CN103865898B - 一对特异识别绵羊mmp2基因的多肽及其编码基因和应用 - Google Patents

一对特异识别绵羊mmp2基因的多肽及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一对特异识别绵羊MMP2基因的多肽，其由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸；所述多肽乙由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸。本发明可实现在细胞或个体水平上对绵羊MMP2基因进行敲除或修饰，以解析绵羊MMP2基因的功能、构建绵羊MMP2基因突变库或获得相关疾病模型，为绵羊育种及医药研发服务。

Description

一对特异识别绵羊MMP2基因的多肽及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一对特异识别绵羊MMP2基因的多肽及其编码基因和应用。
背景技术
MMPs是一个重要的蛋白酶家族，含有锌离子和活性位点保守的蛋氨酸残基(Bodeet al.，1993；Stocker et al.，1995)。一系列类似的蛋白酶被发现(人类中发现23种，小鼠有24种)。MMPs曾经被认为主要在细胞外基质结构成分的降解中发挥作用。然而，最近研究发现，MMPs参与众多生理和病理学过程(Page-McCaw et al.，2007)，他们会影响细胞移行，产生有生物学功能的底物切割片段，通过作用于细胞外基质和细胞间黏结，活化、失活信号分子或改变信号分子的活性，来调节组织重构。在几乎所有人类癌症和过敏性炎症反应中，MMPs的表达均上调(Egeblad and Werb，2002；Becky Kelly et al.，2000)。多项研究表明，MMPs参与肺脏疾病的病理过程(Zheng et al.，2000；Kumagai et al.，1999；Holla etal.，2000；Cataldo et al.，2000)，也促进内皮基质膜附近的炎症细胞的聚集(Haas andMadri，1999；Madri et al.，1996)。
MMP-2是MMP家族的重要成员之一，是基底膜的主要结构成分。此酶也影响生长因子结合蛋白和生长因子受体的活性。MMP-2能够切割IGF结合蛋白并释放IGFs(Sternlichtand Werb，1999)，刺激细胞增殖，抑制凋亡。MMP-2敲除小鼠表型明显：剧烈的哮喘症状，由过敏源引起的窒息(Corry et al.，2002)；体型变小(Itoh et al.，1997)；血管新生缺陷(Kato et al.，2001)，等等。MMP-2在炎症和免疫方面发挥着至关重要的作用。它影响被招募免疫细胞的清除，削弱炎症反应(Corry et al.，2002)。MMP-2参与建立趋化梯度，在防止窒息致死中发挥作用。
基因表达谱芯片研究结果显示，敖汉细毛羊被毛丰富的体侧部皮肤MMP2基因的表达量相对于腹股沟部(无被毛)下调13.52倍，这一结果通过定量PCR得到了验证(Zhao etal.，2012)。
综上所述，MMP2基因可作为绵羊抗病育种及羊毛细度育种的一个重要候选基因。在细胞或个体水平上对绵羊MMP2基因进行敲除或修饰，可解析绵羊MMP2基因的功能，为绵羊育种及医药研发服务。
转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectornucleases，TALENs)技术是一个高效的基因打靶新工具。转录因子激活效应物家族中有一种蛋白(TALEs)能够识别、结合DNA。TALE与DNA序列特异性结合主要是由TAL结构内34个恒定氨基酸序列介导。将TALEs与FokI核酸内切酶的切割域相连接，形成TALENs，从而可以实现对基因组DNA序列的精确修饰。TALENs是一种异源二聚体分子(两单位的TALE DNA结合结构域融合到一单位的催化性结构域)，能够切割两个相隔较近的序列，从而使得特异性增强。
发明内容
本发明的目的是提供一对特异识别绵羊MMP2基因的多肽及其编码基因和应用。本发明利用这对多肽构建获得的一对重组的转录激活子样效应因子(TALE)能够特异性地识别绵羊MMP2基因。本发明还利用这对转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)，能够对绵羊MMP2基因进行准确、高效地靶向修饰。
具体地，本发明的目的是这样实现的：
一对特异识别绵羊MMP2基因的多肽(命名为特异多肽对)，由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸；所述多肽乙由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸；
所述多肽甲中的16个双连氨基酸依次如下：序列表的序列2自N末端第12-13位氨基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残基、第148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、第250-251位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第352-353位氨基酸残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455位氨基酸残基、第488-489位氨基酸残基和第522-523位氨基酸残基；
所述多肽乙中的16个双连氨基酸依次如下：序列表的序列4自N末端第12-13位氨基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残基、第148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、第250-251位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第352-353位氨基酸残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455位氨基酸残基、第488-489位氨基酸残基和第522-523位氨基酸残基。
所述多肽甲的氨基酸序列具体可如序列表中的序列2所示。
所述多肽乙的氨基酸序列具体可如序列表中的序列4所示。
本发明还保护一对DNA分子(命名为特异DNA分子对)，由编码所述多肽甲的DNA分子甲和编码所述多肽乙的DNA分子乙组成。
所述DNA分子甲中，编码所述多肽甲的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列4自5’末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸和第1564-1569位核苷酸；
