CN102584955A - 一种转录激活子样效应因子的固相合成方法 - Google Patents

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Abstract

一种转录激活子样效应因子的固相合成方法，包括以下步骤：将一段核酸适配序列(DNAlinker)固定化到固相界面上，用限制性内切酶剪切产生3′-粘性末端；将产物与经限制性内切酶处理过的具有5′-粘性末端的TALE连接单元接触，在DNA连接酶的作用下连接，洗脱未连接底物；用限制性内切酶处理上一步骤所得产物，在DNA上剪切重新生成一个3′-粘性末端，再与经限制性内切酶处理过的具有5′-粘性末端的TALE连接单元接触，在DNA连接酶的作用下连接，洗脱未连接底物；重复操作上述步骤至少一次；用限制性内切酶将连接好的DNA分子从固相界面上剪切下来，分离纯化，除去未连接底物；将所得DNA分子表达成蛋白分子，即为含目标TALE的融合蛋白(如TALEN，或者TALEA)。

Description

一种转录激活子样效应因子的固相合成方法
技术领域
本发明涉及一种转录激活子样效应因子(Transcription Activator Like Effectors，TALE)的固相合成方法，特别涉及一种由短小重复TALE单体(TALE monomer)的DNA序列组装成长链TALE的大规模、低成本、高效率合成方法。
背景技术
在后基因组时代，我们迫切需要高效的基因操纵、合成等新型的生物工程技术。比如，我们常常需要抑制或沉默一个基因的表达。传统的基因敲除(Gene Knockout)技术依赖于细胞内自然发生的同源重组，其效率非常低，通常为10-6级；RNAi技术虽然简单易行，但是又很难获得百分之百的抑制效果。除了抑制或沉默特定的基因，我们常常还需要针对特定基因，进行某几个碱基，甚至某一段序列的修改。同样只依赖于同源重组技术，很难获得理想的效果。
TALE(Transcription Activator Like Effectors)首先是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)上发现的，特异性地结合到DNA，在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。简单讲，TALE是由4个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成，而每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，其中第12和13位氨基酸是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双氨基酸残基(repeat variable diresidue，或者RVDs)。TALE识别DNA的机制在于DNA靶点上的一个核苷酸被一个重复序列上的RVD识别。
理论上，针对A、T、G、C任何一个碱基，都能找到与之特定结合的RVDs。因此，对任何一段DNA序列，我们可以方便的设计、合成出对应蛋白模块组成的TALE。需要指出的问题是，1)虽然针对A、T、G、C都可以设计出对应的RVD，但是，它们之间的对应关系还有待于进一步优化；2)设计合成的TALE能否高效地靶向结合基因组上的预期位置，还决定于很多其它因素；3)蛋白模块的组成也有进一步优化的空间。
虽然TALE还有很多问题有待于深入研究加以解决，但是这并不妨碍它的应用。一个最大的应用前景是TALEN。TALEN是一个融合蛋白，由某段识别特异性DNA序列的TALE与能在DNA序列上产生双链断裂(double strand break，DSB)的内切核酸酶(Nuclease)融合而成。TALEN是异源二聚体分子(即两单位的TALE-Nuclease共同作用)，能够在两个相隔较近的特异识别序列间切割DNA。
TALEN产生的DSB能够通过以下两种途径进行修复：1)非同源末端连接(Non HomologousEnd Joining，NHEJ)：NHEJ是以自然修复机制，能被用来引入核苷酸缺失以便失活或敲除一个特异性的靶基因；2)同源重组(Homologous Recombination，HR)：DSB促进同源重组，在一个DNA模版存在下，能够产生特异性DNA序列改变，也能够将DNA模版整合到DNA序列上。NHEJ途径可以用于基因沉默，而HR可用于修改基因(Gene Editing)，或者基因敲入(GeneKnock-in)。无论是哪种途径，TALEN产生的修复与单纯依赖于同源重组相比，基因发生重组的效率大大提高，这为我们从事基因组订制化(genome customization)提供方便的技术手段，为开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。
TALE另外一个大的应用前景是TALEA(transcription activator-like(TAL)effectoractivator)。TALEA是一个融合蛋白，将识别特异DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64 Activation Domain)融合，可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA。该融合蛋白将结合基因启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与Polymerase II结合，从而激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。
