WO2018170754A1 - 重组 Ad-29a-152-424-Tud 腺病毒及其构建和应用 - Google Patents

重组 Ad-29a-152-424-Tud 腺病毒及其构建和应用 Download PDF

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Definitions

  • the present invention belongs to the field of genetic engineering, and relates to the construction of an adenovirus, and more particularly to a recombinant adenovirus which interferes with the expression of miR-29a, miR-152 and miR-424.
  • MicroRNAs are a class of endogenous, non-coding RNAs found in eukaryotes, typically between 22 and 25 nt in size. miRNAs are widely distributed in plants, animals, and multicellular organisms, and can Play an important regulatory role, and in the study of human miRNAs, it is found that the expression of miRNA in normal tissues and tumor tissues is significantly different, some miRNAs are lowly expressed in tumor tissues, and some are highly expressed in tumor tissues. This suggests that miRNAs play a crucial role in tumorigenesis.
  • miR-29a is a small RNA closely related to cell proliferation. It is involved in many diseases and can act as a tumor suppressor gene in a variety of tumors. It has the ability to grow and invade cells such as human gastric cancer and bladder cancer.
  • miR-152 is a kind of Multi-functional miRNA, the study found that miR-152 is related to methylation, such as the methyltransferase DNMT1 content and enzyme activity, miR-152 can be methylated by endometrial cancer DNA into a silent gene, and its It is involved in the development of various cancers. It is a tumor suppressor microRNA, which is associated with many diseases such as preeclampsia, trophoblastic tumor, bladder cancer, gastrointestinal cancer, ovarian cancer, etc.
  • miR-424 is a miRNA discovered in recent years. It affects the biological effects and development of tumor cells by acting on target genes and participating in the signal transduction pathway of target genes in a variety of tumors. The role of tumor suppressor genes may promote or inhibit the invasion and metastasis of tumors. Studies have shown that miR-424 is a multifunctional miRNA, which is associated with cell invasion and metastasis of cervical cancer, pancreatic cancer, etc.; it is associated with the expression of inflammatory factors such as IL-6 and TNF-oc; since the miR-424 promoter region has CpG islands It is also associated with methylation-induced gene silencing. By controlling the expression of miR-29a, miR- 152 and miR-424, peers and other drugs work together to provide new epigenetic ideas for the treatment of cancer.
  • Tough Decoy RNA is a novel miRNA-inhibiting miRNA that inhibits miRNA by introducing double-stranded RNA to target miRNAs. Because the inserted RNA is double-stranded and has a secondary structure of stem-loops, it is resistant to intracellular nuclease degradation and inhibits miRNAs in a long-term, stable, and efficient manner.
  • the present invention provides a recombinant Ad-29a-152-424-Tud adenovirus containing a Tud RNA which interferes with the expression of iR-29a, miR-152 and miR-424, the Tud RNA has SEQ ID NO: 1
  • the shuttle plasmid used to construct the recombinant Ad-29a-152-424-Tud adenovirus is pHBAd-U6-
  • the Tud RNA that interferes with expression of miR-29a, miR-152 and miR-424 is ligated under the U6 promoter of the shuttle plasmid.
  • framework plasmid used in the construction of the recombinant adenovirus of the present invention is pHBAd-BHG, and the packaging cell is 293 cells.
  • the recombinant Ad-29a-152-424-Tud adenovirus of the present invention is constructed by designing a Tud RNA of the nucleotide sequence shown in SEQ ID No. 1, and chemically synthesizing the corresponding SEQ ID No 2 and SEQ ID No.
  • the Tud RNA complementary single-stranded target gene fragment shown in 3 is annealed to obtain a double-stranded expression template of the target gene fragment, and ligated with the BAHHI and EcoRI double-digested vector pHBAd-U6-GFP to construct an adenoviral shuttle plasmid, and then The adenovirus shuttle plasmid was co-transfected with the backbone plasmid pHBAd-BHG into 293 cells to obtain recombinant adenovirus A d-29a-152-424-Tud.
  • Ad-29a-152-424-Tud adenovirus constructed by the present invention can be used as a tool for blocking/reducing the expression of miR-29a, miR-152 and miR-424.
