CN102782155B - 用于肺癌的血浆中微rna表达谱分析的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供鉴定展现出肺癌的一或多种目标血浆的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含编码miRNA序列的多种核酸分子。所述编码miRNA序列的核酸分子中的一或多种在目标血浆中及在对照血浆中差异表达。本发明还提供了使用所述微RNA来鉴定展现出肺癌的一或多种目标血浆的方法，以及用于预防或治疗肺癌的方法和药物组合物。

Description

用于肺癌的血浆中微RNA表达谱分析的组合物和方法
发明领域
本发明涉及用于肺癌的血浆中(theplasmaoflungcancer)，尤其是腺癌肺癌(adenocarcinomalungcancer)、鳞状细胞肺癌(squamouscelllungcancer)和小细胞肺癌(smallcelllungcancer)的微RNA(microRNA)表达谱分析的组合物和方法。
发明背景
肺癌依然是导致全球癌症相关性死亡的最常见原因。据估计，在2009年有140万新病例，年均增长率达2.51%（Frost&Sullivanestimates）,而这些在2009年被确诊为肺癌的患者也会最终死于肺癌(Higgins,M.J.et15al.(2009)ExpertRevAnticancerTher9,1365-1378)。尽管于过去的数十年中，肺癌的手术方法与综合治疗有一定的进展，但是在欧美等地区，不同级别肺癌的五年生存率总计只有15%。
肺癌可分为小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)或非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)。肺癌的大部分组织学分型(>80%)是非小细胞肺癌，当中包括肺腺癌和肺鳞状细胞癌。吸烟是导致肺癌的最主要危险因素，分别占全球男、女性的肺癌病例中的80%及50%。
肺癌的治疗根据癌症的亚型各有不同。早期NSCLC的首选治疗方案是手术，其五年总生存率达40%。不过，大部分患者在确诊为肺癌时已属于晚期，错过一线治疗到多药化疗，导致期望生存率少于8个月。目前最新的靶向治疗要求更准确的区分非小细胞肺癌的亚型。肿瘤血管生成抑制剂对于肺鳞状细胞癌治疗过程中所引起的不良反应产生更高的风险(Lebanoy,D.(2009)JClinOncol27,2030-2037)。小细胞肺癌(SCLC)被视为癌症中致命率最高的一种，其病死率大于90%。尽管观察到较高的初始反应率，处于局限期的患者的中位生存期约为20个月。手术治疗甚少适用于对SCLC患者的处理，因此单独化疗或合并放疗常被采用。
除了根据肺癌的不同亚型和病因选用不同的治疗方法，测量者间变异和缺乏特异性、标准化的检测限制了目前对病患者采取最适治疗的能力。肺癌个体患者的治疗决策将根据肿瘤及患者本身的特征而制定，基于这一设想，用于区分肺癌的特异性的分子生物标记物是必不可缺的。
目前对肺癌的早期检测的手段还没有被证实能有效降低死亡率。胸片，痰液细胞和光纤支气管镜的分析等检查对降低肺癌死亡率效果有限。崭新的检测手段，诸如低剂量螺旋电脑扫描成像（即CT）和痰液中分子标志物，对检测更早期、可手术阶段的肺癌和术后生存期的延长的产生了惊人的效果。但是，肺部活检及手术的相关风险以及晒查的净效益并未被考虑。因此，经临床验证的血液肿瘤生物标记物仍未能满足肺癌的检测。所以探索对目前肺癌检测手段的辅助和改进的办法成为了逼切的需要。
由于很多常规的诊断性检测只分析单个分子标记物，干扰了检测的可靠性及准确性。此外，单个分子标记物一般不能详细预测肿瘤的潜伏阶段、肿瘤的恶化程度等等，由此可见，需要使用其他分子标记物和检测方法去克服这一方面的缺陷。
针对这一方面的其中一个解决方法就是利用小分子调控RNA，特别是微RNA(miRNA)。作为一种进化保守的内源性表达的一类有20-25个核苷酸(nt)构成的非编码RNA，可以诱导目的mRNA的表达。而自十年前被发现后，miRNA被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中有着重要的功能(Bartel,D.P.(2004)Cell116,281-297,Ambros,V.(2004)Nature431,350-355;He,L.etal.(2004)5NatRevGenet5,522-531)。此外，miRNA比mRNA作为肿瘤生物标记物的有着更大的优势，这是因为在试管内，miRNA比mRNA十分稳定；而在体内前者的存在时限较后者更长(综述见例如Lu,J.etal.,(2005)Nature435,834-838;Lim,L.P.etal.,(2005)Nature433,769-773)。
miRNA由初级转录产物经核糖核酸酶IIIDrosha(RNaseIIIDrosha)切割后生成的发夹茎环结构的前体(前体-微miRNA，pre-miRNA)。在转运到细胞质后，通过另外的核糖核酸酶III，Dicer(RNaseIIIDicer)切开pre-miRNA的发夹茎环结构，生成双链短RNA(dsRNA)，其中一条链充当成熟miRNA组成miRNA-蛋白（miRNP）。然后，miRNA介导miRNP到它们的目的mRNA发挥作用(Bartel,D.P.(2004)Cell23,281-292;He,L.andHannon,G.J.(2004)NatRevGenet5,522-531)。
根据miRNA和起目的mRNA的互补性，miRNA可以介导不同的调控程序。miRNA若与目的mRNA高度互补，则其切割机制与干扰RNA(RNAi)的完全相同。为此，在这种情况下，miRNA作用于短干扰RNA(siRNA)一致。反之，miRNA与目的mRNA呈低互补性的话，目的mRNA会在不影响mRNA水平的情况下，被导向细胞降解途径或翻译抑制。但是，对于miRNA通过什么机制抑制其目的mRNA的翻译的问题，至今尚存争议。
高通量miRNA定量技术，如miRNA微阵列，实时RT-PCR技术为基础的荧光定量miRNA检测（基于实时RT-PCR的TaqManmiRNA测定）等，对整个肿瘤基因谱中的全miRNA表达谱的检测提供了强大的技术平台。不断更新的数据表示miRNA表达失调的情况下与某些种类肿瘤的发生发展的关系尤其密切。例如，2个miRNA，miR-15和miR-16-1，已被证实定位于慢性淋巴白血病(chroniclymphaticleukemia，CLL)丢失的基因座上，同时，研究发现，这两个miRNA基因在大约70%的CLL患者中表现为缺失或表达下调。另外，研究发现miR-143和miR-145在大肠肿瘤发生中表达下调，而miRNAlet-7则在肺癌中的表达常有所下降(综述见例如Michael,M.Z.etal.(2003)MolCancerRes1,882-891;Mayr,C.etal.(2007)Science315,1576-1579)。实际上，众多研究发现miRNA表达所导致于肿瘤相关的改变，以及miRNA经常定位于肿瘤发生的基因位点上，推断miRNA可以是癌基因、也可以是抑癌基因(综述见例如Esquela-Kerscher,A.andSlack,F.J(2006)NatRevCancer6,259-269;Calin,G.A.andCroce,C.M.(2007)JClinInvest117,2059-2066;Blenkiron,C.andMiska,E.A.(2007)HumMolGenet16,R106-R113)。人类癌症中miRNA的异常表达模式突出了其作为诊断和预后的生物标记物的潜力。
已经有一些研究报道了关于人类肺癌中的miRNA表达谱(Johnson,S.M.etal.(2005)Cell120,635-647;Liang,Y.etal.(2008)BMCMedGenomics1,61;Kumar,M.S.etal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105,3903-3908;Miko,E.etal.(2009)ExpLungRes35,646-664;Xie,Yetal.(2009)LungCancer15May13;Lebanony,D.etal.(2009)JClinOncol27,2030-2037;Kauppinen,S.etal.(2009)ClinCancerRes15,1177-1183;Mascaux,C.etal.(2009)EurRespirJ33,352-359)。这些研究报告一致认为，与正常组织相比，特异的miRNA在恶性组织中异常表达。不仅如此，研究还发现某些miRNA可能于预后有关(Yu,S.L.etal.(2008)20CancerCell13,48-57;Raponi,M.etal(2009)CancerRes69,5776-5783)。因此，这些miRNA可能对细胞的恶性转化和发展过程提供线索。
不同类型的样本之中，血液一直被视为高危人群中理想的筛查工具，提供早期检测、诊断、监测和有效的癌症治疗——这都是基于血液在侵袭性低又易于采集的情况下做出的判断。有研究证实肿瘤源性的miRNA在人类血浆和血清中呈非常稳定的结构，能避免内源性RNA酶降解。这些在血清或血浆中的肿瘤源性miRNA的水平足以使它们作为肿瘤检测的生物标记物。而且，血浆和血清miRNA的水平强烈相关，提示血浆或血清样本中miRNA水平检测作为临床应用的肿瘤诊断生物标记物尤为适合(Mitchell,P.S.etal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105,10513–10518;Gilad,S.etal.(2008)PLoSONE3,e3148;Chen,X.etal.(2008)CellRes18,997-1006)。陈等人在研究肺癌中血清miRNA表达模式时发现hsa-miR-25和hsa-miR-223可作为检测NSCLC的血中的生物标记。不过，又因单个miRNA检测缺乏足够的敏感性和特异性，不足以作为临床应用的诊断生物标记。
因此，急需要检测肺癌的血中诊断标记物，特别是以“表达特征”(expressionsignature)或“分子印迹”(molecularfootprint)形式出现在血中，这样可为不同类型的肺癌提供迅速、可靠又经济的检测。再者，相对应的早期肺癌筛选、不同类型肺癌的鉴别诊断、癌症复发的早期检测、癌症治疗及其有效性的评估等不同的检测手段也不乏需求。
发明目的和发明概述
本发明的目的是提供新的方法，其通过确定血液中多种核酸分子(每种核酸分子均编码miRNA序列)，来诊断肺癌、区别性地诊断不同类型的肺癌、监测癌症治疗、和/或治疗肺癌。其中所述多种核酸分子中的一或多种在不同类型的肺癌血浆中差异表达，这是通过与健康对照相比、和/或与其它类型的肺癌相比而进行分析的。其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征(expressionsignature),所述核酸表达特征是肺癌存在的指征。
更具体地，本发明的目的是提供血液中的核酸表达特征和/或组合物，以用于鉴别肺癌、和/或区分不同类型的肺癌。另外，所述核酸表达特征包括肿瘤相关特征(tumor-relatedsignature)、血浆特异性特征(plasma-specificsignature)和内部稳定对照(internalstablecontrol)。不同类型的肺癌包括腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌和小细胞肺癌。
此外，本发明的目的是提供相应的方法，以用于在展现出肺癌的血液中鉴别一或多种核酸表达特征。更具体地说，本发明的目的是提供用于与健康对照和/或其它类型肺癌比较而区分不同类型的肺癌的方法。
这些及其它目的从以下描述将变得清楚，它们由独立权利要求的主题实现。本发明的一些优选实施方案由从属权利要求的主题限定。
在第一方面，本发明涉及用于鉴别腺癌肺癌的血液中分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆与健康对照血浆相比差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肺鳞腺癌症的指征。
本文限定的核酸表达特征可包含至少12种核酸分子，优选的至少6种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被上调；以及包含至少一种中编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被下调。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征：hsa-miR-638、hsa-miR-572；血浆特异性特征：hsa-miR-383、hsa-miR-1233、hsa-miR-545*和hsa-miR-655、hsa-miR-19b-2*、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-190b、hsa-miR-623、hsa-miR-923和内部稳定对照hsa-miR-1238的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种健康对照血浆相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-638、hsa-miR-572、hsa-miR-383、hsa-miR-545*、hsa-miR-655、hsa-miR-19b-2*、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-190b、hsa-miR-623和hsa-miR-923的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；hsa-miR-1233的表达被下调，而hsa-miR-1238没有改变。
在更优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征：hsa-miR-638、hsa-miR-572和血浆特异性特征：hsa-miR-383、hsa-miR-1233、hsa-miR-545*及hsa-miR-655的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种健康对照血浆相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-638、hsa-miR-572、hsa-miR-383、hsa-miR-545*、hsa-miR-655的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；而hsa-miR-1233的表达被下调。
在更优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-383/hsa-miR-1233、hsa-miR-19b-2*/hsa-miR-1233、hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-1233、hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-1233、hsa-miR-545*/hsa-miR-1233、hsa-miR-923/hsa-miR-483-3p、hsamiR-638/hsa-miR-483-3p、hsa-miR-190a/hsa-miR-1233、hsa-miR-190b/hsa-miR-1233、及hsa-miR-572/hsa-miR-1233的任意一种或多种核酸组合。
