CN103080334B

CN103080334B - 用于诊断早期结直肠癌及高级腺瘤的微rna生物标记及方法

Info

Publication number: CN103080334B
Application number: CN201180027693.8A
Authority: CN
Inventors: 吴莹; 朱虹光; 王漱阳; 娜依玛; 李健
Original assignee: Fudan University
Current assignee: SHANGHAI LABWAY CLINICAL LABORATORY Co.,Ltd.
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2011-06-02
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2031-06-02
Also published as: WO2011150855A1; CN103080334A

Abstract

本发明提供了用于鉴别展现早期结直肠癌或高级腺瘤的一或多种哺乳动物靶细胞的诊断试剂盒。所述试剂盒包含编码miRNA序列的多种核酸分子，其中所述核酸分子在靶细胞中和在对照细胞中差异表达，且所述核酸分子一起代表核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是鉴别早期结直肠癌和高级腺瘤的指征。本发明还提供了通过使用所述核酸分子来鉴别展现出早期结直肠癌和高级腺瘤的一或多种哺乳动物靶细胞的方法。还公开了用于预防和/或治疗早期结直肠癌或高级腺瘤的方法和药物组合物。

Description

用于诊断早期结直肠癌及高级腺瘤的微RNA生物标记及方法

技术领域

本发明涉及用于在结直肠外科手术组织和活组织检查组织中，可靠地诊断早期结直肠癌或高级腺瘤的经验证的微RNA生物标记及相应的方法。尤其是区分早期结直肠癌和高级腺瘤。早期结直肠癌是Dukes’A癌。高级腺瘤是高级上皮内瘤。

背景技术

大多数癌源于表皮，并且通过多步骤转变形成：从正常细胞转化为不典型增生，最后恶变成为肿瘤细胞，后者侵袭周围组织并具有转移能力。结直肠癌(CRC,也称为结肠癌或大肠癌)是一种经历这种肿瘤发展的主要癌症类型。

CRC包括在生长在结肠、直肠和阑尾中的肿瘤。结直肠癌是最有影响的人类癌症，在2009年全世界约有1.067.000个新发病例。它是世界上第3大常见癌症及第4大导致死亡的癌症(综述参见例如Gryfe,R.etal.(1997)Curr.Probl.Cancer21,233-300;Petersen,G.M.etal.(1999)Cancer86,2540-2550)。如果在大肠癌早期阶段被诊断出来，结直肠癌是可治愈的。在这一早期阶段，大多数患者没有症状。而早期检测可以显著提高生存率。

最初，结直肠癌的特征是结肠中发生异性增生(不典型增生)上皮，所谓异性增生上皮是指首先转变为炎性腺瘤样息肉，然后转变为腺瘤，腺瘤是在结肠或直肠的上皮中的异常赘生物(即良性肿瘤)。通常所形成的腺瘤中仅有较小的亚组(到60岁时发生率为60-70%)发展为恶性腺癌。超过95%的结直肠癌病例表现为腺癌(Muto,T.etal.(1975)Cancer36,2251-2270;Fearon,E.R.andVogelstein,B.(1990)Cell61,759-767)。

世界卫生组织的肿瘤分类中表明，高级上腺瘤与癌在形态学上非常相似，唯一的区别是这两种损伤是否浸润间质(StanleyRetal.(2003)IARCPress103-142)。在临床实践中，大肠活组织检查时由于肠壁较薄，不可能取材太深，往往不能获得黏膜肌层下的组织，而无法判断肿瘤是否存在浸润。临床手术时对高级别上皮内瘤与浸润癌的处理有很大的差别，特别是直肠肿瘤：高级别上皮内瘤一般不需要切除肛门，而浸润癌则往往需要切除肛门。所以当反复活组织检查后仍然得到直肠活组织检查诊断为高级别上皮内瘤时，采取何种手术方式对于外科医生来说是一个两难的选择。由于上述原因，通过寻找分子标记物而在活组织检查组织中鉴别结直肠肿瘤中的高级别上皮内瘤和癌，尤其是早期浸润癌，有着非常重要的现实意义和迫切需要。

分子学研究表明结肠癌发生的病因学来自于多种表观遗传学和遗传学改变的累积，这些改变包括K-ras原癌基因突变的激活、APC及p53抑癌基因和DNA修复基因的突变失活等(综述参见，例如，Forrester,K.etal.(1987)Nature327,298-303;Baker,S.J.etal.(1989)Science244,217-221)。

基因组不稳定性是从腺瘤发展为腺癌的另一种关键步骤并且在结直肠癌中存在两条途径(Lengauer,C.etal.(1997)Nature386,623-627)。导致微卫星不稳定性的DNA错配修复缺陷仅解释大约15%病例由腺瘤发展为腺癌(Umar,A.etal.(2004)J.Natl.CancerInst.96,261-268;diPietro,M.etal.(2005)Gastroenterology129,1047-1059)。在其它的85%的腺癌中，基因组不稳定性在染色体水平发生(CIN)，导致非整倍体状态。在结直肠癌中报道的染色体畸变有7pq、8q、13q、20q的获得以及4pq、5q、8p、15q、17p和18q的丢失(Douglas,E.J.etal.(2004)CancerRes.64,4817-4825)。

然而，尽管cDNA微阵列分析揭示了一系列差异表达的基因明显参与CRC的发生发展(Kitahara,O.etal.(2001)CancerRes.61,3544-3549)，但是目前尚未发现可以用于可靠的诊断CRC，尤其是肠腺癌，和/或良性腺瘤向这种恶性肿瘤发展的特异性分子标记物。(Kitahara,O.etal.(2001)CancerRes.61,3544-3549)。

这些分子标记物的鉴别在临床中非常重要，特别是如果这些标记能够诊断早期肿瘤并接受早期治疗，则可避免不必要的外科手术。理想的状态是，由原位技术或生物活组织检查样品或切除物的显微镜分析尚不能检测到恶性细胞的存在时，这些标记物已经可以鉴别癌症了。

许多诊断测定通常仅仅分析单个分子标记物，这可能影响检测的可靠性和/或准确性。另外，单个标记物通常不能进行有关潜伏期、肿瘤发展等的详细预测。因此，仍然需要其它的分子标记物和测定模式以克服这些限制。

微RNA(miRNA)，有调节作用的小RNA，可能是解决这一问题的途径。它们是一类进化保守的内源性表达的非编码小RNA，大小为20-25个核苷酸(nt)，可以介导靶mRNA的表达。因此自从它们在大约10年前被发现就被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中有重要功能。

miRNA是从初级转录物产生的，初级转录物被RNaseIIIDrosha加工为茎-环结构的前体(pre-miRNA)。在转运到细胞质后，另一种称为Dicer的RNaseIII酶将pre-miRNA的发夹结构切割掉，并形成短的双链(ds)RNA，其中一条链作为成熟miRNA掺入miRNA-蛋白质(miRNP)中。miRNA指导miRNP到达它们的靶mRNA，以发挥它们的功能(综述参见例如Bartel,D.P.(2004)Cell23,281-292;He,L.andHannon,G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5,522-531)。

根据miRNA与其靶之间的互补性程度，miRNA可以指导不同的调节过程。与miRNA高度互补的靶mRNA被与RNA干扰(RNAi)相同的机制特异性降解。因此，在这种情况中，miRNA的功能是小干扰RNA(siRNA)。与miRNA互补性较低的靶mRNA要么被导入细胞降解途径要么被翻译阻遏而不影响mRNA水平。但是，miRNA如何阻遏它们的靶mRNA的翻译的机制尚有争论。