  • 1 is the expression level of miRNA, wherein a. miR-29a expression, b. miR-152 expression, c. miR-424 expression.
  • Tud DNA-F/Tud DNA-R 1/1 ⁇ l
  • Procedure 95 ° C for 5 min, cooled to 25 ° C at a rate of 0.1 ° C / s, and then stored at 4 ° C.
  • the linearized pHBAd-U6-GFP vector was recovered using a PCR reaction recovery kit (Axygen).
  • the annealing product of the above Tud RNA expression sequence was ligated to the BamHI and EcoRI sites of the vector pHBAd-U6-GFP with T4 ligase to construct an adenoviral shuttle plasmid, which was regulated by the U6 promoter.
  • Tud RNA and carrier-coupled reaction system 1 ⁇ annealing product; 100-200
  • Ngx linearized pHBAd-U6-GFP vector 2 ⁇ 1 T4 DNA Ligase Buffer; ⁇ ⁇ 4 DNA Ligase; diluted to ⁇ 20 to a total volume of 20 ⁇ 1.
  • the ligation reaction system was allowed to stand at 4 ° C overnight.
  • the constructed adenovirus shuttle plasmid was transformed into competent cells Jml07, resistant: ampicillin; cultured overnight at 37 °C.
  • the transformed Tud RNA was picked by a plate, and the bacteria were shaken at 37 ° C for 200 hours, and the bacterial solution was sequenced.
  • the sequencing result was consistent with the target sequence to obtain a large intestine containing the plasmid pHBAd-T U d-29a-152-424. Bacillus.
  • the recombinant adenoviral vector plasmid pHBAd-Tud-29 a-152-424 and the backbone plasmid pHBAd-BHG were used, and Lipofectamine 2000 (purchased from Invitrogen) was used.
  • Dyeing reagents for transfection The specific steps are:
  • pHBAd-Tud-29a-152-424 lO g backbone plasmid pHBAd-BHG, diluted with 300 ⁇ DMEM medium and allowed to stand at room temperature for 5 min.
  • the 50 ml centrifuge tube was repeatedly freeze-thawed three times in a liquid nitrogen and a 37 ° C constant temperature water bath, centrifuged at 3000 rpm for 5 min, and the virus-containing supernatant was collected, and the precipitate was discarded.
  • the supernatant is the first generation of Ad-29a-152-424-T U d (P1), which is used as a virus for subsequent amplification of a large number of viruses.
  • P2 generation virus (except for a small amount of virus-retaining species) was all inoculated into the culture flask, cultured for 24 h, 60% cytopathic observation was observed under the microscope, and the cells were completely lesioned 48 h later.
  • Harvest the diseased cell suspension centrifuge at 2000 rpm for 5 min, discard the supernatant, add 4 ml ST buffer (culture medium + 10% serum + 2.5% glycerol), vortex and mix, freeze at -80 ° C and 37 ° C Three times, 3000 ⁇ 1 centrifugation 5 1 ⁇ Take the supernatant as a third generation virus (P3).
  • the WRL-68 cells were seeded into a six-well plate at a density of 20,000 cells/well, and the Ad-29a-152-424-Tud adenovirus was infected at 37° after the cells were grown to 60% confluence. Incubate for 2 h in a C 5% C02 incubator, change the medium, and continue to culture for 36 hours.
  • the miRNAs of these cells were extracted using the miRcute miRNA extraction and isolation kit, and then S-Poly(T) hsa-miR-29a qPCR-assay primer set, S-Poly(T) hsa-miR-152 qPCR-assay primer Set and S-Poly(T) hsa-miR-424 qPCR-assay primer seti box to reverse transcribe and tail the miRNA to obtain the corresponding cDNA. Take 2 kinds of cells of cDNA 2
  • the expression levels of miR-29a, miR-152 and miR-424 were detected by real-time PCR, and the experiment was repeated 3 times with 3 parallel samples per well, with snord 44 as an internal reference. The results are shown in Fig. 2. It can be seen that the expression level of miR-29a in TuD-29a-152-424 cells is 56 ⁇ 3 ⁇ 4 lower than that in 16HBE cells, and the expression level of miR-152 is 47% lower than that in 16HBE cells, miR-424. The expression level was 71% lower than that of 16HBE cells. The difference was statistically significant (p ⁇ 0.01), indicating that the TuD-29a-152-424 cell line was successfully constructed.