在第二方面，本发明涉及用于鉴别鳞状细胞肺癌的血液中分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中与健康对照血浆相比差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是存在鳞状细胞肺癌的指征。
本文限定的核酸表达特征可包括至少19种核酸分子，优选的至少6种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被下调。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征：hsa-miR-181a、hsa-miR-623、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-21*、hsa-miR-572、hsa-miR-34b*、hsa10miR-221、hsa-miR-939；血浆特异性特征：hsa-miR-654-5p、hsa-miR-432、hsa-miR-194*、hsa-miR-302a、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-22、hsamiR-423-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-923以及内部稳定对照：hsa-miR-1238的任意一种或多种核酸分子。
在优选的实施方案中，与所述一或多种健康对照血浆相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-181a、hsa-miR-623、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-21*、hsa-miR-572、hsa-miR-34b*、hsa-miR-221、hsa-miR-939、hsa-miR-432、hsa-miR-194*、hsa-miR-302a、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-22、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-923的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；hsa-miR-654-5p被下调，而hsa-miR-1238-5p没有改变。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征：hsa-miR-181a、hsa-miR-623、hsa-miR-769-5p和血浆特异性特征：hsa-miR-654-5p、hsa-miR-432、hsa-miR-194*的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种健康对照血浆相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-181a、hsa-miR-623、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-432、hsa-miR-194*的任意一种或多种核酸分子的表达被上调，而hsa-miR-654-5p的表达被下调。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-194*/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-194*/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-623/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-181a/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-432/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-520d-3p/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-302a/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-423-5p/hsa-miR-654-5p及hsa-miR-221/hsa-miR-654-5p的任意一种或多种核酸组合。
在第三方面，本发明涉及用于鉴别小细胞肺癌的血液中分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和与健康对照血浆相比差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是存在小细胞肺癌的指征。
本文限定的核酸表达特征可包括至少36种核酸分子，优选的至少16种核酸分子，和特别优选的至少6种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被下调。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征：hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-34b*、hsa-miR-429、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-130b、hsa-miR-196a、hsa-miR-200a、hsa-miR-765、hsa-miR-33b*及血浆特异性特征:hsa-miR-377、hsa-miR-136、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-767-3p、hsamiR-637的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种健康对照血浆相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-34b*、hsa-miR-429、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-130b、hsa-miR-196a、hsa-miR-200a、hsa-miR-765、hsa-miR-377、hsa-miR-136、hsa-miR-574-5p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调，而编码hsa-miR-139-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-637的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
在更优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征：hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-34b*、hsa-miR-429、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-130b、hsa-miR-196a、hsa-miR-200a、hsa-miR-765、hsa-miR-33b*、hsa-miR-106a、hsa-miR-874、hsa-miR-142-5p；血浆特异性特征：hsa-miR-377、hsa-miR-136、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-637、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-520b、hsa-miR-609、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-1233、hsa-miR-634、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-138、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-665、hsa-miR-501-5p、hsa-let-7f、hsa-miR-193b*、hsa-miR-30d*以及内部稳定对照：hsa-miR-1238的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种健康对照血浆相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-34b*、hsa-miR-429、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-130b、hsa-miR-196a、hsa-miR-200a、hsa-miR-765、hsa-miR-377、hsa-miR-136、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-520b、hsa-miR-609、hsa-miR-423-5p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；而编码hsa-miR-139-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-637、hsa-miR-106a、hsa-miR-874、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-1233、hsa-miR-634、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-138、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-665、hsa-miR-501-5p、hsa-let-7f、hsa-miR-193b*、hsa-miR-30d*的任意一种或多种核酸分子的表达被下调，而hsa-miR-1238没有改变。
在进一步优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征：hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-34b*、hsa-miR-429以及hsa-miR-361-5p的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种健康对照血浆相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-34b*、hsa-miR-429以及hsa-miR-361-5p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；而hsa-miR-139-3p的表达被下调。
在更优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码：hsa-miR-520b/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-375/hsa-miR-106a、hsa-miR-196a/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-375/hsa-miR-193b*、hsa-miR-609/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-136/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-377/hsa-miR-637、hsa-miR-375/hsa-miR-637、hsa-miR-200a/hsa-miR-637、hsa-miR-520b/hsa-miR-637、hsa-miR-429/hsa-miR-637、hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-375/hsa-miR-1233、hsa-miR-543/hsa-miR-637、hsa-miR-375/hsa-miR-874、hsa-miR-196b/hsa-miR-637、hsa-miR-136/hsa-miR-637、hsa-miR-136/hsa-miR-637、hsa-miR-574-5p/hsa-miR-637、hsa-miR-130b/hsa-miR-634、hsa-miR-361-5p/hsa-miR-634、hsa-miR-765/hsa-miR-634、hsa-miR-130b/hsa-miR-767-3p、hsa-miR-361-5p/hsa-miR-767-3p、hsa-miR-485-3p/hsa-miR-767-3p以及hsa-miR-520b/hsa-miR-767-3p的任意一种或多种核酸组合。
在第四方面，本发明涉及用于区别不同类型肺癌的血液中分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在不同类型肺癌的血浆中以及在健康对照血浆中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是存在不同类型肺癌的指征，其中不同类型肺癌包括腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌。
在一个实施方案中，与健康对照血浆、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌相比，本文限定的血液中的核酸表达特征在腺癌肺癌中差异表达。本文限定的核酸表达特征可包括至少三种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌相比被上调。
在更优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-383、hsa-miR-545*、hsa-miR-19b-2*的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种健康对照、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-383、hsa-miR-545*、hsa-miR-19b-2*的任意一种或多种核酸分子的表达被上调。
在另一实施方案中，与所述一或多种健康对照、腺癌肺癌以及小细胞肺癌相比，本文限定的血液中的核酸表达特征在鳞状细胞肺癌中差异表达。本文限定的核酸表达特征可包括至少三种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，与一或多种对照血浆、腺癌肺癌以及小细胞肺癌相比，其表达在一或多种目标血浆中被上调。
在更优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-194*、hsa-miR-302a、hsa-miR-432的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种健康对照、腺癌肺癌以及小细胞肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-194*、hsa-miR-302a、hsa-miR-432的任意一种或多种核酸分子的表达被上调。
