JP7372917B2 - ｍｉＲＮＡを含有する、腎癌の処置における使用のための薬学的キャリア - Google Patents
ｍｉＲＮＡを含有する、腎癌の処置における使用のための薬学的キャリア Download PDFInfo
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Description
本発明は、腎癌の新たな治療的処置に関する。より詳細には、本発明は、腎癌の処置に有効な特定のｍｉＲＮＡのセットを担持する薬学的キャリアの使用に関する。腎癌を処置するための薬学的キャリアとしての、幹細胞に由来する細胞外小胞（ＥＶ）に焦点をあてる。
腫瘍の血管形成（vascularization）は、腫瘍の成長および転移における基本的なステップである。固形腫瘍は、実際に、血管による酸素および栄養素の供給なしでは数平方ミリメートルを超えて成長できない。さらに、転移の数は、原発腫瘍の血管密度に相互に関連する。
腫瘍内皮細胞（ＴＥＣ）は、正常内皮細胞とは異なり、血管新生促進表現型（pro-angiogenic phenotype）を呈する。例えば、ＴＥＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて血清とは無関係な高い運動および増殖、ならびにＡｋｔシグナル伝達を介した生存率の向上を実証している。表現型の上では、ＴＥＣは、ＶＥＧＦおよびＥＧＦ受容体を含む増殖因子受容体の発現を向上させることがあった。ＴＥＣは、ある化学療法薬物にも耐性であり、ＶＥＧＦを標的とする抗血管新生薬にさほど感受性ではない。さらに、ＴＥＣは、遺伝子学的に正常内皮細胞と異なる。
細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞間コミュニケーションの重要な機構と思われ、その活性カーゴは、レシピエント細胞の機能および表現型を改変することにより、それを再プログラムし得る。実際に、ＥＶの活性は、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび脂質を含むいくつかの異なる因子の移動にリレーするとみられ、中でもマイクロＲＮＡは、主要な役割を有すると思われる。幹細胞に由来するＥＶ、詳細にはヒト骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）は、腫瘍型および発現段階に応じて、腫瘍形成促進活性（pro-tumorigenic activity）および抗腫瘍形成活性の両方を呈することが公知である。同様に、ＭＳＣ－ＥＶも、腫瘍の血管形成を陽性にも、または陰性にも調整し得る（Zhu W, Huang L, Li Y, Zhang X, Gu J, Yan Y, et al. Exosomes derived from human bone marrow mesenchymal stem cells promote tumor growth in vivo. Cancer letters. 2012;315(1):28-37）。ＭＳＣ－ＥＶは、腫瘍を抱えるマウスへの投与後に、ｉｎ ｖｉｖｏで血管新生促進性になると報告された（Zhu W, Xu W, Jiang R, Qian H, Chen M, Hu J, et al. Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth in vivo. Exp Mol Pathol. 2006;80(3):267-74）。他の研究では、ＭＳＣ－ＥＶの、腫瘍細胞によるＶＥＧＦ分泌に対する間接的効果が観察された。
腫瘍内皮細胞（ＴＥＣ）は、正常内皮細胞とは異なり、血管新生促進表現型（pro-angiogenic phenotype）を呈する。例えば、ＴＥＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて血清とは無関係な高い運動および増殖、ならびにＡｋｔシグナル伝達を介した生存率の向上を実証している。表現型の上では、ＴＥＣは、ＶＥＧＦおよびＥＧＦ受容体を含む増殖因子受容体の発現を向上させることがあった。ＴＥＣは、ある化学療法薬物にも耐性であり、ＶＥＧＦを標的とする抗血管新生薬にさほど感受性ではない。さらに、ＴＥＣは、遺伝子学的に正常内皮細胞と異なる。
細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞間コミュニケーションの重要な機構と思われ、その活性カーゴは、レシピエント細胞の機能および表現型を改変することにより、それを再プログラムし得る。実際に、ＥＶの活性は、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび脂質を含むいくつかの異なる因子の移動にリレーするとみられ、中でもマイクロＲＮＡは、主要な役割を有すると思われる。幹細胞に由来するＥＶ、詳細にはヒト骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）は、腫瘍型および発現段階に応じて、腫瘍形成促進活性（pro-tumorigenic activity）および抗腫瘍形成活性の両方を呈することが公知である。同様に、ＭＳＣ－ＥＶも、腫瘍の血管形成を陽性にも、または陰性にも調整し得る（Zhu W, Huang L, Li Y, Zhang X, Gu J, Yan Y, et al. Exosomes derived from human bone marrow mesenchymal stem cells promote tumor growth in vivo. Cancer letters. 2012;315(1):28-37）。ＭＳＣ－ＥＶは、腫瘍を抱えるマウスへの投与後に、ｉｎ ｖｉｖｏで血管新生促進性になると報告された（Zhu W, Xu W, Jiang R, Qian H, Chen M, Hu J, et al. Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth in vivo. Exp Mol Pathol. 2006;80(3):267-74）。他の研究では、ＭＳＣ－ＥＶの、腫瘍細胞によるＶＥＧＦ分泌に対する間接的効果が観察された。
最近、本発明者らは、肝臓から単離される肝細胞マーカーを発現するヒトに固有な非卵形（non-oval）多能性前駆細胞の別の供給源、すなわちヒト肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）が、抗腫瘍効果を呈し得ることを示した（Herrera MB, Bruno S, Buttiglieri S, Tetta C, Gatti S, Deregibus MC, et al. Isolation and characterization of a stem cell population from adult human liver. Stem cells. 2006;24(12):2840-50）。詳細には、ＨＬＳＣ－ＥＶは、特定の抗腫瘍ｍｉＲＮＡの送達を伴う機構により、肝細胞腫の成長を低下させることを示した（Fonsato V, Collino F, Herrera MB, Cavallari C, Deregibus MC, Cisterna B, et al. Human liver stem cell-derived microvesicles inhibit hepatoma growth in SCID mice by delivering antitumor microRNAs. Stem cells. 2012;30(9):1985-98）。しかし、ＨＬＳＣ－ＥＶが、腫瘍血管新生にも影響を与えるかどうかは調査されなかった。
ＨＬＳＣは、国際公開第２００６／１２６２３６号に記載されている。
さらに、本発明者らの知る限りでは、腎癌に対して、特定のｍｉＲＮＡの送達による、幹細胞に由来するＥＶの抗腫瘍効果は、これまで報告されていない。
ＨＬＳＣは、国際公開第２００６／１２６２３６号に記載されている。
さらに、本発明者らの知る限りでは、腎癌に対して、特定のｍｉＲＮＡの送達による、幹細胞に由来するＥＶの抗腫瘍効果は、これまで報告されていない。
国際公開第２０１１／１０７４３７号は、成体幹細胞に由来する微小胞、例えばＢＭ－ＭＳＣ、Ｇｌ－ＭＳＣおよびＨＬＳＣが、腫瘍疾患、例えば肝臓、上皮、肺、前立腺、卵巣、乳房、胃および結腸の腫瘍の処置に有効であることを開示している。国際公開第２０１１／０７０００１号は、肝細胞腫、カポジ肉腫および乳腺癌を処置するための、ＨＬＳＣに由来する馴化培地の使用を開示している。これらの特許では、腎癌もｍｉＲＮＡの役割も論じられていない。
本明細書の実験セクションでより詳細に例証されるように、本発明者らは、今般、成体幹細胞に由来する細胞外小胞（ＥＶ）、例えばＨＬＳＣ－ＥＶおよびＭＳＣ－ＥＶは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腎臓の腫瘍内皮細胞の移行を阻害できること、ならびに、ＨＬＳＣ－ＥＶは、血管様形成（vessel-like formation）も有意に低下させることを意外にも見出した。Ｉｎ ｖｉｖｏ実験からも、ＨＬＳＣ－ＥＶが、腫瘍の血管新生を阻害できることが示された。きわめて興味深いことに、これらの実験では、ＨＬＳＣ－ＥＶは、正常内皮細胞に対しては効果を一切示さなかった。したがって、本発明により、腎癌の治療的処置において効率的な生成物を得る問題が解決される。
ＥＶは、複雑な組成を有し、いくつかの機能タンパク質、脂質および核酸を含有する。本発明者らは、ＨＬＳＣ－ＥＶが担持する４種のマイクロＲＮＡ、すなわちｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃおよびｍｉＲ－８７４を同定しており、これらは、腎癌－ＴＥＣトランスフェクション後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍の血管新生を阻害できる。これらのｍｉＲＮＡを用いたトランスフェクションにより、それぞれの標的遺伝子ＦＧＦ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＢ３およびＥＰＨＢ４の発現が低下した。ＴＥＣが、上で同定されているｍｉＲＮＡを担持するＥＶで刺激される場合、ＦＧＦ１およびＰＬＡＵ発現の阻害に関連するｍｉＲＮＡの発現の有意な向上が観察された一方、ＩＴＧＢ３およびＥＰＨＢ４の阻害は観察されなかった。ＦＧＦ１は、腫瘍の血管新生に関与する、最も重要な血管新生促進因子の１つであり、ＶＥＧＦと無関係に血管新生を調節できる。ＰＬＡＵは、プラスミノーゲンからプラスミンを活性化する酵素のウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）をコード化する遺伝子である。プラスミンは、血管新生およびがんの進行に重要な細胞外マトリックス分解のタンパク質分解プロセスに加わる。ＦＧＦ１およびＰＬＡＵは、ｕＰＡを活性化でき、その受容体ｕＰＡＲの発現を向上できるＦＧＦ１（ＦＧＦＲ）の受容体によって結び付けられる。こうしたＦＧＦ１、ｕＰＡおよびｕＰＡＲのすべてが、ＦＧＦＲを介した正のフィードバックループに連結する。
これらの結果を踏まえると、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４またはそれらの混合物を含む薬学的キャリアは、腎癌の処置にきわめて有望な治療剤である。
