WO2011001906A1 - 培養細胞の評価方法およびバイオマーカーのスクリーニング方法 - Google Patents

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cell
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佳之 堀田
和也 小見
麻子 岡
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating cultured cells and a method for screening biomarkers using nucleic acids such as microRNA (miRNA) released from cultured cells into the culture solution.
  • nucleic acids such as microRNA (miRNA) released from cultured cells into the culture solution.
  • Cultured cells are evaluated by methods such as immunostaining of cultured cells and analysis of proteins and genes expressed in the cells. For example, embryonic stem cells are evaluated by immunostaining targeting OCT4, NANOG, etc., and cells induced to differentiate from embryonic stem cells are evaluated based on a decrease in OCT4, NANOG gene expression or an increase in tissue-specific genes. ing.
  • the cultured cells In the evaluation method using cells such as immunostaining method and gene expression level, the cultured cells must be fixed and lysed. Therefore, in order to evaluate changes over time, culture under the same conditions A large amount of cells must be prepared. And there is a problem that the cells cultured over time must be consumed.
  • RNA precursor microRNA
  • RNA-degrading enzyme RNA-degrading enzyme to become single-stranded RNA of 17 to 24 bases.
  • This miRNA has a function of inhibiting the translation of messenger RNA having a base sequence complementary to itself, and differentiation from stem cells to tissue cells (Non-patent Document 1) and determination of each tissue cancer cell ( In Patent Document 1), it is reported that it plays an important role.
  • this miRNA exists in blood (Non-patent Document 2), and it has been noted that it may be used for diagnosis / prognosis prediction for diseases such as cancer.
  • a medium supplemented with serum is generally used from the viewpoint of increasing the culture efficiency. Since it is difficult to discriminate between added serum-derived nucleic acid and nucleic acid released from cultured cells, no method for evaluating cells with nucleic acid released from cultured cells or a method for screening biomarkers has been reported so far.
  • an object of the present invention is to provide a novel means capable of evaluating cultured cells and screening biomarkers without consuming cultured cells.
  • nucleic acids such as miRNA are released from the cultured cells into the culture solution, and further, stem cells, differentiated tissue cells, drug treatment, progression of malignancy of cancer cells, etc. It was found that the amount and type of nucleic acid such as miRNA released into the culture medium differ depending on the situation.
  • the inventors have found that the state of cells can be evaluated by using a nucleic acid such as miRNA as an indicator, and the present invention has been completed.
  • biomarker screening can be performed by measuring nucleic acids such as miRNA in a serum-free medium, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a method for evaluating cultured cells, comprising culturing cells in a serum-free medium and measuring at least one kind of nucleic acid released from the cells into the culture medium. Since the present method cultivates cells in a serum-free medium, it provides a screening method capable of easily finding nucleic acid candidates for biomarkers such as stem cells and cancer cells.
  • the present invention provides the following inventions.
  • a method for evaluating cultured cells comprising culturing cells in a serum-free medium and measuring at least one nucleic acid released from the cells into the culture medium.
  • the nucleic acid is microRNA.
  • the method according to (2), wherein at least one kind of microRNA having a base sequence represented by SEQ ID Nos. 1, 3 to 5, 7 to 19, 41 to 44 in the sequence listing is measured.
  • (4) The method according to (3), wherein at least one kind of microRNA comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3 to 5, and 7 to 19 in the sequence listing is measured.
  • the cell is a mammal-derived cell
  • the serum-free medium is a medium containing a ligand for an endothelial cell differentiation gene (Edg) family receptor and a ligand for a serotonin receptor (1) to (4) The method according to any one of the above.
  • the ligand for the endothelial cell differentiation gene family receptor is selected from the group consisting of lysophosphatidic acid (LPA) and salts thereof, sphingosine monophosphate (S1P) and an agonist of the endothelial cell differentiation gene (Edg) family receptor.
  • LPA lysophosphatidic acid
  • S1P sphingosine monophosphate
  • Edg endothelial cell differentiation gene
  • the ligand for the serotonin receptor is at least one selected from the group consisting of serotonin, a salt thereof, and an agonist of the serotonin receptor.
  • the method according to (8), wherein the differentiation of stem cells is evaluated using at least one microRNA comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 41 to 44 as an index.
  • the method according to (9), wherein the differentiation into bone cells is evaluated using the microRNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 44 as an index.
  • a novel cell evaluation method and biomarker screening method using a nucleic acid released into a culture solution as an index are provided.
  • the method of the present invention since it is not necessary to consume cells only for evaluation, it is not necessary to separately prepare cultured cells for evaluation, and labor and cost can be greatly reduced. Another significant advantage is that precious cell samples are not consumed.
  • the cell itself actually used can be directly evaluated, it is extremely useful for cell evaluation in fields such as regenerative medicine. It is also useful for easily screening biomarkers.
  • Example 1 it is the result of having investigated the pattern of the amount of miRNA in a culture solution at the time of differentiation-inducing a bone cell or an adipocyte from a mesenchymal stem cell.
  • Example 2 it is the result of having investigated the pattern of the amount of miRNA in a culture solution at the time of giving a cell injury by treating the cultured cell derived from human liver cancer with carbon tetrachloride.
  • FIG. 5 shows the results of examining patterns with relative expression levels obtained by correcting the amount of miRNA in the culture solution of human colon cancer-derived cell line SW480 and its lymph node metastasis cell line SW620 with the amount of hsa-miR-16 in Example 3.
  • Example 4 it is the result of having investigated the pattern of the miRNA amount in a culture solution at the time of differentiation-inducing a bone cell or an adipocyte from a human bone marrow origin mesenchymal stem cell.
  • the evaluation of a cell is to evaluate the state of the cell, including cell differentiation, chemical / biological substances (for example, nucleic acids, proteins and fragments thereof, carbohydrates, lipids, vitamins, etc.) / Environment. Effects, effects, and toxicity due to stimulation (eg, temperature decrease or increase, humidity decrease or increase, pressure decrease or increase, oxygen concentration decrease or increase, CO 2 concentration decrease or increase, ultraviolet irradiation, radiation irradiation, etc.)
  • the evaluation of various conditions such as the presence or absence of cancer cells, the malignancy of cancer cells, and the like is included.
  • the biomarker is a substance derived from a living body (for example, a nucleic acid, a protein and a fragment thereof, a carbohydrate, a lipid, an index for qualitatively or quantitatively grasping a state change of a cell, tissue, living body, etc. Vitamins).
  • the nucleic acid to be measured by the method of the present invention may be any kind as long as it is released from the cultured cells into the culture solution, and may be DNA or RNA, but is preferably microRNA (miRNA). is there.
  • miRNA is a single-stranded RNA in which RNA of about 60 to 100 bases transcribed from a gene encoding miRNA and folded into a hairpin type is decomposed to about 17 to 24 bases by RNase. It has a function of inhibiting the translation of messenger RNA having a base sequence complementary to itself.
  • the gene encoding miRNA is known, and various miRNAs are also known.
  • miRNAs to be measured include miRNAs consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3 to 5, and 7 to 19 in the sequence listing. In any of the following examples, it has been specifically confirmed that the abundance in the medium changes depending on cell differentiation, cell damage, presence or absence of cancer cells, progression of malignancy of cancer cells, etc. Is. However, the nucleic acid to be measured is not limited to these miRNAs.
  • miRNAs comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 41 to 44 (hsa-miR-145, hsa-miR-130a, hsa-miR-143, hsa-miR- 214, hsa-miR-365) can be used as an indicator of cell differentiation.
  • the miRNAs of SEQ ID NOs: 1 and 44 are used as indicators of differentiation from stem cells to bone cells, and the miRNAs of SEQ ID NO: 41 (hsa-miR-130a) Can be used as indicators of differentiation into adipocytes, respectively.
  • the miRNA (hsa-miR-143) of SEQ ID NO: 42 is often measured when differentiated into either bone cells or adipocytes, it can be used as an index of differentiation into tissue cells such as bone cells and adipocytes. it can.
  • the miRNA (hsa-miR-214) of SEQ ID NO: 43 is often measured in the culture solution of undifferentiated stem cells before differentiation induction, it can be used as an indicator of the presence or absence of stem cell differentiation.
  • MiRNAs (hsa-miR-16, hsa-miR-21, hsa-miR-122) consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 5 are more specific because of cytotoxicity such as cytotoxicity caused by chemical substances. Can be used as an indicator of hepatocellular injury due to drug treatment.
  • MiRNAs consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 to 19 (hsa-miR-20a, hsa-miR-892a, hsa-miR-22 *, hsa-miR-19a, hsa-miR-484, hsa-miR-638 , Hsa-miR-125b, hsa-miR-339-5p, hsa-miR-532-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-138, hsa-miR-186, hsa-miR-223) It can be used as an index of malignancy of cancer, more specifically malignancy of colorectal cancer.
  • miRNAs comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7, 10 to 15 (hsa-miR-20a, hsa-miR-19a, hsa-miR-484, hsa-miR-638, hsa- miR-125b, hsa-miR-339-5p, hsa-miR-532-3p) are commonly detected in the culture medium regardless of the malignancy of the cancer and can be used as an indicator of the presence or absence of cancer cells it can.
  • MiRNAs (hsa-miR-892a, hsa-miR-22 *) consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 were specifically detected in the cell line culture medium derived from the primary site.