在另一实施方案中，与所述一或多种对照血浆、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌相比，本文限定的血液中的核酸表达特征在小细胞肺癌中差异表达。
本文限定的核酸表达特征可包括至少12种核酸分子，优选的至少5种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌相比被下调。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-574-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-196a、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-106a、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-141、hsa-miR-765、hsa-miR-609、hsa-miR-520b以及hsa-miR-769-3p的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种健康对照、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-574-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-196a、hsamiR-361-5p、hsa-miR-141、hsa-miR-765、hsa-miR-609、hsa-miR-520b的任意一种或多种核酸分子的表达被上调，而编码hsa-miR-139-3p、hsa-miR-106a、hsa-miR-769-3p的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
在更优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-574-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-196a以及hsa-miR-139-3p的任意一种或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种健康对照、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-574-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-196a的任意一种或多种核酸分子的表达被上调，而hsa-miR-139-3p的表达被下调。
在第五方面，本发明涉及用于鉴别展现出肺癌的一或多种目标血浆的方法，所述方法包括：(a)在一或多种目标血浆中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；(b)在一或多种对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；及(c)通过比较在步骤(a)和(b)中获得的各自表达水平而从所述多种核酸分子中鉴别出在目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表了本文限定的核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肺癌的指征。
在发明的优选的实施方案中，所述方法包括：(a)在一或多种目标血浆中确定多种核酸分子组合的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列，并利用特定公式计算，然后；(b)在健康对照血浆中确定所述核酸分子组合的表达水平，并利用特定公式计算；及(c)通过比较在步骤(a)和(b)中获得的各自计算结果从而鉴别出所述核酸分子组合在一或多种目标血浆中与在对照血浆中的差异，其中所述一或多种差异表达的组合一起代表了本文限定的核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肺癌的指征。
在发明的更优选的实施方案中，所述方法进一步用于区分腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌。
在第六方面，本发明涉及监测肺癌治疗的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文限定的方法，在一或多种目标血浆中鉴别核酸分子表达特征，然后；(b)在血液中监测所述核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述监测以如下的方式进行，即其在血浆中的表达在治疗前被上调的核酸分子在治疗后表达被下调，而其在血浆中的表达在治疗前被下调的核酸分子在治疗后表达被上调。
在第七方面，本发明涉及预防或治疗肺癌的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文限定的方法，在血浆中鉴别核酸分子的表达特征，然后；(b)在血液中改变所述核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在血液中被上调的核酸分子的表达被下调，且其表达在血液中被下调的核酸分子的表达被上调。
在第八方面，本发明涉及用于预防和/或治疗血液中的肺癌的药物组合物，所述药物组合物包括一或多种核酸分子，每种核酸分子编码序列，所述序列与本文限定的其表达在肺癌患者的血浆中被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于本文限定的其表达在肺癌患者血浆中被下调的核酸分子所编码的微RNA序列的序列。
最后，在第九方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肺癌的药物中的用途。
本发明的其它实施方案从以下详细描述中将变得明了。
附图简述
图1：示出包含在本发明中所述方法，用于检测表达特征的核心步骤的流程图，以鉴定具有发生肺癌倾向的一或多种目标血浆以及区别腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌和小细胞癌症。
图2：描绘了在本发明中第一方面所述的特别优选的表达特征中的人类miRNA，所述表达特征用于鉴定具有发生腺癌肺癌倾向的一或多种目标血浆。与所述健康对照血浆相比，这些miRNA在腺癌肺癌同时示出表达水平以及准确性(即表达被上调或表达被下调)。
图3：描绘了在本发明中第二方面所述的特别优选的表达特征中的人类miRNA，所述表达特征用于鉴定具有发生鳞状细胞肺癌倾向的一或多种目标血浆。与所述健康对照血浆相比，这些miRNA在鳞状细胞肺癌同时示出表达水平以及准确性(即表达被上调或表达被下调)。
图4：描绘了在本发明中第三方面所述的特别优选的表达特征中的人类miRNA，所述表达特征用于鉴定具有发生小细胞肺癌倾向的一或多种目标血浆。与所述健康对照血浆相比，这些miRNA在小细胞肺癌同时示出表达水平以及准确性(即表达被上调或表达被下调)。
图5：描绘了在本发明中第四方面所述的特别优选的表达特征中的人类miRNA，所述表达特征用于区分不同类型肺癌。图5A描绘了与所述健康对照血浆、鳞状细胞肺癌、小细胞肺癌相比，腺癌肺癌的miRNA特征的表达水平。图5B描绘了与所述健康对照血浆、腺癌肺癌、小细胞肺癌相比，鳞状细胞肺癌的miRNA特征的表达水平。图5C描绘了与所述健康对照血浆、腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌相比，小细胞肺癌的miRNA特征的表达水平。
发明详述
本发明基于如下出乎意料的发现，即肺癌可以通过血浆中特定的miRNA表达特征以高精确性和灵敏性被可靠地鉴定并区别不同类型的肺癌，其中所述表达特征如本文定义典型地包括被上调和下调的人类miRNA。更特别地，所述miRNA表达特征—通过分析整体miRNA表达模式和/或各个miRNA表达水平—使得能检测早期疾病状态下的肺癌以及区分不同类型的肺癌。
以下例证的本发明可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多个元件、一或多种限制的条件下实施。
本发明将根据特定的实施方案并参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。
当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案，这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。
当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”时，包括该名词的复数形式，除非特别指出。
术语“大约”在本发明中是指本领域技术人员理解仍能保证目的特征的技术效果的精确性区间。该术语通常表示偏离指示值的±10%，优选±5%。
另外，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在说明书和权利要求书中用于区分类似的元件，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解如此应用的术语在合适情况下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本文所述或例证的其它顺序操作。
术语的进一步定义在以下使用术语时给出。
以下术语或定义仅为了理解本发明而提供。这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。
本发明的目的是为提供诊断肺癌和/或监测肺癌治疗的新方法，通过检测血中的多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在不同类型的肺癌的血浆和在一或多种对照血浆中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，该核酸表达特征是存在或发生肺癌倾向的指征。
更具体地说明，本发明是为鉴定肺癌和/或区分不同类型肺癌而提供核酸表达特征。进一步具体地说明，其中所述的核酸表达特征包括肿瘤相关特征以及血浆特异性特征。其中所述的不同类型肺癌包括腺癌肺癌、肺鳞状细胞癌以及小细胞癌症。
本文所用术语“癌症”(也称为“癌(carcinoma)”)通常指任何类型的恶性赘生物，即与未受影响的(健康)野生型对照组织相比显示或具有发生癌特征倾向的靶组织的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重编程(geneticre-programming))。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。
本文所用术语“肺癌”是指肺组织中细胞失控生长，或者呈肿瘤性生长。
本文所用术语“不同类型肺癌”，包括腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌。
“腺癌肺癌”或“肺腺癌”是一种非小细胞肺癌。百分之八十的肺癌属于非小细胞癌症，而其中，大约有50%属于腺癌肺癌。肺部腺癌从肺部外缘开始，在确诊之前可存在一段较长时间。这型肺癌最常见于女性以及常见于非吸烟者。
“鳞状细胞肺癌”或“肺鳞状细胞癌”是一种非小细胞肺癌。约占非小细胞癌症中的30%。肺鳞状细胞癌通常从肺部中央的支气管管道(大气道)开始。多数患者在早期出现症状，常见的为咯血(咳嗽中带血)。
“小细胞肺癌”或“小细胞肺癌(SCLC)”，被视为来源于构成一部分支气管(气道)上皮(分布)的神经内分泌细胞。SCLC占总肺癌病例的18%。SCLC有很强的侵袭性，可以通过血液迅速转移到肝、肺、骨和脑，因此在被确诊时，常见到肿瘤沉积在这些器官。
本文所用术语“血浆”，是指血中的黄色液体成分，即全血中血细胞正常悬浮其中。它构成了总血容量的55%，其中最大成分是水(容量中90%)以及包含蛋白质、葡萄糖、凝血因子、矿物离子、激素和二氧化碳(血浆作为排泄物转运的主要介质)。血中血浆可以在离心机中旋转载有新鲜血液的离心管，直到血细胞沉淀在离心管地步。血浆可从中倒出或抽出。血浆密度大约为1025公斤/立方(1025kg/m3)，或1.025公斤/升(1.025kg/l)。近期研究表示miRNA在血浆中稳定。本文所用术语“血浆”，是指从患者个体或健康对照个体身上采集所得。
本文所用术语“患者”，代表一位至少认定是显示或具有发生肺癌，或者是至少认定是显示或具有发生某一类型的肺癌的人；而本文所用术语“目标血浆”，代表从患者身上采集的血浆；本文所用术语“健康个体”或“健康对照”典型地是指不具有这种癌表型特征表型的健康人。而术语“对照血浆”典型地是指从健康个体身上采集的血浆。但是在一些应用中，例如当比较显示不同类型的肺癌时，具有其他类型肺癌的个体或从这些个体身上采集的血浆典型地被认为是“对照血浆”。
典型地，所用的目标血浆来源于被诊断为肺癌的对象的生物学样品。为了确证获得的数据，“比较样品”也可以从患有给定已知疾病状态的对象中收集。生物学样品可包括机体组织和液体，如肺组织、血清、血液、痰和尿。另外，生物学样品可采集于含有肺肿瘤特征或怀疑是患有肺癌的个体。另外，如果需要，样品可以从获得的机体组织和液体中纯化，然后用作生物学样品。根据本发明，本发明的核酸标记物的表达水平由源于对象的生物学样品中确定。
在本发明的体外(试管)方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，优选以保护核酸(特别是RNA)或蛋白质的方式收集。待分析的样品典型地是血液。另外，肺组织和其它类型样品也可以使用。样品，尤其是在首次处理过后可以混合。但是也可以使用未经混合的样品。
本文所用术语“微RNA”(或“miRNA”)是其在本领域的普通含义(综述参见例如Bartel,D.P.(2004)Cell23,281-292；He,L.andHannon,G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5,522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因组基因座的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。
miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异的内切核酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生典型地折叠成发夹或茎-环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。从这个miRNA前体，通过Dicer切割miRNA双链体，其在发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，在另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。miRNA然后被导向其靶mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。
