CN105264085B - 合成核酸的方法和设备 - Google Patents

Abstract

本发明提供改进的使用酶和特别设计的核苷酸类似物合成如DNA和RNA的聚核苷酸的方法。使用本发明方法，特异性聚核苷酸序列可以在水性环境中在不使用核酸模板下一个碱基接一个碱基地从头合成。因为所述核苷酸类似物具有未经修饰的3'OH，即如“天然”脱氧核糖和核糖分子中所见，所以所述类似物产生适用于并入到生物系统中的天然聚核苷酸。

Description

合成核酸的方法和设备

相关申请

本申请要求2013年10月17日提交的美国专利申请第14/056，687号、2013年4月2日提交的美国临时申请第61/807,327号以及2013年10月15日提交的美国临时申请第61/891,162号，所述申请均以全文引用的方式并入。

技术领域

本发明涉及合成具有所需序列的聚核苷酸(从头)且不需要模板的方法和设备。由此，本发明能够制造具有变化序列和变化长度的聚核苷酸文库以用于研究、基因工程改造以及基因疗法。

背景技术

基因工程需要确定基因物质的含量的工具以及构筑所需基因物质的工具。确定基因物质的含量的工具使得可以在低于$1,000下在约一天内对整个人类基因组测序。(参见生命技术，新闻稿：Benchtop Ion Proton^TM测序仪，2012年1月10日(Life Technologies,Press Release: Benchtop Ion Proton^TMSequencer,January 10,2012))。相反，构筑所需基因物质(例如从头DNA合成)的工具并未同步改进。作为参照点，在过去的25年，小核酸从头合成的成本(每个碱基)下降10倍，同时核酸测序的成本(每个碱基)下降10,000,000倍以上。DNA合成缺乏进展目前限制了转译基因组学的步伐，即，由此确定个别序列变异的作用并且用以改进治疗性治疗。

目前，大多数新生核酸序列使用30多年前研发的固相亚磷酰胺技术合成。所述技术涉及由与天然(或非天然)核酸碱基对应的亚磷酰胺试剂构建的序列的依序去保护和合成。亚磷酰胺核酸合成长度受限，然而，这是因为长度大于200个碱基对(bp)的核酸会历经高断裂率和副反应。另外，亚磷酰胺合成会产生有毒副产物，并且这一废弃物的处置限制核酸合成器的可用性，并且增加合同寡核苷酸生产成本。(估计每年对寡核苷酸合成的需要会造成大于300,000加仑的有害化学废弃物，包括乙腈、三氯乙酸、甲苯、四氢呋喃以及吡啶。参见勒普罗斯特(LeProust)等人，核酸研究，第38(8)卷，第2522-2540页，(2010)(Nucleic Acids Res.,vol.38(8),p.2522-2540,(2010))，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，需要更有效并且更具成本效益的寡核苷酸合成方法。

发明内容

本发明提供改进的核酸合成方法。本发明方法提供更快并且更长的聚核苷酸从头合成。由此，本发明大大减少合成定制核酸的总成本。本发明方法是针对使用核苷酸转移酶来并入具有未经修饰的3'羟基和可裂解封端基团的核苷酸类似物而不依赖模板地合成聚核苷酸。由于存在封端基团，合成因添加每一新的碱基而停顿，因此封端基团发生裂解，从而留下聚核苷酸，其与天然存在的核苷酸(即，通过酶识别为用于进一步核苷酸并入的底物)实质上相同。

本发明另外包括利用本发明方法产生定制聚核苷酸的设备。本发明的设备包括提供水性条件的一个或多个生物反应器和多个核苷酸类似物来源。生物反应器可以为例如储槽、流槽或多孔板。以固体支撑物起始，通过经由核苷酸转移酶(例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或无模板指向使DNA或RNA链伸长的任何其它酶)的天然活性添加连续核苷酸使聚核苷酸生长于反应器中。在封端基团裂解时，天然聚核苷酸暴露于固体支撑物上。一旦序列完整，支撑物就会裂解掉，留下聚核苷酸，其实质上相当于自然界中所见的聚核苷酸。在一些实施例中，将设备设计为通过在核苷酸添加之后回收溶液并且将溶液再用于子序列核苷酸添加来回收利用核苷酸类似物溶液。因此，产生较少废弃物，并且，与目前先进技术方法相比每个碱基的总成本降低。

所属领域的技术人员在考虑以下图式和具体实施方式后将显而易知本发明的其它方面。

附图说明

图1A展示在N-4位连接有可裂解终止子的一种脱氧胞苷三磷酸(dCTP)类似物；

图1B展示来自图1A的dCTP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”dCTP和环状离去分子；

图2A展示在N-6位连接有可裂解终止子的一种脱氧腺苷三磷酸(dATP)类似物；

图2B展示来自图2A的dATP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”dATP和环状离去分子；

图3A展示在N-2位连接有可裂解终止子的一种脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)类似物；

图3B展示来自图3A的dGTP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”dGTP和环状离去分子；

图4A展示在N-3位连接有可裂解终止子的一种脱氧胸苷三磷酸(dTTP)类似物；

图4B展示来自图4A的dTTP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”dTTP和环状离去分子；

图5A展示在N-3位连接有可裂解终止子的一种脱氧尿苷三磷酸(dUTP)类似物；

图5B展示来自图5A的dUTP类似物的可裂解终止子裂解以获得dUTP和环状离去分子；

图6展示例示性脱氧胞苷三磷酸(dCTP)类似物，其具有使封阻Asp-Asp分子连接到脱氧胞苷的N-4位的施陶丁格(Staudinger)连接子并且随后在水性条件下使施陶丁格连接子裂解以获得dCTP和离去基；

