PL1747023T5 - Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych - Google Patents

Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych

Info

Publication number
PL1747023T5
PL1747023T5 PL05749437T PL05749437T PL1747023T5 PL 1747023 T5 PL1747023 T5 PL 1747023T5 PL 05749437 T PL05749437 T PL 05749437T PL 05749437 T PL05749437 T PL 05749437T PL 1747023 T5 PL1747023 T5 PL 1747023T5
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
hcv
agent
rna
treating
disease condition
Prior art date
Application number
PL05749437T
Other languages
English (en)
Other versions
PL1747023T3 (pl
Inventor
Peter Sarnow
Catherine L. Jopling
Alissa M. Lancaster
Original Assignee
Univ Leland Stanford Junior
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35320743&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL1747023(T5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Leland Stanford Junior filed Critical Univ Leland Stanford Junior
Publication of PL1747023T3 publication Critical patent/PL1747023T3/pl
Publication of PL1747023T5 publication Critical patent/PL1747023T5/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/10—Production naturally occurring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
WSTĘP Tło wynalazku [0001] Infekcje wirusowe stanowią nieustannie problem medyczny, ponieważ podobnie jak każdy gwałtownie namnażający się czynnik zakaźny, ciągle ulegają one mutacjom, które pomagają pewnym subpopulacjom wirusów utrzymać oporność na obecnie stosowane sposoby leczenia. Na wiele chorób związanych z zakażeniem wirusowym nie ma skutecznego sposobu leczenia przeciwwirusowego, ponieważ stosowane sposoby leczenia skierowane są przeciwko objawom choroby wirusowej, a nie przeciwko przyczynie tej choroby. W stanie techniki istnieje potrzeba odkrycia i opracowania nowych terapii przeciwwirusowych.
[0002] Mikrocząsteczki RNA - mikroRNA (miRNA) stanowią klasę małych cząsteczek RNA, o długości około 21-22 nukleotydów, które wykryto u wielu gatunków roślin i zwierząt. Co więcej, stwierdzono, że pewne genomy wirusowego RNA wirusów zwierzęcych kodują miRNA. Intensywne badania oparte na klonowaniu oraz przewidywania oparte na modelowaniu komputerowym wykazały, że prawdopodobnie u ludzi występuje ponad 200 genów kodujących miRNA, które mogą regulować około 1000-2000 mRNA. Pewne miRNA ulegają ekspresji w całym organizmie, podczas gdy ekspresja innych jest wysoko tkankowospecyficzna. Na przykład, zaobserwowano, że miR-122 ulega ekspresji specyficznie w wątrobie, gdzie stanowi 70% całkowitej populacji miRNA.
Literatura dotycząca tematu [0003] Tomari & Zamore, Genes Dev. 19, 517 (2005); Bennasser, i wsp., Retrovirology 1, 43 (2004); Pfeffer i wsp., Science 304, 734 (2004); Baskerville & Bartel, RNA 11, 241 (2005);
John i wsp., PLoS Biol. 2; e363 (2004); Lim i wsp., Nature 433, 769 (2005); Hutvagner, Science 297, 2056 (2002); Yekta, i wsp., Science 304, 594 (2004); Chen, Science 303, 2022 (2004); Doench, i wsp., Genes Dev. 17, 438 (2003); Doench &
Sharp, Genes Dev. 18, 504 (2004); Olsen, Dev. Biol. 216, 671 (1999); Saxena & Dutta, J. Biol. Chem. 278, 44312 (2003);
Zeng, i wsp., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 100, 9779 (2003); Lagos-Quintana i wsp., Curr. Biol. 12, 735 (2002); Sempere i wsp., Genome Biol. 5, R13 (2004); Chang, i wsp., RNA Biology 1, 106 (2004); Lewis, i wsp., Cell 120, 15 (2005); Lewis i wsp., Cell 115, 787 (2003); Ikeda, i wsp., J. Virol. 76, 2997 (2002). Friebe, i wsp., J. Virol. 75, 12047 (2001); Sunkar, i wsp., Plant Cell 16, 2001 (2004).
[0004] WO 02/081494 dotyczy antysensowych cząsteczek kwasu nukleinowego, które modulują syntezę, ekspresję i/lub stabilność HCV albo HBV. Praca McCaffrey'a, A. i wsp., Nature, 418 (6893), str. 38-39, dotyczy hamowania wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez interferencję RNA (RNAi) u myszy.
STRESZCZENIE WYNALAZKU
[0005] Przedmiotem wynalazku są środki hamujące miR122 do zastosowania do leczenia organizmu gospodarza cierpiącego na chorobę związaną z zakażeniem HCV, gdzie środkiem tym jest antysensowy oligonukleotyd lub środek powodujący interferencję RNA (RNAi). Inne aspekty wynalazku zostały zdefiniowane w zastrzeżeniach.
[0006] Sposoby i kompozycje do zmniejszania ilości wirusowego genomu w komórce docelowej opracowane według wynalazku zostały ujawnione tutaj w przedmiotowych sposobach, aktywność miRNA jest hamowana w sposób wystarczający do obniżenia ilości genomu wirusowego w komórce docelowej, to jest przez wprowadzenie środka hamującego miRNA do komórki docelowej. Wynalazek obejmuje również kompozycje farmaceutyczne, zestawy i układy do zastosowania w realizacji sposobów według wynalazku. Przedmiot wynalazku może mieć szerokie zastosowanie, obejmujące leczenie pacjentów cierpiących na choroby związane z zakażeniem wirusowym, np. stan chorobowy związany z HCV.
KRÓTKI OPIS RYSUNKU
[0007] Fig. 1A-1C. miR-122 ulega ekspresji w komórkach Huh7 i ma dwa przewidywane miejsca wiążące w genomie HCV. (A) Analiza Northern biot ekspresji miR-122 w całkowitym RNA wyodrębnionym z mysiej i ludzkiej wątroby oraz komórek HeLa, HepG2 i Huh7: natywnych, poddawanych leczeniu i zawierających replikon. (B) Sekwencja miR-122 zawierająca sekwencję seed wskazaną w prostokątnej ramce. (C) Struktura drugorzędowa niekodujących regionów 3' i 5' genotypu 1 HCV szczep H77c, ze wskazaniem przewidywanych miejsc wiążących miR-122. Dopasowania w regionie seed przedstawiono w prostokątnych ramkach.
[0008] Fig. 2A-C. Sekwestracja miR-122 zmniejsza ilość RNA i białek HCV w komórkach replikonu. (A) Analiza Northern biot RNA replikonu, eGFP i aktyny w linii komórkowej replikonu NNeo/C-5B. Przedstawiono organizację replikonu. Do komórek, przy pomocy transfekcji za pośrednictwem lipofektaminy 2000, wprowadzano plazmidy zawierające wskaźnik eGFP i 2'-0-metylowane oligonukleotydy i ekstrahowano całkowite RNA po 48 godzinach, eGFP-124 i eGFP-122 stanowią wektory ekspresyjne eGFP z miejscami komplementarnymi dla, odpowiednio, miR-124 i miR-122 w 3'UTR. 122-2'OMe jest 31-merowym 2'-O-metylowanym oligomerem komplementarnym dla miR-122, Rand-2'OMe jest randomizowaną odmianą tej sekwencji, a let7-2'OMe jest podobnym oligomerem komplementarnym dla let-7a. (B) Analiza Western biot przedstawiająca poziomy białka rdzeniowego HCV, eGFP i aktyny po 48 godzinach od transfekcji określonymi plazmidami ze wskaźnikiem eGFP i 2'-O-metylowanymi oligomerami. (C) Analiza Northern biot RNA replikonu, eGFP i aktyny w komórkach Huh7 zawierających pełnogenomowy replikon H77c genotypu la i transfekowano eGFP-122 i 122-2'OMe.
[0009] Fig. 3A-3C. Przewidywane miejsce wiążące miR-122 w rejonie niekodującym 5' HCV jest konieczne do utrzymania wirusowego RNA ze względu na bezpośrednie oddziaływanie z miR-122 (A) Lokalizacja mutacji wprowadzonej do pełnej długości RNA H77c. Mutacja stanowiąca substytucję 4 nukleotydów została wprowadzona w regionie seed w niekodującym rejonie 3' (m3') a mutacje stanowiące substytucję 4 nukleotydów, 2 nukleotydów lub 1 nukleotydu wprowadzono w regionie dopasowania do seed w niekodującym rejonie 5' (odpowiednio, m5'A, B i C) . Zmutowane nukleotydy zostały objęte prostokątnymi ramkami. (B) RNA został zsyntetyzowany w wyniku transkrypcji in vitro i wprowadzony do komórek Huh7 poprzez elektroporację, a poziomy RNA replikonu wyznaczano techniką Northern blotting po 5 dniach. Jako kontrolę przedstawiono wybarwiony błękitem metylenowym rybosomalny RNA. (C) Komórki Huh7 transfekowano syntetycznymi dupleksami odpowiadającymi miR-122 typu dzikiego (122wt) lub miR-122 z mutacją 1 nukleotydu w regionie seed komplementarną z mutacją m5'C w regionie dopasowania do seed (122mC), i o przeciwległej nici dupleksu opartej na prekursorowej strukturze spinki do włosów miR-122. Dupleksy wprowadzano do komórek Huh7 na jeden dzień przed elektroporacją cząsteczkami RNA H77c typu dzikiego lub cząsteczkami RNA z mutacją m5'C, i ponownie 1 i 3 dni po elektroporacji. Całkowite RNA zbierano 5 dni po elektroporacji i poziom RNA replikonu i aktyny wyznaczano techniką Northern blotting.
[0010] Fig. 4. Mutacja w miejscu wiążącym miR-122 nie wpływa na translację mRNA HCV. Mutację m5'C wprowadzono do mutanta H77c, u którego nie zachodzi replikacja, AAG-H77, zawierającego zmianę aminokwasów z GDD na AAG w pozycjach 2737 do 2739 w wirusowej polimerazie NS5B (23). Lizaty zbierano 20 godzin po transfekcji RNA replikonu a ekspresję białka rdzeniowego HCV i aktyny wyznaczano techniką Western blotting.
[0011] Fig. S3A i B. Dodanie syntetycznego dupleksu miR-122 do komórek replikonu NNeo/C-5B prowadziło do zwiększenia ilości replikonu RNA. Wskazane plazmidy niosące wskaźnik eGFP i typu dzikiego (122wt) lub zmutowane (122mC) dupleksy miR-122 wprowadzano do komórek transfekując je z użyciem lipofektaminy 2000. Całkowite
OPIS SZCZEGÓLNYCH POSTACI REALIZACJI WYNALAZKU
[0012] Przedmiotem wynalazku są sposoby i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego w komórce docelowej. W sposobach według wynalazku aktywność miRNA jest hamowana w sposób wystarczający do zmniejszenia ilości genomu wirusowego w określonej komórce np. przez wprowadzenie środka hamującego miRNA w żądanej komórce. Przedmiotem wynalazku są również kompozycje farmaceutyczne, zestawy i układy do zastosowania w realizacji sposobów według wynalazku. Wynalazek może być zastosowany w wielu różnych dziedzinach obejmujących leczenie pacjentów cierpiących na stany chorobowe, które związane są z zakażaniem wirusowym, np. stanu chorobowego, który związany jest z infekcją HCV.
