CN102964431A - 一对特异识别肌肉生长抑制素基因的多肽及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一对特异识别肌肉生长抑制素基因的多肽及其编码基因和应用。本发明提供的多肽对，由多肽甲和多肽乙组成；多肽甲中双连氨基酸依次如下：序列3的2-3、36-37、70-71、104-105、138-139、172-173、206-207、240-241、274-275、308-309、342-343、376-377、410-411、444-445、478-479和512-513；多肽乙中双连氨基酸依次如下：序列5的2-3、36-37、70-71、104-105、138-139、172-173、206-207、240-241、274-275、308-309、342-343、376-377、410-411、444-445、478-479、512-513和546-547。本发明提供的多肽对可以特异识别肌肉生长抑制素基因，对于在猪上对MSTN进行敲除或改造以获得优质高瘦肉率的猪种具有重大应用价值。

Description

一对特异识别肌肉生长抑制素基因的多肽及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一对特异识别肌肉生长抑制素基因的多肽及其编码基因和应用。
背景技术
肌肉生长抑制素（MSTN）是骨骼肌生长的负调控因子，在其活力消失后，动物会出现肌肉过度发育的症状，其肌肉纤维会增粗或数目增加，表现为出双肌臀症状。由于它是能决定肌肉器官大小的调控因子之一，因此在畜牧生产上有很好的应用价值和应用前景。很多科学家在猪上对该基因进行了深入的研究，期望通过在猪上对MSTN进行敲除或改造以获得优质高瘦肉率的猪种。
寻找一种能靶向修饰MSTN基因的技术相当重要。传统的打靶技术效率非常的低，其主要是依赖细胞内部的同源重组随机交换完成的，效率非常低。
近年来发展的主要方法为依托序列特异的核酸酶进行基因的精确修饰。序列特异的核酸酶主要由一个DNA识别域与一个能非特异性切割DNA的内切酶结构域连接而成。其主要原理为先由DNA识别域识别并结合到需要改造的DNA片段上，然后由与DNA相连的非特异性内切酶结构域对DNA进行切割，造成DNA的双链断裂（Double-strandbreak，DSB），DSB会激活DNA的自我修复而引起基因的突变从而促进该位点的同源重组。
锌指核酸酶技术（Zinc Finger Nuclease，ZFN）就是前一段所述的基因精确修饰技术，由一个特异性的DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。在ZFN识别结构域中，一个锌指结构可以特异识别多个(通常是3个)连续的碱基，多个锌指结构能够识别一连串的碱基。所以，在ZFN的设计过程中，锌指识别结构域的氨基酸序列是重点，特别是设计如何将多个赖氨酸2-组氨酸2（Cys2-His2）锌指蛋白串联，以及如何通过改变α螺旋的16氨基酸残基决定每个锌指蛋白识别的特定三联体碱基。
ZFN技术在基因靶向修饰方面的可行性使得其广泛应用于个体水平和细胞水平的基因修饰。首先人们通过利用ZFN技术实现了细胞水平的基因定向修饰。如Sangamo公司于2005年首次在人类培养细胞系中实现ZFN介导的基因打靶，2007年应用同样的ZFN通过同源重组基因实现了基因定点插入。最近，人们利用ZFN分别在人的iPS和ES细胞中实现了基因的靶向突变。
ZFN已经成功用于植物、斑马鱼、昆虫以及多种哺育动物的基因操作，但是仍然有很多问题有待解决，主要包括以下几个方面：（1）ZFN的制备过程繁琐、复杂、耗时长、价格昂贵（Sigma公司的一对ZFNs 20万元人民币，制备出1对ZFN通常需要2个月）；（2）不能保证所有的基因都能采用ZFN进行敲除，因为锌指库里的基因数目有限；（3）ZFN的细胞毒性，主要是非特异切割（脱靶切割）所带来的副作用。
相比之下，转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN）有更多优势，它是继锌指核酸酶技术以来的另一种能够对基因组进行高效定点修饰的新技术。转录因子激活效应物家族中有一种蛋白(TALEs)能够识别、结合DNA。TALE与DNA序列特异性结合主要是由TAL结构内34个恒定氨基酸序列介导。将TALEs与FokI核酸内切酶的切割域相连接，形成TALEN，从而可以实现对基因组DNA双链在特定位点进行修饰。
