CN105999269A - miR-411作为膀胱癌的靶标及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及miR‑411作为膀胱癌的靶标及其应用，本发明以膀胱癌T24，UMUC3细胞为模型，过表达miR‑411可在体内外抑制膀胱癌细胞增殖，诱导膀胱癌细胞周期G2/M期阻滞，同时增强化疗药物(丝裂霉素和吉西他滨)对膀胱癌细胞的敏感性。可见，miR‑411表达促进剂可以预防或/和治疗膀胱癌。利用miRNA芯片技术，实时荧光定量PCR技术，生物信息学分析TCGA数据库等方法检测膀胱癌原发动物模型与临床膀胱癌组织中miR‑411表达均呈显著下调趋势，且miR‑411表达与膀胱癌患者生存期有一定正相关性。可见，通过检测miR‑411的表达，可以辅助诊断或/和预后检测膀胱癌。

Description

miR-411作为膀胱癌的靶标及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及膀胱癌的新靶标及其应用，更具体涉及miR-411作为膀胱癌的靶标及其应用。
背景技术
膀胱癌是最常见恶性肿瘤之一，居泌尿系统恶性肿瘤之首位。近年来，环境因素包括吸烟和对化学物质的暴露及不良生活习惯与膀胱癌的发生密切相关并导致膀胱癌的发病率和死亡率呈逐渐升高的趋势。据最新发表的统计数据表明，每年全世界会出现超过350,000新的案例，造成132000人死亡。尽管其流行性和对社会经济的影响，但是膀胱癌是被研究最少的肿瘤。而新靶向药物的研发及新预防措施的应用是公认遏制这一态势的主要途径，这使得相应新分子靶标鉴定成为膀胱癌防治研究中的热点。因此，找到与膀胱癌发生发展相关的新的靶分子，是提高该疾病的临床预防效果和生存质量的有效方法，对于膀胱癌的防治具有重大意义。
微小RNA(miRNA)是一类高度保守的大小约19～25个核苷酸的非编码小分子RNA普遍存在于各种生物的细胞中，miRNAs进化上是保守的，位于编码蛋白基因(70％)的内含子或外显子中或基因间隔区(30％)。大多数内含子和外显子miRNA来源于他们的宿主基因，暗示他们同宿主转录子共同转录，其他可从作为独立转录单元的基因间隔区域转录。成熟的miRNA通过与靶mRNA的3'UTR不完全互补匹配或完全互补匹配时，使该基因的翻译过程受到抑制或在核酸内切酶作用下降，从而参与多种生命过程，包括细胞生长，增殖，分化，和凋亡。已有研究显示miRNA可发挥促癌或抑癌的作用，因此，miRNA与肿瘤的发生发展密切相关。除此之外，miRNA在人的组织中的表达具有组织特异性，提示其作为不同实体瘤特异性标志。近年来研究报道多种miRNA在膀胱癌中异常表达，其中miR-145,miR-125和miR-143是常被报道下调的miRNAs，而miR-182和miR-183是被报道下调的miRNAs，并且在肿瘤发起，发展和转移中发挥重要作用。然而较多miRNA未在膀胱癌中报导，因此探索该部分miRNA同时找到膀胱癌新的标记物并对其功能开展研究对该疾病的临床防治具有重要意义。
miR-411在多种肿瘤组织中异常表达，包括肝癌和乳腺癌等，参与多种生物学进程。研究显示，miR-411在肿瘤中的表达具有组织特异性。在肝癌细胞和肝癌组织中表达显著高于正常细胞和组织，miR-411作为促癌因子作用于ITCH促进肝癌细胞增殖。在乳腺癌组织中，miR-411表达下调。进一步研究显示，相比低转移性乳癌细胞，miR-411在高转移性乳癌细胞中的表达水平更低，瞬时转染miR-411mimic之后，miR-411能够抑制乳癌细胞的侵袭和迁移能力。在胰腺癌和壶腹腺癌中，miR-411显著下调，可作为胰腺癌早期诊断的标志。以上研究表明miR-411的生物学功能有显著的器官组织依赖性，其在膀胱癌中的相关功能未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供miR-411作为膀胱癌的靶标及其应用。