可获得的现有数据表明miRNA表达的调节异常(dysregulation)可能与某些类型的癌症的发生和/或发展相关。例如，已表明两种miRNA，miR-15及miR-16-1,定位于在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的基因座上，并且发现在大约70%的CLL患者中，两种miRNA基因的表达缺失或下调。另外，在结直肠赘生物中观察到miR-143及miR-145的表达下调，而miRNAlet-7的表达在肺癌中经常表现为表达降低(Michael,M.Z.etal.(2003)Mol.CancerRes.1,882-891;Mayr,C.etal.(2007)Science315,1576-1579)。

事实上，基于miRNA表达中的癌症相关改变和miRNA通常位于癌症相关基因组区域的观察，推测miRNA可能既作为抑癌基因，也作为癌基因(综述参见例如Esquela-Kerscher,A.andSlack,F.J(2006)Nat.Rev.Cancer6,259-269;Calin,G.A.andCroce,C.M.(2007)J.Clin.Invest.117,2059-2066;Blenkiron,C.andMiska,E.A.(2007)Hum.Mol.Genet.16,R106-R113)。

因此，仍需要(一组)诊断标记，特别是“表达特征”或“分子足迹”形式的诊断标记，以使得鉴别结直肠癌和腺瘤更快速、可靠和节省费用。另外，还持续需要相应的方法以鉴别和治疗展示这种癌表型的靶细胞。

发明目的和发明概述

本发明的目的是提供在结直肠外科手术组织和活组织检查组织中，可靠地诊断早期结直肠癌或高级腺瘤的经验证的微RNA生物标记及相应的方法。尤其是区别早期结直肠癌和高级腺瘤。具体而言，通过确定多种核酸分子来诊断早期结直肠癌或高级腺瘤，每种核酸分子编码微RNA(miRNA)序列，其中所述多种核酸分子中的一或多种在所分析的靶细胞中与在对照细胞中相比差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，该核酸表达生物标记是鉴别早期结直肠癌和高级腺瘤的指征。

更具体地，本发明的一个目的是提供用于可靠地诊断早期结直肠癌或高级腺瘤的经验证的miRNA生物标记。尤其是区分Dukes’A腺癌和高级腺瘤。此外，本发明的目的还在于提供用于可靠地诊断早期结直肠癌或高级腺瘤的方法。尤其是鉴别Dukes’A腺癌和高级腺瘤。

早期结直肠癌表现为Dukes’A腺癌。高级腺瘤变现为高级别上皮内瘤。

这些及其它目的从以下描述而变得明了，它们由独立权利要求的主题实现。本发明的一些优选实施方案由从属权利要求的主题限定。

在第一方面，本发明涉及miRNA生物标记的诊断试剂盒，其用于鉴别展现出早期结直肠癌或高级腺瘤的一或多种哺乳动物细胞，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子中的一或多种在靶细胞和在一或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达标记(signature)，该核酸表达标记是存在早期结直肠癌或高级腺瘤的指征。

优选的，早期结直肠癌是Dukes’A腺癌，高级腺瘤是高级别上皮内瘤。

在其它特异的实施方案中，所述核酸表达生物标记包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被上调，以及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被下调。

本文所述的核酸表达生物标记可包括至少三种核酸分子，优选地至少六种核酸分子。

优选的，所述核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-375,hsa-miR-92a及hsa-miR-99a的任意一种或多种核酸分子。

更优选的，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-92a及hsa-miR-99a的任意一种或多种核酸分子的表达上调，hsa-miR-375的表达被下调。

在特别优选的实施方案中，所述核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-92a/hsa-miR-375和hsa-miR-99a/hsa-miR-375的任意一种或多种核酸组合。

更优选的，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-92a/hsa-miR-375和hsa-miR-99a/hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子组合的表达被上调。

在优选的实施方案中，所述核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-125b,hsa-miR-375,hsa-miR-424,hsa-miR-92a,hsa-miR-99a和hsa-miR-7核酸分子。

更优选的，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-125b,hsa-miR-424,hsa-miR-92a,hsa-miR-99a和hsa-miR-7的任意一种或多种核酸分子的表达被上调，而hsa-miR-375的表达被下调。

在另外的特别优选的实施方案中，所述核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-125b/hsa-miR-375,hsa-miR-424/hsa-miR-375,hsa-miR-92a/hsa-miR-375,hsa-miR-99a/hsa-miR-375和hsa-miR-7/hsa-miR-375的任意一种或多种核酸组合。

更优选的，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-125b/hsa-miR-375,hsa-miR-424/hsa-miR-375,hsa-miR-92a/hsa-miR-375,hsa-miR-99a/hsa-miR-375和hsa-miR-7/hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子组合的表达被上调。

在第二方面中，本发明涉及一种用于鉴别展现早期结直肠癌或高级腺瘤的一或多种哺乳动物靶细胞的方法，所述方法包括：(a)从患者收集活组织检查组织或外壳手术组织；(b)在载玻片上制备组织切片；(c)将至少一种编码微RNA序列的核酸分子与载玻片上的切片杂交；(d)在显微镜下或者用数字病理学方案对miRNA表达进行定量；(e)在一或多种靶细胞中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子均编码微RNA序列；(f)在一或多种对照细胞中确定所述多种核酸分子的表达水平；(g)通过对比在步骤(e)和(f)中获得的各自表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在靶细胞和对照细胞中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，如权利要求1-8任一项所定义的，其是存在早期结直肠癌或高级腺瘤的指征。

特别是，所述方法优选用原位杂交的来展示。

为了定量测定，使用六个已经验证的miRNA生物标记：hsa-miR-125b,hsa-miR-375,hsa-miR-424,hsa-miR-92a,hsa-miR-99a和hsa-miR-7。

为了对核酸分子标记物编码的微RNA序列进行表达量的标准化，最好使用hsa-miR-423-5p核酸分子，它在结直肠组织中的表达最为稳定。为了对核酸分子标记物编码的微RNA序列进行表达量的阴性对照，最好使用hsa-miR-122核酸分子，它在结直肠组织中无表达。

在第三方面，本发明涉及在一或多种哺乳动物靶细胞中预防或治疗优选表现为腺癌的结肠直肠癌的方法，所述方法包括：(a)通过使用权利要求1-8的方法在一或多种靶细胞中鉴别核酸表达生物标记；及(b)在所述一或多种细胞中修饰核酸表达标记中包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，其中所述修饰是以如下方式进行：其表达在所述一或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在所述一或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。

在第四方面，本发明涉及用于预防和/或治疗一或多种哺乳动物靶细胞中优选表现为腺癌的结肠直肠癌的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，

所述序列与如权利要求1-8任一项所定义的在一或多种靶细胞中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于在一或多种靶细胞中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。

最后移方面，本发明涉及所述药物组合物在生产用于预防和/或治疗结肠直肠癌的药物中的用途，其中所述结肠直肠癌优选表现为腺癌。

本发明的其它实施方案从以下详细描述变得明了。

附图说明

图1描绘了流程图，示意性示出用于确定本发明的表达特征的五个方面的关键方法步骤，所述表达特征用于鉴别早期结直肠癌或高级腺瘤的一或多种靶细胞。尤其是用原位杂交的方法鉴别早期结直肠癌或高级腺瘤。

图2展示了本发明中第一方面所述的人类微RNA生物标记在手术切除冰冻组织中Dukes’A腺癌或高级腺瘤的在一个或多个细胞中的表达。同时，指出了在与高级腺瘤相比时Dukes’A腺癌中，这些微RNA的表达水平与准确度（比如，表达上调或表达下调）。数据显示，在手术切除冰冻组织中，早期腺癌和高级腺瘤可以区分开。