  • MiRNAs (hsa-miR-142-3p, hsa-miR-138, hsa-miR-186, hsa-miR-223) consisting of the nucleotide sequences shown in the cell line cultures derived from higher-grade metastases It is detected specifically.
  • the type of nucleic acid to be measured can be appropriately selected according to the evaluation purpose. For example, if you want to evaluate the differentiation of stem cells into bone cells, combine with hsa-miR-145 and hsa-miR-365, which are indicators of differentiation into bone cells, and hsa-miR, which is an indicator of undifferentiated cells. -214 and hsa-miR-143 which is an index of differentiation into tissue cells may be measured.
  • the cell cultured in the present invention is not particularly limited as long as it can be cultured under in vitro culture conditions, but is preferably a mammal-derived cell.
  • cells that form tissues extracted from mammals are also included as long as they can be cultured under in vitro conditions.
  • Mammalian cells that can be cultured in vitro include stem cells (embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, skin stem cells, etc.), tissue precursor cells and tissue cells (bone cells, Osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, skin cells, nerve cells, muscle cells, blood cells, fibroblasts, liver cells, etc.), cancer cells and cancer-derived cell lines (HepG2, HuH-7, SW480, SW620, Caco-2, CH-4, CH-5, CoLo-205, Hc110, PMP-1, etc.), but are not limited thereto.
  • stem cells embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, skin stem cells, etc.
  • tissue precursor cells and tissue cells bone cells, Osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, skin cells, nerve cells, muscle
  • the medium used for culturing cells in the present invention may be a medium that is generally called a serum-free medium and does not contain animal serum as an additive.
  • a known basic medium having a composition containing other additives (excluding animal serum) can be used.
  • the composition of the basic medium can be appropriately selected according to the type of cells to be cultured.
  • Minimum Essential Medium such as Eagle Medium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Minimum Essential Medium ⁇ (MEM- ⁇ ), Mesenchymal Cell Basal Medium (MSCBM), Ham's F-12 and F -10 medium, DMEM / F12 medium, Williams medium E, RPMI-1640 medium, MCDB medium, 199 medium, Fisher medium, Iscove modified Dulbecco medium (IMDM), McCoy modified medium, and the like.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • MSCBM Mesenchymal Cell Basal Medium
  • Ham's F-12 and F -10 medium Ham's F-12 and F -10 medium
  • DMEM / F12 medium Williams medium E
  • RPMI-1640 medium RPMI-1640 medium
  • MCDB medium 199 medium
  • Fisher medium Iscove modified Dulbecco medium (IMDM), McCoy modified medium, and the like.
  • additives added to the basic medium include amino acids, inorganic salts, vitamins, and other additives such as carbon sources and antibiotics.
  • concentration of these additives is not particularly limited, and can be used at a concentration used in a normal medium for mammalian cells.
  • Amino acids include glycine, L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-cystine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-histidine, L-isoleucine, L- Mention may be made of leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine and L-valine.
  • inorganic salts include calcium chloride, copper sulfate, iron (III) nitrate, iron sulfate, magnesium chloride, magnesium sulfate, potassium chloride, sodium bicarbonate, sodium chloride, disodium hydrogen phosphate and sodium dihydrogen phosphate. be able to.
  • vitamin B1 As vitamins, choline, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B4, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B12, vitamin B13, vitamin B15, vitamin B17, vitamin Bh, vitamin Bt, vitamin Mention may be made of Bx, vitamin C, vitamin D, vitamin E, vitamin F, vitamin K, vitamin M and vitamin P.
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF endothelial cell growth factor
  • PDGF platelet derived growth factor
  • FGF growth factors
  • penicillin streptomycin
  • gentamicin kanamycin
  • carbon sources such as glucose, galactose, fructose and sucrose
  • magnesium iron, zinc, calcium, potassium, sodium, copper, selenium, cobalt, tin, molybdenum, nickel and silicon, etc.
  • ⁇ -glycerophosphate dexamethasone, rosiglitazone, isobutylmethylxanthine, 5-azacytidine and other stem cell differentiation inducers
  • 2-mercaptoethanol catalase, superoxide dismutase and N-acetylcysteine Antiacid such as Agents, as well as adenosine 5'-monophosphate, corticosterone, ethanolamine, insulin, reduced glutathione, lipoic acid, melatonin, hypoxanthine, phenol red, progesterone, putrescine, pyruvate, thymidine, triiodothyronine, transferrin And other additives such as lactoferrin.
  • a medium capable of effectively growing mammalian cells without serum a medium containing a ligand for endothelial cell differentiation gene (Edg) family receptor and a ligand for serotonin receptor (hereinafter, this medium is referred to as “high efficiency” for convenience).
  • Edg endothelial cell differentiation gene
  • serotonin receptor a medium containing a ligand for serotonin receptor
  • serum-free medium can be preferably used as a medium capable of effectively growing mammalian cells without serum.
  • the highly efficient serum-free medium contains a ligand for the Edg family receptor as one of the essential components.
  • the Edg family receptors are a group of G protein-coupled receptors having high homology in their gene sequences.
  • Edg-1 to Edg-8 have been identified in mammals such as humans, mice, and sheep. (Science. Vol. 294, pp. 1875-1878, 2001, and J Biol Chem. Vol. 277, No. 29, pp. 25851-25854, 2002).
  • Edg-2, Edg-4 and Edg-7 function as LPA receptors
  • Edg-1, Edg-3, Edg-5, Edg-6 and Edg-8 are known to function as S1P receptors. It has been.
  • a “ligand for a receptor” is a substance that specifically binds to the receptor, and includes not only natural ligands existing in the body, but also other natural or synthesized compounds known as agonists and antagonists. Include.
  • the ligand for the Edg family receptor includes lysophosphatidic acid (LPA) and salts thereof, sphingosine monophosphate (S1P), and an agonist of the Edg family receptor.
  • LPA lysophosphatidic acid
  • S1P sphingosine monophosphate
  • One or more compounds selected from the above are preferred.
  • An agonist of an Edg family receptor is a substance that binds to an Edg family receptor and acts similarly to LPA and S1P.
  • dihydrosphingosine monophosphate platelet activating factor (PAF), sphingosylphosphorylcholine, alkyl LPA analog, FTY720 etc. are mentioned.
  • LPA is the following general formula (I): R—O—CH 2 CH (OH) CH 2 PO 4 H 2 (I) (Wherein R is an alkyl group having 10 to 30 carbon atoms, an alkenyl group having 10 to 30 carbon atoms, or an acyl group having 10 to 30 carbon atoms) It is a compound represented by these.
  • the carbon number of the acyl group for the R group of the above formula (I) does not include the carbon number of the carbonyl group.
  • the salt of LPA a conventionally known salt can be used, and examples thereof include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, ammonium salt and the like.
  • Examples of the salt of LPA or LPA include 1-oleoyl lysophosphatidic acid sodium salt and LPA potassium salt.
  • Edg ligands can be used alone or in combination of two or more.
  • the high-efficiency serum-free medium described above further contains a ligand for serotonin receptors (hereinafter sometimes referred to as “serotonin ligand” for convenience).
  • Serotonin receptors are a type of G protein-coupled receptor mainly found in the central nervous system.
  • the serotonin ligand is preferably one or more compounds selected from serotonin, salts thereof and serotonin agonists. Serotonin is also called 5-hydroxytryptamine and is known to act as a neurotransmitter.
  • a serotonin agonist is a substance known to bind to a serotonin receptor and act similarly to serotonin.
  • PADD 1- [2- (4-aminophenyl) ethyl] -4- (3-bifluoromethylphenyl) piperazine
  • DP-5CT N-dipropyl-5-carboxyamidotryptamine
  • HT ⁇ -methyl-5-hydroxytryptamine
  • 2-methyl-5-HT etc.
  • the salt of serotonin a conventionally known salt can be used, and examples thereof include hydrochloride.
  • Serotonin ligands can be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of Edg ligand in the medium (when multiple types are included, the total concentration) is usually about 0.01 to 100 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is preferably 0.25 to 10 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is preferably 0.01 ⁇ M to 0.2 ⁇ M.
  • the concentration of serotonin ligand in the medium (the total concentration when multiple types are included) is preferably 0.1 to 100 ⁇ M, more preferably 0.25 to 20 ⁇ M.
  • the highly efficient serum-free medium further contains an antioxidant.
  • the antioxidant include at least one selected from the group consisting of N-acetylcysteine (NAC), L-cysteine, catalase, superoxide dismutase and 2-mercaptoethanol, more preferably N-acetylcysteine and There may be mentioned at least one selected from the group consisting of L-cysteine.
  • NAC N-acetylcysteine
  • L-cysteine catalase
  • superoxide dismutase and 2-mercaptoethanol more preferably N-acetylcysteine
  • 2-mercaptoethanol more preferably N-acetylcysteine
  • L-cysteine L-cysteine
  • These antioxidants are known to have an apoptosis-inhibiting action and are therefore effective for maintaining and growing cultured cells.
  • Antioxidants can be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the antioxidant in the medium is preferably 0.01 mM to 10 mM, more preferably 0.1 mM to 1 mM.
  • the high-efficiency serum-free medium preferably further contains animal serum albumin.
  • Albumin is a major component of serum, and is known to play a role such as drug transport in blood. Inclusion of animal serum albumin further promotes the growth of cultured cells.
