CN109055551B - miR-3687作为治疗膀胱癌的靶标的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微小核苷酸miR‑3687的应用，具体是指抑制miR‑3687作为治疗膀胱癌新型靶标分子的应用。本发明公开了miR‑3687作为治疗膀胱癌的靶标的应用；抑制miR‑3687，能在体外抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长、并在体内抑制裸鼠皮下肿瘤的形成；抑制miR‑3687，能在体外抑制膀胱癌细胞迁移浸润、并在体内抑制裸鼠肺转移灶的形成。

Description

miR-3687作为治疗膀胱癌的靶标的应用

技术领域

本发明涉及一种微小核苷酸miR-3687的应用，具体是指抑制miR-3687作为治疗膀胱癌新型靶标分子的应用。

背景技术

膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，居我国泌尿系统恶性肿瘤首位，且临床调查分析发现过去几十年，我国膀胱癌的发病率、复发率呈现稳定上升趋势。根据病理分型可将膀胱癌分为两类：非肌肉浸润性和肌肉浸润性。非肌肉浸润性复发的膀胱癌15％-20％会发展成肌肉浸润性膀胱癌。并且膀胱癌患者术后生存率低，伴有区域或远处转移的患者，其5年生存率仅为45％。目前临床针对膀胱癌治疗缺乏有效手段，膀胱根治性切除或电切术后膀胱灌注给患者带来了巨大痛苦，同时术后巨额医药费用给家庭带来沉重负担。新靶向药物的研发及新预防措施的应用是公认遏制这一态势的主要途径，这使得相应新分子靶标鉴定成为膀胱癌防治研究中的热点。因此，筛选出治疗膀胱癌的新靶标分子已经对于膀胱癌的治疗至关重要。

微小RNA(microRNA)是一类内源基因编码高度保守大小约19～25个核苷酸的非编码小分子单链RNA，其普遍存在于各种生物的细胞中，位于编码蛋白基因(70％)的内含子或外显子中或基因间隔区(30％)。大多数内含子和外显子microRNA来源于他们的宿主基因，暗示他们同宿主转录子共同转录，其他作为独立转录单元在基因间隔区域转录。microRNA与靶mRNA的3'UTR结合，可导致microRNA抑制靶基因的蛋白质翻译或促进靶基因mRNA的降解。microRNA的调控作用构成了复杂的调控网络，既可以通过一个microRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个microRNA的组合来精细调控某个基因的表达。从而参与多种生命过程，包括细胞生长，增殖，转移和凋亡等。因此，可以认为microRNA与肿瘤的发生发展密切相关。研究发现microRNA在人体组织中的表达具有特异性，为microRNA作为不同实体瘤特异性标志分子提供依据。近年来研究报道多种microRNA在膀胱癌中异常表达，然而部分microRNA仍未在膀胱癌中报道，因此探索该部分microRNA同时找到调控膀胱癌发展进程中新的标记物并对其功能开展研究对该疾病的临床防治具有重要意义。

膀胱癌是一种发生在膀胱上皮的泌尿系统恶性肿瘤，多由吸烟及环境致癌物引起，目前尚未发现有效的治疗靶点，而microRNA具有成为潜在的膀胱癌治疗靶点的价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供miR-3687可作为治疗膀胱癌新靶标的应用，miR-3687在抑制膀胱癌细胞增殖转移方面的应用，为临床上膀胱癌的早期诊断、靶向microRNA治疗膀胱癌药物的研发提供理论依据。

为了解决上述技术问题，本发明提供miR-3687作为治疗膀胱癌的靶标的应用。

作为本发明的miR-3687作为治疗膀胱癌的靶标的应用的改进：抑制膀胱癌增殖或转移。

作为本发明的miR-3687作为治疗膀胱癌的靶标的应用的进一步改进：抑制miR-3687，能在体外抑制(显著抑制)膀胱癌细胞锚定非依赖性生长、并在体内抑制(显著抑制)裸鼠皮下肿瘤的形成。