本文所用术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指从其加工成熟miRNA的miRNA初级转录物的部分。典型地，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构典型地长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(计数miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段，但排除更远端的序列)。
本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码微RNA(miRNA)的任何核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA，也指相应的如上所述的前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码微RNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的微RNA序列的核酸分子典型地编码单个miRNA序列(即个体miRNA)。但是，也可能这种核酸分子编码两个或多个miRNA序列(即两个或多个miRNA)，例如一个转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多个miRNA序列。
本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5′→3′)匹配或相应于所编码的miRNA(5′→3′)序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5′→3′)序列或者换句话说匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3′→5′)的分子)。本文所用术语“互补”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。
在本发明范围内，两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两个分子包含一或多个碱基错配或者在它们的核苷酸总数上不同(由于添加或缺失导致)。优选地，“互补”核酸分子包含与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列显示完全互补性的至少10个连续核苷酸。
因此，包含在本发明的诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多种核酸分子可包括一或多种“有义核酸分子”和/或一或多种“反义核酸分子”。有时，诊断试剂盒包括一或多种“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标记)的全体或至少亚集合，所述差异表达的miRNA是存在或发生特定病症倾向的指征，本文是肺癌。另一方面，当诊断试剂盒包括一或多种“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一或多种特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)。
在本发明中定义的多种核酸分子可以包含至少2种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种、至少10000种或至少100000种核酸分子，每种分子编码miRNA序列。
本文所用术语“差异表达”是指特定miRNA在目标血浆中的表达水平相比于健康对照血浆是改变的，其可以是上调(即在目标血浆中miRNA浓度增加)或下调(即在目标血浆中miRNA浓度降低或消失)。换句话说，核酸分子在目标血浆样品中被激活至比在对照血浆中更高或更低的水平。
在本发明范围内，核酸分子被认为是差异表达的，如果该核酸分子在目标血浆和对照血浆中的相应表达水平典型地相差至少5%或至少10%，优选地至少20%或至少25%，最优选地至少30%或至少50%。因此，后者的值相应于给定核酸分子在目标血浆样品中的表达水平相比于野生型对照血浆样品分别上调至少1.3倍或至少1.5倍，或者反之在目标血浆样品中的表达水平下调至少0.7倍或至少0.5倍。
本文所用术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一或多种被分析血浆样品中的浓度。
如上所述，术语“对照血浆”典型地是指不具有肺癌表型特征的(健康)野生型血浆样品。但是，在一些应用中，例如当比较显示不同类型的肺癌时，具有另一类型的肺癌典型地被认为是“对照血浆”。
表达水平的确定典型地遵循本领域熟知的已建立的标准程序(参见例如Sambrook,J.etal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual.2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY；Ausubel,F.M.etal.(2001)CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley&Sons,Hoboken,NJ)。确定可以在RNA水平进行，例如使用miRNA特异性探针进行Northern印迹分析，或者在逆转录(及克隆)RNA群后例如通过定量PCR或实时PCR技术在DNA水平进行。本文所用术语“确定”包括分析编码上述微RNA序列的任何核酸分子。但是，由于pri-miRNA及re-mRNA半寿期短，典型地仅测量成熟miRNA的浓度。
在具体的实施方案中，在给定样品的若干独立测量(例如两个、三个、五个或十个测量)和/或在一群目标血浆样品或对照血浆样品内的若干测量中获得的表达水平的标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。
所获得的一或多种目标血浆和一或多种对照血浆的表达水平之间的差异可以归一化至进一步的对照核酸例如管家基因的表达水平，管家基因的表达水平已知不根据细胞的疾病状态而不同。举例的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1等。在优选的实施方案中，对照核酸是已知在取样个体的血浆中的不同非癌和癌(前)状态中稳定表达的另一种miRNA。
但是，代替在任何实验中确定一或多种对照血浆的表达水平，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定疾病表型(即疾病状态)的一或多个截断值。在这种情况中，一或多种目标血浆样品的相应表达水平可以用用于归一化的稳定表达的对照miRNA确定。如果计算的“归一化”的表达水平高于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达上调的指征。反之，如果计算的“归一化”的表达水平低于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达下调的指征。
在本发明中，术语“鉴定显示或具有发生肺癌倾向和/或区分不同类型肺癌”也包括预测和可能性分析(“诊断”意义上)。本文公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监测和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病。或者，本发明可用于检测对象血浆检测肿瘤改变状况，并提供有用信息给医生以进行诊断。另外，本发明还用于区别不同类型的肺部肿瘤。
在本发明中，所鉴定的一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，该核酸表达特征是在目标血浆中存在肺癌或发生肺癌倾向的指征。本文所用术语“表达特征”是指一组核酸分子(例如miRNA)，其中各个核酸分子的表达水平在(癌性)目标血浆和(非癌性)对照血浆之间不同。本文中，核酸表达特征也指一组标记并代表最低数目的(不同)核酸分子，每种核酸分子编码能鉴定目标血浆的表型状态的miRNA序列。
在第一方面，本发明涉及用于鉴别腺癌肺癌的血液中分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆与健康对照血浆相比差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肺鳞腺癌症的指征。
本文限定的核酸表达特征可包含至少12种核酸分子，优选的至少6种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被上调；以及包含至少一种中编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被下调。
在特异的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种对照血浆相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种对照血浆相比被下调。
本文所用术语“源于肿瘤”或“肿瘤相关”是指在肺癌患者与健康对照人群的血浆中的核酸特征的差异表达，以及指在肺癌组织细胞与非癌症组织细胞中核酸特征的差异表达。
本文所用术语肺癌组织细胞是指癌性肺细胞，即来源于被诊断存在肺癌或发生肺癌倾向的对象所采集的切割物。本文所用术语非肺癌组织细胞，典型地指(健康)野生型肺细胞，即不含有癌性表型特征的细胞。
本文所用术语“血浆特异性”是指在肺癌患者与健康对照人群的血浆中的核酸特征的差异表达，但在肺癌组织细胞与非癌症组织细胞中核酸特征的为发现显著的差异表达。
典型地，包含在核酸表达特征中的核酸分子是人类序列(以后称为“hsa”(智人(Homosapiens)))。
在优选的实施方案中，诊断试剂盒中的核酸表达特征包含编码肿瘤相关特征：hsa-miR-638(SEQIDNO:1)、hsa-miR-572(SEQIDNO:2)；和核酸血浆特异性特征：hsa-miR-383(SEQIDNO:3)、hsa-miR-1233(SEQIDNO:4)、hsa-miR-545*(SEQIDNO:5)、hsa-miR-655(SEQIDNO:6)、hsa-miR-19b-2*(SEQIDNO:7)、hsa-miR-548d-5p(SEQIDNO:8)、hsa-miR-190b(SEQIDNO:9)、hsa-miR-623(SEQIDNO:10)、hsa-miR-923(SEQIDNO:11)和hsa-miR-1238(SEQIDNO:55)的任意一种或多种核酸分子。
上述miRNA的核酸序列列于表1。
表1
本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-JonesS.etal.(2008)Nucl.AcidsRes.36,D154-D158)。
在更优选的实施方案中，与一或多种健康对照血浆相比，在来自腺癌肺癌患者的一或多种目标血浆中编码hsa-miR-638、hsa-miR-572、hsa-miR-383、hsa-miR-545*、hsa-miR-655、hsa-miR-19b-2*、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-190b、hsa-miR-623以及hsa-miR-923的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；hsa-miR-1233的的表达被下调，而hsa-miR-1238的没有改变。
如本文所用术语“至少一种核酸分子”可涉及所述多种核酸分子的任何亚群，例如任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种、任九种、任十种等核酸分子，每种核酸分子均编码包含于所述核酸表达特征内的微RNA序列。
在本发明的优选实施方案中，所述核酸表达特征包括编码：hsa-miR-383/hsa-miR-1233、hsa-miR-19b-2*/hsa-miR-1233、hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-1233、hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-1233、hsa-miR-45*/hsa-miR-1233、hsa-miR-923/hsa-miR-483-3p、hsa-miR-638/hsa-miR-483-3p、hsa-miR-190b/hsa-miR-1233、hsa-miR-190b/hsa-miR-1233以及hsa-miR-572/hsa-miR-1233的任意一种或多种核酸组合。
本文所用术语“核酸组合”，是指整体同时使用最少2个核酸表达水平。特别指整体使用时可以通过公式计算出相对改变或计算结果。
本文所用术语“至少一种核酸组合”可涉及所述多种核酸组合的任何亚群，例如任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种、任九种、任十种等核酸分子；如本文所指明，每组核酸分子均编码包含至少2个于所述核酸表达特征内的微RNA序列。
在第二方面，本发明涉及用于鉴别鳞状细胞肺癌的血液中分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中与健康对照血浆相比差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是存在鳞状细胞肺癌的指征。
本文限定的核酸表达特征可包括至少19种核酸分子，优选的至少6种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被下调。
在更优选的实施方案中，诊断试剂盒中的核酸表达特征包含编码肿瘤相关特征：hsa-miR-181a(SEQIDNO:12)、hsa-miR-623(SEQIDNO:10)、hsa-miR-769-5p(SEQIDNO:13)、hsa-miR-21*(SEQIDNO:14)、hsa-miR-572(SEQIDNO:2)、hsa-miR-34b*(SEQIDNO:15)、hsa-miR-221(SEQIDNO:16)、hsa-miR-939(SEQIDNO:17)；血浆特异性特征：hsa-miR-654-5p(SEQIDNO:18)、hsa-miR-432(SEQID15NO:19)、hsa-miR-194*(SEQIDNO:20)、hsa-miR-302a(SEQIDNO:21)、hsa-miR-485-3p(SEQIDNO:22)、hsa-miR-654-3p(SEQIDNO:23)、hsa-miR-22(SEQIDNO:24)、hsa-miR-423-5p(SEQIDNO:25)、hsa-miR-520d-3p(SEQIDNO:26)、hsa-miR-923(SEQIDNO:11)和内部稳定对照：hsa-miR-1238(SEQIDNO:55)的任意一种或多种核酸分子。
上述miRNA的核酸序列列于表2。
表2
本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-JonesS.etal.(2008)Nucl.AcidsRes.36,D154-D158)。
特别优选地，与一或多种健康对照血浆中相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-181a、hsa-miR-623、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-21*、hsa-miR-572、hsa-miR-34b*、hsa-miR-221、hsa-miR-939、hsa-miR-432、hsa-miR-194*、hsa-miR-302a、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-22、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-923的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；hsa-miR-654-5p的表达被下调，而hsa-miR-1238没有改变。