图7A展示在N-4位连接有可裂解终止子的一种胞嘧啶核苷三磷酸(rCTP)类似物；

图7B展示来自图7A的rCTP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”rCTP和环状离去分子；

图8A展示在N-6位连接有可裂解终止子的一种腺苷三磷酸(rATP)类似物；

图8B展示来自图8A的rATP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”rATP和环状离去分子；

图9A展示在N-2位连接有可裂解终止子的n种鸟苷三磷酸(rGTP)类似物；

图9B展示来自图9A的rGTP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”rGTP和环状离去分子；

图10A展示在N-3位连接有可裂解终止子的一种胸苷三磷酸(rTTP)类似物；

图10B展示来自图10A的rTTP类似物的可裂解终止子裂解以获得“天然”rTTP和环状离去分子；

图11A展示在N-3位连接有可裂解终止子的一种尿苷三磷酸(rUTP)类似物；

图11B展示来自图11A的rUTP类似物的可裂解终止子裂解以获得rUTP和环状离去分子；

图12展示例示性胞嘧啶核苷三磷酸(rCTP)类似物，其具有使封阻Asp-Asp分子连接到胞嘧啶核苷的N-4位的施陶丁格连接子并且随后在水性条件下使施陶丁格连接子裂解以获得rCTP和离去基；

图13展示例示性末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的聚核苷酸合成循环，其包括：(a)并入包含可裂解终止子的核苷三磷酸类似物dN*TP-OH，(b)去除封端封阻基团(由*所示)，因此使得下一个dN*TP-OH并入，其中N＝A、G、C或T。

具体实施方式

本发明提供改进的使用酶和核苷酸类似物合成如DNA和RNA的聚核苷酸的方法。使用所公开的方法，特异性聚核苷酸序列可以在水性环境中在不使用核酸模板下一个碱基接一个碱基地从头合成。另外，因为核苷酸类似物具有未经修饰的3'羟基，即如“天然”脱氧核糖和核糖分子中所见，所以所述类似物在从碱基去除可裂解封阻基团时产生“天然”核苷酸。还可以使用其它核苷酸类似物，其例如包括自消除连接子或具有经修饰磷酸基的核苷酸。在大多数情况下，封阻基团经设计不会留下大量其它分子，即经设计以留下通过酶识别为“天然”核苷酸的“无瘢痕”核苷酸。因此，在合成结束时，在去除最后一个封阻基团时，合成的聚核苷酸从化学性和结构上相当于具有相同序列的天然存在的聚核苷酸。因此，可以将合成聚核苷酸并入到生命系统中，不用担心合成的聚核苷酸会干扰生物化学途径或代谢。

本发明的方法和类似物可以用于有用寡核苷酸和寡脱氧核苷酸，尤其长寡核苷酸(<5000nt)的非模板化酶促合成。视所用起始子而定，产物可以为单链或部分双链的。长寡核苷酸的合成需要高效并入和高效可逆终止子去除。结合于固体支撑物的起始子由短单链DNA序列组成，所述短单链DNA序列为一小段用户定义的序列或从其去除用户定义的单链产物的通用起始子。

一方面，所公开的方法采用可商购的核苷酸转移酶(如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT))以逐步方式从核苷酸类似物合成聚核苷酸。核苷酸类似物具有以下形式：

NTP-连接子-抑制因子

其中NTP为核苷三磷酸(即dNTP或rNTP)，连接子为碱基的吡啶或嘧啶之间的可裂解连接子，并且抑制因子为防止酶将随后的核苷酸并入的基团。在每一步，将新的核苷酸类似物并入到生长聚核苷酸链中，因此通过抑制因子基团阻止酶添加其它核苷酸。一旦酶停止，可以从生长链去除过量核苷酸类似物，可以从NTP裂解抑制因子，并且可以引入新的核苷酸类似物以将下一个核苷酸添加到链中。通过依序重复所述步骤，有可能快速构造所需长度和序列的核苷酸序列。聚核苷酸合成使用核苷酸转移酶的优势包括：1)在不依赖模板的聚合中使用单链(ss)起始引子的3'-延伸活动，2)能以高度有效的方式延伸引子致使添加数千个核苷酸，和3)接受多种经修饰和经取代的NTP作为有效底物。此外，本发明可以利用作为核苷酸转移酶的底物的起始子序列。起始子连接到固体支撑物并且充当酶的结合位点。起始子优选地为酶的通用起始子，如均聚物序列，并且可在固体支撑物上再循环，形成的寡核苷酸可从起始子裂解。

本发明方法非常适合于目前使用合成核酸，例如亚磷酰胺合成的DNA寡核苷酸的多种应用。举例来说，由本发明方法合成的聚核苷酸可以用作核酸扩增的引子、侦测特异性标记的杂交探针并且用于并入到质粒中进行基因工程改造。然而，因为所公开的方法以更快的速率并且在水性环境中产生更长的合成核苷酸串，所以所公开的方法又适于高产量应用，如在细胞分析中针对遗传变异的表达进行筛选，以及合成生物学。此外，本发明方法将提供下一代应用所需的功能性，如使用DNA作为合成读/写存储器，或产生完全(或部分)从DNA合成的宏观物质。

