CN109022585A - Pbld基因在制备肾透明细胞癌诊断和预测预后药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供PBLD基因在制备肾透明细胞癌诊断和预测预后药物中的应用，联合Q‑PCR和免疫组织化学的方法对肾透明细胞癌组织和癌旁组织中PBLD基因的mRNA和蛋白质进行检测，发现PBLD在肾透明细胞癌组织中显著低表达。明确PBLD作为一种新型特异的肾癌标志物可为肾癌的治疗提供新的靶点。

Description

PBLD基因在制备肾透明细胞癌诊断和预测预后药物中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及PBLD基因在肾透明细胞癌诊断和预测预后药物中的应用，及PBLD作为肾癌标志物在制备分子靶向药物中的应用。

背景技术

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)，简称肾癌，是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，为最常见的肾实质恶性肿瘤。肾癌约占所有成人恶性肿瘤的2%，在全球范围广泛存在，尤其是在发达国家中发病率高于欠发达国家。在世界范围内，每年295000余例新发诊断为肾癌，超过134000肾癌患者死亡。在美国，每年新诊断为肾癌患者达63990余人，有14400余肾癌患者死亡。在欧洲每年有84000余例新发诊断为肾癌，35000余肾癌患者死亡。在我国，不同地区，肾癌发病率及死亡率呈现地域性差异，发病率约为4.5/10万，死亡率约为1.46/10万。

肾癌早期症状不明显，常常被患者忽略，近些年来随诊影像学技术及人们对自身将康的重视，肾癌的发现主要依赖于体检发现，传统的“肾癌三联症”(血尿、腰痛、腹部包块)的出现不足20%，约有20~30%的患者就诊时就已经出现远处转移，未出现转移的肾癌患者5年生产率为70%，而出现远处转移的患者5年生产率不到10%。

临床上肾细胞癌中最常见的病理类型为肾透明细胞癌 (clear cell renal cellcarcinoma, ccRCC）（60%-85%），其他肿瘤类型如嫌色细胞癌(4%-10%)、肾乳头状细胞癌(7%-14%)、集合管癌(1%-2%)和未分化癌等。目前外科手术切除仍是局限性肾癌的首选治疗方案，主要包括根治性肾切除术和保留肾单位的肾部分切除术，后者主要适用于双侧肾癌或者孤立肾肾癌或者一些早期肾癌。肾癌患者未能手术切除者3年生产率不足5%，5年生产率在2%以下，根治手术切除后5年生产率：早期局限性肿瘤患者可达60~90%，未侵犯肾周筋膜者40~80%，超过肾周筋膜者仅2~20%。由于肾癌对放化疗不敏感，部分不能行手术治疗患者需要考虑靶向治疗。自2006年美国FDA批准索拉非尼治疗转移性肾癌以来，先后批准了一系列药物，主要分为三类：①酪氨酸酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors，TKI）类：舒尼替尼(sunitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)等；②抗血管内皮生长因子类：贝伐单抗(bevacizumab)等；③mTOR抑制剂：依维莫司(everolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)等。虽然靶向药物延长了患者的生存时间，但是其费用高以及长时间的使用导致耐药以及毒副作用等问题逐渐出现，限制了其在临床上广泛使用和有效延长患者生存时间。因此，深入的阐述肾癌发病机制、进一步寻找肾癌靶向治疗的新靶点、探索靶向药物的耐药等问题是当前肾癌研究的重点。

人类PBLD 基因全长2575bp，位于人类10号染色体上，广泛表达于脑、心脏、肺、肝、胰腺等组织中。目前，在肝癌基因表达谱的基因组学研究中发现PBLD 的表达较癌旁正常肝组织降低或者缺失。但是，PBLD 在肾透明细胞癌组织中的这种异常表达在临床预后中的意义未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供PBLD基因在肾透明细胞癌诊断和预测预后药物中的应用，及PBLD作为肾癌标志物在制备分子靶向药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

