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一种利用miR-145为标志物的肝癌患者血清检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了属于分子生物医学技术领域的一种利用miR-145为标志物的肝癌患者血清检测试剂盒及方法。本发明设计miR-145特异性的引物，采用定量PCR的方法检测正常人血清、肝癌患者血清中miR-145的含量变化，含量显著降低为肝癌患者血清。本发明的方法简单，迅速，灵敏，适用于检测患者是否患有肝癌。

Description

一种利用miR-145为标志物的肝癌患者血清检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物医学技术领域，具体涉及一种利用循环miR-145作为肝癌血清标志物及其检测试剂盒。 
背景技术
肝癌是一种常见的恶性肿瘤，据报道，世界范围内每年新增肝细胞癌患者达到700,000以上。中国是全球肝癌发病率最高的国家，有统计显示，我国肝癌发病人数占全球55％，死亡人数占全球45％，列癌症死亡的第二位，而且发病率不断上升。肝细胞癌的早期发现、早期诊断、早期治疗对肝癌患者的预后和存活时间至关重要。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是迄今人类发现的第一个具有诊断价值的肿瘤标志物，在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生发展中扮演着重要的角色。但根据临床资料，约有30％～40％肝癌患者血清AFP阴性，而中国又是原发性肝细胞癌的高发国家，近年来报道的血清AFP阴性原发性肝细胞癌有增多趋势。这部分肝癌患者缺乏有效的肿瘤标志物用于预后判断与疗效评价。因此，新的肝癌血清标志物，尤其是AFP阴性肝细胞癌的血清标志物的检测具有重要的临床意义。 
microRNA(miRNA)是一类长约22nt的非编码小RNA分子，它们通过与靶基因3′UTR结合降解靶基因或者抑制翻译，在多种生理过程中发挥重要作用。研究表明，microRNA与癌症的发生发展有十分密切的关系。许多肿瘤患者血清中循环microRNA水平发生明显特异性变化，可以用作肿瘤检测生物标志物。肝癌的发生发展过程由多种复杂的调控通路参与，其中miRNA也参与了肝癌致病相关基因的转录后调控。近期越来越多的研究发现，miRNA能够参与到肝癌发生发展各个过程之中。 
本发明证实，miR-145在AFP为阴性的肝癌患者血浆中含量明显低于正常，这种特性能作为这种疾病的标志分子，用于临床诊断。进一步研究证实在肝癌细胞中miRNA-145能抑制人肝癌细胞的增殖、迁移作用。 
发明内容
本发明的目的在于提供miR-145作为肝癌血清分子标志物。 
本发明的目的在于提供一种检测miR-145表达量的引物。 
本发明的目的还在于提供一种肝癌血清检测试剂盒。 
本发明的目的还在于提供一种非诊断目的的肝癌血清检测方法。 
一种检测miR-145表达量的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2，SEQ ID No.3所示。 
一种肝癌血清检测试剂盒，所述试剂盒包含序列表中SEQ ID No.2，SEQ ID No.3所示的引物，标准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs，buffer，RNA酶抑制剂和灭菌水。 
所述标准样品为未经过处理的人血清样品中的RNA反转录成的cDNA。 
一种非诊断目的的肝癌血清检测方法，按照如下步骤进行： 
(1)提取待检样品的总RNA； 
(2)将步骤(1)得到的总RNA反转录为cDNA； 
(3)利用权利要求3或4所述的一种肝癌血清检测试剂盒，以步骤(2)得到的cDNA为模板，做定量PCR，检测样品中miR-145的表达量； 
(4)若待检样品的表达量显著高于标准样品的表达量，则该待检样品取自肝癌患者的生物样品。 
本发明的有益效果：本发明的方法简单，迅速，灵敏，适用于检测患者是否患有肝癌。 
附图说明
图1是定量PCR检测正常人血清与AFP为阴性的肝癌患者血清中miR-145含量的结果。 
图2是定量PCR检测人肝癌细胞中miR-145含量的结果。 
图3转染NC、si-VASN、miR-145 mimics与miR-145 inhibitor后，对人肝癌细胞株HepG2中VASN mRNA水平的影响。 
图4转染NC、si-VASN、miR-145 mimics与miR-145 inhibitor后，对人肝癌细胞株HepG2中VASN蛋白水平的影响。 
图5是MTT实验检测转染miR-145 mimics与miR-145 inhibitor后，对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响。 
图6是划痕实验检测转染miR-145 mimics与miR-145 inhibitor后，对人肝癌细胞株HepG2迁移的影响。 
图7是Transwell实验检测转染miR-145 mimics与miR-145 inhibitor后，对人肝癌细胞株HepG2迁移的影响。 
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。 