TALE技术已经开始在生命科学领域崭露头角。2011年，法国和美国两个小组合作，利用TALEN技术，在大鼠中敲除失活IgM功能，效率高达60％。2011年，包括中国在内的几个小组，利用TALEN技术，在斑马鱼中，敲除失活hey2等基因，效率也达到了30％以上。
TALE是一组重复蛋白模块组成。按照现有的合成制备方法，需要大量的酶切、链接以及产物纯化等操作，不仅耗时长(～3周)，而且需要大量的劳动力，不适合于大规模应用。
发明内容
本发明的目的正是为了解决上述技术问题，提供一种新型TALE合成组装的方法，利用固相组装合成方法便于清洗底物、纯化产物的特性，在固相界面上完成TALE连接单元的循环连接组装。流程可概括为：首先将一段核酸适配序列(DNA linker)固定化到固相载体界面上，如果核酸适配序列带有3’-粘性末端，可以与带5’-粘性末端的TALE连接单元在DNA连接酶的作用下连接，随后洗脱未连接的底物，再用限制性内切酶将连接到固相载体上DNA剪切重新生成3’-粘性末端，再连接新的TALE连接单元。如此反复上述步骤，可将TALE连接单元一步步组装到期望长度，最后再用另一种限制性内切酶将组装好的TALE序列从固相界面上剪切下来，通过电泳分离纯化后，克隆到不同的表达载体(TALEN或者TALEA)上。整个组装流程可参考图示意图5。
在本发明中，术语“固定化”(immobilize)指的是核酸分子(包括但不限于DNA探针、RNA等)通过化学基团(如氨基-NH2)与固态物体上的化学基团(如羧基-COOH)通过化学反应(如氨基与羧基脱去一分子水)形成共价键，从而将核酸分子与高分子块体紧密连接在一起；或者指溶液中的核酸分子通过高亲和分子(包括但不限于biotin与avidin或streptavidin)之间的相互作用与固态物体连接在一体；或者指溶液中的核酸分子与已经固定化到高分子块体上的探针分子通过碱基配对生成氢键紧密连接在一起。因此，“固定化”不同于物理的吸附或粘附，通常的洗涤方式可以将吸附或粘附在高分子块体上的杂质洗去，却不能洗去“固定化”到高分子块体上的核酸分子。
“TALE”指的是由4个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成，而每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，其中第12和13位氨基酸是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双氨基酸残基(repeat variable diresidue，或者RVDs)。
“TALE单体(TALE monomer)”指的是上述特异性识别DNA的“蛋白模块”。
“TALE单体(TALE monomer)的DNA序列”指的是编码TALE单体(TALE monomer)的对应DNA序列，将该DNA序列经过转录、翻译等生物化学过程表达出来的蛋白质即为TALE单体(TALE monomer)。
“TALE连接单元”指的是至少一个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列，例如可以是2个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列(即两个TALE单体并列相连形成的蛋白单元所对应的DNA序列，可称为“二连子”)，3个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列(三连子)，或4个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列(四连子)，或是非整数个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列(若干个TALE连接单元经过组装连接等一系列步骤后能够形成至少含有一个完整TALE单体的DNA序列；更为简单可设计为如O.5、1.5、2.5、3.5、4.5或5.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列，它们经过组装连接后能够形成至少含有一个完整TALE单体的DNA序列)。
本发明采用的技术方案如下。
方案1：一种转录激活子样效应因子(Transcription Activator Like Effectors，TALE)的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将一段核酸适配序列(DNA Linker)固定化到固相界面上，用限制性内切酶3a剪切产生3’-粘性末端；
(2)将步骤(1)的产物与经限制性内切酶5a处理过的具有5’-粘性末端的TALE连接单元接触，在DNA连接酶的作用下连接，洗脱未连接底物，上述5’-粘性末端具有与DNA Linker上3’-粘性末端互补配对的核苷酸序列；
(3)用限制性内切酶3b处理上一步骤所得产物，在DNA上剪切重新生成一个3’-粘性末端，再与经限制性内切酶5b处理过的具有5’-粘性末端的TALE连接单元接触，在DNA连接酶的作用下连接，洗脱未连接产物；上述5’-粘性末端具有与上述3’-粘性末端互补配对的核苷酸序列；
(4)重复步骤(3)至少一次；
(5)用限制性内切酶将连接好的DNA分子从固相界面上剪切下来，分离纯化，除去未连接产物；
(6)将步骤(5)所得DNA分子连接到一定表达载体上，表达成蛋白分子，即为含目标TALE的融合蛋白(如TALEN，或者TALEA)。