PBLD基因在制备肾透明细胞癌诊断和预测预后产品中的应用。

所述产品通过检测PBLD基因及其表达来诊断肾透明细胞癌。

所述的PBLD基因作为肾癌标志物在制备分子靶向药物中的应用。

所述的肾透明细胞癌诊断产品包括对特异性扩增PBLD基因的引物，序列如下：正向： 5’- TCGTCTGGCCCTTAGTTCTC -3’ 反向： 5’- TGGTTTACACCAGCGAGTGA -3’。

本发明的优点在于：

为肾透明细胞癌提供了新的标志物，采用PBLD特异引物，以ACTIN为内参定量PCR检测基因的mRNA水平,方法简单有效。选取染色背景值很低的抗体做PBLD蛋白质的免疫组织化学检测。两种方法结合使用更易获得可信的结果，提高检测性能，使结果更可靠。

附图说明

图1为PBLD在50对肾透明细胞癌和癌旁组织中定量PCR检测后的示意图（A）和成对t检验的图（B），其中黑色为肿瘤组织。

图2为RNA-Seq检测中PBLD在肿瘤和癌旁中的表达分析、不同病理分级组织中PBLD表达趋势以及PBLD高表达组和低表达组患者的生存分析，其中下方的曲线是PBLD低表达组。

图3为PBLD免疫组织化学染色图，其中深色是PBLD的特异性染色，其他部位浅色是苏木精-伊红染色( hematoxylin-eosin staining, HE)。

具体实施方式

实施例1

1. qRT-PCR检测50对ccRCC和相应癌旁肾组织标本中PBLD mRNA表达水平

1.1 引物设计及合成

设计PBLD特异性引物，序列如下：正向： 5’- TCGTCTGGCCCTTAGTTCTC -3’ 反向： 5’-TGGTTTACACCAGCGAGTGA -3’。

组织中RNA的提取

1）标号好EP管，从-80℃冰箱取出组织，依次加入，对应好癌旁及编号，将每号标本的癌组织和对应癌旁组织分别捣碎，加入300μlTrizo裂解液充分裂解组织后，再加入700μlTrizo裂解液，室温下孵育5min。

2）每EP管中加入氯仿（三氯甲烷）200ul，盖上EP管，用手剧烈震荡半分钟，冰上孵育10min后，4℃离心机1200rpm离心15min。

3）此时管内物质呈现分层现象，取1000ul枪头小心吸取400ul上清至新的标记好的EP管中，此过程应注意避免吸到中间层，加入1/3体积无水乙醇，混匀，涡旋15s。

4）将Omega公司的HiBind RNA柱子置于2ml收集管上，移入混合液，每次取的混合液不超过700ul，室温1000g离心1min，弃除滤出的废液。将剩余的液体再次过柱离心，弃下层管中液体。

5）将柱子置于新2ml收集管中，加入300ul RNA Wash BufferⅠ，室温1000g离心1min，弃去滤出的废液。

6）再次将柱子置于收集管中，加400ul RNA Wash BufferⅠ，静置5min，室温1000g离心1min，弃去滤出液。

7）同样将柱子置于该2ml收集管中，加入500ul RNA Wash BufferⅡ，室温1000g离心1min，弃滤出液。

8）重复上一步，然后13000g空转2min。

9）洗脱RNA。将柱子置于标记好的1.5ml EP中，加入30-50ul DEPC水溶RNA，注意淹没柱子基底，室温静置2min后13000g离心2min，将收集好的RNA放置于-80℃冰箱中保存。（注意RNA抽提过程中枪头需全部用RNA专用枪头。）

1.3 RNA的纯度和浓度的测定

取5μl的RNA溶液，加入95μlddH2O中，利用紫外分光光度计测RNA纯度和浓度。RNA纯度=OD260/OD280，认为比值在1.6-2.1之间时，表示纯度好；比值<1.6时，提示杂质较多；比值>2.2表示RNA降解较多。RNA浓度=（OD260/0.024）×20（ng/μl）。筛选出符合要求的组织总RNA。