  • animal serum albumin include human serum albumin (HSA), recombinant human serum albumin (rHSA), bovine serum albumin (BSA) and the like. These albumins can be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of albumin in the medium (the total concentration when multiple types are included) is preferably 0.0001 to 10% by weight, more preferably 0.0001 to 1% by weight.
  • the high-efficiency serum-free medium preferably further contains a growth factor.
  • a growth factor By containing a growth factor, the proliferation of cultured cells is further promoted.
  • growth factors include epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), transforming growth factor (TGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), vascular endothelial cells
  • growth factor VEGF
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • EPO erythropoietin
  • TPO thrombopoietin
  • HGF hepatocyte growth factor
  • More preferred examples include platelet derived growth factor (PDGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF). All of these growth factors are well known in the art.
  • a growth factor can also be used independently and can also be used in combination of 2 or more types.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • mesenchymal stem cells proliferate. Since it is sufficiently achieved, in the medium used for culturing mesenchymal stem cells, these two kinds of growth factors are sufficient as the growth factors contained in the medium.
  • the high-efficiency serum-free medium may further contain a ligand (PDGF) for platelet-derived growth factor receptor (PDGFR).
  • a medium for culturing mesenchymal stem cells preferably contains this.
  • PDGFR is a kind of tyrosine kinase-related receptor that is mainly present in mesenchymal cells. By containing a ligand for PDGFR, it is possible to efficiently proliferate mesenchymal stem cells.
  • PDGFR ligands include PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, and PDGF-DD, all of which are well known. PDGFR ligands can be used alone or in combination of two or more.
  • the high-efficiency serum-free medium may contain a ligand (FGF) for basic fibroblast growth factor receptor (FGFR), and in particular, when culturing mesenchymal stem cells, it is preferable to contain this.
  • FGF ligand
  • FGFR is known to exist mainly in mesenchymal cells, and by including a ligand for this, the life span of mesenchymal stem cells is improved.
  • ligands for PDGFR it is known that there are a total of 20 or more types such as basic fibroblast growth factor (bFGF) and acidic fibroblast growth factor (aFGF). Examples thereof include FGF-1 and FGF-4.
  • bFGF is known to be strongly involved in tissue formation. These are all well known.
  • the concentration of growth factor (the total concentration when multiple types are included) is preferably 0.1 to 100 ng / mL, more preferably 1 to 10 ng / mL.
  • the high-efficiency serum-free medium may further contain a surfactant. It is considered that the inclusion of a low concentration of the surfactant has an effect of reducing adverse effects on the cell membrane. On the other hand, it is known that when a high concentration surfactant is added to a medium, cell growth inhibition or cell death is induced.
  • Surfactants include polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters (trade names Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, etc.), alkylphenoxy polyethylene glycols (trade name, Triton X-100, etc.), alkyl phenyl polyethylene glycols (trade names)
  • Nonionic surfactants such as Triton® X-114 and NP-40 are preferred. Surfactants can be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the surfactant (when multiple types are included, the total concentration thereof) is usually 0.1 to 100 ng / mL, preferably 1 to 10 ng / mL.
  • a high-efficiency serum-free medium is a known mammal except that it contains one or more of the above-mentioned Edg ligand and serotonin ligand, preferably, the above-mentioned antioxidant, animal serum albumin, growth factor and surfactant. It may be the same as the cell culture medium. Therefore, basically, a highly efficient serum-free medium can be obtained by adding one or more of the above-mentioned two essential components, preferably one of the above-mentioned preferred components, to a known basic medium. Examples of known basic media are as described above.
  • Optional additives are also as described above, and may include one or more of the above-described additives.
  • a differentiation-inducing agent can be added and used as a differentiation-inducing medium.
  • a differentiation inducer is not limited to said illustration, According to the kind of cell which should be prepared by differentiation induction, it can select from a well-known differentiation inducer suitably and can be used.
  • Culture of the cultured cells of the present invention can be carried out in the same manner as before, and is usually carried out at a temperature of 30 to 37 ° C., in a 5% CO 2 environment, and in a 5 to 21% O 2 environment. .
  • the culture time required for differentiation induction is appropriately set depending on the differentiation inducer used, the type of cells, and the like, and can be appropriately selected while observing the state of the cells.
  • Extraction of nucleic acid in the culture solution can be performed using a conventional method well known in this field.
  • Various reagent kits for nucleic acid extraction from a liquid sample are commercially available and can be easily performed using them.
  • Nucleic acid measurement methods themselves are well known.
  • examples of the measurement method by nucleic acid amplification method using primers include real-time PCR and NASBA method.
  • examples of the measurement method using the probe include an array analysis method using a solid phase probe. Any known measurement method may be used in the method of the present invention.
  • the measurement method by real-time PCR as described in the following examples, after preparing a cDNA by introducing a primer site into the 3 ′ end of an RNA sample extracted from a culture solution, The presence or amount of miRNA can be measured by performing real-time PCR using specific primers.
  • a primer specific for the miRNA consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 19, for example, those consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 22 to 40 can be used.
  • Commercially available TaqMan Probe MicroRNA Assays developed by Applied Biosystems can also be used.
  • the kit is compatible with various known miRNAs, and a desired miRNA can be measured by real-time PCR.
  • “measurement” includes detection, quantification, and semi-quantification.
  • the relative amount of nucleic acid in the culture medium after the reference time is determined by relative evaluation of the amount of nucleic acid in the culture solution after the reference time, with the start time of culture being the reference time and the reference amount of nucleic acid being 1. Can be measured.
  • the time point or the amount of nucleic acid used as a reference for relative evaluation can be set as appropriate. Evaluation can be performed by correcting the amount of nucleic acid with an internal standard substance (for example, miR-16).
  • stem cells and stem cell-derived tissue cells For example, by analyzing the amount and pattern of nucleic acids released from stem cells and stem cell-derived tissue cells, it becomes possible to evaluate stem cells and stem cell-derived tissue cells. Analyzing the amount and pattern of nucleic acid released from cells based on the amount of drug treated, etc. makes it possible to evaluate the effect and toxicity of the drug. By analyzing the amount and pattern of nucleic acids released from cancer cells with different malignancy, the malignancy of cancer cells can be evaluated. By analyzing the amount and pattern of nucleic acids released from cancer cells and normal tissue cells, the presence or absence of cancer cells can be evaluated.
  • Example 1 MicroRNA sample preparation and analysis 1 Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (manufactured by LONZA) are seeded in a culture container of a 12-well culture plate so as to have a cell density of 20000 cells / cm 2 , and a serum-free maintenance medium, bone cell differentiation induction medium or fat Differentiation into bone cells or adipocytes was induced by culturing in a cell differentiation induction medium for 21 days.
  • the composition of each medium used is as follows.
  • Cell maintenance additive final concentration: 5 ⁇ M LPA (Cayman), 10 ⁇ M serotonin (SIGMA), 1 nM PDGF (Wako Pure Chemicals), 2.5 nM bFGF) to MEM-Alpha (Wako Pure Chemicals) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)).
  • Bone cell differentiation induction medium BMEM differentiation inducer (final concentration: 10 mM ⁇ -glycerophosphate (SIGMA), 100 nM dexamethasone, 1 mM vitamin C (Wako Pure Chemical Industries), 5 ⁇ M LPA (Cayman))
  • Serum-free medium supplemented with Adipocyte differentiation induction medium A serum-free medium in which an adipocyte differentiation inducer (final concentration: 1 ⁇ M dexamethasone, 1 ⁇ M rosiglitazone, 500 ⁇ M isobutylmethylxanthine, 1 ⁇ M insulin, 5 ⁇ M LPA (Cayman)) is added to DMEM (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the culture broth cultured for 7 days from the 14th day to the 21st day after the start of the culture was collected, and the suspended cells were removed with a 0.22 ⁇ m filter to prepare a sample.
  • TriZOL LS reagent manufactured by Invitrogen
  • 200 ⁇ L of chloroform was added, vigorously stirred, and centrifuged at 12,000 ⁇ g to collect the supernatant.
  • 500 ⁇ L of isopropanol was added, allowed to stand at ⁇ 30 ° C. for 12 hours or more, and then centrifuged at 12000 ⁇ g to discard the supernatant.
  • 500 ⁇ L of a 75% ethanol solution the mixture was centrifuged at 12000 ⁇ g, and the supernatant was discarded to recover a nucleic acid sample.
  • This nucleic acid sample was dissolved in 14 ⁇ L of H 2 O, and then Poly (A) Tailing was modified with Poly (A) Tailing Kit (manufactured by Ambion) (Poly (A) miRNA).
  • This Poly (A) miRNA sample was dissolved in 10 ⁇ L of H 2 O, and RNA was reversed to DNA with RT primer (5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN-3 ′, SEQ ID NO: 20) and Super Script II reverse transcriptase (Invitrogen).
  • RT primer 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN-3 ′, SEQ ID NO: 20
  • Super Script II reverse transcriptase Invitrogen.
  • a cDNA sample was obtained by adding 25 ⁇ L of H 2 O.
  • Hsa-miR-145, hsa-miR-24 and hsa-miR-16 contained in this cDNA sample were confirmed by a real-time PCR method using Platinum SYBR Green (manufactured by Invitrogen). The following primers were used.