本发明所采取的技术方案如下：miR-411表达促进剂或/和miR-411模拟物或/和miR-411外源导入试剂在制备抑制膀胱癌细胞增殖的药物中的应用。
所述miR-411表达促进剂为miR-411过表达质粒。
一种预防或/和治疗膀胱癌的组合物，组合物包含：
(1)miR-411表达促进剂或/和miR-411模拟物或/和外源导入miR-411的试剂；
(2)药剂学上能够接受的载体。
包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐、凝胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙酸吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、丙基羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并非局限与此。
本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。
所述miR-411表达促进剂为miR-411过表达质粒。
所述组合物包含化疗药物丝裂霉素或/和吉西他滨。
一种检测miR-411表达的试剂，所述检测miR-411表达的试剂包含基于荧光定量PCR定量检测方法的试剂。
所述基于荧光定量PCR定量检测方法的试剂包含特异性引物与通用引物，特异性引物序列为5’-TAGTAGACCGTATAGCGTACG-3’。
上述miR-411的序列为5’-UAGUAGACCGUAUAGCGUACG-3’。
本发明有益效果如下：本发明以膀胱癌T24，UMUC3细胞为模型，过表达miR-411可在体内外抑制膀胱癌细胞增殖，诱导膀胱癌细胞周期G2/M期阻滞，同时增强化疗药物(丝裂霉素和吉西他滨)对膀胱癌细胞的敏感性。可见，可以通过过表达miR-411抑制膀胱癌细胞增殖起到预防或/和治疗膀胱癌的作用，用miR-411表达促进剂、miR-411模拟物、外源导入miR-411的试剂可以过表达miR-411。利用miRNA芯片技术，实时荧光定量PCR技术，生物信息学分析TCGA数据库等方法检测膀胱癌原发动物模型与临床膀胱癌组织中miR-411表达均呈显著下调趋势，且miR-411表达与膀胱癌患者生存期有一定正相关性。可见，通过检测miR-411的表达，可以辅助诊断或/和预后检测膀胱癌。
附图说明
图1为BBN不同时间段诱导C57BL/6J小鼠的膀胱组织病理损伤鉴定图。以0.05％的BBN诱导C57BL/6J小鼠0周、5周、9周、15周、20周，将小鼠膀胱组织取出后采用苏木精-伊红染色法(HE)证实BBN诱导的膀胱癌早在15W时出现，在20W时发现高级别浸润性膀胱癌发生率为100％。
图2A、2B为miRNA芯片技术检测到BBN诱导的膀胱癌动物模型中差异表达的miRNA聚类图及miR-411在5周、9周、15周、20周相对于0周表达显著下调的qPCR验证图，p<0.001。
图3A、3B为miR-411在人膀胱癌组织样本和人膀胱癌细胞中表达显著下调的qPCR图，N是正常，T是肿瘤。
图4为生物信息学分析TCGA数据库中miR-411在膀胱癌的表达(A)及miR-411与膀胱癌病人的生存曲线图(B和C)。
图5A、4B为实时荧光定量PCR检测T24-miR-411，UMUC3-miR-411及其空载稳定转染细胞中miR-411表达的柱状图，p<0.001。
图6为miR-411作用软琼脂中的膀胱癌细胞3周后的特征性图像(×100)(A、C)及显微镜下计数软琼脂集落形成实验中超过32个细胞的克隆数统计图(B、D)。采用采用软琼脂集落形成实验，将T24-miR-411，UMUC3-miR-411以及对照细胞种于软琼脂中，3周左右拍摄特征性的图像，证实miR-411抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长，p<0.001。