合成

1）在RNA专用EP管中按照下表中逆转录体系依次加入5×buffer、10×mmdNTP、Oligo(dT)、RiboLock RNase inhibitor(RI）、RevertAid Reverse Transcriptase (RT)，充分混匀；

2）按照上述体系配置，配置总体系为20ul，混匀，标记PCR联管，置入PCR管；

3）放置入PCR仪中，扩增程序：42℃ 59min，70℃ 5min，4℃ 保存；

1.5 实时荧光定量RT-PCR反应

稀释cDNA，20 μl的cDNA加去离子水280 μl。用ABI公司的SYBRgreen荧光定量混合液做定量PCR反应。PBLD基因检测采用设计并合成的PBLD的引物。反应以β-actin为内参基因，β-actin的引物：正向5‘-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’，反向5‘- AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’。

定量PCR体系的总体积是10μl（三复孔），各成分体积如下：

将混合液分装到384孔板的孔中，离心；在ABI7900定量PCR仪上扩增检测。

实时定量RT-PCR 的扩增程序

第一步：预变性95℃ 10min；

第二步：扩增（均设定为40个循环）变性95℃ 15S ; 退火延伸60℃ 1min；

第三步：制备溶解曲线:95℃ 15s; 60℃15s; 95℃ 15s。

结果判定

标准曲线符合标准，溶解曲线呈现单峰，说明PCR产物单一，具有特异性，提取RNA较纯，扩增曲线均达到平台期，表示各样品扩增完全。利用β-actin 作为内参，运用公式2−ΔΔCt 计算目的基因的相对表达量。实验每组设置3个复孔。

结果: PBLD mRNA在肾透明细胞癌组织中较正常肾组织中表达下调

在qRT-PCR实验中，以2ΔCT值来分别表示PBLD mRNA在肿瘤及癌旁正常肾组织中表达水平，采用配对t检验，分析PBLD mRNA在肾透明细胞癌和相应癌旁正常肾组织中表达差异，PBLD mRNA在肾透明细胞癌中较癌旁正常肾组织低表达，p<0.001，差异具有统计学意义。见图1。

对PBLD在TCGA数据库中做表达分析和预后分析，PBLD在肾透明细胞癌中表达明显降低，随肿瘤分级增加表达呈递减趋势，且与病人预后密切相关(图2)。

免疫组化实验检测ccRCC和相应癌旁正常组织中PBLD蛋白表达水平

1）实验准备：将术后标本（包括肾透明细胞癌和癌旁组织）经福尔马林固定，脱水，常规石蜡包埋，经病理科医师连续切片，切片厚度约4-5um。组织芯片购自上海芯超生物科技公司Hkid-CRC060CS-01芯片。

2）烤片：将烤箱温度调至70℃，放入组织切片，烤片45min。

3）脱蜡并水化组织切片：将二甲苯（A）、二甲苯（B）、二甲苯（C）、无水乙醇（D）、95%乙醇（E）、80%乙醇（F）、60%乙醇（G）按A到G顺序放置好，将已烤好的切片于载片架上，依次浸没上述液体中，其中二甲苯每次浸泡5分钟，乙醇每次3分钟，浸泡完经PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。

4）分化及抗原修复：取出玻片架，放入200ml的5%醋酸浸泡20分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟，回收5%醋酸，现配的0.01mol/L柠檬酸缓冲液，PH调为6.0，浸没切片，放入高压锅煮30min。

5）冷却：取出抗原修复盒于室温下冷却，然后回收抗原修复液，待恢复至室温，PBS洗涤3次，每次3分钟。

6）免疫组化PEN笔画圈：取出玻片，轻微甩干表面水分，注意区分正反面，用干净滤纸吸干背面及玻片边缘水分，注意避免接触组织，用PEN笔围绕组织边缘（距组织约2mm）一圈，尽量画明显一点。