以下实施例未说明的实验步骤参照《分子克隆实验指南》第三版，或参照相应试剂盒的说明书。 
实施例1人血清样品中RNA的抽提 
(1)样品(正常人血清、肝癌患者血清)室温放置5分钟，从-80℃冰箱取出的样品室温放置15分钟至融化。 
(2)每250μl样品加750μl Trizol混匀，再加入250μl三氯甲烷，剧烈晃动15秒，室温静置3分钟。 
(3)4℃、12000g离心15分钟，上层为RNA 
(4)将上层水相约500μl转移到新EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀10秒，置于-20℃冰箱沉淀两小时或过夜。 
(5)取出样品，4℃12000g离心15分钟，倒掉上清加入1ml80％7醇(DEPC水配置)洗涤沉淀，上下翻转十次，使白色RNA沉淀浮起，4℃、7500g离心5分钟，共进行两次。 
(6)弃上清，吸尽管中液体，使乙醇挥发干净(约2-5分钟) 
(7)待RNA沉淀边缘开始变干透明时，立即加入DEPC水(20μl左右)。取1μl用于定量，其它RNA与-80℃保存备用。可加入1μl RNAase inhibiter防止RNA降解。 
实施例2反转录 
采用M-MLV Reverse Transcriptase[Promega#9PIM170]反转录试剂盒进行反转录。 
每个样品取1μg RNA分别和miR-145及U6的特异反转引物混合，70度水浴10分钟，冰上放置两分钟。然后每个样品分别加入buffer5μl，dNTP4μl，反转录酶1μl，RNAase inhibitor0.2μl。反转好的cDNA在-20度保存，避免反复冻融。 
实施例3定量-PCR 
按照实验分组，每个样品检测内参和miR-145的含量。PCR正向引物和反向引物如序列表中SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，每个实验组三个复孔，体系为20μl，仪器为Stratagene MxPro3000，SYBR Green mix为Promega公司产品。实验体系为：10μl2×SYBR Green mix，8μl水，1μl引物，1μl cDNA。PCR反应条件是95度5分钟，95度20秒，60度20秒，72度20秒，50个循环，溶解曲线为60度到95度，温度间隔为0.4度。 
PCR结果如图1-2所示，在AFP为阴性的肝癌患者中miR-145的拷贝数明显低于正常人血清中miR-145的拷贝数，并且这种变化与VASN的表达量呈负相关关系(图1)；在人肝癌细胞株HepG2中miR-145的拷贝数明显低于肝正常细胞株L02中miRNA-145的拷贝数(图2)。 
实施例4MTT实验 
以2×103个细胞/孔接种于96孔板；培养过夜后，待细胞密度达到40％时进行转染。37℃培养24h-72h，检测细胞数；每孔加入100μl培养基和20μl MTS的混合液，37℃孵育1h，酶联免疫检测仪490nm 读取吸光度值，绘制生长曲线。 
实施例5细胞划痕实验 
以5×105个细胞/孔接种于6孔板；培养过夜后待细胞密度达到40％时进行转染。37℃培养24h，使细胞浓度达到90％左右；用黄枪头在培养孔中轻划2-3条划痕，换新鲜培养基继续培养，每隔6h观察划痕愈合情况。 
实施例6细胞迁移实验 
以5×105个细胞/孔接种于6孔板；培养过夜待细胞密度达到40％时进行转染。37℃培养24h后换无血清培养基继续培养24h；消化细胞制备单细胞悬液，稀释为5×105个细胞/ml，每种细胞种3个小室，每个小室中加入100μl，在24孔板中加入500μl含10％FBS的培养基作为下液，将Transwell小室放入孔中，继续培养12-24h取出小室；用PBS擦去小室内表面上未穿膜的细胞，甲醛固定30min，结晶紫染色30min，与显微镜下观察。20×视野下细胞计数，共计数四个视野，取平均值。 

Claims (5)

1.miR-145作为肝癌血清分子标志物，其特征在于，所述核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
2.一种检测miR-145表达量的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2，SEQID No.3所示。
3.一种肝癌血清检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的引物，标准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs，buffer，RNA酶抑制剂和灭菌水。
4.根据权利要求3所述一种肝癌血清检测试剂盒，其特征在于，所述标准样品为未经过处理的人血清样品中的RNA反转录成的cDNA。
5.一种非诊断目的的肝癌血清检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)提取待检样品的总RNA；
(2)将步骤(1)得到的总RNA反转录为cDNA；
(3)利用权利要求3或4所述的一种肝癌血清检测试剂盒，以步骤(2)得到的cDNA为模板，做定量PCR，检测样品中miR-152的表达量；
(4)若待检样品的表达量显著高于标准样品的表达量，则该待检样品取自肝癌患者的生物样品。
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