图7A、B为过表达miR-411抑制膀胱癌细胞T24、UMUC3增殖曲线图。通过ATP生物荧光检测法证实过表达miR-411后膀胱癌细胞增殖能力明显低于为过表达的细胞，p<0.001。
图8A、B为稳定过表达miR-411抑制裸鼠肿瘤生长曲线图。将稳定转染细胞系T24-miR-411，UMUC3-miR-411以及对照细胞皮下接种于4周龄的裸鼠，共4组，每组5只，接种一周后每3天测量肿瘤大小，直到33天后将裸鼠处死，肿瘤取出，拍照并称重，p<0.001。
图9为稳定过表达miR-411抑制裸鼠皮下肿瘤形成的图片(A和C)，及肿瘤重量图(B和D)。
图10为Ki-67在裸鼠肿瘤中表达的免疫组织化学染色图片。放大倍数：100×、400×(A和C)及Image-Pro Plus version 6.0软件定量分析Ki-67的阳性细胞数统计图(B和D)。通过免疫组织化学染色方法检测了T24-miR-411组和UMUC3-miR-411组及其对照组中Ki-67的表达，进一步证实miR-411能显著抑制肿瘤细胞的增殖，具有抗肿瘤作用，p<0.001。
图11为过表达miR-411诱导膀胱癌细胞周期G2/M期阻滞的流式细胞仪检测图谱。通过流式细胞术证实miR-411可诱导膀胱癌细胞G2/M期生长阻滞，从而抑制膀胱癌细胞增殖。
图12为过表达miR-411增强丝裂霉素和吉西他滨化疗药物对膀胱癌细胞T24，UMUC3的敏感性作用的相差显微镜图(A和C)，及ATP法证实的过表达miR-411组的细胞活性明显低于对照组，p<0.001。
具体实施方式
下面结合附图以及本发明的具体实施方式，可以更好地说明本发明。
实验实施例1
BBN诱导膀胱癌动物模型构建
1)动物饲养
购买C57BL/6小鼠，3-4周龄，适应性饲养1周后，随机分笼，每笼4只。所有动物实验均依据温州医科大学伦理委员会相关规定。
2)BBN不同周处理小鼠设计
将BBN(N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺)物质放入动物房小鼠饮用水中，使其终浓度为0.05％，按照如下设计，先20周12只给药，之后依次推，一周更换2次饮用水，最后1周给药后将小鼠全部处死。每只小鼠取膀胱一般组织包埋以备做免疫组化，余下一半刮上皮细胞，同一组每4只小鼠混合后，提取RNA。每组取4μg RNA送出测序。
3)组织病理学检测BBN诱导小鼠膀胱癌组织学病变情况(HE染色)
a.烤片：根据实验需要取石蜡切片放置65℃烘箱烤片30min，冬天可延长时间
b.脱蜡复水：从65℃烘箱中取出切片，立即放入二甲苯Ⅰ8min→二甲苯Ⅱ8min→1/2二甲苯+1/2乙醇2min后，充分脱蜡。脱蜡时间取决于蜡能否彻底溶解。如气温较低，则可延长脱蜡时间，反之亦然。然后经梯度乙醇进行复水：100％乙醇→100％乙醇→95％乙醇→90％乙醇→80％乙醇→70％乙醇→50％乙醇，各1-2min，最后放置去离子水5min。
脱蜡复水：同免疫组织化学染色。
c.染色：组织复水后苏木精染色大约3-4min，用流动的自来水缓慢冲洗大约6min。在此过程中，切片的颜色会逐渐变成浅蓝色。如苏木精着色过深，可使用1％盐酸乙醇分化液中进行褪色，大约需2-5s。切片依次经过50％乙醇→70％乙醇→80％乙醇各2min来进行脱水。然后用伊红复染大约15-30s。
d.脱水Ⅱ：伊红染色后将组织放入95％乙醇Ⅰ、95％乙醇Ⅱ洗掉切片上多余染料，然后切片放入100％乙醇Ⅰ、100％乙醇Ⅱ中2min。
e.透明：切片依次经过乙醇/二甲苯等量混合液1min、二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min。
f.封片镜检。
实验实施例2
miRNA表达谱芯片实验(该部分由杭州联川生物技术有限公司完成)
