JP2009100687A - microRNA発現プロファイリングに基づく膀胱癌の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】miRNAの機能、特に、細胞の癌化との関連を解明し、miRNAの発現量の変動を測定することから成る膀胱癌の検出方法を提供すること。
【解決手段】細胞中のmiR-96, miR-190, miR-183, miR-130b, miR-124b, miR-215, miR-224及びmiR-106a、並びに、miR-145, miR-30a-3p, miR-100, miR-150, miR-133a, miR-320, miR-133b, miR-151, miR-195, miR-125b, miR-152, miR-218, miR-199-s, miR-199a, miR-199a*, miR-223, miR-139, miR-9及び miR-140から成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の変動を測定することから成る、膀胱癌の検出方法。
【選択図】なし
Description
Calin GA and Croce CM (2006) MicroRNA signatures in human cancers, Nature Reviews, 6, 857-866. Volinia S et al, (2006) A microRNA expression signature of human solid tumors define cancer gene targets, PNAS, USA, 103, 2257-2261.
[1]細胞中のmiR-96, miR-190, miR-183, miR-130b, miR-124b, miR-215, miR-224及びmiR-106a、並びに、miR-145, miR-30a-3p, miR-100, miR-150, miR-133a, miR-320, miR-133b, miR-151, miR-195, miR-125b, miR-152, miR-218, miR-199-s, miR-199a, miR-199a*, miR-223, miR-139, miR-9及び miR-140から成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の変動を測定することから成る、膀胱癌の検出方法。
[2]細胞中のmiR-96, miR-190, miR-183, miR-130b, miR-124b, miR-215, miR-224及びmiR-106a、並びに、miR-145, miR-30a-3p, miR-100, miR-150, miR-133a, miR-320, miR-133b, miR-151, miR-195, miR-125b, miR-152, miR-218, miR-199-s, miR-199a, miR-199a*, miR-223, miR-139, miR-9及び miR-140から成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の変動に基づく、膀胱癌の治療又は予防に有効な物質のスクリーニング方法。
[3]本発明スクリーニング方法に用いるスクリーニングキット。
(a) 被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における各miRNAの発現量を測定する工程、及び
(c)発現量の亢進を抑制するか又は発現量を減少させる物質を選択する工程、を含む方法でスクリーニングすることができる。
(a) 被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における各miRNAの発現量を測定する工程、及び
(c)発現量の低下を抑制するか又は発現量を増加させる物質を選択する工程、を含む方法でスクリーニングすることができる。
miRNA特異的逆転写反応および定量PCR
膀胱癌患者臨床検体19検体(癌部14検体、非癌部5検体)及び膀胱癌由来細胞株3種(BOY、KK47、T24)よりtotal RNAをtrizol(Gibco BRL, Life Technologies, Gaitherburg, MD, USA)用いて抽出した。cDNAは得られたtotal RNAからmiRNA特異的なプライマー(TaqMan microRNA Assay Protocol, PE, Applied Biosystems, Foster City, CA, UAS)を用いて合成した。逆転写反応は以下のとおり行った。10nM RNA samples, 50nM stem-loop RT primer, 1 x RT buffer, 0.25mM each of dNTPs, 3.33 U/μl MultiScribe reverse transcriptase 及び 0.25 U/μl RNase Inhubitor。また、これら7.5μlの反応液を以下のプロトコールでインキュベートした。16℃・30分、42℃・30分、85℃・5分、反応後4℃で保存した。定量PCRは、ABI 7300 Seqence Detection Systemを用いて以下の反応系で行った。95℃・10分インキュベートした後、95℃・15秒、60度・10分の反応を40回行った。
膀胱癌患者臨床検体19例(癌部14検体および非癌部5検体)及び膀胱癌由来細胞株3種について、既に記載したデータベース(miRBase::Sequences, Sanger Institute)から選んだ156種類のmiRNA及びコントロール遺伝子の解析を行った。解析結果について、マイクロアレイで用いられているglobal median normalization法を用いてデータの標準化を行った。この解析データから、癌部および非癌部で優位に(P<0.01)発現差のある遺伝子を選択した。その結果、27種類のmiRNAが癌部で有意に発現変動していることが判明した(8種類のmiRNAは癌部で発現亢進、19種類のmiRNAは癌部で発現低下)。以下の表1及び表2にそのリストを示す。
今回の解析で27種類のmiRNAが膀胱癌に関係するmiRNAとしてリストアップすることができた。この中で、正常移行上皮に比べ、癌部で発現が低下しているmiRNAの中のmiR-30-3p、miR-133b、及びmiR-145は、同じくABI TaqMan法を用いた大腸癌のプロファイルにおいても癌部において発現が低下していることが報告された(Bandres et al, 2006)。miR-145は大腸癌(Cummins et al, 2006)以外にも、肺癌(Yanaihara et al, 2006)や乳癌(Iorio et al, 2005)で発現が低下することが報告されており、癌抑制遺伝子的な働きを担うmiRNAであることが示唆される。
1. Calin GA and Croce CM (2006) MicroRNA signatures in human cancers, Nature Reviews, 6, 857-866.
2. Calin GA et al, (2002) Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia, PNAS, USA, 99, 15524-15529.
3. Hayashida Y et al, (2005) A polycistronic microRNA cluster, miR-17-92, is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation. Cancer Res, 65, 9628-9632.