  • hsa-miR-145 (SEQ ID NO: 1): Forward (CCGCGTCCAGTTTTCCCAGGAA, SEQ ID NO: 22) hsa-miR-24 (SEQ ID NO: 2): Forward (CCGCTGGCTCAGTTCAGCAG, SEQ ID NO: 23) hsa-miR-16 (SEQ ID NO: 3): Forward (CGCGCTAGCAGCACGTAAAT, SEQ ID NO: 24) Reverse common (GCGAGCACAGAATTAATACGAC, SEQ ID NO: 21)
  • Example 2 Preparation and analysis of microRNA samples 2
  • Cell lines derived from human liver cancer (HuH-7, purchased from ATCC) are seeded in a culture container of a 12-well culture plate so as to have a cell density of 20000 cells / cm 2 , and damage to liver tissue and hepatocytes Serum-free maintenance with the known carbon tetrachloride added at a relatively low concentration of 0-1000 ⁇ M used in World J Gastroenterol. 2008 Jun 21; 14 (23): 3693-709 Cultured in the medium for 7 days. A maintenance medium similar to that used in Example 1 was used.
  • the culture solution cultured for 7 days was collected, and the centrifuged supernatant was removed with a 0.22 ⁇ m filter to prepare a sample.
  • Hsa-miR-21, hsa-miR-122, hsa-miR-451 and hsa-miR-16 contained in this cDNA sample were confirmed by real-time PCR using Platinum SYBR Green (Invitrogen). . The following primers were used.
  • hsa-miR-21 (SEQ ID NO: 4): Forward (GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG, SEQ ID NO: 25) hsa-miR-122 (SEQ ID NO: 5): Forward (GCGCTGGAGTGTGACAATGGT, SEQ ID NO: 26) hsa-miR-451 (SEQ ID NO: 6): Forward (GCCGCAAACCGTTACCATTACT, SEQ ID NO: 27) hsa-miR-16 (SEQ ID NO: 3): Forward (CGCGCTAGCAGCACGTAAAT, SEQ ID NO: 24) Reverse common (GCGAGCACAGAATTAATACGAC, SEQ ID NO: 21)
  • Example 3 MicroRNA sample preparation and analysis 3
  • a cell line derived from human colorectal cancer and its lymph node metastasis cell line (SW480 and SW620, purchased from ATCC) are seeded in a culture vessel of a 6-well culture plate so as to have a cell density of 20000 cells / cm 2 , and serum Culturing was carried out in a maintenance medium without containing for 3 days.
  • a maintenance medium similar to that used in Example 1 was used.
  • the culture solution cultured for 3 days was collected, and the centrifuged supernatant was removed with a 0.22 ⁇ m filter to prepare a sample.
  • hsa-miR-20a (SEQ ID NO: 7): Forward (CCGCCGCTAAAGTGCTTATAGTG, SEQ ID NO: 28) hsa-miR-892a (SEQ ID NO: 8): Forward (CCGCCACTGTGTCCTTTCTGC, SEQ ID NO: 29) hsa-miR-22 * (SEQ ID NO: 9): Forward (CCGCGAGTTCTTCAGTGGCAA, SEQ ID NO: 30) hsa-miR-19a (SEQ ID NO: 10): Forward (CCGCCTGTGCAAATCTATGCA, SEQ ID NO: 31) hsa-miR-484 (SEQ ID NO: 11): Forward (CCGTCAGGCTCAGTCCCCT, SEQ ID NO: 32) hsa-miR-638 (SEQ ID NO: 12): Forward (CCGCAGGGATCGCGGGC, SEQ ID NO: 33) hsa-miR-
  • SW620 is a lymph node metastasis cell line, it has higher malignancy than the original colon cancer-derived cell line SW480. From FIG. 3, increase / decrease in miRNA released from the cells due to the progression of malignancy of the cancer cells was confirmed. This result suggests that the pattern of the amount of miRNA released into the medium changes with the progression of malignancy of cancer cells. In addition, it was confirmed that miRNAs commonly released from cancer cells exist regardless of the progression of cancer malignancy. This result suggests the presence of miRNAs that are commonly released by cancer cells, that is, it is possible to evaluate the presence or absence of cancer cells.
  • Example 4 Preparation and analysis of microRNA samples 4
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells manufactured by LONZA
  • serum-free maintenance medium bone cells Differentiation induction into bone cells or adipocytes was performed by culturing in a differentiation induction medium or adipocyte differentiation induction medium for 21 days.
  • the culture solution cultured for 7 days from the 14th day to the 21st day after the start of differentiation induction was collected, and the suspended cells were removed with a 0.22 ⁇ m filter to prepare a sample.
  • Trizol® LS reagent manufactured by Invitrogen
  • 200 ⁇ L of chloroform was added, vigorously stirred, and centrifuged at 12,000 ⁇ g to collect the supernatant.
  • 500 ⁇ L of isopropanol was added, allowed to stand at ⁇ 30 ° C. for 12 hours or more, and then centrifuged at 12000 ⁇ g to discard the supernatant.
  • 500 ⁇ L of a 75% ethanol solution the mixture was centrifuged at 12000 ⁇ g, and the supernatant was discarded to recover a nucleic acid sample.
  • This nucleic acid sample was dissolved in 14 ⁇ L of H 2 O, and a cDNA sample was obtained using TaqMan (registered trademark) MicroRNA RT primer (Applied Biosystems).
  • This cDNA sample was quantified by a real-time PCR method using TaqMan (registered trademark) MicroRNA Realtime Primer (Applied Biosystems) and confirmed by correcting with hsa-miR-16.
  • TaqMan registered trademark
  • MicroRNA ASSAY Probe manufactured by Applied Biosystems
  • hsa-miR-130a SEQ ID NO: 41: 000454 (ASSAY ID) hsa-miR-143 (SEQ ID NO: 42): 002249 (ASSAY ID) hsa-miR-214 (SEQ ID NO: 43): 002306 (ASSAY ID) hsa-miR-365 (SEQ ID NO: 44): 00120 (ASSAY ID) hsa-miR-16 (SEQ ID NO: 3): 000391 (ASSAY ID)

Abstract

培養細胞を消費することなく培養細胞の評価やバイオマーカーのスクリーニングをすることができる新規な手段が開示されている。本発明の培養細胞の評価方法は、無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸の少なくとも１種を測定することを含む。また、本発明のバイオマーカーのスクリーニング方法は、無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸を測定することを含む。指標とする核酸は、例えばマイクロＲＮＡである。

Description

培養細胞の評価方法およびバイオマーカーのスクリーニング方法
　本発明は、培養細胞から培養液中へ放出されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの核酸を指標とした培養細胞の評価方法およびバイオマーカーのスクリーニング方法に関する。
　培養細胞の評価は、培養した細胞の免疫染色や、細胞内に発現しているタンパク質や遺伝子などを解析する方法で評価されている。例えば、胚性幹細胞は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧなどを標的とした免疫染色法で、胚性幹細胞から分化誘導した細胞は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧの遺伝子発現量の減少や組織特異的な遺伝子の増加から評価している。
　免疫染色法、遺伝子発現量などの細胞を使用した評価方法は、培養した細胞を固定、溶解などしなければならないということから、経時的な変化を評価するためには、同一条件で培養する培養細胞を多量に準備しなければならない。そして、経時的に培養した細胞を消費しなければならないという問題点がある。