图3A展示了本发明中第一方面所述的人类微RNA生物标记在手术切除石蜡组织中Dukes’A腺癌或高级腺瘤的在一个或多个细胞中的表达。同时，指出了在与高级腺瘤相比时Dukes’A腺癌中，这些微RNA的表达水平与准确度（比如，表达上调或表达下调）。数据显示，在手术切除石蜡组织中，早期腺癌和高级腺瘤可以区分开。

图3B描绘了本发明中第一方面所述的两个人类微RNA生物标记组合（hsa-miR-92a/hsa-miR-375和hsa-miR-99a/hsa-miR-375)在手术切除石蜡组织中Dukes’A腺癌或高级腺瘤的在一个或多个细胞中的ROC曲线分析结果。数据显示，在手术切除石蜡组织中，早期腺癌和高级腺瘤可以区分开。

图4展示了本发明中第一方面所述的人类微RNA生物标记在肠镜活组织检查石蜡组织中Dukes’A腺癌或高级腺瘤的在一个或多个细胞中的表达。同时，指出了在与高级腺瘤相比时Dukes’A腺癌中，这些微RNA的表达水平与准确度（比如，表达上调或表达下调）。数据显示，在肠镜活组织检查石蜡组织中，早期腺癌和高级腺瘤可以区分开。

发明详述

本发明基于如下出乎意料的发现，即早期结直肠癌优先为腺癌和高级腺瘤可以基于特定的miRNA表达特征以高精确性和高灵敏性被可靠地鉴别，其中本文所述表达特征通常包括被上调和下调的人类miRNA。更具体地，所述miRNA表达特征通过分析特定miRNA表达和/或多个miRNA的表达组合-可以诊断早期结直肠癌和高级腺瘤，尤其可以区分早期结直肠癌和高级腺瘤。

早期结直肠癌表示Dukes’A腺癌，高级腺瘤表示高级别上皮内瘤。

以下例证的本发明可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多种元件、一或多种限制的条件下实施。本发明将根据特定的实施方案参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。

当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案，这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。

当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”时，包括该名词的复数形式，除非特别指出。

术语“大约”在本发明中是指本领域技术人员理解仍能保证目的特征的技术效果的精确性区间。该术语通常表示偏离指示值的±10%，优选±5%。

另外，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在说明书和权利要求书中用于区分类似的元件，不是必须描述顺序或时间次序。应理解如此应用的术语在合适情况下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本文所述或例证的其它顺序操作。

术语的进一步定义在下文中使用术语时给出。

以下术语或定义仅为了理解本发明。这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。

本发明的研究目的是提供用于结直肠癌手术切除及肠镜活组织检查组织，可靠地诊断早期结直肠癌或高级腺瘤的微RNA生物标记及检测方法。尤其是区分早期结直肠癌和高级腺瘤。与健康对照细胞相比，每种核酸分子编码微RNA(miRNA)序列在其中所述多种核酸分子中的一或多种在所分析的靶细胞中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表这样的核酸表达生物标记(signature)，该核酸表达生物标记是鉴别早期结直肠癌和高级腺瘤的指征。

本文所用术语“结肠直肠”涉及结肠、直肠和/或阑尾，即完整的大肠。

本文所用术语“癌症”(也称为“癌”)通常指任何类型的恶性赘生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征的倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重编程(geneticre-programming))。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态中的变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。因此，术语“结直肠癌”是指在结肠、直肠和阑尾中的癌性生长。

优选地，结直肠癌表现为腺癌。

最常见的结肠直肠癌(CRC)细胞类型是腺癌，其占大约95%的病例。其它类型的CRC包括淋巴瘤和鳞状细胞癌等。

本文所用术语“腺癌”涉及结肠直肠粘膜的恶性赘生物。通常，腺癌是源自腺组织的癌症类型。这一组织是已知为上皮组织的更常见组织类型的一部分。上皮组织包括皮肤、腺体和位于机体腔和器官的内衬层(lining)/周围的各种其它组织。

胚胎学上，上皮源自外胚层、内胚层和中胚层。为了被分类为腺癌，细胞不必须是腺体的一部分，只要它们具有分泌性质即可。因此，腺癌通常也称作“腺体癌(glandularcancer)"或"腺状癌(glandularcarcinoma)"。高度分化的腺癌倾向于与它们所来源的腺体组织相象，而分化差的则可能不是这样。

在结肠中出现异型增生上皮是癌发展的第一步。这中发育异常表皮转变为炎性腺瘤样息肉，随后转变为腺瘤，腺瘤是在结肠或直肠的内层中的异常但良性的赘生物(即肿瘤)。因此，本文所用术语“腺瘤”涉及良性上皮赘生物。腺瘤通常是边界清楚的并可以是扁平的或息肉样的。良性腺瘤的赘生物细胞不浸润或侵袭相邻组织并且极少转移。术语“腺瘤”应理解为等价于“非进展性腺瘤”。但是恶性腺癌侵袭其它组织并在时间足够时经常转移。恶性细胞的特征经常是进展性和不受控的生长。它们可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到机体的其它部分。具体地，肝转移(即在肝中的转移)常被发现与腺癌相关。这种转移的发生可被认为是结直肠癌的晚期(或甚至是癌症后期(post-cancerousstage))。

本文所用术语“进展型腺瘤(progressedadenoma)”是指携带癌症病灶的腺瘤。这也称作“恶性息肉”。结直肠腺瘤在老年人群中常见，但仅少部分这些前恶性肿瘤(估计约5%)发展为恶性肿瘤。这种恶性肿瘤在本文中称作(结肠直肠)“腺癌”。

腺癌可根据Dukes系统分类(Dukes,C.E.(1932)J.Pathol.Bacteriol.35,323-325)，其区分如下阶段：Dukes’A–限于粘膜下的肿瘤；DukesB’–侵袭限于肠壁的肿瘤；Dukes’C–还累及淋巴结的肿瘤；Dukes’D–具有远处转移的肿瘤。

本发明中采用的哺乳动物靶细胞可以是人或非人类来源的。本发明通常用人类细胞进行。本文所用术语“一或多种细胞”应被理解为不仅包括个体细胞，也包括组织、器官和生物体。本文所用术语“靶细胞”是指被至少认定是显示或具有发生结肠直肠癌倾向的细胞，其中术语“对照细胞”通常是指不具有这种癌性表型的特征的(健康)野生型细胞。但是在一些应用中，例如当比较显示不同癌或癌前状态的细胞时，具有不太严重疾病特征的细胞通常被认为是“对照细胞”。

通常，所用的靶细胞和对照细胞衍生自从待被诊断是否存在结直肠癌或具有发生结肠直肠癌倾向的对象中收集的生物学样品。另外，为了确证数据，“比较样品”也可以从患有给定的已知疾病状态的对象中收集。生物学样品可包括身体组织和液体，如血液、痰和尿。另外，生物学样品可含有衍生自以下细胞的细胞提取物或含有以下细胞的细胞群：上皮细胞，优选癌性上皮细胞或衍生自疑为癌性的组织的上皮细胞。还更优选的是，生物学样品包含衍生自腺组织的细胞群。另外，如果需要，细胞可以从获得的身体组织和液体中纯化，然后用作生物学样品。根据本发明，本发明的核酸标记的表达水平在对象衍生的生物学样品中确定。

用于在本发明的体外方法中检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，优选以核酸(特别是RNA)或蛋白质被保护的方式收集。待分析的样品通常是结肠直肠活组织检查样品或切除物。来自肿瘤组织的完整细胞或细胞裂解物也可以不经介入而从结肠脱落，并最终在粪便中。因此，大便样品也被认为是分离RNA的合适来源。另外，结直肠腺癌细胞可迁移进其它组织。因此，血液及其它类型样品也可以使用。活组织检查样品或切除物可含有大部分腺瘤细胞和仅少部分腺癌细胞。为增加信号/背景比，切除物可以在分析之前分成不同的亚样品(例如，通过激光捕获显微切割)。即使活组织检查样品或切除物中的癌细胞总数有限，至少一个亚样品可含有增加的腺癌对腺瘤细胞比率。样品特别在最初加工之后可以合并。但是也可以使用未合并的样品。