本发明和本文所述的系统提供包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的聚核苷酸的合成。尽管如DNA和RNA的“天然”核苷酸的合成途径已描述于例如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)以及尿嘧啶(U)的常见核酸碱基的情况下，但应了解本发明方法可以用于所谓的“非天然”核苷酸，包括并入有通用碱基的核苷酸，如3-硝基吡咯2'-脱氧核苷和5-硝基吲哚2'-脱氧核苷、α硫代磷酸酯、硫代磷酸酯核苷三磷酸，或具有其它所需特性(如萤光)的嘌呤或嘧啶结合物。嘌呤和嘧啶碱基的其它实例包括吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-α-硫胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基(例如8-溴)、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基、尤其5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、脱氮腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑[1,5-a]1,3,5三嗪酮、9-脱氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡嗪、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡嗪-2-酮、1,2,4-三嗪、哒嗪；和1,3,5三嗪。在一些情况下，可以用于产生具有无反应但大致等效碱基的核苷酸序列，即碱基不与其它蛋白质(即转录酶)反应，因此使序列信息的影响与碱基的结构效果分离。

类似物

本发明提供具有式NTP-连接子-抑制因子的核苷酸类似物以在水性环境中合成聚核苷酸。关于式NTP-连接子-抑制因子的类似物，NTP可以为任何核苷三磷酸，如腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)、胸苷三磷酸(TTP)、尿苷三磷酸(UTP)、核苷三磷酸酯、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)或脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。

连接子可以为使抑制因子连接到NTP的任何分子部分，并且可以发生裂解，例如化学裂解、电化学裂解、酶促裂解或光解裂解。举例来说，连接子可以通过调节周围环境的pH值来裂解。连接子还可以通过在既定温度下活化但在另一温度下失活的酶来裂解。在一些实施例中，连接子包括二硫键。

连接子可以例如在下胞嘧啶的N4、胸腺嘧啶的N3或O4、鸟嘌呤的N2或N3以及腺嘌呤的N6、或尿嘧啶的N3或O4处连接，这是因为碳处的连接导致在去除聚合酶抑制性基团之后存在残余瘢痕。连接子典型地为约至少约10埃长，例如至少约20埃长，例如至少约25埃长，因此使抑制因子离吡啶或嘧啶足够远以使酶将NTP经由所连接的糖主链结合到聚核苷酸链。在一些实施例中，可裂解连接子自环化，因为其形成对生长核苷酸链尤其无反应性的环分子。

核苷酸类似物可以包括抑制通过酶使随后的核苷酸发生偶联的连接到NTP的任何部分。抑制性基团可以为带电基团，如带电荷氨基酸，或抑制性基团可以为视环境条件而变的带电的基团。在一些实施例中，抑制因子可以包括带负电或能够带负电的部分。在其他实施例中，抑制因子基团带正电或能够带正电。在一些其他实施例中，抑制因子为氨基酸或氨基酸类似物。抑制因子可以为具有2到20个氨基酸单元的肽或类似物、具有2到10个氨基酸单元的肽或类似物、具有3到7个氨基酸单元的肽或类似物、具有3到5个氨基酸单元的肽或类似物。在一些实施例中，抑制因子包括选自由以下组成的群组的基团：Glu、Asp、Arg、His和Lys以及其组合(例如Arg、Arg-Arg、Asp、Asp-Asp、Asp、Glu、Glu-Glu、Asp-Glu-Asp、Asp-Asp-Glu或AspAspAspAsp等)。肽或基团可以为相同或不同氨基酸或类似物的组合。抑制性基团还可以包括与酶活性位点中的残基反应的基团，因此干扰通过酶使随后的核苷酸发生偶联。

NTP-连接子-抑制因子型核苷酸类似物的实例示于图1A中。图1A中的类似物包括经由二硫(-S-S-)键连接到dCTP的N4位的抑制性(-Asp-Asp-)基团，同时在糖环上提供为未封阻、未经修饰的3'-OH。连接子经构筑以使得所有连接子原子(包括第2并入抑制部分)均可以去除，由此使初生DNA链恢复到天然核苷酸。如图1B中所示，还原剂水溶液，如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)可以用以裂解-S-S-键，从而致使抑制因子功能(解封)损失。如图1B中所示，可以并入自环化连接子，产生在核苷酸合成结束时容易从试剂溶液去除的环状氧化四氢噻吩离去基。

下文展示合成图1A的dCTP类似物的例示性流程：

以与图1类似的方式，NTP-连接子-抑制因子型核苷酸类似物还可以由将连接子-抑制因子部分连接到腺嘌呤的N6(图2)、鸟嘌呤的N2(图3)、胸腺嘧啶的N3(图4)或尿嘧啶的N3(图5)来形成，由此提供“天然存在的”dNTP的类似物以及脱氧尿嘧啶核苷酸(dUTP)。尽管不大可能广泛使用dUTP，但根据化学方法合成为简单的。

本发明不限于流程1的连接化学方法，然而，还可以使用氨基甲酸酯、酰胺或其它自消除键联。举例来说，如流程2中所示，核苷酸还可以由施陶丁格连接子来制备。

由Asp-Asp封阻基团的施陶丁格连接子(流程2)产生的脱氧胞苷三磷酸(dCTP)类似物示于图6中。如图6中所示，施陶丁格dCTP类似物在水性条件下由添加叠氮化物和三苯基膦经历裂解。图6中所示的施陶丁格类似物还适用于如上文所述和图1-5中所例示的使用核苷酸转移酶(如TdT)进行核苷酸延伸。尽管图中未明确展示，但所属领域的技术人员可以视完整从头核苷酸合成所需用流程2以及适合的反应物产生具有施陶丁格连接子的其它核苷酸类似物。以与图6类似的方式，流程2的核苷酸类似物可以由将施陶丁格部分连接到腺嘌呤的N6、鸟嘌呤的N2、胸腺嘧啶的N3或尿嘧啶的N3来形成，由此提供“天然存在的”dNTP的类似物以及脱氧尿嘧啶核苷酸(dUTP)。