作为本发明的miR-3687作为治疗膀胱癌的靶标的应用的进一步改进：抑制miR-3687，能在体外抑制(显著抑制)膀胱癌细胞迁移浸润能力、并在体内抑制(显著抑制)裸鼠肺转移灶的形成。

本发明通过生物信息学分析TCGA数据库中的膀胱癌数据，筛查到miR-3687在配对病人中表达上调，进一步采用实时荧光定量PCR技术在人膀胱癌组织与癌旁组织中检测到miR-3687表达上调，与TCGA数据库筛选结果一致。

进一步抑制miR-3687在体外显著抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长能力及迁移能力，在体内显著抑制裸鼠皮下异位移植瘤形成及裸鼠肺转移灶形成。裸鼠异位移植瘤模型构建应用的膀胱癌细胞为T24，UMUC3细胞，裸鼠肺转移模型应用的膀胱癌细胞为T24T细胞。

本发明利用TCGA数据库以及实时荧光定量PCR技术等技术检测miR-3687表达在膀胱癌中呈显著高表达趋势；进一步应用膀胱癌T24，UMUC3细胞构建裸鼠皮下异位移植瘤模型以及T24T细胞构建裸鼠肺转移模型，抑制miR-3687可在体内外抑制膀胱癌细胞增殖及转移能力。本发明为膀胱癌的治疗提供了新的靶标分子，也有助于推动抗膀胱癌新药研发等方面的应用基础研究。

为了探究膀胱癌治疗的新靶标，本发明首次发现miR-3687在膀胱癌中高表达，并且抑制其表达明显抑制膀胱癌细胞的增殖及侵袭能力。鉴于miR-3687在膀胱癌增殖转移中的重要调控功能，本发明对于膀胱癌的治疗具有重大意义。尽管有研究表明miR-3687在长春新碱耐药结肠癌细胞中表达明显高于正常非耐药结肠癌细胞，可能在结肠癌细胞对长春新碱化疗耐药中起关键作用，但这一发现并不能启示本发明miR-3687在膀胱癌中的作用及对增殖转移的抑制作用。理由如下，例如：miR-92a在结肠癌中高表达且与其复发转移相关，其在膀胱癌中的表达却呈显著下调趋势；miR-100在结肠癌及膀胱癌中表达一致均呈下调趋势，然而其却抑制膀胱癌细胞的增殖侵袭迁移能力，因此已有miR-3687在结肠癌的研究只能为结肠癌术后化疗耐药的靶向治疗提供一定依据，但不能提供其作为膀胱癌肿瘤标志物的诊断治疗及临床应用的技术启示。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1A为生物信息学分析TCGA数据库中miR-3687在膀胱癌的表达情况，结果显示miR-3687在膀胱癌组织呈上调趋势。图1B为miR-3687在临床膀胱癌组织样本中miR-3687表达显著上调的实时荧光定量PCR验证图，Normal为正常癌旁组织，Tumor为膀胱肿瘤组织。

图2A为miR-3687在人膀胱癌细胞中表达显著下调的荧光定量PCR图，图2B-2D分别为选定UMUC3-miR-3687i、T24-miR-3687i、T24T-miR-3687i及其空载稳定抑制miR-3687表达的柱状图，p<0.01。

图3A为采用软琼脂集落形成实验，将UMUC3-miR-3687i、T24-miR-3687i以及对照细胞种于软琼脂中，细胞生长10天后的代表性图像；图3B为显微镜下计数软琼脂集落形成实验中超过32个细胞的克隆数统计图。该数据证实抑制miR-3687的表达可抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长，p<0.01。

图4A-B分别为抑制miR-3687表达抑制膀胱癌细胞UMUC3、T24增殖能力的示意图。利用ATP生物荧光检测法证实抑制miR-3687表达后膀胱癌细胞的增殖能力明显低于对照组细胞，p<0.01。