[0013] Zanim przedmiot wynalazku zostanie opisany bardziej szczegółowo, konieczne jest wskazanie, że wynalazek jest zdefiniowany przez zastrzeżenia i nie jest ograniczony do żadnego szczególnego rozwiązania. Należy również wskazać, że terminologia zastosowana tutaj ma na celu jedynie opisanie poszczególnych rozwiązań, lecz nie ma ograniczać zakresu wynalazku, ponieważ został on ograniczony jedynie zastrzeżeniami.
[0014] Gdy podany jest zakres wartości, należy rozumieć, że wynalazek obejmuje każdą z wartości znajdujących się w tym zakresie do dziesiętnych części jednostki dolnej granicy, jeśli treść nie wskazuje inaczej, pomiędzy górną a dolną granicą tego zakresu, jak również wszystkie inne wartości wskazane lub pośrednie w określonym zakresie. Górne i dolne granice tych mniejszych zakresów mogą niezależnie być objęte mniejszymi zakresami i są również objęte zakresem wynalazku, stanowiąc przedmiot względem dowolnej, szczegółowo wykluczonej granicy w określonym zakresie. Gdy określony zakres obejmuje jedną lub obie granice, zakresy wykluczające dowolną lub obie te granice również objęte są zakresem wynalazku.
[0015] Sposoby przedstawione tutaj mogą być realizowane w dowolnej kolejności, która jest logicznie możliwa, jak i w określonej tu kolejności.
[0016] Jeśli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie techniczne i naukowe terminy stosowane tutaj mają takie samo znaczenie jakie jest ogólnie zrozumiałe dla specjalisty o typowej wiedzy z dziedziny do której należy wynalazek. Mimo, że dowolne sposoby i materiały podobne lub równoważne do tych opisanych tutaj również mogą być stosowane w praktyce lub badaniu przedmiotowego wynalazku, korzystne są sposoby i materiału opisane tutaj.
[0017] Należy podkreślić, że formy pojedyncze stosowane tutaj i w załączonych zastrzeżeniach obejmują też formy mnogie, jeśli treść nie wskazuje inaczej. Ponadto należy podkreślić, że zastrzeżenia mogą być opracowane tak aby wykluczały wszelkie elementy opcjonalne. Jako takie, twierdzenie to ma służyć jako poprzednia podstawa do zastosowania takiej wyłączającej terminologii jak „tylko" „jedynie" i tym podobne w połączeniu z wymienianiem elementów zastrzeżenia lub zastosowanie ograniczenia przez „negację".
[0018] Cyt owane tu publikacje przedstawiono wyłącznie ze względu na ujawnienie mające miejsce przed datą zgłoszenia wynalazku. Żaden z cytowanych tutaj dokumentów nie powinien być interpretowany jako przyznanie, że wynalazek nie jest uprawniony do takiej publikacji poprzedzającej zgłoszenie wynalazku. Ponadto, daty publikacji, mogą różnić się od rzeczywistych dat publikacji, które powinny być niezależnie potwierdzone.
[0019] Jak przedstawiono powyżej, przedmiotem wynalazku są sposoby i kompozycje do zmniejszania ilości wirusowego genomu w określonej komórce genomu. Sposoby według wynalazku zostały opisane bardziej szczegółowo na początku, a następnie zamieszczono przegląd różnych reprezentatywnych zastosowań, w których wynalazek ma zastosowanie, jak również zestawy, które mają stosowania w realizacji przedmiotu wynalazku.
SPOSOBY
[0020] Jak wskazano powyżej, ujawnione zostały sposoby zmniejszenia ilości genomu wirusa w komórce docelowej, gdzie komórka docelowa może oznaczać komórki w warunkach in vitro i in vivo. Termin "zmniejszenie ilości" oznacza, że poziom lub ilość docelowego genomu wirusa w określonej komórce jest zmniejszona co najmniej 2-krotnie, zwykle co najmniej około 5-krotnie, np. 10-krotnie, 15-krotnie, 20-krotnie, 50-krotnie, 100-krotnie lub więcej, w porównaniu do komórki kontrolnej, czyli identycznej komórki docelowej nie traktowanej zgodnie z przedmiotowym sposobem.
[0021] W realizacji sposobów według wynalazku, skuteczną ilość środka hamującego miRNA (mikroRNA) wprowadza się do komórki docelowej, przy czym w celu wprowadzenia środka do komórki docelowej może być wykorzystany każdy odpowiedni protokół. Środek hamujący miRNA jest czynnikiem, który hamuje aktywność miRNA w określonej komórce docelowej. Docelowy miRNA jest miRNA, którego obecność jest związana z replikacją genomu wirusowego w komórce i jego ilością. Jak wiadomo, miRNA są to jednoniciowe cząsteczki RNA o długości w zakresie od około 20 do około 25 nukleotydów, na przykład od około 21 do około 24 nukleotydów, np. 22 lub 23 nukleotydów. Docelowe cząsteczki miRNA mogą być w pełni lub jedynie częściowo komplementarne z regionem tej samej długości co miRNA z genomu wirusa. Jeśli cząsteczki te nie są w pełni komplementarne, miRNA i odpowiadający jej docelowy genom są przynajmniej zasadniczo komplementarne, tak, że ilość rozbieżnych zasad obecnych na całej długości miRNA, (w zakresie od około 20 do około 25 nukleotydów) nie przekracza około 8 nukleotydów a w pewnych rozwiązaniach nie może przekraczać 6 lub 5 nukleotydów, np. 4 nukleotydów.
[0022] Środek hamujący miRNA oznacza środek, który hamuje aktywność docelowego miRNA. Środek hamujący może hamować aktywność miRNA poprzez wiele różnych mechanizmów. W pewnych realizacjach wynalazku środek hamujący to środek, który wiąże się z miRNA w ten sposób hamując jego aktywność. Reprezentatywne środki hamujące miRNA obejmują, między innymi: oligonukleotydy antysensowne, takie jak selektywne oligonukleotydy antysensowne przedstawione w części doświadczalnej poniżej, i tym podobne. Inne środki obejmują między innymi: Naturalnie występujące lub syntetyczne małocząsteczkowe związki obejmujące liczne klasy chemiczne, ale zazwyczaj są to cząsteczki organiczne, korzystnie małocząsteczkowe związki organiczne o masie cząsteczkowej większej niż 50 i mniejszej niż 2500 daltonów. Środki, które mogą być stosowane zawierają grupy funkcyjne konieczne do oddziaływań strukturalnych z białkami, szczególnie tworzące wiązania wodorowe, i typowo obejmują co najmniej jedną grupę aminową, karbonylową, hydroksylową lub karboksylową, korzystnie co najmniej dwie z wymienionych chemicznych grup funkcyjnych. Środki, które mogą być stosowane często zawierają cykliczne, złożone z atomów węgla lub heterocykliczne struktury i/lub aromatyczne lub poliaromatyczne struktury podstawione przynajmniej jedną z powyższej wymienionych grup funkcyjnych. Rozważane są również środki będące biocząsteczkami w tym peptydy, węglowodany, kwasy tłuszczowe, steroidy, puryny, pirymidyny, ich pochodne, analogi strukturalne lub ich kombinacje. Cząsteczki takie mogą być identyfikowane między innymi, wykorzystując odpowiednie protokoły przeszukiwania.
[0023] Również przedmiotem zainteresowania w niektórych realizacjach są środki powodujące interferencję RNA (RNAi) -dalej jako „środki do RNAi". W reprezentatywnych odmianach, środek do RNAi jest ukierunkowany na cząsteczkę prekursorową mikroRNA, znaną jako cząsteczka pre-mikroRNA. Środek do RNAi oznacza środek, który moduluje ekspresję mikroRNA poprzez mechanizm interferencji (wyciszania) RNA. Środki do RNAi wykorzystywane w jednej z realizacji wynalazku stanowią małe cząsteczki kwasu rybonukleinowego (określane tu jako środki wyciszające kwasy rybonukleinowe), czyli oligorybonukleotydy, które są obecne w strukturach dupleksowych, np. dwa odrębne oligorybonukleotydy hybrydyzujące ze sobą lub pojedynczy oligorybonukleotyd, który przyjmuje formę małej spinki do włosów tworząc strukturę dupleksową. Oligorybonukleotyd oznacza kwas rybonukleinowy, który nie przekracza długości około 100 nukleotydów, a typowo nie przekracza długości około 75 nukleotydów, a w niektórych rozwiązaniach długość nie przekracza około 70 nukleotydów. Jeżeli środek RNA jest strukturą dupleksową złożoną z dwóch różnych kwasów rybonukleinowych hybrydyzujących ze sobą, np. siRNA (np. d-siRNA, jak opisano we wspólnie złożonym zgłoszeniu nr 60/377 704, którego ujawnienie jest włączone tutaj przez odniesienie) , długość struktury dupleksowej zwykle zawiera się od około 15 do 30 bp, zwykle od około 15 do 29 bp, przy czym w pewnych realizacjach wynalazku korzystne są długości od około 20 do 29 bp, np. 21 bp, 22 bp, są szczególnie interesujące. Gdy środek RNA jest strukturą dupleksową utworzoną przez jednen kwas rybonukleinowy, który przyjmuje strukturę spinki do włosów, czyli shRNA, długość hybrydyzującej części w strukturze spinki do włosów jest zwykle taka sama, jak podana powyżej dla środka typu siRNA lub jest o 4-8 nukleotydów dłuższa. Masa cząsteczkowa środków do RNAi według tego rozwiązania wynosi typowo od około 5 000 daltonów do około 35 000 daltonów, a w wielu realizacjach wynosi co najmniej około 10 000 daltonów a mniej niż 27 500 daltonów, często mniej niż około 25 000 daltonów.
[0024] W pewnych realizacjach zamiast środka do RNAi będącego wyciszającym kwasem rybonukleinowym, np. siRNA lub shRNA, jak opisano powyżej, środek do RNAi może kodować wyciszający kwas rybonukleinowy, np. shRNA, jak opisano powyżej. Innymi słowy, środek do RNAi może stanowić matrycę do transkrypcji dla wyciszającego kwasu rybonukleinowego. W tych odmianach, matrycą do transkrypcji jest zazwyczaj DNA, który koduje wyciszający kwas rybonukleinowy. DNA może być obecny w wektorze, przy czym znanych jest wiele różnych wektorów, np. wektor plazmidowy, wektor wirusowy, itp.
[0025] Jak wskazano powyżej, środek hamujący miRNA można wprowadzić do komórki(ek) docelowej (ych) stosując dowolny odpowiedni protokół, przy czym zastosowany protokół będzie zależał od tego, czy komórki docelowe są obecne in vitro czy in vivo.