本文所用术语“微RNA”(或“miRNA”)具有其在本领域的普通含义(综述参见例如Bartel,D.P.(2004)Cell23,281-292;He,L.andHannon,G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5,522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因组基因座的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。

miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在不完美RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，其作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工通常通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异的内切核酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生通常折叠成发夹或茎-环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。从这一miRNA前体，通过Dicer切割miRNA双链体，其在发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，在另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。miRNA然后被导向其靶mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA通常衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。

本文所用术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指从其加工出成熟miRNA的miRNA初级转录物部分。通常，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构通常长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(计数miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段，但排除更远的序列)。

本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码微RNA(miRNA)的任何核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA，也指如上所述的各种前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码微RNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的微RNA序列的核酸分子通常编码单个miRNA序列(即个体miRNA)。但是，也可能这种核酸分子编码两个或多种miRNA序列(即两个或多种miRNA)，例如转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多种miRNA序列。

本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5'→3')匹配或相应于所编码的miRNA(5'→3')序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5'→3')序列或者换句话说匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3'→5')的分子)。本文所用术语“互补于”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。

在本发明范围内，两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两个分子包含一或多种碱基错配或者它们的核苷酸总数不同(由于添加或缺失导致)。优选地，“互补”核酸分子包含显示与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列完全互补的至少10个连续核苷酸。

因此，包含在本发明的诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多种核酸分子可包括一或多种“有义核酸分子”和/或一或多种“反义核酸分子”。有时，诊断试剂盒包括一或多种“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标记)的全体或至少一个亚集合，是存在特定疾病或发生特定疾病的倾向的指征，所述特定疾病在本文中是结肠直肠癌，优选表现为腺癌的结肠直肠癌。另一方面，当诊断试剂盒包括一或多种“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一或多种特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)等。

在本发明中定义的多种核酸分子可以包含至少2个、至少10个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个、至少1000个、至少10000个或至少100000个核酸分子，每个分子均编码miRNA序列。

本文所用术语“差异表达”是指特定miRNA在靶细胞中的表达水平相比于健康对照细胞被改变，其可以是上调(即在靶细胞中增加的miRNA浓度)或下调(即在靶细胞中降低的或消失的miRNA浓度)。换句话说，核酸分子在靶细胞中被激活至比在对照细胞中更高或更低的水平。

在本发明范围内，在以下情况中核酸分子被认为是差异表达的，即该核酸分子在靶细胞和对照细胞中的相应表达水平通常相差至少5%或至少10%，优选地至少20%或至少25%，最优选地至少30%或至少50%。因此，后者的值相应于给定核酸分子在靶细胞中的表达水平相比于野生型对照细胞上调至少1.3倍或至少1.5倍，或者反之在靶细胞中的表达水平下调至少0.7倍或至少0.5倍。

本文所用术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一或多种被分析细胞中的浓度。

如上所述，术语“对照细胞”通常是指不具有CRC表型特征的(健康的)野生型细胞。但是，在一些应用中，例如，当比较显示不同的癌或癌前状态的细胞时，具有较不严重疾病特征的细胞通常被认为是“对照细胞”。

表达水平的确定通常遵循本领域熟知的已建立的标准程序(综述参见例如Sambrook,J.etal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual.2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY；Ausubel,F.M.etal.(2001)CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley&Sons,Hoboken,NJ)。确定可以使用例如miRNA特异性探针进行Northern印迹分析在RNA水平进行，或者在逆转录(及克隆)RNA群后用例如定量PCR或实时PCR技术在DNA水平进行。本文所用术语“确定”包括分析编码上述微RNA序列的任何核酸分子。但是，由于pri-miRNA及前-mRNA半寿期短，通常仅测量成熟miRNA的浓度。

在具体的实施方案中，在给定样品的若干独立测量(例如两个、三个、五个或十个测量)和/或在一群靶细胞或对照细胞内的若干测量中获得的表达水平标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。

所获得的一或多种靶细胞和一或多种对照细胞的表达水平之间的差异可以标准化至进一步的对照核酸例如管家基因的表达水平，管家基因的表达水平已知不根据细胞的疾病状态而不同。举例的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1等。

在优选的实施方案中，用于标准化所获得的表达水平的对照核酸是已知在细胞的各种非癌和癌(前)状态中稳定表达的另一种miRNA。

但是，代替在任何实验中确定一或多种对照细胞的表达水平，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定细胞表型(即疾病状态)的一或多个截断值。在这种情况中，一或多种靶细胞的相应表达水平可以用用于标准化的稳定表达的对照miRNA确定。如果计算的“标准化”表达水平高于相应的定义的截断值，则这一发现是基因表达上调的指征。反之，如果计算的“标准化”的表达水平低于相应的定义的截断值，则这一发现是基因表达下调的指征。

在本发明中，术语“鉴别早期结直肠癌或高级腺瘤的一或多种哺乳动物靶细胞”也包括预测和可能性分析(“诊断”意义上)。本文公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性介入，诊断标准如疾病阶段，和疾病监控和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病。或者，本发明可用于检测对象衍生的组织中的癌细胞，并提供有用信息给医生以诊断出该对象患有该疾病。

在本发明中，所鉴别的一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，该核酸表达生物标记是在靶细胞中存在结肠直肠癌或发生结肠直肠癌倾向的指征。本文所用术语“表达特征”是指核酸分子(例如miRNA)的集合，其中各个核酸分子的表达水平在(癌性)靶细胞和(非癌性)对照细胞之间不同。本文中，核酸表达生物标记也指标记的集合并代表最低数目的(不同)核酸分子，每个都编码能用于鉴别靶细胞的表型状态的miRNA序列。

在本发明的第一方面中所涉及关于微RNA生物标记诊断试剂盒鉴别早期结直肠癌或高级腺瘤的一或多种哺乳动物靶细胞。与健康对照细胞相比，每种核酸分子编码微RNA(miRNA)序列在其中所述多种核酸分子中的一或多种在所分析的靶细胞中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表这样的核酸表达生物标记(signature)，该核酸表达生物标记是鉴别早期结直肠癌和高级腺瘤的指征。

在进一步优选的实施方案中，核酸表达生物标记包含至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被上调(即其浓度增加)，以及包含至少一种编码miRNA序列的核酸分子，其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被下调(即其浓度降低)。

通常，包含在核酸表达生物标记中的核酸分子是人类序列(以后称为“hsa”(人(Homosapiens)))。

在特异的实施方案中，核酸表达生物标记包含至少三个核酸分子，每个编码(不同的)miRNA序列。优选地，核酸表达生物标记包含至少六个(不同的)核酸分子。

在本发明的优选的实施方案中，诊断试剂盒的核酸表达生物标记包含任何一或多种人类靶细胞衍生的核酸分子，所述核酸分子编码选自如下一组的微RNA序列：hsa-miR-375(SEQIDNO:2),hsa-miR-92a(SEQIDNO:1)和hsa-miR-99a(SEQIDNO:5)。

为了标准化包含在所述核酸表达生物标记中的编码微RNA序列的核酸分子的所获得的表达水平，可优选使用miRNAhsa-miR-423-5p(SEQIDNO:17)，其在结肠直肠组织中稳定表达。为了对核酸分子标记物编码的微RNA序列进行表达量的阴性对照，可优选应用hsa-miR-122(SEQIDNO:8)，其在结直肠组织中无表达。