图5A、D为稳定抑制miR-3687的表达显著抑制裸鼠皮下异位移植瘤形成的图片。将稳定转染细胞UMUC3-miR-3687i、T24-miR-3687i以及对照细胞各2.5×10 ⁶细胞悬浮于100μL PBS中，皮下注射于4周龄无胸腺裸鼠的右上背腹区域，共四组，每组六只。具体而言，图5A为UMUC3-miR-3687i以及对照细胞各2.5×10 ⁶个细胞皮下注射细胞后35天时裸鼠活体图片；图5D为T24-miR-3687i以及对照细胞各2.5×10 ⁶个细胞皮下注射细胞后35天时裸鼠活体图片。图5B、E在细胞注射后35天处死裸鼠，取出肿瘤拍照并称重。具体而言，图5B为UMUC3-miR-3687i以及对照组在细胞注射后35天处死裸鼠，取其右背部肿瘤所拍照片；图5E为T24-miR-3687i以及对照组在细胞注射后35天处死裸鼠，取其右背部肿瘤所拍照片。柱形图表示每组6只裸鼠肿瘤重量的平均值±标准差(图5C、F)，p<0.01。具体而言，图5C为UMUC3-miR-3687i以及对照组每组6只裸鼠肿瘤重量统计图；图5F为T24-miR-3687i以及对照组每组6只裸鼠肿瘤重量统计图。

图6A、6B为抑制miR-3687对膀胱癌细胞周期影响的流式细胞仪检测图谱。通过流式细胞术证实miR-3687可诱导膀胱癌细胞G0/G1期过渡，从而促进膀胱癌细胞的增殖能力。具体而言，图6A为抑制miR-3687表达诱导UMUC3细胞周期G0/G1期阻滞；图6B为抑miR-3687表达诱导T24细胞周期G0/G1期阻滞。

图7A-F为Transwell小室实验验证miR-3687对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响。经固定和染色后拍照，统计迁移和侵袭细胞数目，并与对照组进行平均值±标准差统计分析，结果表明抑制miR-3687表达抑制了膀胱癌细胞迁移和浸润能力。具体而言，图7A为10倍显微镜下拍摄，抑制miR-3687抑制UMUC3细胞的转移及浸润小室图片，图7B为抑制miR-3687抑制UMUC3细胞的转移的统计图，图7C为抑制miR-3687抑制UMUC3细胞的浸润的统计图，图7D为10倍显微镜下拍摄，抑制miR-3687抑制T24细胞的转移及浸润小室图片，图7E为抑制miR-3687抑制T24细胞的转移的统计图，图7F为抑制miR-3687抑制T24细胞的浸润的统计图。

图8为构建膀胱癌细胞肺转移动物模型验证抑制miR-3687在体内具有抑制膀胱癌细胞迁移和侵袭作用示意图。我们将T24T-miR-3687i及其对照T24T-Vector计数2.5×10⁶细胞重悬于100μL PBS中，经尾静脉注射至裸鼠体内，注射六周时处死裸鼠取其肺组织经苦味酸固定24小时后，体式显微镜拍摄图像记录肺组织转移灶情况(图8A)。同时，肺组织进行石蜡包埋HE染色检测裸鼠肺组织转移灶的形成情况(图8B)。

图9A为裸鼠肺部肿瘤转移灶数量表格统计，图9B为提取裸鼠肺部组织匀浆后通过荧光定量PCR检测鼠肺组织(1μg)中人基因组DNA的含量(ng)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、生物信息学分析miR-3687在TCGA数据库中表达上调：

生物信息学下载分析TCGA数据库中的RNA-seq V2和microRNA-seq的level 3数据。集合样本的barcode信息，选取Primary solid Tumor(sampe ID以01结尾)和SolidTissue Normal(samples ID以11结尾)的样本作分析，共19个病例，38个样本。用R包分析肿瘤(tumor)和癌旁(normal)配对的样本中microRNA差异表达量，该包采取的是对数表达比率的加权截断均值(trimmed mean of M values，TMM)归一化方法。为降低假阳性(falsediscover rate,fdr),p-value用Benjamini–Hochberg(BH)方法校正。差异显著性的筛选阈值为log2fold-change(logFC)不小于3，fdr<0.01，其中miR-3687在膀胱癌中显著升高。于是进一步分析miR-3687在每一对癌症和癌旁样本中的变化，结果如图1A所示，19例病人中，18例表达量均呈现升高趋势，仅有1例表达量稍有降低。