[0026] W przypadku, gdy komórki docelowe są obecne in vivo, środek do miRNA może być podawany gospodarzowi za pomocą dowolnego dogodnego protokołu. W postaciach wykonania wynalazku, w których środkiem hamującym jest kwas nukleinowy, zastosowanym protokołem jest zazwyczaj protokół wprowadzania kwasów nukleinowych, przy czym znanych jest wiele różnych odpowiednich protokołów. Poniżej przedstawiono przegląd reprezentatywnych protokołów podawania kwasu nukleinowego, które mogą być zastosowane. Kwasy nukleinowe mogą być wprowadzane do tkanek i komórek gospodarza dowolną z wielu różnych dróg, w tym przez zakażenie wirusem, mikroiniekcję lub fuzję pęcherzyków. Może być również zastosowane wstrzyknięcie przezskórne strumieniem roztworu pod wysokim ciśnieniem do podawania domięśniowego, jak opisano przez Furtha i wsp. (1992), Anal Biochem 205:365-368. Kwasy nukleinowe mogą być naniesione na mikrocząstki złota i dostarczane śródskórnie za pośrednictwem urządzenia do bombardowania cząstkami, lub "strzelbą genową", jak opisano w literaturze (zob. na przykład, Tang i wsp. (1992), Nature 356:152-154), gdzie opisano mikropociski ze złota pokrywane DNA, którymi następnie bombarduje się komórki skóry. Do wprowadzania kwasów nukleinowych do komórki mogą być wykorzystywane wektory ekspresyjne. Wektory takie mają zwykle dogodne miejsca restrykcyjne zlokalizowane w pobliżu sekwencji promotora aby zapewnić wprowadzenie sekwencji kwasu nukleinowego. Kasety transkrypcyjne mogą być przygotowane tak aby obejmowały region inicjacji transkrypcji, docelowy gen lub jego fragment oraz region terminacji transkrypcji. Kasety transkrypcyjne mogą być wprowadzane do różnych wektorów, np. plazmidu, retrowirusów, np. lentiwirusa, adenowirusa i tym podobnych, przy czym wektory są zdolne do utrzymania się w komórkach czasowo lub stabilnie, zwykle przez okres co najmniej jednego dnia, częściej przez okres co najmniej kilku dni do kilku tygodni.
[0027] Na przykład, środek hamujący może być podawany bezpośrednio, wstrzykiwany do organizmu gospodarza zawierającego gen docelowy. Środek może być wprowadzony do komórki bezpośrednio (np. wewnątrzkomórkowe) lub wprowadzany zewnątrzkomórkowo do jamy, przestrzeni międzykomórkowej, do układu krążenia organizmu, wprowadzony doustnie, itd. Metody wprowadzania doustnego obejmują bezpośrednie mieszanie RNA z żywnością dla organizmu. Fizyczne metody wprowadzania kwasów nukleinowych obejmują bezpośrednie wstrzyknięcie roztworu RNA do komórki lub wstrzyknięcie do przestrzeni zewnątrzkomórkowej organizmu. Środek może być wprowadzony w ilości, która pozwala na dostarczenie co najmniej jednej kopii na komórkę. Wyższe dawki środka (np. co najmniej 5, 10, 100, 500 lub 1000 kopii na komórkę) mogą zapewnić skuteczniejsze hamowanie, w określonych zastosowaniach mogą być odpowiednie również niższe dawki.
[0028] W pewnych postaciach wynalazku, można stosować protokół hydrodynamicznego podawania kwasu nukleinowego. Jeżeli środkiem jest kwas rybonukleinowy, protokół hydrodynamicznego podawania kwasu rybonukleinowego szczegółowo opisany poniżej, jest przedmiotem szczególnego zainteresowania. Jeżeli środkiem jest kwas deoksyrybonukleinowy, protokoły hydrodynamicznego podawania kwasu deoksyrybonukleinowego zostały opisane w pracach Chang i wsp., J. Virol. (2001) 75:, Liu i wsp, Gene Ther.. (1999) 6:1258-1266; Wolff i wsp, Nauka (1990) 247:.. 1465/68; Zhang i wsp, Hum. Gene Ther. (1999) 10:1735-1737: i Zhang i wsp, Gene Ther. (1999) 7: 1344/49, są przedmiotem zainteresowania.
[0029] Dodatkowe protokoły podawania kwasu nukleinowego obejmują między innymi: te opisane w patentach US 5 985 847 i US 5 922 687; WO/11092; w pracach Acsadi i wsp., New Biol. (1991) 3:71-81; Hickman i wsp, Hum. Gen. Ther. (1994) 5:1477-1483; i Wolff i wsp, Science (1990) 247:. 1465-1468, itp.
[0030] W zależności od właściwości środka hamującego, substancja (-e) czynna (-e) mogą być podawane gospodarzowi w dowolny dogodny sposób zdolny do wywołania pożądanego zmniejszenia ilości lub obciążenia przez docelowy genom wirusa w komórce docelowej. Tak więc środek może być wprowadzony do różnych preparatów do podawania terapeutycznego. W szczególności, środki według wynalazku mogą być formułowane w farmaceutyczne kompozycje poprzez połączenie z odpowiednimi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami lub rozcieńczalnikami i mogą być formułowane w preparaty w postaci stałej, pół-stałej, ciekłej lub gazowej, np. obejmujące tabletki, kapsułki, proszki, granulki, maści, roztwory, czopki, zastrzyki, formy do inhalacji i aerozole.
Jako takie podawanie środków może być prowadzone różnymi sposobami, w tym poprzez podawanie doustne, podpoliczkowe, doodbytnicze, pozajelitowe, dootrzewnowe, śródskórne, przezskórne, dotchawicze itp.
[0031] W farmaceutycznych postaciach dawkowania, środki mogą być podawane same lub w odpowiednim połączeniu, jak również w połączeniu z innymi związkami farmaceutycznie aktywnymi. Dalej opisane sposoby i substancje pomocnicze stanowią jedynie przykłady i w żaden sposób nie ograniczają zakresu wynalazku.
[0032] W preparatach doustnych, środki mogą być stosowane same lub w połączeniu z odpowiednimi dodatkami do wytwarzania tabletek, proszków, granulek lub kapsułek, na przykład, z typowymi dodatkami, takimi jak laktoza, mannitol, skrobia kukurydziana lub skrobia ziemniaczana, ze środkami wiążącymi, takimi jak celuloza krystaliczna, pochodne celulozy, guma arabska, skrobia kukurydziana lub żelatyna, ze środkami rozsądzającymi, takimi jak skrobia kukurydziana, skrobia ziemniaczana lub sól sodowa karboksymetylocelulozy, ze środkami poślizgowymi, takimi jak talk lub stearynian magnezu, a w razie potrzeby, z rozcieńczalnikami, środkami buforującymi, nawilżającymi, środkami konserwującymi i środkami aromatyzującymi (smakowymi).
[0033] Środki mogą być formułowane w preparaty do wstrzykiwać przez rozpuszczenie, zawieszenie lub tworzenie emulsji w wodnych lub niewodnych rozpuszczalnikach, takich jak oleje roślinne lub inne podobne oleje, syntetyczne glicerydy kwasów alifatycznych, estry wyższych kwasów alifatycznych lub glikol propylenowy, i jeśli jest to wskazane, z tradycyjnymi dodatkami, takimi jak solubilizatory, środki izotoniczne, środki zawieszające, emulgatory, stabilizatory i środki konserwuj ące.
[0034] Środki mogą być stosowane w aerozolu do podawania przez inhalację. Związki według wynalazku mogą być formułowane w aerozol z gazami pędnymi takimi jak dichlorodifluorometan, propan, azot i tym podobne.
[0035] Ponadto, środki mogą być w postaci czopków uzyskanych przez zmieszanie z różnymi podłożami, takimi jak podłoża emulgujące lub podłoża rozpuszczalne w wodzie. Związki według wynalazku można podawać doodbytniczo w postaci czopków. Czopki mogą zawierać nośniki takie jak: masło kakaowe, woski glikole polietylenowe Carbowax i glikole polietylenowe, które topią się w temperaturze ciała, ale są w stanie stałym w temperaturze pokojowej.
[0036] Jednostkowe postacie dawkowania do podawania doustnego lub doodbytniczego, takie jak syropy, eliksiry i zawiesiny mogą być uzyskane, tak że każda jednostka dawkowania, na przykład, łyżeczka, łyżka, tabletka lub czopek, zawiera wcześniej określoną ilość kompozycji zawierającej jeden lub więcej inhibitorów. Podobnie jednostkowe postacie dawkowania do wstrzykiwać lub podawania dożylnego mogą zawierać inhibitor(y) w kompozycji w postaci roztworu w sterylnej wodzie, soli fizjologicznej lub innym farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
[0037] Określenie "jednostkowa postać dawkowania," jak tutaj stosowano, odnosi się do fizycznie odrębnych jednostek do wykorzystania jako dawki jednostkowe u ludzi i zwierząt, przy czym każda jednostka zawiera określoną ilość związków według wynalazku obliczoną tak aby związki aktywne były obecne w ilości wystarczającej do wytworzenia pożądanego efektu, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem, nośnikiem lub zaróbką. Zestawienie nowych jednostkowych postaci dawkowania według wynalazku zależy od konkretnego stosowanego związku i tego jaki efekt ma być osiągnięty, a także od farmakodynamiki związanej z każdym związkiem w organizmie gospodarza.
[0038] Farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, takie jak zarobki, adjuwanty, nośniki lub rozcieńczalniki, są łatwo dostępne. Ponadto farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, takie jak środki dostosowujące pH i środki buforujące, środki regulujące toniczność, stabilizatory, środki zwilżające itp. są łatwo dostępne.
[0039] Specjaliści w tej dziedzinie łatwo zauważą, że dawki mogą się różnić w zależności od określonego związku, rodzaju stosowanej zarobki do podawania, i tym podobnych. Korzystne dawki dla danego związku specjalista w tej dziedzinie łatwo określi, stosując różne środki.
[0040] Wprowadzenie skutecznej ilości środka do RNAi do komórek ssaków, jak opisano powyżej prowadzi do modulacji ekspresji docelowego genu (ów) np. obniżenia poziomu ekspresji docelowego genu(ów), jak opisano powyżej.
[0041] Opi sane powyżej sposoby są odpowiednie do stosowania w dowolnych komórkach ssaków, przy czym reprezentatywnymi komórkami ssaków interesującymi według wynalazku są między innymi komórki: zwierząt parzystokopytnych lub nieparzystokopytnych, np. bydła, kóz, świń, owiec, itp., gryzoni, np. chomików, myszy, szczurów, itp., zajęczaków, np. królików, naczelnych, np. małp, pawianów, ludzi, i tym podobnych.