7）双氧水孵育：每张切片圈内滴加3%H₂O₂去离子水，湿盒内室温下孵育20min，以去除内源性过氧化物酶活性；小心甩干表面水分，PBS洗3次，每次3min。

8）封闭：轻轻甩干玻片，圈内滴加150μl二抗来源羊血清，倾斜分布均匀后室温封闭1小时。

9）结合一抗：弃封闭液，滤纸擦干边缘，再次用PEN笔画圈，平放于湿盒中，每张滴加150μl一抗（PBLD抗体, Pierce，PA5-58219, 用PBS 1:400稀释），涂布均匀后盖上湿盒，置于4℃冰箱孵育过夜（12小时）。

10）复温：取出湿盒，使其恢复室温，PBS洗3次，每次3min。

11）滴加增强剂：轻微甩干，边缘滤纸擦干，每张切片滴加2滴或100μl聚合物增强剂，涂布均匀，室温孵育20min；PBS洗3次，每次3min。

12）结合二抗：用滤纸把边缘擦干，每张切片滴加100μl第二抗体-酶标抗鼠/兔聚合物，涂布均匀，室温孵育20min。

13）DAB显色：PBS洗3次，每次3min，在普通光学显微镜下迅速滴50-100ul新鲜配制的DAB工作液（1ml的试剂2+1滴的试剂1，避光保存），显微镜下观察组织颜色变化控制反应时间5min，当细胞明显着色而背景尚未着色时放入流动蒸馏水中停止染色。

14）复染、脱水、透明、封片：用PBS缓冲液缓慢冲洗3次，每次持续3min，用蒸馏水冲洗5min；进行苏木素染色，滴加苏木素后30s-1min后用自来水冲洗5min，再将玻片放入PBS缓冲液中返蓝5min。按照G到A顺序，依次浸泡玻片，将其在乙醇中每次浸泡5分钟，二甲苯中留置10min，晾干后中性树胶封片，室温晾干，待树脂凝固后在显微镜下进行观察。整张片子扫描，保存结果。

15）结果判读：所有通过免疫组化实验芯片由病理科两位副高级病理科医师分别独立进行评分，评分细则：对免疫组化染色强度分为0分：无表达；1分：弱；2分：中等；3分：强。分别计算芯片每个点的分值，其中≥2分为高表达，<2分为低表达。

结果：PBLD蛋白在肾透明细胞癌组织中较癌旁正常肾组织中表达下调

通过29对（芯片原有30对，有一对样本脱离）肾透明细胞癌及对应的癌旁正常肾组织的组织芯片应用免疫组化实验结果分析，结果示28例PBLD蛋白在在肾透明细胞癌组织中的低表达。通过卡方检验，分析得出PBLD蛋白在肾透明细胞癌组织中较正常组织低表达， p<0.001差异具有统计学意义，如图3所示。

以定量PCR检测的50对样本为例，我们随机选取了6个患者的病理石蜡切片做PBLD的免疫组化检测，其中四个患者的肿瘤组织中PBLD蛋白质着色不明显，2个患者的肿瘤组织中有着色但比其癌旁对照组织着色程度浅，且样本PBLD的蛋白质表达水平与定量PCR检测结果正相关。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 路君

<120> PBLD基因在制备肾透明细胞癌诊断和预测预后药物中的应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgtctggcc cttagttctc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggtttacac cagcgagtga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agagctacga gctgcctgac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcactgtgt tggcgtacag 20

Claims (4)

1.PBLD基因在制备肾透明细胞癌诊断和预测预后产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品通过检测PBLD基因及其表达来诊断肾透明细胞癌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的PBLD基因作为肾癌标志物在制备分子靶向药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肾透明细胞癌诊断产品包括对特异性扩增PBLD基因的引物，序列如下：正向： 5’- TCGTCTGGCCCTTAGTTCTC -3’ 反向： 5’-TGGTTTACACCAGCGAGTGA -3’。