利用上述技术方案可以方便地对每一步的连接产物进行纯化，由于目标产物通过DNALinker固定化到固相界面上，因此通过简单的固液分离手段，如磁力、离心、过滤等，将固相界面与液体体系分离开，再对固相界面进行冲洗便可以除去绝大部分的非目标产物(包括错误连接产物、未反应的反应物等)。此外，每一个TALE连接单元的5’-粘性末端的核苷酸序列都能与固定化到固相界面上的DNA分子的3’-粘性末端的核苷酸序列互补配对，这保证了连接的准确度。上述两个优点保证了采用本发明的方法可以简便而高效地大规模合成TALE。
优选地，步骤(4)中重复步骤(3)2-20次使得TALE具备合适的长度，适应特定场合的应用。
优选地，TALE连接单元为0.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、1个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、1.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、2个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、2.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、3个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、3.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、4个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、4.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、5.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列或6个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列。具体的选择可以根据合成过程中的需要(如合成更简便、更快捷等)具体确定。
优选地，，剪切DNA分子产生粘性末端的限制性内切酶可以为II型限制性内切酶，为防止剪切出粘性末端的时候将之前连接好的DNA链切断，每一次使用的酶都必须与之前用过的不同，因此，需设定限制性内切酶3a、3b、……均不相同，限制性内切酶5a、5b、……也均不相同。
优选地，剪切DNA分子产生粘性末端的限制性内切酶为同尾酶，采用同尾酶的好处是，DNA连接之后，识别位点不复存在，因此剪切产生3’-粘性末端的酶可以相同，剪切产生5’-粘性末端的酶也可以相同，操作更加简便，也更加便宜。因而设定限制性内切酶3a、3b、……均相同，限制性内切酶5a、5b、……也均相同。
优选地，所述剪切产生3’-粘性末端的限制性内切酶为NheI，剪切产生5’-粘性末端的限制性内切酶为SpeI；或者剪切产生3’-粘性末端的限制性内切酶为NheI，剪切产生5’-粘性末端的限制性内切酶为xbaI；或者剪切产生3’-粘性末端的限制性内切酶为SpeI，剪切产生5’-粘性末端的限制性内切酶为xbaI；或者剪切产生3’-粘性末端的限制性内切酶为SalI，剪切产生5’-粘性末端的限制性内切酶为xhoI。
优选地，剪切DNA分子产生粘性末端的限制性内切酶为剪切位点不在限制性内切酶DNA识别位点上的限制性内切酶，这样经一次剪切后，限制性内切酶识别位点不存在固相的DNA分子上，从而再次无法剪切固相的DNA分子上。因此剪切产生3′-粘性末端的酶可以相同，剪切产生5′-粘性末端的酶也可以相同，因而设定限制性内切酶3a、3b、......均相同，限制性内切酶5a、5b、......也均相同。但是剪切产生3′-粘性末端的酶和剪切产生5′-粘性末端的酶不相同。
优选地，所述剪切产生3’-粘性末端的限制性内切酶为BsaI，剪切产生5’-粘性末端的限制性内切酶为ESP3I；或者剪切产生3’-粘性末端的限制性内切酶为BbsI，剪切产生5’-粘性末端的限制性内切酶为BbvI。
优选地，步骤(1)中所述将一段核酸适配序列(DNA Linker)固定化到固相界面上按如下步骤操作：在DNA Linker一端修饰生物素biotin，在固相界面上修饰链霉亲和素streptavidin，将上述修饰了biotin的DNA Linker与修饰了链霉亲和素streptavidin的固相界面接触。固定化的方法并不限于上述例子，任何化学、生物的方法都可以使用，前提是可以在DNA Linker与固相界面之间形成紧密的结合，以常规的冲洗方法冲洗不掉为准。
优选地，所述固相界面包括磁性材料、硅、二氧化硅、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。为了方便合成，本发明实施例中使用磁珠，但是任何形式的固体材料，只要可以固定化DNA Linker的，都可以使用。
优选地，步骤(2)和(3)中所述洗脱未连接产物按如下步骤操作：a.固液分离；b.将分离得到的固相冲洗至少一次。固液分离包括磁力分离、离心分离、过滤等常规手段，冲洗可以用蒸馏水。
优选地，所述DNA Linker为一段与TALE单体的DNA序列完全不相同的序列，或者所述DNA Linker为TALE单体的DNA序列的一部分或全部。当DNA Linker为TALE单体的DNA序列的一部分或全部时，可以将DNA Linker连同TALE长链DNA分子一起从固相界面上剪切下来，作为合成TALE的DNA模板。
