物上的各种示例性方法可参见例如G.Steinberg-Tatman等人,BioconjugateChemistry 2006,17,841-848；Xu X.等人Journal of the American Chemical Society128(2006)9286-9287；美国专利申请US 5639603、US 5641658、US2010248991；国际专利申请WO 2001062982、WO 2001012862、WO 2007111937、WO0006770，为了所有目的，特别是为了与制备形成其上固定有核酸的固体支持物有关的全部教导，以上文献均通过引用全文并入本文。

如本文所使用的，术语“固体支持物”意指核酸可以与其附接的任何不可溶的基底或基质，诸如例如，乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面、玻璃表面、芯片、传感器、电极和硅晶片，优选地，所述固体支持物由选自下列的材料制成：玻璃、陶瓷、金属(例如金颗粒)、硅片(硅晶)、聚四氟乙烯、乳胶、葡聚糖、聚苯乙烯(修饰或未经修饰的，例如聚乙二醇包覆的聚苯乙烯)、聚丙烯、聚酰胺(例如聚丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺)、聚乙二醇，或其任何组合。固体支持物的表面可以是任何所需形状，所述形状包括，例如片状，棱柱体形(例如长方体)、球形、锥体形、圆柱体形、不规则形状、或其任何组合。例如，固体支持物表面为平面的或多孔的。固体支持物还可以被安装在流动池的内部，以允许与多个试剂的溶液相互作用。

在某些实施方案中，固体支持物可以包括惰性基底或基质，该惰性基底或基质已经例如通过应用中间材料的层或涂层被化学官能化，所述中间材料具有允许共价附接至多核苷酸的反应性基团。中间材料可以经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。作为用于非共价附接至固体支持物的非限制性实例，这类支持物可以包括在惰性基底例如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶层。在这类实施方案中，多核苷酸可以直接共价附接至中间层(例如，水凝胶)，但是中间层本身可以非共价附接至其他基底或基质(例如玻璃基底)层。

如本文所用，术语“反应容器”意指能够容纳反应溶液的任何装置，包括但不限于槽、渠、孔、试管、杯、皿等。反应容器可以具有任何合适的形状，例如反应容器可以是方形、球形、锥形、圆柱体形、不规则形状等。反应容器可以具有任何合适的尺寸，例如其尺寸可以根据所需要容纳的反应溶液的体积而进行任意的调整，例如其尺寸可以允许容纳至少1μL、至少5μL、至少10μL、至少20μL、至少50μL、至少100μL、至少1mL、至少5mL、至少10mL、至少20mL、至少50mL、至少100mL、至少200mL、至少500mL、至少1L或更多的反应溶液，或者其尺寸可以允许容纳至多1μL、至多5μL、至多10μL、至多20μL、至多50μL、至多100μL、至多1mL、至多5mL、至多10mL、至多20mL、至多50mL、至多100mL、至多200mL、至多500mL、至多1L或更多的反应溶液。反应容器可由任何合适的材料制成，例如可由玻璃、金属诸如不锈钢、聚合材料如塑料等制成。应理解，反应容器的材料应不会不利地影响反应溶液的反应活性。

如本文所用，术语“反应试剂TdT-dNTP”是指WO 2017/223517中描述的缀合物(“TdT-dNTP”conjugate)，其包含聚合酶和核苷三磷酸，其中聚合酶和核苷三磷酸通过包含可切割键的接头共价连接，其中dNTP对应于碱基G，A，T(或U)和C。所述接头能够使用刺激(例如，光，其环境的变化或暴露于化学物质或酶)而不破坏核酸中的其他键而被选择性地切割。在一些实施方案中，可裂解键可以是二硫键，其可以使用还原剂(例如β-巯基乙醇等)容易地破坏。其他可能合适的可裂解键其他可切割键对于本领域技术人员来说是显而易见的或在相关文献和文本中有描述(例如，Brown(1997)Contemporary Organic Synthesis 4(3)；216-237)。在另外的实施方案中，可以使用光可切割(“PC”)接头(例如，紫外可切割接头)。适合使用的光可切割接头如WO 2017/223517中所详述。

因此，在使用本文所述的浸泡式反应方案对核酸分子进行核酸合成的方法的一个实施方案中，步骤c中所述切割是通过将固体支持物暴露于光，例如暴露于365nm光照射30分钟(Benchtop 2UV Transilluminator(UVP,LLC))以从第一延伸产物上切除TdT。