微阵列实验由LC Sciences公司进行。微阵列实验使用4μg总RNA样品。在总RNA的3'端通过Poly(A)聚合酶加上poly(A)尾巴，再与一个寡聚核苷酸标记连接(ligation)用于后续的荧光标记。利用微循环泵(Atactic Technologies)的循环作用在μParaflo微流体芯片上过夜进行杂交反应。在该芯片上，每条检测探针都是由一个化学修饰核苷酸编码段(与目标microRNA互补(来源于miRBase，http://www.mirbase.org/)或是与其他RNA(质控或是客户定制序列)互补)和一个由聚乙二醇组成的间隔段(扩大编码段与基质的间距)组成。检测探针均使用PGR(photogenerated reagent)化学法进行原位合成。杂交解链温度是通过化学修饰检测探针进行平衡。杂交使用含有25％甲酰胺的100μL 6xSSPE缓冲液(0.90M NaCl，60mM Na2HPO4，6mM EDTA，pH 6.8)，杂交温度为34℃。RNA与探针杂交后，与标记特异结合的Cy3染料在微流体芯片上循环流动进行染色。利用激光扫描仪(GenePix 4000B，Molecular Device)采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件(Media Cybernetics)将图像数字化转换。数据分析时先要减除背景值，然后使用LOWESS过滤(Locally-WeightedRegression)进行信号归一化。
最后如图2A所示，采用ANOVA分析miRNA在0W，5W，9W，15W，20W这五个样本中的变化，选择P-Value<0.005，log2fold-change(logFC)>1.5或log2fold-change(logFC)<-1.5的microRNA为差异microRNA，其中上调的miRNA共15个，下调的miRNA共8个做聚类图，其中miR-411降低最明显。进一步通过荧光定量PCR技术验证miR-411在0W，5W，9W，15W，20W的表达情况，结果如图2B所示，miR-411在BBN诱导的膀胱癌形成过程中表达明显降低。
实验实施例3
临床膀胱癌样本和人膀胱癌细胞中miR-411的表达
组织样本
收集温州医科大学第二附属医院泌尿外科行膀腕癌手术的14例患者的组织标本。收集患者姓名、性别、年龄、病理号码、病理等资料。入选患者大部分为男性且均经膀胱全切术,术前活检和术后病理检查证实为膀胱尿路上皮癌。每例标本均采集肿瘤组织,同时距肿瘤周围约3cm处切取正常组织作为对照。每份样本在组织离体后冻存于液氮灌中。实验操作经伦理审查批准。
组织/细胞总RNA提取
a.从-80℃冰箱中取出膀胱癌临床样本，每个样本约30-50μg于EP管中，放置冰上；细胞约1x107个以内。
b.加入700μl的Qiazol混匀，组织需要剪碎。
c..彻底混匀后，室温放置5-10min。组织需要使用匀浆器以最大转速将组织匀碎，通常2min，整个过程在冰上进行。
d.加入140μl氯仿(chloroform)，剧烈震荡1min，室温静置2-3min。
e.将样品在12000g 4℃离心15min，离心后吸取上清至新的去酶EP管。
f.加入1.5倍体积100％乙醇(通常是525μl)，上下颠倒混匀数次，作为样本备用于下一步；
g.将RNeasy Mini spin column置于2ml离心管中，吸取上述700μl样本至离心柱中，室温离心30s，速度10000rpm，弃去滤液。
h.将步骤7重复，直至样本全被过滤。
i.向离心柱中加入700μl Buffer RWT，转速10000rpm，室温离心30s，弃去滤液；
j.向离心柱中500μl Buffer RPE，转速8000g，室温离心30s，弃去滤液；
k.再次向离心柱中加入500μl Buffer RPE入柱，8000g转速离心1min,再以10000rpm离心1min，以此更能有效富集RNA，弃去滤液。
l.将RNeasy Mini spin column置于新的2ml离心管，1000g室温离心2min。
m.将离心柱置于新的1.5ml去酶EP管中，加入Rnase-free water 30-50μl(直接加在膜上)，10000rpm，室温离心1min，收集滤液。
n.吸取滤液至离心柱膜上，重复13步，收集滤液。