したがって、本発明の第１の態様は、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを含む、腎癌の処置における使用のための薬学的に許容できるキャリアである。本発明の好ましい実施形態によれば、薬学的に許容できるキャリアは、少なくとも、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃおよびｍｉＲ－８７４のうち２つの組合せを含む。さらに好ましくは、薬学的に許容できるキャリアは、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃおよびｍｉＲ－８７４のすべてを含む。
ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃおよびｍｉＲ－８７４は、それ自体公知のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、それらの特徴および配列は、例えば、ｍｉＲＢａｓｅと呼ばれるデータベースにおいて、受託番号ＭＩ０００００６９、ＭＩ００００２６９、ＭＩ０００３７７８、ＭＩＰＦ００００４０１で見出され得る。
薬学的効果は、薬学的キャリアに含有されるｍｉＲＮＡに起因し得る。ｍｉＲＮＡを用いた標的細胞の任意の効率的トランスフェクションは、腎癌の処置における有効な使用のために想定される。ｍｉＲＮＡの効率的トランスフェクションは、好ましくはマイクロまたはナノ粒子の形態の適切な薬学的キャリアを必要とする。そのようなキャリアは市販されており、アルギネートベース（ＧＥＭ、Ｇｌｏｂａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、デキストランベース（Ｃｙｔｏｄｅｘ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、コラーゲンベース（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ、Ｐｅｒｃｅｌｌ）およびポリスチレンベース（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）微小キャリアを含む。
薬学的効果は、薬学的キャリアに含有されるｍｉＲＮＡに起因し得る。ｍｉＲＮＡを用いた標的細胞の任意の効率的トランスフェクションは、腎癌の処置における有効な使用のために想定される。ｍｉＲＮＡの効率的トランスフェクションは、好ましくはマイクロまたはナノ粒子の形態の適切な薬学的キャリアを必要とする。そのようなキャリアは市販されており、アルギネートベース（ＧＥＭ、Ｇｌｏｂａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、デキストランベース（Ｃｙｔｏｄｅｘ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、コラーゲンベース（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ、Ｐｅｒｃｅｌｌ）およびポリスチレンベース（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）微小キャリアを含む。
別法として、ｍｉＲＮＡに対する薬学的キャリアは、ウイルスベクターであり得る。ウイルスベース系は、通常、例えば、Ningning Yang. An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA. Int J Pharm Investig. 2015 Oct-Dec; 5(4): 179-181で開示されているように、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）を送達ベクターとして使用する。したがって、ｍｉＲＮＡに好適なキャリアの選択および使用は、十分に当業者の能力の範囲内である。
ｍｉＲＮＡにさらに好ましい薬学的キャリアは、小胞、例えばリポソームまたは細胞外小胞（ＥＶ）である。細胞外小胞、例えば細胞由来微小胞またはエキソソームが、最も好ましい薬学的キャリアである。
したがって、本発明の別の好ましい実施形態によれば、薬学的に許容できるキャリアは、幹細胞に由来する、好ましくは成体幹細胞からの、より好ましくは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、例えば骨髄間質幹細胞からの、もしくは脂肪由来幹細胞（ＡＤＳ）からの、または非卵形ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）からの細胞外小胞（ＥＶ）である。ＨＬＳＣおよびそれを得る方法は、国際公開第２００６１２６２１９号として公表されている国際特許出願で開示されている。
ｍｉＲＮＡにさらに好ましい薬学的キャリアは、小胞、例えばリポソームまたは細胞外小胞（ＥＶ）である。細胞外小胞、例えば細胞由来微小胞またはエキソソームが、最も好ましい薬学的キャリアである。
したがって、本発明の別の好ましい実施形態によれば、薬学的に許容できるキャリアは、幹細胞に由来する、好ましくは成体幹細胞からの、より好ましくは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、例えば骨髄間質幹細胞からの、もしくは脂肪由来幹細胞（ＡＤＳ）からの、または非卵形ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）からの細胞外小胞（ＥＶ）である。ＨＬＳＣおよびそれを得る方法は、国際公開第２００６１２６２１９号として公表されている国際特許出願で開示されている。
本発明のさらなる態様は、幹細胞の馴化培地から、好ましくは成体幹細胞の馴化培地から、より好ましくは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、もしくはヒト肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）、または脂肪由来幹細胞（ＡＤＳ）の馴化培地から単離された、腎癌の処置における使用のための細胞外小胞の、組成物である。そのような細胞外小胞は、ナイーブ、すなわち、幹細胞の馴化培地から単離される、操作されていないＥＶであり、これは、生物学的活性分子、特にｍｉＲＮＡの内因系カーゴ（intrinsic cargo）により腎癌の治療的処置において有効である。
したがって、本発明に従って使用するための細胞外小胞（ＥＶ）は、単離した、天然に存在するＥＶ、あるいは、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のマイクロＲＮＡを含有するように操作されたＥＶである。
したがって、本発明に従って使用するための細胞外小胞（ＥＶ）は、単離した、天然に存在するＥＶ、あるいは、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のマイクロＲＮＡを含有するように操作されたＥＶである。
欧州特許第２０１０６６３号として公表されている欧州特許出願は、当業者に、特定のｍｉＲＮＡを用いてＥＶを操作する仕方の指導を提供している。ＲＮＡを小胞またはエキソソームに導入するための当業者に公知の技術は、トランスフェクションまたは共インキュベーションである。公知のトランスフェクション方法は、例えばエレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターによるトランスフェクション、マグネットアシストトランスフェクション（magnet assisted transfection）およびソノポレーション（sonoporation）である。結果として、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡが、ｅｘ ｖｉｖｏで導入されている操作されたＥＶは、本発明の別の態様である。
本発明に従って使用するための操作された細胞外小胞（ＥＶ）は、天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）に含有されている量より著しく多量の上述のマイクロＲＮＡを含有する。
本発明に従って使用するための細胞外小胞（ＥＶ）は、天然に存在するＥＶ、あるいは、天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）と比較して著しく多量の、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のマイクロＲＮＡを含有するように操作されているＥＶである。操作されたＥＶは、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のマイクロＲＮＡを、単離した細胞外小胞にｅｘ ｖｉｖｏで負荷することにより得ることができる。別法として、操作されたＥＶは、上で定義されている幹細胞にｍｉＲＮＡをトランスフェクトすること、次いでトランスフェクトされた幹細胞の馴化培地からＥＶを単離し精製することにより得ることができる。
天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）と比較して著しく多量のｍｉＲＮＡを見積もる好適な方法は、ｑＰＣＲデータ分析のΔΔＣＴ法である。
本発明に従って使用するための細胞外小胞（ＥＶ）は、天然に存在するＥＶ、あるいは、天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）と比較して著しく多量の、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のマイクロＲＮＡを含有するように操作されているＥＶである。操作されたＥＶは、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のマイクロＲＮＡを、単離した細胞外小胞にｅｘ ｖｉｖｏで負荷することにより得ることができる。別法として、操作されたＥＶは、上で定義されている幹細胞にｍｉＲＮＡをトランスフェクトすること、次いでトランスフェクトされた幹細胞の馴化培地からＥＶを単離し精製することにより得ることができる。
天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）と比較して著しく多量のｍｉＲＮＡを見積もる好適な方法は、ｑＰＣＲデータ分析のΔΔＣＴ法である。
相対値として表現すると、負荷効率、すなわち、天然の量と比較して、本発明の操作されたＥＶに存在する標的ｍｉＲＮＡの量は、少なくとも２倍である。あるいは、負荷効率は、ＥＶ当たりの負荷された標的分子の数として絶対項（absolute term）で表現され得る。この値は、天然の量のものより多い、約１×１０3～約１×１０5個の標的分子／ＥＶの範囲になり得ると考えられる。
ＭＳＣおよびＨＬＳＣに由来するＥＶを用いて本発明者らにより実行された実験を開示する以下の実験の部は、例示の目的でのみ示されており、添付の特許請求の範囲により決定される本発明の範囲を限定することを意図していない。