流程1的方法可以用以通过以适当核糖核苷酸反应物为起始物质产生例如如图7-10中所示的对应核糖核苷酸类似物。包含施陶丁格连接子的核糖核苷酸类似物还可以使用流程2产生，以形成所需核糖核苷酸类似物，包括例如如图12中所示的CTP类似物。此外，所有核糖核苷酸类似物，即C、A、T、G、U均可以使用与流程2类似的反应物形成。

酶

本发明方法采用核苷酸转移酶将核苷酸类似物组合到聚核苷酸中。核苷酸转移酶包括若干相关转移酶和聚合酶家族。一些核苷酸转移酶会使脱氧核糖核苷酸比核糖核苷酸更高效地聚合，一些核苷酸转移酶使核糖核苷酸比脱氧核糖核苷酸更高效地聚合，并且一些核苷酸基转移酶使核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸以大致相同的速率聚合。

本发明特别重要的是，具有聚合酶活性的转移酶，如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)能够催化脱氧核糖核苷酸向核苷酸链的3'端的添加，由此使DNA核苷酸中的链长逐渐增加。TdT仅催化1-2个核糖核苷酸向DNA链的生长端的添加，其可适用于位点特异性DNA-RNA嵌合聚核苷酸的构筑。具体来说，来源于经工程改造大肠杆菌的小牛胸腺TdT适合用于本发明并且购自商业来源，如赛默科技(Thermo Scientific)(宾夕法尼亚州匹兹堡(Pittsburgh,PA))。与小牛TdT对应的氨基酸序列以SEQ ID NO.1列举于表1中。

表1.牛TdT的氨基酸序列

SEQ ID NO.1：MAQQRQHQRL PMDPLCTASS GPRKKRPRQV GASMASPPHD IKFQNLVLFILEKKMGTTRR NFLMELARRK GFRVENELSD SVTHIVAENN SGSEVLEWLQ VQNIRASSQL ELLDVSWLIESMGAGKPVEI TGKHQLVVRT DYSATPNPGF QKTPPLAVKK ISQYACQRKT TLNNYNHIFT DAFEILAENSEFKENEVSYV TFMRAASVLK SLPFTIISMK DTEGIPCLGD KVKCIIEEII EDGESSEVKA VLNDERYQSFKLFTSVFGVG LKTSEKWFRM GFRSLSKIMS DKTLKFTKMQ KAGFLYYEDL VSCVTRAEAE AVGVLVKEAVWAFLPDAFVT MTGGFRRGKK IGHDVDFLIT SPGSAEDEEQ LLPKVINLWE KKGLLLYYDL VESTFEKFKLPSRQVDTLDH FQKCFLILKL HHQRVDSSKS NQQEGKTWKA IRVDLVMCPY ENRAFALLGW TGSRQFERDIRRYATHERKM MLDNHALYDK TKRVFLKAES EEEIFAHLGL DYIEPWERNA

与小牛TdT对应的核苷酸序列以SEQ ID NO.2列举于表2中。

表2.牛TdT的核酸序列

SEQ ID NO.2：ctcttctgga gataccactt gatggcacag cagaggcagc atcagcgtcttcccatggat ccgctgtgca cagcctcctc aggccctcgg aagaagagac ccaggcaggt gggtgcctcaatggcctccc ctcctcatga catcaagttt caaaatttgg tcctcttcat tttggagaag aaaatgggaaccacccgcag aaacttcctc atggagctgg ctcgaaggaa aggtttcagg gttgaaaatg agctcagtgattctgtcacc cacattgtag cagaaaacaa ctctggttca gaggttctcg agtggcttca ggtacagaacataagagcca gctcgcagct agaactcctt gatgtctcct ggctgatcga aagtatggga gcaggaaaaccagtggagat tacaggaaaa caccagcttg ttgtgagaac agactattca gctaccccaa acccaggcttccagaagact ccaccacttg ctgtaaaaaa gatctcccag tacgcgtgtc aaagaaaaac cactttgaacaactataacc acatattcac ggatgccttt gagatactgg ctgaaaattc tgagtttaaa gaaaatgaagtctcttatgt gacatttatg agagcagctt ctgtacttaa atctctgcca ttcacaatca tcagtatgaaggatacagaa ggaattccct gcctggggga caaggtgaag tgtatcatag aggaaattat tgaagatggagaaagttctg aagttaaagc tgtgttaaat gatgaacgat atcagtcctt caaactcttt acttctgtttttggagtggg actgaagaca tctgagaaat ggttcaggat ggggttcaga tctctgagta aaataatgtcagacaaaacc ctgaaattca caaaaatgca gaaagcagga tttctctatt atgaagacct tgtcagctgcgtgaccaggg ccgaagcaga ggcggttggc gtgctggtta aagaggctgt gtgggcattt ctgccggatgcctttgtcac catgacagga ggattccgca ggggtaagaa gattgggcat gatgtagatt ttttaattaccagcccagga tcagcagagg atgaagagca acttttgcct aaagtgataa acttatggga aaaaaagggattacttttat attatgacct tgtggagtca acatttgaaa agttcaagtt gccaagcagg caggtggatactttagatca ttttcaaaaa tgctttctga ttttaaaatt gcaccatcag agagtagaca gtagcaagtccaaccagcag gaaggaaaga cctggaaggc catccgtgtg gacctggtta tgtgccccta cgagaaccgtgcctttgccc tgctaggctg gactggctcc cggcagtttg agagagacat ccggcgctat gccacacacgagcggaagat gatgctggat aaccacgctt tatatgacaa gaccaagagg gtatttctca aagcggaaagtgaagaagaa atctttgcac atctgggatt ggactacatt gaaccatggg aaagaaatgc ttaggagaaagctgtcaact tttttctttt ctgttctttt tttcaggtta gacaaattat gcttcatatt ataatgaaagatgccttagt caagtttggg attctttaca ttttaccaag atgtagattg cttctagaaa taagtagttttggaaacgtg atcaggcacc ccctgggtta tgctctggca agccatttgc aggactgatg tgtagaactcgcaatgcatt ttccatagaa acagtgttgg aattggtggc tcatttccag ggaagttcat caaagcccactttgcccaca gtgtagctga aatactgtat acttgccaat aaaaatagga aac