在本发明的具体实施方案中，可以使用合适的温度控制设备来将各个反应容器内的温度调节至其中的反应溶液发生反应或用洗涤溶液洗涤时所需要的温度。在一个实施方案中，各反应容器所需的温度可以是不同的。在另一个实施方案中，各反应容器所需的温度可以是部分相同的。在另一个实施方案中，各反应容器所需的温度可以是相同的。在一个实施方案中，可以采用一个温度控制设备来控制所有反应容器的温度。在另一个实施方案中，尤其是各反应容器所需的温度不相同的情况下，可以采用不同的温度控制设备来分别控制各反应容器的温度。可用于本发明的方法的合适的温度控制设备是容易获得的，例如可购自市面上可获得的各种温度控制设备，例如水浴锅。

如本文所用的洗涤溶液是能够将固体支持物上与其非特异性结合的物质洗掉并且不会不利地影响后续反应的任何溶液。适当地，洗涤试剂含有缓冲剂，例如有机盐，以保持约pH 6至pH 9的稳定pH，并且可能还包含一价或二价阳离子，从而从固体支持物除去非特异性结合的分子。示例性的洗涤试剂可以包括例如pH 6.5的100mM Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液(Tris-HCl pH 8,10mM和EDTA,1mM)等。根据需要，在本文所述的浸泡式反应方案中的各步骤中使用的洗涤溶液可以是相同或不同的，并且可以取决于所采用的反应试剂而进行适应性调整和选择，这样的调整和选择在本领域技术人员的能力范围内。

在一个实施方案中，本发明提供的浸泡式反应方案还包括优化固体支持物在各反应容器之间的移动速率，以使得固体支持物暴露于空气中的时间最小化。应理解，这样的速率优化应不会对反应溶液、固体支持物以及固体支持物上的核酸分子造成任何不利的影响。

因此，在一个具体的实施方案中，优化固体支持物在各反应容器之间的移动速率包括优化固体支持物从反应容器中的溶液或试剂中取出的速率，以使得固体支持物从溶液或试剂中尽可能快地取出而同时不会因较快的取出而对反应溶液、固体支持物以及固体支持物上的核酸分子造成任何不利的影响。不受理论约束，认为将固体支持物从溶液或试剂中更快地取出有助于避免其表面可能因为蒸发和疏水性而导致的干燥，同时还有助于减少其表面携带的溶液或试剂的量，从而降低对后续程序的污染，然而，过快的取出速率可能会对固体支持物及其上固定的核酸分子带来损害，从而影响合成质量，因而需要根据具体使用的固体支持物、其上固定的核酸分子以及反应溶液或试剂对取出速率进行优化。在一个实施方案中，固体支持物从反应容器中的溶液或试剂中取出的速率可以是例如但不限于至少1mm/s、至少5mm/s、至少10mm/s、至少15mm/s、至少20mm/s、至少25mm/s、至少30mm/s、至少40mm/s、至少50mm/s或更高。在另一个实施方案中，固体支持物从反应容器中的溶液或试剂中取出的速率可以是例如但不限于不高于50mm/s、不高于40mm/s、不高于30mm/s、不高于20mm/s、不高于10mm/s或更低。在优选的实施方案中，固体支持物从反应容器中的溶液或试剂中取出的速率可以是例如约20mm/s。

在一个具体的实施方案中，优化固体支持物在各反应容器之间的移动速率包括优化固体支持物在从反应容器中的溶液或试剂中取出后的移动速率，以使得固体支持物暴露于空气中的时间最小化。不受理论约束，据认为在从反应容器中的溶液或试剂中取出后，尽可能快地移动固体支持物有助于避免其表面可能因为蒸发和疏水性而导致的干燥。在一个实施方案中，优化固体支持物在从反应容器中的溶液或试剂中取出后的移动速率，以使得固体支持物暴露于空气中的时间小于或等于100ms、小于或等于200ms、小于或等于500ms、小于或等于1s、小于或等于1.5s、小于或等于2s、小于或等于2.5s、小于或等于3s、小于或等于3.5s、小于或等于4s、小于或等于4.5s、小于或等于5s、小于或等于5.5s、小于或等于6s、小于或等于6.5s、小于或等于7s、小于或等于7.5s、小于或等于8s、小于或等于8.5s、小于或等于9s、小于或等于9.5s、小于或等于10s、小于或等于15s、小于或等于20s、小于或等于30s、小于或等于1min、小于或等于2min、小于或等于5min或小于或等于10min。