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

提供了一种重组Ad-29a-152-424-Tud腺病毒，所述腺病毒含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的抑制人miR-29a、miR-152和miR-424表达的TudRNA，将其连接于穿梭质粒pHBAd-U6-GFP的U6启动子之下，制备腺病毒穿梭质粒，再与骨架质粒pHBAd-BHG共转染293细胞，得到重组腺病毒Ad-29a-152-424-Tud。该重组Ad-29a-152-424-Tud腺病毒能够阻断/减少miR-29a、miR-152和miR-424的表达，可用于研究miR-29a、miR-152和miR-424三者在肿瘤发生发展过程中的相互作用。

Description

说明书 发明名称：重组 Ad-29a-152-424-Tud腺病毒及其构建和应用 技术领域
[0001] 本发明属于基因生物工程技术领域， 涉及一种腺病毒的构建， 特别是涉及一种 干扰 miR-29a、 miR- 152和 miR-424表达的重组腺病毒。
背景技术
[0002] MicroRNA (miRNA) 是在真核生物中发现的一类内源性的非编码 RNA， 大小 一般在 22-25 nt之间， miRNA广泛分布于植物、 动物和多细胞生物中， 并且能发 挥重要的调节作用， 而在人类 miRNA的研究中， 发现 miRNA在正常组织和肿瘤 组织中的表达有着显著差异， 有些 miRNA会在肿瘤组织中有低表达， 有些则在 肿瘤组织中有高表达， 这说明 miRNA在肿瘤发生过程中起了至关重要的作用。
[0003] miR-29a是一个与细胞增殖紧密相关的小分子 RNA， 参与多种疾病， 可在多种 肿瘤中起到抑癌基因作用， 它与人胃癌和膀胱癌等细胞的生长和侵袭能力相关 ， 其表达水平是评价胶质瘤良恶性的重要参考指标， 还与动脉粥样硬化肝纤维 化等疾病相关， 对多种肿瘤的治疗具有重要的潜在应用价值； miR-152是一种具 有多功能的 miRNA, 研究发现 miR-152与甲基化相关， 如与甲基转移酶 DNMT1 含量和酶活性相关， miR-152可被子宫内膜癌 DNA甲基化变为沉默基因， 并且其 与多种癌症的发生发展相关， 它是一种肿瘤抑制 microRNA, 与子痫前期、 滋养 细胞肿瘤、 膀胱癌、 胃肠癌、 卵巢癌等诸多疾病相关； miR-424是近年来发现的 一个 miRNA, 其在多种肿瘤中通过作用于靶基因， 参与靶基因调控的信号通路 ， 从而影响肿瘤细胞生物学效应和发生发展， 发挥类似于癌基因、 抑癌基因的 作用， 或促进、 抑制肿瘤的侵袭转移。 有研究表明 miR-424是多功能 miRNA, 它 与宫颈癌， 胰腺癌等细胞侵袭转移相关； 与炎性因子如 IL-6、 TNF-oc的表达相关 ； 由于 miR-424启动子区域具有 CpG岛， 它与甲基化诱导的基因沉默也相关。 通 过控制 miR-29a、 miR- 152和 miR-424的表达， 同吋与其他药物协同作用， 能为治 疗癌症提供新的表观遗传思路。
技术问题 [0004] MiRNA的功能研究主要通过 miRNA干扰和过表达技术完成。 现有 miRNA干扰 技术中， anti-miR和 antagomiR为瞬吋转染技术， 其干扰效果不能稳定保持， 而 m iRNA sponge效果远未达到最优， 现有技术缺乏一种干扰效果好且能实现长期稳 定干扰的技术。
[0005] Tough Decoy RNA (Tud RNA) 是一种新幵发出的 miRNA抑制手段， 其通过引 入双链 RNA对目标 miRNA进行吸附， 达到抑制 miRNA的目的。 由于弓 |入的 RNA 为双链并且带有茎环的二级结构， 因此其够抵抗胞内核酸酶的降解， 能长期、 稳定和高效地抑制 miRNA。
问题的解决方案
技术解决方案
[0006] 本发明的目的是提供一种重组 Ad-29a-152-424-Tud腺病毒， 以及该重组腺病毒 的构建方法， 以用于阻断 /减少 miR-29a、 miR-152和 miR-424的表达。