ＭＳＣおよびＨＬＳＣに由来するＥＶを用いて本発明者らにより実行された実験を開示する以下の実験の部は、例示の目的でのみ示されており、添付の特許請求の範囲により決定される本発明の範囲を限定することを意図していない。
実験の部
材料および方法
細胞培養
ＴＥＣは以前に、本発明者らの研究室において、腎臓癌患者の切除標本４例から単離され、培養されている。ＴＥＣは、磁気細胞選別（ＭＡＣＳシステム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）により、抗ＣＤ１０５ポジティブ選択を使用して、消化された組織から単離し、記載されているように（Bussolati B, Deambrosis I, Russo S, Deregibus MC, Camussi G. Altered angiogenesis and survival in human tumor-derived endothelial cells. FASEB journal, official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 2003;17(9):1159-61）、ＥｎｄｏＧｒｏ完全培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において成長させた。
材料および方法
細胞培養
ＴＥＣは以前に、本発明者らの研究室において、腎臓癌患者の切除標本４例から単離され、培養されている。ＴＥＣは、磁気細胞選別（ＭＡＣＳシステム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）により、抗ＣＤ１０５ポジティブ選択を使用して、消化された組織から単離し、記載されているように（Bussolati B, Deambrosis I, Russo S, Deregibus MC, Camussi G. Altered angiogenesis and survival in human tumor-derived endothelial cells. FASEB journal, official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 2003;17(9):1159-61）、ＥｎｄｏＧｒｏ完全培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において成長させた。
ＨＬＳＣは、以前に記載されているように（Herrera MB, Bruno S, Buttiglieri S, Tetta C, Gatti S, Deregibus MC, et al. Isolation and characterization of a stem cell population from adult human liver. Stem cells. 2006;24(12):2840-50）、Ｌｏｎｚａから得た凍結保存された正常ヒト肝細胞から、本発明者らの研究室において単離した。簡潔には、細胞は、コラーゲンでコーティングした培養プレート上において、ｃｍ2当たり生細胞１．０～１．５×１０5個の密度で、肝細胞血清を含まない培地（Ｇｉｂｃｏ Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ－ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に２週間播種した。培養の２週間後、肝細胞を死滅させ、次いで、培地は、Ｌ－グルタミン（５ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（１２ｍＭ、ｐＨ７．４）、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、（すべてＳｉｇｍａから）、および１０％ ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を補充したα－最少必須培地／内皮細胞基礎培地－１（α－ＭＥＭ／ＥＢＭ）（３：１）（Ｇｉｂｃｏ／Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）で置換した。個々の付着した細胞を、３週間後にクローン化し、増加させた。ＨＬＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９およびＣＤ４４に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（ｃ－キット）およびＣＤ１３３に対して陰性であった。
ＭＳＣは、Ｌｏｎｚａから購入し、ＭＳＣＢＭ完全培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。
ＭＳＣは、Ｌｏｎｚａから購入し、ＭＳＣＢＭ完全培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。
ＥＶ単離および特徴
ＥＶ単離は、改変をわずかにして、以前に記載されている（Herrera MB, Fonsato V, Gatti S, Deregibus MC, Sordi A, Cantarella D, et al. Human liver stem cell-derived microvesicles accelerate hepatic regeneration in hepatectomized rats. Journal of cellular and molecular medicine. 2010;14(6B):1605-18）ように行った。簡潔には、ＨＬＳＣまたはＭＳＣの密集培地は、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩに１８時間変えた。翌日、この培地は、３０００ｇで３０分遠心分離して、細胞デブリおよびアポトーシス小体を除去した。その後、上澄みは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００Ｋ Ｕｌｔｒａｃｅｔｒｉｆｕｇｅとロータータイプ４５ Ｔｉ、４５０００ＲＰＭを使用して、１０００００ｇで２時間、超遠心分離にかけた。ＥＶペレットは、１０％のＤＭＳＯを補充したＲＰＭＩに再懸濁した。ＨＬＳＣ－ＥＶの懸濁液は、次いで、使用するまで－８０℃にて冷凍した。ＥＶは、ＮＴＡ分析および電子顕微鏡法を使用して分析した。ＥＶの平均径は、９０ｎｍ（±２０）であった。いくつかのｉｎ ｖｉｖｏ撮像実験のために、ＥＶは、１μＭ Ｖｙｂｒａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅｒｓ ＤｉＤ（Ｅｘ：６４０ｎｍ、Ｅｍ：７００ｎｍ）または血清なしのＤｉｌ溶液（Ｅｘ：５３０ｎｍ、Ｅｍ：５８０ｎｍ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）により標識し、次いで、ＰＢＳ １×４０中での超遠心分離により２回洗浄した。
ＥＶ単離は、改変をわずかにして、以前に記載されている（Herrera MB, Fonsato V, Gatti S, Deregibus MC, Sordi A, Cantarella D, et al. Human liver stem cell-derived microvesicles accelerate hepatic regeneration in hepatectomized rats. Journal of cellular and molecular medicine. 2010;14(6B):1605-18）ように行った。簡潔には、ＨＬＳＣまたはＭＳＣの密集培地は、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩに１８時間変えた。翌日、この培地は、３０００ｇで３０分遠心分離して、細胞デブリおよびアポトーシス小体を除去した。その後、上澄みは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００Ｋ Ｕｌｔｒａｃｅｔｒｉｆｕｇｅとロータータイプ４５ Ｔｉ、４５０００ＲＰＭを使用して、１０００００ｇで２時間、超遠心分離にかけた。ＥＶペレットは、１０％のＤＭＳＯを補充したＲＰＭＩに再懸濁した。ＨＬＳＣ－ＥＶの懸濁液は、次いで、使用するまで－８０℃にて冷凍した。ＥＶは、ＮＴＡ分析および電子顕微鏡法を使用して分析した。ＥＶの平均径は、９０ｎｍ（±２０）であった。いくつかのｉｎ ｖｉｖｏ撮像実験のために、ＥＶは、１μＭ Ｖｙｂｒａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅｒｓ ＤｉＤ（Ｅｘ：６４０ｎｍ、Ｅｍ：７００ｎｍ）または血清なしのＤｉｌ溶液（Ｅｘ：５３０ｎｍ、Ｅｍ：５８０ｎｍ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）により標識し、次いで、ＰＢＳ １×４０中での超遠心分離により２回洗浄した。
生存能力および移行テスト
増殖のテストでは、ＴＥＣは、２×１０3個／ウェルの密度で９６ウェルプレートにシードした。翌日、細胞は、ＥｎｄｏＧｒｏ完全培地（Ｌｏｎｚａ）中１×１０10または５×１０10または１０×１０10個のＥＶ／ＴＥＣの濃度で、ＨＬＳＣ－ＥＶまたはＭＳＣ－ＥＶを用いて処理した。増殖は、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（比色分析）キット（Ｒｏｃｈｅ、１１６４７２２９００１）を製造者の指示に従って使用したＥＶ刺激後の２４、４８および７２時間にて、ＢｒｄＵの組み込みにより測定した。移行テストは、２４ウェルプレートにシードしたＴＥＣで行い、密集するまで成長させた。ＥＶを、スクラッチ直後に１×１０15または５×１０15または１０×１０15個のＥＶ／ウェルの濃度で添加した。顕微鏡での優れた１０×の撮像は、スクラッチ後０、３、７および２４時間で行った。距離は、ＬＡＳソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）により測定した。結果は、平均放射輝度±ＳＤとして提示する。
増殖のテストでは、ＴＥＣは、２×１０3個／ウェルの密度で９６ウェルプレートにシードした。翌日、細胞は、ＥｎｄｏＧｒｏ完全培地（Ｌｏｎｚａ）中１×１０10または５×１０10または１０×１０10個のＥＶ／ＴＥＣの濃度で、ＨＬＳＣ－ＥＶまたはＭＳＣ－ＥＶを用いて処理した。増殖は、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（比色分析）キット（Ｒｏｃｈｅ、１１６４７２２９００１）を製造者の指示に従って使用したＥＶ刺激後の２４、４８および７２時間にて、ＢｒｄＵの組み込みにより測定した。移行テストは、２４ウェルプレートにシードしたＴＥＣで行い、密集するまで成長させた。ＥＶを、スクラッチ直後に１×１０15または５×１０15または１０×１０15個のＥＶ／ウェルの濃度で添加した。顕微鏡での優れた１０×の撮像は、スクラッチ後０、３、７および２４時間で行った。距離は、ＬＡＳソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）により測定した。結果は、平均放射輝度±ＳＤとして提示する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管様構造形成
ＴＥＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした２４ウェルプレートに、ウェル当たり２５×１０3個の細胞の密度でシードし、１×１０10、５×１０10、１０×１０10または２０×１０10個のＥＶ／ＴＥＣの存在下で、ＥｎｄｏＧｒｏ完全培地において培養した。ＥＶなしのＴＥＣを対照として使用した。２４時間のインキュベーション後、位相差像（倍率×１０）を記録し、ＬＡＳソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）を使用して、ネットワーク構造の全長を測定した。フィールド当たりの全長を５つのランダムなフィールドで計算し、それぞれの対照に対する比として表現した。データは、平均放射輝度±ＳＤとして表現した。
ＴＥＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした２４ウェルプレートに、ウェル当たり２５×１０3個の細胞の密度でシードし、１×１０10、５×１０10、１０×１０10または２０×１０10個のＥＶ／ＴＥＣの存在下で、ＥｎｄｏＧｒｏ完全培地において培養した。ＥＶなしのＴＥＣを対照として使用した。２４時間のインキュベーション後、位相差像（倍率×１０）を記録し、ＬＡＳソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）を使用して、ネットワーク構造の全長を測定した。フィールド当たりの全長を５つのランダムなフィールドで計算し、それぞれの対照に対する比として表現した。データは、平均放射輝度±ＳＤとして表現した。
ｉｎ ｖｉｖｏ血管新生モデル
動物研究は、国のガイドラインおよび規制に従って実施し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｉｎｏの治験審査委員会の承認を受けた（プロトコールナンバー：３３８／２０１６－ ＰＲ）。Ｍａｔｒｉｇｅｌ内にＴＥＣを注入することにより得られたｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の血管新生のモデルを使用して、記載されている（ref FASEB 2003）ように幹細胞に由来するＥＶの効果を見積もった。腫瘍の血管新生発現を防止するために、ＴＥＣは、前処理してから注入した。この目的のために、ＳＣＩＤマウス（６～８週齢）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）に、ＨＬＳＣ－ＥＶ／ＭＳＣ－ＥＶで前処理した、またはしていないＭａｔｒｉｇｅｌ内の１×１０6個のＴＥＣを皮下注入した（細胞当たり１０×１０3個のＥＶ）：（対照ではｎ＝８、それぞれＥＶ処理）。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグを切除し、血管密度をＭａｓｓｏｎの三色反応で分析した。ＥＶの、確立された腫瘍血管に対する影響を評価するために、１×１０6個のＴＥＣをＳＣＩＤマウスのＭａｔｒｉｇｅｌ内に皮下注入した。ＨＬＳＣ－ＥＶ（細胞当たり１０×１０3個のＥＶ）を、ＴＥＣ注入から３日後および７日後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグに２回注入した。対照マウスは、ビヒクル（ＰＢＳ）を注入した。実験の１０日目に、マウスを屠殺し、組織化学的分析のためにＭａｔｒｉｇｅｌプラグを切除した（対照ではｎ＝８、ＨＬＳＣ－ＥＶ処理）。
動物研究は、国のガイドラインおよび規制に従って実施し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｉｎｏの治験審査委員会の承認を受けた（プロトコールナンバー：３３８／２０１６－ ＰＲ）。Ｍａｔｒｉｇｅｌ内にＴＥＣを注入することにより得られたｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の血管新生のモデルを使用して、記載されている（ref FASEB 2003）ように幹細胞に由来するＥＶの効果を見積もった。腫瘍の血管新生発現を防止するために、ＴＥＣは、前処理してから注入した。この目的のために、ＳＣＩＤマウス（６～８週齢）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）に、ＨＬＳＣ－ＥＶ／ＭＳＣ－ＥＶで前処理した、またはしていないＭａｔｒｉｇｅｌ内の１×１０6個のＴＥＣを皮下注入した（細胞当たり１０×１０3個のＥＶ）：（対照ではｎ＝８、それぞれＥＶ処理）。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグを切除し、血管密度をＭａｓｓｏｎの三色反応で分析した。ＥＶの、確立された腫瘍血管に対する影響を評価するために、１×１０6個のＴＥＣをＳＣＩＤマウスのＭａｔｒｉｇｅｌ内に皮下注入した。ＨＬＳＣ－ＥＶ（細胞当たり１０×１０3個のＥＶ）を、ＴＥＣ注入から３日後および７日後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグに２回注入した。対照マウスは、ビヒクル（ＰＢＳ）を注入した。実験の１０日目に、マウスを屠殺し、組織化学的分析のためにＭａｔｒｉｇｅｌプラグを切除した（対照ではｎ＝８、ＨＬＳＣ－ＥＶ処理）。
生体内分布分析
ＴＥＣによるＥＶ取込みをｉｎ ｖｉｖｏ撮像するために、ＳＣＩＤマウス２５匹に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内の１×１０6個のＴＥＣを皮下注入した。腫瘍血管が発達した（１週間）後、マウスを、ビヒクル（ＰＢＳ）を受けた対照、ＤｉＬ ＭＳＣ－ＥＶ、ＤｉＤ ＭＳＣ－ＥＶ、ＤｉＬ ＨＬＳＣ－ＥＶおよびＤｉＤ ＨＬＳＣ－ＥＶの５群に分けた（ｎ＝それぞれ５）。ＤｉＤまたはＤｉＬで標識したＥＶ（１．３×１０10個のＥＶ／マウス）を静脈内注入し、５時間後、マウスを屠殺した。ＤｉＬ ＥＶで処理したマウスから得た器官（Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグ、皮膚、腎臓、脾臓、肝臓および肺）を、免疫蛍光のために回収した。各器官の冷凍切片を、核対比染色のためにＤａｐｉで染色し、共焦点顕微鏡法により分析して、ＤｉＬ標識ＥＶを検出した。
ＴＥＣによるＥＶ取込みをｉｎ ｖｉｖｏ撮像するために、ＳＣＩＤマウス２５匹に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内の１×１０6個のＴＥＣを皮下注入した。腫瘍血管が発達した（１週間）後、マウスを、ビヒクル（ＰＢＳ）を受けた対照、ＤｉＬ ＭＳＣ－ＥＶ、ＤｉＤ ＭＳＣ－ＥＶ、ＤｉＬ ＨＬＳＣ－ＥＶおよびＤｉＤ ＨＬＳＣ－ＥＶの５群に分けた（ｎ＝それぞれ５）。ＤｉＤまたはＤｉＬで標識したＥＶ（１．３×１０10個のＥＶ／マウス）を静脈内注入し、５時間後、マウスを屠殺した。ＤｉＬ ＥＶで処理したマウスから得た器官（Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグ、皮膚、腎臓、脾臓、肝臓および肺）を、免疫蛍光のために回収した。各器官の冷凍切片を、核対比染色のためにＤａｐｉで染色し、共焦点顕微鏡法により分析して、ＤｉＬ標識ＥＶを検出した。
ＤｉＤ－標識ＥＶの生体内分布を光学的撮像により評価した。すべての研究は、６４０ｎｍの励起フィルターおよび７００ｎｍの発光フィルターを使用して、ＩＶＩＳ ２００小動物撮像システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で行った。同一の照明設定、例えば曝露時間、ビニング係数、ｆ／ストップ、および視野（Ｇｒａｎｇｅ ２０１４）を、すべての画像取得で使用し、蛍光発光は、１秒当たり、平方センチメートル当たり、ステラジアン当たりの光子（ｐ／秒／ｃｍ2／ｓｒ）に標準化した。画像は、ＥＶ注入から５時間後に収集した器官で取得した。バックグラウンド光子放射をコントロールするために、得られたデータに、５３５ｎｍの励起でキャプチャーしたデータを使用して、平均バックグラウンド除去（average background subtraction）を施した。画像を取得し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ４．０ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）（Ｇｒａｎｇｅ ２０１４）を使用して分析した。蛍光性（ｐ／秒／ｃｍ2／ｓｒ）は、フリーハンドで描いた対象領域（ＲＯＩ）で定量した。データは、平均放射輝度±ＳＤとして表現した。
遺伝子発現研究およびリアルタイムＰＣＲ
ＨＬＳＣ－ＥＶまたはＭＳＣ－ＥＶにおけるｍｉＲＮＡ発現レベルは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイヒトマイクロＲＮＡ Ａ／Ｂカード（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して分析して、ｑＲＴ－ＰＣＲにより７５４種の成熟ｍｉＲＮＡの特性を明らかにした。キットは、マイクロＲＮＡ特異的ステムループ逆転写プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを使用して、２－ステップリアルタイム逆転写ＰＣＲアッセイで成熟ｍｉＲＮＡ転写産物を検出した。簡潔には、一本鎖ｃＤＮＡは、全ＲＮＡ試料（８０ｎｇ）から、ループプライマー（マルチプレックスＲＴキット、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の混合物を製造者のプロトコールに従って使用した逆転写により生成した。ＲＴ反応を、次いで希釈し、Ｔａｑｍａｎ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ）と１：１比で混合し、ＴａｑＭａｎマイクロ流体カードに負荷し、ｑＲＴ－ＰＣＲ実験を行った。すべての反応は、３８４ウェル反応プレートを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ機器を使用して行った。生Ｃｔ値は、ＳＤＳソフトウェアバージョン２．３を使用し、自動ベースラインおよび閾値を使用して計算した。筆者らは、３例のＨＬＳＣ－ＥＶ試料でｍｉＲ発現を分析した。３５サイクルのＰＣＲ後に増幅したマイクロＲＮＡは、すべて非発現として分類した。検出された、または２例を超える試料で検出されていないマイクロＲＮＡのみを考慮に入れた。