在其它实施方案中，本发明还提供了用于本发明所述的浸泡式反应方案以合成核酸分子的设备，所述设备包括：

a.一个或多个反应装置，其各自包含反应试剂TdT-dNTP，用于与固定在固体支持物上的起始核酸分子反应以产生延伸产物；

b.包含终止试剂的一个或多个反应装置；

c.包含用于从固体支持物上切除TdT的反应装置；

d.包含洗涤试剂的一个或多个反应装置。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是，本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了本发明的浸泡式反应方案的示例性实施方案的流程图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1-利用浸泡式反应方案进行核酸合成

起始核酸分子的制备：采用化学合成法合成5’-FAM-dT₆₀

反应试剂TdT-dNTP的制备：

按照WO2017223517A1所述的方法制备聚合酶(TdT)突变体，dATP、dCTP、dGTP和dTTP分别通过连接基团与TdT连接制备TdT-dATP、TdT-dTTP、TdT-dCTP和TdT-dGTP，具体制备方法见WO2017223517A1的实施例2，连接基团可被光切割，从而去除聚合酶，进行下一个核苷酸的合成。

将四个核苷酸ATCG依次添加至起始核酸分子：

(1)提供固定有起始核酸分子的固体支持物；

(2)将固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dATP的第一反应容器中，37℃反应120s，使所述起始核酸分子与TdT-dATP充分反应，生成第一延伸产物；

(3)将固体支持物浸泡在置于第五反应容器中的终止试剂EDTA(100mM)中，37℃反应60s，以终止反应；

(4)将固体支持物暴露于365nm的光照条件下(Benchtop 2UV投射仪)冰上处理1h，光照强度为5mW/cm²从第一延伸产物上切除TdT；

(5)将固体支持物浸泡在置于第六反应容器中的洗涤试剂中进行洗涤、纯化得到第一延伸分子；

(6)将固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dTTP的第二反应容器中37℃反应120s，使所述第一延伸分子与TdT-dTTP充分反应，生成第二延伸分子；

(7)重复步骤(3)-(5)；

(8)将固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dCTP的第三反应容器中37℃反应120s，使所述第二延伸分子与TdT-dCTP充分反应，生成第三延伸分子；

(9)重复步骤(3)-(5)；

(10)将固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dGTP的第四反应容器中37℃反应120s，使所述第三延伸分子与TdT-dGTP充分反应，生成第四延伸分子；

(11)重复步骤(3)-(5)，即得到在起始核酸分子上连接了序列ATCG的合成的核酸分子；

经Sanger测序法检测合成的核酸分子，结果显示合成序列的确为ATCG。

实施例2：多个固体支持物同时采用浸泡反应方案进行核酸合成

按照实施例1的方法同时将AT、GA、CG添加至3个固体支持物上的起始核酸分子。

(1)将固定有起始核酸分子的三个固体支持物分别置于含有TdT-dATP的第一反应容器、TdT-dGTP的第四反应容器、TdT-dCTP的第三反应容器中，37℃反应120s，分别生成三个第一延伸产物；

(2)将三个固体支持物至于第五反应容器中的终止试剂；EDTA(100mM)中，37℃反应60s，以终止反应；

(3)将三个固体支持物暴露于365nm的光照条件下(Benchtop 2UV投射仪)冰上处理1h，光照强度为5mW/cm²，从而从第一延伸产物上切除TdT；

(4)将三个固体支持物浸泡在置于第六反应容器中的洗涤试剂中进行洗涤、纯化得到三个第一延伸分子；

(5)将三个固体支持物分别浸泡在含有TdT-dTTP的第二反

应容器、TdT-dATP的第一反应容器、TdT-dGTP的第四反应容器中，37℃反应120s，分别生成第二延伸分子；

(6)重复步骤(2)-(4)即得到分别在起始核酸分子上连接了AT、GA、CG的合成的核酸分子。

经Sanger测序法检测合成的核酸分子，结果显示三个合成的序列分别为AT、GA、CG。

Claims (10)