　新しい治療法として注目されている再生医療（細胞医療）分野では、移植細胞の評価は、同一条件で培養した細胞を細胞染色などで間接的に評価しなければならないという問題点がある。移植に用いる細胞自体を評価することは従来法では不可能である。
　近年、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたヘアピン型に折りたたまれた６０から１００塩基程度のＲＮＡ（前駆体マイクロＲＮＡ）がＲＮＡ分解酵素で分解され、１７から２４塩基の一本鎖ＲＮＡなったｍｉＲＮＡが注目されている。このｍｉＲＮＡは、自身と相補的な塩基配列をもったメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害する機能を有しており、幹細胞から組織細胞への分化（非特許文献１）や各組織がん細胞の判定（特許文献１）で重要な役割を果たしているという報告がされている。さらに、このｍｉＲＮＡが血液中に存在している報告（非特許文献２）があり、がん等の疾病に対する診断・予後予測等に利用できる可能性があることも注目されている。
　培養細胞の培養には、培養効率を高める観点から、血清を添加した培地が一般的に使用される。添加した血清由来の核酸と培養細胞から放出された核酸との区別が難しいことから、これまでに培養細胞から放出された核酸で細胞を評価する方法やバイオマーカーのスクリーニング方法は報告されていない。
特開２００９－１００６８７号
Exp. Hematol. 2008;36:1354-1369 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008;105:10513-8
　従って、本発明の目的は、培養細胞を消費することなく培養細胞の評価やバイオマーカーのスクリーニングをすることができる新規な手段を提供することにある。
　本願発明者は、鋭意研究の結果、培養細胞から培養液中にｍｉＲＮＡ等の核酸が放出されていることを見出し、さらに、幹細胞、分化した組織細胞、薬剤処理、がん細胞の悪性度進展等に応じて、培養液中に放出されるｍｉＲＮＡ等の核酸の量や種類が異なることを見出した。そして該ｍｉＲＮＡ等の核酸を指標とすれば細胞の状態を評価できることを見出し、本願発明を完成した。また、無血清培地で該ｍｉＲＮＡ等の核酸を測定すれば、バイオマーカーのスクリーニングを行えることを見出し、本願発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸の少なくとも１種を測定することを含む、培養細胞の評価方法を提供する。本法は無血清培地で細胞を培養するので、幹細胞、がん細胞などのバイオマーカー候補となる核酸を容易に見出すことが可能な、スクリーニング方法を提供する。
　より具体的には、本発明は以下の発明を提供する。
(1)　無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸の少なくとも１種を測定することを含む、培養細胞の評価方法。
(2)　前記核酸がマイクロＲＮＡである(1)記載の方法。
(3)　配列表の配列番号１、３～５、７～１９、４１～４４に示される塩基配列からなるマイクロRNAの少なくとも１種を測定する(2)記載の方法。
(4)　配列表の配列番号１、３～５、７～１９に示される塩基配列からなるマイクロRNAの少なくとも１種を測定する(3)記載の方法。
(5)　前記細胞は哺乳動物由来細胞であり、前記無血清培地は、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを含む培地である(1)ないし(4)のいずれか１つに記載の方法。
(6)　内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びに内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である(5)記載の方法。
(7)　セロトニンレセプターに対する前記リガンドが、セロトニン、その塩及びセロトニンレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である(5)又は(6)記載の方法。
(8)　幹細胞の分化を評価する方法である(1)ないし(7)のいずれか１つに記載の方法。
(9)　配列番号１、４１～４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標として幹細胞の分化を評価する(8)記載の方法。
(10)　配列番号１又は４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として骨細胞への分化を評価する(9)記載の方法。
(11)　配列番号１に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として骨細胞への分化を評価する(10)記載の方法。
(12)　配列番号４１に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として脂肪細胞への分化を評価する(9)記載の方法。
(13)　配列番号４２に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として組織細胞への分化を評価する(9)記載の方法。
(14)　配列番号４３に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として幹細胞の分化の有無を評価する(9)記載の方法。
(15)　細胞障害を評価する方法である(1)ないし(7)のいずれか１つに記載の方法。
(16)　配列番号３～５に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標として培養細胞への障害を評価する(15)記載の方法。
(17)　前記培養細胞が肝細胞である(16)記載の方法。
(18)　培養細胞への化学物質・生物由来物質・環境刺激等による効果・影響・毒性等を評価する方法である(1)ないし(7)のいずれか１つに記載の方法。
(19)　がん細胞の有無を評価する方法である(1)ないし(7)のいずれか１つに記載の方法。
(20)　がん細胞の悪性度を評価する方法である(1)ないし(7)のいずれか１つに記載の方法。
(21)　配列番号７～１９に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標とする(19)又は(20)記載の方法。
(22)　前記がん細胞が大腸がん細胞である(21)記載の方法。
(23)　無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸を測定することを含む、バイオマーカーのスクリーニング方法。
(24)　配列表の配列番号１、３～５、７～１９、４１～４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を測定する(23)に記載の方法。
(25)　配列表の配列番号１、３～５、７～１９に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を測定する(24)に記載の方法。
　本発明により、培養液中に放出される核酸を指標とした新規な細胞評価法およびバイオマーカーのスクリーニング方法が提供された。本発明の方法によれば、細胞を評価のためだけに消費する必要がないため、評価のために別途培養細胞を用意する必要がなく、手間とコストを大幅に軽減できる。貴重な細胞サンプルを消費しないで済むという点も大きな利点である。さらに、本発明によれば、実際に使用する細胞自体を直接評価することができるため、再生医療等の分野での細胞評価にも極めて有用である。また、バイオマーカーを容易にスクリーニングするために有用である。
実施例１において、間葉系幹細胞から骨細胞または脂肪細胞を分化誘導した際の培養液中ｍｉＲＮＡ量のパターンを調べた結果である。 実施例２において、ヒト肝臓がん由来の培養細胞を四塩化炭素処理することで細胞障害を与えた際の培養液中ｍｉＲＮＡ量のパターンを調べた結果である。 実施例３において、ヒト大腸がん由来細胞株ＳＷ４８０およびそのリンパ節転移巣細胞株ＳＷ６２０の培養液中ｍｉＲＮＡ量をｈｓａ－ｍｉＲ－１６量で補正した相対発現量でパターンを調べた結果である。 実施例４において、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から骨細胞または脂肪細胞を分化誘導した際の培養液中ｍｉＲＮＡ量のパターンを調べた結果である。
　本発明において、細胞の評価とは、細胞の状態を評価することであり、細胞の分化、化学物質・生物由来物質（例えば核酸、タンパク質およびその断片、糖質、脂質、ビタミン類等）・環境刺激（例えば温度の低下または上昇、湿度の低下または上昇、圧力の低下または上昇、酸素濃度の低下または上昇、ＣＯ２濃度の低下または上昇、紫外線照射、放射線照射等）等による効果・影響・毒性等、がん細胞の有無、がん細胞の悪性度等の種々の状態の評価が包含される。また、本発明においてバイオマーカーとは、細胞、組織、生体等の状態変化を定性・定量的に把握するための指標となる生体由来の物質（例えば核酸、タンパク質およびその断片、糖質、脂質、ビタミン類等）である。
　本発明の方法で測定される核酸は、培養細胞から培養液中に放出されるものであればいかなる種類のものであってもよく、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、好ましくはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。本発明において、ｍｉＲＮＡとは、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子から転写されヘアピン型に折りたたまれた６０～１００塩基程度のＲＮＡがＲＮＡ分解酵素で１７～２４塩基程度に分解された一本鎖のＲＮＡであり、自身と相補的な塩基配列をもったメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害する機能を有している。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は公知であり、ｍｉＲＮＡ自体も種々のものが公知である。
　測定対象となるｍｉＲＮＡの具体例としては、配列表の配列番号１、３～５、７～１９に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡを挙げることができる。これらはいずれも、下記実施例において、細胞の分化、細胞障害、がん細胞の有無、がん細胞の悪性度進展等に応じて培地中存在量が変化することが具体的に確認されているものである。もっとも、測定対象となる核酸はこれらのｍｉＲＮＡに限定されるものではない。
　例えば、下記実施例に記載されるように、配列番号１、４１～４４に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-145、hsa-miR-130a、hsa-miR-143、hsa-miR-214、hsa-miR-365）は、細胞の分化の指標として用いることができる。より具体的には、配列番号１及び４４のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-145、hsa-miR-365）は幹細胞から骨細胞への分化の指標として、配列番号４１のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-130a）は脂肪細胞への分化の指標として、それぞれ用いることができる。配列番号４２のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-143）は、骨細胞および脂肪細胞のいずれに分化した場合でも多く測定されるため、骨細胞および脂肪細胞等の組織細胞への分化の指標として用いることができる。配列番号４３のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-214）は、分化誘導前の未分化幹細胞の培養液中で多く測定されるため、幹細胞の分化の有無の指標として用いることができる。
　配列番号３～５に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-16、hsa-miR-21、hsa-miR-122）は、細胞障害、例えば化学物質による細胞毒性等があり、より具体的には薬剤処理による肝細胞障害の指標として用いることができる。