上述miRNA的核酸序列列于表1。

表1

miRNA	序列(5'→3')
		生物标记
hsa-miR-92a	uauugcacuugucccggccugu
		hsa-miR-375	uuuguucguucggcucgcguga
hsa-miR-99a	aacccguagauccgaucuugug
		对照
hsa-miR-423-5p	ugaggggcagagagcgagacuuu
		hsa-miR-122	uggagugugacaaugguguuug

本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/;也参见Griffiths-JonesS.etal.(2008)Nucl.AcidsRes.36,D154-D158)。

优选的，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-92a及hsa-miR-99a的核酸分子的表达上调，hsa-miR-375的核酸分子的表达下调。

如本文所用，术语“多种核酸分子中的一或多种”及“任何一或多种人靶细胞衍生的核酸分子”可涉及本文所述核酸表达生物标记中包含的多种核酸分子的任何亚群，例如任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种、任九种、任十种等核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA序列。

在本发明优选的实施方案中，所述核酸表达生物标记包含编码组合hsa-miR-92a(SEQIDNO:1)/hsa-miR-375(SEQIDNO:2)和hsa-miR-99a(SEQIDNO:5)/hsa-miR-375(SEQIDNO:2)的核酸分子。

如本文所用，术语“编码组合”是指共同使用至少两个核酸编码的表达水平。优选的共同使用相对变量或通过公式所得的计算结果。在本发明的其它优选实施方案中，所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-125b(SEQIDNO:3),hsa-miR-375(SEQIDNO:2),hsa-miR-424(SEQIDNO:4),hsa-miR-92a(SEQIDNO:1),hsa-miR-99a(SEQIDNO:5)和hsa-miR-7(SEQIDNO:6).

上述miRNA的核酸序列列于表2。

表2

miRNA	序列(5'→3')
		生物标记
hsa-miR-92a	uauugcacuugucccggccugu
		hsa-miR-375	uuuguucguucggcucgcguga
hsa-miR-125b	ucccugagacccuaacuuguga
		hsa-miR-424	cagcagcaauucauguuuugaa
hsa-miR-99a	aacccguagauccgaucuugug
		hsa-miR-7	uggaagacuagugauuuuguugu
对照
		hsa-miR-423-5p	ugaggggcagagagcgagacuuu
hsa-miR-122	uggagugugacaaugguguuug

更优选的，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-125b,hsa-miR-424,hsa-miR-92a,hsa-miR-99a和hsa-miR-7的核酸分子的表达上调，hsa-miR-375的核酸分子的表达被下调。

在另外的特别优选的实施方案中，所述核酸表达生物标记包括编码组合hsa-miR-125b(SEQIDNO:3)/hsa-miR-375(SEQIDNO:2),hsa-miR-424(SEQIDNO:4)/hsa-miR-375(SEQIDNO:2),hsa-miR-92a(SEQIDNO:1)/hsa-miR-375(SEQIDNO:2),hsa-miR-99a(SEQIDNO:5)/hsa-miR-375(SEQIDNO:2)和hsa-miR-7(SEQIDNO:6)/hsa-miR-375(SEQIDNO:2)。

第二方面，本发明涉及诊断早期结直肠癌或高级腺瘤的一或多种哺乳动物靶细胞的方法，所述方法包括：

(a)采集病人的活组织检查组织或手术切除组织；

(b)切片、制片；

(c)在切片上杂交至少一个编码微RNA序列的核酸分子；

(d)在显微镜下对微RNA的表达进行半定量，或用数字化图像进行定量分析；

(e)确定一或多种靶细胞中多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子均编码一种微RNA序列；

(f)确定一或多种对照细胞中所述多种核酸分子的表达水平；

(g)通过对比在步骤(e)和(f)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴定出在靶细胞和对照细胞中差异表达的一或多种核酸分子，即可用于诊断早期结直肠癌或高级腺瘤。

本发明包括了所验证的生物标记和原位杂交技术。该方法确定并比较获得了具有鉴定出在靶细胞和对照细胞中差异表达的一或多种核酸分子的核酸表达生物标记，所述核酸表达生物标记是诊断早期结直肠癌或高级腺瘤的指征。比如，典型的野生型细胞不具有肿瘤表型的特征。

在定量测定中，用到了表2中所示的6个已验证的微RNA生物标记，即hsa-miR-125b(SEQIDNO:3),hsa-miR-375(SEQIDNO:2),hsa-miR-424(SEQIDNO:4),hsa-miR-92a(SEQIDNO:1),hsa-miR-99a(SEQIDNO:5)andhsa-miR-7(SEQIDNO:6)。

原位杂交技术是将特定核酸序列在组织切片上进行染色体、细胞或组织的检测。与免疫细胞化学相结合后，原位杂交可以得到DNA、mRNA和蛋白水平的基因活化微观拓扑信息。目前有两种非放射性的杂交方法：直接法和间接法。直接法是用荧光或其他荧光染料直接与被测序列杂交(Baumann,J.G.J.etal.((1980)Exp.CellRes.138,485–490).间接法是用地高辛（用特异抗体检测）和生物素（用链酶检测）(Leary，J.Letal(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80,4045–4049)。

第三方面，本发明涉及在一或多种哺乳动物靶细胞中预防或治疗结肠直肠癌、优选表现为腺癌的方法，所述方法包括：

(a)通过使用如本文所述方法在一或多种靶细胞中鉴别核酸表达生物标记；及

(b)修饰所述一或多种细胞中核酸表达生物标记中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，由此其表达在所述一或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调，且其表达在所述一或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。

如本文所用，术语“修饰编码miRNA序列的核酸分子的表达”是指导致所述分子的表达水平改变的对特定核酸分子的任何操纵，即与“野生型”(即未修饰的对照)核酸分子的表达相比产生不同量的相应miRNA。如本文所用，术语“不同量”包括与未修饰的对照相比较高的量以及较低的量。换句话说，如本文所定义的操纵可以是上调(即激活)或下调(即抑制)核酸分子的表达(即特别是转录)。

在本发明中，编码核酸表达生物标记中所包含的微RNA序列的一或多种核酸分子的表达以这样的方式被修饰，由此其表达在所述一或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调，且其表达在所述一或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。换句话说，编码miRNA序列的特定核酸分子的表达的修饰以所述分子在所述一或多种癌性靶细胞中的调节作用的反循环(anti-cyclical)方式发生，以在所述一或多种靶细胞中干扰被上调的分子的“过度活性”和/或恢复被下调的分子的“缺陷活性”。

在本发明方法的一个优选实施方案中，下调核酸分子的表达包括将编码与被下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的序列的核酸分子导入一或多种靶细胞中。

如本文所用，术语“导入细胞中”是指允许一或多种核酸分子转移进入细胞中的任何处理。这种技术的例子包括本领域熟知的转染或转导技术(综述参见例如Sambrook,J.etal.(1989)Molecular,Cloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY；Ausubel,F.M.etal.(2001)CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley&Sons,Hoboken,NJ)。

如本文所用，术语“互补序列”是指导入一或多种细胞中的“互补的”核酸分子(本文也称作“反义核酸分子”)能与上调的内源“有义”核酸分子形成碱基对，优选Watson-Crick碱基对。

两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以是完全互补的，即其不含有任何碱基错配和/或添加或缺失核苷酸。在其它实施方案中，这两个分子包含一或多种碱基错配或者其核苷酸总数不同(由于添加或缺失所致)。在另外的实施方案中，“互补的”核酸分子包含与上调的“有义”核酸分子中包含的序列完全互补的至少十个连续的核苷酸。