尽管市售TdT适用于本发明方法，但本发明方法可以使用例如氨基酸序列与SEQID NO.1至少95％一致，例如氨基酸序列与SEQ ID NO.1至少98％一致，例如氨基酸序列与SEQ ID NO.1至少99％一致的经修饰的TdT。表达适合的核苷酸转移酶的生物体可以包含与SEQ ID NO.2至少95％一致，例如与SEQ ID NO.2至少98％一致，例如与SEQ ID NO.2至少99％一致的核酸序列。在一些情况下，经修饰的TdT将更有效地产生聚核苷酸，或更好地控制链长。TdT的其它变体可以改变酶的释放特征，由此降低对如TCEP或DTT的还原剂水溶液的需要。

对于RNA聚核苷酸的合成，如大肠杆菌聚(A)聚合酶的核苷酸转移酶可以用以催化核糖核苷酸向核糖核苷酸起始子的3′端的添加。在其他实施例中，大肠杆菌聚(U)聚合酶可以更适用于本发明方法。大肠杆菌聚(A)聚合酶与大肠杆菌聚(U)聚合酶皆可购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)(马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich，MA))。下文再现大肠杆菌聚(A)聚合酶和大肠杆菌聚(U)聚合酶的氨基酸和核苷酸序列。经修饰的大肠杆菌聚(A)聚合酶大肠杆菌大肠杆菌聚(U)聚合酶可以适用于本发明方法。举例来说，氨基酸序列与SEQ ID NO.3至少95％一致，例如氨基酸序列与SEQ ID NO.3至少98％一致，例如氨基酸序列与SEQ ID NO.3至少99％一致的酶可以用于本发明方法。表达适合的酶的生物体可以包含与SEQ ID NO.4至少95％一致，例如与SEQ ID NO.4至少98％一致，例如与SEQ ID NO.4至少99％一致的核酸序列。举例来说，氨基酸序列与SEQ ID NO.5至少95％一致，例如氨基酸序列与SEQ ID NO.5至少98％一致，例如氨基酸序列与SEQ ID NO.5至少99％一致的酶可以用于本发明方法。表达适合的核苷酸转移酶的生物体可以包含与SEQ ID NO.6至少95％一致，例如与SEQ ID NO.6至少98％一致，例如与SEQ ID NO.6至少99％一致的核酸序列。

表3：大肠杆菌聚(A)聚合酶的氨基酸序列

SEQ ID NO.3：MFTRVANFCR KVLSREESEA EQAVARPQVT VIPREQHAIS RKDISENALKVMYRLNKAGY EAWLVGGGVR DLLLGKKPKD FDVTTNATPE QVRKLFRNCR LVGRRFRLAH VMFGPEIIEVATFRGHHEGN VSDRTTSQRG QNGMLLRDNI FGSIEEDAQR RDFTINSLYY SVADFTVRDY VGGMKDLKDGVIRLIGNPET RYREDPVRML RAVRFAAKLG MRISPETAEP IPRLATLLND IPPARLFEES LKLLQAGYGYETYKLLCEYH LFQPLFPTIT RYFTENGDSP MERIIEQVLK NTDTRIHNDM RVNPAFLFAA MFWYPLLETAQKIAQESGLT YHDAFALAMN DVLDEACRSL AIPKRLTTLT RDIWQLQLRM SRRQGKRAWK LLEHPKFRAAYDLLALRAEV ERNAELQRLV KWWGEFQVSA PPDQKGMLNE LDEEPSPRRR TRRPRKRAPR REGTA