[0007] 为实现上述目的， 本发明提供了一种含有干扰 iR-29a、 miR-152和 miR-424表达 的 Tud RNA的重组 Ad-29a-152-424-Tud腺病毒， 所述 Tud RNA具有 SEQ ID
No.l所示的核苷酸序列。
[0008] 用于构建所述重组 Ad-29a-152-424-Tud腺病毒所采用的穿梭质粒为 pHBAd-U6-
GFP， 所述干扰 miR-29a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA连接于所述穿梭质 粒的 U6启动子之下。
[0009] 进一步地， 本发明构建所述重组腺病毒所采用的骨架质粒为 pHBAd-BHG， 包 装细胞为 293细胞。
[0010] 本发明所述重组 Ad-29a-152-424-Tud腺病毒的构建方法是设计 SEQ ID No 1所示 核苷酸序列的 Tud RNA， 化学合成对应的 SEQ ID No 2和 SEQ ID No 3所示的 Tud RNA互补单链目的基因片段， 退火得到所述目的基因片段的双链表达模版， 与 B amHI和 EcoRI双酶切的载体 pHBAd-U6-GFP连接构建腺病毒穿梭质粒， 再将所述 腺病毒穿梭质粒与骨架质粒 pHBAd-BHG共转染 293细胞， 即可得到重组腺病毒 A d-29a-152-424-Tud。
[0011] 本发明所构建的重组 Ad-29a-152-424-Tud腺病毒可以作为一种工具药， 用于阻 断 /减少 miR-29a、 miR- 152和 miR-424的表达。 发明的有益效果
有益效果
[0012] 通过本发明上述工具药的设计， 可以进一步探索 miR-29a、 miR-152和 miR-424 三者在肿瘤发生发展过程中的相互作用， 进而为肿瘤治疗的研究做出贡献。
对附图的简要说明
附图说明
[0013] 图 1为 miRNA表达水平情况， 其中， a. miR-29a的表达情况， b. miR-152的表达 情况， c. miR-424的表达情况。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0014] 实施例一
[0015] 设计干扰 miR-29a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA序列， 具体为： 5'- ggcgctaggatcatcaacagtcacgtactatctgtcttgaacccaagttttgcactcatctcgcgacgatacaaatcgtggtag acatcttttagccaatcaagtattctggtcacagaatacaacagtcacgtactatctgtcttgaacccaagttttgcactcatctcg cgacgatacaaatcgtggtagacatcttttagccaatcaagatgatcctagcgccaccttttt-3'°
[0016] 人工合成含有上述 Tud RNA表达序列， 并在序列两端分别引入 BamHI和 EcoRI 酶切位点。
[0017] Top strand:
[0018] 5'-AATTCggcgctaggatcatcaacagtcacgtactatctgtcttgaacccaagttttgcactcatctcgcgacgatac aaatcgtggtagacatcttttagccaatcaagtattctggtcacagaatacaacagtcacgtactatctgtcttgaacccaagtttt gcactcatctcgcgacgatacaaatcgtggtagacatcttttagccaatcaagatgatcctagcgccacctttttg-3';
[0019] Bottom strand:
[0020] 5'-GATCCaaaaaggtggcgctaggatcatcttgattggctaaaagatgtctaccacgatttgtatcgtcgcgagatga gtgcaaaacttgggttcaagacagatagtacgtgactgttgtattctgtgaccagaatacttgattggctaaaagatgtctacca cgatttgtatcgtcgcgagatgagtgcaaaacttgggttcaagacagatagtacgtgactgttgatgatcctagcgccg-3'°