在TALE的中央存在着一个重复区域，这个区域通常是由33-35个氨基酸的数量可变的重复单元构成。重复序列结构域(Repeat Domain)负责识别特异性的DNA序列。每个重复序列基本上都是一样的，除了两个可变的氨基酸，即重复序列可变的双氨基酸残基(Repeat-Variable Diresidues,RVD)。TALE识别DNA的机制在于一个重复序列上的RVD能够识别DNA靶点上的一个核苷酸，再融合FokI核酸内切酶，组合成TALEN。TALEN是一种异源二聚体分子(两单位的TALE DNA结合结构域融合到一单位的催化性结构域)，能够切割两个相隔较近的序列，从而使得特异性增强。该酶的效率高，毒性小，制备周期短，成本低等优势越来越明显。
发明内容
本发明的目的是提供一对特异识别肌肉生长抑制素基因的多肽及其编码基因和应用。
本发明提供了一对特异识别肌肉生长抑制素基因的多肽（命名为特异多肽对），由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有两个双连氨基酸；所述多肽乙由17个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有两个双连氨基酸；
所述多肽甲中的16个双连氨基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第2-3位氨基酸残基、第36-37位氨基酸残基、第70-71位氨基酸残基、第104-105位氨基酸残基、第138-139位氨基酸残基、第172-173位氨基酸残基、第206-207位氨基酸残基、第240-241位氨基酸残基、第274-275位氨基酸残基、第308-309位氨基酸残基、第342-343位氨基酸残基、第376-377位氨基酸残基、第410-411位氨基酸残基、第444-445位氨基酸残基、第478-479位氨基酸残基和第512-513位氨基酸残基；
所述多肽乙中的17个双连氨基酸依次如下：序列表的序列5自N末端第2-3位氨基酸残基、第36-37位氨基酸残基、第70-71位氨基酸残基、第104-105位氨基酸残基、第138-139位氨基酸残基、第172-173位氨基酸残基、第206-207位氨基酸残基、第240-241位氨基酸残基、第274-275位氨基酸残基、第308-309位氨基酸残基、第342-343位氨基酸残基、第376-377位氨基酸残基、第410-411位氨基酸残基、第444-445位氨基酸残基、第478-479位氨基酸残基、第512-513位氨基酸残基和第546-547位氨基酸残基。
所述多肽甲具体可如序列表的序列3所示。
所述多肽乙具体可如序列表的序列5所示。
本发明还保护一对DNA分子（命名为特异DNA分子对），由编码所述多肽甲的DNA分子甲和编码所述多肽乙的DNA分子乙组成。
所述DNA分子甲中，编码所述多肽甲的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列2自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸和第1534-1539位核苷酸。
所述DNA分子乙中，编码所述多肽乙的17个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列4自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸、第1534-1539位核苷酸和第1636-1641位核苷酸。
所述DNA分子甲具体可如序列表的序列2所示。
所述DNA分子乙具体可如序列表的序列4所示。
本发明还保护一对质粒（命名为特异质粒对），由具有所述DNA分子甲的质粒甲和具有所述DNA分子乙的质粒乙组成。
所述质粒甲具体可为在pCS2-FokⅠ载体（PEAS型）的多克隆位点（如NheI酶切位点）插入所述DNA分子甲得到的重组质粒。
所述质粒乙具体可为在pCS2-Fok Ⅰ载体（PERR型）的多克隆位点（如NheI酶切位点）插入所述DNA分子乙得到的重组质粒。
本发明还保护所述特异多肽对在特异识别肌肉生长抑制素基因中的应用。所述肌肉生长抑制素基因可为猪的肌肉生长抑制素基因，具体可如序列表的序列1所示。
本发明还保护所述特异质粒对在特异切割肌肉生长抑制素基因中的应用。所述肌肉生长抑制素基因可为猪的肌肉生长抑制素基因，具体可如序列表的序列1所示。
本发明还保护所述特异质粒对在构建肌肉生长抑制素基因突变库中的应用。所述肌肉生长抑制素基因可为猪的肌肉生长抑制素基因，具体可如序列表的序列1所示。
本发明提供了特异识别肌肉生长抑制素基因的多肽对，并提供了该多肽对的编码基因。本发明同时提供了用于基因工程的质粒对，该质粒对由两个质粒组成，其中一个质粒表达一条多肽和PEAS型Fok I核酸内切酶的融合蛋白，另一个质粒表达另一条多肽和Fok I核酸内切酶（PERR型）的融合蛋白。将所述质粒对导入含有目的基因的细胞，可以使细胞中的目的基因被特异切割，在细胞自身修复系统的作用下，可以得到目的基因的突变库。本发明对于在猪上对MSTN进行敲除或改造以获得优质高瘦肉率的猪种具有重大应用价值。