所述DNA分子乙中，编码所述多肽乙的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列4自5’末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸和第1564-1569位核苷酸。
所述DNA分子甲的核苷酸序列具体可如序列表中的序列1所示。
所述DNA分子乙的核苷酸序列具体可如序列表中的序列3所示。
本发明还保护所述特异多肽对在特异识别和靶向修饰绵羊MMP2基因中的应用。所述绵羊MMP2基因，其NCBI Gene ID为261244993。
本发明还保护所述特异多肽对在构建绵羊MMP2基因突变库中的应用。所述绵羊MMP2基因，其NCBI Gene ID为261244993。
与现有技术相比，本发明提供了特异识别绵羊MMP2基因的多肽对，并提供了该多肽对的编码基因。本发明可实现在细胞或个体水平上对绵羊MMP2基因进行敲除或修饰，以解析绵羊MMP2基因的功能、构建绵羊MMP2基因突变库或获得相关疾病模型，为绵羊育种及医药研发服务。
附图说明
图1为TALENs靶点设计结果示意图。
图2为TALEN质粒对(左臂TALEN和右臂TALEN)转染绵羊SEF细胞60小时后提取DNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果(突变序列)。
图3为TALEN质粒对的工作原理示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，如无特殊说明，均采用低糖DMEM培养基培养细胞。
FastTALETM TALEN快速构建试剂盒：上海斯丹赛生物技术有限公司，Cat No.1802-030。该试剂盒包含两个模块板：模块板1包含96个模块，每个模块识别连续的两个碱基；模块板2包含76个模块，其中48个模块识别连续的两个碱基，28个模块识别单个碱基。另外，该试剂盒还包括其他组分：溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5、感受态细胞、SOC培养基、ddH2O；TALEN骨架载体，包括左臂骨架和右臂骨架。
实施例1、TALENs质粒对的构建
1、TALENs靶点设计
采用在线软件(https://tale-nt.cac.cornell.edu)设计。将绵羊MMP2基因CDS序列(NCBI Gene ID为261244993)输入软件中，在161-213bp区域找到靶序列，具体示意图如图1所示。TALENs左臂识别序列是5’-ACCTAAACACTTTCTA-3’，右臂识别序列是5’-CAGCACAAACAAGTTA-3’。
2、TALENs模块组装
依照FastTALETM TALEN快速构建试剂盒(以下简称“试剂盒”)说明书进行。具体步骤如下：
1)将左右臂识别序列分别拆分为9个模块，以一个或两个碱基组合为一个模块，依次进行标记，如首个标记为1，最后一个标记为9，如下所示：
左臂L5：A1 C2 CT3 AA4 AC5 AC6 TT7 TC8 TA9(使用骨架载体L16)
右臂R5：C1 AG2 CA3 C4 AA5 AC6 AA7 GT8 TA9(使用骨架载体R12)
2)从试剂盒中取出相应编号的9个模块，每个模块取1.5微升，并将其加入同一个PCR管中。
3)将溶液1、溶液2从-20℃冰箱取出置于冰盒上，溶液3放置于37℃水浴锅中溶解。
4)按如下体系加样，先加入相应的TALEN骨架载体(L16或R12)，然后将溶液3、溶液1、溶液2依次加入步骤2的PCR管中，最后加水补至20微升，短暂离心混匀。
连接体系：
5)将上述PCR管放入PCR仪中进行连接反应(关掉PCR仪热盖温度)。
连接程序如下：
6)取出PCR管，将溶液4(1微升)、溶液5(0.5微升)依次加入该管中，混匀，在PCR仪中37℃孵育一小时。
7)将步骤6的最终产物(20微升)加入含感受态细胞(试剂盒组分)的EP管中，混匀，在冰上放置30分钟，然后放入42℃水浴锅中热激45秒，在迅速放置于冰上3分钟。
8)在超净工作台中向上一步的EP管中加入500微升SOC溶液(试剂盒组分)，置于37℃、250rpm的摇床中培养30分钟。
9)将上一步的EP管取出，4000rpm离心5分钟。
10)在超净工作台中弃去EP管中的大部分上清，留下约100微升，并将沉淀轻轻吹打均匀，均匀涂布于卡那霉素抗性的平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时。
11)次日挑取10个单克隆，将单克隆接种于装有5毫升LB培养液(含卡那霉素)的15毫升离心管中，在37℃、250rpm的摇床中培养16小时。
12)将上一步所得单克隆菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。测序正向引物为5’-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3’，测序反向引物为5’-AGCTGGGCCACGATTGAC-3’。所得一对质粒命名为左臂TALEN和右臂TALEN。左臂TALEN质粒测序所得序列为序列表所示序列1，右臂TALEN质粒测序所得序列为序列表所示序列3。
实施例2、通过测序验证实施例1构建的TALENs对的活性
绵羊胎儿成纤维细胞(SEF)：分离培养方法参见文献：孟凡华，肖红梅，张东，周欢敏.蒙古绵羊胎儿皮肤成纤维细胞分离培养与特性分析.《中国畜牧兽医》2012年第3期，136-140.
1、将重组质粒左臂TALEN和右臂TALEN各4μg通过电转化的方式共转染1×106SEF细胞，得到重组细胞。
2、将步骤1得到的重组细胞30℃培养60小时，然后收集细胞。
3、提取步骤2收集的细胞的基因组DNA并作为模板，用PCRF与PCRR组成的引物对进行PCR扩增，回收222bp的PCR扩增产物。
PCRF：5’-GCAATACCTAAACACTTTCT-3’；
PCRR：5’-GTGATCTGGTTCTTGTCC-3’。
4、将步骤3得到的PCR扩增产物与pMD18-T载体(宝生物，货号：D101A)连接，得到连接产物。
5、将步骤4得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(宝生物，D9057S)，然后涂布于氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养，随机挑取100个克隆并进行测序，计算突变的克隆占总体克隆数的比例，从而估算出该对TALEN质粒的效率。结果发现3个克隆在预期切割位点附近出现突变(详见图2)，即重组质粒左臂TALEN和右臂TALEN组成的TALEN质粒对在SEF细胞基因组中的切割效率达3％。
重组质粒左臂TALEN和右臂TALEN的工作原理见图3，两种带有Fok I功能域的靶向TALE核酸酶分别在CMV启动子控制下高效表达，并进入细胞核内，与相应的靶点DNA发生特异性结合，使得Fok I核酸内切酶形成二聚体行使DNA切割活性，切断目标基因DNA双链。