1.一种使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，包括以下步骤：

a.提供其上固定有起始核酸分子的固体支持物，

b.将所述固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dNTP的第一反应容器中，使所述起始核酸分子与TdT-dNTP充分反应，生成第一延伸产物；

c.将固体支持物浸泡在置于第二反应容器中的终止试剂中，以终止反应；

d.将固体支持物浸泡在置于第三反应容器中的切除试剂中，或将固体支持物暴露于光，以从第一延伸产物上切除TdT；

e.将固体支持物浸泡在置于第四反应容器中的洗涤试剂中进行洗涤、纯化得到延伸后的核酸分子；

f.任选地，重复步骤b至e。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应试剂TdT-dNTP选自TdT-dATP、TdT-dTTP、TdT-dCTP、TdT-dGTP、TdT-dUTP中的任一种，根据意欲合成的核酸分子的序列，在步骤b中将所述固体支持物浸泡在含有相应反应试剂TdT-dNTP的反应容器中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤b至e重复一次或多次，例如重复1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多次。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，还包括：在合成完成后从合成的核酸分子中除去所述起始核酸分子。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述反应试剂TdT-dNTP含有光可切割的接头，在步骤d中将固体支持物暴露于切除试剂后，TdT被切除。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述反应试剂TdT-dNTP含有化学可切割的接头，在步骤d中将固体支持物暴露于光后，TdT被切除。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中，所述反应容器具有选自下列的一个或多个特征：

(a)所述反应容器为能够容纳试剂的装置或容器，例如槽、渠、孔、试管、杯、皿；

(b)所述反应容器具有期望的形状，例如方形、球形、锥形、圆柱体形、不规则形状、或其任何组合；

(c)所述反应容器具有期望的尺寸，例如能够容纳至少1μL、至少2μL、至少5μL、至少10μL、至少20μL、至少50μL、至少100μL、至少200μL、至少500μL、至少1mL、至少2mL、至少5mL、至少10mL、至少20mL、至少50mL、至少100mL、至少200mL、至少500mL、至少1L或更多的溶液；

(d)所述反应容器由不会不利地影响反应试剂的活性的材料制成，例如由玻璃、金属诸如不锈钢、聚合材料如塑料等制成；和

(e)所述反应容器是一端开口的。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中，所述固体支持物具有选自下列的一个或多个特征：

(a)所述固体支持物由惰性材料制成；优选地，所述固体支持物由选自下列的材料制成：玻璃、陶瓷、金属(例如金颗粒)、硅片(硅晶)、聚四氟乙烯、乳胶、葡聚糖、聚苯乙烯(修饰或未经修饰的，例如聚乙二醇包覆的聚苯乙烯)、聚丙烯、聚酰胺(例如聚丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺)、聚乙二醇，或其任何组合；

(b)所述固体支持物具有期望的形状，例如片状，棱柱体形(例如长方体)、球形、锥体形、圆柱体形、不规则形状、或其任何组合；和

(c)所述固体支持物的表面为平面的或多孔的。

9.使用浸泡式反应方案同时进行多个核酸分子合成的方法，包括以下步骤：

a.提供其上固定有起始核酸分子的多个固体支持物，

b.将所述多个固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dNTP的第一反应容器中，使所述起始核酸分子与TdT-dNTP充分反应，生成第一延伸产物；

c.将所述多个固体支持物浸泡在置于第二反应容器中的终止试剂中，以终止反应；

d.将所述多个固体支持物浸泡在置于第三反应容器中的切除试剂中，或将所述多个固体支持物暴露于光，以从第一延伸产物上切除TdT；

e.将所述多个固体支持物浸泡在置于第四反应容器中的洗涤试剂中进行洗涤、纯化得到延伸后的核酸分子；

f.任选地，重复步骤b至e。

10.一种用于权利要求1-9中任一项所述的浸泡式反应方案以合成核酸分子的设备，所述设备包括：

a.一个或多个反应装置，其各自包含反应试剂TdT-dNTP，用于与固定在固体支持物上的起始核酸分子反应以产生延伸产物；

b.包含终止试剂的一个或多个反应装置；

c.包含用于从固体支持物上切除TdT的反应装置；

d.包含洗涤试剂的一个或多个反应装置。