实施例2、临床膀胱癌配对样本和人膀胱癌细胞系中miR-3687的表达水平检测：

1)组织样本

收集于温州医科大学第二附属医院泌尿外科行膀胱全切术的19例患者的组织标本。本研究中所用的膀胱癌临床样本多数为男性患者且行膀胱全切术，组织经病理诊断为膀胱尿路上皮癌。每例标本均采集肿瘤组织，同时距肿瘤周围约3cm处切取癌旁正常组织作为对照，每份样本在组织离体后冻存于液氮灌中。所有患者资料均包含姓名、性别、年龄、病理诊断等信息。

2)组织/细胞总RNA提取

使用美国Qiagen公司所购miRNeasy Mini Kit提取，依据其说明书提取步骤如下：

(1)从-80℃冰箱中取出收集的膀胱癌组织样本，剪取30-50μg样本加入去酶EP管中，置冰上；细胞约2x10⁶个以内。加入700μl的Qiazol后组织匀浆器匀浆组织以尽量研磨完全；加入700μl的Qiazol吹打细胞直至完全溶解。

(2)涡旋振荡器震荡后，平衡室温5-10min。

(3)加入140μl氯仿(chloroform)，剧烈震荡1min，室温静置2-3min。

(4)样品12000g 4℃离心15min，离心后吸取上清至新的去酶EP管。

(5)加入1.5倍体积100％乙醇(通常是500微升)，上下颠倒混匀数次。

(6)将RNeasy Mini spin column置于2ml离心管中，吸取700μl混合样本至离心柱中，室温离心30s，速度12000rpm，弃去滤液。

(7)重复步骤(6)步骤，直至样本全部过柱。

(8)向离心柱中加入700μl Buffer RWT，转速12000rpm，室温离心30s，弃去滤液。

(9)向离心柱中500μl Buffer RPE，转速12000g，室温离心30s，弃去滤液；

(10)再次向离心柱中加入500μl Buffer RPE入柱，12000g转速离心1min,再以10000rpm离心1min，以此更能有效富集RNA，弃去滤液。

(11)将RNeasy Mini spin column置于新的2ml离心管，空柱12000g室温离心2min纯化RNA。

(12)将离心柱置于新的1.5ml去酶EP管中，加入Rnase-free water 20μl(直接加在膜上)，静置5min溶解RNA，12000rpm，室温离心1min，以便RNA收集。

(13)吸取滤液至离心柱膜上，重复(12)步骤。

(14)使用Nanodrop测定浓度，封口膜密封后保存于-80℃，或者直接逆转录后进行荧光定量实验。

3)microRNA逆转录

所需组织，细胞按照上述方法提取总RNA后，应用逆转录试剂盒进行逆转录，步骤如下：配制RT反应体系如下，冰上操作。

将上述体系振荡混匀后点离，放入PCR仪中设置程序如下：37℃70min→95℃5min。逆转录microRNA，反应结束后样品置冰上2min，用封口膜密封后至-80℃保存或用于荧光定量实验。

4)荧光定量PCR检测microRNA的表达

将所需组织、细胞获得cDNA后，使用美国Qiagen公司所购miScript SYBR GreenPCR Kit进行PCR，配制PCR反应体系如下：

充分混匀以上反应体系，然后加入至384孔板中，每个样本设置3个复孔，短暂离心后将384孔板，置于Q6荧光定量PCR仪中检测。Q-PCR反应，预变性95℃，15min后循环条件如下，扩增40个循环，95℃变性，15秒，55℃退火，30秒，72℃延伸，30秒。主要引物序列如前文所示，U6作为内参对照，从Qiagen公司购买。

主要引物序列如下：

mmu/hsa-miR-3687 5’-CCCGGACAGGCGTTCGTGC-3’