在本发明的优选实施方案中，所述核酸表达特征包含编码：hsa-miR-194*/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-194*/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-623/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-181a/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-432/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-520d-3p/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-302a/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-423-5p/hsa-miR-654-5p以及hsa-miR-221/hsa-miR-654-5p的任意一或多种核酸组合。
在第三方面，本发明涉及用于鉴别小细胞肺癌的血液中分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和与健康对照血浆相比差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是存在小细胞肺癌的指征。
本文限定的核酸表达特征可包括至少36种核酸分子，优选的至少16种核酸分子，和特别优选的至少6种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照血浆相比被下调。
在更优选的实施方案中，诊断试剂盒中的核酸表达特征包含编码肿瘤相关特征：hsa-miR-375(SEQIDNO:27)、hsa-miR-543(SEQIDNO:28)、hsa-miR-139-3p(SEQID15NO:29)、hsa-miR-34b*(SEQIDNO:15)、hsa-miR-429(SEQIDNO:30)、hsa-miR-361-5p(SEQIDNO:31)、hsa-miR-130b(SEQIDNO:32)、hsa-miR-196a(SEQIDNO:33)、hsa-miR-200a(SEQIDNO:34)、hsa-miR-765(SEQIDNO:35)、hsa-miR-33b*(SEQIDNO:36)、hsa-miR-106a(SEQIDNO:37)、hsa-miR-874(SEQIDNO:38)、hsa-miR-142-5p(SEQIDNO:39)；血浆特异性特征：hsa-miR-377(SEQIDNO:40)、hsa-miR-136(SEQIDNO:41)、hsa-miR-574-5p(SEQIDNO:42)、hsa-miR-767-3p(SEQIDNO:43)、hsa-miR-637(SEQIDNO:44)、hsa-miR-548d-5p(SEQIDNO:8)、hsa-miR-485-3p(SEQIDNO:22)、hsa-miR-141(SEQIDNO:45)、hsa-miR-520b(SEQIDNO:46)、hsa-miR-609(SEQIDNO:47)、hsa-miR-423-5p(SEQIDNO:25)、hsa-miR-1233(SEQIDNO:4)、hsa-miR-634(SEQIDNO:18)、hsa-miR-654-5p(SEQID25NO:48)、hsa-miR-138(SEQIDNO:49)、hsa-miR-769-3p(SEQIDNO:50)、hsa-miR-665(SEQIDNO:6)、hsa-miR-501-5p(SEQIDNO:51)、hsa-let-7f(SEQIDNO:52)、hsa-miR-193b*(SEQIDNO:53)、hsa-miR-30d*(SEQIDNO:54)和内部稳定对照hsa-miR-1238(SEQIDNO:55)的任意一种或多种核酸分子。
上述miRNA的核酸序列列于表3。
表3
本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-JonesS.etal.(2008)Nucl.AcidsRes.36,D154-D158)。
特别优选地，与一或多种健康对照血浆相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-375、hsa-miR-54、hsa-miR-34b*、hsa-miR-429、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-130b、hsa-miR-196a、hsa-miR-200a、hsa-miR-765、hsa-miR-377、hsamiR-136、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-520b、hsa-miR-609、hsa-miR-423-5p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；而编码hsa-miR-139-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-637、hsa-miR-106a、hsa-miR-874、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-1233、hsa-miR-634、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-138、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-665、hsa-miR-501-5p、hsa-let-7f、hsa-miR-193b*、hsa-miR-30d*的任意一种或多种核酸分子的表达被下调，hsa-miR-1238没有改变。
在本发明的优选实施方案中，所述核酸表达特征包含编码：hsa-miR-520b/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-375/hsa-miR-106a、hsa-miR-196a/hsa-miR-139-3p,、hsa-miR-375/hsa-miR-193b*、hsa-miR-609/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-136/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-377/hsa-miR-637、hsa-miR-375/hsa-miR-637、hsa-miR-200a/hsa-miR-637、hsa-miR-520b/hsamiR-637、hsa-miR-429/hsa-miR-637、hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-375/hsa-miR-1233、hsa-miR-543/hsa-miR-637、hsa-miR-375/hsa-miR-874、hsa-miR-196b/hsa-miR-637、hsa-miR-136/hsa-miR-637、hsa-miR-136/hsa-miR-637、hsa-miR-574-5p/hsa-miR-637、hsa-miR-130b/hsa-miR-634、hsa-miR-361-5p/hsa-miR-634、hsa-miR-765/hsa-miR-634、hsa-miR-130b/hsa-miR-767-3p、hsa-miR-361-5p/hsa-miR-767-3p、hsa-miR-485-3p/hsa-miR-767-3p以及hsa-miR-520b/hsa-miR-767-3p的任意一种或多种核酸组合。
在第四方面，本发明涉及用于区别不同类型肺癌的血液中分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在不同类型肺癌的血浆中以及在健康对照血浆中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是存在不同类型肺癌的指征，其中不同类型肺癌包括腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌。
在一个实施方案中，与健康对照血浆、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌相比，本文限定的血液中的核酸表达特征在腺癌肺癌中差异表达。本文限定的核酸表达特征可包括至少三种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌相比被上调。
在更优选的实施方案中，诊断试剂盒中的核酸表达特征包含编码hsa-miR-383(SEQIDNO:3)、hsa-miR-545*(SEQIDNO:5)以及hsa-miR-19b-2*(SEQIDNO:7)的任意一种或多种核酸分子。
上述miRNA的核酸序列列于表4。
表4
miRNA 序列(5′→3′)
hsa-miR-183 agaucagaaggugauuguggcu
hsa-miR-545* ucaguaaauguuuauuagauga
hsa-miR-19b-2* aguuuugcagguuugcauuuca
本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-JonesS.etal.(2008)Nucl.AcidsRes.36,D154-D158)。
特别优选地，与一或多种健康对照、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-383、hsa-miR-545*、hsa-miR-19b-2*的任意一种或多种核酸分子的表达被上调。
在另一实施方案中，与所述健康对照、腺癌肺癌以及小细胞肺癌相比，本文限定的血液中的核酸表达特征在鳞状细胞肺癌中差异表达。本文限定的核酸表达特征可包括至少三种核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照、腺癌肺癌以及小细胞肺癌相比被上调。
在更优选的实施方案中，诊断试剂盒中的核酸表达特征包含编码hsa-miR-194*(SEQIDNO:20)、hsa-miR-302a(SEQIDNO:21),、hsa-miR-432(SEQIDNO:19)的任意一种或多种核酸分子。
上述miRNA的核酸序列列于表5。
表5
miRNA 序列(5′→3′)
hsa-miR-194* ccaguggggcugcuguuaucug
hsa-miR-302a uaagugcuuccauguuuugguga
hsa-miR-432 ucuuggaguaggucauugggugg
本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-JonesS.etal.(2008)Nucl.AcidsRes.36,D154-D158)。
特别优选地，与一或多种健康对照、腺癌肺癌以及小细胞肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-194*、hsa-miR-302a、hsa-miR-432的任意一种或多种核酸分子的表达被上调。
在另一实施方案中，与所述健康对照、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌相比，本文限定的血液中的核酸表达特征在小细胞肺癌中差异表达。本文限定的核酸表达特征可包括至少12种核酸分子，优选至少5中核酸分子。
在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与所述一或多种健康对照、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌相比被上调；所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与所述一或多种健康对照、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌相比被下调。
在更优选的实施方案中，诊断试剂盒中的核酸表达特征包含编码：hsa-miR-574-5p(SEQIDNO:42)、hsa-miR-375(SEQIDNO:27)、hsa-miR-543(SEQIDNO:28)、hsa-miR-196a(SEQIDNO:33)、hsa-miR-139-3p(SEQIDNO:29)、hsa-miR-106a(SEQIDNO:37)、hsa-miR-361-5p(SEQIDNO:31)、hsa-miR-141(SEQIDNO:45)、hsa-miR-765(SEQ15IDNO:35)、hsa-miR-609(SEQIDNO:47)、hsa-miR-520b(SEQIDNO:46)以及hsa-miR-769-3p(SEQIDNO:50)的任意一种或多种核酸分子。
上述miRNA的核酸序列列于表6
表6
miRNA 序列(5′→3′)
hsa-miR-574-5p ugagugugugugugugagugugu
hsa-miR-375 uuuguucguucggcucgcgu
hsa-miR-543 aaacauucgcggugcacuucuu
hsa-miR-196a uagguaguuucauguuguuggg
hsa-miR-139-3p ggagacgcggcccuguuggagu
hsa-miR-106a aaaagugcuuacagugcagguag
hsa-miR-361-5p uuaucagaaucuccagggguac
hsa-miR-141 uaacacugucugguaaagaugg20 -->
hsa-miR-765 uggaggagaaggaaggugaug
hsa-miR-609 aggguguuucucucaucucu
hsa-miR-520b aaagugcuuccuuuuagaggg
hsa-miR-769-3p cugggaucuccggggucuugguu
本文揭示的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-JonesS.etal.(2008)Nucl.AcidsRes.36,D154-D158)。
特别优选地，与一或多种健康对照、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-574-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-543、hsa-miR-196a、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-141、hsa-miR-765、hsa-miR-609、hsa-miR-520b的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；编码hsa-miR-139-3p、hsa-miR-106a、hsa-miR-769-3p的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。