　配列番号７～１９に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-20a、hsa-miR-892a、hsa-miR-22*、hsa-miR-19a、hsa-miR-484、hsa-miR-638、hsa-miR-125b、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-138、hsa-miR-186、hsa-miR-223）は、がんの悪性度、より具体的には大腸がんの悪性度の指標として用いることができる。配列番号７～１９のうち、配列番号７、１０～１５に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-20a、hsa-miR-19a、hsa-miR-484、hsa-miR-638、hsa-miR-125b、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-532-3p）はがんの悪性度にかかわらず共通して培養液中に検出され、がん細胞の有無の指標として用いることができる。配列番号８、９に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-892a、hsa-miR-22*）は原発部由来の細胞株培養液中に特異的に検出され、配列番号１６～１９に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-142-3p、hsa-miR-138、hsa-miR-186、hsa-miR-223）はより悪性度の高い転移巣由来の細胞株培養液中に特異的に検出される。
　上記したｍｉＲＮＡは、いずれか１種類のみを測定してもよいし、また、複数種類を測定してもよい。評価目的に応じて測定する核酸の種類は適宜選択することができる。例えば、幹細胞の骨細胞への分化を評価したい場合には、骨細胞への分化の指標となるhsa-miR-145及びhsa-miR-365と組み合わせて、未分化細胞の指標となるhsa-miR-214及び組織細胞への分化の指標となるhsa-miR-143を測定してもよい。
　本発明において培養される細胞は、試験管内培養（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）条件下で培養できる細胞であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来の細胞である。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ条件下で培養できるのであれば、哺乳動物より摘出した組織を形成する細胞も含まれる。
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養できる哺乳類由来の細胞としては、幹細胞（胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞など）、組織前駆細胞および組織細胞（骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液系細胞、繊維芽細胞、肝臓細胞など）、がん細胞およびがん由来細胞株（ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ－７、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、Ｃａｃｏ－２、ＣＨ－４、ＣＨ－５、ＣｏＬｏ－２０５、Ｈｃ１１０、ＰＭＰ－１など）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　本発明で細胞の培養に用いる培地は、一般に無血清培地と呼ばれる、添加剤としての動物血清を含まない培地であればよい。公知の基本培地にその他添加剤（動物血清を除く）を含有した組成を有するものを用いることができる。基本培地の組成は、培養するべき細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ－α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２およびＦ－１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地などが挙げられる。これらの培地は、いずれもこの分野において周知の培地である。
　基本培地に加えるその他の添加剤としては、アミノ酸類、無機塩類、ビタミン類および炭素源や抗生物質等の他の添加剤を挙げることができる。これらの添加剤の使用濃度は特に限定されず、通常の哺乳動物細胞用培地に用いられる濃度で用いることができる。
　アミノ酸類としては、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシンおよびＬ－バリンを挙げることができる。
　無機塩類としては、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（III）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウム等を挙げることができる。
　ビタミン類としては、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭおよびビタミンＰを挙げることができる。
　他の添加剤としては、（１）繊維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、内皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の増殖因子、（２）ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびカナマイシン等の抗生物質、（３）グルコース、ガラクトース、フルクトースおよびスクロース等の炭素源、（４）マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケルおよびケイ素等の微量金属）、（５）β－グリセロリン酸、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、イソブチルメチルキサンチン、および５－アザシチジン等の幹細胞分化誘導剤、（６）２－メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよびＮ-アセチルシステイン等の抗酸化剤、並びにアデノシン ５'－一リン酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、メラトニン、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリンおよびラクトフェリン等の他の添加剤を挙げることができる。
　無血清条件で動物細胞を培養できる培地や培養法は種々のものが公知であり、本発明ではそのいずれを用いてもよい。とりわけ、無血清でも哺乳動物細胞を効果的に増殖できる培地として、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを含む培地（以下、便宜的にこの培地を「高効率無血清培地」と呼ぶ）を好ましく用いることができる。
　高効率無血清培地は、上記の通り、必須成分の一つとしてＥｄｇファミリーレセプターに対するリガンドを含む。Ｅｄｇファミリーレセプターとは、その遺伝子配列の相同性が高いＧタンパク質共役型のレセプターの一群であり、現在までにヒト、マウス、ヒツジなどの哺乳類でＥｄｇ－１からＥｄｇ－８までが同定されている（Science. Vol. 294，pp. 1875-1878，2001、及びJ Biol Chem. Vol. 277, No.29, pp. 25851-25854, 2002）。これらのうち、Ｅｄｇ－２、Ｅｄｇ－４およびＥｄｇ－７はＬＰＡレセプターとして機能し、Ｅｄｇ－１、Ｅｄｇ－３、Ｅｄｇ－５、Ｅｄｇ－６およびＥｄｇ－８はＳ１Ｐレセプターとして機能することが知られている。また、「レセプターに対するリガンド」とは、該レセプターと特異的に結合する物質であり、生体内に存在する天然のリガンドのみならず、アゴニストやアンタゴニストとして知られる天然または合成された他の化合物をも包含する。
　Ｅｄｇファミリーレセプターに対するリガンド（以下、便宜的に「Ｅｄｇリガンド」と呼ぶことがある）としては、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びにＥｄｇファミリーレセプターのアゴニストからなる群より選択される１または複数種の化合物が好ましい。
　Ｅｄｇファミリーレセプターのアゴニストとは、Ｅｄｇファミリーレセプターと結合してＬＰＡおよびＳ１Ｐと同様に作用する物質であり、例えばジヒドロスフィンゴシン１リン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、スフィンゴシルホスホリルコリン、アルキルＬＰＡアナログ、ＦＴＹ７２０などが挙げられる。
　ＬＰＡとは、下記の一般式（Ｉ）：
Ｒ－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＰＯ４Ｈ２　　　　　　　　　　（Ｉ）
（式中、Ｒは、炭素数１０～３０のアルキル基、炭素数１０～３０のアルケニル基または炭素数１０～３０のアシル基である）
で表される化合物である。
　上記の式（Ｉ）のＲ基についてのアシル基の炭素数は、カルボニル基の炭素数を含まない。
　ＬＰＡの塩としては、従来公知の塩を用いることができ、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
　ＬＰＡまたはＬＰＡの塩としては、例えば１－オレオイルリゾホスファチジン酸ナトリウム塩、ＬＰＡカリウム塩などが挙げられる。
　Ｅｄｇリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　また、上記した高効率無血清培地は、さらに、セロトニンレセプターに対するリガンド（以下、便宜的に「セロトニンリガンド」と呼ぶことがある）を含む。セロトニンレセプターは主に中枢神経系にあるGタンパク質結合レセプターの一種である。セロトニンリガンドとしては、セロトニン、その塩およびセロトニンアゴニストから選択される１または複数種の化合物が好ましい。セロトニンは、５－ヒドロキシトリプタミンともよばれ、神経伝達物質として作用することが知られている。セロトニンアゴニストとは、セロトニンレセプターと結合してセロトニンと同様に作用することが知られている物質であり、例えばイプサピロン、ゼロピン、ブスピロン、１－［２－（４－アミノフェニル）エチル］－４－（３－ビフルオロメチルフェニル）ピペラジン（ＰＡＤＤ）、Ｎ，Ｎ－ジプロピル－５－カルボキシアミドトリプタミン（ＤＰ－５ＣＴ）、α－メチル－５－ヒドロキシトリプタミン（ＨＴ）、２－メチル－５－ＨＴなどが挙げられる。セロトニンの塩は、従来公知の塩を用いることができ、例えば塩酸塩などが挙げられる。
　セロトニンリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　培地中のＥｄｇリガンドの濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、通常、0.01～100μM程度である。Ｅｄｇリガンドが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびその塩から成る群より選択される少なくとも１種である場合には、その培地中の濃度は、0.25～10μMが好ましい。また、Ｅｄｇリガンドが、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）である場合には、その培地中の濃度は、0.01μM～0.2μMが好ましい。また、培地中のセロトニンリガンドの濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.1～100μMが好ましく、0.25～20μMがさらに好ましい。
　高効率無血清培地は、抗酸化剤をさらに含むことが好ましい。抗酸化剤の好ましい例としては、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ｌ－システイン、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよび２－メルカプトエタノールから成る群より選ばれる少なくとも１種、さらに好ましくは、Ｎ－アセチルシステインおよびＬ－システインから成る群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。これらの抗酸化剤は、アポトーシス阻害作用を有することが知られており、従って、培養細胞の維持、増殖に有効である。抗酸化剤は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　培地中の抗酸化剤の濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.01mM～10mMが好ましく、さらに好ましくは0.1mM～1mMである。
　高効率無血清培地は、動物血清アルブミンをさらに含むことが好ましい。アルブミンは、血清の主要成分であり、血液中では薬物の輸送等の役割を担っていることが知られている。動物血清アルブミンを含むことにより、培養細胞の増殖が一層促進される。動物血清アルブミンの好ましい例として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などが挙げられる。これらのアルブミンは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　培地中のアルブミンの濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.0001～１０重量％が好ましく、0.0001～１重量％がさらに好ましい。