“互补的”核酸分子(即编码与待下调核酸分子所编码微RNA序列互补的核酸序列的核酸分子)可以是天然存在的DNA-或RNA分子或者在其序列中包含相同类型或一或多种不同类型的一或多个修饰的核苷酸的合成的核酸分子。

例如，可能的是这种核酸分子包含至少一个核糖核苷酸主链单位及至少一个脱氧核糖核苷酸主链单位。此外，所述核酸分子可含有一或多个将RNA主链修饰为2'-O-甲基基团或者2'-O-甲氧基基团(也称作2'-O-甲基化)的修饰，其防止培养基中的核酸酶降解，并且重要地是也防止RNA诱导的沉默复合核酸酶的内切核苷酸裂解，其导致miRNA的不可逆抑制。另一可能的修饰-其功能等价于2'-O-甲基化包含锁核酸(LNA)，代表含有一或多个LNA核苷酸单体的核酸类似物，其具有在RNA模拟糖构象中锁定的双环呋喃糖单位(综述参见例如Orom,U.A.etal.(2006)Gene372,137-141)。

最近开发了另一类别的miRNA表达沉默剂。这些称作“antagomirs”的化学工程化的寡核苷酸是与胆固醇缀合的23个核苷酸单链RNA分子(Krutzfeldt,J.etal.(2005)Nature438,685-689)。作为这种化学修饰的寡核苷酸的另一选择，产生了作为RNA从转基因中产生的可以在细胞中表达的微RNA抑制剂。称作“微RNA海绵(sponges)”的这些竞争性抑制剂是从强启动子中表达的转录体，含有感兴趣的微RNA的多个串联结合位点(Ebert,M.S.etal.(2007)Nat.Methods4,721-726)。

在本发明方法的特别优选的实施方案中，表达被下调的一种核酸分子编码选自hsa-miR-375的微RNA序列。

在本发明方法的另一优选的实施方案中，上调核酸分子的表达包括将编码待上调的核酸分子编码的微RNA序列的核酸分子导入一或多种靶细胞中。换句话说，编码miRNA序列的核酸分子表达的上调通过将所述miRNA序列的另一拷贝(即另外的“有义”核酸分子)导入所述一或多种靶细胞中而实现。导入一或多种靶细胞中的所述“有义”核酸分子可包含与上述“反义”核酸分子相同的修饰。

在特别优选的实施方案中，表达被上调的一或多种核酸分子编码选自hsa-miR-125b,hsa-miR-424,hsa-miR-92a,hsa-miR-99a和hsa-miR-7的微RNA序列。

导入一或多种靶细胞中以修饰核酸表达生物标记中所包含的一或多种编码微RNA序列的核酸分子表达的“有义”和/或“反义”核酸分子可以与调节序列可操纵地连接，以使得所述核苷酸序列表达。

为了阐明癌性或癌前病变样品中鉴别的miRNA的任何潜在意义，可以进行关于所述miRNA可以结合的mRNA靶序列的鉴别的预备功能分析。基于发现miRNA既可以参与肿瘤阻抑也可以参与肿瘤发生(综述参见例如Esquela-Kerscher,A.andSlack,F.J(2006)如前;Calin,G.A.andCroce,C.M.(2007)如前;Blenkiron,C.andMiska,E.A.(2007)如前)，可以推测这种miRNA的mRNA靶位点包括肿瘤阻抑基因以及癌基因。

如果核酸分子包含含有关于转录和/或翻译调节信息的序列元件，且这种序列“可操纵地”与编码多肽的核苷酸序列连接，则称该核酸分子“能表达核酸分子”或者能“允许核酸序列表达”。可操纵地连接是其中所述调节序列元件与待表达的序列(和/或互相表达的序列)以能使得基因表达的方式相连的连接。

基因表达所必需的调节区的确切性质在不同物种中可以不同，但是通常这些区域均包含启动子，在原核生物中其含有两个启动子，即指导转录起始的DNA元件以及当转录为RNA时发出翻译起始信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译起始的5'非编码区，如在原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgarno元件，或者在真核细胞中的TATA盒、CAAT序列和5'-加帽元件。这些区域也可以包含增强子或阻抑子元件以及翻译信号和前导序列以将天然多肽靶向于宿主细胞的特定区室。

另外，3'非编码序列可含有参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞中的功能不令人满意，则可以被在该细胞中发挥功能的信号取代。

此外，如本文定义的核酸分子的表达也可以通过例如存在修饰的核苷酸而影响(如上所述)。例如锁核酸(LNA)单体被认为通过增强对降解的抗性及通过稳定对于沉默活性关键的miRNA-靶双链体结构而增加体内miRNA的功能性半衰期(见例如Naguibneva,I.etal.(2006)Biomed.Pharmacother.60,633–638)。

因此，被导入提供的一或多种细胞中的本发明的核酸分子可包含调节序列，优选启动子序列，任选还包含转录终止序列。

所述启动子可以允许组成型或者诱导型基因表达。合适启动子包括大肠杆菌lacUV5和tet(四环素应答性)启动子、T7启动子以及SV40启动子或者CMV启动子。

本发明的核酸分子也可以包含在载体或者其它克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒或人工染色体中。在优选的实施方案中，所述核酸分子包含在载体中，特别是包含在表达载体中。除了上述调节序列及编码如本发明定义的遗传构建体的核酸序列以外，这种表达载体可包括衍生自与用于表达的宿主相容的物种的复制和控制序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本领域已知且可商购许多合适的载体如pSUPER和pSUPERIOR。

第四方面，本发明涉及在一或多种靶细胞中预防和/或治疗优选表现为腺癌的结肠直肠癌的组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码一种序列，该序列与由其表达在一或多种靶细胞中被上调的核酸分子编码的微RNA序列至少部分互补，和/或该序列相应于由其表达在一或多种靶细胞中被下调的核酸分子编码的微RNA序列。

在最后一方面中，本发明涉及所述的药物学组合物在生产用于预防和/或治疗优选表现为腺癌的结肠直肠癌的药物中的应用。

在本发明中，合适的药物学组合物包括适于口服、经直肠、经鼻、经局部(包括经含服和舌下)、经腹膜和经胃肠外(包括经肌内、皮下或静脉内)给予的那些组合物，或者通过吸入或吹入给予的那些组合物。可以局部或全身性给予。优选通过口服、经直肠或静脉内途径给予。所述配制品可以包装为独立剂量单位。

本发明的药物组合物包括本领域确定的任何药物剂量形式，例如胶囊、微囊、扁囊、丸剂、片剂、粉末、小丸剂(pellet)、多颗粒配制物(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、悬浮液、油包水乳状液如软膏剂，及水包油乳状液如乳液、洗剂和香脂。

使用药物学可接受的成分以及已建立的配制方法，可以将上述(有义和反义)和核酸分子配制为药物组合物(Gennaro,A.L.andGennaro,A.R.(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy，20thEd.,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA;Crowder,T.M.etal.(2003)AGuidetoPharmaceuticalParticulateScience.Interpharm/CRC,BocaRaton,FL;Niazi,S.K.(2004)HandbookofPharmaceuticalManufacturingFormulations,CRCPress,BocaRaton,FL)。

为了制备药物组合物，可以使用药物学惰性的无机或有机赋形剂(即载体)。为了制备例如丸剂、片剂、胶囊或颗粒剂，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油或硬化油。用于生产溶液、悬浮液、乳状液、气雾剂混合物或在使用之前重配为溶液或气雾剂混合物的粉末的合适赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。所述药物学组合物也可以含有添加剂，如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，及另外的溶剂或者增溶剂或者实现储存效应的试剂。后者可理解为可以将核酸分子掺入缓释或持续释放或靶向输送系统中，如脂质体、纳米颗粒和微囊中。