在第五方面，本发明涉及用于鉴别展现出肺癌的一或多种目标血浆的方法，所述方法包括：(a)在一或多种目标血浆中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；(b)在一或多种对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；及(c)通过比较在步骤(a)和(b)中获得的各自表达水平而从所述多种核酸分子中鉴别出在目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表了本文限定的核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肺癌的指征。
在发明的优选的实施方案中，所述方法包括：(a)在一或多种目标血浆中确定多种核酸分子组合的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列，并利用特定公式计算，然后；(b)在健康对照血浆中确定所述核酸分子组合的表达水平，并利用特定公式计算；及(c)通过比较在步骤(a)和(b)中获得的各自计算结果从而鉴别出所述核酸分子组合在一或多种目标血浆中与在对照血浆中的差异，其中所述一或多种差异表达的组合一起代表了本文限定的核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肺癌的指征。
在发明的更优选的实施方案中，所述方法进一步用于区分腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌。
在第七方面，本发明涉及预防或治疗肺癌的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文限定的方法，在血浆中鉴别核酸分子的表达特征，然后；(b)在血液中改变所述核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在血液中被上调的核酸分子的表达被下调，且其表达在血液中被下调的核酸分子的表达被上调。
如本文所用，术语“改变编码miRNA序列的核酸分子的表达”是指对特定核酸分子的任何操纵以导致所述分子的表达水平改变，即与“野生型”(即未改变的对照)的表达相比产生不同量的相应miRNA。如本文所用，术语“不同量”既包括与未改变的对照相比较高的量，也包括较低的量。换句话说，如本文所定义的操纵可以是上调(即激活)或下调(即抑制)核酸分子的表达(即特别是转录)。
在本发明中，核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达以这样的方式被改变，即其表达在所述一或多种目标血浆中被上调的核酸分子的表达被下调且其表达在所述一或多种目标血浆中被下调的核酸分子的表达被上调。换句话说，编码miRNA序列的特定核酸分子的表达的修饰以与所述分子在所述一或多种癌目标血浆中的调节作用的反循环模式(anti-cyclical)的发生，以在所述一或多种目标血浆中干扰被上调的分子的“过度活性”和/或恢复被下调的分子的“缺陷活性”。
在本发明方法的一个优选实施方案中，下调核酸分子的表达包括将编码与被下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的序列的核酸分子导入一或多种目标血浆中。
如本文所用术语“导入血液中”是指使得一或多种核酸分子转移进入血液中的任何操纵。这种技术的例子包括注射、消化或任何其他可能涉及的技术。
如本文所用术语“互补序列”是指导入一或多种血液中的“互补”核酸分子(本文也称作“反义核酸分子”)能与上调的内源“有义”核酸分子形成碱基对，优选Watson-Crick碱基对。两种核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以是完全互补的，即其不含有任何碱基错配和/或添加或缺失核苷酸。在其它实施方案中，这两种分子包含一或多个碱基错配或者其核苷酸总数不同(由于添加或缺失所致)。在另外的实施方案中，“互补”核酸分子包含一段与上调的“有义”核酸分子中包含的序列完全互补的至少十个连续核苷酸。
“互补”核酸分子(即编码与下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的核酸序列的核酸分子)可以是天然发生的DNA-或RNA分子或者在其序列中包含一或多个相同类型或一或多种不同类型的修饰核苷酸的合成的核酸分子。
例如，可能这种核酸分子包含至少一个核糖核苷酸主链单位及至少一个脱氧核糖核苷酸主链单位。此外，所述核酸分子可含有一或多个RNA主链修饰为2′-O-甲基基团或者2′-O-甲氧基基团(也称作2′-O-甲基化)，其防止在培养基中核酸酶降解，并且重要地是也防止RNA诱导性沉默复合物核酸酶的内核分离，导致miRNA的不可逆抑制。另一可能的修饰(其功能等价于2′-O-甲基化)包含锁定核酸(LNA)，代表含有一或多个LNA核苷酸单体的核酸类似物，所述单体在RNA模拟糖构象中具有锁定双环呋喃糖单位(参见例如Orom,U.A.etal.(2006)Gene372,137-141)。
最近开发了另一类的miRNA表达沉默基因。这些称作“antagomirs”的化学工程化寡核苷酸是与胆固醇缀合的单链23个核苷酸的RNA分子(Krutzfeldt,J.etal.(2005)Nature438,685–689)。作为这种化学修饰寡核苷酸的另一选择，产生了作为RNA从转基因中产生的可以在细胞中表达的微RNA抑制剂。称作“微RNA海绵(microRNAsponges)”的这些竞争性抑制剂是从强启动子表达的转录物，含有感兴趣的微RNA的多个串联结合位点(Ebert,M.S.etal.(2007)Nat.Methods4,721-726)。
在本发明方法的特别优选的实施方案中，其表达被下调的一或多种核酸分子编码选自如下的微RNA序列：
(a)由hsa-miR-638、hsa-miR-572、hsa-miR-383、hsa-miR-545*、hsa-miR-655、hsa-miR-190b、hsa-miR-19b-2*、hsa-miR-548-5p、hsa-miR-623及hsa-miR-923构成的组，相对于上述表达特征，如上述所定义假定是腺癌肺癌的指征；和/或
(b)由hsa-miR-181a、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-21*、hsa-miR-34b*、hsa-miR-221、hsa-miR-623、hsa-miR-572、hsa-miR-939、hsa-miR-194*、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-302a、hsa-miR-432、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-923、hsa-miR-22及hsa-miR-423-5p构成的组，相对于上述表达特征，如上述所定义假定是肺鳞状细胞癌的指征；和/或
(c)由hsa-miR-375、hsa-miR-34b*、hsa-miR-429、hsa-miR-543、hsa-miR-200a、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-130b、hsa-miR-196a、hsa-miR-765、hsa-miR-377、hsa-miR-141、hsa-miR-548d-5p、hsamiR-609、hsa-miR-136、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-520b及hsa-miR-423-5p构成的组，相对于上述表达特征，如上述所定义假定是肺小细胞癌的指征。
在本发明方法的另一优选的实施方案中，上调核酸分子表达包括将编码被上调的核酸分子编码的微RNA序列的核酸分子导入一或多种靶血液中。换句话说，编码miRNA序列的核酸分子的表达的上调通过将所述miRNA序列的另一拷贝(即另外的“有义”核酸分子)导入所述一或多种细胞中而实现。导入一或多种靶细胞中的所述“有义”核酸分子可包含与上述“反义”核酸分子相同的修饰。
在一个特别优选的实施方案中，其表达被上调的一或多种核酸分子编码选自如下一组的微RNA序列：
(a)由hsa-miR-构成，相对于上述表达特征，如上述所定义假定是腺癌肺癌的指征；和/或
(b)由hsa-miR-654-5p构成，相对于上述表达特征，如上述所定义假定是鳞状细胞肺癌的指征；和/或
(c)由hsa-miR-33b*、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-874、hsa-miR-106a、hsa-miR-142-5p、hsa-let-7f、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-637、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-665、hsa-miR-501-5p、hsa-miR-138、hsa-miR-1233、hsa-miR-30d*、hsa-miR-193b、hsa-miR-769-3p以及hsa-miR-634构成的组，相对于上述表达特征，如上述所定义假定是肺小细胞癌症的指征。
导入一或多种靶血液中以修饰一或多种编码核酸表达特征中所包含的微RNA序列的核酸分子的表达的“有义”和/或“反义”核酸分子可以与调节序列可操纵地连接以使得所述核苷酸序列表达
为了阐明癌性或癌前样品中鉴别的miRNA的任何潜在关联，可以进行关于所述miRNA可以结合的mRNA靶序列的鉴别的预备功能分析。基于发现miRNA既可以参与肿瘤阻抑也可以参与肿瘤发生(综述参见例如Esquela-Kerscher,A.andSlack,F.J(2006)如前;Calin,G.A.andCroce,C.M.(2007)如前;Blenkiron,C.andMiska,E.A.(2007)如前)，可以推测这种miRNA的mRNA靶位点包括肿瘤阻抑基因以及癌基因。
如果核酸分子包含含有关于转录和/或翻译调节信息的序列元件，且这种序列“可操纵地连接”于编码多肽的核苷酸序列，则称该核酸分子为
“能表达核酸分子”或者能“使得核苷酸序列表达”。可操纵地连接是其中所述调节序列元件与被表达的序列(和/或互相表达的序列)以能使得基因表达的方式进行连接的连接。
为基因表达必需的调节区的确切性质在不同物种中可以不同，但是通常这些区域均包含启动子，在原核生物中其含有两个启动子，即指导转录起始的DNA元件以及当转录为RNA时发出翻译起始信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译起始的5′非编码区，如在原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgarno元件或者在真核细胞中的TATA盒、CAAT序列和5′-加帽元件。这些区域也可以包括增强子或阻抑子元件以及翻译信号和前导序列以将天然多肽靶向于宿主细胞的特定区室。另外，3′非编码序列可含有参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞中的功能不令人满意，则可以用在该细胞中发挥功能的信号取代。
此外，如本文定义的核酸分子的表达也可以通过例如存在修饰的核苷酸而影响(如上所述)。例如，锁定核酸(LNA)单体被认为通过增强对降解的抗性及通过稳定对于沉默活性关键的miRNA-靶双链体结构而增加体内miRNA的功能性半衰期(见例如Naguibneva,I.etal.(2006)Biomed.Pharmacother.60,633–638)。
因此，被导入提供的一或多种血液中的本发明的核酸分子可包括调节序列，优选启动子序列，任选还包括转录终止序列。所述启动子可以允许组成型或者可诱导的基因表达。合适启动子包括大肠杆菌(E.coli)lacUV5和tet(四环素应答)启动子、T7启动子以及SV40启动子或者CMV启动子。
本发明的核酸分子也可以包含在载体或者其它克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒或人工染色体中。在优选的实施方案中，所述核酸分子包含在载体中，特别是包含在表达载体中。这种表达载体除了上述调节序列及编码如本发明定义的遗传构建体的核酸序列以外可包括衍生自与用于表达的宿主相容的物种的复制和控制序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本领域已知且可商购许多合适的载体如pSUPER和pSUPERIOR。
在第八方面，本发明涉及用于预防和/或治疗血液中的肺癌的药物组合物，所述药物组合物包括一或多种核酸分子，每种核酸分子编码序列，所述序列与本文限定的其表达在肺癌患者的血浆中被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于本文限定的其表达在肺癌患者血浆中被下调的核酸分子所编码的微RNA序列的序列。
最后，在第九方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肺癌的药物中的用途。
在本发明范围内，合适的药物组合物包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括经含服和舌下)、腹膜和胃肠外(包括肌内、皮下或静脉内)给予的那些组合物，或者通过吸入或吹入给予的那些组合物。可以局部或全身性给予。优选通过口服或静脉内途径给予。所述制剂可以包装为独立剂量单位。
本发明的药物组合物包括本领域确定的任何药物剂量形式，例如胶囊、微囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、小丸剂(pellet)、多颗粒制剂(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、悬浮液、油包水乳状液如软膏，及水包油乳状液如乳剂、洗剂和香脂。
使用药理学可接受的成分以及已建立的制备方法可以将上述(“有义”和“反义”)核酸分子配制为药物组合物(Gennaro,A.L.andGennaro,A.R.(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thEd.,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA;Crowder,T.M.etal.(2003)AGuidetoPharmaceuticalParticulateScience.Interpharm/CRC,BocaRaton,FL;Niazi,S.K.(2004)HandbookofPharmaceuticalManufacturingFormulations,CRCPress,BocaRaton,FL)。
为了制备药物组合物，可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂(即载体)。为了制备例如丸剂、片剂、胶囊或颗粒，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油或硬化油。用于生产溶液、悬浮液、乳状液、气雾剂混合物或在使用之前重配为溶液或气雾剂混合物的粉末的合适赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。
所述药物组合物也可以含有添加剂，如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，及另外的溶剂或者增溶剂或者实现储存效应的物质。后者可理解为可以将核酸分子掺入缓释或持续释放或靶向输送系统中如脂质体、纳米颗粒和微囊中。