ＨＬＳＣ－ＥＶまたはＭＳＣ－ＥＶにおけるｍｉＲＮＡ発現レベルは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ（登録商標）アレイヒトマイクロＲＮＡ Ａ／Ｂカード（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して分析して、ｑＲＴ－ＰＣＲにより７５４種の成熟ｍｉＲＮＡの特性を明らかにした。キットは、マイクロＲＮＡ特異的ステムループ逆転写プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを使用して、２－ステップリアルタイム逆転写ＰＣＲアッセイで成熟ｍｉＲＮＡ転写産物を検出した。簡潔には、一本鎖ｃＤＮＡは、全ＲＮＡ試料（８０ｎｇ）から、ループプライマー（マルチプレックスＲＴキット、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の混合物を製造者のプロトコールに従って使用した逆転写により生成した。ＲＴ反応を、次いで希釈し、Ｔａｑｍａｎ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ）と１：１比で混合し、ＴａｑＭａｎマイクロ流体カードに負荷し、ｑＲＴ－ＰＣＲ実験を行った。すべての反応は、３８４ウェル反応プレートを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ機器を使用して行った。生Ｃｔ値は、ＳＤＳソフトウェアバージョン２．３を使用し、自動ベースラインおよび閾値を使用して計算した。筆者らは、３例のＨＬＳＣ－ＥＶ試料でｍｉＲ発現を分析した。３５サイクルのＰＣＲ後に増幅したマイクロＲＮＡは、すべて非発現として分類した。検出された、または２例を超える試料で検出されていないマイクロＲＮＡのみを考慮に入れた。
ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、ｍｉＲＮＡまたはＴＥＣにおける標的遺伝子発現を確認した。簡潔には、すべての試料からの２００ｎｇのインプットＲＮＡを、ｍｉＳｃｒｉｐｔ逆転写キットで逆転写し、次いでｃＤＮＡを使用して検出し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキットを使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲにより対象ｍｉＲＮＡまたは遺伝子を定量化した（すべてＱｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡから）。すべての試料は、製造者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）により記載されているように、各反応に対して３ｎｇのｃＤＮＡを使用して３回実行した。相対発現データは、次いで、Mestdagh P, Van Vlierberghe P, De Weer A, Muth D, Westermann F, Speleman F, et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome biology. 2009;10(6):R64)に記載されているように、ＰＣＲ３５サイクルのＣｔ検出カットオフに従って、各アレイにおける全体のｍｉＲＮＡ発現で計算した平均発現値を使用して標準化した。ＨＬＳＣ－ＥＶで処理した、またはしていないＴＥＣにおける血管新生促進遺伝子発現のＰＣＲ分析は、製造者の指示に従って、ヒト血管新生ＰＣＲアレイ（ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲアレイ、９６／ウェルフォーマット、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して３回行った。データは、ＳａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｑｉａｇｅｎ）オンラインソフトウェアを使用して分析し、相対定量±ＣＩ（信頼区間）として表現した。
細胞トランスフェクション
ＴＥＣのトランスフェクションは、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。理想的なトランスフェクション濃度を見出すために、ＴＥＣに、模倣ｍｉＲ－ＦＩＴＣおよびＨｉＰｅｒｆｅｃｔ試薬の推奨される濃度すべてをトランスフェクトした。ＨｉＰｅｒｆｅｃｔの最大用量（５０×１０3個のＴＥＣ当たり９μｌのＨｉＰｅｒｆｅｃｔ）の倍増を、同様に行った。ＦＡＣＳ分析をトランスフェクションの翌日行い、この分析により、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔの最大用量の倍は、ＴＥＣの６０％超に生存能力および増殖にダメージを与えずにトランスフェクトできたことが明らかになった。この用量を、すべてのトランスフェクション実験に使用した。
ＴＥＣのトランスフェクションは、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。理想的なトランスフェクション濃度を見出すために、ＴＥＣに、模倣ｍｉＲ－ＦＩＴＣおよびＨｉＰｅｒｆｅｃｔ試薬の推奨される濃度すべてをトランスフェクトした。ＨｉＰｅｒｆｅｃｔの最大用量（５０×１０3個のＴＥＣ当たり９μｌのＨｉＰｅｒｆｅｃｔ）の倍増を、同様に行った。ＦＡＣＳ分析をトランスフェクションの翌日行い、この分析により、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔの最大用量の倍は、ＴＥＣの６０％超に生存能力および増殖にダメージを与えずにトランスフェクトできたことが明らかになった。この用量を、すべてのトランスフェクション実験に使用した。
ＴＥＣのトランスフェクションは、以下の模倣ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－４２４およびｍｉＲ－８７４（すべてＱｉａｇｅｎから）を使用して行った。トランスフェクション翌日、新たな増殖培地を置き換え、２日目に細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ実験（増殖、アポトーシステスト、血管新生ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ）、または遺伝子発現分析（リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析）に使用した。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
ＨＬＳＣ－ＥＶおよびＭＳＣ－ＥＶのＦＡＣＳ分析は、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して行った。使用される抗体は、ＦＩＴＣ－結合体化抗体抗ＣＤ６３（Ａｂｎｏｖａ）、抗ＣＤ１０５（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、抗ＣＤ９０（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、抗ＣＤ４４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣＤ４５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、抗ＩＣＡＭおよび抗ＶＣＡＭ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ３１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、インテグリンサブユニットα４、α５、α６（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎから）；ＰＥ－結合体化抗体抗ＣＤ７３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、抗インテグリンサブユニットα４、α５（すべてＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎから）およびＶＥ－カドヘリン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であった。ＦＩＴＣまたはＰＥマウス非免疫アイソタイプＩｇＧ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を対照として使用した。
ＨＬＳＣ－ＥＶおよびＭＳＣ－ＥＶのＦＡＣＳ分析は、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して行った。使用される抗体は、ＦＩＴＣ－結合体化抗体抗ＣＤ６３（Ａｂｎｏｖａ）、抗ＣＤ１０５（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、抗ＣＤ９０（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、抗ＣＤ４４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣＤ４５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、抗ＩＣＡＭおよび抗ＶＣＡＭ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ３１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、インテグリンサブユニットα４、α５、α６（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎから）；ＰＥ－結合体化抗体抗ＣＤ７３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、抗インテグリンサブユニットα４、α５（すべてＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎから）およびＶＥ－カドヘリン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であった。ＦＩＴＣまたはＰＥマウス非免疫アイソタイプＩｇＧ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を対照として使用した。
ウエスタンブロット
タンパク質試料は、４％～１５％勾配硫酸ドデシルナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）により分離し、ＰＬＡＵ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３１４３３）またはＦＧＦ１（Ａｂｃａｍ ａｂ９５８８）に対する抗体を用いて、免疫ブロッティングを施した。タンパク質バンドは、増強化学発光（ＥＣＬ）検出キットおよびＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）で視覚化した。２０μｇ／ウェルの細胞溶解物を負荷した。
タンパク質試料は、４％～１５％勾配硫酸ドデシルナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）により分離し、ＰＬＡＵ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３１４３３）またはＦＧＦ１（Ａｂｃａｍ ａｂ９５８８）に対する抗体を用いて、免疫ブロッティングを施した。タンパク質バンドは、増強化学発光（ＥＣＬ）検出キットおよびＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）で視覚化した。２０μｇ／ウェルの細胞溶解物を負荷した。
統計値