[0042] Kompozycje mogą być korzystnie połączone i/lub stosowane w połączeniu lub naprzemiennie z innymi środkami przeciwwirusowymi, które są środkami terapeutycznymi lub profilaktycznymi i różnią się od omawianych związków. Kompozycje mogą także być korzystnie połączone i/ lub stosowane w połączeniu ze środkami do leczenia stanów często związanych z zakażeniami wirusowymi, które są wrażliwe na obecne związki, takie jak środki przeciwko HCV lub leki immunosupresyjne. W niektórych postaciach wynalazku, podawanie w połączeniu z przedmiotowymi kompozycjami zwiększa skuteczność takich środków. W związku z powyższym, związki według wynalazku, w połączeniu lub podawane w połączeniu z innymi środkami przeciwwirusowymi, mogą być stosowane w pewnych postaciach wynalazku w dawkach, które są mniejsze od spodziewanych, gdy środki te są stosowane same lub mniejsze niż ilości obliczone w przypadku leczenia skojarzonego.
[0043] Przykładowe możliwości terapii wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV) obejmują podawanie interferonów, np. interferonu alfa-2b, interferonu alfa-2a i interferonu aifacon-1. Rzadsze dawkowanie interferonu można osiągnąć stosując pegylowany interferon (interferon z dołączoną resztą glikolu polietylenowego, który znacząco poprawia jego farmakokinetykę). Leczenie skojarzone z interferonem alfa-2b (pegylowanym i niepegylowanym) i rybawaryną również okazało się skuteczne u niektórych populacji pacjentów. Inne, obecnie opracowane środki obejmują inhibitory replikacji RNA (np. serie VP50406 z ViroPharma), środki antysensowne, szczepionki terapeutyczne, inhibitory proteazy, inhibitory helikazy i terapie przeciwciałami (monoklonalnymi i poliklonalnymi).
[0044] Związki i kompozycje według wynalazku można również stosować ze środkami, które wspomagają system odpornościowy organizmu, w tym cyklofosfamidem w małej dawce, tymostymuliną, witaminami i suplementami diety (np. przeciwutleniaczami, w tym witaminą A, C, E, beta-karotenem, cynkiem, selenem, glutationem, koenzymem Q-10 i wyciągiem z jeżówki), i szczepionkami, np. kompleksem immunostymulującym (ISCOM), który składa się z preparatu szczepionki, obejmującego multimeryczną prezentację antygenu i adiuwant.
[0045] Opi sane powyżej sposoby znajdują zastosowanie w wielu różnych dziedzinach, z których reprezentatywne rodzaje zostały opisane bardziej szczegółowo poniżej.
ZASTOSOWANIE
[0046] Przedmiotowe sposoby znajdują zastosowanie w leczeniu wielu różnych stanów, w których pożądane jest zmniejszenie ilości docelowego genomu wirusowego w docelowej komórce lub u gospodarza zawierającego ten genom. W wielu postaciach wynalazku, przedmiotowe sposoby znajdują zastosowanie w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z wirusem. Leczenie oznacza, że osiąga się co najmniej złagodzenie objawów związanych z chorobą, dotykającą gospodarza, przy czym termin złagodzenie jest stosowany w szerokim sensie odnosząc się do co najmniej zmniejszenia wielkości parametru, np. objawu związanego z leczonym stanem. W związku z tym leczenie obejmuje również sytuacje, w których stan patologiczny, a przynajmniej objawy z nim związane, są całkowicie zahamowane, np. zapobiega się wystąpieniu objawu, lub dany objaw przestaje występować, np. kończy się i gospodarz nie cierpi już z powodu stanu lub przynajmniej z powodu objawów charakterystycznych dla tego stanu.
[0047] Przedmiotowe sposoby są przydatne w leczeniu wielu gospodarzy. Ogólnie, takimi gospodarzami są "ssaki" lub "ssacze", przy czym termin ten jest stosowany szeroko aby opisać organizmy, które należą do gromady Mammalia, w tym rząd mięsożerne (np. psy i koty), gryzonie (np. myszy, świnki morskie oraz szczury) i naczelne (np. ludzie, szympansy i małpy). W wielu realizacjach, gospodarzem będzie człowiek.
[0048] Jak wskazano powyżej, sposoby mogą być zastosowane do dowolnego wirusowego genomu, którego ilość w określonej komórce koreluje się z ilością miRNA w tej komórce. W pewnych postaciach wynalazku, genom wirusowy stanowi genom wirusa mającego genom RNA, przy czym wirus może być z rodziny Flaviviridae, np. hepacivirus, taki jak wirus zapalenia wątroby typu C, np. , Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat 1), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat BK), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat EC1), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat EC10), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat HC-J2), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat HC-J5), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat HC-J6), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat HC-J7), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat HC-J8), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat HC-JT), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat HCT18), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat HCT27), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat HCV-476), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat HCV-KF), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat Hunan), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat japoński), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat taiwański), Wirus zapalenia wątroby typu C (izolat TH) , Wirus zapalenia wątroby typu C izolat H, Wirus zapalenia wątroby typu C typ 1, Wirus zapalenia wątroby typu C typ 10, Wirus zapalenia wątroby typu C typ 2, Wirus zapalenia wątroby typu C typ 3, Wirus zapalenia wątroby typu C typ 4, Wirus zapalenia wątroby typu C typ 5, Wirus zapalenia wątroby typu C typ 6, Wirus zapalenia wątroby typu C typ 7, Wirus zapalenia wątroby typu C typ 8, itp.
[0049] W pewnych reprezentatywnych postaciach wynalazku, wynalazek jest stosowany w sposobach leczenia gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, np. wirus zapalenia wątroby nie będący typem A ani typem B (NANBH). W tych realizacjach, skuteczną ilość środka hamującego miRl22, takiego jak antysensowny oligo jak przykładowo opisano dalej, podaje się gospodarzowi, aby ilość HCV genomu w komórkach gospodarza, szczególnie w komórkach wątroby była zmniejszona, jak opisano powyżej.
KOMPOZYCJE FARMACEUTYCZNE
[0050] Przedmiotem wynalazku są również kompozycje farmaceutyczne zawierające związki hamujące miRNA zastosowane w przedmiotowych sposobach. Odpowiednio, związki, np. w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli, mogą być przygotowywane do podawania doustnego lub pozajelitowego do stosowania w tych sposobach, jak opisano powyżej.
[0051] Przykładowo, związki mogą być zmieszane z konwencjonalnymi farmaceutycznymi nośnikami i substancjami pomocniczymi (np. zarobkami) i stosowane w postaci wodnych roztworów, tabletek, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków i tym podobnych. Takie kompozycje farmaceutyczne zawierają w pewnych postaciach wynalazku, od około 0,1 do około 90% wagowych substancji czynnej, a bardziej ogólnie od około 1 do około 30% wagowych substancji czynnej. Farmaceutyczne kompozycje mogą zawierać typowe nośniki i substancje pomocnicze, takie jak skrobia kukurydziana lub żelatyna, laktoza, dekstroza, sacharoza, celuloza mikrokrystaliczna, kaolin, mannitol, difosforan wapnia, chlorek sodu i kwas alginowy. Środki rozsadzające powszechnie stosowane w preparatach według wynalazku obejmują kroskarmelozę, celulozę mikrokrystaliczną, skrobię kukurydzianą, sól sodową glikolanu skrobi i kwas alginowy.
[0052] Kompo zycje ciekłe zwykle składają się z zawiesiny lub roztworu związku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli w odpowiednim(-ch) ciekłym(-ch) nośniku(-ach), takim(-ch) jak na przykład, etanol, gliceryna, sorbitol, rozpuszczalniku niewodnym, taki jak glikol polietylenowy, oleje lub w wodzie, zawierając środek zawieszający, środek konserwujący, środek powierzchniowo czynny, środek zwilżający, środek aromatyzujący (smakowy) lub środek barwiący. Alternatywnie, postaci płynne mogą być wytwarzane z odtwarzalnego proszku.
[0053] Na przykład, proszek zawierający substancję czynną, środek zawieszający, sacharozę i słodzik może być rozpuszczony w wodzie do wytworzenia zawiesiny a syrop może być przygotowany z proszku zawierającego składnik aktywny, sacharozę i słodzik.
[0054] Kompo zycję w postaci tabletki można wytwarzać przy użyciu wszelkich odpowiednich nośników farmaceutycznych rutynowo stosowanych do wytwarzania kompozycji stałych. Przykłady takich nośników obejmują stearynian magnezu, skrobię, laktozę, sacharozę, celulozę mikrokrystaliczną i środki wiążące, na przykład, poliwinylopirolidon. Tabletka może również zawierać powłokę określonego koloru lub kolor może być wprowadzony do nośnika(ów). Ponadto, związek czynny może być przygotowany w postaci formy dawkowania o kontrolowanym uwalnianiu jako tabletka zawierająca podłoże hydrofiłowe lub hydrofobowe.
[0055] Kompozycja w postaci kapsułki może być wytworzona z użyciem rutynowych procedur kapsułkowania, na przykład przez wprowadzenie substancji czynnej i substancji pomocniczych do twardej kapsułki żelatynowej. Alternatywnie, pół-stała macierz substancji czynnej i glikolu polietylenowego o dużej masie cząsteczkowej może być przygotowana i wprowadzona do twardej kapsułki żelatynowej albo roztwór substancji czynnej w glikolu polietylenowym lub zawiesina w oleju jadalnym, na przykład w ciekłej parafinie lub frakcjonowanym oleju kokosowym, mogą być przygotowane i wprowadzone do miękkiej kapsułki żelatynowej.
[0056] Środki wiążące stosowane w tabletkach, które mogą być obecne obejmują gumę arabską, metylocelulozę, sól sodową karboksymetylocelulozy, poli-winylopirolidon (Rovidone), hydroksypropylometylocelulozę, sacharozę, skrobię i etylocelulozę. Środki smarujące, które mogą być zastosowane obejmują stearynian magnezu lub stearyniany innych metali, kwas stearynowy, płyn silikonowy, talk, woski, oleje i krzemionkę koloidalną.
[0057] Środki smakowo-zapachowe takie jak mięta pieprzowa, olejek z golterii pełzającej, aromat wiśniowy i tym podobne, mogą być również stosowane. Dodatkowo aby uzyskać bardziej atrakcyjny wygląd lub do identyfikacji produktu, może być pożądane dodanie barwnika do postaci do dawkowania.
[0058] Związki według wynalazku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, które są aktywne podczas podawania pozajelitowego można przygotowywać w formie do podawania domięśniowego, dooponowego lub dożylnego.
[0059] Typowa kompozycja do podawania domięśniowego lub podpajęczynówkowego będzie miała postać zawiesiny lub roztworu składnika aktywnego w oleju, na przykład, oleju arachidowym lub oleju sezamowym. Typowa kompozycja do podawania dożylnego lub podpajęczynówkowego będzie jałowym izotonicznym roztworem wodnym zawierającym, na przykład, składnik aktywny i dektrozę lub chlorek sodu lub mieszaninę dekstrozy i chlorku sodu. Inne przykłady obejmują mleczan Ringera do zastrzyków, mleczan Ringera do zastrzyków z dekstrozą, Normosol-M i dekstrozę, Isolit E, acylowany roztwór Ringera do zastrzyków i tym podobne. Ewentualnie preparat zawiera ko-rozpuszczalnik, na przykład, glikol polietylenowy, środek chelatujący, na przykład, kwas etylenodiaminotetraoctowy i przeciwutleniacz, na przykład, pirosiarczyn sodu. Alternatywnie, roztwór może być liofilizowany a następnie odtwarzany tuż przed podaniem z użyciem odpowiedniego rozpuszczalnika.