附图说明
图1为四种质粒的结构示意图和工作原理示意图。
图2为重组质粒TALE-1L具有的串联模块及其构建过程的示意图。
图3为重组质粒TALE-1R具有的串联模块及其构建过程的示意图。
图4为重组质粒TALE-1L和重组质粒TALE-1R的PCR鉴定图。
图5为重组质粒TALE-1L和重组质粒TALE-1R的酶切鉴定图。
图6为重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R的构建流程图。
图7为重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R的PCR鉴定图。
图8为重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R的酶切鉴定图。
图9为重组质粒pSSA-MSTN的结构示意图。
图10为重组质粒pSSA-MSTN的工作原理示意图。
图11为PCR扩增产物的HindIII酶切图谱。
图12为重组核酸酶异二聚体识别靶点序列并切割目标DNA示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，如无特殊说明，均采用低糖DMEM培养基培养细胞。
pTALE-A：CWBIO，Cat No.CW2238。pTALE-G：CWBIO Cat No.CW2239。pTALE-C：CWBIO Cat No.CW2240。pTALE-T：CWBIO Cat No.CW2241。293T细胞系：CWBIO Cat No.CW2095。
pSSA载体（文献中的名称为“SSA reporter plasmid”）：参考文献：Heritable genetargeting in zebrafish using customized TALENs.Huang P,Xiao A,Zhou M,ZhuZ,Lin S,Zhang B.Nat Biotechnol.2011Aug 5;29(8):699-700.doi:10.1038/nbt.1939.。
Renilla luciferase质粒（文献中的名称为“Renilla plasmid”）：参考文献：Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.Huang P,XiaoA,Zhou M,Zhu Z,Lin S,Zhang B.Nat Biotechnol.2011Aug 5;29(8):699-700.doi:10.1038/nbt.1939.。
实施例1、TALE靶点识别模块的构建
一、四种模块以及将模块进行组合的机理描述
TAL的核酸识别单元为间隔32个恒定氨基酸序列的双连氨基酸。双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A、NG识别T、HD识别C、NN识别G。pTALE-A质粒、pTALE-G质粒、pTALE-C质粒和pTALE-T质粒为单模块载体，为分别具有上述四种TAL的核酸识别单元的编码DNA的质粒，且在编码DNA的5’末端具有Spe I酶切识别序列、3’末端具有连续的Nhe I酶切识别序列和Hind III识别序列。通过单模块载体上的Spe I、Nhe I和Hind III酶切位点按照靶点序列相对应的TAL单元即可串联克隆，其中右侧靶点序列需反向构建模块。四种质粒的结构示意图和工作原理示意图见图1。目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因，因为FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔14-18碱基）的靶序列（一般十几个碱基）分别进行TAL识别模块构建。
二、靶点的选择
MSTN基因的部分序列见序列表的序列1，其中自5’末端第615至995位核苷酸为第三外显子。首先通过大量序列分析和筛选工作将第三外显子作为初步选定的靶点，然后通过进一步筛选，将序列表的序列1自5’末端第713至767位核苷酸作为进一步选定的靶点，通过再次的筛选，将序列表的序列1自5’末端第714-729位核苷酸和第750-766位核苷酸作为最终的靶点。
三、重组质粒TALE-1L（左侧TALE模块）和重组质粒TALE-1R（右侧TALE模块）的构建
根据选定的靶点，用pTALE-A质粒、pTALE-G质粒、pTALE-C质粒和pTALE-T质粒构建重组质粒TALE-1L（具有图2所示的串联模块），构建过程见图2。根据选定的靶点，用pTALE-A质粒、pTALE-G质粒、pTALE-C质粒和pTALE-T质粒构建重组质粒TALE-1R（具有图3所示的串联模块），构建过程见图3。重组质粒TALE-1L识别16个核苷酸（CGTTACCCTCTAACTG），重组质粒TALE-1R识别17个核苷酸（GCAATAATCCAGTCCCA）。