优选地，所述DNA Linker具有20-500个核苷酸，优选具有30-200个核苷酸，进一步优选具有50-80个核苷酸。
优选地，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶或Tag DNA连接酶。
3’-粘性末端和5’-粘性末端也可以通过两条互补的DNA单链退火成为DNA双链而形成，或者分别由两条互补的DNA单链退火成为DNA双链而形成以及由限制性内切酶剪切形成。所以也可以采用下面的方案2：
一种转录激活子样效应因子(Transcription Activator Like Effectors，TALE)的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将一段核酸适配序列(DNA Linker)固定化到固相界面上，所述DNA Linker具有3’-粘性末端；
(2)将步骤(1)的产物与具有5’-粘性末端和3’-粘性末端的TALE连接单元接触，在DNA连接酶的作用下连接，洗脱未连接产物，上述5’-粘性末端具有与DNA Li nker上3’-粘性末端互补配对的核苷酸序列；
(3)将步骤(2)的产物与具有5’-粘性末端和3’-粘性末端的TALE连接单元接触，在DNA连接酶的作用下连接，洗脱未连接产物；上述5’-粘性末端具有与步骤(2)所得产物的3’-粘性末端互补配对的核苷酸序列；
(4)重复步骤(3)至少一次；
(5)用限制性内切酶将连接好的DNA分子从固相界面上剪切下来，分离纯化，除去未连接产物；
(6)将步骤(5)所得DNA分子连接到一定表达载体上，表达成蛋白分子，即为含目标TALE的融合蛋白(如TALEN，或者TALEA)。
上述3’-粘性末端和5’-粘性末端均通过两条互补的DNA单链退火成为DNA双链而形成，或者均通过限制性内切酶剪切DNA双链而形成，或者3’-粘性末端通过两条互补的DNA单链退火成为DNA双链而形成、5’-粘性末端通过限制性内切酶剪切DNA双链而形成，或者5’-粘性末端通过两条互补的DNA单链退火成为DNA双链而形成、3’-粘性末端通过限制性内切酶剪切DNA双链而形成。
DNA Linker上的3’-粘性末端可以在固定化到固相界面上之前形成，也可以在固定化到固相界面上之后形成。其他的3’-粘性末端可以在同一DNA分子上的5’-粘性末端形成的同时形成或者之后形成。
优选地，步骤(4)中重复步骤(3)2-20次。
优选地，TALE连接单元为0.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、1个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、1.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、2个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、2.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、3个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、3.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、4个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、4.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、5.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列或6个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列。具体的选择可以根据合成过程中的需要(如合成更简便、更快捷等)具体确定。
优选地，步骤(1)中所述将一段DNA衔接物(DNA Linker)固定化到固相界面上按如下步骤操作：在DNA Linker一端修饰生物素biotin，在固相界面上修饰链霉亲和素streptavidin，将上述修饰了biotin的DNA Linker与修饰了链霉亲和素streptavidin的固相界面接触。固定化的方法并不限于上述例子，任何化学、生物的方法都可以使用，前提是可以在DNA Linker与固相界面之间形成紧密的结合，以常规的冲洗方法冲洗不掉为准。
优选地，所述固相界面包括磁性材料、硅、二氧化硅、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。为了方便合成，本发明实施例中使用磁珠，但是任何形式的固体材料，只要可以固定化DNA Linker的，都可以使用。
优选地，步骤(2)和(3)中所述洗脱未连接产物按如下步骤操作：a.固液分离；b.将分离得到的固相冲洗至少一次。固液分离包括磁力分离、离心分离、过滤等常规手段，冲洗可以用蒸馏水。
优选地，所述DNA Linker为一段与TALE单体的DNA序列完全不相同的序列，或者所述DNA Linker为TALE单体的DNA序列的一部分或全部。当DNA Linker为TALE单体的DNA序列的一部分或全部时，可以将DNA Linker连同TALE长链DNA分子一起从固相界面上剪切下来，作为合成TALE的DNA模板。
优选地，所述DNA Linker具有20-500个核苷酸，优选具有30-200个核苷酸，进一步优选具有50-80个核苷酸。