[0060] Związki według wynalazku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, które są aktywne przy podawaniu doodbytniczym można przygotowywać w postaci czopków. Typowy preparat czopków zwykle składa się z substancji czynnej ze środkiem wiążącym i/lub środkiem smarującym, takim jak żelatyna lub masło kakaowe lub inny roślinny lub syntetyczny wosk lub tłuszcz o niskiej temperaturze topnienia.
[0061] Związki według wynalazku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, które są aktywne przy podawaniu miejscowym mogą być przygotowane jako kompozycje przezskórne lub układy do podawania przezskórnego ("plastry - patches"). Takie kompozycje obejmują na przykład, podłoże, zbiornik związku aktywnego, błonę kontrolującą, wykładzinę i klej kontaktowy. Takie plastry transdermalne mogą być wykorzystane w celu zapewnienia ciągłej lub nieciągłej infuzji związków według wynalazku w kontrolowanych ilościach. Budowa i zastosowanie plastrów transdermalnych w celu dostarczania środków farmaceutycznych są dobrze znane. Zobacz np. patent US 5023252, udzielony 11 czerwca 1991, włączony tu w całości przez odniesienie. Plastry takie mogą być wytworzone tak aby dostarczały środek farmaceutyczny w sposób ciągły, pulsacyjny lub na żądanie.
[0062] Ewentualnie, kompozycja farmaceutyczna może zawierać inne farmaceutycznie dopuszczalne składniki, takie jak bufory, środki powierzchniowo czynne, przeciwutleniacze, środki modyfikujące lepkość, środki konserwujące i tym podobne. Każdy z tych składników jest dobrze znany. Zobacz na przykład patent US 5985310, którego ujawnienie jest tu włączone przez odniesienie.
[0063] Inne składniki odpowiednie do stosowania w kompozycjach według wynalazku można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company,
Philadelphia, Pennsylvania, wyd. 17. (1985). W jednej postaci wykonania, wodny roztwór cyklodekstryny zawiera ponadto dekstrozę, np. około 5% dekstrozy.
ZESTAWY
[0064] Przedstawione są również odczynniki i ich zestawy do wykonywania jednego lub więcej z wyżej opisanych sposobów. Przedmiotowe odczynniki i ich zestawy mogą być bardzo różne. Zazwyczaj zestawy zawierają co najmniej środek hamujący miRNA, jak opisano powyżej. Zestawy mogą zawierać również farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, które mogą być połączone lub przygotowane oddzielnie od środka hamującego miRNA w zestawie, np. w którym dwa składniki mogą być w tym samym lub oddzielnych pojemnikach.
[0065] Oprócz powyżej wspomnianych składników, zestawy dodatkowo będą zawierać instrukcje do przeprowadzenia tych sposobów. Instrukcje te mogą być obecne w zestawach w różnych formach, z których przynajmniej jedna może być obecna w zestawie. Jedną z form, w których instrukcje mogą być dostarczone jest podanie informacji na odpowiednim nośniku lub podłożu, np. na papierze, na którym informacje zostały wydrukowane, stanowiąc opakowanie zestawu, lub osobną ulotkę, itp. Jeszcze inny sposób obejmuje nośnik do komputerowego odczytu, np. dyskietkę, płytę CD itp. na którym informacja została zapisana. Jeszcze innym rozwiązaniem jest skorzystanie ze strony internetowej, która zapewnia dostęp do informacji przez internet. Każdy dogodny sposób może być zastosowany w zestawach.
UKŁADY
[0066] Ponadto wynalazek obejmuje układy, które znajdują zastosowanie w realizacji sposobów, jak opisano powyżej. Na przykład, układy do realizacji sposobów mogą obejmować jeden lub więcej preparatów farmaceutycznych, które obejmują środek hamujący miRNA. Określenie "układ" stosowane w dokumencie odnosi się do zestawu składników, np. środka czynnego, nośnika, itp. obecnych w jednej kompozycji lub jako osobne kompozycje, które są łączone razem w celu przeprowadzenia sposobu. Na przykład, oddzielnie uzyskane środek czynny i nośnik połączone razem i podane pacjentowi jednocześnie, według wynalazku, stanowią układ według wynalazku.
[0067] Przedstawione dalej przykłady są jedynie ilustracją rozwiązań, nie stanowiąc ograniczenia.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA I. Wyniki i dyskusja [0068] Aby rozpocząć poznawanie roli miR-122 w regulowaniu funkcjonowania mRNA, badano ekspresję miR-122 w próbkach RNA ekstrahowanych z tkanek wątroby oraz z linii komórkowych komórek wątroby. Fig. 1A przedstawia, że miR-122 mógł być wykrywany w wątrobie myszy i ludzi oraz w hodowlach linii komórkowych komórek wątroby Huh7, jednakże nie stwierdzono jego obecności w komórkach HeLa pochodzących z ludzkiego raka szyjki macicy, ani nawet w komórkach HepG2 pochodzących z wątroby ludzkiej (Fig. 1A).
[0069] Wiadomo, że RNA wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), który niesie mutacje adaptacyjne, może ulegać replikacji w komórkach Huh7 lecz nie w komórkach HepG2, i twórcy chcieli zbadać czy obecność miR-122 w komórkach Huh7 z RNA HCV ulegającym replikacji było czymś więcej niż tylko czystym zbiegiem okoliczności. W tym celu zbadano pozytywną nić RNA o długości 9 600 nukleotydów pod kątem ewentualnych miejsc wiążących miR-122, które spełniłyby wymagania konieczne do wystąpienia oddziaływania miRNA z docelowym RNA. Poszukiwano sekwencji w wirusowym mRNA, która mogłaby uczestniczyć w doskonałym parowaniu zasad według Watsona i Cricka, zawierającej od 2 do 8 nukleotydów, tj. „sekwencji seed" w obrębie miR-122. Wykorzystując tę zasadę stwierdziliśmy obecność w wirusowych rejonach niekodujących dwóch przewidywanych miejsc wiążących miR-122 (Fig. IB). Jeden region był zlokalizowany w zmiennym regionie wirusowego rejonu niekodu j ącego 3' genotyp typu 1 (Fig. 1C) . Mimo, że sekwencja ta była w nominalnie „rejonie zmiennym", badanie wszystkich sześciu genotypów HCV wykazało, że sekwencja dopasowana do seed sama była wysoko konserwowana (Tabela 1) . Drugie przewidywane miejsce wiążące miR-122 znajduje się w rejonie niekodującym 5' i jest oddalone o jedynie 21 nukleotydów od końca 5' genomu wirusowego (Fig. 1C) . Tutaj możliwa sekwencja dopasowania do seed była flankowana przez reszty adenozyny. Prowadzi to do dalszego parowania zasad z 1 nukleotydem w miRNA, który w większości przypadków stanowi reszta urydynowa, prowadząc do zwiększonej specyficzności oddziaływania docelowych mikroRNA. Możliwa domniemana sekwencja dopasowana do seed w obrębie miR-122 obejmująca flankujące reszty adenozyny jest w znacznym stopniu konserwowana wśród wszystkich genotypów wirusowych z wyjątkiem sekwencji dopasowanej do seed w genotypie 2, w której nie jest obecna zakotwiczająca adenozyna (Tabela 1).
Tabela 1
[0070] Przewidywane miejsca wiążące miR-122 w HCV są konserwowane we wszystkich genotypach. Sekwencję 5'UTR od nukleotydów 10-30 w genomie i sekwencję 3'UTR od kodonu stop do końca przewidywanego miejsca wiążącego, przedstawiono dla każdego z genotypów. Dopasowania seed wskazano wytłuszczoną czcionką.
[0071] Aby określić czy miR-122 odgrywa funkcjonalną rolę w regulacji ekspresji genów HCV, twórcy określili czy akumulacja replikonowych cząsteczek RNA ulegałaby regulacji w wyniku dezaktywacji miR-122 w komórkach NNeo/C-5B Huh7 (Ikeda, M. Yi, K. Li, S. M. Lemon, J. Virol. 76, 2997 (2002)). Komórki te prowadzą konstytutywną ekspresję dicistronowych wirusowych replikonów, w których wewnętrzne miejsce wejścia do rybosomu w HCV (IRES) ukierunkowuje syntezę produktu genu oporności na neomycynę, a IRES wirusa zapalenia serca, mózgu i rdzenia ukierunkowuje syntezę białek strukturalnych i niestrukturalnych szczepu Nib HCV (Fig. 2A, górny wykres). W celu dezaktywacji miR-122 w tej linii komórkowej, komórki NNeo/C-5B transfekowano 2' -O-metylowanym oligonukleotydem RNA (122-2'OMe), o długości 31 nukleotydów, 0 pełnej komplementarności z miR-122; wykazano, że komplementarne 2'O-metylowane nukleotydy RNA sekwestrują miRNA (Hutvagner, i wsp., PLoS Biol. 2, E98 (2004); Meister, 1 wsp., RNA 10, 544 (2004)). Jako kontrolę funkcjonalnej dezaktywacji miR-122 twórcy monitorowali ekspresję cząsteczek mRNA białka wskaźnikowego eGFP (eGFP-122), które zawierały sekwencje komplementarne z miR-122 w swoich rejonach niekodujących 3'. Ze względu na jego pełną komplementarność, miR-122 powinien funkcjonować tak jak siRNA względem tych cząsteczek docelowych i prowadzić do ich rozkładu nukleolitycznego. Faktycznie, niewielki pełnej długości RNA eGFP-122 był widoczny w komórkach transfekowanych plazmidem kodującym eGFP-122 (Fig. 2A, ścieżka 3), mimo, że podobny RNA, który zawierał miejsca komplementarne ze specyficznym dla mózgu miR-124 ulegał ekspresji na znacznym poziomie (Fig. 2A, ścieżka 2) . Po transfekcji z użyciem 122-2'OMe, ilość RNA eGFP-122 dramatycznie zwiększyła się (Fig. 2A, ścieżka 4), podczas gdy randomizowana odmiana tego oligomeru (Rand-2'OMe, ścieżka 5) lub oligomer komplementarny z miRNA let-7a (let7-2'OMe) nie wykazywał żadnego wpływu (Fig. 2A, ścieżka 6) . Oligomer o 23 merach komplementarny z miR-122 prowadził do tego samego efektu co 31-mer.