重组质粒TALE-1L和重组质粒TALE-1R的PCR鉴定图见图4。PCR鉴定采用的引物对为对应载体骨架的M13-47和RV-M（M13-47:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；RV-M:5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’）。图4中，泳道8为重组质粒TALE-1L，泳道16为重组质粒TALE-1R，泳道M5为Trans 5K Marker（5k、3k、2k、1.5k、1k、800bp、500bp、300bp）。重组质粒TALE-1L的预期条带为1788bp左右，重组质粒TALE-1R的预期条带为1890bp左右，两个质粒均显示预期条带。
重组质粒TALE-1L和重组质粒TALE-1R的酶切鉴定图见图5（SpeI和NheI双酶切）。图5中，1和2为重组质粒TALE-1R（预期条带为1.7k左右），3为重组质粒TALE-1L（预期条带为1.6k左右），M2为Trans 2K plus Marker（5k、3k、2k、1k、750bp、500bp、250bp、100bp）。重组质粒TALE-1L和重组质粒TALE-1R的检测结果均呈阳性。
重组质粒TALE-1L和重组质粒TALE-1R统称重组质粒TALE。
四、重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R的构建
pCS2-FokⅠ载体：CWBIO，Cat No.CW2273；包括一对结构基本相同的质粒，pCS2-FokⅠ载体（PEAS型）和pCS2-FokⅠ载体（PERR型），pCS2-FokⅠ载体（PEAS型）又称PEAS型pCS2-FokⅠ载体，pCS2-FokⅠ载体（PERR型）又称PERR型pCS2-FokⅠ载体，pCS2-FokⅠ载体（PEAS型）和pCS2-FokⅠ载体（PERR型）的差异仅在于pCS2-FokⅠ载体（PEAS型）具有编码Fok I核酸内切酶（PEAS型）的DNA序列，pCS2-FokⅠ载体（PERR型）具有编码Fok I核酸内切酶（PERR型）的DNA序列；质粒的结构为：具有由sCMV启动子控制的、除目标基因靶点识别域外的TALEN必需元件、编码Fok I核酸内切酶（PEAS型或PERR型）的DNA序列，在编码TALE 0.5单元模块（RVD NG，识别T碱基）的DNA序列的5’端嵌有限制性内切酶NheI DNA的识别序列。Fok I核酸内切酶（PEAS型）和Fok I核酸内切酶（PERR型）形成2聚体后发挥内切酶的功能。
重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R统称pcs2-TALEN，构建流程图见图6。
1、用限制性内切酶Spe I和NheI双酶切重组质粒TALE-1L，回收约1600bp的DNA片段。
2、用限制性内切酶NheI酶切pCS2-Fok Ⅰ载体（PEAS型），回收约5500bp的载体骨架。
3、将步骤1得到的DNA片段和步骤2得到的载体骨架连接，得到重组质粒pcs2-TALE-peas-1L（左侧表达质粒）。根据测序结果，对重组质粒pcs2-TALE-peas-1L进行结构描述如下：在pCS2-FokⅠ载体（PEAS型）的NheI酶切位点插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子（序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的蛋白质；序列3中的双连氨基酸分别为：第2-3位氨基酸残基、第36-37位氨基酸残基、第70-71位氨基酸残基、第104-105位氨基酸残基、第138-139位氨基酸残基、第172-173位氨基酸残基、第206-207位氨基酸残基、第240-241位氨基酸残基、第274-275位氨基酸残基、第308-309位氨基酸残基、第342-343位氨基酸残基、第376-377位氨基酸残基、第410-411位氨基酸残基、第444-445位氨基酸残基、第478-479位氨基酸残基、第512-513位氨基酸残基）；重组质粒pcs2-TALE-peas-1L中，在CMV启动子的作用下，表达序列3所示蛋白质与Fok Ⅰ内切酶单体的融合蛋白（命名为融合蛋白-L），该融合蛋白中，序列3所示蛋白质位于N末端。
4、用限制性内切酶Spe I和NheI双酶切重组质粒TALE-1R，回收约1700bp的DNA片段。