优选地，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶或Tag DNA连接酶。
上述方法还可以扩展到任意长链核酸分子的合成，只需将上述方法中的TALE连接单元替换为任意的DNA序列，并省略步骤(6)，便可以采用上述固相合成方法由短链核酸分子合成任意的长链核酸分子。
附图说明
图1TALE结构示意图。TALE的核酸识别单位为重复34个恒定氨基酸序列，其中的12、13位点双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T，HD识别C，NI识别A，NN识别G。
图2TALEN结构以及其工作原理示意图。将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联，可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALEN。而且FokI需形成2聚体方能发挥活性，大大减少了随意剪切的几率。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻(间隔13-22碱基)的靶序列(一般12-20个碱基)分别进行TAL识别模块构建。将这两个相邻靶点识别模块(分别)融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。
图3TALEN剪切后介导的同源重组示意图。当通过TALEN产生DSB后，若能提供同源修复模板，细胞可通过同源重组方式修复DNA，因此可以对内源DNA做更精细的操作，如点突变(磷酸化位点)、保守区域替换、N端或C端加标记(GFP、HA、Flag)等等。
图4TALEA结构以及工作原理示意图。将识别特异DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64 Activation Domain)融合，可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA.在实际操作中，需在目标基因的启动子上游选取靶序列(一般12-18个碱基)，构建TAL识别模块。将识别模块TALE融合克隆到VP64的N-末端，形成真核表达质粒TALEA。将TALEN质粒转入细胞中，表达的融合蛋白结合启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与Pol II结合，从而激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。
图5组装流程示意图。a)固定化在固相表面的DNA linker的3’-粘性末端由限制性内切酶剪切产生，TALE连接单元的5’-粘性末端由限制性内切酶剪切产生；b)固定化在固相表面的DNA linker的3’-粘性末端由限制性内切酶剪切产生，TALE连接单元的5’-粘性末端是通过两条互补的DNA单链退火成为DNA双链时形成；c)固定化在固相表面的DNA linker的3’-粘性末端、TALE连接单元的3’-粘性末端和5’-粘性末端均是通过两条互补的DNA单链退火成为DNA双链时形成；d)固定化在固相表面的DNA linker的3’-粘性末端、TALE连接单元的5’-粘性末端均是通过两条互补的DNA单链退火成为DNA双链时形成，在完成每一步连接后，对固定化在固相表面的连接产物进行一步酶切产生3’-粘性末端，保证下一步组装的顺利进行。
图6由1个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列(1连子)组装为的五个TALE单体(TALEmonomer)的DNA序列(5连子)。1)在DNA固定化前，将5’-端修饰biotin的DNA linker与BbsI酶切后的第一个连接单元混合，在溶液中连接；2)用BbvI酶切固定在磁珠上的连接单元，产生3’-端粘性末端，清洗三次；3)第二个TALE连接单元在加入前，先经过BbsI酶切产生5’-端粘性末端、纯化等处理，然后在T4 DNA连接酶的作用下连接到磁珠上。4)重复步骤2-3 3次即可得到5连子。组装产物在图中左道所示。
图7由1个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列(1连子)组装为的10个TALE单体(TALEmonomer)的DNA序列(10连子)。组装产物在图中左道所示。
图8由TALE四连子连接单元组装为TALE 16连子。在TALE四连子的基础上，可在磁珠上进行4步的组装，最后组装成TALE 16连子。第一步，生物素修饰的双链DNA linker(Biotinylatedds-DNA linker)带有SpeI酶切位点，因此经过酶切后会产生粘性末端，纯化后与磁珠孵育将固定到磁珠表面。第二步，纯化扩增TALE 4连子。第三步，利用SpeI酶切TALE 4连子。第四步，将SpeI酶切好第一个4连子加入带有DNA连接子的磁珠溶液上，连接后清洗3次。第五步，利用NheI酶切连接完第一个4连子的磁珠溶液，清洗3次，加入SpeI酶切好第二个4连子，重复上述步骤。第六步和第七步，分别加入第三个和第四个4连子，重复步骤5的操作，然后跑胶回收1.6k大小的片段，可得到TALE 16连子。
具体实施方式
以下将通过具体的实施例说明本发明，但是这些具体的实施例不应当理解为对本发明的限制，对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护范围之内。