データは、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖテストを使用して、分布の正常性について見積もった。統計分析は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １１．０ソフトウェアを使用して行った。処理群と対照群との間の差は、分布が正常である場合、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ－検定を使用して分析した。データは、平均±ＳＥＭとして表現した。差は、ｐ＜０．０５の場合、有意とみなした。
データは、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖテストを使用して、分布の正常性について見積もった。統計分析は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １１．０ソフトウェアを使用して行った。処理群と対照群との間の差は、分布が正常である場合、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ－検定を使用して分析した。データは、平均±ＳＥＭとして表現した。差は、ｐ＜０．０５の場合、有意とみなした。
結果
ＨＬＳＣ－ＥＶは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腎臓ＴＥＣの血管新生能力、および移行を阻害する
ＭＳＣＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶのＴＥＣに対する影響は、増殖、アポトーシスおよび血管様構造形成のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価により見積もった。ＨＬＳＣ－ＥＶの刺激により、用量依存手段で、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＥＣの血管新生が有意に阻害され、ＴＥＣ当たり１０×１０3個のＥＶの添加により、血管様構造形成が３７％減少し、ＴＥＣ当たり２０×１０3個のＥＶの用量では、血管様構造形成が４４％減少した（図１、Ａ、Ｂ、Ｄ）。ＭＳＣＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶのいずれも、ＴＥＣの生存能力を変化させなかった（示されていないデータ）。ＭＳＣ－ＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶの、ＴＥＣの運動に対する効果も、創傷治癒アッセイにより評価した。いずれのＥＶも、ＴＥＣの移行を有意に阻害し、ＨＬＳＣ－ＥＶは、ＴＥＣ当たり１×１０3個の用量で早くも有効となった（図１、Ｅ）。
対照実験では、ＭＳＣ－ＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶの、正常内皮細胞に対する効果を評価した。ＭＳＣ－ＥＶは、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）の血管新生特性を向上できるが、ＨＬＳＣ－ＥＶは、効果を一切示さなかった（図１、Ｆ）。これにより、ＭＳＣおよびＨＬＳＣからのＥＶは、正常な血管新生および腫瘍の血管新生に対して、異なる作用を有することが示される。
図１．ＨＬＳＣ－ＥＶまたはＭＳＣ－ＥＶの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴＥＣの血管新生特性に対する効果。対照ＴＥＣによる（Ａ）、ＨＬＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣによる（Ｂ）、およびＭＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣによる血管様構造の形成（Ｃ）；対照ＴＥＣにより形成された、またはＥＶで処理した、フィールド当たりの血管様構造の全長のダイアグラム（Ｄ）；創傷治癒アッセイ中のＴＥＣ移行のダイアグラム（Ｅ）；ＨＭＥＣにより形成された、ＥＶで処理した、フィールド当たりの血管様構造の全長のダイアグラム（Ｆ）。
ＨＬＳＣ－ＥＶは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腎臓ＴＥＣの血管新生能力、および移行を阻害する
ＭＳＣＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶのＴＥＣに対する影響は、増殖、アポトーシスおよび血管様構造形成のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価により見積もった。ＨＬＳＣ－ＥＶの刺激により、用量依存手段で、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＥＣの血管新生が有意に阻害され、ＴＥＣ当たり１０×１０3個のＥＶの添加により、血管様構造形成が３７％減少し、ＴＥＣ当たり２０×１０3個のＥＶの用量では、血管様構造形成が４４％減少した（図１、Ａ、Ｂ、Ｄ）。ＭＳＣＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶのいずれも、ＴＥＣの生存能力を変化させなかった（示されていないデータ）。ＭＳＣ－ＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶの、ＴＥＣの運動に対する効果も、創傷治癒アッセイにより評価した。いずれのＥＶも、ＴＥＣの移行を有意に阻害し、ＨＬＳＣ－ＥＶは、ＴＥＣ当たり１×１０3個の用量で早くも有効となった（図１、Ｅ）。
対照実験では、ＭＳＣ－ＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶの、正常内皮細胞に対する効果を評価した。ＭＳＣ－ＥＶは、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）の血管新生特性を向上できるが、ＨＬＳＣ－ＥＶは、効果を一切示さなかった（図１、Ｆ）。これにより、ＭＳＣおよびＨＬＳＣからのＥＶは、正常な血管新生および腫瘍の血管新生に対して、異なる作用を有することが示される。
図１．ＨＬＳＣ－ＥＶまたはＭＳＣ－ＥＶの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴＥＣの血管新生特性に対する効果。対照ＴＥＣによる（Ａ）、ＨＬＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣによる（Ｂ）、およびＭＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣによる血管様構造の形成（Ｃ）；対照ＴＥＣにより形成された、またはＥＶで処理した、フィールド当たりの血管様構造の全長のダイアグラム（Ｄ）；創傷治癒アッセイ中のＴＥＣ移行のダイアグラム（Ｅ）；ＨＭＥＣにより形成された、ＥＶで処理した、フィールド当たりの血管様構造の全長のダイアグラム（Ｆ）。
ＨＬＳＣ－ＥＶは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の血管新生を防止する
ＭＳＣ－ＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶの効果は、ＳＣＩＤマウスに皮下移植された場合、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内のＴＥＣ組織により誘導されるヒト腫瘍の血管新生モデルを使用することによりｉｎ ｖｉｖｏで評価した。このモデルでは、ＴＥＣは、マウスの血液循環に接続した構造において７日以内に組織化する。前処理設定では、ＴＥＣをＨＬＳＣ－ＥＶまたはＭＳＣ－ＥＶで２４時間処理し、ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。埋め込んでから７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグを切除し、血管密度を免疫組織化学的に分析した。対照プラグの分析から、予想通り、マウスの血管系に接続した血管の存在が示された（図２、Ａ）。埋め込み前にＨＬＳＣ－ＥＶで２４時間処理したＴＥＣのプラグは、赤血球を含有する血管を提示しなかった（図２Ｂ、Ｄ）が、ＭＳＣ－ＥＶで前処理したものは、効果を一切示さなかった（図２Ｃ、Ｄ）。
ＨＬＳＣ－ＥＶは、腫瘍の血管新生を防止できるので、確立された腫瘍の血管に対するその効果も評価した。この目的のために、ＨＬＳＣ－ＥＶを、ＴＥＣを埋め込みから３日後および７日後にＭａｔｒｉｇｅｌプラグ中に注入し、プラグを１０日後に回収した。ＨＬＳＣ－ＥＶの処理は、血管密度をほぼ５０％有意に低下させた（図２、Ｅ）。
図２．ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の血管新生。Ｍａｓｓｏｎの三色反応（細胞外マトリックスが青、細胞が赤、また、赤血球が黄色に染色される）で染色したＭａｔｒｉｇｅｌ切片の代表的な画像：Ａ－対照ＴＥＣを含有したＭａｔｒｉｇｅｌプラグ、Ｂ－ＨＬＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣを含有したＭａｔｒｉｇｅｌプラグ、Ｃ－ＭＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣを含有したＭａｔｒｉｇｅｌプラグ。赤血球を含有する血管は、矢印で示されている。Ｄ－対照を含有した、またはＥＶ ＴＥＣで前処理したＭａｔｒｉｇｅｌにおける血管密度のダイアグラム（ｎ＝８、５フィールド／実験を分析した、***－ｐ＜０．００１ｖｓ．対照ＴＥＣ）。Ｅ－注入後３日目および７日目にＨＬＳＣＥＶで処理した、またはしていないＭａｔｒｉｇｅｌを含有したＴＥＣにおける血管密度のダイアグラム（ｎ＝８、５フィールド／実験を分析した、*－ｐ＜０．０５ｖｓ．対照Ｍａｔｒｉｇｅｌ）。
ＭＳＣ－ＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶの効果は、ＳＣＩＤマウスに皮下移植された場合、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内のＴＥＣ組織により誘導されるヒト腫瘍の血管新生モデルを使用することによりｉｎ ｖｉｖｏで評価した。このモデルでは、ＴＥＣは、マウスの血液循環に接続した構造において７日以内に組織化する。前処理設定では、ＴＥＣをＨＬＳＣ－ＥＶまたはＭＳＣ－ＥＶで２４時間処理し、ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。埋め込んでから７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグを切除し、血管密度を免疫組織化学的に分析した。対照プラグの分析から、予想通り、マウスの血管系に接続した血管の存在が示された（図２、Ａ）。埋め込み前にＨＬＳＣ－ＥＶで２４時間処理したＴＥＣのプラグは、赤血球を含有する血管を提示しなかった（図２Ｂ、Ｄ）が、ＭＳＣ－ＥＶで前処理したものは、効果を一切示さなかった（図２Ｃ、Ｄ）。