[0072] Niespodziewanie, poziom RNA wirusowego replikonu HCV ulegał selektywnemu i dramatycznemu zmniejszeniu, gdy miR-122 ulegał dezaktywacji (Fig. 2A, ścieżki 4 i 7) . Zmniejszona ilość wirusowego mRNA prowadziła do zmniejszenia poziomu ekspresji białek HCV w komórkach transfekowanych oligomerem 122-2'OMe, podczas gdy w tych warunkach doświadczalnych poziom białka wskaźnikowego eGFP uległ zwiększeniu (Fig. 2B, ścieżka 3). Możliwe, że oligomery 122-2'OMe oddziałują na RNA replikonu i poziomy białek poprzez oddziaływanie z negatywną nicią HCV, która wykazuje znaczącą komplementarność z sekwencją oligomeru w rejonie otaczającym przewidywane miejsca wiążące miR-122. Jednakże, oligomer w pełni komplementarny z negatywną nicią niekodującego rejonu 3' obejmującego przewidywane miejsce wiążące miR-122 w żaden sposób nie wpływał na poziom replikonu, co sugeruje, że wirusowa negatywna nić nie jest dostępna dla oligomeru. Ponadto, oligomer 122-2'OMe nie wpływał na poziom syntezy całkowitego białka w komórkach transfekowanych, co wyklucza możliwość, że oligomer 122-2'OMe indukował działania przeciwwirusowe. Podsumowując, odkrycia te wskazują, że miR-122 jest krytyczny do utrzymywania wewnątrzkomórkowej dużej ilości cząsteczek RNA replikonu HCV.
[0073] Aby stwierdzić czy miR-122 mógłby wpływać na akumulację RNA w komórkach świeżo tranfekowanych cząsteczkami RNA HCV ulegającymi replikacji, transkrypty RNA zsyntetyzowano z cDNA kodującego pełnej długości genom o genotypie 1 szczepu H77c z pięcioma adaptacyjnymi mutacjami (Fig. 2C, górny wykres), które umożliwiają uzyskanie wysokich poziomów replikacji RNA w komórkach Huh7 (Yi i Lemon, J. Virol. 78, 7904 (2004)). Wprowadzenie tych cząsteczek RNA do komórek Huh7 prowadziło do akumulacji wirusowego RNA w obecności endogennego miR-122 (Fig. 2C, ścieżki 1 i 2); przeciwnie, wirusowy RNA nie mógł być akumulowany, gdy miR-122 był sekwestrowany przez oligomery 122-2'OMe (Fig. 2C, ścieżka 3). Zatem konieczna jest obecność miR-122 aby utrzymać dużą ilość RNA HCV w przypadku obu typów genotypów la i lb, w liniach komórkowych, w których stabilnie zachodzi ekspresja i po bezpośredniej transfekcji.
[0074] Aby stwierdzić czy przypuszczalne miejsca wiążące miR-122 były konieczne do wpływu miR-122 na akumulację RNA, mutacje wprowadzono do pełnej długości cDNA H77c. Transfekcja cząsteczkami RNA H77c zawierającymi mutację obejmującą podstawienie czterech nukleotydów w przewidywanym dopasowania regionie dopasowania do seed w niekodującym rejonie 3' (Fig. 3A) , która powinna znosić wiązanie miR-122, nie zmniejszyła akumulacji RNA (Fig. 3B, ścieżka 2) . Przeciwnie, mutacja polegająca na substytucji czterech nukleotydów w przewidywanym regionie dopasowania do seed w rejonie niekodującym 5' (Fig. 3A) nie prowadziła do indukowania akumulacji RNA (Fig. 3B, ścieżka 3). Co zdumiewające, genomy, w których obecne były mutacje polegające na substytucji dwóch nukleotydów (Fig. 3B, ścieżka 4) lub nawet jednego nukleotydu (Fig. 3B, ścieżka 5) w pozycji 27 w wirusowym genomie (m5'C) również nie powadziły do akumulacji po pięciu dniach od transfekcji. Uzyskane dane wskazują, że albo niezdolność do pozyskania miR-122 prowadziła do utraty wirusowego RNA, albo mutacje miały pewien wpływ na replikację lub stabilność RNA.
[0075] Jeśli mutacje w sekwencji seed miR-122 zmniejszały akumulację RNA ze względu na słabe wiązanie miR-122, ekspresja ektopowa cząsteczek RNA miR-122, które zawierały mutację w trzecim nukleotydzie od końca 5' (mC) powinna przywracać tworzenie kompleksów RNA miR-122(mC)-m5'C (Lewis, i wsp., Celi 120, 15 (2005)). Ekspresja ektopowa cząsteczek RNA miR-122 typu dzikiego nie prowadziła do odzyskania zmutowanych wirusowych cząsteczek RNA zawierających m5'C (Fig. 3C, ścieżka 3), lecz zwiększała ilość cząsteczek RNA typu dzikiego (Fig. 3C, ścieżka 1) i cząsteczek RNA replikonu (Fig. S3A i B) , co wskazuje, że wprowadzone cząsteczki RNA miR-122 ulegały obróbce do funkcjonalnych jednoniciowych cząsteczek miR-122 RNA i że endogenna pula miR-122, która pośredniczy w akumulacji wirusowego RNA stanowi ograniczenie. Przeciwnie, ekspresja zmutowanych dupleksów m5'C miR-122 umożliwiała akumulację wirusowych RNA zawierających m5'C (Fig. 3C, ścieżka 4), silnie wskazując na genetyczne oddziaływanie pomiędzy miR-122 a sekwencją końcową 5' w genomie HCV. Ponadto, odzyskiwanie funkcjonowania przez zmutowane cząsteczki RNA wirusowego zawierające m5'C przez zmutowane cząsteczki mC-miR-122 musi być spowodowane raczej przez bezpośrednie oddziaływanie RNA-miR-122 HCV, niż przez pośrednie działanie poprzez inny, prawdopodobnie komórkowy cel dla miR-122.
[0076] Następnie twórcy badali czy miR-122 moduluje translację RNA HCV, która jak wiadomo zachodzi poprzez niezwykły mechanizm wewnętrznego wejścia do rybosomu (Ji, i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 16990 (2004); Otto, Celi 119, 369 (2004); Pestova, i wsp., Genes Dev. 12, 67 (1998)). Bardziej szczegółowo, twórcy badali produkcję białka rdzeniowego HCV na bazie wirusowych cząsteczek RNA ulegających replikacji i nie ulegających replikacji, w obecności lub przy braku funkcjonalnego miejsca wiążącego miR-122. Fig. 4 wskazuje, że podobne ilości białka rdzeniowego ulegały akumulacji w komórkach transfekowanych cząsteczkami RNA typu dzikiego (ścieżka 1) lub zmutowanych RNA m5'C (ścieżka 2) po dwudziestu godzinach od transfekcji, w momencie, gdy powinna wystąpić replikacja niewielkiej ilości RNA. Aby zbadać bezpośrednio czy rdzeń został zsyntetyzowany z wprowadzonych cząsteczek RNA, badano translację cząsteczek wirusowego RNA nie ulegających replikacji. Wyniki wykazały, że wprowadzone cząsteczki RNA typu dzikiego (Fig. 4, ścieżka 3) i zmutowane m5'C (ścieżka 4) ulegały translacji z podobną wydajnością, co wskazuje, że miR-122 reguluje ilość RNA HCV na etapie następnym po etapie translacji, najprawdopodobniej na etapie replikacji RNA.
[0077] Odkrycie twórców wynalazku, że cząsteczka miR-122 jest wiązana do sekwencji genomu HCV na jego końcu 5' jest nowym odkryciem. Wyniki te wykazują, że miR122 jest cząsteczką docelową przy kontrolowaniu poziomów HCV, i dlatego stanowi cel przy leczeniu stanów chorobowych związanych z zakażeniem HCV. II. Materiały i metody
A. Oligonukleotydy i konstrukty DNA
[0078] Oligonukleotydy RNA i 2'-O-metylowane oligonukleotydy zostały zsyntetyzowane przez spółkę Dharmacon Inc. (Lafayette, CO). Sekwencje były następujące: 122-2'OMe, 5'AGACACAAACACCAUUGUCACACUCCACAGC (SEQ ID NO:15);
Rand-2'OMe, 5' CACGUUAAAACCAUACGCACUACGAAACCCC (SEQ IDNO:16); let7-2'OMe, 5'CUAAAACUAUACAACCUACUACCUCAUCCCA (SEQ ID NO:17); 122-2'OMe23, 5'ACAAACACCAUUGUCACACUCCA (SEQ IDNO:18); HCVbs-2'OMe, 5'UGAACGGGGAGCUAAACACUCCA ((SEQ ID NO:19); miR-122wt, 5'UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU ((SEQ ID NO:20); miR-122mC, 5'UGCAGUGUGACAAUGGUGUUUGU (SEQ ID NO:21); miR-122*, 5'AAACGCCAUUAUCACACUAAAUA ((SEQ ID NO :22).