5、用限制性内切酶NheI酶切pCS2-Fok Ⅰ载体（PERR型），回收约5500bp的载体骨架。
6、将步骤4得到的DNA片段和步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pcs2-TALE-peas-1R（右侧表达质粒）。根据测序结果，对重组质粒pcs2-TALE-peas-1R进行结构描述如下：在pCS2-Fok Ⅰ载体（PERR型）的NheI酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的DNA分子（序列表的序列4所示的DNA分子编码序列表的序列5所示的蛋白质；序列5中的双连氨基酸分别为：第2-3位氨基酸残基、第36-37位氨基酸残基、第70-71位氨基酸残基、第104-105位氨基酸残基、第138-139位氨基酸残基、第172-173位氨基酸残基、第206-207位氨基酸残基、第240-241位氨基酸残基、第274-275位氨基酸残基、第308-309位氨基酸残基、第342-343位氨基酸残基、第376-377位氨基酸残基、第410-411位氨基酸残基、第444-445位氨基酸残基、第478-479位氨基酸残基、第512-513位氨基酸残基、第546-547位氨基酸残基）；重组质粒pcs2-TALE-peas-1R中，在CMV启动子的作用下，表达序列5所示蛋白质与FokⅠ内切酶单体的融合蛋白（命名为融合蛋白-R），该融合蛋白中，序列5所示蛋白质位于N末端。
重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R的PCR鉴定图见图7。PCR鉴定重组质粒pcs2-TALE-peas-1L采用的引物对为对应载体骨架的GNNFor和63dn（GNN For:5’-AGTAACAATGGCAAACA-3’；63dn:5’-GGATCCGGCAACGCGATGGGATGTG-3’）。PCR鉴定重组质粒pcs2-TALE-peas-1R采用的引物对为对应载体骨架的AFor和63dn（AFor:5’-AGTAATATTGGTGGCAAACA-3’；63dn:5’-GGATCCGGCAACGCGATGGGATGTG-3’）。图7中，泳道8为重组质粒pcs2-TALE-peas-1L，泳道15为重组质粒pcs2-TALE-peas-1R，泳道M1为Trans 1K Marker（700bp 600bp 500bp 400bp 300bp200bp 100bp），泳道M2为Trans 2K plus Marker（5k 3k 2k 1k 750bp 500bp250bp 100bp）。重组质粒pcs2-TALE-peas-1L的预期条带为350bp左右，重组质粒pcs2-TALE-perr-1R的预期条带为350bp左右，两个质粒均显示预期条带。
重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R的酶切鉴定图见图8（KpnI和NheI双酶切）。图8中，3为重组质粒pcs2-TALE-peas-1L（预期条带为5.5k左右+2k左右），5为重组质粒pcs2-TALE-peas-1R（预期条带为5.5k左右+2.1k左右），M2为Trans 2K plus Marker（5k、3k、2k、1k、750bp、500bp、250bp、100bp），泳道M5为Trans 5K Marker（5k、3k、2k、1.5k、1k、800bp、500bp、300bp）。重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R的检测结果均呈阳性。
实施例2、报告质粒的构建
1、合成序列表的序列6所示的双链DNA分子（靶点片段）。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用mstnssaup和mstnssadn组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
mstnssaup:5’-AGTAGATCTGTGATTCAGGATCTATTGCTAC-3’；
mstnssadn:5’-AGTCTCGAGGCAGTAATTGGCCTTATATCT-3’。