与大肠杆菌聚(A)聚合酶对应的核苷酸序列以SEQ ID NO.4列举于表4中。

表4：大肠杆菌聚(A)聚合酶的核苷酸序列

SEQ ID NO.4：atttttaccc gagtcgctaa tttttgccgc aaggtgctaa gccgcgaggaaagcgaggct gaacaggcag tcgcccgtcc acaggtgacg gtgatcccgc gtgagcagca tgctatttcccgcaaagata tcagtgaaaa tgccctgaag gtaatgtaca ggctcaataa agcgggatac gaagcctggctggttggcgg cggcgtgcgc gacctgttac ttggcaaaaa gccgaaagat tttgacgtaa ccactaacgccacgcctgag caggtgcgca aactgttccg taactgccgc ctggtgggtc gccgtttccg tctggctcatgtaatgtttg gcccggagat tatcgaagtt gcgaccttcc gtggacacca cgaaggtaac gtcagcgaccgcacgacctc ccaacgcggg caaaacggca tgttgctgcg cgacaacatt ttcggctcca tcgaagaagacgcccagcgc cgcgatttca ctatcaacag cctgtattac agcgtagcgg attttaccgt ccgtgattacgttggcggca tgaaggatct gaaggacggc gttatccgtc tgattggtaa cccggaaacg cgctaccgtgaagatccggt acgtatgctg cgcgcggtac gttttgccgc caaattgggt atgcgcatca gcccggaaaccgcagaaccg atccctcgcc tcgctaccct gctgaacgat atcccaccgg cacgcctgtt tgaagaatcgcttaaactgc tacaagcggg ctacggttac gaaacctata agctgttgtg tgaatatcat ctgttccagccgctgttccc gaccattacc cgctacttca cggaaaatgg cgacagcccg atggagcgga tcattgaacaggtgctgaag aataccgata cgcgtatcca taacgatatg cgcgtgaacc cggcgttcct gtttgccgccatgttctggt acccactgct ggagacggca cagaagatcg cccaggaaag cggcctgacc tatcacgacgctttcgcgct ggcgatgaac gacgtgctgg acgaagcctg ccgttcactg gcaatcccga aacgtctgacgacattaacc cgcgatatct ggcagttgca gttgcgtatg tcccgtcgtc agggtaaacg cgcatggaaactgctggagc atcctaagtt ccgtgcggct tatgacctgt tggccttgcg agctgaagtt gagcgtaacgctgaactgca gcgtctggtg aaatggtggg gtgagttcca ggtttccgcg ccaccagacc aaaaagggatgctcaacgag ctggatgaag aaccgtcacc gcgtcgtcgt actcgtcgtc cacgcaaacg cgcaccacgtcgtgagggta ccgcatga

表5：大肠杆菌聚(U)聚合酶的氨基酸序列

SEQ ID NO.5：GSHMSYQKVP NSHKEFTKFC YEVYNEIKIS DKEFKEKRAA LDTLRLCLKRISPDAELVAF GSLESGLALK NSDMDLCVLM DSRVQSDTIA LQFYEELIAE GFEGKFLQRA RIPIIKLTSDTKNGFGASFQ CDIGFNNRLA IHNTLLLSSY TKLDARLKPM VLLVKHWAKR KQINSPYFGT LSSYGYVLMVLYYLIHVIKP PVFPNLLLSP LKQEKIVDGF DVGFDDKLED IPPSQNYSSL GSLLHGFFRF YAYKFEPREKVVTFRRPDGY LTKQEKGWTS ATEHTGSADQ IIKDRYILAI EDPFEISHNV GRTVSSSGLY RIRGEFMAASRLLNSRSYPI PYDSLFEEA

与大肠杆菌聚(U)聚合酶对应的核苷酸序列以SEQ ID NO.6列举于表6中。

表6：大肠杆菌聚(A)聚合酶的核苷酸序列

SEQ ID NO.6：ggcagccata tgagctatca gaaagtgccg aacagccata aagaatttaccaaattttgc tatgaagtgt ataacgaaat taaaattagc gataaagaat ttaaagaaaa acgcgcggcgctggataccc tgcgcctgtg cctgaaacgc attagcccgg atgcggaact ggtggcgttt ggcagcctggaaagcggcct ggcgctgaaa aacagcgata tggatctgtg cgtgctgatg gatagccgcg tgcagagcgataccattgcg ctgcagtttt atgaagaact gattgcggaa ggctttgaag gcaaatttct gcagcgcgcgcgcattccga ttattaaact gaccagcgat accaaaaacg gctttggcgc gagctttcag tgcgatattggctttaacaa ccgcctggcg attcataaca ccctgctgct gagcagctat accaaactgg atgcgcgcctgaaaccgatg gtgctgctgg tgaaacattg ggcgaaacgc aaacagatta acagcccgta ttttggcaccctgagcagct atggctatgt gctgatggtg ctgtattatc tgattcatgt gattaaaccg ccggtgtttccgaacctgct gctgagcccg ctgaaacagg aaaaaattgt ggatggcttt gatgtgggct ttgatgataaactggaagat attccgccga gccagaacta tagcagcctg ggcagcctgc tgcatggctt ttttcgcttttatgcgtata aatttgaacc gcgcgaaaaa gtggtgacct ttcgccgccc ggatggctat ctgaccaaacaggaaaaagg ctggaccagc gcgaccgaac ataccggcag cgcggatcag attattaaag atcgctatattctggcgatt gaagatccgt ttgaaattag ccataacgtg ggccgcaccg tgagcagcag cggcctgtatcgcattcgcg gcgaatttat ggcggcgagc cgcctgctga acagccgcag ctatccgatt ccgtatgatagcctgtttga agaagcg

如上文所论述，与核苷酸类似物偶联的抑制因子将使例如TdT的转移酶不从聚核苷酸释放或防止其它类似物并入到生长链中。带电部分会产生较好的抑制作用，然而，研究表明抑制因子的特定化学性质并非尤其重要。举例来说，可以使用磷酸与酸性肽抑制酶活性。参见例如鲍尔斯等人，性质方法，第6卷，(2009)第593-95页(Bowers et al，Nature Methods，vol.6，(2009)p.593-95)和美国专利第8,071，755号，两文献皆以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抑制因子将包括单一胺基酸或二肽，如-(Asp)₂，然而部分上的尺寸和电荷可以视需要根据以实验方式确定的第一核苷酸并入和第二核苷酸并入的速率来调节。也就是说，其它实施例可以使用更多或不同的带电氨基酸或其它生物相容性带电分子。

可以使用其它核苷酸合成方法以与不依赖模板的方式使用核苷酸转移酶或经修饰的核苷酸转移酶从头建构寡核苷酸。在一个实施例中，聚合酶/转移酶可以经修饰以使得其在遇到对3′-未经修饰的dNTP类似物的磷酸的进行修饰时中止核苷酸添加。这一流程需要修饰核苷酸类似物的磷酸末端的解封试剂/反应，由此空出初生链以进行随后的核苷酸并入。这一方法的优选实施例将使用仅磷酸(α、β或γ)经修饰的核苷酸类似物，但允许对核苷酸的嘌呤/嘧啶碱基进行修饰。