为了靶向体内的大多数组织，需要临床可行的非侵入性策略以将如本文定义的这种药物学组合物定向于细胞。在过去，一些方法在通过将合理剂量的siRNA经静脉内注入小鼠和灵长类动物体内已经达到相当的治疗益处，而无明显的限制毒性。

一种方法包括将miRNA的过客链(passengerstrand)(miRNA*链)与胆固醇或其衍生物/缀合物共价结合，以促进通过遍在表达的细胞表面LDL受体的吸收(Soutschek,J.etal.(2004)Nature432,173-178)。或者，未缀合的PBS-配制的锁核酸修饰的寡核苷酸(LNA-反义miR)可以用于全身性输送(Elmen,J.etal.(2008)Nature452,896-899)。另一种输送miRNA的方法包括使用聚乙二醇使miRNA囊化成为特定的脂质体，以降低清道夫细胞的吸收并增加循环时间。这些特定的核酸颗粒(稳定的核酸-脂质颗粒或者SNALP)有效地将miRNA输送至肝脏(且不到达其它器官(综述参见例如Zimmermann,T.S.etal.(2006)Nature441,111-114所述))。近年来，描述了一类称作lipidoid的新型脂质样输送分子(基于烷基丙烯酸酯或者烷基-丙烯酰胺与伯胺或仲胺的缀合而合成)作为RNAi治疗的输送剂(Akinc,A.etal.(2008)Nat.Biotechnol.26,561-569)。

进一步的细胞特异性靶向策略包括将miRNA与一种融合蛋白混合，该融合蛋白由与鱼精蛋白连接的靶向抗体片段组成，所述鱼精蛋白是使精子中的DNA成核并通过电荷结合miRNA的碱性蛋白(Song,E.etal.(2005)Nat.Biotechnol.23,709-717)。近来已经开发了对上述基本输送方法进行的多种修改和改变。这些技术为本领域所已知，其综述参见例如deFougerolles,A.etal.(2007)Nat.Rev.DrugDiscov.6,443-453;Kim,D.H.andRossi,J.J.(2007)Nat.Genet.8,173-184)所述。

本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述实施例只是例证了本发明的具体实施方案，无以任何方式限制本发明范围之意。

实施例

实施例1：病人资料

在发现实验组中，共使用47例结直肠癌病人的手术切除冰冻组织，它们获取自复旦大学上海医学院组织库所储存的2007至2009年标本。所有病人对参与科学研究都有知情同意。所有采集标本的步骤都通过了上海医学院机构审查委员会的同意。组织包括了7例高级腺瘤，20例Dukes'A腺癌以及相应的20例正常肠组织（至少据肿瘤边缘10cm）。

在验证实验中，共使用128例结直肠癌病人的石蜡组织，它们获取自复旦大学附属华山医院和中山医院所储存的2006至2009年标本。在这128例石蜡组织中，53例病例既有肠镜活组织检查组织的病例也有手术切除组织。这53例病例在肠镜活组织检查时都被病理诊断为高级腺瘤。后经手术切除确诊后，有24例仍为高级腺瘤，剩下的29例则被重新诊断为浸润癌。发现实验和验证实验的具体肿瘤分组情况详见表3。

患者资料(年龄、性别、影像资料、治疗方法、其它医疗状况、家族史等)得自医院数据库用于匹配所收集的各种样品。病理学跟踪研究(例如通过苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学分析)用于明确确定给定样品的疾病状态(即健康对照、腺瘤、腺癌或中间状态)以及保证样品的一致分级。

表3

发现组和验证组的具体肿瘤分组情况

实施例2：样本准备

在发现实验中，对每个癌样品任选进行激光捕获显微切割技术，以特异性分离肿瘤细胞群(大约200000个细胞)。简而言之，将透明的转移膜应用于组织切片或样品的表面。在显微镜下，观察置于载玻片上的薄组织切片，并鉴别细胞群以进行分离。当选择的细胞位于观察视野的中心时，激活近红外激光二极管集成显微镜光学器件(nearIRlaserdiodeintegralwiththemicroscopeoptics)。脉冲的激光束激活转移膜上的斑点(spot)，使该膜与下面的选择的细胞融合。然后将具有结合的细胞的转移膜从所述薄组织切片中剥离(综述参见例如Emmert-Buck,M.R.etal.(1996).Science274,998-1001;Espina,V.etal.(2007)ExpertRev.Mol.Diagn.7,647-657)。制备恒冷箱切片并基本如厂商指导使用激光捕获显微镜(ArcturusVeritas^TMLaserCaptureMicrodissectionInstrument(MolecularDevices,Inc.,Sunnyvale,CA,USA)进行捕获步骤。

为了由探索性研究转向临床实施，在验证实验中所用的都是手术切除和肠镜活组织检查的石蜡组织标本。所用的石蜡组织都进行了连续切片和苏木精和伊红(H&E)染色，用来确定每个样本中肿瘤组织的比例。如果，该组织所含肿瘤细胞超过整块组织的75％，则被认为适于进行后续实验并不需要进一步的细胞纯化。相反，若该组织所含肿瘤细胞不足整块组织的75％，则相应的肿瘤细胞区域将进行标记，并在显微镜下进行微切割。此外，对照正常肠组织必须距离据肿瘤边缘至少10cm。

用mirVanamiRNA抽提试剂盒(Ambion,Austin,TX).抽提总RNA，NanoDrop1000Spectrophotometer(NanoDropTechnologies,Waltham,MA).测定总RNA浓度。用2100BioanalyzerusingtheRNA6000PicoLabChip试剂盒(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)进行RNA质量的检测。方法均参照其各自说明书。

实施例3：芯片数据

在发现实验中，可以任选地使用AgilentmiRNA微阵列平台(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)根据厂商指导对特定样品中(差异)表达的miRNA进行定性分析。该芯片所含人类723个微RNA选自Sangerdatabasev.10.1。每例标本的所需总RNA的上样量为100ng，并掺入Cy3染色的标记。芯片扫描则通过XDRScan(PMT100,PMT5)。标记和杂交的具体操作步骤详见AgilentmiRNA芯片平台系统。通过应用Quantile方法并使用本领域已知的GeneSpringGX10software(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)将针对单色(CY3)杂交获得的原始数据归一化。

非配对Fisher检验(F-test)用于分辨腺瘤和腺癌的重要miRNA信号。受试者工作特征曲线(receiveoperatingcharacteristiccurve,ROC)评估候选miRNA肿瘤标记区分大肠癌和癌前病变的诊断价值，检测制定miRNA的特异性和敏感性。ROC分析由MedCalc软件完成。95％可信区间具有统计学意义。

第一方面所述的6个可以区分手术切除冰冻组织中的早期结直肠癌和高级腺瘤的关键基因的实验数据已在表4中列出。

表4

区分手术切除冰冻组织中的早期结直肠癌和高级腺瘤的候选miRNA生物标记

实施例4：用手术切除石蜡组织验证芯片数据的结果

在验证实验中，用TaqMan探针法(AppliedBiosystems,FosterCity，CA,USA)对miRNA的表达进行realtimeRT-PCR的检测，从而验证相应miRNA在芯片中所检测获得的表达数据。具体方法参照厂家说明书。分别对75例手术切除石蜡标本进行以下基因的检测：hsa-miR-125b(SEQIDNO:3),hsa-miR-375(SEQIDNO:2),hsa-miR-424(SEQIDNO:4),hsa-miR-92a(SEQIDNO:1),hsa-miR-99a(SEQIDNO:5)andhsa-miR-7(SEQIDNO:6)。同时进行的对小RNAU47表达的检测用来作为标准化的质量监控。每个实验重复三次。