[0021] 将上述互补利用 3'和 5'的单链退火得到相对应的目的片断 Tud RNA的双链 表达模版退火产物。 退火程序为： [0022] 20μ1体系：
[0023] lOxBuffer: 2μ1;
[0024] Tud DNA-F/Tud DNA-R: 1/1μ1;
[0025] H20: 16μ1。
[0026] 程序： 95°C 5 min， 按 0.1°C/s的速度降温至 25°C， 然后保存于 4°C。
[0027] 用限制性内切酶 BamHI和 EcoRI双酶切载体 pHBAd-U6-GFP， 酶切体系如下
[0028] 20μ1酶切体系 37°C 30 min:
[0029] 2μ1载体（500 ng/μΐ)；
[0030] Ιμΐ BamHI/ΙμΙ EcoRI；
[0031] 2μ1 lOxbuffer；
[0032] 14μ1 Η20。
[0033] 酶切完成后， 用 PCR反应回收试剂盒 （Axygen) 回收线性化的 pHBAd-U6-GFP 载体。
[0034] 将上述 Tud RNA表达序列的退火产物用 T4连接酶连接到载体 pHBAd-U6-GFP 的 BamHI、 EcoRI位点之间， 构建腺病毒穿梭质粒， 由 U6启动子调控表达。
[0035] Tud RNA与载体连接的反应体系： 1 μΐ退火产物； 100-200
ngx线性化的 pHBAd-U6-GFP载体； 2μ1 T4 DNA Ligase Buffer; Ιμΐ Τ4 DNA Ligase; 以 Η20稀释至总体积 20μ1。 将连接反应体系置于 4°C反应过夜。
[0036] 将构建的腺病毒穿梭质粒转化感受态细胞 Jml07， 抗性： 氨苄青霉素； 37°C培 养过夜。 转化后的 Tud RNA进行平板挑菌， 37°C 200 rpm摇菌 14小吋， 将菌液进 行测序， 测序结果与目的序列相符， 得到包含 pHBAd-TUd-29a-152-424质粒的大 肠杆菌。
[0037] 实施例二
[0038] 取上述实施例制备的对数生长期的腺病毒穿梭质粒菌液 2ml， 加入 100ml含 100μ g/mlAmp的 LB培养基中， 37°C 300 rpm震荡摇菌过夜， 用质粒大抽提试剂盒 （购 自 Invitrogen) 提取质粒 pHBAd-Tud-29a- 152-424。
[0039] 转染前一天， 将 293细胞接种于 100 mm培养皿， 培养基为 DMEM+10<¾胎牛血 清 （FBS) ， 置 37°C含 5% C02的培养箱中培养过夜。
[0040] 待细胞生长至长满底面积的 70〜80%吋， 取重组腺病毒载体质粒 pHBAd-Tud-29 a-152-424及骨架质粒 pHBAd-BHG， 用 Lipofectamine 2000 (购自 Invitrogen)转染 试剂进行转染。 具体步骤为：
[0041] a . 转染前 2小吋更换完全培养基。 取 5μ§重组腺病毒载体质粒
pHBAd-Tud-29a- 152-424, lO g骨架质粒 pHBAd-BHG， 用 300 μΐ DMEM培养 液进行稀释， 室温放置 5 min。
[0042] b . 取 40μ1 Lipofectamine 2000， 用 300 μΐ DMEM培养液进行稀释， 室温放置
5min。
[0043] c . 将两者混和， 室温避光放置 20 min。 然后将混合物加入到 100 mm培养皿 中， 混匀后置于 37°C含 5% C02的培养箱中培养。
[0044] 转染 5 h后， 更换新鲜的细胞培养液。
[0045] 每天观察细胞， 待细胞变大变圆， 呈葡萄状， 幵始出现明显噬斑并从底部脱落 幵始收集病毒， 将 100 mm培养皿中所有细胞及培养液收于 50 ml离心管中。
[0046] 将 50 ml离心管在液氮及 37°C恒温水浴中反复冻融三次， 3000 rpm离心 5 min ， 收集含病毒的上清液， 弃去沉淀。 该上清即为 Ad-29a-152-424-TUd第一代毒种 (P1) ， 将其作为随后大量病毒扩增的毒种。