使用与不依赖模板的聚合酶/转移酶的另一实施例将使用蛋白质工程改造或蛋白质进化来修饰酶以在每一单核苷酸并入之后保持紧紧地结合于初生链且不与其反应，因此防止任何随后的并入，直到此类通过使用释放试剂/条件使聚合酶/转移酶从链释放的时间。将选择此类修饰以允许使用天然未经修饰的dNTP代替可逆终止子dNTP。释放试剂可为高盐缓冲剂、变性剂等。释放条件可为高温、搅拌等。举例来说，TdT的Loop1和SD1区的突变已展示会使活性由与不依赖模板的活性显著改变为更具与模板相关的活性。所关注的特定突变包括(但不限于)Δ₃384/391/392、del loop1(386→398)、D339A、F401A以及Q402K403C404→E402R403S404。实现并入后紧密结合TdT酶的目的的其它方式可以包括引起结合起始子链的三个磷酸(包括(但不限于)K261、R432和R454)的残基的突变。

使用与不依赖模板的聚合酶/转移酶的另一实施例将为使用蛋白质工程改造或蛋白质进化来修饰酶以高效地接受3-封阻可逆终止子。大多数天然存在的聚合酶/转移酶并不并入有3'-封阻可逆终止子，这归因于酶的活性位点中的空间限制。在与上述完全类似的方法中，修饰酶活性位点中的单一或若干aa残基可以极有效地将3'-封阻可逆终止子并入到结合起始子的支撑物中。在并入之后，用解封试剂/条件去除3'-可逆终止子，由此产生完全天然(无瘢痕)单链分子准备用于随后的受控延伸反应。很少有残基接近输入dNTP的3'-OH，这解释了TdT使核糖核苷三磷酸并入与去氧核糖核苷三磷酸酯一样容易的倾向；残基，包括(但不限于)β1与β2之间的那些残基、尤其R334，Loop1以及a13与a14之间的那些残基、尤其R454，很可能为突变诱发以容纳大量3'-可逆终止子基团并且允许其有效并入的标靶。使用与模板有关的聚合酶的另一实施例将为使用多个引子-模板对连接到固体支撑物的经3'封阻或未经3'封阻的dNTP类似物。

使用与不依赖模板的聚合酶/转移酶的另一实施例可以使用蛋白质工程改造或蛋白质进化来修饰酶以按类似特定方式优化四种不同核苷酸或甚至不同经修饰核苷酸类似物中的每一者的用途。核苷酸特异性或核苷酸类似物特异性酶变体可以经过工程改造而具有所需生物化学属性，如降低的K_m或提升的添加速率，由此将进一步降低合成所需聚核苷酸的成本。

固体状态合成

本发明方法可以在多种反应条件下实施，然而，在大多数情况下所需聚核苷酸的有序构筑和回收需要可以生长聚核苷酸的固体支撑物。在一些实施例中，所述方法包括在固体支撑物上酶促介导地合成聚核苷酸，如图7中所示。当与上文所论述的可裂解终止子核苷三磷酸(NTP)类似物结合使用时，有可能通过在水性环境中使用例如TdT或聚(A)聚合酶构筑DNA以及RNA的特异性多核苷酸序列。如图13中所示，TdT可以用以通过以逐步方式延伸聚核苷酸序列实现定制聚核苷酸的逐步构筑。如先前所论述，每一NTP类似物的抑制因子基团使酶因添加核苷酸而停止。在每一核苷酸延伸步骤之后，从固体支撑物洗掉反应物，之后通过使连接子裂解而去除抑制因子，并且接着添加新的反应物，从而使循环重新开始。在n个延伸-去除-解封-洗涤周期结束时，成品全长、单股聚核苷酸完整并且可以从固体支撑物裂解并回收，以随后用于如DNA定序或PCR的应用中。或者，成品全长、单股聚核苷酸可以保持连接到固体支撑物，以随后用于如杂交分析、蛋白质或DNA亲和力捕获的应用中。在其他实施例中，部分双链的DNA可以作用起始子，致使双链聚核苷酸合成。

适用于本发明方法的固体支撑物可以包括玻璃和二氧化硅支撑物，包括珠粒、载片、栓钉或孔。在一些实施例中，支撑物可以系栓到另一结构，如聚合物孔板或移液管尖端。在一些实施例中，固体支撑物可以具有额外磁特性，因此使得使用磁体操控或从某一位置去除支撑物。在其它实施例中，固体支撑物可以为涂有二氧化硅的聚合物，由此使得形成适于自动加工的多种结构形状。

合成器

为利用所公开的方法的有效性，可以构筑水相DNA合成器以大量生产所需聚核苷酸。在一个实施例中，合成器将包括四个孔的所述NTP类似物试剂，即dCTP、dATP、dGTP以及dTTP，以及浓度足以实现聚核苷酸生长的TdT。可以将多个起始序列连接到固体支撑物，所述固体支撑物经设计以例如使用实验室机器人反复浸渍到四个孔中的每一者中。可对机器人另外编程以在核苷酸添加之间用洗涤缓冲剂冲洗固体支撑物，通过使支撑物暴露于解封剂而使键联基团裂解，以及第二次洗涤固体支撑物，之后将固体支撑物移到下一所需核苷酸的孔。经简单编程，有可能在大约几小时内产生有用量的所需核苷酸序列，并且充分减少有害废弃物。在小心控制的条件下进行合成将使得合成长度为数千碱基对的聚核苷酸。完成时，延伸产物从固体支撑物释放出，由此其可以用作成品核苷酸序列。