材料和方法：
利用PCR反应，扩增第一个要组装的TALE连接单元，其中PCR上游引物5端带有biotin修饰。然后将PCR产物与磁珠孵育固定，再经过BbvI酶切处理，清洗3次去除酶等杂质。在开始第二步组装前，先将要组装的TALE连接单元经过PCR扩增，然后利用BbsI酶切处理后，纯化回收。将纯化好的第二个TALE连接单元加入已组装第一个TALE单元的磁珠，在T4 DNA连接酶的作用下，完成第二步组装。重复上述酶切、纯化、连接等步骤，直到获得预定长度的TALE。组装完毕后，利用酶切释放磁珠上的DNA片段，酶切产物跑Agarose胶进行回收，连接到特定的表达质粒载体上，转化涂板挑菌测序。
从实施例1-3的结果(实验结果见图6-8及附图说明)可以看出固相组装的效率还是非常高，至少在10步后，仍能得到30％的连接产物。
实施例1.由1个TALE单元(1连子)组装为的TALE 5连子单元
DNA linker序列、5个TALE连接单元序列、5连子要结合的DNA序列以及最后组装完成的TALE 5连子单元序列见附表1。
首先，在DNA固定化前，将5端修饰biotin的DNA linker与BbsI酶切后的第一个连接单元混合，在溶液中连接；其次，用BbvI酶切处理固定在磁珠上的连接单元后，清洗磁珠3次；再者，第二个TALE连接单元在加入前，将其用BbsI酶切处理、纯化，在T4 DNA连接酶的作用下连接到磁珠上；重复上述酶切、纯化、连接等步骤3次，即可得到5连子。
实施例2由1个TALE单元(1连子)组装为的TALE 10连子单元
DNA linker序列、5个TALE连接单元序列、5连子要结合的DNA序列以及最后组装完成的TALE 5连子单元序列见附表2。
首先，在DNA固定化前，将5端修饰biotin的DNA linker与BbsI酶切后的第一个连接单元混合，在溶液中连接；其次，用BbvI酶切处理固定在磁珠上的连接单元后，清洗磁珠3次；再者，在加入第二个TALE连接单元前，将其用BbsI酶切处理、纯化，在T4 DNA连接酶的作用下连接到磁珠上；重复上述酶切、纯化、连接等步骤8次，即可得到10连子。
实施例3由4个TALE四连子连接单元组装为TALE 16连子
DNA linker、16连子要结合的DNA序列以及各个TALE连接单元的序列见附表3。
在TALE四连子的基础上，可在磁珠上进行4步的组装，最后组装成16 TALE连子。第一步，生物素修饰的双链DNA linker(Biotinylated ds-DNA linker)带有SpeI酶切位点，因此经过酶切后会产生粘性末端，纯化后与磁珠孵育将固定到磁珠表面。第二步，纯化扩增TALE4连子。第三步，利用SpeI酶切TALE 4连子。第四步，将酶切好第一个4连子加入带有DNA连接子的磁珠溶液上，连接15分钟-1个小时，清洗3次。第五步，利用NheI酶切连接完第一个4连子的磁珠溶液，清洗3次，加入SpeI酶切好第二个4连子，重复上述步骤。第六步和第七步，分别加入第三个和第四个4连子，重复步骤5的操作，然后跑胶回收1.6k大小的片段，可得到TALE 16连子。
附表：
表1、
Figure BSA00000648188500101
Figure BSA00000648188500111
表2、
Figure BSA00000648188500112
表3、
Figure BSA00000648188500122
Figure BSA00000648188500131
Figure BSA00000648188500141

Claims (27)

1.一种转录激活子样效应因子(Transcription Activator Like Effectors，TALE)的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将一段核酸适配序列(DNA Linker)固定化到固相界面上，用限制性内切酶3a剪切产生3′-粘性末端；
(2)将步骤(1)的产物与经限制性内切酶5a处理过的具有5′-粘性末端的TALE连接单元接触，在DNA连接酶的作用下连接，洗脱未连接底物，上述5′-粘性末端具有与DNA Linker上3′-粘性末端互补配对的核苷酸序列；
(3)用限制性内切酶3b处理上一步骤所得产物，在DNA上剪切重新生成一个3′-粘性末端，再与经限制性内切酶5b处理过的具有5′-粘性末端的TALE连接单元接触，在DNA连接酶的作用下连接，洗脱未连接底物；上述5′-粘性末端具有与上述3′-粘性末端互补配对的核苷酸序列；
(4)重复步骤(3)至少一次；
(5)用限制性内切酶将连接好的DNA分子从固相界面上剪切下来，分离纯化，除去未连接产物；
(6)将步骤(5)所得DNA分子连接到一定表达载体上，表达成蛋白分子，即为含目标TALE的融合蛋白(如TALEN，或者TALEA)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中重复步骤(3)2-20次。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述TALE连接单元为整数或非整数个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列，若干个TALE连接单元经过组装连接等一系列步骤后能够形成至少含有一个完整TALE单体的DNA序列。