为了靶向体内的大多数组织，需要临床可行的无创策略以将如本文定义的这种药物组合物定向于细胞。在过去，一些方法通过将合理剂量的siRNA经静脉内注射入小鼠和灵长类动物体内已经获得重大的治疗益处，而无明显的限制毒性。
一种方法包括将miRNA的过客链(miRNA*链)与胆固醇或其衍生物/缀合物共价偶联以促进通过遍在表达的细胞表面LDL受体的吸收(Soutschek,J.etal.(2004)Nature432,173-178)。或者，未缀合的PBS-配制的锁定核酸修饰的寡核苷酸(LNA-antimiR)可以用于全身性输送(Elmen,J.etal.(2008)Nature452,896-899)。另一种输送miRNA的方法包括使用聚乙二醇使miRNA包囊化成为特定的脂质体以降低清除细胞的吸收并增强循环时间。这些特定的核酸颗粒(稳定的核酸-脂质颗粒或者SNALP)有效地将miRNA输送至肝脏(且不到达其它器官(参见例如Zimmermann,T.S.etal.(2006)Nature441,111-114所述))。近年来，描述了一类称作lipidoids的新型脂质样输送分子(基于烷基丙烯酸酯或者烷基-丙烯酰胺与伯胺或仲胺的缀合加成而合成)作为RNAi治疗剂的输送剂(Akinc,A.etal.(2008)Nat.Biotechnol.26,561-569)。
进一步的细胞特异性靶向策略包括将miRNA与一种融合蛋白混合，该融合蛋白由与鱼精蛋白连接的靶向抗体片段组成，所述鱼精蛋白是使精子中的DNA成核并通过电荷结合miRNA的碱性蛋白(Song,E.etal.(2005)Nat.Biotechnol.23,709-717)。近来已经开发了对上述基本输送方法进行的多种修改和改变。这些技术为本领域所已知，并综述在例如deFougerolles,A.etal.(2007)Nat.Rev.DrugDiscov.6,443-453;Kim,D.H.andRossi,J.J.(2007)Nat.Genet.8,173-184)中。
本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述附图和实施例只是为了例证本发明的特异的实施方案的目的，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。
实施例
实施例1：样品收集与制备
九十一名肺癌患者的癌组织在手术过程中取活检样品。将手术样本在收集时或收集后立即于液氮中速冻。样品可以贮存于-80°C。发明中能鉴别患者肿瘤组织样品的主要特征示于表7。
表7
发明中能鉴别患者肿瘤组织样品的主要特征
组织样品 数量
正常肺组织 44
肺癌 25 -->
腺癌 20
鳞状细胞癌 19
小细胞癌 8
总数 91
患者资料(年龄、性别、影像资料、治疗方法、其它医疗状况、家族史等)得自医院数据库用于匹配所收集的不同样品。病理学追踪研究(例如通过苏木精和伊红(H&E)染色进行的组织学分析)用于明确确定给定样品的疾病状态以及保证样本的一致分级。
对每个癌样品任选进行激光捕获显微切割以特异性分离肿瘤细胞群(大约200000个细胞)。简而言之，将透明的转移膜应用于组织切片或样本的表面。在显微镜下，观察置于载玻片上的薄组织切片，并鉴别细胞群以进行分离。当选择的细胞位于观察视野的中心时，激活近红外激光二极管集成显微镜光学器件(nearIRlaserdiodeintegralwiththemicroscopeoptics)。脉冲激光束激活转移膜上的斑点(spot)，使该膜与下面的选择的细胞融合。然后将具有结合的细胞的转移膜从所述薄组织切片中剥离(综述参见例如Emmert-Buck,M.R.etal.(1996).Science274,998-1001;Espina,V.etal.(2007)ExpertRev.Mol.Diagn.7,647-657)。基本如厂商指导制备冷冻切片并使用激光捕获显微镜(ArcturusVeritasTMLaserCaptureMicrodissectionInstrument(MolecularDevices,Inc.,Sunnyvale,CA,USA)进行捕获步骤。
使用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX,USA)根据厂商指导分离miRNA群。利用NanoDrop1000分光光度计(NanoDropTechnologies,Waltham,MA测定浓度。RNA的质量则由利用RNA6000PicoLabChip试剂盒(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)的2100生物分析仪监测(2100Bioanalyzer)。
实施例2：样品中miRNA表达谱的分析
使用AgilentmiRNA微阵列平台(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)根据厂商指导任选对特定样品中(差异)表达的miRNA进行定性分析。该微阵列含有Sanger数据库V.10.1中的723个人类微RNA探针。对91个LCM选择切割的肺组织中每例抽提总RNA(100ng)后通过Cy3整合标记。微阵列切片经由XDR扫描仪扫描(PMT100,PMT5)。标记和杂交则根据AgilentmiRNA微阵列系统中的步骤进行。
对于数据分析，通过应用Quantile方法及使用本领域已知的GeneSpringGX10(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)软件将针对单色(CY3)杂交获得的原始数据归一化。先后分别用Fisher检验(F-检验)及非配对T检验(p值<0.01)检测肺癌组织与正常组织的miRNA的表达差异。
对91个组织样品每个测量进行至少三个独立实验，确定的miRNA表达水平代表获得的各自的各个数据的平均值。
实施例3：血浆样品收集与制备
对目标血浆中的肺癌检测的主要方法步骤如图1显示。
从健康人群和上海中山医院2008至2009年的肺癌患者中收集共五十九个血液样品。发明中能鉴别患者肿瘤血液样品的主要特征示于表8。所有样品来自于手术前患者。患者资料(年龄、性别、影像资料、治疗方法、其它医疗状况、家族史等)得自医院数据库。肿瘤组织病理学分型分别经三位病理学家根据世界卫生组织肿瘤系统分型(WorldHealthOrganizationClassificationofTumorSystem)作出独立诊断。
表8
发明中能鉴别患者肿瘤血液样品的主要特征
血液样品 数量
健康个体 23
肺癌患者
腺癌 19
鳞状细胞癌 10
小细胞癌 7
总数 59
抽取外周血(2毫升)入EDTA管。两小时内置管于820g离心机中离心10分钟。然后，将1ml等分的血浆转装入1.5毫升管中，置于16,000个离心机中离心10分钟以分离剩余的细胞碎片。接着，将上清液装入新管子中，存放于-80°C。
使用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX,USA)根据厂商指导分离miRNA群。利用NanoDrop1000分光光度计(NanoDropTechnologies,Waltham,MA测定浓度。RNA的质量则由利用RNA6000PicoLabChip试剂盒(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)的2100生物分析仪监测(2100Bioanalyzer)。
实施例4：血浆样品中miRNA表达谱的分析
使用AgilentmiRNA微阵列平台(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)根据厂商指导任选对特定样品中(差异)表达的miRNA进行定性分析。该微阵列含有Sanger数据库V.10.1中的723个人类微RNA探针。对59个血浆样品中每例抽提总RNA(100ng)后通过Cy3整合标记。微阵列切片经由XDR扫描仪扫描(PMT100,PMT5)。标记和杂交则根据AgilentmiRNA微阵列系统中的步骤进行。
对于数据分析，通过应用Quantile方法及使用本领域已知的GeneSpringGX10(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)软件将针对单色(CY3)杂交获得的原始数据，加入内部稳定对照hsa-miR-1238，进行归一化。先后分别用Fisher检验(F-检验)及非配对T检验检测肺癌血浆与正常血浆或其它类型的肺癌血浆miRNA的表达差异。
对于检测单个miRNA作为诊断生物学标记物的特异性以及灵敏度，可应用MedCalc软件，制作单个miRNA的接受者操作特征曲线(简称ROC分析(receiveroperatingcharacteristic,ROC))进行分析，分别分析肺癌患者与健康人群和/或其它类型肺癌患者，利用95%置信空间(简称95%CI(95%confidenceinterval))检测是否有显著差异。
为了评估一特定miRNA在肺癌目标血浆中与在对照血浆或其它类型肺癌血浆中相比是否差异表达，使用如下标准：
(i)所测试肿瘤样品中差异表达≥2倍改变的p值(概率值)<0.05；
(ii)作为诊断生物学标记物的准确率(简称AUC(accuracyasadiagnosticbiomarker,AUC))>0.700。
如果至少这些标准满足，则认为所述miRNA在肺癌目标血浆和对照血浆，和/或其它类型肺癌中分别差异表达。
对59个血浆样品每个测量进行至少三个独立实验，确定的miRNA表达水平代表获得的各自的各个数据的平均值。
在第一方面区别腺癌肺癌患者与健康人群的优先表达特征的表达数据总结在下表9-11中。表9列出了肿瘤相关的miRNA特征，其中显示在腺癌肺癌患者的组织和血浆中差异表达的miRNA。表10总结了血浆特异性miRNA特征，显示仅在腺癌肺癌患者血浆中差异表达的miRNA，而表11列出了血浆中检测腺癌肺癌的最佳miRNA特征组合。在“t”栏中表示肺癌组织，缩写“n”表示匹配正常对照组织，“p”表示患者血浆以及“h”表示健康对照血浆。特别优选的miRNA(表9中的SEQIDNO:1至SEQIDNO:2；表10中的SEQIDNO:3至SEQIDNO:10)以黑体示出。
表9
腺癌肺癌患者血浆中的肿瘤相关miRNA表达特征
表10
血浆中检测腺癌肺癌的miRNA表达特征
表11
腺癌肺癌患者血浆中的血浆特异性miRNA表达特征组合
miRNA组合 敏感性 特异性 AUC 95%CI
hsa-miR-19b-2*&hsa-miR-572&hsa-miR-383 95 91 0.984 0.887至1.000
hsa-miR-383/hsa-miR-1233 95 70 0.886 0.749至0.963
hsa-miR-19b-2*/hsa-miR-1233 79 74 0.823 0.674至0.92328 -->
hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-1233 90 61 0.819 0.670至0.921
hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-1233 90 61 0.819 0.670至0.921
hsa-miR-545*/hsa-miR-1233 79 74 0.809 0.658至0.914
hsa-miR-923/hsa-miR-483-3p 84 65 0.808 0.657至0.913
hsa-miR-638/hsa-miR-483-3p 84 70 0.808 0.657至0.913
hsa-miR-190b/hsa-miR-1233 63 96 0.803 0.652至0.910
hsa-miR-190b/hsa-miR-1233 63 96 0.803 0.652至0.910
hsa-miR-572/hsa-miR-1233 73 83 0.801 0.649至0.908
在第二方面区别鳞状细胞肺癌患者与健康人群的优先表达特征的表达数据总结在下表12-14中。表12列出了肿瘤相关的miRNA特征，其中显示在鳞状细胞肺癌患者的组织和血浆中差异表达的miRNA。表13总结了血浆特异性miRNA特征，显示仅在鳞状细胞肺癌患者血浆中差异表达的miRNA，而表14列出了检测鳞状细胞肺癌的最佳miRNA特征组合的miRNA。在“t”栏中表示肺癌组织，缩写“n”表示匹配正常对照组织，“p”表示患者血浆以及“h”表示健康对照血浆。特别优选的miRNA(表12中的SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13；表13中的SEQIDNO:18至SEQIDNO:20)以黑体示出。
表12
鳞状细胞肺癌患者血浆中的肿瘤相关miRNA表达特征
表13
血浆中检测鳞状细胞肺癌的miRNA表达特征
表14
鳞状细胞肺癌患者血浆中的血浆特异性miRNA表达特征组合
miRNA组合 敏感性 特异性 AUC 95%CI
hsa-miR-194*/hsa-miR-654-5p 100 61 0.854 0.688至0.952
hsa-miR-623/hsa-miR-654-5p 90 74 0.843 0.675至0.946
hsa-miR-181a/hsa-miR-654-5p 90 74 0.839 0.670至0.943
hsa-miR-432/hsa-miR-654-5p 90 61 0.826 0.655至0.935
hsa-miR-520d-3p/hsa-miR-654-5p 90 70 0.809 0.634至0.924
hsa-miR-302a/hsa-miR-654-5p 80 78 0.807 0.632至0.923
hsa-miR-423-5p/hsa-miR-654-5p 70 83 0.804 0.630至0.921
hsa-miR-221/hsa-miR-654-5p 80 74 0.802 0.627至0.920
在第三方面区别小细胞肺癌患者与健康人群的优先表达特征的表达数据总结在下表15-17中。表15列出了肿瘤相关的miRNA特征，其中显示在鳞状细胞肺癌患者的组织和血浆中差异表达的miRNA。表16总结了血浆特异性miRNA特征，显示仅在小细胞肺癌患者血浆中差异表达的miRNA，而表17列出了检测小细胞肺癌的最佳miRNA特征组合的miRNA。在“t”栏中表示肺癌组织，缩写“n”表示匹配正常对照组织，“p”表示患者血浆以及“h”表示健康对照血浆。特别优选的miRNA(表15中的SEQIDNO:27至SEQIDNO:29、SEQIDNO:15、SEQIDNO:30至SEQIDNO:36；表16中的SEQIDNO:40至SEQIDNO:44)以黑体示出。
表15
小细胞肺癌患者血浆中的肿瘤相关miRNA表达特征
表16
血浆中检测小细胞肺癌癌症的miRNA表达特征
表17
小细胞肺癌患者血浆中的血浆特异性miRNA表达特征组合
miRNA组合 敏感性 特异性 AUC 95%CI
hsa-miR-520b/hsa-miR-139-3p 100 91 0.975 0.841至1.000
hsa-miR-361-5p/hsa-miR-634 100 96 0.969 0.831至0.999
hsa-miR-361-5p/hsa-miR-767-3p 100 83 0.963 0.822至0.999
hsa-miR-375/hsa-miR-106a 100 78 0.963 0.822至0.999
hsa-miR-196a/hsa-miR-139-3p 86 91 0.938 0.786至0.993
hsa-miR-375/hsa-miR-193b* 100 78 0.935 0.781至0.992
hsa-miR-765/hsa-miR-634 100 74 0.932 0.777至0.991