4. Volinia S et al, (2006) A microRNA expression signature of human solid tumors define cancer gene targets, PNAS, USA, 103, 2257-2261.
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10. Chen C et al, (2005) Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR, Nucleic Acids Res, 33, e179.
11. Bandres E et al, (2006) Identification by Real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues, Molecular Cancer, 5, 29.
12. Cummins JM et al, (2006) The colorectal microRNAome, PNAS, USA, 103, 3687-3692.
13. Hayashita Y et al, (2006) A polycistronic microRNA cluster, miR-17-92, is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation, Cancer Res, 65, 9628-9632.
14. Iorio MV et al, (2006) MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer, Cancer Res, 65, 7065-7070.
Claims (18)
- 細胞中のmiR-96, miR-190, miR-183, miR-130b, miR-124b, miR-215, miR-224及びmiR-106a、並びに、miR-145, miR-30a-3p, miR-100, miR-150, miR-133a, miR-320, miR-133b, miR-151, miR-195, miR-125b, miR-152, miR-218, miR-199-s, miR-199a, miR-199a*, miR-223, miR-139, miR-9及び miR-140から成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の変動を測定することから成る、膀胱癌の検出方法。
- 細胞中のmiR-96, miR-190, miR-183, miR-130b, miR-124b, miR-215, miR-224及びmiR-106aから成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の亢進を測定することから成る、膀胱癌の検出方法。
- miRNAの発現量が正常組織由来の細胞に比べて2倍以上亢進していることを膀胱癌の判定基準とする、請求項1記載の検出方法。
- miR-145, miR-30a-3p, miR-100, miR-150, miR-133a, miR-320, miR-133b, miR-151, miR-195, miR-125b, miR-152, miR-218, miR-199-s, miR-199a, miR-199a*, miR-223, miR-139, miR-9及び miR-140から成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の低下を測定することから成る、膀胱癌の検出方法。
- miR-145, miR-30a-3p 及びmiR-133b から成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の低下を測定することから成る、膀胱癌の検出方法。
- miRNAの発現量が正常組織由来の細胞に比べて2分の1以下に低下していることを膀胱癌の判定基準とする、請求項4又は5記載の検出方法。
- 請求項1に記載の各miRNAに特異的にハイブリダイズするプライマーを用いてmiRNAの発現量を測定する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の検出方法。
- リアルタイムPCRによりmiRNAの発現量を測定する、請求7記載の検出方法。
- 細胞中のmiR-96, miR-190, miR-183, miR-130b, miR-124b, miR-215, miR-224及びmiR-106a、並びに、miR-145, miR-30a-3p, miR-100, miR-150, miR-133a, miR-320, miR-133b, miR-151, miR-195, miR-125b, miR-152, miR-218, miR-199-s, miR-199a, miR-199a*, miR-223, miR-139, miR-9及び miR-140から成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の変動に基づく、膀胱癌の治療又は予防に有効な物質のスクリーニング方法。
- 細胞中のmiR-96, miR-190, miR-183, miR-130b, miR-124b, miR-215, miR-224及びmiR-106aから成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の亢進に基づく、膀胱癌の治療又は予防に有効な物質のスクリーニング方法。
- 請求10記載のスクリーニング方法であって、
(a) 被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における各miRNAの発現量を測定する工程、及び
(c)発現量の亢進を抑制するか又は発現量を減少させる物質を選択する工程、を含む方法。 - miR-145, miR-30a-3p, miR-100, miR-150, miR-133a, miR-320, miR-133b, miR-151, miR-195, miR-125b, miR-152, miR-218, miR-199-s, miR-199a, miR-199a*, miR-223, miR-139, miR-9及び miR-140から成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の低下に基づく、膀胱癌の治療又は予防に有効な物質のスクリーニング方法。
- miR-145, miR-30a-3p 及びmiR-133b から成る群より選択された少なくとも一つのmiRNAの発現量の低下に基づく、膀胱癌の治療又は予防に有効な物質のスクリーニング方法。
- 請求12又は13記載のスクリーニング方法であって、
(a) 被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における各miRNAの発現量を測定する工程、及び
(c)発現量の低下を抑制するか又は発現量を増加させる物質を選択する工程、を含む方法。 - 請求項1に記載の各miRNAに特異的にハイブリダイズするプライマーを用いてmiRNAの発現量を測定する、請求項9〜14のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- リアルタイムPCRによりmiRNAの発現量を測定する、請求15記載のスクリーニング方法。
- 請求項9〜16のいずれか一項に記載のスクリーニング方法に用いるスクリーニングキット。
- 請求項1に記載の各miRNAに特異的にハイブリダイズするプライマーの少なくとも一つを有する、請求項17記載のスクリーニングキット。
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