o.使用NanoDrop 2000c测定浓度，封口膜密封后保存于-80℃。
miRNA逆转录
配制RT反应体系如下，冰上操作。
将上述体系振荡混匀后点离，放入PCR仪中，
反应程序:37℃70min→95℃5min→4℃∞，反应程序结束后，收取样品放置冰上2min，然后用封口膜密封后至-80℃保存或用于下一步实验。
荧光定量PCR检测miRNA的表达
将所需组织、细胞获得cDNA后，使用美国Qiagen公司所购Green PCR Kit进行PCR，步骤如下：
a.配制PCR反应体系如下，冰上操作。
b.充分混匀以上反应体系，然后加入至PCR管中，每个样本3个复孔，短暂离心以便试剂混匀且不能有气泡，置于PCR仪中运行程序。
c.Q-PCR反应，预变性95℃，15min,循环条件如下，扩增40个循环
变性95℃，15秒，退火55℃，30秒，延伸70℃，30秒
d.主要引物序列如下：
U6:Reverse: 5’-TGGTGTCGTGGAGTCGG-3’
U6:Forward: 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
mmu/hsa-miR-411-5p 5’-TAGTAGACCGTATAGCGTACG-3’
实验实施例4
生物信息学分析miR-411在TCGA数据库中表达降低且与膀胱癌病人生存期有正相关性。
生物信息学下载并分析TCGA数据库中的RNA-seq V2和miRNA-seq的level3数据。
集合样本的barcode信息，选取Primary solid Tumor(sampe ID以-01结尾)和Solid Tissue Normal(samples ID以11结尾)的样本作分析，共19对，38个样本。用R包edgeR分析癌症(tumor)和癌旁(normal)配对的样本中miRNA差异表达量，该包采取的是对数表达比率的加权截断均值(trimmed mean of Mvalues，TMM)归一化方法。为降低假阳性(false discover rate,fdr),p-value用Benjamini–Hochberg(BH)方法校正。差异显著性的筛选阈值为log2fold-change(logFC)不小于3，fdr<0.01，其中miR-411在膀胱癌中显著降低。于是进一步分析miR-411在每一对癌症和癌旁样本中的变化，结果如图4A所示，19例病人中，有4例表达量稍有升高，其余15例表达量降低。
选取生存期3年至3500天的患者共55例，然后采用Kaplan–Meier分析该群体中按高表达miR-411(>6.45；n＝27)或低表达miR-411(<6.45；n＝28)分类的膀胱癌样本的总体生存期，并用log-rank检验比较其差异。两组样本中miR-411对应的表达量用counts per million(cpm)衡量。结果如图4B、4C表明高表达miR-411的病人生存期明显优于低表达miR-411的病人(p＝0.007)。
实验实施例5
过表达miR-411抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长和细胞增殖
选用T24，UMUC3细胞作为研究对象采用LV3-pGLV-h1-GFP-puro-miR-411-5p-pre质粒在T24，UMUC3细胞中过表达miR-411，并建立稳定转染细胞T24(miR-411)，UMUC3(miR-411)及其对照T24-Vector，UMUC3-Vector，以U6作为内参，采用2-△△ct相对定量计算miR-411在稳定转染细胞中基因表达的倍数变化。结果如图5A，5B显示，转染T24，UMUC3细胞实验组中miR-411相对表达表达量分别是42.46±0.2620，72.95±3.107，对照组中分别为1.030±0.2849，1.023±0.2755，差异具有统计学意义。