hsa-miR-136/hsa-miR-139-3p 86 87 0.932 0.777至0.991
hsa-miR-609/hsa-miR-139-3p 100 74 0.932 0.777至0.991
hsa-miR-485-3p/hsa-miR-767-3p 87 100 0.925 0.768至0.98932 -->
hsa-miR-200a/hsa-miR-637 100 83 0.925 0.768至0.989
hsa-miR-375/hsa-miR-637 86 96 0.925 0.768至0.989
hsa-miR-377/hsa-miR-637 100 70 0.925 0.768至0.989
hsa-miR-485-3p/hsa-miR-767-3p 86 87 0.919 0.760至0.987
hsa-miR-130b/hsa-miR-634 100 78 0.919 0.760至0.987
hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-139-3p 86 96 0.919 0.760至0.987
hsa-miR-429/hsa-miR-637 100 74 0.919 0.760至0.987
hsa-miR-520b/hsa-miR-637 86 91 0.919 0.760至0.987
hsa-miR-375/hsa-miR-874 100 74 0.913 0.752至0.984
hsa-miR-543/hsa-miR-637 86 96 0.913 0.752至0.984
hsa-miR-375/hsa-miR-1233 86 83 0.913 0.752至0.984
hsa-miR-136/hsa-miR-637 86 91 0.907 0.744至0.982
hsa-miR-196b/hsa-miR-637 86 83 0.907 0.744至0.982
hsa-miR-520b/hsa-miR-767-3p 86 96 0.901 0.736至0.979
hsa-miR-574-5p/hsa-miR-637 86 87 0.901 0.736至0.979
在第四方面区别不同类型肺癌患者的优先表达特征的表达数据总结在下表18-20中。表18列出了腺癌肺癌患者与健康人群、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌患者的miRNA特征的差异表达。表19列出了肺鳞状细胞癌患者与健康人群、腺癌肺癌症以及小细胞肺癌患者的miRNA特征的差异表达。表20列出了小细胞肺癌患者与健康人群、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌患者的miRNA特征的差异表达，而且表20列出了小细胞肺癌患者与健康人群、腺癌肺癌以及鳞状细胞肺癌患者的miRNA特征组合的差异表达。在“H”栏中表示健康对照，缩写“AC”表示腺癌肺癌，“SQ”表示鳞状细胞肺癌以及“SCLC”表示小细胞腺癌症。特别优选的miRNA(表18中的SEQIDNO:3；表19中的SEQIDNO:20；表20中的SEQIDNO:42、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:33以及SEQIDNO:29)以黑体示出。
表18
腺癌肺癌与健康对照、鳞状细胞肺癌及小细胞肺癌的miRNA表达特征的区别
t-检验 倍数 敏感性 特异性 AUC 95%CI
p-值 AC/H-SQ-SCLC
hsa-miR-383 1.8E-05 17.4 84 73 0.816 0.693至0.905
hsa-miR-545* 4.2E-03 7.7 63 83 0.750 0.620至0.854
hsa-miR-19b-2* 1.9E-03 5.0 79 63 0.702 0.569至0.814
表19
鳞状细胞肺癌与健康对照、腺癌肺癌及小细胞肺癌的miRNA表达特征的区别
t-检验 倍数 敏感性 特异性 AUC 95%CI
p-值 SQ/H-AC-SCLC
hsa-miR-194＊ 8.4E-03 8.0 90 74 0.813 0.691至0.903
hsa-miR-302a 2.3E-02 5.7 70 84 0.760 0.631至0.86233 -->
hsa-miR-432 1.3E-03 4.7 70 82 0.788 0.662至0.883
表20
小细胞肺癌与健康对照、腺癌肺癌及鳞状细胞肺癌的miRNA表达特征的区别
t-检验 倍数 敏感性 特异性 AUC 95%CI
p-值 SCLC/H-AC-SQ
hsa-miR-574-5p 3.9E-05 4.2 100 75 0.915 0.813至0.971
hsa-miR-375 3.0E-05 68.7 86 8498 0.904 0.799至0.965
hsa-miR-543 7.5E-04 12.4 100 8267 0.874 0.761至0.946
hsa-miR-196a 7.0E-04 3.0 86 77 0.843 0.725至0.925
hsa-miR-139-3p 1.6E-03 0.1 71 83 0.823 0.701至0.910
hsa-miR-106a 2.3E-03 0.1 86 81 0.775 0.647至0.873
hsa-miR-361-5p 4.3E-02 4.9 100 48 0.764 0.635至0.865
hsa-miR-141 2.6E-02 7.2 100 44 0.762 0.634至0.863
hsa-miR-765 4.7E-03 2.6 57 100 0.742 0.611至0.847
hsa-miR-609 2.5E-04 3.9 86 69 0.742 0.611至0.847
hsa-miR-520b 4.1E-03 3.2 86 58 0.728 0.596至0.836
hsa-miR-769-3p 2.0E-02 0.2 71 83 0.718 0.586至0.828
所获得的结果证实在肺癌中miRNA表达的全局高特异性调节。因此，本文所述的miRNA的相应亚集代表独特的miRNA表达特征，用于肺癌的表达谱分析，其不仅使得可以鉴别癌发生状态(cancerogenousstate)本身，而且使得可以区别不同类型的肿瘤，即腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌以及小细胞肺癌。
本发明中定义的miRNA表达特征提供一种独特的分子标记物，利用血液作筛查、检测、诊断和区分不同类型的肺癌。而且，miRNA表达特征可以用于监测肺癌患者的治疗反应和指导治疗决策。再者，miRNA表达特征还可以用于抗肺癌药物的开发。
在此举例描述的本发明可以适当地在不存在本文特别揭示的任何元件、限制的条件下进行。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应具有广泛含义且无限制。另外，本文应用的术语和表达用于描述本发明而无限制之意，且没有使用这些术语和表达排除任何其所示特征和描述或其一部分的等价物之意，但是应意识到在请求保护的本发明范围内可以进行各种修改。因此，应理解尽管通过实施方案和任选的特征对本发明进行的特别揭示，但是本领域技术人员可以对本发明进行修改和改变，这种修改和改变认为在本发明的范围内。
本文广泛及概括地描述了本发明。落入上位描述范围内的每个较窄的下位概念和亚上位集合也组成了本发明的一部分。这包括用条件或从上位中除去任何主题的否定限制对本发明的上位描述，而无论所除去的主题是否在本文中特别引述。
其它实施方案在如下权利要求范围内。另外，当本发明的特征或各个方面用马库什组方式描述时，本领域技术人员能意识到本发明也以马库什组的任何各个成员或成员亚组方式被描述。

Claims (18)

1.核酸分子在制备用于鉴别展现出肺癌的一或多种目标血浆的分子标记的诊断试剂盒中的用途，所述核酸分子均编码微RNA序列，
其中所述多种核酸分子的一或多种在所述目标血浆和一或多种对照血浆中差异表达，以及
其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征是存在肺癌和/或非小细胞肺癌的指征，
其中非小细胞肺癌由腺癌肺癌和鳞状细胞肺癌所组成；
当所述非小细胞肺癌为腺癌肺癌时，其中所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-572、hsa-miR-623，以及选自hsa-miR-638、hsa-miR-383、hsa-miR-1233、hsa-miR-545*、hsa-miR-655、hsa-miR-19b-2*、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-190b、hsa-miR-923和hsa-miR-1238的任意一种或多种核酸分子；
当所述非小细胞肺癌为鳞癌肺癌时，其中所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-572、hsa-miR-623，以及选自hsa-miR-181a、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-21*、hsa-miR-34b*、hsa-miR-221、hsa-miR-939、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-432、hsa-miR-194*、hsa-miR-302a、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-22、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-520d-3p的任意一种或多种核酸分子。
2.权利要求1的用途，其中所述非小细胞肺癌为腺癌肺癌。
3.权利要求2的用途，其中所述核酸表达特征包含至少十二种核酸分子。
4.权利要求2的用途，其中所述核酸表达特征包含至少六种核酸分子。
5.权利要求1-4任一项的用途，其中所述核酸表达特征包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种对照血浆相比被上调；以及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种对照血浆相比被下调。
6.权利要求5的用途，其中与一或多种健康对照血浆相比，在所述一或多种目标血浆中，编码hsa-miR-638、hsa-miR-572、hsa-miR-383、hsa-miR-545*、hsa-miR-655、hsa-miR-19b-2*、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-190b、hsa-miR-623、hsa-miR-923的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；hsa-miR-1233的表达被下调，而hsa-miR-1238没有变化。
7.权利要求1-4任一项的用途，其中核酸表达特征包括编码hsa-miR-572/hsa-miR-1233的核酸组合。
8.权利要求7的用途，其中核酸表达特征还包括编码hsa-miR-383/hsa-miR-1233、hsa-miR-19b-2*/hsa-miR-1233、hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-1233、hsa-miR-548d-5p/hsa-miR-1233、hsa-miR-545*/hsa-miR-1233、hsa-miR-923/hsa-miR-483-3p、hsa-miR-638/hsa-miR-483-3p、hsa-miR-190b/hsa-miR-1233以及hsa-miR-190b/hsa-miR-1233的任意一种或多种核酸组合。
9.权利要求1的用途，其中所述非小细胞肺癌为鳞状细胞肺癌。
10.权利要求9的用途，其中所述核酸表达特征包含至少十九种核酸分子。
11.权利要求10的用途，其中所述核酸表达特征包含至少六种核酸分子。
12.权利要求1或9-11任一项的用途，其中所述核酸表达特征包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种对照血浆相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种对照血浆相比被下调。
13.权利要求12的用途，其中与一或多种健康对照血浆相比，在所述一或多种目标血浆中，编码hsa-miR-181a、hsa-miR-623、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-21*、hsa-miR-34b*、hsa-miR-221、hsa-miR-939、hsa-miR-432、hsa-miR-194*、hsa-miR-302a、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-22、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-520d-3p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；hsa-miR-654-5p被下调。
14.权利要求1或9-11任一项的用途，其中核酸表达特征还包括编码hsa-miR-194*/hsamiR-654-5p、hsa-miR-194*/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-623/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-181a/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-432/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-520d-3p/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-302a/hsa-miR-654-5p、hsa-miR-423-5p/hsa-miR-654-5p以及hsa-miR-221/hsa-miR-654-5p的任意一种或多种核酸组合。
15.权利要求1的用途，进一步用于将腺癌肺癌与健康对照、鳞状细胞肺癌和小细胞肺癌区分开，并且
其中所述核酸表达特征还包含编码hsa-miR-383、hsa-miR-545*、hsa-miR-19b-2*的任意一种或多种核酸分子。
16.权利要求15的用途，其中与一或多种健康对照、鳞状细胞肺癌和小细胞肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中，编码hsa-miR-383、hsa-miR-545*、hsa-miR-19b-2*的任意一种或多种核酸分子的表达被上调。
17.权利要求1的用途，进一步用于将鳞状细胞肺癌与健康对照、腺癌肺癌和小细胞肺癌区分开，并且
其中所述核酸表达特征还包含编码hsa-miR-194*、hsa-miR-302a、hsa-miR-432的任意一种或多种核酸分子。
18.权利要求17的用途，其中与一或多种健康对照、腺癌肺癌和小细胞肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中，编码hsa-miR-194*、hsa-miR-302a、hsa-miR-432的任意一种或多种核酸分子的表达被上调。
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