　高効率無血清培地は、成長因子をさらに含むことが好ましい。成長因子を含むことにより、培養細胞の増殖が一層促進される。成長因子の好ましい例としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等を挙げることができ、さらに好ましい例として、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）を挙げることができる。これらの成長因子自体は、いずれもこの分野において周知である。成長因子は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。特に、下記実施例に具体的に示されるように、成長因子として血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）と塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の２種類のみを含むものでも間葉系幹細胞の増殖が十分に達成されるので、間葉系幹細胞の培養に用いられる培地では、培地中に含まれる成長因子は、これら２種類の成長因子だけでも十分である。
　高効率無血清培地は、さらに、血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）に対するリガンド（ＰＤＧＦ）を含んでいてもよく、特に、間葉系幹細胞を培養する培地では、これを含むことが好ましい。ＰＤＧＦＲは、主に間葉系細胞にあるチロシンキナーゼ関連型受容体の一種であり、これに対するリガンドを含むことにより、間葉系幹細胞を効率良く細胞を増殖させることができる。ＰＤＧＦＲのリガンドとしては、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ、ＰＤＧＦ－ＤＤなどが挙げられ、これらはいずれも周知である。ＰＤＧＦＲのリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　高効率無血清培地は、塩基性線維芽細胞成長因子レセプター（ＦＧＦＲ）に対するリガンド（ＦＧＦ）を含んでいてもよく、特に、間葉系幹細胞を培養する場合には、これを含むことが好ましい。ＦＧＦＲは、主に間葉系細胞に存在することが知られており、これに対するリガンドを含むことにより、間葉系幹細胞の寿命を改善させる。ＰＤＧＦＲのリガンドとしては、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）など、計20種以上存在することが知られている。例えば、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－４などが挙げられる。特に、ｂＦＧＦは組織の形成に強く関与していることが知られている。これらはいずれも周知である。
　成長因子の濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.1～100ng/mLが好ましく、1～10ng/mLがさらに好ましい。
　高効率無血清培地は、界面活性剤をさらに含んでいてもよい。低濃度の界面活性剤を含むことにより、細胞膜への悪影響を減じる効果等があると考えられる。一方、高濃度の界面活性剤を培地に添加すると、細胞増殖阻害や細胞死の誘導をすることが知られている。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80等）、アルキルフェノキシポリエチレングリコール（商品名Triton X-100等）、アルキルフェニルポリエチレングリコール（商品名Triton X-114、NP-40等）の非イオン性界面活性剤が好ましい。界面活性剤は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　界面活性剤の濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、通常、0.1～100ng/mLであり、好ましくは1～10ng/mLである。
　高効率無血清培地は、上記したＥｄｇリガンドおよびセロトニンリガンド、好ましくは、さらに、上記した抗酸化剤、動物血清アルブミン、成長因子および界面活性剤の１種以上を含むことを除き、公知の哺乳動物細胞用培地と同様でよい。従って、基本的に、公知の基本培地に、上記した２種類の必須成分、好ましくはさらに上記した好ましい成分の１種以上を添加することにより、高効率無血清培地を得ることができる。公知の基本培地の例は上記の通りである。任意の添加剤も上記の通りであり、上記した添加剤の１種または複数種を含むことができる。また、公知の基本培地と同様に、分化誘導剤を添加して分化誘導培地として用いることもできる。分化誘導剤の例は上記したが、上記の例示に限定されず、分化誘導により調製すべき細胞の種類に応じて、公知の分化誘導剤から適宜選択して用いることができる。
　本発明の培養細胞の培養自体は、従来と同様な方法で行うことができ、通常、３０～３７℃の温度、および５％ＣＯ２環境下、および５～２１％Ｏ２環境下で行われる。また、分化誘導に必要な培養時間は、用いる分化誘導剤や細胞の種類等により適宜設定され、また、細胞の様子を観察しながら適宜選択することができる。
　培養液中の核酸の抽出は、この分野で周知の常法を用いて行うことができる。液体試料からの核酸抽出のための各種試薬キット類が市販されており、それらを用いて容易に行うことができる。
　核酸の測定方法自体は周知である。例えば、プライマーを用いた核酸増幅法による測定法としては、リアルタイムＰＣＲやNASBA法等を挙げることができる。また、プローブを用いた測定法としては、ノーザンブロット、サザンブロットの他、固相化プローブを用いたアレイ解析法等を挙げることができる。本発明の方法では周知のいずれの測定法を用いてもよい。リアルタイムＰＣＲによる測定法の具体的な例としては、下記実施例に記載されるように、培養液から抽出したＲＮＡ試料の３’末端にプライマーサイトを導入してｃＤＮＡを調製した後、各種ｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、ｍｉＲＮＡの有無ないしはその量を測定することができる。配列番号１～１９に示す塩基配列からなるｍｉＲＮＡに特異的なプライマーとしては、例えば、配列番号２２～４０に示す塩基配列からなるものを用いることができる。また、Applied Biosystems社が開発した市販のTaqMan Probe microRNA Assaysを用いることができる。該キットは、公知の各種ｍｉＲＮＡに対応しており、所望のｍｉＲＮＡをリアルタイムＰＣＲにより測定できる。なお、本発明において、「測定」には、検出、定量、半定量が包含される。
　細胞の変化によって培養液中への放出が開始される核酸を測定する場合には、経時的に培養液の一部を採取して核酸を測定し、核酸が検出されるかどうかを調べればよい。核酸量の変化を測定する場合には、例えば、培養開始時を基準時とし、基準時の核酸量を１として、基準時以降の培養液中核酸量を相対評価することにより、核酸量の変化を測定することができる。相対評価の基準とする時点または核酸量は適宜設定することができる。内標準物質（例えば、miR-16など）で核酸量を補正することで評価することができる。例えば、幹細胞と該幹細胞由来の組織細胞から放出される核酸量およびパターン等を解析することで、幹細胞および該幹細胞由来の組織細胞の評価が可能となる。薬剤処理量等によって、細胞から放出される核酸量およびパターン等を解析することで、薬剤の効果・毒性の評価が可能となる。悪性度の異なるがん細胞から放出される核酸量およびパターン等を解析することで、がん細胞の悪性度の評価が可能となる。がん細胞と正常な組織細胞から放出されてくる核酸量およびパターン等を解析することで、がん細胞の有無を評価することが可能となる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１：マイクロＲＮＡサンプルの調製および解析１
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＬＯＮＺＡ社製）を２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように１２穴培養プレートの培養容器に播種し、血清不含の維持培地、骨細胞分化誘導培地または脂肪細胞分化誘導培地で２１日間培養することにより、骨細胞または脂肪細胞への分化誘導を行った。用いた各培地の組成は以下の通りである。
維持培地：
ＭＥＭ－Ａｌｐｈａ（和光純薬社製）に細胞維持用添加剤（最終濃度：５μＭ ＬＰＡ(Cayman社製)、１０μＭ セロトニン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｎＭ ＰＤＧＦ(和光純薬社製)、２．５ｎＭ ｂＦＧＦ（和光純薬社製））を含んだ無血清培地。
骨細胞分化誘導培地：
ＤＭＥＭ（和光純薬社製）に骨細胞分化誘導剤（最終濃度：１０ｍＭ β-グリセロリン酸（ＳＩＧＭＡ社製）、１００ｎＭ デキサメタゾン、1ｍＭ ビタミンＣ（和光純薬社製）、５μＭ ＬＰＡ(Cayman社製)）を添加した無血清培地。
脂肪細胞分化誘導培地：
ＤＭＥＭ（和光純薬社製）に脂肪細胞分化誘導剤（最終濃度：１μＭ デキサメタゾン、１μＭ ロシグリタゾン、５００μＭ イソブチルメチルキサンチン、１μＭ インスリン、５μＭ ＬＰＡ(Cayman社製)）を添加した無血清培地。
　培養開始後１４日目から２１日目までの７日間培養した培養液を回収し、０．２２μｍのフィルターにて浮遊した細胞を除去し、サンプルとした。
　サンプル２５０μＬに対して７５０μＬのTriZOL LS試薬（インビトロジェン社製）と混和した後、クロロホルム２００μＬを添加、激しく攪拌、１２０００ｘｇにて遠心分離してその上清を回収した。この上清に、イソプロパノール５００μＬを加え、マイナス３０℃にて１２時間以上静置後に１２０００ｘｇにて遠心分離して上清を廃棄した。そして、７５％エタノール溶液５００μＬを添加後、１２０００ｘｇにて遠心分離、上清を廃棄して核酸サンプルを回収した。
　この核酸サンプルを１４μＬのＨ２Ｏに溶解後、Poly(A) Tailing Kit（Ambion社製）にてｍｉＲＮＡにPoly(A) Tailingを修飾した（Poly(A)miRNA）。
　このPoly(A)miRNA溶液に１００μＬのＨ２Ｏを添加後、３７５μＬのTriZOL LS試薬（インビトロジェン社製）を添加、クロロホルム１００μＬを添加、激しく攪拌、１２０００ｘｇにて遠心分離してその上清を回収した。この上清に、イソプロパノール５００μＬを加え、マイナス３０℃にて１２時間以上静置後に１２０００ｘｇにて遠心分離して上清を廃棄した。そして、７５％エタノール溶液５００μＬを添加後、１２０００ｘｇにて遠心分離、上清を廃棄してPoly(A)miRNAサンプルを回収した。
　このPoly(A)miRNAサンプルを１０μＬのＨ２Ｏに溶解、ＲＴプライマー（5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN-3’、配列番号２０）およびSuper Script II逆転写酵素（インビトロジェン社製）にてＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、２５μＬのＨ２Ｏを添加してｃＤＮＡサンプルを得た。
　このｃＤＮＡサンプル中に含まれるhsa-miR-145、hsa-miR-24およびhsa-miR-16を、Platinum SYBR Green（インビトロジェン社製）を使用したリアルタイムＰＣＲ法にて確認した。プライマーは以下のものを使用した。
hsa-miR-145（配列番号１）：フォワード（CCGCGTCCAGTTTTCCCAGGAA、配列番号２２）
hsa-miR-24（配列番号２）：フォワード（CCGCTGGCTCAGTTCAGCAG、配列番号２３）
hsa-miR-16（配列番号３）：フォワード（CGCGCTAGCAGCACGTAAAT、配列番号２４）
リバース共通（GCGAGCACAGAATTAATACGAC、配列番号２１）
　結果を図１に示す。図１より、培養細胞外へ放出されるｍｉＲＮＡが存在していることが確認された。そして、培養細胞から放出されるｍｉＲＮＡ量のパターンが、組織細胞種によって変化することが確認された。例えば、間葉系幹細胞が骨細胞に分化と共にhsa-miR-145の放出量が著しく上昇する。この結果は、培養細胞の変化（幹細胞の分化）によって、放出されるｍｉＲＮＡ量のパターンが変化することを示唆するものである。つまり、放出されるｍｉＲＮＡを解析することで、間葉系幹細胞からの分化誘導の進行度の予測を可能にすることを示唆するものである。骨細胞への分化確認は、アリザインレッドＳ染色、脂肪細胞への分化確認は、オイルレッドＯ染色にて確認した。
実施例２：マイクロＲＮＡサンプルの調製および解析２
　ヒト肝臓がん由来の細胞株（ＨｕＨ－７、ＡＴＣＣより購入）を２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように１２穴培養プレートの培養容器に播種し、肝組織および肝細胞に障害を与えることで知られている四塩化炭素を、World J Gastroenterol. 2008 Jun 21;14(23):3693-709にて用いられている比較的低濃度である０～１０００μＭで添加した血清不含の維持培地で７日間培養した。維持培地は実施例１と同様のものを用いた。
　７日間培養した培養液を回収し、遠心処理をした上清を０．２２μｍのフィルターにて細胞を除去し、サンプルとした。