采用软琼脂集落形成实验，将T24-miR-411，UMUC3-miR-411以及对照细胞种于软琼脂中，3周左右拍摄特征性的图像(×100)，如图6A，6C所示。同时显微镜下观察并计数软琼脂集落形成超过32个细胞的克隆数，结果如图6B，6D所示，两组比较并进行统计学分析差异具有显著性(p<0.001)。。该数据表明miR-411显著抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长。
进一步通过ATP生物荧光检测法检测miR-411对人膀胱癌T24，UMUC3细胞增殖的影响。将T24-miR-411，UMUC3-miR-411以及对照细胞接种于96孔培养板，待0天，1天，2天，3天，4天，5天后分别提取ATP，酶标仪检测Luminescence。经公式计算后，结果如图7A，7B所示，进一步证明miR-411抑制膀胱癌细胞增殖，并且随着时间的增加，miR-411抑制膀胱癌细胞增殖的效果更明显。
实验实施例6
过表达miR-411抑制裸鼠异种移植模型中肿瘤的形成和生长
1)裸鼠皮下成瘤实验
a.动物饲养
购买BALB/C-nu裸鼠，3-4周龄，适应性饲养1周。所有动物实验均依据温州医科大学伦理委员会相关规定。
b.细胞皮下接种
T24-vector，T24-miR-411，UMUC3-vector，UMUC3-miR-411细胞处于对数生长期，弃去培养基，PBS洗一遍；0.05％胰酶消化2min后，培养基终止，离心后用PBS重悬，检测细胞活力并计数细胞总数，将细胞浓度调整至2×106/ml。
c.裸鼠注射部位用75％酒精消毒。接种前充分混匀细胞，1ml无菌注射器吸取100ul细胞悬液，将细胞悬液注射于小鼠右背部皮下，每种细胞注射5只裸鼠。
d.待肿瘤长起来后，每3天测一次肿瘤大小(肿瘤体积V＝0.52×(a×b2)。
e.待裸鼠肿瘤达到相应体积时，对比拍照，再取出肿瘤，拍照，并分别对每组肿瘤称重，结果如图8，图9所示稳定过表达miR-411显著抑制裸鼠肿瘤生长。
2)免疫组织化学染色方法检测Ki的表达(即用型二步法)
a.烤片：根据实验需要取石蜡切片放置65℃烘箱烤片30min，冬天可延长时间
b.脱蜡复水：从65℃烘箱中取出切片，立即放入二甲苯Ⅰ8min→二甲苯Ⅱ8min→1/2二甲苯+1/2乙醇2min后，充分脱蜡。脱蜡时间取决于蜡能否彻底溶解。如气温较低，则可延长脱蜡时间，反之亦然。然后经梯度乙醇进行复水：100％乙醇→100％乙醇→95％乙醇→90％乙醇→80％乙醇→70％乙醇→50％乙醇，各1-2min，最后放置去离子水5min。
c.抗原修复：组织经脱蜡复水后用10mM柠檬酸钠抗原修复液微波炉煮约30min，调至高火，4次，每次7min。然后放置室温，待样本能够自然冷却至室温后(切不可骤然冷却)，使用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，每次2min。
d.通透封闭：采用0.3％或3％H2O2去离子水孵育5分钟-15分钟，以阻断内源性过氧化物酶，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，每次2min
e.一抗孵育：滴加一抗，室温或37℃孵育30～60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次
f.滴加enhangcer增强剂，室温20min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次
g.二抗孵育：滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟×5次
h.DAB显色：将A、B液按相应比例混匀(1：50)，滴加于标本表面，室温静置5-10min。当标本出现黄色时终止染色。PBS或自来水冲洗5-10min。
i.复染：苏木精复染约30s-1min，以较浅为宜。
j.脱水透明：经复染后石蜡切片再次经过梯度乙醇进行脱水：50％乙醇→70％