ＨＬＳＣ－ＥＶは、腫瘍の血管新生を防止できるので、確立された腫瘍の血管に対するその効果も評価した。この目的のために、ＨＬＳＣ－ＥＶを、ＴＥＣを埋め込みから３日後および７日後にＭａｔｒｉｇｅｌプラグ中に注入し、プラグを１０日後に回収した。ＨＬＳＣ－ＥＶの処理は、血管密度をほぼ５０％有意に低下させた（図２、Ｅ）。
図２．ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の血管新生。Ｍａｓｓｏｎの三色反応（細胞外マトリックスが青、細胞が赤、また、赤血球が黄色に染色される）で染色したＭａｔｒｉｇｅｌ切片の代表的な画像：Ａ－対照ＴＥＣを含有したＭａｔｒｉｇｅｌプラグ、Ｂ－ＨＬＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣを含有したＭａｔｒｉｇｅｌプラグ、Ｃ－ＭＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣを含有したＭａｔｒｉｇｅｌプラグ。赤血球を含有する血管は、矢印で示されている。Ｄ－対照を含有した、またはＥＶ ＴＥＣで前処理したＭａｔｒｉｇｅｌにおける血管密度のダイアグラム（ｎ＝８、５フィールド／実験を分析した、***－ｐ＜０．００１ｖｓ．対照ＴＥＣ）。Ｅ－注入後３日目および７日目にＨＬＳＣＥＶで処理した、またはしていないＭａｔｒｉｇｅｌを含有したＴＥＣにおける血管密度のダイアグラム（ｎ＝８、５フィールド／実験を分析した、*－ｐ＜０．０５ｖｓ．対照Ｍａｔｒｉｇｅｌ）。
Ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＬＳＣ－ＥＶのＴＥＣへの取込み
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、既に血管へと組織化したＴＥＣがＥＶを取り込む能力を評価するために、標識したＭＳＣ－ＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶ（１．３×１０10個のＥＶ／マウス）を静脈内注入した。ＥＶを、蛍光色素、光学撮像の場合は近赤色（ＤｉＤ）、また、免疫蛍光の場合は赤色（ＤｉＬ）で標識した（方法を参照されたい）。５時間後、マウスを屠殺し、器官を回収した。ＥＶの用量および時間を、予備実験（示されていない）に基づき選択した。光学撮像で、筆者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでＭａｔｒｉｇｅｌ内に注入されたＴＥＣが、図３ＡおよびＣで示されているように、両方のタイプのＤｉＤ標識ＥＶ（ＭＳＣ－ＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶ）を取り込めることを実証した。対照的に、プラグの近くで単離した皮膚組織では、きわめて蛍光性が低いシグナルが生じた（図３ＢおよびＣ）。すべての器官内における生体内分布に関して、ＥＶは、主に肝臓内に蓄積した。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、既に血管へと組織化したＴＥＣがＥＶを取り込む能力を評価するために、標識したＭＳＣ－ＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶ（１．３×１０10個のＥＶ／マウス）を静脈内注入した。ＥＶを、蛍光色素、光学撮像の場合は近赤色（ＤｉＤ）、また、免疫蛍光の場合は赤色（ＤｉＬ）で標識した（方法を参照されたい）。５時間後、マウスを屠殺し、器官を回収した。ＥＶの用量および時間を、予備実験（示されていない）に基づき選択した。光学撮像で、筆者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでＭａｔｒｉｇｅｌ内に注入されたＴＥＣが、図３ＡおよびＣで示されているように、両方のタイプのＤｉＤ標識ＥＶ（ＭＳＣ－ＥＶおよびＨＬＳＣ－ＥＶ）を取り込めることを実証した。対照的に、プラグの近くで単離した皮膚組織では、きわめて蛍光性が低いシグナルが生じた（図３ＢおよびＣ）。すべての器官内における生体内分布に関して、ＥＶは、主に肝臓内に蓄積した。
図３．標識したＥＶの生体内分布。ＡおよびＢ。ＥＶ注入後５時間で収集した、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグ（Ａ）および移植器官（Ｂ）の光学撮像による代表的な画像。ＣＴＬ：未処理；ＭＳＣ－ＥＶ：ＤｉＤ ＭＳＣ－ＥＶで処理した；ＨＬＳＣ－ＥＶ：ＤｉＤ ＨＬＳＣ－ＥＶで処理した。Ｃ．ＤｉＤ ＭＳＣ－ＥＶおよびＤｉＤ ＨＬＳＣ－ＥＶで処理したマウスを屠殺してから５時間後の平均放射輝度±ＳＤとして表現される、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグおよび隣接した皮膚の蛍光強度の定量。未処理マウスに由来するバックグラウンドを除去した（Ｎ＝５）。Ｄ．器官（肺、肝臓、脾臓および腎臓）の蛍光強度の定量は、ＤｉＤ ＭＳＣ－ＥＶおよびＤｉＤ ＨＬＳＣ－ＥＶで処理したマウスを屠殺してから５時間後の平均放射輝度±ＳＤとして表現した。未処理マウスに由来するバックグラウンドを除去した（Ｎ＝５）。
移植された器官での免疫蛍光により、似た結果が得られた。Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグでは、ＭＳＣおよびＨＬＳＣのいずれによっても取り除かれるＤｉＬ標識ＥＶは、共焦点分析によりヒトＴＥＣ内で検出可能であった（図４、Ａ）。蓄積は、皮膚における正常内皮細胞と比較してＴＥＣにかなり特異的である（図４、Ａ）。これにより、ＴＥＣは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内のＥＶを取り込めると確認される。免疫蛍光により、ＥＶも、全試料の肝臓実質および脾臓内で可視になった（図４、Ｂ）。いくつかの陽性細胞は、肺および腎臓に存在していた。ＨＬＳＣと比較して、ＭＳＣにより取り除かれたＥＶの生体内分布で、差は観察されなかった。
図４．組織における標識ＤｉＬ ＥＶの検出。ＭＳＣ－またはＨＬＳＣ－標識ＥＶの静脈内注入から５時間後における、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグおよびマウスの皮膚（Ａ）、ならびに他の器官（肝臓、脾臓、腎臓および肺）の代表的な蛍光画像。ＤｉＬ ＥＶ（赤色スポット）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける細胞内および排泄器官で検出可能である。核は、ＤＡＰＩ（青）と同時染色する（Ｎ＝５）。
図４．組織における標識ＤｉＬ ＥＶの検出。ＭＳＣ－またはＨＬＳＣ－標識ＥＶの静脈内注入から５時間後における、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグおよびマウスの皮膚（Ａ）、ならびに他の器官（肝臓、脾臓、腎臓および肺）の代表的な蛍光画像。ＤｉＬ ＥＶ（赤色スポット）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける細胞内および排泄器官で検出可能である。核は、ＤＡＰＩ（青）と同時染色する（Ｎ＝５）。
ＨＬＳＣ－ＥＶのＴＥＣに対する分子効果
これらの結果に基づき、ＨＬＳＣ－ＥＶ刺激後、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管様構造の組織化中に、ＴＥＣにおいて発生する変化の分子分析は、血管新生アレイを使用することにより行った。ＴＥＣは、ＨＬＳＣ－ＥＶ（１０×１０3個のＥＶ／ＴＥＣ）で処理し、血管新生アッセイからの伸展細胞（spreading cell）を採取した。テストした８４種の遺伝子のうち、筆者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血管新生中に、ＨＬＳＣ－ＥＶによりＴＥＣにおいて有意に下方調節された１１種の血管新生促進因子を同定した（図５、Ａ）。詳細には、ＴＥＣは、Ｔｉｅ－１、ベータ３インテグリン（ＩＴＧＢ３）、エフリン受容体Ｂ４（ＥＰＨＢ４）およびエンドグリン（またはＣＤ１０５））を含む血管新生促進表面受容体、ならびに、増殖因子、例えばＦＧＦ１、ＴＧＦファミリーメンバー、ウロキナーゼ－型プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＬＡＵ）および組織因子（Ｆ３）を下方調節した。最終的に、ＴＥＣの血管新生促進効果に関与することが公知のＡｋｔ１も下方調節された。
図５．ＴＥＣに対する抗血管新生効果に反応するＨＬＳＣ－ＥＶ特異的ｍｉＲＮＡの選択。Ａ－ＨＬＳＣ－ＥＶでの処理後にＴＥＣにおいて下方調節された遺伝子のリスト（ｎ＝３、データは、平均倍率変化±ＣＩ（信頼区間）として提示されている；これらの遺伝子は、１３６種のｍｉＲＮＡにより標的化でき（Ｂ）、そのうち４２種はＨＬＳＣ－ＥＶが担持する。これらの４２種のｍｉＲＮＡから、２６種はＭＳＣ－ＥＶが担持し、２６種は、抗腫瘍効果をＴＥＣに対して一切示さなかった。したがってこれら２６種のｍｉＲＮＡは、試験から排除した（Ｃ）。ＥＶのＴＥＣに対する生物学的作用に関連性があり得る、１６種のＨＬＳＣ－ＥＶ特異的ｍｉＲＮＡ。試験に選択されたｍｉＲＮＡは太字である。
これらの結果に基づき、ＨＬＳＣ－ＥＶ刺激後、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管様構造の組織化中に、ＴＥＣにおいて発生する変化の分子分析は、血管新生アレイを使用することにより行った。ＴＥＣは、ＨＬＳＣ－ＥＶ（１０×１０3個のＥＶ／ＴＥＣ）で処理し、血管新生アッセイからの伸展細胞（spreading cell）を採取した。テストした８４種の遺伝子のうち、筆者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血管新生中に、ＨＬＳＣ－ＥＶによりＴＥＣにおいて有意に下方調節された１１種の血管新生促進因子を同定した（図５、Ａ）。詳細には、ＴＥＣは、Ｔｉｅ－１、ベータ３インテグリン（ＩＴＧＢ３）、エフリン受容体Ｂ４（ＥＰＨＢ４）およびエンドグリン（またはＣＤ１０５））を含む血管新生促進表面受容体、ならびに、増殖因子、例えばＦＧＦ１、ＴＧＦファミリーメンバー、ウロキナーゼ－型プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＬＡＵ）および組織因子（Ｆ３）を下方調節した。最終的に、ＴＥＣの血管新生促進効果に関与することが公知のＡｋｔ１も下方調節された。
図５．ＴＥＣに対する抗血管新生効果に反応するＨＬＳＣ－ＥＶ特異的ｍｉＲＮＡの選択。Ａ－ＨＬＳＣ－ＥＶでの処理後にＴＥＣにおいて下方調節された遺伝子のリスト（ｎ＝３、データは、平均倍率変化±ＣＩ（信頼区間）として提示されている；これらの遺伝子は、１３６種のｍｉＲＮＡにより標的化でき（Ｂ）、そのうち４２種はＨＬＳＣ－ＥＶが担持する。これらの４２種のｍｉＲＮＡから、２６種はＭＳＣ－ＥＶが担持し、２６種は、抗腫瘍効果をＴＥＣに対して一切示さなかった。したがってこれら２６種のｍｉＲＮＡは、試験から排除した（Ｃ）。ＥＶのＴＥＣに対する生物学的作用に関連性があり得る、１６種のＨＬＳＣ－ＥＶ特異的ｍｉＲＮＡ。試験に選択されたｍｉＲＮＡは太字である。
ＨＬＳＣ－ＥＶが担持する抗血管新生マイクロＲＮＡの同定