4.根据权利要求1-3的任一项所述的方法，其特征在于所述TALE连接单元为0.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、1个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、1.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、2个TALE单体(TALEmonomer)的DNA序列、2.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、3个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、3.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、4个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、4.5个TALE单体(TALEmonomer)的DNA序列、5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、5.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列或6个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的方法，其特征在于剪切DNA分子产生粘性末端的限制性内切酶为II型限制性内切酶，且限制性内切酶3a、3b、……均不相同，限制性内切酶5a、5b、……也均不相同。
6.根据权利要求1-5的任一项所述的方法，其特征在于剪切DNA分子产生粘性末端的限制性内切酶为同尾酶，且限制性内切酶3a、3b、……均相同，限制性内切酶5a、5b、……也均相同。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的方法，其特征在于剪切DNA分子产生粘性末端的限制性内切酶为剪切位点不在限制性内切酶DNA识别位点上的限制性内切酶，且限制性内切酶3a、3b、……均相同，限制性内切酶5a、5b、……也均相同。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述剪切产生3′-粘性末端的限制性内切酶为NheI，剪切产生5′-粘性末端的限制性内切酶为SpeI；或者剪切产生3′-粘性末端的限制性内切酶为NheI，剪切产生5′-粘性末端的限制性内切酶为xbaI；或者剪切产生3′-粘性末端的限制性内切酶为SpeI，剪切产生5′-粘性末端的限制性内切酶为xbaI；或者剪切产生3′-粘性末端的限制性内切酶为SalI，剪切产生5′-粘性末端的限制性内切酶为xhoI；或者剪切产生3′-粘性末端的限制性内切酶为BsaI，剪切产生5′-粘性末端的限制性内切酶为ESP3I；或者剪切产生3′-粘性末端的限制性内切酶为BbsI，剪切产生5′-粘性末端的限制性内切酶为BbvI。
9.根据权利要求1-8的任一项所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述将一段DNA衔接物(DNA Linker)固定化到固相界面上按如下步骤操作：在DNA Linker一端修饰生物素biotin，在固相界面上修饰链霉亲和素streptavidin，将上述修饰了biotin的DNALinker与修饰了链霉亲和素streptavidin的固相界面接触；或者按如下步骤操作：在DNA Linker一端修饰氨基-NH2，在固相界面上修饰羧基-COOH，将上述修饰了氨基-NH2的DNA Linker与修饰了羧基-COOH的固相界面接触并反应脱去一分子水。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的方法，其特征在于所述固相界面包括磁性材料、硅、二氧化硅、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。
11.根据权利要求1-10的任一项所述的方法，其特征在于步骤(2)和(3)中所述洗脱未连接底物按如下步骤操作：a.固液分离；b.将分离得到的固相冲洗至少一次。
12.根据权利要求1-11的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA Linker为一段与TALE单体的DNA序列完全不相同的序列，或者所述DNA Linker为TALE单体的DNA序列的一部分或全部。
13.根据权利要求1-12的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA Linker具有20-500个核苷酸，优选具有30-200个核苷酸，进一步优选具有50-80个核苷酸。
14.根据权利要求1-13的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶或Tag DNA连接酶。
15.一种转录激活子样效应因子(Transcription Activator Like Effectors，TALE)的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将一段核酸适配序列(DNA Linker)固定化到固相界面上，所述DNA Linker具有3′-粘性末端；
(2)将步骤(1)的产物与具有5′-粘性末端和3′-粘性末端的TALE连接单元接触，在DNA连接酶的作用下连接，洗脱未连接底物，上述5′-粘性末端具有与DNALinker上3′-粘性末端互补配对的核苷酸序列；