Dupleksy utworzono pomiędzy cząsteczkami typu dzikiego lub formami mC miR-122 a miR-122*. Plazmid miR-122 niosący białko wskaźnikowe eGFP-122 skonstruowano poprzez insercję z użyciem techniki PCR sekwencji 5'ACAAACACCAUUGUCACACUCCA (SEQ ID NO:23), która wykazuje pełną komplementarność z miR-122, w miejsce restrykcyjne Not I w regionie niekodującym 3' plazmidu pd2eGFP-Nl (Clontech). Aby skonstruować wektor kontrolny eGFP-124, wprowadzono sekwencję 5'TTAAGGCACGCGGTGAATGCCA (SEQ ID NO:24), która jest komplementarna z miR 124 występującym selektywnie w mózgu. Mutacje polegające na substytucji wprowadzono do rejonów niekodujących 3' i wektora replikonu H77c (Yi & Lemon, J Virol 78, 7904 (Aug, 2004)) stosując nakładającą się PCR i mutagenne startery, a następnie ligację produktów PCR z wektorem wyjściowym. B. Hodowla i transfekcja komórek [0079] Komórki linii komórkowych Huh7, HeLa i HepG2 hodowano w DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% aminokwasami niebędącymi aminokwasami niezbędnymi (Gibco) . Komórki linii Huh7 zawierające dicistronowy replikon NNeo/C-5B, jak opisano wcześniej (Ikeda, i wsp., J Virol 76, 2997 (Mar, 2002)), hodowano w obecności 1 mg/ml G418. Genomowy RNA ulegający transkrypcji H77c in vitro wprowadzono do komórek Huh7 przez elektroporację jak opisano w Yi & Lemon, supra, i uzyskano RNA, który poddano badaniu 5 dni później. Aby obserwować syntezę białek z RNA H77c nie ulegającego replikacji, zastosowano Dmrie-C (Invitrogen) w celu dostarczenia RNA do komórek Huh7, i uzyskano lizaty białkowe, które poddano badaniu 20 godzin później . Zastosowano taką metodę, gdyż komórki poddane elektroporacji nie były w pełni adherentne przy tak wcześnie przeprowadzonych badaniach. Konstrukty DNA i oligonukleotydy wprowadzano do komórek stosując lipofektaminę 2000 (Invitrogen), zgodnie z instrukcją producenta. 2'-O-metylowane oligonukleotydy i dupleksy RNA miR-122 dostarczano w stężeniach 50nM do komórek w 6-studzienkowych szalkach. Transfekowane komórki przed zebraniem hodowano przez 48 godzin. C. Wyodrębnianie RNA i Northern blotting
[0080] Całkowity RNA ekstrahowano z komórek stosując odczynnik Trizol (Invitrogen), zgodnie z instrukcją producenta. Aby wykryć ekspresję miRNA, 30 μρ całkowitego RNA rozdzielono na 15% poliakrylamidowych żelach zawierających 7M mocznik w 0,5x TBE, przeniesiono na membranę Hybond N+ (Amersham) i hybrydyzowano z 32P-znakowanym oligonukleotydem 5' komplementarnym z miR-122 o sekwencji 5'ACAAACACCAUUGUCACACUCCA (SEQ ID NO:25) . Aby zanalizować poziomy mRNA, 2,5 μρ RNA z komórek replikonu NNeo/C-5B, lub 15 μρ RNA z komórek transfekowanych RNA H77c, rozdzielono w 1% żelu agarozowym zawierającym bufor 1 x MOPS i 2,2M formaldehyd, i przenoszono na membranę Zeta-probe (Bio-Rad). Membrany hybrydyzowano w ExpressHyb (Clontech) z sondami random-primed znakowanymi 32P DNA odpowiadającym nukleotydom 84-374 HCV, 40-814 eGFP, i 685-1171 α-aktyny jak wskazano. D. Western blotting i znakowanie metaboliczne [0081] Próbki białek otrzymano przez zeskrobanie komórek do RIPA zawierającego pełny koktajl inhibitorów proteaz (Roche). 10 μρ białka rozdzielono techniką SDS-PAGE w żelu 12% i przeniesiono na membranę Immobilon-P (Millipore). Membrany następnie znakowano z użyciem przeciwciała 6G7 skierowanego przeciwko białku rdzenia HCV (otrzymanego dzięki uprzejmości Harry'ego Greenberga, z Uniwersytetu Stanforda), lub przeciwciał skierowanych przeciwko eGFP (Roche) lub aktynie (Sigma). Do znakowania metabolicznego komórki inkubowano w pożywce bez metioniny przez 1 godzinę przed inkubacją z 35S-metioniną przez 1 godzinę i ekstrakcją białka. Białko, 25 μρ, wytrącono stosując kwas trichlorooctowy i ilość wbudowanej 35S-metioniny określano ilościowo przez wiązanie z filtrem. E. Dane dotyczące sekwencji [0082] Sekwencje rejonów niekodujących 5' i 3' różnych genotypów HCV otrzymano z bazy danych HCV, obecnej na stronie internetowej, którą wytworzono przez wpisanie "http://" przed i ".gov" po "hcv.lanl" a reprezentatywne przykłady każdego z genotypów przedstawiono w tabeli 1. Szczepy były następujące: H77c (genotyp la), nr dostępu w banku genów: AF011751; HCVN (1 b) , AF13 95 94; JFH-1 (2a), AB047639; NZL11 (3a), D17763; HEMA51 (4a), D45193 i D45194; FR741 (5a), D50466 i D50467; TH271 (6f), D37848 i D37858.
[0083] Jest oczywiste, z powyższych wyników i dyskusji, że przedmiotem wynalazku są nowe sposoby leczenia chorób związanych z HCV. W związku z tym, wynalazek stanowi istotny wkład do stanu techniki.
[0084] Publikacje cytuje się ze względu na ich ujawnienie przed datą zgłoszenia, lecz nie powinno to być interpretowane jako przyznanie, że wynalazek nie jest uprawniony do antydatowania takiej publikacji poprzedzającej wynalazek.
[0085] Jakkolwiek powyższy wynalazek został opisany szczegółowo, jako ilustracja i przykład, aby zapewnić jasność i zrozumienie wynalazku, to jest oczywiste dla fachowca w tej dziedzinie w świetle tego opisu, że pewne zmiany i modyfikacje mogą być wprowadzane do wynalazku w zakresie ograniczonym zastrzeżeniami.
LISTA SEKWENCJI <11G> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University <120> Sposoby i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego w komórkach docelowych
<130> STAN-364WO <150> 60/568,358 <151> 2004-05-04 <160> 25 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213>ludzki <4 00> 1 ugaugggggc gacacuccac <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> ludzki <400> 2 ugaagguugg gguaacacuc cggcc <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213>ludzki <400> 3 auugggggcg acacuccacc <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213>ludzki <400> 4 ugaacgggga gcuaaacacu ccagg <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213>ludzki <400> 5 aauaggggcg acacuccgcc <210> 6 <211> 28 <212> RNA <213>ludzki <400> 6 uagagcggca cacacuaggu acacucca
<210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> iudzki <400> 7 uacgaggcga cacuccacca <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> ludzki <400> 8 ugagcuggua agauaacacu ccauu
<210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> ludzki <400> 9 uaugagagca acacuccacc <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> ludzki <400> 10 uaggcagcuu aacacuccga ccuua <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> ludzki <400> 11 uauuggggcg acacuccacc <210> 12 <211> 25 <212> RNA <213> ludzki <400> 12 uaggcuggga gcuaaacacu ccaua <210> 13 <211> 20 <212> RNA <213>ludzki <400> 13 aauggggcga cacuccacca <210> 14 <400> 14 000 <210> 15 <211> 31 <212> RNA <213> ludzki <400> 15 agacacaaac accauuguca cacuccacag c <210> 16 <211> 30 <212> RNA <213> ludzki <400> 16 cacguuaaaa ccauacgcac uacgaaaccc
<210> 17 <211> 31 <212> RNA <213> ludzki <400> 17 cuaaaacuau acaaccuacu accucauccc a
<210> 18 <211> 23 <212> RNA <213> ludzki <400> 18 acaaacacca uugucacacu cca <210> 19 <211> 23 <212> RNA <213> ludzki <4 0Q> 19 ugaacgggga gcuaaacacu cca <210> 20 <211> 23 <212> RNA <213> ludzki <400> 20 uggaguguga caaugguguu ugu
<210> 21 <211> 23 <212> RNA <213> ludzki <400> 21 ugcaguguga caaugguguu ugu <210> 22 <211> 23 <212> RNA <213> ludzki <400> 22 aaacgccauu aucacacuaa aua <210> 23 <211> 23 <212> RNA <213> iucjzki <400> 23 acaaacacca uugucacacu cca <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> ludzki <400> 24 ttaaggcacg cggtgaatgc ca <210> 25 <211> 23 <212> RNA <213> ludzki <400> 25 acaaacacca uugucacacu cca

Claims (15)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Środek hamujący miR122 do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, gdzie środek ten jest antysensownym oligonukleotydem lub środkiem powodującym interferencję RNA.
  2. 2. Środek według zastrz. 1, do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, gdzie antysensowny oligonukleotyd obejmuje sekwencję przedstawioną jako SEQ ID NO:15 lub SEQ ID NO:18.
  3. 3. Środek według zastrz. 2, do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, gdzie antysensowny oligonukleotyd składa się z sekwencji przedstawionej jako SEQ ID NO:15 lub SEQ ID NO:18.
  4. 4. Środek według dowolnego z zastrz. 1-3, do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, gdzie antysensowny oligonukleotyd jest 2'-O-metylowanym oligonukleotydem RNA.
  5. 5. Środek według dowolnego z powyższych zastrzeżeń do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, gdzie gospodarzem jest człowiek.
  6. 6. Środek według dowolnego z powyższych zastrzeżeń do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, w połączeniu lub w kombinacji z innym związkiem aktywnym farmaceutycznie.
  7. 7. Środek według dowolnego z zastrz. 1-5 do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, w kombinacji i/lub naprzemiennie z innym leczniczym lub profilaktycznym środkiem przeciwwirusowym.
  8. 8. Środek według zastrz. 7 do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, w kombinacji ze środkiem przeciwko HCV.
  9. 9. Środek według zastrz. 8 do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, gdzie środek przeciwko HCV jest wybrany spośród interferonów, inhibitorów replikacji RNA, środków antysensownych, szczepionek leczniczych, inhibitorów proteazy, inhibitorów helikazy i leczenia przeciwciałami.
  10. 10. Środek według zastrz. 9 do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, gdzie środek przeciwko HCV jest interferonem.
  11. 11. Środek według zastrz. 9 do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, gdzie środek przeciwko HCV jest inhibitorem replikacji RNA.
  12. 12. Środek według zastrz. 9 do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, gdzie środek przeciwko HCV jest inhibitorem proteazy.
  13. 13. Środek według zastrz. 9 do zastosowania w leczeniu gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV, gdzie środek przeciwko HCV jest inhibitorem helikazy.
  14. 14. Zastosowanie środka hamującego miR122 określonego w dowolnym z zastrz. 1-13 do wytwarzania leku do leczenia gospodarza cierpiącego na stan chorobowy związany z zakażeniem HCV.
  15. 15. Spo sób modulowania in vitro ilości genomu wirusa zapalenia wątroby typu C w komórkach docelowych, który obejmuje hamowanie aktywności miR122 w komórce docelowej przez wprowadzenie środka hamującego miR122 określonego w dowolnym z zastrz. 1-6 do tej komórki docelowej.