　実施例１同様にPoly(A)miRNAサンプルのｃＤＮＡサンプルを得た。
　このｃＤＮＡサンプル中に含まれるhsa-miR-21、hsa-miR-122、hsa-miR-451およびhsa-miR-16を、Platinum SYBR Green（インビトロジェン社製）を使用したリアルタイムＰＣＲ法にて確認した。プライマーは以下のものを使用した。
hsa-miR-21（配列番号４）：フォワード（GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG、配列番号２５）
hsa-miR-122（配列番号５）：フォワード（GCGCTGGAGTGTGACAATGGT、配列番号２６）
hsa-miR-451（配列番号６）：フォワード（GCCGCAAACCGTTACCATTACT、配列番号２７）
hsa-miR-16（配列番号３）：フォワード（CGCGCTAGCAGCACGTAAAT、配列番号２４）
リバース共通（GCGAGCACAGAATTAATACGAC、配列番号２１）
　結果を図２に示す。図２より、幹細胞以外の培養細胞でも細胞外に放出されるｍｉＲＮＡが存在していることが確認された。そして、培養細胞の障害依存的に、細胞から放出されるｍｉＲＮＡの上昇が確認された。この結果は、培養細胞の変化、例えば薬剤処理によって、培養液中へ放出されるｍｉＲＮＡ量のパターンが変化することを示唆するものである。つまり、本法は、培養液中へ放出されるｍｉＲＮＡ量を解析することで、薬剤等の効果または毒性を評価することが可能であることを示唆するものである。
実施例３：マイクロＲＮＡサンプルの調製および解析３
　ヒト大腸がん由来の細胞株およびそのリンパ節転移巣細胞株（ＳＷ４８０およびＳＷ６２０、ＡＴＣＣより購入）を２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように６穴培養プレートの培養容器に播種し、血清不含の維持培地で３日間培養した。維持培地は実施例１と同様のものを用いた。
　３日間培養した培養液を回収し、遠心処理をした上清を０．２２μｍのフィルターにて細胞を除去し、サンプルとした。
　実施例１と同様にPoly(A)miRNAサンプルのｃＤＮＡサンプルを得た。
　このｃＤＮＡサンプル中に含まれるhsa-miR-20a、hsa-miR-892a、hsa-miR-22*、hsa-miR-19a、hsa-miR-484、hsa-miR-638、hsa-miR-125b、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-138、hsa-miR-186、hsa-miR-223を、Platinum SYBR Green（インビトロジェン社製）を使用したリアルタイムＰＣＲ法にて確認した。プライマーは以下のものを使用した。
hsa-miR-20a（配列番号7）：フォワード（CCGCCGCTAAAGTGCTTATAGTG、配列番号28）
hsa-miR-892a（配列番号8）：フォワード（CCGCCACTGTGTCCTTTCTGC、配列番号29）
hsa-miR-22*（配列番号9）：フォワード（CCGCGAGTTCTTCAGTGGCAA、配列番号30）
hsa-miR-19a（配列番号10）：フォワード（CCGCCTGTGCAAATCTATGCA、配列番号31）
hsa-miR-484（配列番号11）：フォワード（CCGTCAGGCTCAGTCCCCT、配列番号32）
hsa-miR-638（配列番号12）：フォワード（CCGCAGGGATCGCGGGC、配列番号33）
hsa-miR-125b（配列番号13）：フォワード（CCGCGTCCCTGAGACCCTAA、配列番号34）
hsa-miR-339-5p（配列番号14）：フォワード（CCGTCCCTGTCCTCCAGGA、配列番号35）
hsa-miR-532-3p（配列番号15）：フォワード（CCCTCCCACACCCAAGGCT、配列番号36）
hsa-miR-142-3p（配列番号16）：フォワード（CCGCCTGTAGTGTTTCCTACTTT、配列番号37）
hsa-miR-138（配列番号17）：フォワード（CCGGCAGCTGGTGTTGTGAA、配列番号38）
hsa-miR-186（配列番号18）：フォワード（CCGCCGCAAAGAATTCTCCTTTT、配列番号39）
hsa-miR-223（配列番号19）：フォワード（CCGCCGTGTCAGTTTGTCAAATA、配列番号40）
リバース共通（GCGAGCACAGAATTAATACGAC、配列番号21）
　結果を図３に示す。ＳＷ６２０は、リンパ節転移巣細胞株であるため、もとの大腸がん由来細胞株ＳＷ４８０よりも悪性度が高い。図３より、がん細胞の悪性度進展により細胞から放出されるmiRNAの増減が確認された。この結果は、がん細胞の悪性度進展によって、培地中へ放出されるｍｉＲＮＡ量のパターンが変化することを示唆するものである。また、がんの悪性度進展に関わらず、がん細胞から共通に放出されているmiRNAが存在することが確認された。この結果は、がん細胞が共通に放出しているmiRNAの存在を示唆するものであり、即ち、がん細胞の有無を評価することが可能であることを示唆するものである。
実施例４：マイクロＲＮＡサンプルの調製および解析４
　実施例１同様、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＬＯＮＺＡ社製）を２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように１２穴培養プレートの培養容器に播種し、血清不含の維持培地、骨細胞分化誘導培地または脂肪細胞分化誘導培地で２１日間培養することにより、骨細胞または脂肪細胞への分化誘導を行った。
　分化誘導開始後１４日目から２１日目までの７日間培養した培養液を回収し、０．２２μｍのフィルターにて浮遊した細胞を除去し、サンプルとした。
　サンプル２５０μＬに対して７５０μＬのTrizol LS試薬（インビトロジェン社製）と混和した後、クロロホルム２００μＬを添加、激しく攪拌、１２０００ｘｇにて遠心分離してその上清を回収した。この上清に、イソプロパノール５００μＬを加え、マイナス３０℃にて１２時間以上静置後に１２０００ｘｇにて遠心分離して上清を廃棄した。そして、７５％エタノール溶液５００μＬを添加後、１２０００ｘｇにて遠心分離、上清を廃棄して核酸サンプルを回収した。
　この核酸サンプルを１４μＬのＨ２Ｏに溶解後、ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭｉｃｒｏＲＮＡ　ＲＴプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてｃＤＮＡサンプルを得た。
　このｃＤＮＡサンプルをＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ｒｅａｌｔｉｍｅプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したリアルタイムＰＣＲ法にて定量し、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６にて補正することで確認した。プローブは、以下の各ASSAY IDで入手可能な市販のＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭｉｃｒｏＲＮＡ ＡＳＳＡＹ Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
hsa-miR-130a（配列番号４１）：０００４５４ （ASSAY ID）
hsa-miR-143（配列番号４２）：００２２４９ （ASSAY ID）
hsa-miR-214（配列番号４３）：００２３０６ （ASSAY ID）
hsa-miR-365（配列番号４４）：００１０２０ （ASSAY ID）
hsa-miR-16（配列番号３）：０００３９１ （ASSAY ID）
　結果を図４に示す。図４より、間葉系幹細胞から細胞外へ放出されるｍｉＲＮＡは、脂肪細胞や骨細胞等の組織細胞へ分化することで変化することが確認された。この結果は、放出されるｍｉＲＮＡを解析することで間葉系幹細胞、組織細胞の品質評価を可能とすることを示唆するものである。以下が間葉系幹細胞から分化誘導したときの各組織細胞のマーカー候補である。
未分化細胞（非誘導）：hsa-miR-214
組織細胞（骨および脂肪細胞）：hsa-miR-143
骨細胞：hsa-miR-365
脂肪細胞：hsa-miR-130a

Claims (25)

  1. 　無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸の少なくとも１種を測定することを含む、培養細胞の評価方法。
  2. 　前記核酸がマイクロＲＮＡである請求項１記載の方法。
  3. 　配列表の配列番号１、３～５、７～１９、４１～４４に示される塩基配列からなるマイクロRNAの少なくとも１種を測定する請求項２記載の方法。
  4. 　配列表の配列番号１、３～５、７～１９に示される塩基配列からなるマイクロRNAの少なくとも１種を測定する請求項３記載の方法。
  5. 　前記細胞は哺乳動物由来細胞であり、前記無血清培地は、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを含む培地である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びに内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項５記載の方法。
  7. 　セロトニンレセプターに対する前記リガンドが、セロトニン、その塩及びセロトニンレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項５又は６記載の方法。
  8. 　幹細胞の分化を評価する方法である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　配列番号１、４１～４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標として幹細胞の分化を評価する請求項８記載の方法。
  10. 　配列番号１又は４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として骨細胞への分化を評価する請求項９記載の方法。
  11. 　配列番号１に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として骨細胞への分化を評価する請求項１０記載の方法。
  12. 　配列番号４１に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として脂肪細胞への分化を評価する請求項９記載の方法。
  13. 　配列番号４２に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として組織細胞への分化を評価する請求項９記載の方法。
  14. 　配列番号４３に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として幹細胞の分化の有無を評価する請求項９記載の方法。
  15. 　細胞障害を評価する方法である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　配列番号３～５に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標として培養細胞への障害を評価する請求項１５記載の方法。
  17. 　前記培養細胞が肝細胞である請求項１６記載の方法。
  18. 　培養細胞への化学物質・生物由来物質・環境刺激等による効果・影響・毒性等を評価する方法である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　がん細胞の有無を評価する方法である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　がん細胞の悪性度を評価する方法である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　配列番号７～１９に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標とする請求項１９又は２０記載の方法。
  22. 　前記がん細胞が大腸がん細胞である請求項２１記載の方法。
  23. 　無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸を測定することを含む、バイオマーカーのスクリーニング方法。
  24. 　配列表の配列番号１、３～５、７～１９、４１～４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を測定する請求項２３に記載の方法。
  25. 　配列表の配列番号１、３～５、７～１９に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を測定する請求項２４に記載の方法。
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