3、用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切pSSA载体，回收约6500bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pSSA-MSTN（报告质粒）。根据测序结果，对重组质粒pSSA-MSTN进行结构描述如下：在pSSA载体的BglII和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列6所示的DNA分子（MSTN片段）。重组质粒pSSA-MSTN的结构示意图见图9，由CMV启动子控制的SSA报告基因(FireflyLuciferase，中文名称为萤火虫荧光素酶)被终止密码子和靶点片段分割两个870bp左右的片段（自上游至下游依次命名为片段甲和片段乙，片段甲的下游和片段乙的上游为同源臂）。将重组质粒pSSA-MSTN导入细胞后，因为片段甲和片段乙之间具有终止密码子和靶点片段组成的间隔区，只能显示很弱的Firefly Luciferase荧光信号。将重组质粒pSSA-MSTN导入细胞后，如果间隔区的DNA片段被敲除，片段甲和片段乙可以借助同源臂发生同源重组并形成有活性的Firefly Luciferase，使得FireflyLuciferase荧光信号显著增加，工作原理示意图见图10。
实施例3、通过荧光素酶报告基因法验证实施例1构建的质粒的TALEN活性
分别进行如下2组实验处理（每个实验处理进行三次重复实验，每次重复实验设置3个重复处理，结果取三个重复处理的平均值；转染试剂均为DNA Fect TransfectionReagentDNA转染试剂，CWBIO、Cat No.CW0860，每个处理中转染试剂的加入量为6ul，并按照说明书进行操作）：
第1组：将0.4ug Renilla luciferase质粒(参考对照质粒)和2.0ug重组质粒pSSA-MSTN共转染1×106293T细胞；
第2组：将0.4ug Renilla luciferase质粒(参考对照质粒)、2.0ug重组质粒pSSA-MSTN、4ug重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和4ug重组质粒pcs2-TALE-peas-1R共转染1×106293T细胞；
转染24小时后取各组的细胞进行裂解并检测荧光素酶的荧光信号（仪器为：Luminometer，DLReady，型号是TD-20/20），结果见表1。
表1各组处理的荧光信号（荧光强度）
Figure BDA00002516774100091
TALENs敲除效率=（第二组的F/R）：（第一组的F/R)=4.599，即重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R对靶点片段的敲除活性为4.599。
实施例4、通过测序验证实施例1构建的质粒的TALEN活性
PEF细胞(猪胎儿成纤维细胞)：从流产的猪胎儿中分离得到PEF细胞（分离方法参见文献：李红，魏红江，许成盛，汪霞，卿玉波，曾养志；版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特征；湖南农业大学学报(自然科学版)；第36卷第6期；2010年12月；678-682）。
1、将4ug重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和4ug重组质粒pcs2-TALE-peas-1R通过电转化的方式共转染1×106PEF细胞，得到重组细胞。
2、将步骤1得到的重组细胞30℃培养60小时，然后收集细胞。
3、提取步骤2收集的细胞的基因组DNA并作为模板，用MSup1与MSdn组成的引物对进行PCR扩增，回收约370bp的PCR扩增产物。
MSup1：5’-ttgctactattaactcttctttca-3’；
MSdn：5’-tatattatttgttctttgccatta-3’。
猪基因组DNA中，融合蛋白-L和融合蛋白-R的识别区域之间具有HindIII酶切位点，被HindIII酶切后产生约130bp和约240bp的两个片段。当基因组DNA中的MSTN基因片段被上述两个融合蛋白识别后，所述识别区域之间DNA片段会被切除从而失去HindIII酶切位点。
PCR扩增产物的HindIII酶切图谱见图12。图12中，1为PCR扩增产物的酶切产物，M为分子量标记。结果表明，部分PCR扩增产物不能被HindIII酶切，原因在于PCR扩增产物被融合蛋白-L和融合蛋白-R识别，且识别区域之间的DNA片段被切除并通过细胞的自身修复发生了突变。
4、回收步骤3得到的PCR扩增产物并与PMD-18T载体（宝生物，货号：D101A）连接，得到连接产物。
5、将步骤4得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α（宝生物，D9057S）感受态细胞，然后涂布于含500mg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板上进行培养，随机挑取100个克隆并进行测序，计算突变的克隆占总体克隆数的比例，从而估算出该对TALEN质粒的效率。发现25个克隆在切割位点附近在出现突变，即重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和4ug重组质粒pcs2-TALE-peas-1R组成的TALEN质粒对在细胞基因组中的切割效率高达25%。