PL05749437T 2004-05-04 2005-05-03 Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych PL1747023T5 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56835804P 2004-05-04 2004-05-04
EP05749437.9A EP1747023B2 (en) 2004-05-04 2005-05-03 Methods and compositions for reducing hcv viral genome amounts in a target cell
PCT/US2005/015264 WO2005107816A2 (en) 2004-05-04 2005-05-03 Methods and compositions for reducing viral genome amounts in a target cell

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL1747023T3 PL1747023T3 (pl) 2011-08-31
PL1747023T5 true PL1747023T5 (pl) 2017-05-31

Family

ID=35320743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL05749437T PL1747023T5 (pl) 2004-05-04 2005-05-03 Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych

Country Status (15)

Country Link
US (6) US7307067B2 (pl)
EP (3) EP2338996A3 (pl)
JP (2) JP4943322B2 (pl)
AT (1) ATE494373T2 (pl)
AU (1) AU2005240118C1 (pl)
CA (2) CA2912903A1 (pl)
CY (1) CY1111755T1 (pl)
DE (1) DE602005025751D1 (pl)
DK (1) DK1747023T4 (pl)
ES (1) ES2361458T5 (pl)
IL (1) IL178679B (pl)
PL (1) PL1747023T5 (pl)
PT (1) PT1747023E (pl)
SI (1) SI1747023T1 (pl)
WO (1) WO2005107816A2 (pl)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
JP5654722B2 (ja) 2003-11-26 2015-01-14 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 短鎖ｒｎａ機能の配列特異的阻害法
PL1747023T5 (pl) 2004-05-04 2017-05-31 Univ Leland Stanford Junior Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych
EP2290072B1 (en) 2004-05-28 2014-12-17 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
ES2534304T3 (es) 2004-11-12 2015-04-21 Asuragen, Inc. Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
WO2006113431A2 (en) * 2005-04-13 2006-10-26 University Of Massachusetts Dual functional oligonucleotides for use as anti-viral agents
WO2007021896A2 (en) 2005-08-10 2007-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro rna and uses thereof
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
JP5523705B2 (ja) 2005-08-29 2014-06-18 レグルス・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｍｉｒ−１２２ａをモジュレートする使用方法
US7516342B2 (en) 2005-12-30 2009-04-07 Intel Corporation Method, apparatus and system to dynamically choose an optimum power state
ES2715625T3 (es) 2006-04-03 2019-06-05 Roche Innovation Ct Copenhagen As Composición farmacéutica que comprende oligonucleótidos antisentido anti-miARN
PL2666859T3 (pl) 2006-04-03 2019-09-30 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Kompozycja farmaceutyczna zawierająca antysensowne oligonukleotydy anty-miRNA
EP2076599A2 (en) * 2006-09-19 2009-07-08 Asuragen, Inc. Mir-200 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
EP2126079A1 (en) 2007-03-22 2009-12-02 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the inhibition of apo-b100 expression
US8580756B2 (en) 2007-03-22 2013-11-12 Santaris Pharma A/S Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA
JP5149528B2 (ja) * 2007-03-30 2013-02-20 学校法人東京医科大学 Ｃ型肝炎ウイルスの複製を制御するマイクロｒｎａ
US8415323B2 (en) * 2007-08-27 2013-04-09 The Regents Of The University Of California MicroRNAs for inhibiting viral replication
EP2198050A1 (en) 2007-09-14 2010-06-23 Asuragen, INC. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
DK2205737T3 (da) * 2007-10-04 2013-05-21 Santaris Pharma As Mikromirer
US8071562B2 (en) 2007-12-01 2011-12-06 Mirna Therapeutics, Inc. MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2009109665A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
WO2010012667A1 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Santaris Pharma A/S Micro-rna mediated modulation of colony stimulating factors
EP2346883B1 (en) 2008-09-23 2016-03-23 Scott G. Petersen Self delivering bio-labile phosphate protected pro-oligos for oligonucleotide based therapeutics and mediating rna interference
EP2191834A1 (en) 2008-11-26 2010-06-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Compositions and methods for treating retrovirus infections
WO2010122538A1 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of hcv patients that are non-responders to interferon
EP2456870A1 (en) 2009-07-21 2012-05-30 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting pcsk9
WO2011130371A1 (en) 2010-04-13 2011-10-20 Life Technologies Corporation Compositions and methods for inhibition of nucleic acids function
ES2699630T3 (es) 2010-04-23 2019-02-12 Cold Spring Harbor Laboratory Novedosos ARNhc diseñados estructuralmente
US9045749B2 (en) 2011-01-14 2015-06-02 The General Hospital Corporation Methods targeting miR-128 for regulating cholesterol/lipid metabolism
US9644241B2 (en) 2011-09-13 2017-05-09 Interpace Diagnostics, Llc Methods and compositions involving miR-135B for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
US8492386B2 (en) 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
SE1450130A1 (sv) 2011-10-21 2014-05-07 Abbvie Inc Förfaranden för att behandla hcv innefattande minst två direktverkande antivirala agenser, ribavirin men inte interferon
EP2583680A3 (en) 2011-10-21 2013-06-12 Abbvie Inc. Mono (PSI-7977) or combination treatment of DAAs for use in treating HCV
SG11201508925WA (en) 2013-05-01 2015-11-27 Regulus Therapeutics Inc Microrna compounds and methods for modulating mir-122
SG10201908122XA (en) 2013-06-27 2019-10-30 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
WO2016049512A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 University Of Massachusetts Rna-modulating agents
SG11201703646SA (en) 2014-11-10 2017-06-29 Glaxosmithkline Intellectual Property (No 2) Ltd Combination long acting compositions and methods for hepatitis c
US20170312297A1 (en) 2014-11-10 2017-11-02 Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited Long Acting Pharmaceutical Compositions For Hepatitis C
EA201892448A1 (ru) 2016-04-28 2019-06-28 Эмори Юниверсити Алкинсодержащие нуклеотидные и нуклеозидные терапевтические композиции и связанные с ними способы применения
JP7279081B2 (ja) 2018-05-08 2023-05-22 レグルス セラピューティクス インコーポレイテッド Ｍｉｒ－１２２を調節するためのマイクロｒｎａ化合物及び方法
CN111904973B (zh) * 2020-07-27 2021-12-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 ssc-miR-122在制备调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的药物中的应用

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5023252A (en) 1985-12-04 1991-06-11 Conrex Pharmaceutical Corporation Transdermal and trans-membrane delivery of drugs
ATE240401T1 (de) 1989-03-21 2003-05-15 Vical Inc Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
US5610050A (en) * 1990-04-20 1997-03-11 The General Hospital Corporation Methods of preventing viral replication
WO2002081494A1 (en) * 2001-03-26 2002-10-17 Sirna Therapeutics, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
JPH06311885A (ja) 1992-08-25 1994-11-08 Mitsubishi Kasei Corp Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子に相補的なアンチセンス化合物
US6423489B1 (en) 1992-09-10 2002-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases
US5985847A (en) 1993-08-26 1999-11-16 The Regents Of The University Of California Devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides
JPH10503364A (ja) 1994-05-10 1998-03-31 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション Ｃ型肝炎ウイルスのアンチセンス阻害
US5922687A (en) 1995-05-04 1999-07-13 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Intracellular delivery of nucleic acids using pressure
EP0877600B1 (en) 1996-08-09 2003-10-22 Alcon Manufacturing Ltd. Preservative systems for pharmaceutical compositions containing cyclodextrins
US6824768B2 (en) * 1998-12-18 2004-11-30 Schering Corporation Ribavirin-pegylated interferon alfa induction HCV combination therapy
JP4371812B2 (ja) * 2001-09-28 2009-11-25 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ マイクロｒｎａ分子
FR2830254B1 (fr) * 2001-09-28 2004-09-17 Synkem Nouvelles diphosphines, leurs complexes avec des metaux de transition et leur utilisation en synthese asymetrique
ATE519774T1 (de) 2002-02-20 2011-08-15 Sirna Therapeutics Inc Durch eine störung der rna vermittelte inhibierung der genexpression des hepatitis c virus (hcv) mit kurzer, störender nukleinsäure (short interfering nucleic acid, sina)
US20040175732A1 (en) * 2002-11-15 2004-09-09 Rana Tariq M. Identification of micrornas and their targets
US20060247193A1 (en) * 2003-02-10 2006-11-02 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Regulation of gene expression by dna interference
BRPI0407587A (pt) * 2003-02-18 2006-02-14 Pfizer inibidores do vìrus da hepatite c, composições e tratamentos que os utilizam
WO2005013901A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
WO2005013904A2 (en) 2003-08-04 2005-02-17 University Of Massachusetts Sars nucleic acids, proteins, vaccines, and uses thereof
CA2532795A1 (en) 2003-08-07 2005-02-17 Avi Biopharma, Inc. Sense antiviral compound and method for treating ssrna viral infection
JP5654722B2 (ja) * 2003-11-26 2015-01-14 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 短鎖ｒｎａ機能の配列特異的阻害法
PL1747023T5 (pl) * 2004-05-04 2017-05-31 Univ Leland Stanford Junior Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
US20090203893A1 (en) 2005-08-29 2009-08-13 Regulus Therapeutics, Llc Antisense compounds having enhanced anti-microrna activity
ES2715625T3 (es) 2006-04-03 2019-06-05 Roche Innovation Ct Copenhagen As Composición farmacéutica que comprende oligonucleótidos antisentido anti-miARN
DK2205737T3 (da) 2007-10-04 2013-05-21 Santaris Pharma As Mikromirer
CA2804178C (en) 2009-06-29 2018-04-24 Rob Nielson A disc brake for a tape measure

Also Published As

Publication number Publication date
EP1747023A4 (en) 2010-03-03
IL178679B (en) 2019-01-31
EP2500431A2 (en) 2012-09-19
ES2361458T3 (es) 2011-06-17
WO2005107816A3 (en) 2006-02-23
PT1747023E (pt) 2011-04-11
DE602005025751D1 (de) 2011-02-17
US20080234220A1 (en) 2008-09-25
ES2361458T5 (es) 2016-04-20
CA2564503C (en) 2015-12-29
SI1747023T1 (sl) 2011-06-30
US7307067B2 (en) 2007-12-11
DK1747023T4 (en) 2016-05-02
CA2912903A1 (en) 2005-11-17
US20120329856A1 (en) 2012-12-27
US9416362B2 (en) 2016-08-16
JP2007536242A (ja) 2007-12-13
PL1747023T3 (pl) 2011-08-31
ATE494373T2 (de) 2011-01-15
US7838504B2 (en) 2010-11-23
EP2338996A2 (en) 2011-06-29
JP5602123B2 (ja) 2014-10-08
IL178679A0 (en) 2007-02-11
US20150005362A1 (en) 2015-01-01
US20110124707A1 (en) 2011-05-26
US20160348116A1 (en) 2016-12-01
DK1747023T3 (da) 2011-04-18
AU2005240118C1 (en) 2014-02-13
AU2005240118A1 (en) 2005-11-17
US20050288245A1 (en) 2005-12-29
JP4943322B2 (ja) 2012-05-30
EP1747023B2 (en) 2016-03-09
US8759312B2 (en) 2014-06-24
JP2012102116A (ja) 2012-05-31
CY1111755T1 (el) 2015-10-07
CA2564503A1 (en) 2005-11-17
EP2500431A3 (en) 2013-12-18
EP1747023A2 (en) 2007-01-31
US8217020B2 (en) 2012-07-10
EP1747023B1 (en) 2011-01-05
AU2005240118B2 (en) 2011-09-08
EP2338996A3 (en) 2013-12-18
WO2005107816A2 (en) 2005-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL1747023T5 (pl) Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych
US8691781B2 (en) Compositions for treating respiratory viral infections and their use
US8415323B2 (en) MicroRNAs for inhibiting viral replication
EP2071030A2 (en) Oligoribonucleotide or peptide nucleic acid which inhibits action of hepatitis C virus
US8957199B2 (en) Oligoribonucleotide or peptide nucleic acid capable of inhibiting activity of hepatitis C virus
AU2015201136B2 (en) Methods and compositions for reducing viral genome amounts in a target cell
JP2008541754A (ja) Ｈｃｖ特異的な低分子干渉ｒｎａおよびそれを含むｃ型肝炎の治療剤
CN102618541A (zh) 用于治疗呼吸道病毒感染的组合物及其用途
JP2013223426A (ja) Ｒｒｍ２のアンタゴニストを有効成分として含有するｃ型肝炎治療剤