[0047] 从 P1代病毒上清中取 2 ml， 感染一个 100 mm细胞培养皿的细胞 （细胞密度保 证 90%以上） 。 余下的病毒上清放入外旋的冻存管中， -80°C保留， 做为毒种保 留。 病毒扩增两天后， 待所有细胞脱落底面即可进行收毒， 将细胞连同培养液 一同收入 50 ml离心管中， 依据前面冻融方法冻融三次， 取上清进行下一代扩增 或于 -80°C保存。 以后每代病毒扩增及收毒都如此反复进行。
[0048] 按每个 T75培养瓶中接种 40万个 293细胞接种 4个 T75培养瓶， 培养过夜， 待细胞 生长满至 90%
吋， 将 P2代病毒 （除取少量留毒种外） 全部接种培养瓶内， 培养 24 h， 显微镜下 观察 60%细胞病变， 48 h后细胞完全病变。 收获病变细胞混悬液， 2000 rpm离心 5 min, 弃上清， 加入 4ml ST buffer (培养液 +10%血清 +2.5%甘油） ， 涡旋混匀 ， 于 -80°C和 37°C间冻融三次， 3000 ^^1离心5 1^^ 取上清， 作为第三代病毒 (P3) 。
[0049] 实施例三
[0050] 以密度 2万个 /孔的量将 WRL-68细胞接种至六孔板中， 待细胞生长至 60%的汇合 度后， 感染 Ad-29a-152-424-Tud腺病毒， 37°C 5% C02培养箱中培养 2 h， 更换培 养液， 继续培养 36小吋。
[0051] 用 miRcute miRNA提取分离试剂盒提取这些细胞的 miRNA, 然后用 S-Poly(T) hsa-miR-29a qPCR-assay primer set、 S-Poly(T) hsa-miR-152 qPCR-assay primer set 和 S-Poly(T) hsa-miR-424 qPCR-assay primer seti式剂盒对 miRNA进行逆转录和加 尾， 得到相应的 cDNA。 取 2种细胞的 cDNA各 2
为模板， 荧光定量 PCR检测 miR-29a、 miR-152和 miR-424表达水平的变化， 实 验重复 3次， 每孔设置 3个平行样，以 snord 44作为内参。 结果如图 2所示， 可以看 到与 TuD-29a-152-424细胞的 miR-29a的表达水平比 16HBE细胞低 56<¾， miR-152 的表达水平比 16HBE细胞低 47%， miR-424的表达水平比 16HBE细胞低 71%。 差 异有统计学意义 （p<0.01) ， 说明 TuD-29a- 152-424细胞株构建成功。
工业实用性
[0052] 通过本发明上述工具药的设计， 可以进一步探索 miR-29a、 miR-152和 miR-424 三者在肿瘤发生发展过程中的相互作用， 进而为肿瘤治疗的研究做出贡献。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 重组 Ad-29a-152-424-Tud腺病毒， 含有干扰人 miR-29a、 miR-152和 mi
R-424表达的 Tud RNA， 所述 Tud RNA具有 SEQ ID No. 1所示的核苷 酸序列。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的重组 Ad-29a-152-424-TUd腺病毒， 其中构建所 述腺病毒所采用的穿梭质粒为 pHBAd-U6-GFP。
[权利要求 3] 根据权利要求 2所述的重组 Ad-29a-152-424-TUd腺病毒， 其中所述干 扰 miR-29a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA连接于所述穿梭质粒 的 U6启动子之下。
[权利要求 4] 一种重组 Ad-29a-152-424-Tud腺病毒的构建方法， 设计 SEQ ID No. 1 所示核苷酸序列的 Tud RNA， 化学合成对应的 SEQ ID No. 2和 SEQ ID No. 3所示的 Tud RNA互补单链目的基因片段， 退火得到所述目的基 因片段的双链表达模版， 与 BamHI和 EcoRI双酶切的载体 pHBAd-U6- GFP连接构建腺病毒穿梭质粒， 再将所述腺病毒穿梭质粒与骨架质粒 pHBAd-BHG共转染 293细胞， 得到重组腺病毒 Ad-29a- 152-424-Tud。
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