简而言之，使用AppliedBiosystem公司的TaqmanmicroRNA逆转录试剂盒进行逆转录。每个反应体系中加入100ng总RNA，15ul逆转录试剂混合物，其中包括1×逆转录缓冲液，1×dNTP，4URNase抑制剂和50UMultiScribeReverseTranscriptase。逆转录反应在PCR仪(Thermalcycleralphaengine,Bio-rad)中完成，具体程序为：16°C,30分钟;42°C,30分钟;85°C,5分钟。定量PCR根据AppliedBiosystem公司的TaqManUniversalPCRMasterMixkitandandTaqmanmicroRNAassayskits的具体说明完成。反应体系中包括2ul的逆转录产物，1XTaqManUniversalPCRMasterMix,无AmpEraseUNG和1XTaqManMicroRNAAssaymix.Real-timePCR在RochLightCycling480仪器中完成，具体程序为96°C,5分钟预热;95°C,15秒;60°C,60秒45或50个循环。Cp值由RochLightCycling480仪器自带软件进行二次衍生法计算所得。miRNA的绝对定量根据标准品的Cp值得到。

6个可以区分手术切除石蜡组织中的早期结直肠癌和高级腺瘤的关键基因的实验数据已在表5中列出。尤其是hsa-miR-92a(SEQIDNO:1),hsa-miR-375(SEQIDNO:2)和hsa-miR-99a(SEQIDNO:5)用粗体标出。

表5

区分手术切除石蜡组织中的早期结直肠癌和高级腺瘤的候选miRNA生物标记

实施例5：用肠镜活组织检查石蜡组织验证芯片数据的结果

这53例病例在肠镜活组织检查时都被病理诊断为高级腺瘤。后经手术切除确诊后，有24例仍为高级腺瘤，剩下的29例则被重新诊断为浸润癌。

在验证实验中，用TaqMan探针法(AppliedBiosystems,FosterCity，CA,USA)对6个miRNA的表达进行realtimeRT-PCR的检测，验证它们在肠镜活组织检查石蜡组织中的表达。同时进行的对小RNAU47表达的检测用来作为标准化的质量监控。每个实验重复三次。非配对Fisher检验(F-test)用于分辨腺瘤和腺癌的重要miRNA信号。受试者工作特征曲线(receiveoperatingcharacteristiccurve,ROC)评估候选miRNA肿瘤标记区分大肠癌和癌前病变的诊断价值，检测制定miRNA的特异性和敏感性。ROC分析由MedCalc软件完成。95％可信区间具有统计学意义。

6个可以区分肠镜活组织检查石蜡组织中的早期结直肠癌和高级腺瘤的关键基因的实验数据已在表6中列出。尤其是hsa-miR-7(SEQIDNO:6),hsa-miR-375(SEQIDNO:2)和hsa-miR-99a(SEQIDNO:5)用粗体标出。

表6

区分肠镜活组织检查石蜡组织中的结直肠癌和高级腺瘤的候选miRNA生物标记

实施例6：微RNA生物标记定量方法

用TaqMan探针法(AppliedBiosystems,FosterCity，CA,USA)根据厂商说明书，对特定标本进行realtimeRT-PCR的检测，从而实现miRNA生物标记的定量分析。

优选的，miRNA生物标记定量分析方法由原位杂交实施（图1）。方法包括：(a)采集病人的活组织检查组织或手术切除组织；(b)切片、制片；(c)在切片上杂交至少一个编码微RNA序列的核酸分子；(d)在显微镜下对微RNA的表达进行半定量，或用数字化图像进行定量分析；(e)确定一或多种靶细胞中多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子均编码一种微RNA序列；(f)确定一或多种对照细胞中所述多种核酸分子的表达水平；(g)通过对比在步骤(e)和(f)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴定出在靶细胞和对照细胞中差异表达的一或多种核酸分子，即可用于诊断早期结直肠癌或高级腺瘤。

杂交探针是合成的非修饰的序列，可以杂交在目标miRNA包括30个碱基残端(GGGGGTCCTATATGGCTCCACTTCTCCCCC)。残端序列用粗体标出。在探针的5’段用荧光标记上。单个或多个探针分别做不同荧光标记后可进行平行杂交。本发明中所提到的用于原位杂交的探针序列详见表7。

残端5’发夹结构(GGGGG-CCCCC环)用于稳定探针和目标miRNA的杂交稳定性，并提高杂交特异性。同样的原理可以用来设计其他用于原位杂交的miRNA生物标记探针。

表7

原位杂交探针

在此举例描述的本发明可以适当地在不存在本文特别揭示的任何因素、限制的条件下进行。因此，例如术语“包含”、“包括”“含有”等应具有广泛含义且无限制。另外，本文采用的术语和表达法用于描述本发明而无限制之意，且使用这些术语和表达法没有排除所示和所述特征的任何等同物或其部分之意，而是能意识到在权利要求范围内可以对本发明进行各种修改。因此，应理解尽管通过实施方案和任选的特征对本发明进行了特别揭示，但是本领域技术人员可以对本发明进行修改和改变，这种修改和改变包含在本发明的范围内。

本文广泛及上位地描述了本发明。落入上位描述范围内的每个较窄的下位概念和亚上位集合也组成了本发明的一部分。这包括用条件或从上位中除去任何主题的否定限制对本发明的上位描述，而无论所除去的主题是否在本文中特别引述。

其它实施方案在如下权利要求范围内。另外，当本发明的特征或各个方面用马库什组方式描述时，本领域技术人员能意识到本发明也以马库什组的任何各个成员或成员亚组方式被描述。

Claims

1.用于鉴别展现早期结直肠癌或高级腺瘤的结直肠外科手术组织或活组织检查组织中的一或多种哺乳动物靶细胞并且区分Dukes’A癌和高级别上皮内瘤变的分子标记诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA序列，

其中所述多种核酸分子的一或多种在所述靶细胞中和在一或多种对照细胞中差异表达，及

其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达生物标记，其是存在早期结直肠癌或高级腺瘤的指征，

其中所述核酸表达生物标记包括编码hsa-miR-375和选自hsa-miR-125b、hsa-miR-424、hsa-miR-92a、hsa-miR-99a和hsa-miR-7中任意一种或多种的微RNA序列的核酸分子。

2.权利要求1的试剂盒，其中与一种或多种对照细胞相比，所述一种或多种靶细胞中编码hsa-miR-125b、hsa-miR-424、hsa-miR-92a、hsa-miR-99a和hsa-miR-7的任意一种或多种核酸分子的表达被上调，核酸分子hsa-miR-375的表达被下调。

3.权利要求1-2任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码选自hsa-miR-125b/hsa-miR-375、hsa-miR-424/hsa-miR-375、hsa-miR-92a/hsa-miR-375、hsa-miR-99a/hsa-miR-375和hsa-miR-7/hsa-miR-375的任意一种或多种核酸分子组合。

4.权利要求1-2任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-92a、hsa-miR-99a和hsa-miR-375的核酸分子组合。

5.权利要求1-2任一项的试剂盒，其中所述核酸表达生物标记包含编码hsa-miR-375、hsa-miR-125b、hsa-miR-424、hsa-miR-92a、hsa-miR-99a和hsa-miR-7的核酸分子组合。

6.权利要求1-2任一项的试剂盒，所获得的编码微RNA序列的核酸分子生物标记，通过在结肠直肠组织中稳定表达的编码hsa-miR-423-5p的核酸表达分子而进行标准化；对于编码微RNA序列的核酸分子生物标记所获得的表达水平的阴性对照，使用在结直肠组织中无表达的编码hsa-miR-122的核酸表达分子。