Claims (6)

1.一对特异识别绵羊MMP2基因的多肽，由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸；所述多肽乙由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸；
所述多肽甲中的16个双连氨基酸依次如下：序列表的序列2自N末端第12-13位氨基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残基、第148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、第250-251位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第352-353位氨基酸残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455位氨基酸残基、第488-489位氨基酸残基和第522-523位氨基酸残基；
所述多肽乙中的16个双连氨基酸依次如下：序列表的序列4自N末端第12-13位氨基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残基、第148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、第250-251位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第352-353位氨基酸残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455位氨基酸残基、第488-489位氨基酸残基和第522-523位氨基酸残基。
所述多肽甲的氨基酸序列如序列表中的序列2所示；所述多肽乙的氨基酸序列如序列表中的序列4所示。
2.一对DNA分子，由编码权利要求1中的所述多肽甲的DNA分子甲和编码权利要求1中的所述多肽乙的DNA分子乙组成。
3.如权利要求2所述的一对DNA分子，其特征在于：
所述DNA分子甲中，编码所述多肽甲的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列1自5’末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸和第1564-1569位核苷酸；
所述DNA分子乙中，编码所述多肽乙的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列3自5’末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸和第1564-1569位核苷酸。
4.如权利要求3所述的一对DNA分子，其特征在于：所述DNA分子甲的核苷酸序列如序列表中的序列1所示，所述DNA分子乙的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。
5.权利要求1所述的一对多肽在特异识别和靶向修饰绵羊MMP2基因中的应用。
6.权利要求1所述的一对多肽在构建绵羊MMP2基因突变库中的应用。
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