所得结果如图1B所示，miR-3687在膀胱癌组织中高表达。

实施例3、抑制miR-3687抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长和细胞增殖能力

1)构建稳转细胞株

我们对比发现相对于人永生化膀胱上皮细胞系UROtsa，多种膀胱癌细胞系中miR-3687的表达呈现显著上调趋势(图2A)，因此选用表达相对较高的UMUC3、T24、T24T细胞作为研究对象，自上海和元生物技术股份有限公司购买PLKD-CMV-eGFP-U6-shmiR-3687质粒，通过polyjet脂质体转染方法转染至细胞中，应用嘌呤霉素筛选3周后获得稳定抑制miR-3687的UMUC3-miR-3687i T24miR-3687i、T24T-miR-3687i细胞。以U6作为内参，采用2-△△ct相对定量计算miR-3687在稳定转染细胞中基因表达的倍数变化。结果如图2B，2C和2D显示，稳定抑制miR-3687的UMUC3、T24、T24T细胞构建成功；柱形图显示来自三个独立实验的平均值±标准差，差异具有统计学意义。

2)软琼脂集落形成实验

UMUC3-miR-3687i、T24miR-3687i及其对照细胞UMUC3-Vector、T24-Vector进行软琼脂实验，10天左右拍摄特征性图片(图3A)；同时显微镜下观察并计数软琼脂集落形成超过32个细胞的克隆数(图3B)。以上数据表明miR-3687可显著促进膀胱癌细胞锚定非依赖性生长能力。

3)ATP细胞增殖实验

进一步通过ATP生物荧光检测法检测miR-3687对人膀胱癌T24，UMUC3细胞增殖的影响。将T24-miR-3687，UMUC3-miR-3687以及对照细胞接种于96孔培养板(接种后置于37度细胞培养箱中培养6h后更换0.1％培养基，饥饿12h后更换完全培养基继续培养)，待1天，3天，5天后分别提取ATP，仪器检测Luminescence。经公式计算后，结果如图4A、B所示，进一步证明抑制miR-3687的表达明显抑制UMUC3及T24膀胱癌细胞增殖，并且第五天抑制情况更显著。

实施例4、抑制miR-3687表达抑制裸鼠异位移植模型中肿瘤的生长

裸鼠皮下成瘤实验

1)动物饲养

购买BALB/C-nu裸鼠，3-4周龄，适应性饲养1周。所有动物实验均依据温州医科大学伦理委员会相关规定执行。

2)细胞皮下接种

UMUC3-miR-3687i、T24-miR-3687i及其对照细胞(vector)按照细胞数2.5×10⁶/只悬浮于100μL PBS中，皮下注射于裸鼠的右背部。裸鼠注射部位用75％酒精消毒。接种前充分混匀细胞，1ml无菌注射器吸取100ul细胞悬液，将细胞悬液注射于小鼠右背部皮下。在细胞注射后，常规方式饲养35天全部处死裸鼠，取出肿瘤拍照并称重。结果如图5所示稳定抑制miR-3687显著抑制裸鼠肿瘤生长。

根据图5C、图5F，可得知：miR-3687有显著促进膀胱癌细胞体内生长的能力，抑制其表达显著抑制了膀胱癌细胞的体内生长。

实施例5、抑制miR-3687表达诱导膀胱癌细胞系G0/G1细胞周期阻滞

PI染色法和流式细胞仪检测细胞周期

a.细胞种板：用0.05％胰酶消化处于对数生长期的T24-Vector，T24-miR-3687i，UMUC3-Vector，UMUC3-miR-3687i细胞，制成单细胞悬液，计数细胞后20万个细胞/孔接种于6孔培养板。

b.细胞贴壁后用0.1％FBS完全培养基饥饿12h。

c.饥饿后用完全培养基培养24h，弃掉培养基，胰酶消化并收集细胞，PBS洗后用预冷的70％乙醇固定，4℃保存12-24h。

d.2500×g离心8min，并用PBS液洗1次。

e.加入PI染色液避光4℃保存30min后，用流式细胞仪(BD，C6，USA)检测细胞周期DNA含量。

结果如图6所示，与对照组相比，抑制miR-3687表达后诱导细胞明显阻滞在G0/G1细胞周期。该结果表明膀胱癌miR-3687表达诱导膀胱癌细胞系G0/G1期过渡促进膀胱癌细胞增殖。