重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R的工作原理见图11，两种带有Fok I功能域的靶向TALE核酸酶分别在CMV启动子控制下高效表达，并进入细胞核内，与相应的靶点DNA链发生特异性结合。Fok Ⅰ核酸内切酶成二聚体行驶DNA切割活性，切断目标基因DNA双链。
Figure IDA00002516775000011
Figure IDA00002516775000021
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Figure IDA00002516775000101

Claims (10)

1.一对多肽，由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有两个双连氨基酸；所述多肽乙由17个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有两个双连氨基酸；
所述多肽甲中的16个双连氨基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第2-3位氨基酸残基、第36-37位氨基酸残基、第70-71位氨基酸残基、第104-105位氨基酸残基、第138-139位氨基酸残基、第172-173位氨基酸残基、第206-207位氨基酸残基、第240-241位氨基酸残基、第274-275位氨基酸残基、第308-309位氨基酸残基、第342-343位氨基酸残基、第376-377位氨基酸残基、第410-411位氨基酸残基、第444-445位氨基酸残基、第478-479位氨基酸残基和第512-513位氨基酸残基；
所述多肽乙中的17个双连氨基酸依次如下：序列表的序列5自N末端第2-3位氨基酸残基、第36-37位氨基酸残基、第70-71位氨基酸残基、第104-105位氨基酸残基、第138-139位氨基酸残基、第172-173位氨基酸残基、第206-207位氨基酸残基、第240-241位氨基酸残基、第274-275位氨基酸残基、第308-309位氨基酸残基、第342-343位氨基酸残基、第376-377位氨基酸残基、第410-411位氨基酸残基、第444-445位氨基酸残基、第478-479位氨基酸残基、第512-513位氨基酸残基和第546-547位氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的多肽对，其特征在于：所述多肽甲如序列表的序列3所示；所述多肽乙如序列表的序列5所示。
3.一对DNA分子，由编码权利要求1中的所述多肽甲的DNA分子甲和编码权利要求1中的所述多肽乙的DNA分子乙组成。
4.如权利要求3所述的一对DNA分子，其特征在于：
所述DNA分子甲中，编码所述多肽甲的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列2自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸和第1534-1539位核苷酸。
所述DNA分子乙中，编码所述多肽乙的17个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列4自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸、第1534-1539位核苷酸和第1636-1641位核苷酸。
5.如权利要求4所述的一对DNA分子，其特征在于：所述DNA分子甲如序列表的序列2所示；所述DNA分子乙如序列表的序列4所示。
6.一对质粒，由质粒甲和质粒乙组成；所述质粒甲为具有权利要求3或4或5中所述的DNA分子甲的质粒；所述质粒乙为具有权利要求3或4或5中所述的质粒乙的质粒。
7.如权利要求6所述的一对质粒，其特征在于：所述质粒甲是在PEAS型pCS2-FokⅠ载体的多克隆位点插入所述DNA分子甲得到的重组质粒；所述质粒乙是在PERR型pCS2-FokⅠ载体的多克隆位点插入所述DNA分子乙得到的重组质粒。
8.权利要求1所述的一对多肽在特异识别肌肉生长抑制素基因中的应用。
9.权利要求7所述的一对质粒在特异切割肌肉生长抑制素基因中的应用。
10.权利要求7所述的一对质粒在构建肌肉生长抑制素基因突变库中的应用。
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