高度平行的实施例可由96或384孔格式中栓钉上的一系列起始子-固体支撑物组成，其可以个别回缩或降低以使得可以指引栓钉以控制方式接触孔中的液体。因此，合成器可由可随机定址的栓钉装置、四个与栓钉装置(96或384空格)相同格式的酶-dNTP类似物储槽、与栓钉装置(96或384空格)相同格式的额外试剂储槽(清洗、解封等)以及以用户可编程控制但随机存取的方式将栓钉装置从一个储槽移动到另一个的输送机构(例如实验室机器人)组成。必须小心以避免四个酶-dNTP储槽中的每一者受到污染，因为内含物在整个合成过程中会重复使用以降低每一次聚核苷酸合成的成本。

在替代实施例中，试剂(例如核苷酸类似物、酶、缓冲剂)将在固体支撑物之间移动，从而使得回收试剂。举例来说，具有储槽和泵的系统可以使四种不同核苷酸类似物溶液、洗涤缓冲剂和/或还原剂溶液在一个或多个将形成寡核苷酸的反应器之间移动。反应器和泵可以为常规的，或装置可以使用微流体构筑。因为所述方法的非无水(水性)性质，所以所用硬件的设计中不需要特别小心地消除暴露于水。合成方法可以实施，仅采取措施以控制蒸发损失。高度平行的实施例可以由96或384孔格式中的栓钉上的单片一系列起始子-固体支撑物组成，其可以接合相同匹配格式的一系列孔。每一孔实际上为一通过具有适当阀门的四个酶-dNTP类似物储槽和额外试剂储槽(清洗、解封等)馈料的反应室。将对流体学逻辑进行规定以在每一延伸反应之后以原始方式回收酶-dNTP反应物，这是因为其在整个合成过程中会重复使用以降低每一次聚核苷酸合成的成本。在其它实施例中，移液尖端的系统可以用以添加和去除试剂。

在合成之后，释放的延伸产物可以通过高分辨率PAGE分析以确定与对照相比起始子是否已延伸预期碱基数。还可以对一部分回收的合成DNA测序以确定合成的聚核苷酸是否具有预期序列。

因为合成器相对简单并且不需要亚磷酰胺合成所需的有毒组分，所以本发明的合成器可广泛用于研究机构、生物技术公司和医院。另外，能重复使用/回收试剂将减少废弃物产生并且有助于降低消耗品成本。本发明人预计所述方法和系统将适用于许多应用，如DNA测序、PCR以及合成生物学。

以引用的方式并入

贯穿本发明已经参考并且引用了其它文献，例如专利、专利申请、专利公开案、期刊、书籍、论文、网络内容。

所有此类文档在此出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

等效内容

根据包含对在此引用的科学和专利文献的参考的本文档的完整内容，所属领域的技术人员将显而易见除本文示出和描述的之外的本发明的各种修改以及其许多其它实施例。本文中的标的物含有重要信息、范例和指南，其可适于本发明在其各种实施例及其等效内容中的实践。

Claims (14)

1.一种合成寡核苷酸的方法，其包含：

在存在核苷酸转移酶和不存在核酸模板下使连接到固体支撑物的核酸暴露于核苷酸类似物，

其中所述核苷酸类似物包含未经修饰的3'羟基和可裂解封端基团，所述可裂解封端基团封阻核苷酸转移酶但在裂解时产生用于核苷酸转移酶的核苷酸底物，

其中所述核苷酸类似物具有以下结构：

其中n＝2或3，并且-X-为-O-、-S-、-NH-或-CH₂-。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸底物包含选自由以下组成的群组的碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸转移酶的序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：

其中n＝2或3，并且-X-为-O-、-S-、-NH-或-CH₂-。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：

其中n＝2或3，并且-X-为-O-、-S-、-NH-或-CH₂-。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述可裂解封端基团为可化学裂解、可光解裂解、可电化学裂解或可生物裂解。

7.根据权利要求1所述的方法，其中连接到所述固体支撑物的所述核酸在pH值在6.5与8.5之间的水溶液下暴露于所述核苷酸类似物。

8.根据权利要求1所述的方法，连接到所述固体支撑物的所述核酸在35℃与39℃之间的温度下在水溶液下暴露于所述核苷酸类似物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体支撑物为珠粒、孔或栓钉。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸为单链的。

11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含：

使所述可裂解封端基团裂解以产生天然核苷酸；和

在存在转移酶和不存在核酸模板下使所述天然核苷酸暴露于第二核苷酸类似物，其中所述第二核苷酸类似物在糖环上包含3'羟基并且包含可裂解封端基团。

12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含提供包含所述核苷酸类似物和所述核苷酸转移酶的水溶液。

13.一种用于合成寡核苷酸的系统，所述系统包含：

固体支撑物，其结合核酸；

核苷酸转移酶；

第一核苷酸类似物，其包含游离3'羟基和通过可裂解连接子连接到所述核苷酸类似物的封阻基团，

其中直到所述封阻基团经由所述可裂解连接子去除，第二核苷酸类似物不可以经由所述第一核苷酸类似物的3'位通过所述核苷酸转移酶偶联到所述第一核苷酸类似物，并且

其中所述系统不含核酸模板，其中所述第一核苷酸类似物和第二核苷酸类似物具有以下结构：

其中n＝2或3，并且-X-为-O-、-S-、-NH-或-CH₂-。

14.根据权利要求13所述的系统，其中所述第一核苷酸类似物和第二核苷酸类似物分别包含选自由以下组成的群组的碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。

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