实施例6、抑制miR-3687抑制膀胱癌细胞迁移和侵袭能力：

Transwell实验：

a.孵育Transwell小室：将Invasion小室从-20℃拿出来，放在24孔板中，室温静止10分钟，分别上室中加入400μL serum-free DMEM，下室加入700μL serum-free DMEM，放在37℃培养箱孵育2小时左右；另取不带胶小室同上孵育1h。

b.消化细胞：将细胞消化后，用0.1％FBS DMEM或者0.1％FBS DMEM/F-12重悬细胞，充池计数。

c.铺板：弃掉小室中的培养基，上室加入400μL细胞悬液(含有3×10⁴个细胞)，下室加入700μL 10％FBS DMEM或5％FBS DMEM/F-12培养基，静置于37℃培养箱培养24小时；

d.4％甲醛固定：弃掉上室培养基，PBS洗两遍，放置在干净的24孔板中，上室加入400μL、下室加入700μL 4％甲醛于室温下固定3分钟；

e.100％甲醇通透：固定结束后，用PBS洗两遍，将小室置于干净的24孔板中，上室加入400μL 100％、下室加入700μL100％甲醇于室温下通透20分钟；

f.吉姆萨染色：PBS洗两遍，将小室放置在干净的24孔板中，上室加入400μL吉姆萨染液，下室加入700μL吉姆萨染液于室温下避光染色15分钟；

g.染色结束后，将小室用PBS洗涤两遍，然后用棉签蘸取PBS擦干净小室底部；

h.采集代表性图像，并统计穿过的细胞数目，进行统计学分析。

结果如图7所示(图片已被进行灰度处理)，抑制miR-3687的表达可明显抑制细胞的迁移及浸润能力。

实施例7

1)肺转移裸鼠模型构建：

将2.5×10⁶个T24T人膀胱癌细胞重悬于100μLPBS中，经尾静脉注射至裸鼠肺部，注射6w时处死10只裸鼠用于苦味酸固定后镜下统计转移点大小并做HE染色，5只裸鼠用于人基因组DNA的检测。

2)基因组DNA的检测：

a.肺组织基因组DNA的提取：取肺组织剪碎后于1.5mLEP管内，通过匀浆器将组织匀浆后用QIAGEN的基因组提取试剂盒提取基因组DNA。

b.标准曲线用已按倍数稀释的人鼠基因组混合DNA检测得到，用荧光定量PCR检测1μg肺转移模型鼠肺组织DNA中人基因组DNA的含量。

3)HE染色

1)脱蜡复水：56度烘箱中2h脱蜡，二甲苯I、II各20min后100％-30％乙醇各5min梯度复水。

2)染色：组织复水后苏木精染色大约3-4min，用流动的自来水缓慢冲洗大约6min。在此过程中，切片的颜色会逐渐变成浅蓝色。如苏木精着色过深，可使用1％盐酸乙醇分化液中进行褪色，大约需2-5s。切片依次经过50％乙醇→70％乙醇→80％乙醇各2min来进行脱水。然后用伊红复染大约15-30s。

3)脱水Ⅱ：伊红染色后将组织放入95％乙醇Ⅰ、95％乙醇Ⅱ洗掉切片上多余染料，然后切片放入100％乙醇Ⅰ、100％乙醇Ⅱ中2min。

4)透明：切片依次经过乙醇/二甲苯等量混合液1min、二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min。

5)封片镜检。

结果如图8-9所示，图片已进行灰度处理抑制miR-3687明显抑制裸鼠肺部转移灶形成。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> miR-3687作为治疗膀胱癌的靶标的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccggacagg cgttcgtgc 19

Claims (4)

1.miR-3687抑制剂在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制膀胱癌增殖和转移。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：抑制miR-3687，能在体外抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长、并在体内抑制裸鼠皮下肿瘤的形成。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：抑制miR-3687，能在体外抑制膀胱癌细胞迁移浸润、并在体内抑制裸鼠肺转移灶的形成。

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