(3)将上一步骤所得固相产物与具有5′-粘性末端和3′-粘性末端的TALE连接单元接触，在DNA连接酶的作用下连接，洗脱未连接底物；上述5′-粘性末端具有与步骤(2)所得产物的3′-粘性末端互补配对的核苷酸序列；
(4)重复步骤(3)至少一次；
(5)用限制性内切酶将连接好的DNA分子从固相界面上剪切下来，分离纯化，除去未连接产物；
(6)将步骤(5)所得DNA分子连接到一定表达载体上，表达成蛋白分子，即为含目标TALE的融合蛋白(如TALEN，或者TALEA)。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述3′-粘性末端和5′-粘性末端均通过两条互补的DNA单链退火成为DNA双链而形成，或者均通过限制性内切酶剪切DNA双链而形成，或者3′-粘性末端通过两条互补的DNA单链退火成为DNA双链而形成、5′-粘性末端通过限制性内切酶剪切DNA双链而形成，或者5′-粘性末端通过两条互补的DNA单链退火成为DNA双链而形成、3′-粘性末端通过限制性内切酶剪切DNA双链而形成。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于DNA Linker上的3′-粘性末端是在固定化到固相界面上之前形成的、其他的3′-粘性末端是在同一DNA分子上的5′-粘性末端形成之后或者同时形成的。
18.根据权利要求15-17的任一项所述的方法，其特征在于步骤(4)中重复步骤(3)2-20次。
19.根据权利要求15-18的任一项所述的方法，其特征在于所述TALE连接单元为整数或非整数个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列，若干个TALE连接单元经过组装连接等一系列步骤后能够形成至少含有一个完整TALE单体的DNA序列。
20.根据权利要求15-19的任一项所述的方法，其特征在于所述TALE连接单元为0.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、1个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、1.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、2个TALE单体(TALEmonomer)的DNA序列、2.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、3个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、3.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、4个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、4.5个TALE单体(TALEmonomer)的DNA序列、5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列、5.5个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列或6个TALE单体(TALE monomer)的DNA序列。
21.根据权利要求15-20的任一项所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述将一段DNA衔接物(DNA Linker)固定化到固相界面上按如下步骤操作：在DNA Linker一端修饰生物素biotin，在固相界面上修饰链霉亲和素streptavidin，将上述修饰了biotin的DNALinker与修饰了链霉亲和素streptavidin的固相界面接触。或者按如下步骤操作：在DNA Linker一端修饰氨基-NH2，在固相界面上修饰羧基-COOH，将上述修饰了氨基-NH2的DNA Linker与修饰了羧基-COOH的固相界面接触并反应脱去一分子水。
22.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其特征在于所述固相界面包括磁性材料、硅、二氧化硅、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。
23.根据权利要求15-22的任一项所述的方法，其特征在于步骤(2)和(3)中所述洗脱未连接产物按如下步骤操作：a.固液分离；b.将分离得到的固相冲洗至少一次。
24.根据权利要求12-23的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA Linker为一段与TALE单体的DNA序列完全不相同的序列，或者所述DNA Linker为TALE单体的DNA序列的一部分或全部。
25.根据权利要求15-24的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA Linker具有20-500个核苷酸，优选具有30-200个核苷酸，进一步优选具有50-80个核苷酸。
26.根据权利要求15-25的任一项所述的方法，其特征在于所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶或Tag DNA连接酶。
27.一种核酸分子的固相合成方法，其特征在于将权利要求1-26任一项中的TALE连接单元替换为任意的DNA序列，并省略步骤(6)。
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