続いて、観察された遺伝子調節の考えられるエフェクターを詳細に分析するために、関与すると考えられるＨＬＳＣのマイクロＲＮＡ含有量を研究した。この目的のために、バイオインフォマティクス分析の方略、続いてｉｎ ｖｉｔｒｏ機能確認を使用した。
続いて、観察された遺伝子調節の考えられるエフェクターを詳細に分析するために、関与すると考えられるＨＬＳＣのマイクロＲＮＡ含有量を研究した。この目的のために、バイオインフォマティクス分析の方略、続いてｉｎ ｖｉｔｒｏ機能確認を使用した。
Ｆｕｎｒｉｃｈ Ｖ３ソフトウェアを使用して、本発明者らは、１１種の下方調節された遺伝子を標的化するｍｉＲＮＡを予測した。１３６種のｍｉＲＮＡを同定し、ＨＬＳＣ－ＥＶが担持するｍｉＲＮＡと適合させた（ｖｅｓｉｃｌｅｐｅｄｉａで証言されているデータベース）。そのうち、ＨＬＳＣ－ＥＶによって表現される４２種のｍｉＲＮＡを同定した（図５、Ｂ）。その後の分析は除いて、ＨＬＳＣ－ＥＶが担持する４２種のｍｉＲＮＡのうち、ＭＳＣ－ＥＶにも存在するものは、ＴＥＣに対する効果が足りないことを考慮する（図５、Ｃ）。同定された遺伝子を標的化する１６種のｍｉＲＮＡは、ＨＬＳＣ－ＥＶとしてのみ提示され、機能研究に使用した（図５、Ｄ）。それらのうち、３種は、腫瘍形成促進性として記載され（ｈａｓｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－２１２－３ｐ）、また、３つ（ｍｉＲ－２３、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－３２０）は、ｍｉＲＮＡファミリーメンバーの１つ超として提示された。したがって、本発明者らは、８種のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－４２４およびｍｉＲ－８７４（図５、Ｄ、太字）を考慮に入れた。興味深いことに、これらの選択されたｍｉＲＮＡは、対照ＴＥＣにおいて下方調節された（Ｃｔ＞３３）。
ＨＬＳＣ－ＥＶ ｍｉＲＮＡのＴＥＣ血管新生に対する効果
これら別々のｍｉＲＮＡの、ＴＥＣ血管新生特性に対する特異的効果を実証するために、ＴＥＣに、選択された模倣体をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、血管様構造形成のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行った。４種のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃおよびｍｉＲ－８７４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて血管様構造形成を有意に阻害した（図６、Ａ）。模倣体の効果は、増殖またはアポトーシスで観察されなかった（図６、ＢおよびＣ）。
図６．選択されたＨＬＳＣ－ＥＶ特異的ｍｉＲＮＡのＴＥＣの血管新生促進特性および生存能力に対する影響。Ａ－選択された模倣ＲＮＡまたはスクランブルＲＮＡでトランスフェクトされたＴＥＣによる、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管様構造形成のダイアグラム（ｎ＝３、繰り返し、ウェルに対し画像１０枚、*－ｐ＜０．０５ｖｓ．スクランブル）；Ｂ－トランスフェクトされたＴＥＣのアポトーシス速度；Ｃ－トランスフェクトされたＴＥＣの増殖速度。
したがって、本発明者らは、４種の活性ｍｉＲＮＡ模倣体を用いたトランスフェクションが、予測された標的（ＥＰＨＢ４、ＩＴＧＢ３、ＦＧＦ１およびＰＬＡＵ）の発現をどのように変化させたかを調査した。ＴＥＣトランスフェクションは、その標的を有意に下方調節した（表１、図７）。表１．選択されたｍｉＲＮＡを用いてトランスフェクトしたＴＥＣ対対照ＴＥＣにおける血管新生促進遺伝子の相対発現。
これら別々のｍｉＲＮＡの、ＴＥＣ血管新生特性に対する特異的効果を実証するために、ＴＥＣに、選択された模倣体をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、血管様構造形成のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行った。４種のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃおよびｍｉＲ－８７４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて血管様構造形成を有意に阻害した（図６、Ａ）。模倣体の効果は、増殖またはアポトーシスで観察されなかった（図６、ＢおよびＣ）。
図６．選択されたＨＬＳＣ－ＥＶ特異的ｍｉＲＮＡのＴＥＣの血管新生促進特性および生存能力に対する影響。Ａ－選択された模倣ＲＮＡまたはスクランブルＲＮＡでトランスフェクトされたＴＥＣによる、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管様構造形成のダイアグラム（ｎ＝３、繰り返し、ウェルに対し画像１０枚、*－ｐ＜０．０５ｖｓ．スクランブル）；Ｂ－トランスフェクトされたＴＥＣのアポトーシス速度；Ｃ－トランスフェクトされたＴＥＣの増殖速度。
したがって、本発明者らは、４種の活性ｍｉＲＮＡ模倣体を用いたトランスフェクションが、予測された標的（ＥＰＨＢ４、ＩＴＧＢ３、ＦＧＦ１およびＰＬＡＵ）の発現をどのように変化させたかを調査した。ＴＥＣトランスフェクションは、その標的を有意に下方調節した（表１、図７）。表１．選択されたｍｉＲＮＡを用いてトランスフェクトしたＴＥＣ対対照ＴＥＣにおける血管新生促進遺伝子の相対発現。
これらのｍｉＲＮＡの発現から、ＨＬＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣにおいて有意に向上したことが見出され（図８、Ａ）、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ データの正当性を指し示した。並行して、模倣体のＨＬＳＣ－ＥＶの４種の標的遺伝子に対する効果（ＥＰＨＢ４、ＩＴＧＢ３、ＦＧＦ１およびＰＬＡＵ）をＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で評価した。
図８．ＨＬＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣにおけるｍｉＲＮＡおよびその標的の発現。Ａ－対照ＴＥＣおよびＨＬＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣにおけるｍｉＲＮＡの相対発現（ｎ＝７、*－ｐ＜０．０５ｖｓ．対照）；Ｂ－対照ＴＥＣおよびＨＬＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣにおける標的遺伝子の相対発現（ｎ＝７、*－ｐ＜０．０５ｖｓ．対照）；Ｃ－対照ＴＥＣ、ｍｉＲ－１５ａでトランスフェクトされたＴＥＣ、またはＨＬＳＣ－ＥＶで刺激されたＴＥＣにおけるＦＧＦ１発現のウエスタンブロット分析の代表的な画像。Ｄ－対照ＴＥＣ、ｍｉＲ－１８１ｂでトランスフェクトされたＴＥＣ、またはＨＬＳＣ－ＥＶで刺激されたＴＥＣにおけるＰＬＡＵ発現のウエスタンブロット分析の代表的な画像。
２つの標的、すなわちＦＧＦ１およびＰＬＡＵは、通常の培養条件において、ＨＬＳＣ－ＥＶで処理した細胞において有意に減少したことを確認した（図８、Ｂ）。トランスフェクトされたＴＥＣまたはＨＬＳＣ－ＥＶで処理したＴＥＣにおける、ＦＧＦ１およびＰＬＡＵ発現の下方調節を、ウエスタンブロットにより確認した（それぞれ図８、ＣおよびＤ）。
ｍｉＲＮＡ組合せを用いた腫瘍内皮細胞のトランスフェクション、および抗血管新生効果の評価
ＴＥＣは、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、以下の組合せのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－８７４／ｍｉＲ－１５ａ；ｍｉＲ－８７４／ｍｉＲ－１８１ｂ；ｍｉＲ－８４７／ｍｉＲ－３２０ｃ；およびｍｉＲ１８１ｃ／ｍｉＲ－３２０を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、血管新生ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行った。ｍｉＲＮＡのすべての組合せが、ＴＥＣの血管新生促進特性を有意に低下させた。さらに、ｍｉＲＮＡの組合せは、単一のｍｉＲＮＡより有効であった。
ＴＥＣは、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、以下の組合せのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－８７４／ｍｉＲ－１５ａ；ｍｉＲ－８７４／ｍｉＲ－１８１ｂ；ｍｉＲ－８４７／ｍｉＲ－３２０ｃ；およびｍｉＲ１８１ｃ／ｍｉＲ－３２０を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、血管新生ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行った。ｍｉＲＮＡのすべての組合せが、ＴＥＣの血管新生促進特性を有意に低下させた。さらに、ｍｉＲＮＡの組合せは、単一のｍｉＲＮＡより有効であった。
結果を図９に示し、これは、単一の、または組み合わせたｍｉＲＮＡをトランスフェクトされたＴＥＣにより形成された血管様構造の相対量を示す棒グラフである。（*＝ｐ＜０．０１ｖｓ．スクランブル）。
Claims (6)
- ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡを含む薬学的に許容できる担体を含む、腎癌の抗血管新生治療における使用のための組成物。
- ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃおよびｍｉＲ－８７４からなる群のうち少なくとも２つの組合せを含む、請求項１に記載の組成物。
- 薬学的に許容できる担体が、マイクロまたはナノ粒子であり、１以上のマイクロＲＮＡが、マイクロもしくはナノ粒子の内側に含有されているか、またはマイクロもしくはナノ粒子の表面に付着している、請求項１または２に記載の組成物。
- 薬学的に許容できる担体が、非卵形ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）由来の細胞外小胞（ＥＶ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
- 薬学的に許容できる担体が、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－８７４およびそれらの任意の組合せの群から選択されるマイクロＲＮＡを含有するように操作されている、成体幹細胞に由来する細胞外小胞（ＥＶ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
- 細胞外小胞（ＥＶ）が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）からなる群から選択される成体幹細胞に由来する、請求項５に記載の組成物。
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