乙醇→80％乙醇→90％乙醇→95％乙醇→100％乙醇→100％乙醇，各1-2min，然后放入1/2二甲苯+1/2乙醇1min，二甲苯Ⅰ8min→二甲苯Ⅱ各4min。
k.封片、镜检、分析：将组织周围多余的二甲苯擦去，滴上适量树胶于组织上(以少为宜)，然后取出干净的盖玻片，慢慢盖到封固剂上，压平，切记不能有气泡。封片完成后，放在通风橱吹干，待镜下观察。
3)Image-Pro Plus version 6.0软件对免疫组化图片进行定量分析，每个组织选取10个在400倍镜视野，统计学结果如图10B、10D显示T24-miR-411组中Ki-67阳性细胞数35.45±7.624，其对照组中为73.56±7.236；UMUC3-miR-411组中Ki-67阳性细胞数30.83±4.388，其对照组中为69.79±10.48。统计学分析miR-411过表达组相对其对照组差异显著，均具有统计学意义，p<0.001。
实验实施例7
过表达miR-411诱导G2/M细胞周期阻滞
PI染色法和流式细胞仪检测细胞周期
1)细胞种板：用0.05％胰酶消化处于对数生长期的T24-NC，T24-miR-411，UMUC3-NC，UMUC3-miR-411细胞，吹打制成单细胞悬液，采用血细胞计数法计数细胞，以8000个细胞/孔的密度接种于6孔培养板
2)细胞贴壁后用0.1％FBS完全培养基饥饿12h。
3)饥饿后用完全培养基培养3day，弃掉培养基，胰酶消化并收集细胞，PBS洗后用预冷的70％乙醇固定，4℃保存12-24h。
4)2500×g离心8min，并用PBS液洗1次。
5)加入PI染色液避光4℃保存30min后，用流式细胞仪(BD，C6，USA)检测细胞周期DNA含量。
结果如图11所示，与对照组相比，miR-411过表达之后诱导细胞明显阻滞在G2/M细胞周期，但不会诱导细胞凋亡。该结果表明miR-411过表达可诱导膀胱癌细胞G2/M期生长阻滞，从而抑制膀胱癌细胞增殖。
实验实施例8
过表达miR-411增加丝裂霉素和吉西他滨化疗药物敏感性作用
T24-NC，T24-miR-411，UMUC3-NC，UMUC3-miR-411细胞分别用0.05mg/ml的丝裂霉素和25uM的吉西他滨处理24h后拍摄细胞状态，并检测细胞ATP活力。如图12所示过表达miR-411组的细胞活性显著低于对照组，p<0.001。
以上所述仅为本发明的一种实施例，并非用来限制本发明的保护范围；本发明的保护范围由权利要求书中的权利要求限定，并且凡是依发明所作的等效变化与修改，都在本发明专利的保护范围之内。

Claims (7)

1.miR-411表达促进剂或/和miR-411模拟物或/和外源导入miR-411的试剂在制备抑制膀胱癌细胞增殖的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述miR-411表达促进剂为miR-411过表达质粒。
3.一种预防或/和治疗膀胱癌的组合物，其特征在于：组合物包含：(1)miR-411表达促进剂或/和miR-411模拟物或/和外源导入miR-411的试剂；
(2)药剂学上能够接受的载体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述促进miR-411表达的试剂为miR-411过表达质粒。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述组合物包含化疗药物丝裂霉素或/和吉西他滨。
6.一种检测miR-411表达的试剂，其特征在于：所述检测miR-411表达的试剂包含基于荧光定量PCR定量检测方法的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于：所述基于荧光定量PCR定量检测方法的试剂包含特异性引物与通用引物，特异性引物序列为
5’-TAGTAGACCGTATAGCGTACG-3’。
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